JP6031718B2

JP6031718B2 - リポ蛋白を用いたα２−マクログロブリンの神経保護抑制効果抑止剤及び眼科用組成物

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Publication number: JP6031718B2
Application number: JP2013534722A
Authority: JP
Inventors: 林　秀樹; 秀樹林
Original assignee: Kumamoto University NUC; Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Kumamoto University NUC; Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: JPWO2013042684A1; US20140228299A1; WO2013042684A1

Description

この発明は、リポ蛋白を用いたα２−マクログロブリンの神経保護抑制効果抑止剤及び眼科用組成物に関するものである。

中高年で発症することが多い、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症などの難治性神経疾患は、いずれも神経細胞内部に異常タンパク質の蓄積が起こり、やがて神経細胞に選択的な細胞死が生じることから、共通の発症機構を持つ神経変性疾患であると考えられている。そこで、神経変性疾患では、おそらく正常細胞のアポトーシス制御機構に異常が生じているものと考えられる。

神経細胞のアポトーシス等を本態とする様々な神経変性疾患の１つと考えられている疾患に、網膜や視神経の変性疾患が存在する。我が国において、この網膜・視神経の変性疾患は、ほとんどの中途失明の原因であり、今後も進行する我が国の超高齢社会においては、「眼の成人病」ともいえる緑内障や糖尿病性網膜症などの視神経変性疾患による失明を予防することは、急務の重要な課題である。緑内障は、視神経が変性・脱落する進行性の神経変性疾患であって、我が国における第一位、世界においては第二位の失明原因疾患である。視覚は、最も重要な感覚の一つであり、失明に至らない場合でも、視覚障害により生活の質（ＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅ）が著しく低下する。また、糖尿病性網膜症は、糖尿病の３大合併症の一つとして知られており、先進国の労働者世代における主な失明原因疾患である。これらのことからでも、両疾患に対する新たな治療法の開発は急務とされる。

上述したように、糖尿病性網膜症および緑内障では、視神経を構成する網膜神経節細胞が障害を受けることが知られているが、いずれの疾患においても詳細な発症メカニズムが明らかになっていないばかりか、一旦発症してしまうと治療が難しいために視機能の維持が極めて困難となり、生活の質の観点からも大きな社会的問題となっている。

近年、神経細胞を物理的および生理的に支持しているグリア細胞が、様々な神経機能に積極的に関わっていることが明らかになってきている。また、グリア細胞から分泌されるリポ蛋白は、中枢神経系で脂質代謝において重要な役割を演じていることが分かっている（非特許文献１）。

そこで、本発明者は、視神経疾患における視神経変性の機序解明と治療法の開発を目的として、この網膜神経節細胞を保護する因子としてグリア細胞由来のリポ蛋白に着目し、緑内障や糖尿病性網膜症などの視神経変性における網膜神経細胞死の抑制について鋭意研究を行った。つまり、このグリア細胞由来リポ蛋白が、かかる視神経変性疾患において視神経細胞死を抑制できれば、その他の神経変性疾患の神経変性における神経細胞死についての機序解明や治療法の開発にもつなげることができるものと期待できる。

その結果、本発明者は、グリア細胞由来アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、アポトーシスに対する神経細胞保護作用を有していることを確認した（非特許文献２）。また、本発明者は、中枢神経系グリア細胞で産生するアポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白 (E-LP)が、ラット網膜神経節ニューロンの栄養剤除去により誘発するアポトーシスを阻止することを確認するとともに、神経細胞死経路に関与するカルシニュ―リン活性化を阻害し、また酸化ストレスによる神経細胞死に対しても保護作用を有することを示した（非特許文献３）。

上述したように、本発明者は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白がアポトーシスに対する神経細胞保護作用があることを、生体外（in vitro）の系を用いた実験によって確認している。しかし生体内には本来リポ蛋白が多量に存在することから、この実験からでは、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を生体内に実際に使用したときに、果たして、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白がアポトーシスに対する神経細胞保護作用を示すかどうか明らかでないと考えられる。そこで本発明者は、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を、リポ蛋白が多量に存在するマウスの硝子体内に注射して、生体内系（ｉｎｖｉｖｏ）におけるアポトーシスに対する神経細胞保護作用を示すかどうかを確認した。その結果、本発明者は、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、生体内の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有することを見いだした。さらに、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白と、ＬＲＰ１などの神経保護分子との複合体が、同様に、生体内の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有することを見いだした。したがって、この発明は、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白および／またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を作用機序とする神経保護機構が、生体内の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有することを見いだしたことに基づいて完成した。

Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２１，２００７，２７（８）：１９３３−１９４１林秀樹他：神経化学Ｖｏｌ．４９Ｎｏ．２／３Ｐａｇｅ４８３（２０１０）Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ：Ｖｏｌ．２８４Ｎｏ．４３ｐｐ．２９６０５−２９６１３（２００９）

したがって、この発明は、少なくともアポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を含むリポ蛋白、またはアポリポ白Ｅ含有リポ蛋白を利用したα２−マクログロブリンの神経保護抑制効果抑止剤及び眼科用組成物を提供することを目的としている。

なお、本明細書で使用する用語「アポリポ蛋白E含有リポ蛋白」は、アポリポ蛋白Eとリポ蛋白とが化学的に会合している場合の他に、アポリポ蛋白Eとリポ蛋白とが同一媒体中に共存している場合も包含するものとする。

また、本明細書で使用する用語「神経保護分子」は、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、神経保護効果を発揮する際に活性化される分子を意味しており、例えば、リポ蛋白受容体、ホスホリパーゼC、プロテインキナーゼCδなどが挙げられる。また、これとは相反する作用効果を奏する、神経保護効果を発揮する際に不活性化（抑制）される分子を「神経変性誘導分子」とし、かかる神経変性誘導分子としては、例えば、NMDA受容体、カルシウム、またはGSK3βなどが挙げられる。

さらに、本明細書で使用する用語「リポ蛋白受容体」とは、中枢神経系でアポ蛋白Ｅと結合するリポ蛋白受容体ファミリーの受容体であって、例えば、LRP1受容体、LDL受容体、ApoER2受容体、VLDL受容体、LR11受容体、LRP4受容体、LRP1B受容体、Megalin受容体、LRP5受容体、LRP6受容体などが挙げられる。

また、この発明は、別の形態として、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白、リポ蛋白受容体、神経保護因子、神経変性誘導因子を有効成分として含有するアポトーシス抑制剤などの神経変性抑制剤、例えば緑内障・糖尿病性網膜症などの予防・治療剤などの神経疾患予防・治療剤、およびアポリポ蛋白E含有リポ蛋白、リポ蛋白受容体、神経保護因子、神経変性誘導因子または神経変性抑制剤などの神経疾患予防・治療剤を用いた神経疾患予防・治療方法を提供することを目的としている。

さらに、この発明は、別の態様として、生体内の系において、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白または、リポ蛋白受容体、神経保護因子、神経変性誘導因子を介する神経保護機構を利用した神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、この発明は、点眼又は眼球に対する注射によって前記眼球内へ投与してα２−マクログロブリンの神経保護抑制効果を抑止するための、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を含有するα２−マクログロブリンの神経保護抑制効果抑止剤を提供する。

また、この発明は、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を含有させた組成物であって、同組成物を眼球に対し点眼又は注射することにより、前記アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白によって、前記眼球内に存在する網膜神経節細胞のグルタミン酸受容体の活性を抑制させると共に、α２−マクログロブリンの神経保護抑制効果を抑止させるべく構成したことを特徴とする眼科用組成物を提供する。

さらに、この発明は、別の形態として、糖尿病性網膜症の予防又は治療剤としての、前記眼科用組成物の使用を提供する。

この発明は、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）の系ばかりではなく、生体内（in vivo）の系においてもアポトーシスに対する神経細胞保護作用を有している。したがって、この発明は、神経変性疾患における神経変性、例えば、視神経細胞のアポトーシスを抑制することができることから、緑内障などの予防、治療薬の開発に寄与できるものと期待される。また視神経細胞だけでなく、大脳皮質神経細胞に対しても神経保護効果を有することから、アルツハイマー病やパーキンソン病などの予防、治療薬の開発にも寄与できるものと期待される。

グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白（LP）を用いた、グルタミン酸による神経変性からの網膜神経節細胞の保護効果を示す図である（実施例３）。グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白（LP）を用いた、グルタミン酸による神経変性からの大脳皮質神経細胞の保護効果を示す図である（実施例４）。高比重リポ蛋白（HDL）を用いた、グルタミン酸による神経変性からの網膜神経節細胞の保護効果を示す図である（実施例６）。再構成LPを用いた、グルタミン酸による神経変性から網膜神経節細胞の保護効果を示す図である（実施例８）。グルタミン酸による神経変性誘導に下記神経変性誘導分子が関わることを示す図である（実施例９）。(a)NMDA受容体 (b)カルシウム(c)カルパイン (d)カルシニューリン(e)カスパーゼ (a)アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を用いた、LRP1を介する神経細胞保護作用を示す図である。(b)アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を用いた、GSK3bのリン酸化レベルの回復作用を示す図である（実施例１０）。アポリポ蛋白E含有リポ蛋白による、LRP1-NMDA受容体コンプレックスの形成促進作用を示す図である（実施例１１）。アポリポ蛋白E含有リポ蛋白の硝子体内投与による、GLAST-KOマウス（正常眼圧緑内障モデル）の網膜神経節細胞死の抑制効果を示す図である（実施例１２）。グルタミン酸とグリシンとの混合物がＲＧＣ中でアポトーシスを誘発することを示す図（実施例１９）。ＲＧＣ中でのグルタミン酸誘発神経毒性に関与する物質を示す図（実施例２０）。グルタミン酸誘発アポトーシスを予防するリポタンパク質を示す図（実施例２１）。 LRP1とNMDA受容体との相互反応による細胞内Ca²⁺の上昇がE-LPによって抑制されることを示す図（実施例２２）。ホスホリバーゼＣ、プロテインキナーゼCδならびにGSK3βによるグルタミン酸誘発神経毒性に対するE-LPの保護効果を示す図（実施例２３）。細胞体におけるグルタミン酸誘発アポトーシスを示す図（実施例２４）。 E-LPによるGlast+/-ならびにGlast-/-マウス中のRGC生存の回復を示す図（実施例２５）。 Glast+/+ならびにGlast-/-マウスの硝子体中のアポリポ蛋白Eと、硝子体内に注射したE-LPに含まれるアポリポ蛋白Eの量を比較したプロット結果を示す図（実施例２６）。 E-LPによってα2マクログロブリンの神経保護抑制効果が抑止されることを示す図（実施例２７）。グリア細胞からのalpha 2-macroglobulin放出量の減少を示す図（実施例２８）。

上述したように、本発明者は、この発明に使用するアポリポ蛋白E含有リポ蛋白が、生体外（in vitro）の系において、グルタミン酸により誘導される培養大脳皮質神経細胞および網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することを確認している。つまり、このメカニズムは、リポ蛋白がリポ蛋白受容体ファミリーの一つであるLRP1（low density lipoprotein receptor-related protein 1）に結合して複合体を形成し、グルタミン酸受容体の活性を抑制することに起因すると考えられる。

そこで本発明者は、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白が生体内（in vivo）の系においても神経保護効果を示すかを、神経変性疾患の１つである緑内障のモデル動物GLAST欠損マウスを使用して検討した。その結果、硝子体液中には多量のマウスリポ蛋白が存在しているにもかかわらず、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白の硝子体投与によって、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制できることを明らかにした。驚いたことに、本発明者は、マウス硝子体中には本来脂質とアポ蛋白が結合したリポ蛋白が多量に存在しているにもかかわらず、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白を少量その硝子体中に注射することによって、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白が網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制できるという格別の作用効果を確認したのである。

したがって、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白は、生体外の系ばかりではなく、生体内の系においても、神経疾患のうち、神経変性、特に神経細胞のアポトーシスを抑制することができることが明らかになった。

また、この発明のアポリポ蛋白E含有リポ蛋白は、アポリポ蛋白の１種であるアポリポ蛋白Eと、脂質とが化学的に会合した状態にあるアポリポ蛋白結合リポ蛋白である。かかるアポリポ蛋白E含有リポ蛋白としては、例えば、グリア細胞由来アポリポ蛋白E含有リポ蛋白、血液から分離したアポリポ蛋白E含有リポ蛋白含有高比重リポ蛋白、人工的に再構成したアポリポ蛋白E含有リポ蛋白などを挙げることができる。なお、高比重リポ蛋白は、そのうちの一部がアポリポ蛋白E含有リポ蛋白であり、他にもアポリポ蛋白A1やJ、Dなどを含む高比重リポ蛋白を含んでいる。したがって、血液から分離した高比重リポ蛋白とは、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白を含む様々な高比重のリポ蛋白の画分（溶液）である。

また、この発明において、前述したように、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白の神経保護効果に関わる分子であって、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白により活性化されて神経保護効果を奏する神経保護分子と、不活性化（抑制）されて神経保護効果を奏する神経変性誘導分子とが包含される。神経保護分子としては、例えば、リポ蛋白受容体、ホスホリパーゼC、プロテインキナーゼCδなどが挙げられる。一方、神経変性誘導分子としては、例えば、NMDA受容体、カルシウム、またはGSK3βなどが挙げられる。このうち、リポ蛋白受容体は、中枢神経系でアポ蛋白Ｅと結合するリポ蛋白受容体ファミリーの受容体であって、例えば、LRP1受容体、LDL受容体、ApoER2受容体、VLDL受容体、LR11受容体、LRP4受容体、LRP1B受容体、Megalin受容体、LRP5受容体、LRP6受容体などが挙げられ、これらのうち、LRP1受容体が特に好ましい。

上述したように、この発明に係るアポリポ蛋白E含有リポ蛋白は、特に生体内の系においても、神経疾患の神経変性を抑制することができることから、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を有効成分または作用機序として利用する神経変性抑制剤、例えば神経細胞アポトーシス抑制剤などの神経疾患予防・治療剤として適用することができる。またかかる神経変性抑制剤としては、例えば、緑内障または糖尿病性網膜症等の予防もしくは治療薬などが挙げられる。

この発明に係る神経疾患予防・治療剤は、経口的または非経口的に投与することができ、剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤、輸液剤、注射剤、点眼薬、坐剤、軟膏剤、貼付剤などを挙げることができる。なお、この発明の神経疾患予防・治療剤を緑内障・糖尿病性網膜症予防・治療薬として適用する場合には、非経口的投与、特に硝子体注射による投与が好ましく、剤型としては、点眼薬、眼科用注射剤などの眼科用組成物が好ましい。

この発明の神経疾患予防・治療剤を輸液剤として生体内に投与する際には、生理食塩水に、必要に応じて他の水溶性の添加剤、薬液を配合したものを用いることができる。このような水に添加される添加剤としては、カリウム、マグネシウム等のアルカリ金属イオン、乳酸、各種アミノ酸、脂肪、グルコース、フラクトース、サッカロース等の糖質等の栄養剤、ビタミンA、B、C、D等のビタミン類、リン酸イオン、塩素イオン、ホルモン剤、アルブミン等の血漿蛋白、デキストリン、ヒドロキシエチルスターチ等の高分子多糖類等を挙げることができる。このような水溶液における化合物の濃度は、10^-7Mから10^-5Mの濃度の範囲とすることが好ましい。

この発明による神経疾患予防・治療剤はまた、固形剤として生体に投与することができる。固形剤としては、粉末、細粒、顆粒、マイクロカプセル、錠剤等を挙げることができる。このような固形剤の中では、好ましくは嚥下しやすい錠剤の形状をしていることが好ましい。

錠剤を形成するための充填剤、粘結剤としては公知のもの、例えばオリゴ糖等を使用することが出来る。錠剤の直径は２〜１０ｍｍ、厚さは１〜５ｍｍの範囲にあることが好ましい。また、他の治療薬と混合して使用してもよい。

固形剤には通常用いられる種々の添加剤を配合することができる。このような添加剤としては、例えば、安定剤、界面活性剤、可溶化剤、可塑剤、甘味剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤、保存剤、無機充填剤等を挙げることができる。

界面活性剤としては、高級脂肪酸石鹸、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アシルＮ−メチルタウリン塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩等のアニオン界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤、ポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤があるが、これらに限定されるものではない。

嚥下性等の改良等の目的のため配合される無機充填剤としては、例えば、タルク、マイカ、二酸化チタン等を挙げることができる。

安定剤としては、例えば、アジピン酸、アスコルビン酸等を挙げることができる。可溶化剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリルアルコール等の界面活性剤、アスパラギン、アルギニン等を挙げることができる。甘味剤として、アスパルテーム、アマチャ、カンソウ等、ウイキョウ等を挙げることができる。

懸濁化剤としては、カルボキシビニルポリマー等を、抗酸化剤としては、アスコルビン酸等を、着香剤としては、シュガーフレーバー等を、ｐＨ調整剤としてはクエン酸ナトリウム等を挙げることができる。

この発明の神経疾患予防・治療剤は、通常１回１〜４０mg、好ましくは１０mg〜２０mg、１日３回までの範囲で体内に投与される。

なお、この発明において、好ましい態様である神経疾患予防・治療剤を点眼薬または眼科用注射剤などとして使用する場合は、その薬剤には、この発明の作用効果を妨げない限り、さらに種々の成分、例えば、薬理活性成分や生理活性成分などが組み合わせて含有されていてもよい。かかる成分は、特に限定されるものではなく、例えば、充血除去成分、α−アドレナリン作動薬成分、抗炎症薬成分、ビタミン類、アミノ酸類、糖類、ステロイド成分、抗ヒスタミン薬成分、抗アレルギー薬成分などが挙げられる。

充血除去成分としては、例えば、エピネフリン、エフェドリンなど、α−アドレナリン作動薬としては、例えば、イミダゾリン誘導体（ナファゾリン、テトラヒドロゾリンなど）、β−フェニルエチルアミン誘導体（フェニレフリン、エピネフリン、エフェドリン、メチルエフェドリンなど）など、抗炎症薬成分としては、例えば、インドメタシン、ベルベリン、セレコキシブ（celecoxib）、ロフェコキシブ（rofecoxib）など、抗ヒスタミン薬成分または抗アレルギー薬成分としては、例えば、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、イプロヘプチンなど、ビタミン類としては、例えば、ブルタチオンやビタミンＣ，Ｅ，Ｂ₆など、アミノ酸類としては、例えば、ロイシン、イソイロイシン、バリン、メチオニンなど、トレオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸など、糖類としては、例えば、グルコース等の単糖類、（例えば、トレハロース、ラクトース、フルクトース等の二糖類、ラクツロース、ラフィノース、プルラン等のオリゴ糖類、アラビアゴム、カラヤガム、キサンタンガム、グアーガム、トラガント等の多糖類など、ステロイド成分としては、例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロンなどが挙げられる。

この発明に係る神経疾患予防・治療剤は、当該技術分野において常用されている製剤化技術によって製剤化することができる。つまり、この発明の神経疾患予防・治療剤は、この発明の有効成分であるアポリポ蛋白E含有リポ蛋白を、安定剤、可塑剤、抗酸化剤、甘味剤、着香剤、保存剤、無機充填剤等の賦形剤と混合して所定の剤型に製剤化することができる。

また、この発明は、この発明に係るアポリポ蛋白E含有リポ蛋白またはリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を有効成分または作用機序として含有する神経疾患予防・治療剤を、神経疾患、特に神経変性疾患に適用することによって、神経疾患を予防・治療することができる神経疾患予防・治療方法を提供することができる。つまり、この発明の神経疾患予防・治療方法は、この発明の神経疾患予防・治療剤を、錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤などの剤型で経口的または輸液剤、注射剤などの剤型で非経口的に投与することからなっている。

以下の実施例によりこの発明を更に詳しく説明するが、この発明はこれらの実施例によって一切限定されるものではない。以下の実施例は、この発明をより理解できるように例示としてだけ記載するものであって、この発明を限定する意図で記載するものでは一切ない。

（材料）
この発明で使用する材料のうち、ウサギポリクローナル抗LRP1 抗体 (R2629) は、Ｄ．Ｋ．ストリックランド博士（Dr. D. K. Strickland; 米国ボルチモア・メリーランド大学医学部）の好意によって提供された。組換えヒトアポ蛋白Ｅ3 およびアポ蛋白Ｅ4は和光純薬（大阪）から購入した。GLAST-/- マウスのコロニーは、東京医科歯科大学（東京）から得たマウスを用いて熊本大学で確立した。なお、全ての実験方法は、熊本大学動物取扱委員会の承認を得て行った。

（ラット網膜神経節細胞の初代培養）
生後２日のSprague Dawley（SD）系ラットを用いて、バレスらの方法（Barres et al.、1988）を多少改良した方法（Hayashi et al., J Biol Chem 2009）に従って網膜神経節細胞の初代培養を行った。単離した網膜神経節細胞（RGC）を RGC培地（1 mM グルタミン、5μg/ml インスリン、60μg/ml N−アセチルシステイン、62 ng/ml プロゲステロン、16μg/ml プトレシン、40 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム塩、0.1 mg/ml ウシ血清アルブミン、40 ng/ml トリヨードチロニン、0.1 mg/ml トランスフエリン、1 mM ピルビン酸ナトリウム塩、2 % B27 サプリメント(Invitrogen, Carlsbad, CA), 10μM ホルスコリン(Sigma, St. Louis, MO), 50 ng/ml 脳由来神経栄養因子 (BDNF; PeproTech, Rocky Hill, NJ), 50 ng/ml 毛様体神経栄養因子(CNTF; PeproTech) 、ならびに50 ng/ml 塩基性繊維芽細胞増殖因子 (bFGF; PeproTech）の基本培地中に懸濁した。９６ウエルプレートをポリ−ｄ−リジン(Sigma) とラミニン(Sigma)でコーティングし、RGCを、９６ウエルプレートに対し各ウエル当たり5,000 個の細胞、マイクロディッシュに対し各培養インサート当たり5,000個の細胞、または区画培養用のディッシュ当たり15,000個の細胞になるように装着した。続いて実験前に少なくとも１０日間培養した。

（グリア細胞由来リポ蛋白の製造）
グリア細胞由来リポ蛋白をグリア細胞用に調整した培地から単離した。グリア細胞は、生後２日のSD系ラットの大脳皮質から調製し、１０％ウシ胎児血清含有ダルベツコ変法イーグル培地中で培養した。グリア細胞培地は星状細胞が＞８０％になるまで濃縮した(Hayashi et al., J Biol Chem 2009) 。グリア細胞は、ホルスコリン、BDNF、CNTF およびbFGFを含有しないRGC培養培地で３日間培養した。この培養培地をグリア細胞調製用培地とした。

本実施例は、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することを示す実験である。実施例１で生後２日のラットから初代培養した網膜神経節細胞を１４日間以上培養し、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制する作用を有するかどうかについて下記の方法に従って実験を行った。その結果を図１に示す。図中、Contは未処理群、Gluは３００μM グルタミン酸添加群、+glial LPは３００μM グルタミン酸+グリア細胞由来アポリポ蛋白E添加群を表している。Glial LPは１μg cholesterol/mlの濃度で添加した。処理後、２４時間で核の凝集（a: Hoechst33342による核染色）またはエステラーゼ活性／膜の透過性保持（b: calcein AM/Propidium Iodide染色）を観察することにより、アポトーシス様細胞の割合を算出した。この結果、グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸によって誘導される網膜神経節細胞のアポトーシスを有意に抑制することが分かった（*p<0.05: Glu vs. Glu + glial LP）。

本実施例は、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による大脳皮質神経細胞のアポトーシスを抑制することを示す実験である。胎生１６日齢のラットから初代培養した大脳皮質神経細胞を６日間培養し、実施例２で得られたグリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸による大脳皮質神経細胞のアポトーシスを抑制する作用を有するかどうかについて実施例３と実質的には同様に実験を行った。その結果を図２に示す。図中、Contは未処理群、Gluは３００μM グルタミン酸添加群、+glial LPは３００μM グルタミン酸+グリア細胞由来アポリポ蛋白E添加群を表している。Glial LPは１μgコレステロール/mlの濃度で添加した。処理後、２４時間で核の凝集を、Hoechst33342にて核染色して観察することにより、アポトーシス様細胞の割合を算出した。この結果、グリア細胞由来アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グルタミン酸によって誘導される大脳皮質神経細胞のアポトーシスを有意に抑制することが分かった（*p<0.0001: Glu vs. Glu+glial LP）。

（血漿HDLの製造）
マウス血漿HDL またはラット血漿HDLは、 C57BL/6J マウスまたはSD系ラットの腹部大動脈血からそれぞれ単離した。

本実施例では、実施例５でラット血液から単離した高比重リポ蛋白(HDL) が、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制するかどうかを実施例３と同様に実験した。その結果、ラット血液から単離したHDLが、実施例３と同様の方法で誘導されたアポトーシスを抑制した（図３参照。*p<0.05: Glu vs. Glu+HDL）。HDLは１μg cholesterol/mlの濃度で添加した。またアポトーシス様細胞はHoechst 33342 による核染色より算出した。

（人工再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白の製造）
再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白（E-LP）は上述した方法によって製造した(Hayashi et al., J Neurosci 2007)。この再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白は、１−パルミトイル−２−オレイル−グリセロホスホコリン (POPC; P3017, Sigma)、コレステロール (C3045, Sigma) および組換えヒトアポ蛋白Ｅから構成されていて、この成分のモル比は１００：１０：1または１００：０：1だった。調製用培地、血漿または再構成アポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を含む溶液は非連続ショ糖勾配に供した。用いた溶液の組成は、密度1.30 g/mlについて3 ml、密度1.2 g/mlについて3 ml 、密度1.1 g/ml について3 ml、密度1.006 g/ml について6 ml であった。ショ糖勾配は、SRP28SA1ローター (Hitachi, Tokyo, Japan) を用いて100,000 g、４℃で７２時間遠心分離した。１０個の分画（1.5 ml）を勾配頂上から採取し、下記のようにしてアポ蛋白Ｅについて免疫ブロッティングした。アポ蛋白Ｅを含む分画（典型的には分画５−７）を合併し、Amicon Ultra filter（100 kDaまたは50 kDa分子量カットオフ；Millipore, Bedford, MA)。なお、リポ蛋白量は、HDLについてはコレステロール濃度（2μg/ml）によつて、また再構成リポ蛋白についてはタンパク濃度（100
ng/ml）によって調整した。このコレステロールならびにタンパク濃度は、LabAssay cholesterol kit（Wako）ならびにBCA protein assay kit （Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL）にてそれぞれ測定した。

本実施例では、実施例７で得られたヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP)、グルタミン酸による網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制するかどうかを実施例３と同様に実験した。その結果、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) が、実施例３と同様の方法で誘導されたアポトーシスを抑制した（図４参照。*p<0.05: Glu vs. Glu+LP）。なお、ヒトアポ蛋白Ｅ3は、100ng protein/mlの濃度で添加した。アポトーシス様細胞はHoechst33342による核染色より算出した。

本実施例では、グルタミン酸によって誘導される網膜神経節細胞のアポトーシスに、NMDA受容体、カルシウム、カルパイン、カルシニューリン、カスパーゼなどの神経変性誘導分子が関与しているかどうかを実施例３の方法に従って同様に実験した。その結果を図５に示す（*p<0.05: Glu vs. Glu+MK801, ALLN, FK506 or Z-VAD）。図中、（a）は、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDA受容体）に対する阻害薬MK801 (10μM) によりアポトーシスが阻害されていることを示している。（b）は、カルシウムを含まない培養液中では、グルタミン酸によるアポトーシスが誘導されなかったことを示している。（c）は、カルパイン阻害薬ALLN (1μM) によりアポトーシスが阻害されたが、ALLNを溶解しているジメチルスルホキシド (DM) は阻害効果を示さなかった。（d）は、カルシニューリン阻害薬FK506 (1μM) によりアポトーシスが阻害されたことを示している。（e）は、カスパーゼ阻害薬Z-VAD-FMK (20μM) によりアポトーシスが阻害されたことを示している。なお、アポトーシス様細胞はHoechst33342による核染色より算出した。

本実施例は、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) がLRP1（low density lipoprotein receptor-related protein 1）を介して網膜神経節細胞を保護し、そのメカニズムにはGSK3βが関与していることを示している（図６参照。*p<0.05: Glu+LP vs. Glu+LP+anti-LRP1）。図６aは、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP)による神経保護効果が、LRP1に対する抗体 (10μg/ml) で阻害されたが、normal IgGでは阻害されなかったことを示している。なお、アポトーシス様細胞はHoechst33342による核染色により算出した。また、図６bは、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) が、glycogen synthase kinase 3β(GSK3β) のリン酸化レベルを回復させたことを示している。グルタミン酸処理後１８時間で、網膜神経節細胞を回収し、ウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロットには、ウサギ抗リン酸化GSK3β （p-GSK3β）抗体およびウサギ抗GSK3β抗体を使用した。

本実施例は、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP) は、LRP1とNMDA受容体の複合体形成を促進することを示している（図７参照）。網膜神経節細胞の培養液中にLPを添加し、１５分後に細胞を回収し、下記に示すように免疫沈降 (IP) を行った。免疫沈降にはウサギ抗NMDA受容体２B抗体を使用し、LRP1およびNMDA受容体2Bのウェスタンブロットを行った。

本実施例は、ヒトアポ蛋白Ｅ3を含む再構成リポ蛋白 (LP)が、正常眼圧緑内障モデルであるGLAST欠損マウスの網膜神経節細胞死を抑制するかどうかを調べる実験である。本実験では、３週齢GLAST欠損マウス（3w KO）にLP（100ng protein/ml）またはリン酸緩衝液（対照群）を硝子体内投与した。６週齢の時点で眼球を摘出し、パラフィン固定、ヘマトキシリン・エオジン染色後、網膜上の網膜神経節細胞をカウントした。

この結果から、LPが、硝子体中にはマウスＬＰが多量に存在するにも拘わらず、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することが明らかになった。このメカニズムは、リポ蛋白がリポ蛋白受容体ファミリーの１つであるLRP1に結合し複合体を形成し、グルタミン酸受容体の活性を抑制することに起因すると考えられる。

（アポ蛋白Ｅ-ＬＰの硝子体中注射および硝子体液の採取）
３週齢GLAST+/- またはGLAST-/-マウスを50 mg/kgペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射して麻酔した。硝子体中注射をするために、一方の眼の硝子体に1μlアポ蛋白Ｅ-LP (1.5μg蛋白/ml) またはHDL (30μgコレステロール/ml)をポリエチレンチューブ(SP8, Natume, Tokyo, Japan)と10μl Hamilton注射器 (Hamilton, Bonaduz, Switzerland) に取り付けた33-gauge nanopass注射針 (Terumo, Tokyo, Japan) を用いて注射し、他方の眼の硝子体には同量のPBSを注射した。この操作は、水晶体と網膜を傷つけないように実体顕微鏡下で慎重に行った。硝子体液の採取も硝子体中注射と同じ注射針を用いて行った。

（マウス網膜の組織学的研究）
６週齢のマウスの眼球を摘出し、Super Fix (KY-500, Kurabo, Osaka)を用いて４℃で一夜固定し、角膜と水晶体を実体顕微鏡下で除去した。強膜付網膜はパラフィンに包埋した。次に、網膜の4μm パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。連続した切片から各５個の切片を選択し、神経節細胞層中の細胞数を網膜切片上の一端から視神経を介して他端に亘って計数した。各網膜の１０個の切片において、2,000個以上の細胞が計数された。

（免疫ブロッティング）
上記実施例で用いられた免疫ブロッティングは次のようにして行った。つまり、上記各実施例で得られたリポ蛋白は、62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)、10% グリセロール、2% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) および5% β−メルカプトエタノール（サンプルバッファー）に溶解し、５分間煮沸した。得られた蛋白は、0.1% SDS含有ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にて分離し、ポリビニリデンジフルオライド・メンブレンに移した。次いで、メンブレンは、TBS-T (10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaClおよび0.1% Tween 20) を入れた5% 脱脂乳と共に室温で１時間培養した後、5%ウシ血清アルブミン追加TBS-T中において一次抗体を用いて一夜プローブした。続いて、メンブレンを、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG (Thermo)、ヤギ抗マウスIgG (Thermo) またはマウス抗ヤギIgG (Thermo)を用いてさらに室温で１時間プローブした。免疫反応性蛋白は、化学発光分析法GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) またはSuper Signal West Dura (Thermo)にて可視化した。使用した一次抗体は次の通りであった：マウス抗β−アクチン (a5441, 希釈1:10,000, Sigma), ヤギ抗ヒトアポ蛋白Ｅ (k74190g, dilution 1:5000, Biodesign, Saco, ME)、ヤギ抗マウスアポ蛋白Ｅ(sc-6384, 希釈1:1000, Santa Cruz)、ウサギ抗ヒトGSK3βおよびホスホ−Ser 9−GSK3β (9315 and 9336S, 希釈1:1000, Cell signaling Technology, Danvers, MA)、ヤギ抗ヒトBrn-3a (sc-31984, 希釈1:1000, Santa Cruz)、ウサギ抗ヒトLRP1 (2703-1, 希釈1:1000, Epitomics)、マウス抗ヒトLRP1 (545503, 希釈1:1000, R&D systems, Minneapolis, MN)、ウサギ抗ウシホスホリバーゼCγ1 (sc-81, 希釈1:1000, Santa Cruz) およびマウス抗ラットNMDAR2B (610416, 希釈1:1000, BD Biosciences, San Jose, CA)。

（RGCの免疫細胞化学）
培養RGCは、リン酸バッファー生理食塩水(PBS)で２度洗浄し、アセトンを用いて１０分間４℃で固定した。次いで、RGCを、1%ウシ血清アルブミンおよび5% ヤギ血清のPBS溶液を用いて室温で１時間ブロックした後、ウサギ抗ヒトLRP1 (希釈度1:2000, Epitomics)、マウス抗NMDAR2B (32-0700, 希釈度1:500, Invitrogen)、マウス抗ラットチトクロームc (556432, 希釈度、1:3000, BD Biosciences) のPBS溶液（1% ウシ血清アルブミンおよび5% ヤギ血清を含む）を用いて室温で１時間培養した。得られた細胞は、PBSで３回洗浄した後、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG (希釈度1:200, Invitrogen)、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗マウスIgG (希釈度1:200, Invitrogen) またはAlexa Fluor 594結合抗マウスIgG (希釈度1:200, Invitrogen) を用いて室温で１時間培養した。得られたRGCは、PBSで３回洗浄した後、Fluormount/Plus (Japan Tanner, Osaka, Japan)を用いて免疫応答を開始した。ミトコンドリアの染色のために、RGCは、実験の１日前に、2 nM MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen)を用いて３７℃で３０分間培養した。写真は、Olympus IX71顕微鏡 (Tokyo, Japan) またはOlympus FV500共焦点顕微鏡で撮影した。

RGC中のアポトーシス誘導および検出は次のようにして行った。つまり、RGCは、2.4 mM CaCl₂、20 mM HEPES含有およびマグネシウム非含有のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で2回洗浄し、上記ハンクス平衡塩類溶液に300μMグルタミン酸塩および10μM グリシンを添加して調製した培地中において３７℃で２時間培養した。グルタミン酸塩での処理後、RGCを、ホルスコリン、BDNF、CNTFならびにbFGFを含まないRGC培養培地を用いて３７℃で２２時間培養した。アポトーシスを検出するために、RGCを1μg/ml Hoechst 33342 (346-07951, Dojindo, Kumamoto, Japan)または1μg/mlカルセイン−AM／プロピジウムヨーダイド (341-07381, Dojindo)で染色した。蛍光画像はOlympus IX71顕微鏡を用いて観察した。上記Hoechst試薬で染色した断片化もしくは凝集した核は、アポトーシスした核として、また丸く滑らかな核は健全な核として計数した。健全な核はプロピジウムヨーダイドで染色されないので、プロピジウムヨーダイドで染色された核は、アポトーシスした核として計数した。各グループ中300個以上の核が計数された。

RGC中へのカルシウム流入は次のようにして確認した。つまり、RGCをマイクロデイッシュ上で少なくとも１４日間培養した後、3μM Fluo-8アセトキシメチルエステル(AAT Bioquest, Sunnyvale, CA)を用いて３７℃で３０分間培養した。得られた細胞を上記HBSS500μlで２回洗浄した後、300μM グルタミン酸塩および10μM グリシンを注入した。蛍光画像は、ORCA-R2デジタルCCDカメラ(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan)を用いて、各500msec毎に撮影し、MetaFluor fluorescence ratio imaging software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) を用いて分析した。

RGCの区画培養は次のようにして行った。区画培養のためにRGCを既知文献記載の方法に従って調製した(Hayashi et al., J Biol Chem 2004)。マイクロデイッシユをポリ−ｄ−リジンとラミニンでコーティングした後、デイッシュの表面をひっかいて２０本の平行な溝を作製し、デイッシュ上にテフロン（登録商標）製３区画デバイダーをシリコーングリースで装着した。この中央の区画に、25 ng/ml BDNFおよび25 ng/ml CNTFを含むRGC培養培地を入れた後、デイッシュ当たり10,000-15,000個のRGC細胞を播種した。両側の区画には、75 ng/ml BDNF、25 ng/ml CNTFおよび50 ng/ml bFGFを含むRGC培養培地を入れた。RGCの軸索は、シリコーングリース下を越えて両側の区画に５日以内に侵入した。実験開始前、RGCの区画培養は少なくとも14日間行った。

免疫沈降法は次のようにして行った。つまり、共免疫沈降法は、RGC溶解液を、10 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl、1 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂および1 % トリトンX-100混合液にコンプリートEDTAフリープロテアーゼ・インヒビター・カクテル(Roche, Mannheim, Germany) とPhosSTOPホスファターゼ・インヒビター・カクテル (Roche)を加えた混合液を用いてメイらの方法（May et al.、2004）に従って行った。RGCは、HBSSで１回洗浄し、各ウエル当たり40μlの溶解バッファーを用いて９６ウエルプレートに採取した。９−１２ウエルからの溶解液を各グループ毎に合併した。RGC溶解液は、22-gauge 注射針中を１５回通し、15,000 x g、４℃で１５分間遠心分離した。得られた上澄液は、40μlの50 % 平衡化蛋白G−セファロース(GＥ Healthcare, Buckinghamshire, UK)で４℃で１時間前処理し、セファロースビーズを遠心分離で除去した。ウサギ抗LRP1抗体(希釈度1:200; 2703-1, Epitomics, Burlingame, CA) またはウサギ抗NR2B抗体(希釈度1:200; AB1557, Millipore) を添加した後、RGC溶菌液を４℃で１２時間回転させた。得られた溶菌液に、40μlの50 % 平衡化蛋白G−セファロースを添加し、４℃でさらに１時間回転させた。セファロースビーズを0.1 % トリトンX-100を含む溶菌バッファーで３回洗浄した。免疫ブロッティングのために30μlサンプルバッファーを添加した後、セファロースビーズを５分間煮沸した。得られた上澄液をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と免疫ブロッティングに供した。

本実施例では、グルタミン酸とグリシンによるＲＧＣでのアポトーシス誘発を調べた。

図９Ａは、コントロール（C; HBSS）後またはグルタミン酸単独（Glu(-); 300μM glutamate）、グリシン単独（Gly(-); 10μM glycine）もしくはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色で検出されたＲＧＣ中の断片化もしくは収縮した核を示す。データは、独立した実験４回の平均＋/−SE値である（＊：p<0.001 (C vs Glu)）。図９Ｂは、コントロール（C; HBSS）またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）をHBSSで非洗浄ならびに１５分間１回、２回または３回洗浄処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色で検出されたＲＧＣ中の断片化もしくは収縮した核を示している。図９Ｃは、コントロールまたはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 30μM glutamate + 10μM glycine）での処理１２時間後にAnnexin V-EGFP、propidium iodideおよびHoechst染色したＲＧＣの蛍光像を示す。スケールバーは20μmである。図９Ｄは、2 nM MitoTracker Red (Mito)で処理したRGCを、コントロールまたはGlu処理１２時間後に抗チトクロームｃ（Cyto C）で免疫染色したRGCを示す。スケールバーは20μmである。

本実施例では、ＲＧＣ中でのグルタミン酸誘発神経毒性に関与する物質について調べた。

コントロール（HBSS）後またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によってＲＧＣ中に断片化もしくは収縮した核が検出された。

図１０Ａは、Ca²⁺の非存在下（no Ca²⁺）または存在下（Ca²⁺）で細胞をグルタミン酸と共に培養した。グルタミン酸誘発神経毒性に関与する物質を示す図。図１０Ｂでは、RGCは10μM MK801（NMDA受容体のインヒビター）、図１０Ｃでは1μM ALLN（カルパインインヒビター）、図１０Ｄでは1μM FK506（カルシニューリン・インヒビター）、図１０Ｅでは200μM MK801（Bax-inhibitory peptide V5;BIP-V5;Baxのインヒビター）、図１０Ｆでは20μM Z-VAD-fmk (Z-VAD;カスパーゼインヒビター）で処理、またはGluを添加した時はジメチルスルホキシドで処理した。図１０Ｂ−Ｆでは、＊：p<0.001（Glu vs. Glu+inhibitor）。データは、独立した実験４回〜６回の平均＋/−SE値である。

本発明者は、栄養性付加物の除去によるRGCのアポトーシス誘発がグリア由来E-LPにより抑制されることを以前報告している。そこで、本実施例では、リポ蛋白がグルタミン酸誘発アポトーシスを予防するかどうかについて調べた。

グリア由来E-LP、血漿HDLならびに再構成E-LPは次のようにして抽出した。まず、グリアを、２日齢のSprague Dawleyラットの大脳皮質から抽出し、0.25％トリプシンで消化し、10％ウシ胎児血清含有ダルベツコ修飾イーグル培地中で培養した。グリアは、RGCに使用した同じ培地（ただし、ホルスコリン、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子ならびに塩基性繊維芽細胞増殖因子は含まず）で３日間培養した。得られた培養液を1000xgで１０分間遠心分離し、得られた上清液をグリア調整培地とした。マウスもしくはラットHDLは、C57BL/6JマウスもしくはSprague Dawleyラットの腹部大動脈から採血した血液から単離した。再構成E-LPは、文献記載の方法で調製した。再構成E-LPには、1-パルミトイル-1-オレオイル-グリセロホスホコリン、コレステロールならびに組換えヒトアポＥをモル比100：10：1または100：0：1の割合で添加した。1-パルミトイル-1-オレオイル-グリセロホスホコリン（2.71 mg）を、単独またはコレステロール（0.14 mg）と混合して、クロロホルムに溶解し、窒素ガス下で蒸発させた。その後、400μlの0.9％NaCl含有10 mM Tris-HCl (pH 7/4) を添加し、氷上で１時間培養した後、15 mg/mlコール酸ナトリウム（100μl）を添加した。得られた混合物を氷上で２時間培養した後、組換えアポＥ３またはＥ4（1mg）と混合し、氷上で１時間培養した。次いで、Bio-Beads (100 mg； Bio-Rad, CA)を添加し、４℃で３時間回転し、ビーズを除去した。この混合物は再構成リポタンパク質を含有していた。グリア調整培地、血漿または再構成リポ蛋白を、下記溶液による非連続ショ糖勾配100000xg、４℃で７２時間遠心分離した：密度1.30 g/ml（3ml）、密度1.2 g/ml（3ml）、密度 1.1 mg/ml（3ml）ならびに密度1.006 g/ml（6ml）。勾配頂上部１０分画（1.5ml）を採取し、アポＥについてイムノブロツトした。アポＥ含有分画を濃縮した後、グリア由来E-LPならびにHDLのためにコレステロール濃度（2μg/ml）または再構成リポ蛋白のためにタンパク質濃度（100ng/ml）に調整した。リポタンパク質のコレステロール濃度ならびにタンパク質濃度は、LabAssay cholesterol kit（ワコー純薬）ならびにBCA protein assay kit（Termo Fisher Scientific, IL）を用いて測定した。α２マクログロブリンは、100mMメチルアミンで室温で１時間処理して活性化した。

RGCのアポトーシスは次のようにして測定した。初代培養したRGCを、マグネシウムを含まない2.4 mM CaCl₂と20mM 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）を含むHank’sBalanced Salt Solution (HBSS)を用いて３７℃で１５分間２回培養して洗浄した。NMDA受容体がブロックされることから、マグネシウムを洗浄液から排除した。その後、RGCを、2.4 mM CaCl₂と20 mM HEPES含有（マグネシウム無含有）HBSS中で、300μMグルタメート＋10μMグリシン（NMDA受容体の共活性化剤）非処理または処理後３７℃で２時間培養した。コントロール（2.4 mM CaCl₂と20 mM HEPES含有（マグネシウム無含有）HBSS）またはグルタミン酸非処理または処理後、RGCを、RGCに使用した同じ培地（ただし、ホルスコリン、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子ならびに塩基性繊維芽細胞増殖因子は含まず）で３７℃で２２時間培養した。ヘキスト33342（同仁化学）を用いてアポトーシスを検出するために、RGCを1μg/mlのヘキスト33342と一緒に１５分間培養した。蛍光イメージ（６イメージ/ウエル）はIX71蛍光顕微鏡でランダムに撮影した。各処理に対して、９６ウエルにおいて少なくとも１ウエル当たり１２イメージを撮影した。ヘキスト染色した断片化もしくは収縮した核を、アポトーシスした神経細胞として計数し、丸いまたは平滑な核を正常な神経細胞として計数した。各処理に対して300個以上の神経細胞を盲検的に計数した。アネキシンV-EGFP含有Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit（MBL）、プロピジウムヨーダイドならび結合バッファーでのアポトーシス検出は製造者のマニュアルに従って行った。アポトーシスの初期段階期間では、ホスファチジルセリンが血漿メンブレンの外側リーフレット上に露出してきて、アネキシンVで染色される。プロピジウムヨーダイドは、壊死細胞ならびに末期段階のアポトーシス性細胞を染色する。一方、正常な細胞はいずれの試薬によっても染色させない。

つまり、グリア調節培地（GLP）から抽出したグリア由来リポタンパク質（2μコレステロール/ml）と、ラット血漿から抽出したHDL（2μコレステロール/ml）を使って、これらのリポタンパク質がRGCをグルタミン酸誘発毒性から保護できるかどうかを実験した。この実験は、コントロール（HBSS）後またはグルタミン酸グルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理して２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によってRGC中に断片化もしくは収縮した核が検出されるかを調べた。その結果、これら２つのタイプのアポＥ含有リポタンパク質は、RGCをグルタミン酸誘発毒性から保護した（図１１Ａ）。

また、組換えアポＥ、コレステロールならびにリン脂質含有再構成E-LPは用量依存的にRGCを保護した（図１１Ｂ）。

さらに、神経保護のために必要なE-LPの成分について調べた結果、この保護には、アポＥと脂質との関連が必要であることが分かった（図１１Ｃ）。しかしながら、コレステロール（11 ng/ml）単独でも、コレステロールとホスファチジルコリン（11 ng/ml）との混合物でも生存を促進しなかったのに対して、アポＥ（100 ng protein/ml）はホスファチジルコリン（11 ng cholesterol/ml）と結合した場合に神経保護作用を有していた。さらに、コレステロールは、ホスファチジルコリンと結合するとアポＥの保護作用を強化した。なお、ホスファチジルコリン：コレステロール：アポEのモル比は、100±10：10±1：1±0.1（90〜110：9〜11：0.9〜1.1）であるのがよい。

さらにまた、ヒトアポＥ３ならびにＥ４イソ体は、神経変性、特にアルツハイマー病における神経変性に影響を及ぼしている。しかしながら、本発明者の実験によると、グルタミン酸処理RGC中におけるヒトアポＥ３ならびにＥ４含有リポタンパク質の神経保護効果については何ら差異は認められなかった。

図１１Ａは、グリア調節培地（GLP）から抽出したリポタンパク質（2μコレステロール/ml）中のアポＥ、ラット血漿から抽出したHDL（2μコレステロール/ml）中のアポＥ、ならびに再構成ヒトアポＥ含有リポタンパク質（E-LP）（100ngタンパク質/ml）に対するイムノブロットを示す。RGCは、GLP、HDLまたはE-LPと15分間培養した後、Gluを添加した。＊：ｐ＜0.005（Glu vs. Glu+GLP、Glu+HDL またはGlu+E-LP）。

図１１Ｂは、Glu誘発神経毒性に対するE-LPの用量依存性保護効果を示す。RGCは、E-LPと15分間培養した後、Gluを添加した。＊および＊＊：ｐ＜0.005およびｐ＜0.0001（Glu vs.Glu+E-LP）。

図１１Ｃは、脂質フリーのアポＥ（100 ng タンパク質/ml）、コレステロール (chol)（11 ng/ml）、ホスファチジルコリン＋コレステロール（PC+chol）リポソーム（11 ngコレステロール/ml）、PC+アポＥリポソーム（100 ngタンパク質/ml）、アポＥ含有E-LP、コレステロールとホスファチジルコリン（100 ngタンパク質/mlと11 ngコレステロール/ml）、またはマウス血漿からのHDL (MsHDL)（2μgコレステロール/ml）と培養後、Gluを添加した。＊および＊＊：ｐ＜0.001およびｐ＜0.0001（Glu vs.Glu+リポタンパク質）。

図１１Ｄでは、RGCは、再構成アポＥ３含有リポソーム（E3-LP）またはアポＥ４含有リポソーム（E4-LP）（100 ngタンパク質/ml）と15分間培養した後、Gluを添加した。＊：ｐ＜0.001（Glu vs. Glu+E3-LPまたはE4+LP）。

本実施例では、LRP1とNMDA受容体との相互反応による細胞間Ca²⁺の上昇がE-LPによって抑制されることを調べた。

RGCは、Fluo-8アセトキシメチルエステルで３０分間標識した後、Glu (300μMグルタメート＋10μMグリシン)を添加した。蛍光レシオイメージ（ratio image）は、図１２Ａ下部に示した色インデックスで示した色で表示された通りである。この色は、Glu刺激前の基底蛍光強度（レシオ１）に対応するレシオ０とレシオ２を表わしている。左側と右側のパネルは、GluとGlu+E-LPとをそれぞれ示している。このデータは、同様の結果を示した８回の実験のうちの１つの実施からのものである。スケールバーは80μmである。

図１２ＢおよびＣは、Fluo-8蛍光の変化をΔF/F0で表した図である。なお、図中、F0は、Glu刺激前の基底蛍光強度である。＊および＊＊：ｐ＜0.005およびｐ＜0.0001（Glu vs.Glu+E-LP）。RGCは、100 ng protein/ml E-LP、10μM MK801、100 ng protein/ml E-LP＋10μM MK801、100 ng protein/ml E-LP＋10μg/ml抗LRP1 抗体もしくは100 ng protein/ml E-LP＋10μg/mg IgGと共に１５分間培養した後、Gluを表示した量添加した。このデータは、同様の結果を示した６〜８回の実験の平均±SEである。図１２Ｄは、コントロール（HBSS）後またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によって検出された断片化もしくは収縮した核の割合を示す図である。RGCに、E-LP (100 ng protein/ml)、E-LP＋抗LRP1 抗体(10μg/ml)、またはE-LP＋IgG(10μg/mg)を１５分間添加した後、Gluを添加した。＊：ｐ＜0.01（Glu＋E-LP vs Glu＋E-LP＋抗LRP1）。このデータは、４回の実験の平均±SEである。図１２ＥおよびＦは、E-LPで無処理または処理RGCの培養液からLRP1（Ｅ）またはNMDA受容体サブユニットNR2B（Ｆ）の抗体を用いて免疫沈降した結果を示している。免疫沈澱物（ペレット）と上清液をLRP1、NR2BまたはNR2Aに対する抗体でプローブした。このデータは、同様の結果を示した３回の実験である１実験の平均±SEである。

本実施例では、ホスホリバーゼＣ、プロテインキナーゼCδならびにGSK3βによるグルタミン酸誘発神経毒性に対するE-LPの予防効果を調べた。

図１３Ａは、コントロール（HBSS）またはグルタミン酸＋グリシン（Glu; 300μM glutamate + 10μM glycine）で処理２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色によって検出された断片化もしくは収縮した核の割合を示す図である。RGCは、E-LP (100 ng protein/ml)またはE-LP＋U(5μM U73122、ホスホリバーゼＣインヒビター)と共に１５分間培養した後、Gluを添加した。このデータは、５回の実験の平均±SEである。＊：ｐ＜0.005（Glu＋E-LP vs Glu＋E-LP＋U）。

図１３Ｂは、RGCにおいて、PKCδsiRNAによってノックダウンされたプロテインキナーゼCδを示す図である。RGCは、300 nMネガテイブコントロール（NC）またはPKCδsiRNAと共に６日間培養した後、PKCδをイムノブロッテイングで検出した。βアクチンを内部コントロールとして使用した。断片化もしくは収縮した核は、ネガテイブコントロール（NC）またはPKCδsiRNAによるノックダウン後、C、GluまたはGlu＋E-LP処理し、２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色して検出した。データは、５回の実験の平均±SEである。＊：ｐ＜0.05（Glu＋E-LP＋NC vs Glu＋E-LP＋PKCδ）。

図１３Ｃは、RGCは、C、GluまたはGlu＋E-LP処理して１６時間後に採取した。RGCは、Ser9 (p-GSK3β) でリン酸化したGSK3βまたは全GSK3βに対する抗体でイムノブロットした。GSK3βのSer9リン酸化の定量は、４回の実験から示している。＊：ｐ＜0.001（Glu vs Glu＋E-LP）。

本実施例では、細胞体区画（末端軸索区画ではない）におけるグルタミン酸誘発アポトーシスを調べた。図１４Ａの上段のパネルにおいて、１トラックの位相差イメージは、細胞体が細胞体区画に局在しているとともに、軸索が右側の軸索区画に存在していることを示している。下端のパネルは、抗LRP1抗体または抗NR2B抗体で染色されたRGCを示している。スケールバーは50μmである。

図１４ＢおよびＣでは、断片化もしくは収縮した核は、細胞体（Ｂ）もしくは軸索（C）のグルタミン酸処理（Glu; 300μM glutamate＋10μM glycine）２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色により検出された。RGCは、100 ng protein/mlのE-LPと共に１５分間培養した後、Gluを細胞体（Ｂ）と軸索（Ｃ）に添加した。＊：ｐ＜0.005（Glu vs Glu＋E-LP）。データは、４回の実験の平均±SEである。

本実施例では、E-LPがGlast+/-ならびにGlast-/-マウス中のRGC生存を回復させることを調べた。図１５ＡおよびＢは、３週齢（３ｗ）または６週齢（６ｗ）のGlast-/-マウス（1μlのPBSまたは1μlの1.5μg protein/ml E-LPを注射した）の網膜を抗Brn-3a抗体もしくは抗β−アクチン抗体（Ａ）、またはSer9 (p-GSK3β) でリン酸化したGSK3βまたは全GSK3βに対する抗体（Ｂ）でイムノブロットした結果を示している。β−アクチン対Brn-3a（Ａ）およびSer9リン酸化GSK3β対全GSK3β（Ｂ）の定量は、５回ならびに６回の実験からそれぞれ行った。＊：ｐ＜0.05（PBS vs E-LP；６週齢Glast-/-マウス）。

図１５Cは、1μlのPBS、1μlの1.5μg protein /ml E-LPまたは30μg cholesterol/ml HDLを注射したGlast+/-ならびにGlast-/-マウス（３または６週齢）からの網膜切片をヘマトキシリン-エオシン染色した結果を示している。矢頭は網膜のガングリオン細胞層（GCL）を示している。スケールバーは40μmである。データは、同様の結果を示した８個の切片を代表する１個の網膜切片から得たものである。

図１５Ｄは、1μlのPBS、1μlの1.5μg protein /ml E-LPまたは30μg cholesterol/ml HDLを無注射または注射した６週齢の野生型マウス（＋/＋）、３週齢もしくは６週齢のGlast+/-マウス（＋／−）もしくはGlast-/-マウス（−／−）Glast+/-ならびにGlast-/-マウス中のRGC数を定量した。データは、８回の実験結果から得た。＊：ｐ＜0.05（PBS vs E-LPまたはHDL；６週齢Glast-/-マウス）。＃：ｐ＜0.05（PBS vs E-LPまたはHDL；６週齢Glast+/-マウス）。

本実施例では、Glast+/+ならびにGlast-/-マウスの硝子体中のアポリポ蛋白Eと、硝子体内に注射したE-LPに含まれるアポリポ蛋白Eの量を比較した。図１６は、Glast+/+ならびにGlast-/-マウスの硝子体液5μlおよび100 ng protein /ml E-LP5μlのイムノブロット結果を示している。

本実施例では、E-LPによりα2マクログロビンの抑制効果が抑止されることを調べた。図１７ＡおよびＢは、３または６週齢のGlast+/+ならびにGlast-/-マウスからの網膜または硝子体液を、アポＥ、LRP1、β−アクチン、α２−マクログロブリン（a2M）、ならびにアルブミンに対する抗体でイムノブロットした結果を示している。矢頭はa2Mを示している。図１７Ａは、β−アクチンに対するアポＥの定量についての４回の実験による結果である。＊：ｐ＜0.05（３週齢Glast+/+vs３週齢Glast-/-マウスの網膜）。図１７Ｂは、アルブミンに対するアポＥならびにa2Mの定量についての３回の実験による結果である。＊：ｐ＜0.05（３週齢Glast+/+vs３週齢Glast-/-マウスの網膜）。＃：ｐ＜0.05（３週齢Glast+/+vs３週齢Glast-/-マウスの網膜）。図１７Ｃは、α2マクログロブリンの非存在下もしくは存在下でのコントロール（C；HBSS）またはグルタミン酸処理（Glu; 300μM glutamate＋10μM glycine）もしくはGlu＋100ng protein/ml E-LP処理して２４時間後にヘキスト（Hoechst）染色して検出された断片化もしくは収縮した核の割合を示している。＊：ｐ＜0.05（Glu＋E-LP vs Glu＋E-LP＋a2M）。図１７Ｄは、100nM a2MとE-LP (100 - 3000ng protein/ml) と共に１５分間培養した後、Gluを添加したRGCの状態を示している。図１７ＣならびにＤのデータは、４回の実験結果からの平均±SE値である。＊ならびに＊＊：ｐ＜0.05ならびにｐ＜0.005（それぞれGlu＋a2M＋E-LP）。

本実施例では、グリア細胞からのalpha 2-macroglobulin放出量を調べた。ヒトアポE含有リポ蛋白（100または1000ng/ml）を初代培養グリア細胞の培養液中に添加し、２４時間後に培養上清を回収した。この培養上清をSDS-PAGE後、イムノブロット法により抗alpha 2-macroglobulin抗体を用いて検出した。その結果、ヒトアポE含有リポ蛋白添加により、グリア細胞からのalpha 2-macroglobulin放出量の減少が観察された（図１８）。

この結果から、ヒトアポE含有リポ蛋白の硝子体内投与は、直接的な神経保護効果だけでなく、アポE含有リポ蛋白の神経保護効果を阻害するalpha 2-macroglobulinの硝子体液中への放出量を減少させる効果も併せ持つ可能性が考えられた。

この発明は、神経細胞のアポトーシス等を本態とする様々な神経変性疾患などの神経疾患に対して、神経変性抑制作用などの神経保護作用効果を有するアポリポ蛋白E含有リポ蛋白およびリポ蛋白受容体を介した神経保護分子の活性化、および神経変性誘導分子の不活性化を神経保護機構を利用する神経疾患予防・治療剤ならびにそれを用いた神経疾患予防・治療方法を提供する。したがって、この発明の神経疾患予防・治療剤ならびに神経疾患予防・治療方法は、神経変性疾患などの神経疾患の予防・治療に有用である。

Claims

点眼又は眼球に対する注射によって前記眼球内へ投与してα２−マクログロブリンの神経保護抑制効果を抑止するための、アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を含有するα２−マクログロブリンの神経保護抑制効果抑止剤。
アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白を含有させた組成物であって、
同組成物を眼球に対し点眼又は注射することにより、前記アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白によって、前記眼球内に存在する網膜神経節細胞のグルタミン酸受容体の活性を抑制させると共に、α２−マクログロブリンの神経保護抑制効果を抑止させるべく構成したことを特徴とする眼科用組成物。
前記アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、グリア細胞由来アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白、血液から分離したアポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白含有高比重リポ蛋白、または人工再構成アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の眼科用組成物。
前記アポリポ蛋白Ｅ含有リポ蛋白が、リポ蛋白受容体を介して、神経保護分子を活性化して神経保護効果を奏し、かつ、神経変性誘導分子を不活化または抑制して神経保護効果を奏することを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の眼科用組成物。
前記リポ蛋白受容体がＬＲＰ１受容体、ＬＤＬ受容体、ＡｐｏＥＲ２受容体、ＶＬＤＬ受容体、ＬＲ１１受容体、ＬＲＰ４受容体、ＬＲＰ１Ｂ受容体、Ｍｅｇａｌｉｎ受容体、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体であることを特徴とする請求項４に記載の眼科用組成物。
前記神経保護分子が、少なくともホスホリパーゼＣまたはプロテインキナーゼＣδのいずれかであり、神経変性誘導分子が、少なくともＮＭＤＡ受容体、カルシウム、またはＧＳＫ３βのいずれかであることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の眼科用組成物。
前記網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載の眼科用組成物。