WO2013042684A1 - リポ蛋白を用いた神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法 - Google Patents

リポ蛋白を用いた神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法 Download PDF

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WO2013042684A1
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receptor
apolipoprotein
neurological diseases
therapeutic agent
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林秀樹
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国立大学法人熊本大学
国立大学法人東京医科歯科大学
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive / therapeutic agent for neurological diseases and a method for preventing / treating neurological diseases, wherein the lipoprotein contains at least apolipoprotein E. More specifically, the present invention relates to a neurological disease characterized in that apolipoprotein E-containing lipoprotein activates a neuroprotective molecule and inactivates or suppresses a neurodegeneration-inducing molecule via a lipoprotein receptor. The present invention relates to a preventive / therapeutic agent and a method for preventing / treating neurological diseases.
  • Refractory neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and spinocerebellar degeneration, which often develop in middle-aged and older, all cause abnormal protein accumulation inside the neuron, and eventually the neuron Since selective cell death occurs, it is considered to be a neurodegenerative disease having a common onset mechanism. Thus, in neurodegenerative diseases, it is likely that abnormalities have occurred in the apoptosis control mechanism of normal cells.
  • Degenerative diseases of the retina and optic nerve exist as diseases that are considered to be one of various neurodegenerative diseases whose main form is apoptosis of nerve cells.
  • this degenerative disease of the retina and optic nerve is the cause of most of the blindness, and in the ongoing super-aged society in Japan, the optic nerve such as glaucoma and diabetic retinopathy can be called “adult diseases of the eye”.
  • Glaucoma is a progressive neurodegenerative disease in which the optic nerve degenerates and falls, and is the first cause of blindness in Japan and second in the world. Vision is one of the most important sensations, and even if it does not lead to blindness, visual impairment significantly reduces the quality of life.
  • Diabetic retinopathy is known as one of the three major complications of diabetes and is a major cause of blindness in the worker generation in developed countries. For these reasons, the development of new treatments for both diseases is urgent.
  • retinal ganglion cells that make up the optic nerve are known to be damaged in diabetic retinopathy and glaucoma. Once it develops, it is difficult to treat, so it is extremely difficult to maintain visual function, which is a big social problem from the viewpoint of quality of life.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • the present inventor has focused on glial cell-derived lipoproteins as a factor that protects retinal ganglion cells, and has developed glaucoma and diabetic retina.
  • glial cell-derived lipoproteins As a factor that protects retinal ganglion cells, and has developed glaucoma and diabetic retina.
  • this glial cell-derived lipoprotein can suppress optic nerve cell death in such optic neurodegenerative diseases, it can be used to elucidate the mechanism of neuronal cell death in the neurodegeneration of other neurodegenerative diseases and develop therapeutic methods. I can expect it.
  • Non-patent Document 2 the present inventor confirmed that the glial cell-derived apolipoprotein E-containing lipoprotein has a nerve cell protective action against apoptosis.
  • the present inventor has confirmed that the apoprotein E-containing lipoprotein ⁇ (E-LP) produced in the central nervous system glial cells prevents apoptosis induced by nutrient removal of rat retinal ganglion neurons, It has been shown that calcineurin activation involved in the neuronal cell death pathway is inhibited and that it also has a protective effect against neuronal cell death caused by oxidative stress (Non-patent Document 3).
  • an apolipoprotein E-containing lipoprotein has a neuronal cell protective action against apoptosis by an experiment using an in vitro system.
  • this experiment shows that when the apolipoprotein E-containing lipoprotein is actually used in the living body, the apolipoprotein E-containing lipoprotein is It is not clear whether it shows a cytoprotective effect.
  • the present inventor injected apolipoprotein E-containing lipoprotein into the vitreous body of a mouse in which a large amount of lipoprotein was present, and confirmed whether it exhibited a neuronal cell protective effect against apoptosis in the in vivo system (in vivo) did.
  • apolipoprotein E-containing lipoprotein has a nerve cell protective action against apoptosis even in an in vivo system.
  • a complex of an apolipoprotein E-containing lipoprotein and a neuroprotective molecule such as LRP1 also has a neuroprotective action against apoptosis in an in vivo system.
  • the present invention provides a neuroprotective mechanism in which activation of neuroprotective molecules via apolipoprotein E-containing lipoproteins and / or lipoprotein receptors, and inactivation of neurodegeneration-inducing molecules are active. It was completed based on the finding that it has a neuronal protective effect against apoptosis in the body system.
  • At least a lipoprotein containing apolipoprotein E-containing lipoprotein or apolipoprotein E-containing lipoprotein activates a neuroprotective molecule and inactivates a neurodegeneration-inducing molecule via a lipoprotein receptor.
  • apolipoprotein E-containing lipoprotein refers to the case where apolipoprotein E and lipoprotein are in the same medium in addition to the case where apolipoprotein E and lipoprotein are chemically associated. It also includes the case of coexisting.
  • neuroprotective molecule used in the present specification means a molecule that is activated when an apolipoprotein E-containing lipoprotein exerts a neuroprotective effect, such as a lipoprotein receptor, Examples thereof include phospholipase C and protein kinase C ⁇ .
  • a molecule that exhibits an effect opposite to this and is inactivated (suppressed) when exerting a neuroprotective effect is referred to as “neurodegeneration-inducing molecule”. Body, calcium, or GSK3 ⁇ .
  • lipoprotein receptor is a receptor of the lipoprotein receptor family that binds to apoprotein E in the central nervous system, and includes, for example, LRP1 receptor, LDL receptor, ApoER2 receptor, VLDL receptor, LR11 receptor, LRP4 receptor, LRP1B receptor, Megalin receptor, LRP5 receptor, LRP6 receptor and the like.
  • the present invention also provides a neurodegeneration inhibitor such as an apoptosis inhibitor containing an apolipoprotein E-containing lipoprotein, a lipoprotein receptor, a neuroprotective factor, and a neurodegeneration inducer as an active ingredient, such as glaucoma
  • a neurodegeneration inhibitor such as an apoptosis inhibitor containing an apolipoprotein E-containing lipoprotein, a lipoprotein receptor, a neuroprotective factor, and a neurodegeneration inducer as an active ingredient, such as glaucoma
  • a neurodegeneration inhibitor such as an apoptosis inhibitor containing an apolipoprotein E-containing lipoprotein, a lipoprotein receptor, a neuroprotective factor, and a neurodegeneration inducer as an active ingredient, such as glaucoma
  • a neurodegeneration inhibitor such as an apoptosis inhibitor containing an apolipoprotein E-containing lipoprotein, a lipoprotein receptor, a neuroprotective factor
  • the present invention provides, as another aspect, prevention of neurological diseases utilizing an apolipoprotein E-containing lipoprotein or a neuroprotective mechanism via a lipoprotein receptor, a neuroprotective factor, or a neurodegeneration inducer in an in vivo system.
  • the object is to provide a therapeutic agent and a method for preventing and treating neurological diseases.
  • the present invention provides a therapeutic agent for neurological diseases, characterized in that the lipoprotein contains at least apolipoprotein E-containing lipoprotein.
  • the apolipoprotein E-containing lipoprotein includes, for example, a glial cell-derived apolipoprotein E-containing lipoprotein, an apolipoprotein E-containing lipoprotein-containing lipoprotein separated from blood, or an artificially reconstituted apolipoprotein E-containing lipoprotein.
  • apolipoprotein E-containing lipoprotein selected from proteins and neuroprotective molecules such as lipoprotein receptor, phospholipase C, protein kinase C ⁇ , and neurodegeneration inducers such as NMDA receptor, calcium, or GSK3 ⁇ Etc. are provided.
  • the present invention also provides a complex in which the apolipoprotein E-containing lipoprotein is bound to a neuroprotective molecule and / or a neurodegeneration-inducing molecule containing a lipoprotein receptor.
  • the present invention provides, as another form, a neurodegeneration inhibitor wherein the lipoprotein uses activation of a neuroprotective molecule via a lipoprotein receptor and inactivation of a neurodegeneration-inducing molecule as a neuroprotective mechanism.
  • An agent for preventing and treating neurological diseases effective for the prevention and treatment of neurological diseases caused by neurodegeneration such as
  • the present invention provides a neuronal apoptosis inhibitor that suppresses apoptosis of neurons, and also provides a prophylactic / therapeutic agent for glaucoma or diabetic retinopathy that suppresses optic nerve degeneration, for example. .
  • activation of a neuroprotective molecule via the lipoprotein receptor and inactivation of a neurodegeneration-inducing molecule are caused by neurodegeneration using a neuroprotective mechanism.
  • a method for preventing and treating neurological diseases effective for the prevention and treatment of diseases such as a method for inhibiting apoptosis of nerve cells.
  • the present invention provides an apolipoprotein E-containing lipoprotein that binds to the lipoprotein receptor, activation of a neuroprotective molecule via the lipoprotein receptor, Provided is a method for preventing and treating neurological diseases using inactivation of degeneration-inducing molecules as a neuroprotective mechanism.
  • the apolipoprotein E-containing lipoprotein has a nerve cell protective action against apoptosis not only in an in vitro system but also in an in vivo system. Therefore, this invention is expected to contribute to the development of preventive and therapeutic agents for glaucoma and the like because it can suppress neurodegeneration in neurodegenerative diseases, for example, apoptosis of optic nerve cells. Further, since it has a neuroprotective effect not only on optic nerve cells but also on cerebral cortical neurons, it is expected to contribute to the development of preventive and therapeutic drugs for Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • Example 11 which is a figure which shows the formation promotion effect
  • Example 12 which is a figure which shows the inhibitory effect of the retinal ganglion cell death of a GLAST-KO mouse (normal-tension glaucoma model) by intravitreal administration of the lipoprotein containing apolipoprotein E.
  • the figure which shows that the mixture of glutamic acid and glycine induces apoptosis in RGC (Example 19).
  • the figure which shows the substance which participates in glutamic acid induction neurotoxicity in RGC (Example 20).
  • FIG. 25 shows the recovery of RGC survival in Glast +/ ⁇ and Glast ⁇ / ⁇ mice by E-LP (Example 25).
  • the present inventor has determined that apoptosis of cultured cerebral cortical neurons and retinal ganglion cells in which the apolipoprotein E-containing lipoprotein used in the present invention is induced by glutamic acid in an in vitro system. It is confirmed that it suppresses. In other words, this mechanism is that lipoproteins bind to LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1), a member of the lipoprotein receptor family, to form a complex and suppress the activity of glutamate receptors. It is thought to be caused.
  • LRP1 low density lipoprotein receptor-related protein 1
  • the present inventor determined whether or not the apolipoprotein E-containing lipoprotein of the present invention has a neuroprotective effect even in an in vivo system, by using a GLAST-deficient mouse model animal for glaucoma, which is one of neurodegenerative diseases. Considered using. As a result, it was clarified that apoptosis of retinal ganglion cells can be suppressed by vitreous administration of apolipoprotein E-containing lipoprotein despite the presence of a large amount of mouse lipoprotein in the vitreous humor.
  • the present inventor has found that a small amount of the lipoprotein containing apolipoprotein E according to the present invention is present in a small amount in spite of the presence of a large amount of lipoprotein originally bound with lipid and apoprotein. It was confirmed that the apolipoprotein E-containing lipoprotein of the present invention can suppress apoptosis of retinal ganglion cells by injection into the vitreous body.
  • the apolipoprotein E-containing lipoprotein of the present invention can suppress neurodegeneration, particularly apoptosis of nerve cells among neurological diseases, not only in in vitro systems but also in in vivo systems. became.
  • the apolipoprotein E-containing lipoprotein according to the present invention is an apolipoprotein-binding lipoprotein in which apolipoprotein E, which is a kind of apolipoprotein, and a lipid are chemically associated.
  • apolipoprotein E-containing lipoproteins include glial cell-derived apolipoprotein E-containing lipoproteins, apolipoprotein E-containing lipoprotein-containing high-density lipoproteins separated from blood, and artificially reconstituted apolipoprotein E-containing lipoproteins And so on.
  • the high-density lipoprotein separated from blood is a fraction (solution) of various high-density lipoproteins including apolipoprotein E-containing lipoprotein.
  • a molecule involved in the neuroprotective effect of the apolipoprotein E-containing lipoprotein which is activated by the apolipoprotein E-containing lipoprotein and exhibits a neuroprotective effect
  • a neurodegeneration-inducing molecule that is activated (suppressed) to exert a neuroprotective effect.
  • the neuroprotective molecule include lipoprotein receptor, phospholipase C, protein kinase C ⁇ , and the like.
  • examples of the neurodegeneration-inducing molecule include NMDA receptor, calcium, GSK3 ⁇ , and the like.
  • the lipoprotein receptor is a receptor of the lipoprotein receptor family that binds to apoprotein E in the central nervous system.
  • LRP1 receptor LDL receptor, ApoER2 receptor, VLDL receptor, LR11
  • LRP4 receptors LRP1B receptors
  • Megalin receptors LRP5 receptors, LRP6 receptors, etc.
  • LRP1 receptors are particularly preferred.
  • an apolipoprotein E-containing lipoprotein or a lipoprotein receptor is used.
  • Neurodegeneration inhibitors that use neuroprotective mechanisms as active ingredients or mechanisms of action such as neurodegenerative inhibitors such as neuronal apoptosis inhibitors / treatments It can be applied as an agent. Examples of such neurodegeneration inhibitors include preventive or therapeutic agents for glaucoma or diabetic retinopathy.
  • the neurological disease preventive / therapeutic agent according to the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the dosage form include tablets, capsules, fine granules, pills, troches, infusions, Injectables, eye drops, suppositories, ointments, patches and the like can be mentioned.
  • parenteral administration particularly administration by vitreous injection is preferable.
  • Ophthalmic compositions such as ophthalmic injections are preferred.
  • a physiological saline mixed with other water-soluble additives and chemicals as necessary can be used.
  • additives added to such water nutrients such as alkali metal ions such as potassium and magnesium, lactic acid, various amino acids, fats, glucose, fructose, saccharose and other carbohydrates, vitamins A, B, C, Examples include vitamins such as D, phosphate ions, chloride ions, hormones, plasma proteins such as albumin, polymer polysaccharides such as dextrin and hydroxyethyl starch, and the like.
  • the concentration of the compound in such an aqueous solution is preferably in the range of 10 ⁇ 7 M to 10 ⁇ 5 M.
  • the neurological disease preventive / therapeutic agent according to the present invention can also be administered to a living body as a solid agent.
  • solid agents include powders, fine granules, granules, microcapsules, tablets and the like. Among such solid preparations, it is preferable that the tablet is preferably easy to swallow.
  • a filler and a binder for forming a tablet known ones such as oligosaccharides can be used. It is preferable that the tablet has a diameter of 2 to 10 mm and a thickness of 1 to 5 mm. Moreover, you may mix and use with another therapeutic agent.
  • additives can be added to the solid agent.
  • additives include stabilizers, surfactants, solubilizers, plasticizers, sweeteners, antioxidants, flavoring agents, coloring agents, preservatives, inorganic fillers, and the like.
  • anionic surfactants such as higher fatty acid soap, alkyl sulfate ester salt, polyoxyethylene alkyl ether sulfate salt, acyl N-methyl taurate salt, alkyl ether phosphate ester salt, N-acyl amino acid salt;
  • Cationic surfactants such as alkyltrimethylammonium chloride, dialkyldimethylammonium chloride, benzalkonium chloride, alkyldimethylaminoacetic acid betaine, alkylamidodimethylaminoacetic acid betaine, 2-alkyl-N-carboxy-N-hydroxyimidazolinium betaine
  • Nonionic surfactants such as amphoteric surfactants, polyoxyethylene types, polyhydric alcohol ester types, and ethylene oxide / propylene oxide block copolymers are available, but are not limited thereto.
  • Examples of the inorganic filler to be blended for the purpose of improving swallowing properties include talc, mica, titanium dioxide and the like.
  • Examples of the stabilizer include adipic acid and ascorbic acid.
  • Examples of the solubilizer include surfactants such as sucrose fatty acid ester and stearyl alcohol, asparagine, arginine and the like.
  • Examples of the sweetener include aspartame, amateur, licorice, fennel and the like.
  • suspending agent examples include carboxyvinyl polymer, the antioxidant includes ascorbic acid, the flavoring agent includes sugar flavor, and the pH adjusting agent includes sodium citrate.
  • the neurological disease preventive / therapeutic agent of the present invention is usually administered into the body within a range of 1 to 40 mg, preferably 10 mg to 20 mg, 3 times a day.
  • the prophylactic / therapeutic agent for neurological diseases which is a preferred embodiment is used as an eye drop or an ophthalmic injection
  • various other components are included in the drug as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • pharmacologically active ingredients and physiologically active ingredients may be contained in combination.
  • Such components are not particularly limited.
  • Examples of decongestants include, for example, epinephrine and ephedrine.
  • ⁇ -adrenergic agonists include imidazoline derivatives (such as naphazoline and tetrahydrozoline) and ⁇ -phenylethylamine derivatives (such as phenylephrine, epinephrine, ephedrine, and methylephedrine).
  • Anti-inflammatory components include, for example, indomethacin, berberine, celecoxib, rofecoxib, and the like, and antihistamine or antiallergic components include, for example, chlorpheniramine, diphenhydramine, iproheptin, and other vitamins is, for example, Burutachion and vitamin C, E, etc.
  • amino acids such as leucine, Isoiroishin, valine, methionine, etc., threonine, alanine
  • saccharides such as phenylalanine, tryptophan, lysine, glycine, asparagine and aspartic acid
  • monosaccharides such as glucose (for example, disaccharides such as trehalose, lactose and fructose, oligosaccharides such as lactulose, raffinose and pullulan
  • steroid components such as gum arabic, karaya gum, xanthan gum, guar gum, and tragacanth polysaccharides include hydrocortisone and prednisolone.
  • the agent for preventing or treating neurological diseases according to the present invention can be formulated by a formulation technique commonly used in the art. That is, the neurological disease preventive / therapeutic agent of the present invention uses apolipoprotein E-containing lipoprotein, which is the active ingredient of the present invention, as a stabilizer, plasticizer, antioxidant, sweetener, flavoring agent, preservative, inorganic filler. It can be formulated into a predetermined dosage form by mixing with an excipient such as an agent.
  • the present invention also relates to activation of a neuroprotective molecule via apolipoprotein E-containing lipoprotein or lipoprotein receptor according to the present invention, and inactivation of a neurodegeneration-inducing molecule as an active ingredient or action mechanism.
  • the preventive / therapeutic agent for neurological diseases contained as an introduction to neurological diseases, particularly neurodegenerative diseases it is possible to provide a method for preventing / treating neurological diseases that can prevent / treat neurological diseases. That is, the method for preventing / treating a neurological disease according to the present invention comprises the agent for preventing / treating the neurological disease according to the present invention in the form of tablets, capsules, fine granules, pills, lozenges, orally or infusions, injections. It consists of parenteral administration in dosage forms such as drugs.
  • rabbit polyclonal anti-LRP1 antibody (material) Among the materials used in the present invention, rabbit polyclonal anti-LRP1 antibody (R2629) is a D.I. K. Provided by courtesy of Dr. D. K. Strickland (University of Baltimore, MD). Recombinant human apoprotein E3 and apoprotein E4 were purchased from Wako Pure Chemical (Osaka). GLAST-/-mouse colonies were established at Kumamoto University using mice from Tokyo Medical and Dental University (Tokyo). All experimental methods were approved by the Kumamoto University Animal Handling Committee.
  • Isolated retinal ganglion cells in RGC medium (1 mM glutamine, 5 ⁇ g / ml insulin, 60 ⁇ g / ml N-acetylcysteine, 62 ng / ml progesterone, 16 ⁇ g / ml putrescine, 40 ng / ml sodium selenite Salt, 0.1 mg / ml bovine serum albumin, 40 ng / ml triiodothyronine, 0.1 mg / ml transpherin, 1 mM pyruvate sodium salt, 2% B27 supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ⁇ M forskolin (Sigma, St.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • RGC RGC was added to each well for 96-well plates. 5,000 cells per cell, each for microdish 5,000 cells per insert, or mounted so as to partition 15,000 cells per dish for culture. Followinged by at least 10 days of culture prior to the experiment.
  • the glial cell-derived lipoprotein was isolated from a medium prepared for glial cells.
  • Glial cells were prepared from cerebral cortex of 2 day old SD rats and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum. Glial cell media was concentrated to> 80% astrocytes (Hayashi et al., J Biol Chem 2009).
  • the glial cells were cultured in RGC culture medium containing no forskolin, BDNF, CNTF and bFGF for 3 days. This culture medium was used as a glial cell preparation medium.
  • This example is an experiment showing that the glial cell-derived apoprotein E-containing lipoprotein obtained in Example 2 suppresses apoptosis of retinal ganglion cells caused by glutamic acid.
  • Retinal ganglion cells primary cultured from 2 days old rats in Example 1 were cultured for 14 days or more, and glial cell-derived apoprotein E-containing lipoproteins obtained in Example 2 were induced to induce apoptosis of retinal ganglion cells by glutamate.
  • An experiment was carried out according to the following method as to whether or not it has an action of suppressing the above. The result is shown in FIG.
  • Cont represents an untreated group
  • Glu represents a 300 ⁇ M glutamic acid addition group
  • + glial LP represents a 300 ⁇ M glutamic acid + glia cell-derived apolipoprotein E addition group.
  • Glial® LP was added at a concentration of 1 ⁇ g cholesterol / ml.
  • the percentage of apoptotic cells was calculated by observing nuclear aggregation (a: nuclear staining with Hoechst33342) or esterase activity / membrane permeability retention (b: calcein AM / Propidium Iodide staining) 24 hours after treatment. .
  • the glial cell-derived apoprotein E-containing lipoprotein significantly suppressed the apoptosis of retinal ganglion cells induced by glutamate (* p ⁇ 0.05: Glu vs. Glu + glial LP).
  • This example is an experiment showing that the glial cell-derived apoprotein E-containing lipoprotein obtained in Example 2 suppresses apoptosis of cerebral cortical neurons caused by glutamic acid.
  • Cortical neurons cultured primarily from embryonic 16-day-old rats are cultured for 6 days, and the glial cell-derived apoprotein E-containing lipoprotein obtained in Example 2 suppresses apoptosis of cerebral cortical neurons by glutamate
  • the experiment was conducted in substantially the same manner as in Example 3. The result is shown in FIG.
  • Cont represents an untreated group
  • Glu represents a 300 ⁇ M glutamic acid addition group
  • + glial LP represents a 300 ⁇ M glutamic acid + glia cell-derived apolipoprotein E addition group.
  • Glial LP was added at a concentration of 1 ⁇ g cholesterol / ml.
  • the proportion of apoptotic cells was calculated by observing nuclear aggregation after staining with Hoechst33342 at 24 hours after treatment. As a result, it was found that the glial cell-derived apoprotein E-containing lipoprotein significantly suppressed the apoptosis of cerebral cortical neurons induced by glutamate (* p ⁇ 0.0001: Glu vs. Glu + glial LP).
  • Mouse plasma HDL or rat plasma HDL was isolated from abdominal aortic blood of C57BL / 6J mice or SD rats, respectively.
  • Example 3 an experiment was conducted in the same manner as in Example 3 to determine whether high-density lipoprotein (HDL) (isolated from rat blood in Example 5 inhibits apoptosis of retinal ganglion cells caused by glutamic acid.
  • HDL high-density lipoprotein
  • Example 5 an experiment was conducted in the same manner as in Example 3 to determine whether high-density lipoprotein (HDL) (isolated from rat blood in Example 5 inhibits apoptosis of retinal ganglion cells caused by glutamic acid.
  • HDL isolated from rat blood suppressed apoptosis induced by the same method as in Example 3 (see FIG. 3 * p ⁇ 0.05: Glu vs. Glu + HDL).
  • HDL was added at a concentration of 1 ⁇ g cholesterol / ml.
  • Apoptotic cells were calculated from nuclear staining with Hoechst 33342.
  • E-LP apoprotein E-containing lipoprotein
  • POPC 1-palmitoyl-2-oleyl-glycerophosphocholine
  • cholesterol C3045, Sigma
  • molar ratio 100: 10: 1 or 100: 0: 1.
  • Preparation media, plasma or solutions containing reconstituted apoprotein E-containing lipoproteins were subjected to a discontinuous sucrose gradient.
  • the composition of the solution used was 3 ml for a density of 1.30 g / ml, 3 ml for a density of 1.2 g / ml, 3 ml for a density of 1.1 g / ml, and 6 ml for a density of 1.006 g / ml.
  • the sucrose gradient was centrifuged at 100,000 g at 4 ° C. for 72 hours using an SRP28SA1 rotor (Hitachi, Tokyo, Japan). Ten fractions (1.5 ml) were collected from the top of the gradient and immunoblotted for apoprotein E as follows.
  • apoprotein E Fractions containing apoprotein E (typically fractions 5-7) were merged and Amicon Ultra filter (100 kDa or 50 kDa molecular weight cutoff; Millipore, Bedford, MA). The amount of lipoprotein is determined by the cholesterol concentration (2 ⁇ g / ml) for HDL, and the protein concentration (100 ng / ml). The cholesterol and protein concentrations were measured with LabAssay cholesterol kit (Wako) and BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL), respectively.
  • Example 3 an experiment was conducted in the same manner as in Example 3 to determine whether or not apoptosis of retinal ganglion cells caused by reconstituted lipoprotein (LP) containing human apoprotein E3 obtained in Example 7 and glutamic acid was suppressed.
  • LP lipoprotein
  • LP reconstituted lipoprotein
  • Human apoprotein E3 was added at a concentration of 100 ng protein / ml.
  • Apoptosis-like cells were calculated from nuclear staining with Hoechst33342.
  • a neurodegeneration-inducing molecule such as NMDA receptor, calcium, calpain, calcineurin, and caspase is involved in the apoptosis of retinal ganglion cells induced by glutamate is similarly performed according to the method of Example 3.
  • the results are shown in FIG. 5 (* p ⁇ 0.05: Glu vs. Glu + MK801, ALLN, FK506 or Z-VAD).
  • (a) shows that apoptosis is inhibited by MK801 (10 ⁇ M), an inhibitor for N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA receptor).
  • (B) shows that apoptosis due to glutamic acid was not induced in a culture solution not containing calcium.
  • apoptosis was inhibited by the calpain inhibitor ALLN (1 ⁇ M), but dimethylsulfoxide (DM) dissolving ALLN did not show an inhibitory effect.
  • (D) shows that apoptosis was inhibited by the calcineurin inhibitor FK506 (1 ⁇ M).
  • (E) shows that apoptosis was inhibited by the caspase inhibitor Z-VAD-FMK (20 ⁇ M). Apoptosis-like cells were calculated from nuclear staining with Hoechst33342.
  • reconstituted lipoprotein (LP) ⁇ ⁇ containing human apoprotein E3 protects retinal ganglion cells via LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1), and GSK3 ⁇ is involved in the mechanism (See FIG. 6. * p ⁇ 0.05: Glu + LP vs. Glu + LP + anti-LRP1).
  • FIG. 6a shows that the neuroprotective effect of reconstituted lipoprotein (LP) containing human apoprotein E3 was inhibited by antibody (10 ⁇ g / ml) against LRP1, but not by normal IgG. Apoptosis-like cells were calculated by nuclear staining with Hoechst33342.
  • FIG. 6b also shows that reconstituted lipoprotein (LP) ⁇ containing human apoprotein E3 restored the phosphorylation level of glycogen synthase kinase 3 ⁇ (GSK3 ⁇ ).
  • LP lipoprotein
  • GSK3 ⁇ glycogen synthase kinase 3 ⁇
  • Rabbit anti-phosphorylated GSK3 ⁇ (p-GSK3 ⁇ ) antibody and rabbit anti-GSK3 ⁇ antibody were used for Western blot.
  • LP lipoprotein
  • IP immunoprecipitation sputum
  • Rabbit anti-NMDA receptor 2B antibody was used for immunoprecipitation, and Western blotting of LRP1 and NMDA receptor 2B was performed.
  • This example is an experiment to examine whether reconstituted lipoprotein (LP) containing human apoprotein E3 suppresses retinal ganglion cell death in GLAST-deficient mice, a normal-tension glaucoma model.
  • LP 100 ng protein / ml
  • phosphate buffer control group
  • LP suppresses apoptosis of retinal ganglion cells despite the presence of a large amount of mouse LP in the vitreous. This mechanism is thought to be due to lipoprotein binding to LRP1, which is one of the lipoprotein receptor families, forming a complex and inhibiting the activity of glutamate receptors.
  • apoprotein E-LP 1.5 ⁇ g protein / ml
  • HDL 30 ⁇ g cholesterol / ml
  • injections were made using a 33-gauge nanopass needle (Terumo, Tokyo, Japan) attached to a 10 ⁇ l Hamilton syringe (Hamilton, Bonaduz, Switzerland), and the vitreous body of the other eye was injected with the same amount of PBS. This operation was carefully performed under a stereomicroscope so as not to damage the lens and retina. The vitreous humor was also collected using the same needle as the intravitreal injection.
  • the immunoblotting used in the above examples was performed as follows. That is, the lipoprotein obtained in each of the above examples was dissolved in 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 5% ⁇ -mercaptoethanol (sample buffer). Boiled for 5 minutes. The obtained protein was separated by electrophoresis using 0.1% SDS-containing polyacrylamide gel and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane.
  • the membrane was then incubated with 5% skimmed milk containing TBS-T (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20) for 1 hour at room temperature, and then 5% bovine serum albumin was added. Probed overnight with primary antibody in TBS-T. Subsequently, the membrane was probed with peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Thermo), goat anti-mouse IgG (Thermo) or mouse anti-goat IgG (Thermo) for an additional hour at room temperature.
  • TBS-T 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20
  • Immunoreactive proteins were visualized with chemiluminescence analysis methods GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) or Super Signal West Dura (Thermo).
  • the primary antibodies used were as follows: mouse anti- ⁇ -actin (a5441, dilution 1: 10,000, Sigma), goat anti-human apoprotein E (k74190g, dilution 1: 5000, Biodesign, Saco, ME), goat anti Mouse apoprotein E (sc-6384, dilution 1: 1000, Santa Cruz), rabbit anti-human GSK3 ⁇ and phospho-Ser 9-GSK3 ⁇ (9315 and 9336S, dilution 1: 1000, Cell signaling Technology, Danvers, MA), goat anti-human Brn-3a (sc-31984, dilution 1: 1000, Santa Cruz), rabbit anti-human LRP1 (2703-1, dilution 1: 1000, Epitomics), mouse anti-human LRP1 (545503, dilution 1: 1000, R & D systems, Minneapolis , MN),
  • RGC immunocytochemistry Cultured RGCs were washed twice with phosphate buffered saline (PBS) and fixed with acetone for 10 minutes at 4 ° C. RGCs were then blocked with 1% bovine serum albumin and 5% goat serum in PBS for 1 hour at room temperature, followed by rabbit anti-human LRP1 (dilution 1: 2000, Epitomics), mouse anti-NMDAR2B (32-0700 , Dilution 1: 500, Invitrogen), mouse anti-rat cytochrome c (556432, dilution, 1: 3000, BD Biosciences) in PBS (containing 1% bovine serum albumin and 5% goat serum) at room temperature Cultured for 1 hour.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the obtained cells were washed three times with PBS, and then Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (dilution 1: 200, Invitrogen), Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (dilution 1: 200, Invitrogen) or The cells were cultured for 1 hour at room temperature using Alexa Fluor 594-conjugated anti-mouse IgG (dilution 1: 200, Invitrogen).
  • the obtained RGC was washed three times with PBS, and then an immune response was initiated using Fluormount / Plus (Japan Tanner, Osaka, Japan).
  • CMXRos MitoTracker Red CMXRos
  • RGC was prepared by washing twice with Hank's balanced salt solution (HBSS) containing 2.4 mM CaCl 2 , 20 mM HEPES and not containing magnesium, and adding 300 ⁇ M glutamate and 10 ⁇ M glycine to the Hanks balanced salt solution.
  • the cells were cultured in the medium at 37 ° C. for 2 hours.
  • RGCs were cultured for 22 hours at 37 ° C. in RGC culture medium without forskolin, BDNF, CNTF and bFGF.
  • RGCs were stained with 1 ⁇ g / ml Hoechst 33342 (346-07951, Dojindo, Kumamoto, Japan) or 1 ⁇ g / ml calcein-AM / propidium iodide (341-07381, Dojindo).
  • the fluorescence image was observed using an Olympus IX71 microscope.
  • Fragmented or aggregated nuclei stained with the Hoechst reagent were counted as apoptotic nuclei, and round and smooth nuclei were counted as healthy nuclei. Since healthy nuclei were not stained with propidium iodide, nuclei stained with propidium iodide were counted as apoptotic nuclei. More than 300 nuclei in each group were counted.
  • RGCs were cultured on a microdish for at least 14 days, and then cultured at 37 ° C. for 30 minutes using 3 ⁇ M Fluo-8 acetoxymethyl ester (AAT® Bioquest, Sunnyvale, CA). The obtained cells were washed twice with 500 ⁇ l of the above HBSS, and then 300 ⁇ M glutamate and 10 ⁇ M glycine were injected. Fluorescence images were taken every 500 msec using an ORCA-R2 digital CCD camera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan), and analyzed using MetaFluor fluorescence, imaging software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
  • RGC compartmental culture was performed as follows.
  • RGCs were prepared according to methods described in known literature (Hayashi et al., J Biol Chem 2004). After coating micro-dish with poly-d-lysine and laminin, scratch the surface of the dish to make 20 parallel grooves, and attach Teflon (registered trademark) 3-compartment divider on the dish with silicone grease did.
  • Teflon registered trademark 3-compartment divider on the dish with silicone grease did.
  • RGC culture medium containing 25 ng / ml BDNF and 25 ng / ml CNTF was added, and then 10,000-15,000 RGC cells were seeded per dish.
  • RGC culture medium containing 75 ng / ml BDNF, 25 ng / ml CNTF and 50 ng / ml bFGF was placed in both compartments. RGC axons penetrated the compartments on both sides beyond the silicone grease within 5 days. Prior to the start of the experiment, RGC compartment culture was performed for at least 14 days.
  • the immunoprecipitation method was performed as follows.
  • the co-immunoprecipitation method uses RGC lysate in a complete EDTA-free mixture of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 and 1% Triton X-100.
  • the reaction was performed according to the method of May et al. (May et al., 2004) using a mixture of protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany) and PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail (Roche).
  • RGCs were washed once with HBSS and collected in 96 well plates using 40 ⁇ l lysis buffer per well.
  • the lysates from 9-12 wells were combined for each group.
  • the RGC lysate was centrifuged 15 times through a 22-gauge injection needle at 15,000 ⁇ g, 4 ° C. for 15 minutes.
  • the resulting supernatant was pretreated with 40 ⁇ l of 50% equilibrated protein G-Sepharose (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) for 1 hour at 4 ° C., and Sepharose beads were removed by centrifugation.
  • rabbit anti-LRP1 antibody diilution 1: 200; 2703-1, Epitomics, Burlingame, CA
  • rabbit anti-NR2B antibody diilution 1: 200; AB1557, Millipore
  • FIG. 9A shows treatment after control (C; HBSS) or with glutamic acid alone (Glu ( ⁇ ); 300 ⁇ M glutamate), glycine alone (Gly ( ⁇ ); 10 ⁇ M glycine) or glutamic acid + glycine (Glu; 300 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine) Shown are fragmented or contracted nuclei in RGC detected after 24 hours by Hoechst staining. Data are the mean +/ ⁇ SE values of 4 independent experiments (*: p ⁇ 0.001 (C vs Glu)).
  • FIG. 9B shows that control (C; HBSS) or glutamic acid + glycine (Glu; 300 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine) was not washed with HBSS and washed with Hoechst after 24 hours after washing once, twice or three times for 15 minutes. Shown are fragmented or contracted nuclei in RGC detected.
  • FIG. 9C shows fluorescence images of RGCs stained with Annexin V-EGFP, propidium Iodide and Hoechst 12 hours after treatment with control or glutamic acid + glycine (Glu; 30 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine). The scale bar is 20 ⁇ m.
  • FIG. 9D shows RGCs immunostained with anti-cytochrome c (Cyto C) 12 hours after control or Glu treatment of RGCs treated with 2 nM MitoTracker Red (Mito). The scale bar is 20 ⁇ m.
  • FIG. 10A cells were incubated with glutamate in the absence of Ca 2+ (no Ca 2+) or presence (Ca 2+).
  • 10B RGC is 10 ⁇ M MK801 (NMDA receptor inhibitor)
  • FIG. 10C is 1 ⁇ M ALLN (calpain inhibitor)
  • FIG. 10D is 1 ⁇ M FK506 (calcineurin inhibitor)
  • FIG. 10E is 200 ⁇ M MK801 (Bax-inhibitory peptide V5; BIP -V5; inhibitor of Bax), in FIG.
  • the present inventor has previously reported that the induction of apoptosis of RGC by the removal of nutritional adducts is suppressed by glial E-LP. Therefore, in this example, it was examined whether lipoproteins prevent glutamate-induced apoptosis.
  • Glia-derived E-LP, plasma HDL and reconstituted E-LP were extracted as follows. First, glia were extracted from cerebral cortex of 2-day-old Sprague® Dawley rats, digested with 0.25% trypsin, and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum. Glia was cultured for 3 days in the same medium used for RGC (but not including forskolin, brain-derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor). The obtained culture solution was centrifuged at 1000 ⁇ g for 10 minutes, and the resulting supernatant was used as a glia-conditioned medium.
  • E-LP Mouse or rat HDL was isolated from blood drawn from the abdominal aorta of C57BL / 6J mice or Sprague Dawley rats.
  • Reconstituted E-LP was prepared by literature methods. To reconstituted E-LP, 1-palmitoyl-1-oleoyl-glycerophosphocholine, cholesterol and recombinant human apo E were added in a molar ratio of 100: 10: 1 or 100: 0: 1.
  • Glia conditioned medium, plasma or reconstituted lipoprotein was centrifuged for 72 hours at discontinuous sucrose gradient 100000xg, 4 ° C with the following solutions: density 1.30 g / ml (3ml), density 1.2 g / ml (3ml), density 1.1 mg / ml (3 ml) and density 1.006 mg / ml (6 ml).
  • the top 10 fractions of the gradient (1.5 ml) were collected and immunoblotted for apoE. ApoE-containing fractions were concentrated and then adjusted to cholesterol concentration (2 ⁇ g / ml) for glial E-LP as well as HDL or protein concentration (100 ng / ml) for reconstituted lipoprotein.
  • the cholesterol concentration and protein concentration of lipoproteins were measured using LabAssay cholesterol kit (Wako Pure Chemical) and BCA protein assay kit (Termo Fisher Scientific, IL). ⁇ 2 macroglobulin was activated by treatment with 100 mM methylamine at room temperature for 1 hour.
  • RGC apoptosis was measured as follows. Primary cultured RGCs were grown at 37 ° C using Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) containing 2.4 mM CaCl 2 without magnesium and 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES). Incubated twice for 15 minutes and washed. Magnesium was excluded from the wash solution because the NMDA receptor was blocked. Thereafter, RGC was cultured in HBSS containing 2.4 mM CaCl 2 and 20 mM HEPES (magnesium-free) without treatment with 300 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine (NMDA receptor coactivator) at 37 ° C. for 2 hours.
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid
  • lipoproteins derived from glia (2 ⁇ cholesterol / ml) extracted from glial conditioned medium (GLP) and HDL extracted from rat plasma (2 ⁇ cholesterol / ml) prevent RGCs from glutamate-induced toxicity.
  • human apo E3 and E4 isoforms affect neurodegeneration, particularly neurodegeneration in Alzheimer's disease.
  • no difference was observed in the neuroprotective effect of human apoE3 and E4 containing lipoprotein in glutamic acid-treated RGC.
  • FIG. 11A shows apoE in lipoprotein (2 ⁇ cholesterol / ml) extracted from glial conditioned medium (GLP), apoE in HDL (2 ⁇ cholesterol / ml) extracted from rat plasma, and lipoprotein containing reconstituted human apoE.
  • Immunoblots against protein (E-LP) 100 ng protein / ml) are shown.
  • RGCs were incubated with GLP, HDL or E-LP for 15 minutes, and then Glu was added. *: P ⁇ 0.005 (Glu vs. Glu + GLP, Glu + HDL or Glu + E-LP).
  • FIG. 11B shows the dose-dependent protective effect of E-LP against Glu-induced neurotoxicity.
  • RGC was incubated with E-LP for 15 minutes, and then Glu was added.
  • FIG. 11C shows lipid-free apo E (100 ng protein / ml), cholesterol chol (11 ng / ml), phosphatidylcholine + cholesterol (PC + chol) liposomes (11 ng cholesterol / ml), PC + apoE liposomes ( 100 ng protein / ml), ApoE-containing E-LP, cholesterol and phosphatidylcholine (100 ng protein / ml and 11 ng cholesterol / ml), or HDL (MsHDL) (2 ⁇ g cholesterol / ml) from mouse plasma, Glu was added. * And **: p ⁇ 0.001 and p ⁇ 0.0001 (Glu vs.Glu + lipoprotein).
  • FIG. 11D RGCs were incubated with reconstituted apoE3-containing liposomes (E3-LP) or apoE4-containing liposomes (E4-LP) (100 ng protein / ml) for 15 minutes, and then Glu was added. *: P ⁇ 0.001 (Glu vs. Glu + E3-LP or E4 + LP).
  • RGCs were labeled with Fluo-8 acetoxymethyl ester for 30 minutes, and then Glu (300 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine) was added.
  • the fluorescence ratio image (ratio image) is as displayed in the color indicated by the color index shown in the lower part of FIG. 12A. This color represents a ratio 0 and a ratio 2 corresponding to the basal fluorescence intensity (ratio 1) before Glu stimulation.
  • the left and right panels show Glu and Glu + E-LP, respectively. This data is from one of eight experiments that showed similar results.
  • the scale bar is 80 ⁇ m.
  • FIGS. 12B and C are diagrams showing changes in Fluo-8 fluorescence by ⁇ F / F0.
  • F0 is the basal fluorescence intensity before Glu stimulation.
  • RGC is 100 ng protein / ml E-LP, 10 ⁇ M MK801, 100 ng protein / ml E-LP + 10 ⁇ M MK801, 100 ng protein / ml E-LP + 10 ⁇ g / ml anti-LRP1 antibody or 100 ng protein / ml E-LP + 10 ⁇ g / mg IgG After incubation for 15 minutes, the indicated amount of Glu was added.
  • FIG. 12D shows the ratio of fragmented or contracted nuclei detected by Hoechst staining after control (HBSS) or after treatment with glutamic acid + glycine (Glu; lu300 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine) for 24 hours.
  • HBSS Hoechst staining after control
  • glutamic acid + glycine glutamic acid + glycine
  • FIGS. 12E and F show the results of immunoprecipitation using an antibody of LRP1 (E) or NMDA receptor subunit NR2B (F) from a culture solution of RGC untreated or treated with E-LP.
  • the immunoprecipitate (pellet) and supernatant were probed with antibodies against LRP1, NR2B or NR2A.
  • This data is the mean ⁇ SE of one experiment, three experiments with similar results.
  • FIG. 13A is a graph showing the ratio of fragmented or contracted nuclei detected by Hoechst staining 24 hours after treatment with control (HBSS) or glutamic acid + glycine (Glu; 300 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine).
  • RGCs were incubated with E-LP (100 ng protein / ml) or E-LP + U (5 ⁇ M U73122, phosphoribose C inhibitor) for 15 minutes, and then Glu was added. This data is the mean ⁇ SE of 5 experiments. *: P ⁇ 0.005 (Glu + E-LP vs Glu + E-LP + U).
  • FIG. 13B is a diagram showing protein kinase C ⁇ knocked down by PKC ⁇ siRNA in RGC.
  • RGCs were cultured for 6 days with 300 nM negative control (NC) or PKC ⁇ siRNA, and PKC ⁇ was detected by immunoblotting.
  • ⁇ -actin was used as an internal control. Fragmented or contracted nuclei were detected by negative control (NC) or PKC ⁇ siRNA knockdown, C, Glu or Glu + E-LP treatment, and 24 hours later, Hoechst staining. Data are the mean ⁇ SE of 5 experiments. *: P ⁇ 0.05 (Glu + E-LP + NC vs Glu + E-LP + PKC ⁇ ).
  • FIG. 13C shows that RGCs were collected 16 hours after C, Glu or Glu + E-LP treatment.
  • RGCs were immunoblotted with antibodies against GSK3 ⁇ phosphorylated at Ser9 (p-GSK3 ⁇ ) or total GSK3 ⁇ . Quantification of Ser9 phosphorylation of GSK3 ⁇ is shown from four experiments. *: P ⁇ 0.001 (Glu vs Glu + E-LP).
  • the phase difference image of one track shows that the cell body is localized in the cell body compartment and the axon exists in the right axon compartment.
  • the bottom panel shows RGCs stained with anti-LRP1 or anti-NR2B antibodies.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIGS. 15A and B show anti-Brn ⁇ retinas of 3 week old (3w) or 6 week old (6w) Glast ⁇ / ⁇ mice (injected with 1 ⁇ l PBS or 1 ⁇ l 1.5 ⁇ g protein / ml E-LP).
  • the results of immunoblotting with 3a antibody or anti- ⁇ -actin antibody (A), GSK3 ⁇ phosphorylated with Ser9 (p-GSK3 ⁇ ) or antibodies against total GSK3 ⁇ (B) are shown.
  • FIG. 15C shows retinal sections from Glast +/ ⁇ and Glast ⁇ / ⁇ mice (3 or 6 weeks old) injected with 1 ⁇ l PBS, 1 ⁇ l 1.5 ⁇ g protein / ml E-LP or 30 ⁇ g cholesterol / ml® HDL. The results of eosin staining are shown. Arrowheads indicate the retinal ganglion cell layer (GCL). The scale bar is 40 ⁇ m. The data was obtained from one retinal section representing 8 sections that showed similar results.
  • FIG. 15D shows 6-week-old wild-type mice (+ / +), 3 weeks old or 6 weeks old that were not injected or injected with 1 ⁇ l PBS, 1 ⁇ l 1.5 ⁇ g protein / ml E-LP or 30 ⁇ g cholesterol / ml® HDL.
  • the number of RGCs in Glast +/ ⁇ mice (+/ ⁇ ) or Glast ⁇ / ⁇ mice ( ⁇ / ⁇ ) Glast +/ ⁇ and Glast ⁇ / ⁇ mice was quantified. Data was obtained from the results of 8 experiments.
  • * P ⁇ 0.05 (PBS v E-LP or HDL; 6-week-old Glast ⁇ / ⁇ mouse).
  • FIG. 16 shows immunoblot results of 5 ⁇ l of vitreous humor and 5 ⁇ l of 100 ng protein / ml E-LP from Glast + / + and Glast-/-mice.
  • FIGS. 17A and B show retinal or vitreous humor from 3 or 6 week old Glast + / + and Glast ⁇ / ⁇ mice, antibodies against apoE, LRP1, ⁇ -actin, ⁇ 2-macroglobulin (a2M), and albumin. The results of immunoblotting with are shown. The arrowhead indicates a2M.
  • FIG. 17A shows the results of four experiments for the quantification of apoE against ⁇ -actin. *: P ⁇ 0.05 (3 week old Glast + / + vs 3 week old Glast ⁇ / ⁇ mouse retina).
  • FIG. 17A shows the results of four experiments for the quantification of apoE against ⁇ -actin. *: P ⁇ 0.05 (3 week old Glast + / + vs 3 week old Glast ⁇ / ⁇ mouse retina).
  • FIG. 17B is the result of three experiments for the quantification of apoE and a2M on albumin. *: P ⁇ 0.05 (3 week old Glast + / + vs 3 week old Glast ⁇ / ⁇ mouse retina). #: P ⁇ 0.05 (3 week old Glast + / + vs 3 week old Glast ⁇ / ⁇ mouse retina).
  • FIG. 17C shows control in the absence or presence of ⁇ 2 macroglobulin (C; HBSS) or glutamic acid treatment (Glu; 300 ⁇ M glutamate + 10 ⁇ M glycine) or Glu + 100 ng protein / ml E-LP and Hoechst 24 hours later. The percentage of fragmented or contracted nuclei detected by staining is shown.
  • FIG. 17D shows the state of RGC added with Glu after culturing with 100 nM100a2M and E-LP (100 -3000 ng protein / ml).
  • the data in FIGS. 17C and D are mean ⁇ SE values from 4 experimental results.
  • the amount of alpha 2 -macroglobulin released from glial cells was examined.
  • Human apo E-containing lipoprotein (100 or 1000 ng / ml) was added to the culture medium of primary cultured glial cells, and the culture supernatant was collected 24 hours later. This culture supernatant was detected by SDS-PAGE, followed by immunoblotting using an anti-alpha 2 -macroglobulin antibody.
  • a decrease in the release amount of alpha 2 -macroglobulin from glial cells was observed with the addition of human apo E-containing lipoprotein (FIG. 18).
  • the present invention relates to an apolipoprotein E-containing lipoprotein and a lipoprotein receptor having a neuroprotective effect such as a neurodegenerative inhibitory effect against various neurodegenerative diseases such as apoptosis of nerve cells.
  • the present invention provides a neurological disease preventive / therapeutic agent using a neuroprotective mechanism and a neurological disease prophylactic / therapeutic method using the same. Therefore, the preventive / therapeutic agent for neurological diseases and the method for preventing / treating neurological diseases of the present invention are useful for the prevention / treatment of neurological diseases such as neurodegenerative diseases.

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Abstract

アポリポ蛋白E含有リポ蛋白、またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を有効成分または作用機序とする神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法を提供すること。この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白および／またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を作用機序とする神経保護機構は、神経細胞のアポトーシス等を本態とする様々な神経変性疾患などの神経疾患における神経細胞のアポトーシスなどの抑制作用などの神経疾患予防・治療効果を有している。したがって、この発明は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白および／またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を作用機序とする神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法を提供する。したがって、この発明の神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法は、アルツハイマー、緑内障、糖尿病性網膜症などの神経疾患の予防・治療に有用である。

Description

リポ蛋白を用いた神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法
　この発明は、リポ蛋白が少なくともアポリポ蛋白Eを含むことを特徴とする神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法に関するものである。更に詳細には、この発明は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、リポ蛋白受容体を介し、神経保護分子を活性化し、かつ神経変性誘導分子を不活化または抑性することを特徴とする神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法に関するものである。
　中高年で発症することが多い、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症などの難治性神経疾患は、いずれも神経細胞内部に異常タンパク質の蓄積が起こり、やがて神経細胞に選択的な細胞死が生じることから、共通の発症機構を持つ神経変性疾患であると考えられている。そこで、神経変性疾患では、おそらく正常細胞のアポトーシス制御機構に異常が生じているものと考えられる。
　神経細胞のアポトーシス等を本態とする様々な神経変性疾患の１つと考えられている疾患に、網膜や視神経の変性疾患が存在する。我が国において、この網膜・視神経の変性疾患は、ほとんどの中途失明の原因であり、今後も進行する我が国の超高齢社会においては、「眼の成人病」ともいえる緑内障や糖尿病性網膜症などの視神経変性疾患による失明を予防することは、急務の重要な課題である。緑内障は、視神経が変性・脱落する進行性の神経変性疾患であって、我が国における第一位、世界においては第二位の失明原因疾患である。視覚は、最も重要な感覚の一つであり、失明に至らない場合でも、視覚障害により生活の質（Quality of Life）が著しく低下する。また、糖尿病性網膜症は、糖尿病の３大合併症の一つとして知られており、先進国の労働者世代における主な失明原因疾患である。これらのことからでも、両疾患に対する新たな治療法の開発は急務とされる。
　上述したように、糖尿病性網膜症および緑内障では、視神経を構成する網膜神経節細胞が障害を受けることが知られているが、いずれの疾患においても詳細な発症メカニズムが明らかになっていないばかりか、一旦発症してしまうと治療が難しいために視機能の維持が極めて困難となり、生活の質の観点からも大きな社会的問題となっている。
　近年、神経細胞を物理的および生理的に支持しているグリア細胞が、様々な神経機能に積極的に関わっていることが明らかになってきている。また、グリア細胞から分泌されるリポ蛋白は、中枢神経系で脂質代謝において重要な役割を演じていることが分かっている（非特許文献１）。
　そこで、本発明者は、視神経疾患における視神経変性の機序解明と治療法の開発を目的として、この網膜神経節細胞を保護する因子としてグリア細胞由来のリポ蛋白に着目し、緑内障や糖尿病性網膜症などの視神経変性における網膜神経細胞死の抑制について鋭意研究を行った。つまり、このグリア細胞由来リポ蛋白が、かかる視神経変性疾患において視神経細胞死を抑制できれば、その他の神経変性疾患の神経変性における神経細胞死についての機序解明や治療法の開発にもつなげることができるものと期待できる。
　その結果、本発明者は、グリア細胞由来アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、アポトーシスに対する神経細胞保護作用を有していることを確認した（非特許文献２）。また、本発明者は、中枢神経系グリア細胞で産生するアポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白 (E-LP)が、ラット網膜神経節ニューロンの栄養剤除去により誘発するアポトーシスを阻止することを確認するとともに、神経細胞死経路に関与するカルシニュ―リン活性化を阻害し、また酸化ストレスによる神経細胞死に対しても保護作用を有することを示した（非特許文献３）。
　上述したように、本発明者は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白がアポトーシスに対する神経細胞保護作用があることを、生体外（in vitro）の系を用いた実験によって確認している。しかし生体内には本来リポ蛋白が多量に存在することから、この実験からでは、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を生体内に実際に使用したときに、果たして、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白がアポトーシスに対する神経細胞保護作用を示すかどうか明らかでないと考えられる。そこで本発明者は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を、リポ蛋白が多量に存在するマウスの硝子体内に注射して、生体内系（in vivo）におけるアポトーシスに対する神経細胞保護作用を示すかどうかを確認した。その結果、本発明者は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、生体内の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有することを見いだした。さらに、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白と、LRP1などの神経保護分子との複合体が、同様に、生体内の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有することを見いだした。したがって、この発明は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白および／またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を作用機序とする神経保護機構が、生体内の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有することを見いだしたことに基づいて完成した。
Hayashi, H., et al., J. Neurosci., February 21, 2007, 27(8):1933-1941 林 秀樹他：神経化学Vol.49 No.2/3 Page 483 (2010) Hayashi, H., et al., J Biol Chem：Vol. 284 No.43 pp. 29605-29613 (2009)
　したがって、この発明は、少なくともアポリポ蛋白E含有リポ蛋白を含むリポ蛋白、またはアポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、リポ蛋白受容体を介し、神経保護分子を活性化、かつ神経変性誘導分子を不活性化または抑制する神経保護機構を利用した神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法を提供することを目的としている。
　なお、本明細書で使用する用語「アポリポ蛋白E含有リポ蛋白」は、アポリポ蛋白Eとリポ蛋白とが化学的に会合している場合の他に、アポリポ蛋白Eとリポ蛋白とが同一媒体中に共存している場合も包含するものとする。
　また、本明細書で使用する用語「神経保護分子」は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、神経保護効果を発揮する際に活性化される分子を意味しており、例えば、リポ蛋白受容体、ホスホリパーゼC、プロテインキナーゼCδなどが挙げられる。また、これとは相反する作用効果を奏する、神経保護効果を発揮する際に不活性化（抑制）される分子を「神経変性誘導分子」とし、かかる神経変性誘導分子としては、例えば、NMDA受容体、カルシウム、またはGSK3βなどが挙げられる。
　さらに、本明細書で使用する用語「リポ蛋白受容体」とは、中枢神経系でアポ蛋白Ｅと結合するリポ蛋白受容体ファミリーの受容体であって、例えば、LRP1受容体、LDL受容体、ApoER2受容体、VLDL受容体、LR11受容体、LRP4受容体、LRP1B受容体、Megalin受容体、LRP5受容体、LRP6受容体などが挙げられる。
　また、この発明は、別の形態として、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白、リポ蛋白受容体、神経保護因子、神経変性誘導因子を有効成分として含有するアポトーシス抑制剤などの神経変性抑制剤、例えば緑内障・糖尿病性網膜症などの予防・治療剤などの神経疾患予防・治療剤、およびアポリポ蛋白E含有リポ蛋白、リポ蛋白受容体、神経保護因子、神経変性誘導因子または神経変性抑制剤などの神経疾患予防・治療剤を用いた神経疾患予防・治療方法を提供することを目的としている。
　さらに、この発明は、別の態様として、生体内の系において、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白または、リポ蛋白受容体、神経保護因子、神経変性誘導因子を介する神経保護機構を利用した神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法を提供することを目的としている。
　上記目的を達成するために、この発明は、リポ蛋白が少なくともアポリポ蛋白E含有リポ蛋白を含むことを特徴とする神経疾患治療剤を提供する。詳細には、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白としては、例えば、グリア細胞由来アポリポ蛋白E含有リポ蛋白、血液から分離したアポリポ蛋白E含有リポ蛋白含有高比重リポ蛋白、または人工再構成アポリポ蛋白E含有リポ蛋白から選ばれるアポリポ蛋白E含有リポ蛋白と、神経保護分子、例えば、リポ蛋白受容体、ホスホリパーゼC、プロテインキナーゼCδ、および神経変性誘導因子、例えば、NMDA受容体、カルシウム、またはGSK3βとの複合体などが提供される。
　また、この発明は、上記アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、リポ蛋白受容体を含む神経保護分子および／または神経変性誘導分子に結合した複合体を提供する。
　さらに、この発明は、別の形態として、上記リポ蛋白が、リポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構として使用する神経変性抑制剤などの、神経変性を原因とする神経疾患の予防・治療に有効な神経疾患予防・治療剤を提供する。また、この発明は、その好ましい態様として、神経細胞のアポトーシスを抑制する神経細胞アポトーシス抑制剤を提供するとともに、例えば、視神経変性を抑制する緑内障または糖尿病性網膜症などの予防・治療剤を提供する。
　また、この発明は、その別の形態として、上記リポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を用いた神経変性を原因とする神経疾患の予防・治療に有効な神経疾患予防・治療方法、例えば、神経細胞アポトーシス抑制方法などを提供する。
　さらにまた、この発明は、別の形態として、生体内の系において、上記リポ蛋白受容体に結合するアポリポ蛋白E含有リポ蛋白、およびリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構として使用する神経疾患予防・治療方法を提供する。
　この発明は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、生体外（in vitro）の系ばかりではなく、生体内（in vivo）の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有している。したがって、この発明は、神経変性疾患における神経変性、例えば、視神経細胞のアポトーシスを抑制することができることから、緑内障などの予防、治療薬の開発に寄与できるものと期待される。また視神経細胞だけでなく、大脳皮質神経細胞に対しても神経保護効果を有することから、アルツハイマー病やパーキンソン病などの予防、治療薬の開発にも寄与できるものと期待される。
グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白（LP）を用いた、グルタミン酸による神経変性からの網膜神経節細胞の保護効果を示す図である（実施例３）。 グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白（LP）を用いた、グルタミン酸による神経変性からの大脳皮質神経細胞の保護効果を示す図である（実施例４）。 高比重リポ蛋白（HDL）を用いた、グルタミン酸による神経変性からの網膜神経節細胞の保護効果を示す図である（実施例６）。 再構成LPを用いた、グルタミン酸による神経変性から網膜神経節細胞の保護効果を示す図である（実施例８）。 グルタミン酸による神経変性誘導に下記神経変性誘導分子が関わることを示す図である（実施例９）。(a)NMDA受容体 (b)カルシウム(c)カルパイン (d)カルシニューリン(e)カスパーゼ (a)アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を用いた、LRP1を介する神経細胞保護作用を示す図である。(b)アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を用いた、GSK3bのリン酸化レベルの回復作用を示す図である（実施例１０）。 アポリポ蛋白E含有リポ蛋白による、LRP1-NMDA受容体コンプレックスの形成促進作用を示す図である（実施例１１）。 アポリポ蛋白E含有リポ蛋白の硝子体内投与による、GLAST-KOマウス（正常眼圧緑内障モデル）の網膜神経節細胞死の抑制効果を示す図である（実施例１２）。 グルタミン酸とグリシンとの混合物がＲＧＣ中でアポトーシスを誘発することを示す図（実施例１９）。 ＲＧＣ中でのグルタミン酸誘発神経毒性に関与する物質を示す図（実施例２０）。 グルタミン酸誘発アポトーシスを予防するリポタンパク質を示す図（実施例２１）。 LRP1とNMDA受容体との相互反応による細胞内Ca2+の上昇がE-LPによって抑制されることを示す図（実施例２２）。 ホスホリバーゼＣ、プロテインキナーゼCδならびにGSK3βによるグルタミン酸誘発神経毒性に対するE-LPの保護効果を示す図（実施例２３）。 細胞体におけるグルタミン酸誘発アポトーシスを示す図（実施例２４）。 E-LPによるGlast+/-ならびにGlast-/-マウス中のRGC生存の回復を示す図（実施例２５）。 Glast+/+ならびにGlast-/-マウスの硝子体中のアポリポ蛋白Eと、硝子体内に注射したE-LPに含まれるアポリポ蛋白Eの量を比較したプロット結果を示す図（実施例２６）。 E-LPによってα2マクログロブリンの神経保護抑制効果が抑止されることを示す図（実施例２７）。 グリア細胞からのalpha 2-macroglobulin放出量の減少を示す図（実施例２８）。
　上述したように、本発明者は、この発明に使用するアポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、生体外（in vitro）の系において、グルタミン酸により誘導される培養大脳皮質神経細胞および網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することを確認している。つまり、このメカニズムは、リポ蛋白がリポ蛋白受容体ファミリーの一つであるLRP1（low density lipoprotein receptor-related protein 1）に結合して複合体を形成し、グルタミン酸受容体の活性を抑制することに起因すると考えられる。
　そこで本発明者は、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白が生体内（in vivo）の系においても神経保護効果を示すかを、神経変性疾患の１つである緑内障のモデル動物GLAST欠損マウスを使用して検討した。その結果、硝子体液中には多量のマウスリポ蛋白が存在しているにもかかわらず、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白の硝子体投与によって、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制できることを明らかにした。驚いたことに、本発明者は、マウス硝子体中には本来脂質とアポ蛋白が結合したリポ蛋白が多量に存在しているにもかかわらず、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白を少量その硝子体中に注射することによって、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白が網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制できるという格別の作用効果を確認したのである。
　したがって、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白は、生体外の系ばかりではなく、生体内の系においても、神経疾患のうち、神経変性、特に神経細胞のアポトーシスを抑制することができることが明らかになった。
　また、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白は、アポリポ蛋白の１種であるアポリポ蛋白Eと、脂質とが化学的に会合した状態にあるアポリポ蛋白結合リポ蛋白である。かかるアポリポ蛋白E含有リポ蛋白としては、例えば、グリア細胞由来アポリポ蛋白E含有リポ蛋白、血液から分離したアポリポ蛋白E含有リポ蛋白含有高比重リポ蛋白、人工的に再構成したアポリポ蛋白E含有リポ蛋白などを挙げることができる。なお、高比重リポ蛋白は、そのうちの一部がアポリポ蛋白E含有リポ蛋白であり、他にもアポリポ蛋白A1やJ、Dなどを含む高比重リポ蛋白を含んでいる。したがって、血液から分離した高比重リポ蛋白とは、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を含む様々な高比重のリポ蛋白の画分（溶液）である。
　また、この発明において、前述したように、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白の神経保護効果に関わる分子であって、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白により活性化されて神経保護効果を奏する神経保護分子と、不活性化（抑制）されて神経保護効果を奏する神経変性誘導分子とが包含される。神経保護分子としては、例えば、リポ蛋白受容体、ホスホリパーゼC、プロテインキナーゼCδなどが挙げられる。一方、神経変性誘導分子としては、例えば、NMDA受容体、カルシウム、またはGSK3βなどが挙げられる。このうち、リポ蛋白受容体は、中枢神経系でアポ蛋白Ｅと結合するリポ蛋白受容体ファミリーの受容体であって、例えば、LRP1受容体、LDL受容体、ApoER2受容体、VLDL受容体、LR11受容体、LRP4受容体、LRP1B受容体、Megalin受容体、LRP5受容体、LRP6受容体などが挙げられ、これらのうち、LRP1受容体が特に好ましい。
　上述したように、この発明に係るアポリポ蛋白E含有リポ蛋白は、特に生体内の系においても、神経疾患の神経変性を抑制することができることから、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を有効成分または作用機序として利用する神経変性抑制剤、例えば神経細胞アポトーシス抑制剤などの神経疾患予防・治療剤として適用することができる。またかかる神経変性抑制剤としては、例えば、緑内障または糖尿病性網膜症等の予防もしくは治療薬などが挙げられる。
　この発明に係る神経疾患予防・治療剤は、経口的または非経口的に投与することができ、剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤、輸液剤、注射剤、点眼薬、坐剤、軟膏剤、貼付剤などを挙げることができる。なお、この発明の神経疾患予防・治療剤を緑内障・糖尿病性網膜症予防・治療薬として適用する場合には、非経口的投与、特に硝子体注射による投与が好ましく、剤型としては、点眼薬、眼科用注射剤などの眼科用組成物が好ましい。
　この発明の神経疾患予防・治療剤を輸液剤として生体内に投与する際には、生理食塩水に、必要に応じて他の水溶性の添加剤、薬液を配合したものを用いることができる。このような水に添加される添加剤としては、カリウム、マグネシウム等のアルカリ金属イオン、乳酸、各種アミノ酸、脂肪、グルコース、フラクトース、サッカロース等の糖質等の栄養剤、ビタミンA、B、C、D等のビタミン類、リン酸イオン、塩素イオン、ホルモン剤、アルブミン等の血漿蛋白、デキストリン、ヒドロキシエチルスターチ等の高分子多糖類等を挙げることができる。このような水溶液における化合物の濃度は、10-7Mから10-5Mの濃度の範囲とすることが好ましい。
　この発明による神経疾患予防・治療剤はまた、固形剤として生体に投与することができる。固形剤としては、粉末、細粒、顆粒、マイクロカプセル、錠剤等を挙げることができる。このような固形剤の中では、好ましくは嚥下しやすい錠剤の形状をしていることが好ましい。
　錠剤を形成するための充填剤、粘結剤としては公知のもの、例えばオリゴ糖等を使用することが出来る。錠剤の直径は２～１０ｍｍ、厚さは１～５ｍｍの範囲にあることが好ましい。また、他の治療薬と混合して使用してもよい。
　固形剤には通常用いられる種々の添加剤を配合することができる。このような添加剤としては、例えば、安定剤、界面活性剤、可溶化剤、可塑剤、甘味剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤、保存剤、無機充填剤等を挙げることができる。
　界面活性剤としては、高級脂肪酸石鹸、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アシルＮ－メチルタウリン塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、Ｎ－アシルアミノ酸塩等のアニオン界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、２－アルキル－Ｎ－カルボキシ－Ｎ－ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤、ポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤があるが、これらに限定されるものではない。
　嚥下性等の改良等の目的のため配合される無機充填剤としては、例えば、タルク、マイカ、二酸化チタン等を挙げることができる。
　安定剤としては、例えば、アジピン酸、アスコルビン酸等を挙げることができる。可溶化剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリルアルコール等の界面活性剤、アスパラギン、アルギニン等を挙げることができる。甘味剤として、アスパルテーム、アマチャ、カンソウ等、ウイキョウ等を挙げることができる。
　懸濁化剤としては、カルボキシビニルポリマー等を、抗酸化剤としては、アスコルビン酸等を、着香剤としては、シュガーフレーバー等を、ｐＨ調整剤としてはクエン酸ナトリウム等を挙げることができる。
　この発明の神経疾患予防・治療剤は、通常１回１～４０mg、好ましくは１０mg～２０mg、１日３回までの範囲で体内に投与される。
　なお、この発明において、好ましい態様である神経疾患予防・治療剤を点眼薬または眼科用注射剤などとして使用する場合は、その薬剤には、この発明の作用効果を妨げない限り、さらに種々の成分、例えば、薬理活性成分や生理活性成分などが組み合わせて含有されていてもよい。かかる成分は、特に限定されるものではなく、例えば、充血除去成分、α－アドレナリン作動薬成分、抗炎症薬成分、ビタミン類、アミノ酸類、糖類、ステロイド成分、抗ヒスタミン薬成分、抗アレルギー薬成分などが挙げられる。
　充血除去成分としては、例えば、エピネフリン、エフェドリンなど、α－アドレナリン作動薬としては、例えば、イミダゾリン誘導体（ナファゾリン、テトラヒドロゾリンなど）、β－フェニルエチルアミン誘導体（フェニレフリン、エピネフリン、エフェドリン、メチルエフェドリンなど）など、抗炎症薬成分としては、例えば、インドメタシン、ベルベリン、セレコキシブ（celecoxib）、ロフェコキシブ（rofecoxib）など、抗ヒスタミン薬成分または抗アレルギー薬成分としては、例えば、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、イプロヘプチンなど、ビタミン類としては、例えば、ブルタチオンやビタミンＣ，Ｅ，Ｂ6など、アミノ酸類としては、例えば、ロイシン、イソイロイシン、バリン、メチオニンなど、トレオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸など、糖類としては、例えば、グルコース等の単糖類、（例えば、トレハロース、ラクトース、フルクトース等の二糖類、ラクツロース、ラフィノース、プルラン等のオリゴ糖類、アラビアゴム、カラヤガム、キサンタンガム、グアーガム、トラガント等の多糖類など、ステロイド成分としては、例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロンなどが挙げられる。
　この発明に係る神経疾患予防・治療剤は、当該技術分野において常用されている製剤化技術によって製剤化することができる。つまり、この発明の神経疾患予防・治療剤は、この発明の有効成分であるアポリポ蛋白E含有リポ蛋白を、安定剤、可塑剤、抗酸化剤、甘味剤、着香剤、保存剤、無機充填剤等の賦形剤と混合して所定の剤型に製剤化することができる。
　また、この発明は、この発明に係るアポリポ蛋白E含有リポ蛋白またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を有効成分または作用機序として含有する神経疾患予防・治療剤を、神経疾患、特に神経変性疾患に適用することによって、神経疾患を予防・治療することができる神経疾患予防・治療方法を提供することができる。つまり、この発明の神経疾患予防・治療方法は、この発明の神経疾患予防・治療剤を、錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤などの剤型で経口的または輸液剤、注射剤などの剤型で非経口的に投与することからなっている。
　以下の実施例によりこの発明を更に詳しく説明するが、この発明はこれらの実施例によって一切限定されるものではない。以下の実施例は、この発明をより理解できるように例示としてだけ記載するものであって、この発明を限定する意図で記載するものでは一切ない。
（材料）
　この発明で使用する材料のうち、ウサギポリクローナル抗LRP1 抗体 (R2629) は、Ｄ．Ｋ．ストリックランド博士（Dr. D. K. Strickland; 米国ボルチモア・メリーランド大学医学部）の好意によって提供された。組換えヒトアポ蛋白Ｅ3 およびアポ蛋白Ｅ4は和光純薬（大阪）から購入した。GLAST-/- マウスのコロニーは、東京医科歯科大学（東京）から得たマウスを用いて熊本大学で確立した。なお、全ての実験方法は、熊本大学動物取扱委員会の承認を得て行った。
（ラット網膜神経節細胞の初代培養）
　生後２日のSprague Dawley（SD）系ラットを用いて、バレスらの方法（Barres et al.、1988）を多少改良した方法（Hayashi et al., J Biol Chem 2009）に従って網膜神経節細胞の初代培養を行った。単離した網膜神経節細胞（RGC）を RGC培地（1 mM グルタミン、5μg/ml インスリン、60μg/ml N－アセチルシステイン、62 ng/ml プロゲステロン、16μg/ml プトレシン、40 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム塩、0.1 mg/ml ウシ血清アルブミン、40 ng/ml トリヨードチロニン、0.1 mg/ml トランスフエリン、1 mM ピルビン酸ナトリウム塩、2 % B27 サプリメント(Invitrogen, Carlsbad, CA), 10μM ホルスコリン(Sigma, St.  Louis, MO), 50 ng/ml 脳由来神経栄養因子 (BDNF; PeproTech, Rocky   Hill, NJ), 50 ng/ml 毛様体神経栄養因子(CNTF; PeproTech) 、ならびに50 ng/ml 塩基性繊維芽細胞増殖因子 (bFGF; PeproTech）の基本培地中に懸濁した。９６ウエルプレートをポリ－ｄ－リジン(Sigma) とラミニン(Sigma)でコーティングし、RGCを、９６ウエルプレートに対し各ウエル当たり5,000 個の細胞、マイクロディッシュに対し各培養インサート当たり5,000個の細胞、または区画培養用のディッシュ当たり15,000個の細胞になるように装着した。続いて実験前に少なくとも１０日間培養した。
（グリア細胞由来リポ蛋白の製造）
　グリア細胞由来リポ蛋白をグリア細胞用に調整した培地から単離した。グリア細胞は、生後２日のSD系ラットの大脳皮質から調製し、１０％ウシ胎児血清含有ダルベツコ変法イーグル培地中で培養した。グリア細胞培地は星状細胞が＞８０％になるまで濃縮した(Hayashi et al., J Biol Chem 2009) 。グリア細胞は、ホルスコリン、BDNF、CNTF およびbFGFを含有しないRGC培養培地で３日間培養した。この培養培地をグリア細胞調製用培地とした。
　本実施例は、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することを示す実験である。実施例１で生後２日のラットから初代培養した網膜神経節細胞を１４日間以上培養し、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制する作用を有するかどうかについて下記の方法に従って実験を行った。その結果を図１に示す。図中、Contは未処理群、Gluは３００μM グルタミン酸添加群、+glial LPは３００μM グルタミン酸+グリア細胞由来アポリポ蛋白E添加群を表している。Glial LPは１μg cholesterol/mlの濃度で添加した。処理後、２４時間で核の凝集（a: Hoechst33342による核染色）またはエステラーゼ活性／膜の透過性保持（b: calcein AM/Propidium Iodide染色）を観察することにより、アポトーシス様細胞の割合を算出した。この結果、グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸によって誘導される網膜神経節細胞のアポトーシスを有意に抑制することが分かった（*p<0.05: Glu vs. Glu + glial LP）。
　本実施例は、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による大脳皮質神経細胞のアポトーシスを抑制することを示す実験である。胎生１６日齢のラットから初代培養した大脳皮質神経細胞を６日間培養し、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による大脳皮質神経細胞のアポトーシスを抑制する作用を有するかどうかについて実施例３と実質的には同様に実験を行った。その結果を図２に示す。図中、Contは未処理群、Gluは３００μM グルタミン酸添加群、+glial LPは３００μM グルタミン酸+グリア細胞由来アポリポ蛋白E添加群を表している。Glial LPは１μgコレステロール/mlの濃度で添加した。処理後、２４時間で核の凝集を、Hoechst33342にて核染色して観察することにより、アポトーシス様細胞の割合を算出した。この結果、グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸によって誘導される大脳皮質神経細胞のアポトーシスを有意に抑制することが分かった（*p<0.0001: Glu vs. Glu+glial LP）。
（血漿HDLの製造）
　マウス血漿HDL またはラット血漿HDLは、 C57BL/6J マウスまたはSD系ラットの腹部大動脈血からそれぞれ単離した。
　本実施例では、実施例５でラット血液から単離した高比重リポ蛋白(HDL) が、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制するかどうかを実施例３と同様に実験した。その結果、ラット血液から単離したHDLが、実施例３と同様の方法で誘導されたアポトーシスを抑制した（図３参照。*p<0.05: Glu vs. Glu+HDL）。HDLは１μg cholesterol/mlの濃度で添加した。またアポトーシス様細胞はHoechst 33342 による核染色より算出した。
（人工再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白の製造）
　再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白（E-LP）は上述した方法によって製造した(Hayashi et al., J Neurosci 2007)。この再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白は、１－パルミトイル－２－オレイル－グリセロホスホコリン (POPC; P3017, Sigma)、コレステロール (C3045, Sigma) および組換えヒトアポ蛋白Ｅから構成されていて、この成分のモル比は１００：１０：1または１００：０：1だった。調製用培地、血漿または再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を含む溶液は非連続ショ糖勾配に供した。用いた溶液の組成は、密度1.30 g/mlについて3 ml、密度1.2 g/mlについて3 ml 、密度1.1 g/ml について3 ml、密度1.006 g/ml について6 ml であった。ショ糖勾配は、SRP28SA1ローター (Hitachi, Tokyo, Japan) を用いて100,000 g、４℃で７２時間遠心分離した。１０個の分画（1.5 ml） を勾配頂上から採取し、下記のようにしてアポ蛋白Ｅについて免疫ブロッティングした。アポ蛋白Ｅを含む分画（典型的には分画５－７）を合併し、Amicon Ultra filter（100 kDaまたは50 kDa分子量カットオフ；Millipore, Bedford, MA)。なお、リポ蛋白量は、HDLについてはコレステロール濃度（2μg/ml）によつて、また再構成リポ蛋白についてはタンパク濃度（100
ng/ml）によって調整した。このコレステロールならびにタンパク濃度は、LabAssay cholesterol kit（Wako）ならびにBCA protein assay kit （Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL） にてそれぞれ測定した。
　本実施例では、実施例７で得られたヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP)、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制するかどうかを実施例３と同様に実験した。その結果、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) が、実施例３と同様の方法で誘導されたアポトーシスを抑制した（図４参照。*p<0.05: Glu vs. Glu+LP）。なお、ヒトアポ蛋白Ｅ3は、100ng protein/mlの濃度で添加した。アポトーシス様細胞はHoechst33342による核染色より算出した。
　本実施例では、グルタミン酸によって誘導される網膜神経節細胞のアポトーシスに、NMDA受容体、カルシウム、カルパイン、カルシニューリン、カスパーゼなどの神経変性誘導分子が関与しているかどうかを実施例３の方法に従って同様に実験した。その結果を図５に示す（*p<0.05: Glu vs. Glu+MK801, ALLN, FK506 or Z-VAD）。図中、（a）は、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDA受容体）に対する阻害薬MK801 (10μM) によりアポトーシスが阻害されていることを示している。（b）は、カルシウムを含まない培養液中では、グルタミン酸によるアポトーシスが誘導されなかったことを示している。（c）は、カルパイン阻害薬ALLN (1μM) によりアポトーシスが阻害されたが、ALLNを溶解しているジメチルスルホキシド (DM) は阻害効果を示さなかった。（d）は、カルシニューリン阻害薬FK506 (1μM) によりアポトーシスが阻害されたことを示している。（e）は、カスパーゼ阻害薬Z-VAD-FMK (20μM) によりアポトーシスが阻害されたことを示している。なお、アポトーシス様細胞はHoechst33342による核染色より算出した。
　本実施例は、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) がLRP1（low density lipoprotein receptor-related protein 1） を介して網膜神経節細胞を保護し、そのメカニズムにはGSK3βが関与していることを示している（図６参照。*p<0.05: Glu+LP vs. Glu+LP+anti-LRP1）。図６aは、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP)による神経保護効果が、LRP1に対する抗体 (10μg/ml) で阻害されたが、normal IgGでは阻害されなかったことを示している。なお、アポトーシス様細胞はHoechst33342による核染色により算出した。また、図６bは、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) が、glycogen synthase kinase 3β(GSK3β) のリン酸化レベルを回復させたことを示している。グルタミン酸処理後１８時間で、網膜神経節細胞を回収し、ウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロットには、ウサギ抗リン酸化GSK3β （p-GSK3β） 抗体およびウサギ抗GSK3β抗体を使用した。
　本実施例は、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) は、LRP1とNMDA受容体の複合体形成を促進することを示している（図７参照）。網膜神経節細胞の培養液中にLPを添加し、１５分後に細胞を回収し、下記に示すように免疫沈降 (IP) を行った。免疫沈降にはウサギ抗NMDA受容体２B抗体を使用し、LRP1およびNMDA受容体2Bのウェスタンブロットを行った。
　本実施例は、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP)が、正常眼圧緑内障モデルであるGLAST欠損マウスの網膜神経節細胞死を抑制するかどうかを調べる実験である。本実験では、３週齢GLAST欠損マウス（3w KO）にLP（100ng protein/ml）またはリン酸緩衝液（対照群）を硝子体内投与した。６週齢の時点で眼球を摘出し、パラフィン固定、ヘマトキシリン・エオジン染色後、網膜上の網膜神経節細胞をカウントした。
　この結果から、LPが、硝子体中にはマウスＬＰが多量に存在するにも拘わらず、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することが明らかになった。このメカニズムは、リポ蛋白がリポ蛋白受容体ファミリーの１つであるLRP1に結合し複合体を形成し、グルタミン酸受容体の活性を抑制することに起因すると考えられる。
（アポ蛋白Ｅ-ＬＰの硝子体中注射および硝子体液の採取）
　３週齢GLAST+/- またはGLAST-/-マウスを50 mg/kgペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射して麻酔した。硝子体中注射をするために、一方の眼の硝子体に1μlアポ蛋白Ｅ-LP (1.5μg蛋白/ml) またはHDL (30μgコレステロール/ml)をポリエチレンチューブ(SP8, Natume, Tokyo, Japan)と10μl Hamilton注射器 (Hamilton, Bonaduz, Switzerland) に取り付けた33-gauge nanopass注射針 (Terumo, Tokyo, Japan) を用いて注射し、他方の眼の硝子体には同量のPBSを注射した。この操作は、水晶体と網膜を傷つけないように実体顕微鏡下で慎重に行った。硝子体液の採取も硝子体中注射と同じ注射針を用いて行った。
（マウス網膜の組織学的研究）
　６週齢のマウスの眼球を摘出し、Super Fix (KY-500, Kurabo, Osaka)を用いて４℃で一夜固定し、角膜と水晶体を実体顕微鏡下で除去した。強膜付網膜はパラフィンに包埋した。次に、網膜の4μm パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。連続した切片から各５個の切片を選択し、神経節細胞層中の細胞数を網膜切片上の一端から視神経を介して他端に亘って計数した。各網膜の１０個の切片において、2,000個以上の細胞が計数された。
（免疫ブロッティング）
　上記実施例で用いられた免疫ブロッティングは次のようにして行った。つまり、上記各実施例で得られたリポ蛋白は、62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)、10% グリセロール、2% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) および5% β－メルカプトエタノール （サンプルバッファー）に溶解し、５分間煮沸した。得られた蛋白は、0.1% SDS含有ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にて分離し、ポリビニリデンジフルオライド・メンブレンに移した。次いで、メンブレンは、TBS-T (10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaClおよび0.1% Tween 20) を入れた5% 脱脂乳と共に室温で１時間培養した後、5%ウシ血清アルブミン追加TBS-T中において一次抗体を用いて一夜プローブした。続いて、メンブレンを、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG (Thermo)、ヤギ抗マウスIgG (Thermo) またはマウス抗ヤギIgG (Thermo)を用いてさらに室温で１時間プローブした。免疫反応性蛋白は、化学発光分析法GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) またはSuper Signal West Dura (Thermo)にて可視化した。使用した一次抗体は次の通りであった：マウス抗β－アクチン (a5441, 希釈1:10,000, Sigma), ヤギ抗ヒトアポ蛋白Ｅ (k74190g, dilution 1:5000, Biodesign, Saco, ME)、ヤギ抗マウスアポ蛋白Ｅ(sc-6384, 希釈1:1000, Santa Cruz)、ウサギ抗ヒトGSK3βおよびホスホ－Ser 9－GSK3β (9315 and 9336S, 希釈1:1000, Cell signaling Technology, Danvers, MA)、ヤギ抗ヒトBrn-3a (sc-31984, 希釈1:1000, Santa Cruz)、ウサギ抗ヒトLRP1 (2703-1, 希釈1:1000, Epitomics)、マウス抗ヒトLRP1 (545503, 希釈1:1000, R&D systems, Minneapolis, MN)、ウサギ抗ウシホスホリバーゼCγ1 (sc-81, 希釈1:1000, Santa Cruz) およびマウス抗ラットNMDAR2B (610416, 希釈1:1000, BD Biosciences, San Jose, CA)。
（RGCの免疫細胞化学）
　培養RGCは、リン酸バッファー生理食塩水(PBS)で２度洗浄し、アセトンを用いて１０分間４℃で固定した。次いで、RGCを、1%ウシ血清アルブミンおよび5% ヤギ血清のPBS溶液を用いて室温で１時間ブロックした後、ウサギ抗ヒトLRP1 (希釈度1:2000, Epitomics)、マウス抗NMDAR2B (32-0700, 希釈度1:500, Invitrogen)、マウス抗ラットチトクロームc (556432, 希釈度、1:3000, BD Biosciences) のPBS溶液（1% ウシ血清アルブミンおよび5% ヤギ血清を含む）を用いて室温で１時間培養した。得られた細胞は、PBSで３回洗浄した後、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG (希釈度1:200, Invitrogen)、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗マウスIgG (希釈度1:200, Invitrogen) またはAlexa Fluor 594結合抗マウスIgG (希釈度1:200, Invitrogen) を用いて室温で１時間培養した。得られたRGCは、PBSで３回洗浄した後、Fluormount/Plus (Japan Tanner, Osaka, Japan)を用いて免疫応答を開始した。ミトコンドリアの染色のために、RGCは、実験の１日前に、2 nM MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen)を用いて３７℃で３０分間培養した。写真は、Olympus IX71顕微鏡 (Tokyo, Japan) またはOlympus FV500共焦点顕微鏡で撮影した。
　RGC中のアポトーシス誘導および検出は次のようにして行った。つまり、RGCは、2.4 mM CaCl2、20 mM HEPES含有およびマグネシウム非含有のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で2回洗浄し、上記ハンクス平衡塩類溶液に300μMグルタミン酸塩および10μM グリシンを添加して調製した培地中において３７℃で２時間培養した。グルタミン酸塩での処理後、RGCを、ホルスコリン、BDNF、CNTFならびにbFGFを含まないRGC培養培地を用いて３７℃で２２時間培養した。アポトーシスを検出するために、RGCを1μg/ml Hoechst 33342 (346-07951, Dojindo, Kumamoto, Japan)または1μg/mlカルセイン－AM／プロピジウムヨーダイド (341-07381, Dojindo)で染色した。蛍光画像はOlympus IX71顕微鏡を用いて観察した。上記Hoechst試薬で染色した断片化もしくは凝集した核は、アポトーシスした核として、また丸く滑らかな核は健全な核として計数した。健全な核はプロピジウムヨーダイドで染色されないので、プロピジウムヨーダイドで染色された核は、アポトーシスした核として計数した。各グループ中300個以上の核が計数された。
　RGC中へのカルシウム流入は次のようにして確認した。つまり、RGCをマイクロデイッシュ上で少なくとも１４日間培養した後、3μM Fluo-8アセトキシメチルエステル(AAT Bioquest, Sunnyvale, CA)を用いて３７℃で３０分間培養した。得られた細胞を上記HBSS500μlで２回洗浄した後、300μM グルタミン酸塩および10μM グリシンを注入した。蛍光画像は、ORCA-R2デジタルCCDカメラ(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan)を用いて、各500msec毎に撮影し、MetaFluor fluorescence ratio imaging software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) を用いて分析した。
　RGCの区画培養は次のようにして行った。区画培養のためにRGCを既知文献記載の方法に従って調製した(Hayashi et al., J Biol Chem 2004)。マイクロデイッシユをポリ－ｄ－リジンとラミニンでコーティングした後、デイッシュの表面をひっかいて２０本の平行な溝を作製し、デイッシュ上にテフロン（登録商標）製３区画デバイダーをシリコーングリースで装着した。この中央の区画に、25 ng/ml BDNFおよび25 ng/ml CNTFを含むRGC培養培地を入れた後、デイッシュ当たり10,000-15,000個のRGC細胞を播種した。両側の区画には、75 ng/ml BDNF、25 ng/ml CNTFおよび50 ng/ml bFGFを含むRGC培養培地を入れた。RGCの軸索は、シリコーングリース下を越えて両側の区画に５日以内に侵入した。実験開始前、RGCの区画培養は少なくとも14日間行った。
　免疫沈降法は次のようにして行った。つまり、共免疫沈降法は、RGC溶解液を、10 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2および1 % トリトンX-100混合液にコンプリートEDTAフリープロテアーゼ・インヒビター・カクテル(Roche, Mannheim, Germany) とPhosSTOPホスファターゼ・インヒビター・カクテル (Roche)を加えた混合液を用いてメイらの方法（May et al.、2004） に従って行った。RGCは、HBSSで１回洗浄し、各ウエル当たり40μlの溶解バッファーを用いて９６ウエルプレートに採取した。９－１２ウエルからの溶解液を各グループ毎に合併した。RGC溶解液は、22-gauge 注射針中を１５回通し、15,000 x g、４℃で１５分間遠心分離した。得られた上澄液は、40μlの50 % 平衡化蛋白G－セファロース(GＥ Healthcare, Buckinghamshire, UK)で４℃で１時間前処理し、セファロースビーズを遠心分離で除去した。ウサギ抗LRP1抗体(希釈度1:200; 2703-1, Epitomics, Burlingame, CA) またはウサギ抗NR2B抗体(希釈度1:200; AB1557, Millipore) を添加した後、RGC溶菌液を４℃で１２時間回転させた。得られた溶菌液に、40μlの50 % 平衡化蛋白G－セファロースを添加し、４℃でさらに１時間回転させた。セファロースビーズを0.1 % トリトンX-100を含む溶菌バッファーで３回洗浄した。免疫ブロッティングのために30μlサンプルバッファーを添加した後、セファロースビーズを５分間煮沸した。得られた上澄液をSDS－ポリアクリルアミドゲル電気泳動と免疫ブロッティングに供した。
本実施例では、グルタミン酸とグリシンによるＲＧＣでのアポトーシス誘発を調べた。
　図９Ａは、コントロール（C; HBSS）後またはグルタミン酸単独（Glu(-); 300μM glutamate）、グリシン単独（Gly(-); 10μM glycine）もしくはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色で検出されたＲＧＣ中の断片化もしくは収縮した核を示す。データは、独立した実験４回の平均＋/－SE値である（＊：p<0.001 (C vs Glu)）。図９Ｂは、コントロール（C; HBSS）またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）をHBSSで非洗浄ならびに１５分間１回、２回または３回洗浄処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色で検出されたＲＧＣ中の断片化もしくは収縮した核を示している。図９Ｃは、コントロールまたはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 30μM glutamate + 10μM glycine）での処理１２時間後にAnnexin V-EGFP、propidium iodideおよびHoechst染色したＲＧＣの蛍光像を示す。スケールバーは20μmである。図９Ｄは、2 nM MitoTracker Red (Mito)で処理したRGCを、コントロールまたはGlu処理１２時間後に抗チトクロームｃ（Cyto C）で免疫染色したRGCを示す。スケールバーは20μmである。
　本実施例では、ＲＧＣ中でのグルタミン酸誘発神経毒性に関与する物質について調べた。
　コントロール（HBSS）後またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によってＲＧＣ中に断片化もしくは収縮した核が検出された。
　図１０Ａは、Ca2+の非存在下（no Ca2+）または存在下（Ca2+）で細胞をグルタミン酸と共に培養した。グルタミン酸誘発神経毒性に関与する物質を示す図。図１０Ｂでは、RGCは10μM MK801（NMDA受容体のインヒビター）、図１０Ｃでは1μM ALLN（カルパインインヒビター）、図１０Ｄでは1μM FK506（カルシニューリン・インヒビター）、図１０Ｅでは200μM MK801（Bax-inhibitory peptide V5;BIP-V5;Baxのインヒビター）、図１０Ｆでは20μM Z-VAD-fmk (Z-VAD;カスパーゼインヒビター）で処理、またはGluを添加した時はジメチルスルホキシドで処理した。図１０Ｂ－Ｆでは、＊：p<0.001（Glu vs. Glu+inhibitor）。データは、独立した実験４回～６回の平均＋/－SE値である。
　本発明者は、栄養性付加物の除去によるRGCのアポトーシス誘発がグリア由来E-LPにより抑制されることを以前報告している。そこで、本実施例では、リポ蛋白がグルタミン酸誘発アポトーシスを予防するかどうかについて調べた。
　グリア由来E-LP、血漿HDLならびに再構成E-LPは次のようにして抽出した。まず、グリアを、２日齢のSprague Dawleyラットの大脳皮質から抽出し、0.25％トリプシンで消化し、10％ウシ胎児血清含有ダルベツコ修飾イーグル培地中で培養した。グリアは、RGCに使用した同じ培地（ただし、ホルスコリン、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子ならびに塩基性繊維芽細胞増殖因子は含まず）で３日間培養した。得られた培養液を1000xgで１０分間遠心分離し、得られた上清液をグリア調整培地とした。マウスもしくはラットHDLは、C57BL/6JマウスもしくはSprague Dawleyラットの腹部大動脈から採血した血液から単離した。再構成E-LPは、文献記載の方法で調製した。再構成E-LPには、1-パルミトイル-1-オレオイル-グリセロホスホコリン、コレステロールならびに組換えヒトアポＥをモル比100：10：1または100：0：1の割合で添加した。1-パルミトイル-1-オレオイル-グリセロホスホコリン（2.71 mg）を、単独またはコレステロール（0.14 mg）と混合して、クロロホルムに溶解し、窒素ガス下で蒸発させた。その後、400μlの0.9％NaCl含有10 mM Tris-HCl (pH 7/4) を添加し、氷上で１時間培養した後、15 mg/mlコール酸ナトリウム（100μl）を添加した。得られた混合物を氷上で２時間培養した後、組換えアポＥ３またはＥ4（1mg）と混合し、氷上で１時間培養した。次いで、Bio-Beads (100 mg； Bio-Rad, CA)を添加し、４℃で３時間回転し、ビーズを除去した。この混合物は再構成リポタンパク質を含有していた。グリア調整培地、血漿または再構成リポ蛋白を、下記溶液による非連続ショ糖勾配100000xg、４℃で７２時間遠心分離した：密度1.30 g/ml（3ml）、密度1.2 g/ml（3ml）、密度 1.1 mg/ml（3ml）ならびに密度1.006 g/ml（6ml）。勾配頂上部１０分画（1.5ml）を採取し、アポＥについてイムノブロツトした。アポＥ含有分画を濃縮した後、グリア由来E-LPならびにHDLのためにコレステロール濃度（2μg/ml）または再構成リポ蛋白のためにタンパク質濃度（100ng/ml）に調整した。リポタンパク質のコレステロール濃度ならびにタンパク質濃度は、LabAssay cholesterol kit（ワコー純薬）ならびにBCA protein assay kit（Termo Fisher Scientific, IL）を用いて測定した。α２マクログロブリンは、100mMメチルアミンで室温で１時間処理して活性化した。
　RGCのアポトーシスは次のようにして測定した。初代培養したRGCを、マグネシウムを含まない2.4 mM CaCl2と20mM 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）を含むHank’sBalanced Salt Solution (HBSS)を用いて３７℃で１５分間２回培養して洗浄した。NMDA受容体がブロックされることから、マグネシウムを洗浄液から排除した。その後、RGCを、2.4 mM CaCl2と20 mM HEPES含有（マグネシウム無含有）HBSS中で、300μMグルタメート＋10μMグリシン（NMDA受容体の共活性化剤）非処理または処理後３７℃で２時間培養した。コントロール（2.4 mM CaCl2と20 mM HEPES含有（マグネシウム無含有）HBSS）またはグルタミン酸非処理または処理後、RGCを、RGCに使用した同じ培地（ただし、ホルスコリン、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子ならびに塩基性繊維芽細胞増殖因子は含まず）で３７℃で２２時間培養した。ヘキスト33342（同仁化学）を用いてアポトーシスを検出するために、RGCを1μg/mlのヘキスト33342と一緒に１５分間培養した。蛍光イメージ（６イメージ/ウエル）はIX71蛍光顕微鏡でランダムに撮影した。各処理に対して、９６ウエルにおいて少なくとも１ウエル当たり１２イメージを撮影した。ヘキスト染色した断片化もしくは収縮した核を、アポトーシスした神経細胞として計数し、丸いまたは平滑な核を正常な神経細胞として計数した。各処理に対して300個以上の神経細胞を盲検的に計数した。アネキシンV-EGFP含有Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit（MBL）、プロピジウムヨーダイドならび結合バッファーでのアポトーシス検出は製造者のマニュアルに従って行った。アポトーシスの初期段階期間では、ホスファチジルセリンが血漿メンブレンの外側リーフレット上に露出してきて、アネキシンVで染色される。プロピジウムヨーダイドは、壊死細胞ならびに末期段階のアポトーシス性細胞を染色する。一方、正常な細胞はいずれの試薬によっても染色させない。
　つまり、グリア調節培地（GLP）から抽出したグリア由来リポタンパク質（2μコレステロール/ml）と、ラット血漿から抽出したHDL（2μコレステロール/ml）を使って、これらのリポタンパク質がRGCをグルタミン酸誘発毒性から保護できるかどうかを実験した。この実験は、コントロール（HBSS）後またはグルタミン酸グルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理して２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によってRGC中に断片化もしくは収縮した核が検出されるかを調べた。その結果、これら２つのタイプのアポＥ含有リポタンパク質は、RGCをグルタミン酸誘発毒性から保護した（図１１Ａ）。
　また、組換えアポＥ、コレステロールならびにリン脂質含有再構成E-LPは用量依存的にRGCを保護した（図１１Ｂ）。
　さらに、神経保護のために必要なE-LPの成分について調べた結果、この保護には、アポＥと脂質との関連が必要であることが分かった（図１１Ｃ）。しかしながら、コレステロール（11 ng/ml）単独でも、コレステロールとホスファチジルコリン（11 ng/ml）との混合物でも生存を促進しなかったのに対して、アポＥ（100 ng protein/ml）はホスファチジルコリン（11 ng cholesterol/ml）と結合した場合に神経保護作用を有していた。さらに、コレステロールは、ホスファチジルコリンと結合するとアポＥの保護作用を強化した。なお、ホスファチジルコリン：コレステロール：アポEのモル比は、100±10：10±1：1±0.1（90～110：9～11：0.9～1.1）であるのがよい。
　さらにまた、ヒトアポＥ３ならびにＥ４イソ体は、神経変性、特にアルツハイマー病における神経変性に影響を及ぼしている。しかしながら、本発明者の実験によると、グルタミン酸処理RGC中におけるヒトアポＥ３ならびにＥ４含有リポタンパク質の神経保護効果については何ら差異は認められなかった。
図１１Ａは、グリア調節培地（GLP）から抽出したリポタンパク質（2μコレステロール/ml）中のアポＥ、ラット血漿から抽出したHDL（2μコレステロール/ml）中のアポＥ、ならびに再構成ヒトアポＥ含有リポタンパク質（E-LP）（100ngタンパク質/ml）に対するイムノブロットを示す。RGCは、GLP、HDLまたはE-LPと15分間培養した後、Gluを添加した。＊：ｐ＜0.005（Glu vs. Glu+GLP、Glu+HDL またはGlu+E-LP）。
　図１１Ｂは、Glu誘発神経毒性に対するE-LPの用量依存性保護効果を示す。RGCは、E-LPと15分間培養した後、Gluを添加した。＊および＊＊：ｐ＜0.005およびｐ＜0.0001（Glu vs.Glu+E-LP）。
　図１１Ｃは、脂質フリーのアポＥ（100 ng タンパク質/ml）、コレステロール (chol)（11 ng/ml）、ホスファチジルコリン＋コレステロール（PC+chol）リポソーム（11 ngコレステロール/ml）、PC+アポＥリポソーム（100 ngタンパク質/ml）、アポＥ含有E-LP、コレステロールとホスファチジルコリン（100 ngタンパク質/mlと11 ngコレステロール/ml）、またはマウス血漿からのHDL (MsHDL)（2μgコレステロール/ml）と培養後、Gluを添加した。＊および＊＊：ｐ＜0.001およびｐ＜0.0001（Glu vs.Glu+リポタンパク質）。
　図１１Ｄでは、RGCは、再構成アポＥ３含有リポソーム（E3-LP）またはアポＥ４含有リポソーム（E4-LP）（100 ngタンパク質/ml）と15分間培養した後、Gluを添加した。＊：ｐ＜0.001（Glu vs.　Glu+E3-LPまたはE4+LP）。
　本実施例では、LRP1とNMDA受容体との相互反応による細胞間Ca2+の上昇がE-LPによって抑制されることを調べた。
　RGCは、Fluo-8アセトキシメチルエステルで３０分間標識した後、Glu (300μMグルタメート＋10μMグリシン)を添加した。蛍光レシオイメージ（ratio image）は、図１２Ａ下部に示した色インデックスで示した色で表示された通りである。この色は、Glu刺激前の基底蛍光強度（レシオ１）に対応するレシオ０とレシオ２を表わしている。左側と右側のパネルは、GluとGlu+E-LPとをそれぞれ示している。このデータは、同様の結果を示した８回の実験のうちの１つの実施からのものである。スケールバーは80μmである。
　図１２ＢおよびＣは、Fluo-8蛍光の変化をΔF/F0で表した図である。なお、図中、F0は、Glu刺激前の基底蛍光強度である。＊および＊＊：ｐ＜0.005およびｐ＜0.0001（Glu vs.Glu+E-LP）。RGCは、100 ng protein/ml E-LP、10μM MK801、100 ng protein/ml E-LP＋10μM MK801、100 ng protein/ml E-LP＋10μg/ml抗LRP1 抗体もしくは100 ng protein/ml E-LP＋10μg/mg IgGと共に１５分間培養した後、Gluを表示した量添加した。このデータは、同様の結果を示した６～８回の実験の平均±SEである。図１２Ｄは、コントロール（HBSS）後またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によって検出された断片化もしくは収縮した核の割合を示す図である。RGCに、E-LP (100 ng protein/ml)、E-LP＋抗LRP1 抗体(10μg/ml)、またはE-LP＋IgG(10μg/mg)を１５分間添加した後、Gluを添加した。＊：ｐ＜0.01（Glu＋E-LP vs Glu＋E-LP＋抗LRP1）。このデータは、４回の実験の平均±SEである。図１２ＥおよびＦは、E-LPで無処理または処理RGCの培養液からLRP1（Ｅ）またはNMDA受容体サブユニットNR2B（Ｆ）の抗体を用いて免疫沈降した結果を示している。免疫沈澱物（ペレット）と上清液をLRP1、NR2BまたはNR2Aに対する抗体でプローブした。このデータは、同様の結果を示した３回の実験である１実験の平均±SEである。
　本実施例では、ホスホリバーゼＣ、プロテインキナーゼCδならびにGSK3βによるグルタミン酸誘発神経毒性に対するE-LPの予防効果を調べた。
　図１３Ａは、コントロール（HBSS）またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によって検出された断片化もしくは収縮した核の割合を示す図である。RGCは、E-LP (100 ng protein/ml)またはE-LP＋U(5μM U73122、ホスホリバーゼＣインヒビター)と共に１５分間培養した後、Gluを添加した。このデータは、５回の実験の平均±SEである。＊：ｐ＜0.005（Glu＋E-LP vs Glu＋E-LP＋U）。
　図１３Ｂは、RGCにおいて、PKCδsiRNAによってノックダウンされたプロテインキナーゼCδを示す図である。RGCは、300 nMネガテイブコントロール（NC）またはPKCδsiRNAと共に６日間培養した後、PKCδをイムノブロッテイングで検出した。βアクチンを内部コントロールとして使用した。断片化もしくは収縮した核は、ネガテイブコントロール（NC）またはPKCδsiRNAによるノックダウン後、C、GluまたはGlu＋E-LP処理し、２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色して検出した。データは、５回の実験の平均±SEである。＊：ｐ＜0.05（Glu＋E-LP＋NC vs Glu＋E-LP＋PKCδ）。
　図１３Ｃは、RGCは、C、GluまたはGlu＋E-LP処理して１６時間後に採取した。RGCは、Ser9 (p-GSK3β) でリン酸化したGSK3βまたは全GSK3βに対する抗体でイムノブロットした。GSK3βのSer9リン酸化の定量は、４回の実験から示している。＊：ｐ＜0.001（Glu vs Glu＋E-LP）。
　本実施例では、細胞体区画（末端軸索区画ではない）におけるグルタミン酸誘発アポトーシスを調べた。図１４Ａの上段のパネルにおいて、１トラックの位相差イメージは、細胞体が細胞体区画に局在しているとともに、軸索が右側の軸索区画に存在していることを示している。下端のパネルは、抗LRP1抗体または抗NR2B抗体で染色されたRGCを示している。スケールバーは50μmである。
　図１４ＢおよびＣでは、断片化もしくは収縮した核は、細胞体（Ｂ）もしくは軸索（C）のグルタミン酸処理（Glu; 300μM glutamate＋10μM glycine）２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色により検出された。RGCは、100 ng protein/mlのE-LPと共に１５分間培養した後、Gluを細胞体（Ｂ）と軸索（Ｃ）に添加した。＊：ｐ＜0.005（Glu vs Glu＋E-LP）。データは、４回の実験の平均±SEである。
　本実施例では、E-LPがGlast+/-ならびにGlast-/-マウス中のRGC生存を回復させることを調べた。図１５ＡおよびＢは、３週齢（３ｗ）または６週齢（６ｗ）のGlast-/-マウス（1μlのPBSまたは1μlの1.5μg protein/ml E-LPを注射した）の網膜を抗Brn-3a抗体もしくは抗β－アクチン抗体（Ａ）、またはSer9 (p-GSK3β) でリン酸化したGSK3βまたは全GSK3βに対する抗体（Ｂ）でイムノブロットした結果を示している。β－アクチン対Brn-3a（Ａ）およびSer9リン酸化GSK3β対全GSK3β（Ｂ）の定量は、５回ならびに６回の実験からそれぞれ行った。＊：ｐ＜0.05（PBS vs E-LP；６週齢Glast-/-マウス）。
　図１５Cは、1μlのPBS、1μlの1.5μg protein /ml E-LPまたは30μg cholesterol/ml HDLを注射したGlast+/-ならびにGlast-/-マウス（３または６週齢）からの網膜切片をヘマトキシリン-エオシン染色した結果を示している。矢頭は網膜のガングリオン細胞層（GCL）を示している。スケールバーは40μmである。データは、同様の結果を示した８個の切片を代表する１個の網膜切片から得たものである。
　図１５Ｄは、1μlのPBS、1μlの1.5μg protein /ml E-LPまたは30μg cholesterol/ml HDLを無注射または注射した６週齢の野生型マウス（＋/＋）、３週齢もしくは６週齢のGlast+/-マウス（＋／－）もしくはGlast-/-マウス（－／－）Glast+/-ならびにGlast-/-マウス中のRGC数を定量した。データは、８回の実験結果から得た。＊：ｐ＜0.05（PBS vs E-LPまたはHDL；６週齢Glast-/-マウス）。＃：ｐ＜0.05（PBS vs E-LPまたはHDL；６週齢Glast+/-マウス）。
　本実施例では、Glast+/+ならびにGlast-/-マウスの硝子体中のアポリポ蛋白Eと、硝子体内に注射したE-LPに含まれるアポリポ蛋白Eの量を比較した。図１６は、Glast+/+ならびにGlast-/-マウスの硝子体液5μlおよび100 ng protein /ml E-LP5μlのイムノブロット結果を示している。
　本実施例では、E-LPによりα2マクログロビンの抑制効果が抑止されることを調べた。図１７ＡおよびＢは、３または６週齢のGlast+/+ならびにGlast-/-マウスからの網膜または硝子体液を、アポＥ、LRP1、β－アクチン、α２－マクログロブリン（a2M）、ならびにアルブミンに対する抗体でイムノブロットした結果を示している。矢頭はa2Mを示している。図１７Ａは、β－アクチンに対するアポＥの定量についての４回の実験による結果である。＊：ｐ＜0.05（３週齢Glast+/+vs３週齢Glast-/-マウスの網膜）。図１７Ｂは、アルブミンに対するアポＥならびにa2Mの定量についての３回の実験による結果である。＊：ｐ＜0.05（３週齢Glast+/+vs３週齢Glast-/-マウスの網膜）。＃：ｐ＜0.05（３週齢Glast+/+vs３週齢Glast-/-マウスの網膜）。図１７Ｃは、α2マクログロブリンの非存在下もしくは存在下でのコントロール（C；HBSS）またはグルタミン酸処理（Glu; 300μM glutamate＋10μM glycine）もしくはGlu＋100ng protein/ml E-LP処理して２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色して検出された断片化もしくは収縮した核の割合を示している。＊：ｐ＜0.05（Glu＋E-LP vs Glu＋E-LP＋a2M）。図１７Ｄは、100nM a2MとE-LP (100 - 3000ng protein/ml) と共に１５分間培養した後、Gluを添加したRGCの状態を示している。図１７ＣならびにＤのデータは、４回の実験結果からの平均±SE値である。＊ならびに＊＊：ｐ＜0.05ならびにｐ＜0.005（それぞれGlu＋a2M＋E-LP）。
　本実施例では、グリア細胞からのalpha 2-macroglobulin放出量を調べた。ヒトアポE含有リポ蛋白（100または1000ng/ml）を初代培養グリア細胞の培養液中に添加し、２４時間後に培養上清を回収した。この培養上清をSDS-PAGE後、イムノブロット法により抗alpha 2-macroglobulin抗体を用いて検出した。その結果、ヒトアポE含有リポ蛋白添加により、グリア細胞からのalpha 2-macroglobulin放出量の減少が観察された（図１８）。
　この結果から、ヒトアポE含有リポ蛋白の硝子体内投与は、直接的な神経保護効果だけでなく、アポE含有リポ蛋白の神経保護効果を阻害するalpha 2-macroglobulinの硝子体液中への放出量を減少させる効果も併せ持つ可能性が考えられた。
　この発明は、神経細胞のアポトーシス等を本態とする様々な神経変性疾患などの神経疾患に対して、神経変性抑制作用などの神経保護作用効果を有するアポリポ蛋白E含有リポ蛋白およびリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を利用する神経疾患予防・治療剤ならびにそれを用いた神経疾患予防・治療方法を提供する。したがって、この発明の神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法は、神経変性疾患などの神経疾患の予防・治療に有用である。

Claims (9)

  1. 　リポ蛋白が少なくともアポリポ蛋白E含有リポ蛋白を含むことを特徴とする神経疾患予防・治療剤。
  2. 　前記神経疾患が神経変性を原因とする神経疾患であることを特徴とする請求項１記載の神経疾患予防・治療剤。
  3. 　アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、グリア細胞由来アポリポ蛋白E含有リポ蛋白、血液から分離したアポリポ蛋白E含有リポ蛋白含有高比重リポ蛋白、または人工再構成アポリポ蛋白E含有リポ蛋白のいずれかであることを特徴とする神経疾患予防・治療剤。
  4. アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、リポ蛋白受容体を介して、活性化して神経保護効果を奏する神経保護分子と、不活化または抑性して神経保護効果を奏する神経変性誘導分子であることを特徴とする請求項１～３記載の神経疾患予防・治療剤。
  5. 　リポ蛋白受容体がLRP1受容体、LDL受容体、ApoER2受容体、VLDL受容体、LR11受容体、LRP4受容体、LRP1B受容体、Megalin受容体、LRP5受容体またはLRP6受容体である請求項１～４記載の神経疾患予防・治療剤。
  6. 　前記神経保護分子が、少なくともホスオリパーゼCまたはプロテインキナーゼCδのいずれかであり、神経変性誘導分子が、少なくともNMDA受容体、カルシウム、またはGSK3βのいずれかである請求項１～５記載の神経疾患予防・治療剤。
  7. 　アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が神経保護分子を活性化し、かつ神経変性誘導分子を不活化または抑性することに加え、グリア細胞からのα２－マクログロブリンの放出を減少させることを特徴とする請求項１～６記載の神経疾患予防・治療剤。
  8. 　大脳皮質神経細胞または網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の神経疾患予防・治療剤。
  9. 　アルツハイマー病、緑内障、または糖尿病性網膜症の予防・治療剤であることを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の神経疾患予防・治療剤。
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