ES2311470T3 - Nuevas citocromo p450 monooxigenasas y su uso para oxidar compuestos organicos. - Google Patents

Nuevas citocromo p450 monooxigenasas y su uso para oxidar compuestos organicos. Download PDF

Info

Publication number
ES2311470T3
ES2311470T3 ES00956319T ES00956319T ES2311470T3 ES 2311470 T3 ES2311470 T3 ES 2311470T3 ES 00956319 T ES00956319 T ES 00956319T ES 00956319 T ES00956319 T ES 00956319T ES 2311470 T3 ES2311470 T3 ES 2311470T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
monooxygenase
oxidation
cytochrome
substrate
replaced
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00956319T
Other languages
English (en)
Inventor
Bernhard Hauer
Juergen Pleiss
Ulrich Schwaneberg
Jutta Schmitt
Markus Fischer
Rolf Schmid
Qing-Shan Li
Daniel Appel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19935115A external-priority patent/DE19935115A1/de
Priority claimed from DE19955605A external-priority patent/DE19955605A1/de
Priority claimed from DE10014085A external-priority patent/DE10014085A1/de
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Application granted granted Critical
Publication of ES2311470T3 publication Critical patent/ES2311470T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90245—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Un proceso para la oxidación microbiológica de un compuesto aromático mono o polinuclear N- O- o S-heterocíclico, que comprende: a1) cultivar un microorganismo recombinante que produce al citocromo P450, transformado por medio de un vector que comprende al menos una construcción de expresión que porta, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de codificación para monooxigenasa, en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia; o a2) incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una citocromo P450 monooxigenasa de origen bacteriano; y b) aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio. donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87 de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en las posiciones 87, 188 y 74, donde Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu; Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y Ala74 es reemplazado por Val o Gly.

Description

Nuevas citocromo P450 monooxigenasas y su uso para oxidar compuestos orgánicos.
La presente invención se relaciona con nuevas citocromo P450 monooxigenasas con especificidad modificada por el sustrato que son capaces de oxidar sustratos orgánicos, por ejemplo compuestos aromáticos N-heterocíclicos, secuencias de nucleótidos que codifican para los mismos, construcciones de expresión y vectores que comprenden estas secuencias, microorganismos transformados con estos, procesos para la oxidación microbiológica de diferentes sustratos orgánicos, tales como compuestos aromáticos N-heterocíclicos y en particular procesos para la preperación de índigo e indirubina.
Las enzimas que tienen nuevas funciones y propiedades se pueden preparar ya sea por selección de muestras naturales o por medio de ingeniería de proteínas de enzimas conocidas. Bajo ciertas circunstancias, el método anteriormente mencionado puede ser más adecuado para inducir características cuya generación por medio de la vía de la selección natural es improbable. A pesar de numerosos intentos por medio de modificación genética de enzimas, hasta ahora existen solamente unos pocos estudios exitosos para la promoción de la actividad catalítica de mutantes enzimáticos con respecto a un cierto sustrato (1-10). En estos casos conocidos, los sustratos están estructuralmente muy relacionados con el sustrato nativo de la enzima respectiva. Hasta ahora, no existen reportes sobre la modificación genética de enzimas las cuales, después de modificación, catalizan la reacción de un compuesto que estructuralmente es completamente diferente del sustrato nativo de la enzima.
La citocromo P450 monooxigenasa aislable de la bacteria Bacillus megaterium usualmente cataliza la hidroxilación subterminal de cadena larga, ácidos saturados y las correspondientes amidas y alcoholes de los mismos o la epoxidación de ácidos grasos insaturados de cadena larga o de ácidos grasos saturados de longitud media de cadena (11-13). La longitud óptima de cadena de ácidos grasos saturados es de 14 a 16 átomos de carbono. Los ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de menos de 12 no son hidroxilados (11).
Se determinó la estructura del dominio hemo de P450 BM-3 por medio de análisis estructural por rayos X (14-16). El sitio de enlazamiento del sustrato está presente en la forma de una abertura larga tipo túnel que se extiende desde la superficie de la molécula hasta la molécula hemo y está bordeada casi exclusivamente por residuos hidrófobos de aminoácidos. Los únicos residuos cargados sobre la superficie del dominio hemo son los residuos Arg47 y Tyr51. Se asume que éstos están involucrados en el enlazamiento del grupo carboxilato del sustrato por medio de la formación de un enlace de hidrógeno (14). La mutación de Arg47 en Glu da lugar a la inactivación de la enzima por el ácido araquidónico (13), pero incrementa su actividad comparada con compuestos de alquiltrimetilamonio C_{12}-C_{14} (17). La utilización del sustrato para compuestos aromáticos, en particular mono, di, o polinucleares, si se desea heterocíclicos, aromáticos, alcanos, alquenos, cicloalcanos y cicloalquenos, no ha sido descrita para esta enzima. Hasta ahora, se ha asumido por lo tanto en círculos especializados que sustratos diferentes a los sustratos orgánicos hasta ahora descritos, por ejemplo indol, a causa de las claras diferencias estructurales de los sustratos nativos de P450 BM-3, en particular a causa de la ausencia de grupos funcionales que podrían enlazarse a los residuos anteriormente mencionados en la cavidad del sustrato, no son un sustrato.
Un objetivo de la presente invención para poner a disposición nuevas citocromo P450 monooxigenasas que tienen especificidad modificada por el sustrato o un perfil modificado por el sustrato. En particular, se proveen mutantes de la monooxigenasa los cuales, en comparación con la enzima tipo silvestre no mutada, son enzimáticamente activos con sustratos claramente estructuralmente diferentes.
Comparado con la enzima de tipo silvestre, se puede observar un "perfil modificado del sustrato" para los mutantes de acuerdo con la invención. En particular, para el mutante en cuestión, se observa una mejora en la reactividad, por ejemplo un incremento de la actividad específica (expresada como nmol de sustrato convertido/minuto/nmol de enzima P450) y/o de al menos un parámetro cinético seleccionado del grupo que consiste de Kcat, Km y Kcat/Km (por ejemplo de al menos un 1%, tal como 10 a 1000%, 10 a 500% ó 10 a 100%) en la conversión de al menos uno de los compuestos oxidables definidos en los grupos a) hasta d). La reacción de oxidación de acuerdo con la invención incluye la oxigenación catalizada por la enzima de al menos un sustrato orgánico exógeno (esto es, añadido al medio de reacción) o endógeno (esto es, ya presente en el medio de reacción). En particular, la reacción de oxidación de acuerdo con la invención incluye una mono y/o polihidroxilación, por ejemplo una mono y/o dihidroxilación, en un grupo C-E aromático o alifático, o un epoxidación en un grupo C=C que es preferiblemente no aromático. También son posibles las combinaciones de las reacciones anteriores. Además, el producto inmediato de la reacción puede ser convertido además en el contexto de una reacción secundaria o subsiguiente no enzimática. Tales combinaciones de procesos enzimáticos y no enzimáticos forman parte además del objeto de la presente invención.
Hemos encontrado que el objetivo anterior se logra sorprendentemente por medio de nuevas citocromo P450 monooxigenasas las cuales, por ejemplo, son capaces de la oxidación de compuestos aromáticos N-heterocíclicos di o polinucleares.
En particular, la invención se relaciona con aquellas monooxigenasas cuya región de enlazamiento con el sustrato es capaz por medio de mutagénesis específica para el sitio de la incorporación funcional de nuevos sustratos, por ejemplo N-heterocíclicos.
En una modalidad preferida de la invención, las nuevas monooxigenasas son solubles, esto es existentes en forma no enlazada la membrana, y enzimáticamente activa en esta forma.
Las monooxigenasas de acuerdo con la invención se derivan preferiblemente de las citocromo P450 monooxigenasas de origen bacteriano, como las derivadas, en particular, a partir de la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la secuencia SEQ ID NO: 2, que tiene al menos una mutación funcional, esto es, que promueve la oxidación de nuevos sustratos orgánicos (consultar en particular los grupos a) hasta d) de compuestos como los definidos más abajo), por ejemplo compuestos aromáticos N-heterocíclicos di o polinucleares, en una de las regiones de la secuencia de aminoácidos 172-224 (región bucle F/G), 39-43 (hebra \beta 1), 48-52 (hebra \beta 2), 67-70 (hebra \beta 3), 330-335 (hebra \beta 5), 352-356 (hebra \beta 8), 73-82 (hélice 5) y 86-88 (hélice 6).
Los mutantes de la citocromo P450 monooxigenasa suministrados de acuerdo con la invención son preferiblemente capaces de al menos una de las siguientes reacciones:
a)
oxidación de compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos sustituidos o no sustituidos;
b)
oxidación de aromáticos mono o polinucleares sustituidos o no sustituidos;
c)
oxidación de alcanos y alquenos de cadena recta y ramificada; y
d)
oxidación de cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos o no sustituidos.
Los mutantes preferidos de la monooxigenasa tienen al menos una mutación funcional, en particular una sustitución de aminoácidos, en al menos una de las regiones de la secuencia 73-82, 86-88 y 172-224. De este modo, por ejemplo, Phe87 puede ser reemplazada por un aminoácido que tiene una cadena lateral alifática, tal como Ala, Val, Leu, en particular Val; Leu188 puede ser reemplazada por un aminoácido que tiene un cadena lateral de amida, tal como Asn o, en particular, Gln; y Ala74 puede ser reemplazada por otro aminoácidos que tiene una cadena lateral alifática, tal como Val y, en particular, Gly.
Los mutantes de monooxigenasa particularmente preferidos de este tipo son aquellos que tienen al menos una de las siguientes sustituciones de mono o poliaminoácidos:
1)
Phe87Val;
2)
Phe87Val, Leu188Gln; o
3)
Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;
y equivalentes funcionales de los mismos. El número indica la posición de la mutación; el aminoácido original está indicado antes del número antes del número y el nuevo aminoácido introducido, después del número.
En este contexto, "equivalentes funcionales" o análogos de los mutantes que son divulgados específicamente son mutantes que difieren de ellos en que además tienen la especificidad deseada del sustrato con respecto al menos a una de las reacciones de oxidación a) hasta d) descritas anteriormente, esto es, por ejemplo, por aromáticos heterocíclicos y que se hidroxilan, por ejemplo, indol, o exhibe además el "perfil modificado del sustrato" con respecto a la enzima de tipo silvestre.
"Equivalentes funcionales" se debe entender también que significa de acuerdo con la invención, mutantes que exhiben, en al menos una de las posiciones anteriormente mencionadas de la secuencia, una sustitución de aminoácido diferente de la mencionada específicamente, pero que aún conduce a un mutante que, como el mutante que ha sido mencionado específicamente, muestra un "perfil modificado de sustrato" con respecto la enzima de tipo silvestre y cataliza al menos una de las reacciones de oxidación anteriormente mencionadas. Existe equivalencia funcional en particular también en el caso donde las modificaciones en el perfil del sustrato corresponden cualitativamente, esto es, donde, por ejemplo, se convierten los mismos sustratos, pero en diferentes proporciones.
Los "equivalentes funcionales" también abarcan naturalmente a los mutantes de P450 monooxigenasa los cuales, como los mutantes P450 BM3 que han sido específicamente mencionados, pueden ser obtenidos por mutación de enzimas P450 de otros organismos. Por ejemplo, se pueden identificar las regiones de regiones de secuencia homóloga por comparación de la secuencia. Siguiendo los principios de lo que ha sido establecido específicamente en la invención, los métodos modernos de modelamiento molecular permiten entonces que se lleven a cabo mutaciones equivalentes que afectan el patrón de la reacción.
Los "equivalentes funcionales" también abarcan a los mutantes que pueden ser obtenidos por medio de una o más adiciones, sustituciones, supresiones y/o inversiones de aminoácidos adicionales, siendo posible para las modificaciones adicionales anteriormente mencionadas que ocurran en cualquier posición de la secuencia mientras dan lugar a un mutante con un perfil modificado el sustrato en el sentido anterior.
Los sustratos del grupo a) que pueden ser oxidados de acuerdo con la invención son compuestos aromáticos mono, di o polinucleares heterocíclicos sustituidos o no sustituidos; en particular compuestos aromáticos mono, di o polinucleares N, O o S-heterocíclicos oxidables o hidroxilables. Ellos incluyen preferiblemente anillos fusionados, en particular dos, de 4 a 7 miembros, en particular de 6 ó 5 miembros, done al menos uno, preferiblemente todos los anillos tienen carácter aromático y donde al menos uno de los anillos aromáticos porta de uno a tres, preferiblemente un heteroátomo de N, O o S en el anillo. La estructura total del anillo puede contener uno o dos heteroátomos adicionales idénticos o diferentes. Los compuestos aromáticos pueden portar adicionalmente de 1 a 5 sustituyentes en los carbonos del anillo o heteroátomos. Los ejemplos de sustituyentes adecuados son alquilo C_{1} a C_{4}, tales como metilo, etilo, n o isopropilo, n, iso o t-butilo, o alquenilo C_{2} a C_{4}, tal como etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo o 3-butenilo, hidroxilo y halógeno, tal como F, Cl y Br. Los sustituyentes alquilo o alquenilo mencionados pueden tener también un grupo ceto o aldehído; siendo ejemplos el propan-2-on-3-ilo, butan-2-on-4-ilo, 3-buten-2-on-4-ilo. Ejemplos no limitantes de sustratos heterocíclicos adecuados son, en particular, heterociclos binucleares, tales como indol, N-metil-indol, y los análogos sustituidos de los mismos que portan de uno a tres de los sustituyentes anteriormente definidos sobre átomos de carbono, por ejemplo 5-cloro o 5-bromoindol; y también quinolina y derivados de quinolina, por ejemplo 8-metilquinolina, 6-metil-quinolina y quinaldina; y benzotiofeno, y los análogos sustituidos de los mismos que portan de uno a tres de los sustituyentes anteriormente definidos sobre átomos de carbono. Además, se pueden mencionar heteroaromáticos trinucleares, tales como acridina y los análogos sustituidos de los mimos que portan de uno a tres de los sustituyentes anteriormente definidos sobre átomos de carbono.
Los sustratos del grupo b) que son oxidables acuerdo con la invención son aromáticos mono o polinucleares sustituidos o no sustituidos, en particular mono o binucleares, tales como benceno y naftaleno. Los compuestos aromáticos pueden ser no sustituidos o mono o polisustituidos y, por ejemplo, portar de 1 a 5 sustituyentes sobre los átomos de carbono del anillo. Los ejemplos de sustituyentes adecuados son alquilo C_{1} a C_{4}, tales como metilo, etilo, n o isopropilo, o n, iso o t-butilo, o alquenilo C_{2} a C_{4}, tal como etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo o 3-butenilo, hidroxilo y halógeno, tal como F, Cl y Br. Los sustituyentes alquilo o alquenilo mencionados pueden tener también un grupo ceto o aldehído; siendo ejemplos el propan-2-on-3-ilo, butan-2-on-4-ilo, 3-buten-2-on-4-ilo. El aromático pues estar fusionado con un anillo no aromático de cuatro a siete miembros. El anillo no aromático puede tener uno o dos dobles enlaces C=C, estar mono o polisustituido por los sustituyentes anteriormente mencionados y puede portar uno o dos heteroátomos en el anillo. Los ejemplos de aromáticos particularmente adecuados son los aromáticos mononucleares, tales como el cumeno, y sustratos binucleares, tales como indeno y naftaleno, y análogos sustituidos de los mismos que portan de uno a tres de los sustituyentes anteriormente definidos sobre átomos de carbono.
Sustratos del grupo c) que pueden ser oxidados de acuerdo con la invención son alcanos o alquenos de cadena recta o ramificados que tienen de 4 a 15, preferiblemente de 6 a 12, átomos de carbono. Los ejemplos que pueden ser mencionados son n-butano, n-pentano, n-hexano, n-heptano, n-octano, n-nonano, n-decano, n-undecano y n-dodecano, y los análogos de estos compuestos que están ramificados una o más veces, por ejemplo compuestos análogos que tienen de 1 a 3 grupos laterales metilo; o mono o poliinsaturados, por ejemplo monoinsaturados, análogos de los alcanos anteriormente mencionados.
Sustratos del grupo d) que pueden ser oxidados de acuerdo con la invención son cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos o no sustituidos que tienen de 4 a 8 átomos de carbono en el anillo. Los ejemplos de estos son ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexeno, cicloheptano y ciclohepteno. La estructura del anillo puede portar uno o más, por ejemplo 1 a 5 sustituyentes de acuerdo con la definición anterior para los compuestos de los grupos a) y b). Ejemplos no limitantes son los iononas, tales como la \alpha, \beta y \gamma-iononas, y las correspondientes metil iononas e iso-metil iononas. Se da particular preferencia a la \alpha y \beta-iononas.
La invención también se relaciona con secuencias ácido nucleico que codifican para una de las monooxigenasas de acuerdo con la invención. Las secuencias preferidas de ácido nucleico se derivan de la SEQ ID NO: 1, que tiene al menos una sustitución nucleótida que conduce a una de las mutaciones funcionales de aminoácido descritas anteriormente. La invención se relaciona además con análogos funcionales de los ácidos nucleicos obtenidos por medio d adición, sustitución, inserción y/o supresión de nucleótidos individuales o múltiples, que además codifican para una monooxidasa que tiene la especificidad deseada por el sustrato, por ejemplo que tiene la actividad oxidante del
indol.
La invención también abarca aquellas secuencias de ácido nucleico que incluyen a las así llamadas mutaciones silenciosas o que están modificadas en comparación con una secuencia específicamente mencionada de acuerdo con el uso del codón de un origen específico u organismo huésped, y variantes de ocurrencia natural de tales secuencias de ácido nucleico. La invención también abarca modificaciones de las secuencias de ácido nucleico obtenidas por degeneración del código genético (esto es, sin ningún cambio en la correspondiente secuencia de aminoácidos) o sustitución conservadora de nucleótidos (esto es, el correspondiente aminoácido es reemplazado por otro aminoácido de la misma carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad), y secuencias modificadas por adición, inserción, inversión o supresión de nucleótidos, cuyas secuencias codifican un monooxigenasa de acuerdo con la invención que tiene un "perfil modificado de sustrato", y las correspondientes secuencias complementarias.
La invención se relaciona además con construcciones de expresión que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica a un mutante de acuerdo con la invención bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico; y vectores que comprenden al menos una de estas construcciones de expresión.
Preferiblemente, las construcciones de acuerdo con la invención abarcan un promotor 5' secuencia arriba de la secuencia de codificación en cuestión y una secuencia terminadora secuencia abajo 3', y, opcionalmente, elementos reguladores habituales adicionales, y, en cada caso operativamente enlazados con la secuencia de codificación. Se entiende que el enlazamiento operativo significa el arreglo secuencial del promotor, la secuencia de codificación, la terminadora y, si es apropiado, otros elementos reguladores de tal forma que cada uno de los elementos reguladores pueden cumplir con su pretendida función sobre la expresión de la secuencia de codificación. Los ejemplos de secuencias operativamente enlazables son las secuencias de acceso, o si no reforzadores de traducción, reforzadores, señales de poliadenilación y similares. Otros elementos reguladores abarcan marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares.
Además de las secuencias reguladoras artificiales, la secuencia reguladora natural puede estar presente aún secuencia arriba del gen estructural real. Si se desea, esta regulación natural puede ser desactivada por medio de modificación genética, y se puede reforzar o disminuir la expresión de los genes. Sin embargo, la construcción del gen puede ser también más simple en su construcción, esto es, no se insertan señales reguladoras adicionales secuencia arriba del gen estructural y no se remueve el promotor natural con su regulación. En vez de eso, se muta la secuencia reguladora natural de tal forma que no tenga lugar nuevamente la regulación y se incremente la expresión del gen o se reduzca. Una o más copias de las secuencias de ácido nucleico pueden esta presentes en la construcción del gen.
Los ejemplos de promotores adecuados son: los promotores cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, 1-PR o 1-PL, que son convenientemente empleados en bacterias Gram-negativas; y promotores Gram-positivos amy y SPO2, los promotores de levadura ADC1, MFa, Ac, P-60, CYC1, GAPDH, o los promotores de la planta CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o el promotor de ubiquitina o de faseolina. Se da particular preferencia al uso de promotores inducibles, por ejemplo promotores inducibles por luz y en particular por temperatura, tales como el promotor P_{r}P_{1}.
En principio, todos los promotores naturales con sus secuencias reguladoras pueden ser utilizados. Además, también se pueden utilizar promotores sintéticos en una forma conveniente.
Las secuencias reguladoras anteriormente mencionadas tienen como fin permitir la expresión dirigida de las secuencias de ácido nucleico y de la expresión de proteínas. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gen se expresa o se sobreexpresa únicamente después de que ha tenido lugar la inducción, o que se expresa y/o sobreexpresa inmediatamente.
Las secuencias reguladoras o factores pueden tener preferiblemente un efecto positivo sobre la expresión y de esta forma incrementan o reducen a ésta última. Por lo tanto, un refuerzo de los elementos reguladores puede tener lugar convenientemente a nivel transcripcional por medio del uso de señales fuertes de transcripción tales como promotores y/o "reforzadores". Además, se puede reforzar también la traducción mejorando, por ejemplo, la estabilidad del ARNm.
Se genera un casete de expresión por fusión de un promotor adecuado con una secuencia adecuada de nucleótidos para la monooxigenasa y una señal terminadora o señal de poliadenilación. Con este propósito se utilizan técnicas de recombinación habituales y de clonación tal y como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y en T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist, Experments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assoc. y Wiley Interscience (1987).
Para expresión en un organismo huésped adecuado, la construcción de ácido nucleico recombinante o construcción génica es convenientemente insertada dentro de un vector huésped específico que permite expresión génica óptima en el huésped. Los vectores son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte y se pueden encontrar, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwells P. H. y colaboradores, Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Se entiende que los vectores no significan únicamente plásmidos, pero todos los otros vectores conocidos como tales por las personas capacitadas, por ejemplo, fagos, virus, tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, plásmidos, cósmicos, y ADN lineal o circular. Estos vectores pueden ser replicados autónomamente en el organismo huésped o cromosómicamente.
Los vectores de acuerdo con la invención permiten la generación de microorganismos recombinantes que son transformados, por ejemplo, con al menos un vector de acuerdo con la invención y que puede ser empleado para producir los mutantes. Las construcciones recombinantes anteriormente descritas de acuerdo con la invención son introducidas convenientemente dentro de un sistema huésped adecuado y expresadas. Se prefiere utilizar métodos usuales de clonación y de transfección conocidas por las personas capacitadas con el propósito de llevara a cabo la expresión de los ácidos nucleicos anteriormente mencionados en el sistema de expresión en cuestión. Los sistemas adecuados están descritos, por ejemplo, en protocolos actuales en biología molecular, F. Ausubel y colaboradores, Ed., Wiley Interscience, New York, 1997.
Los organismos huéspedes adecuados son, en principio, todos los organismos que permiten la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, sus variantes alélicas, y sus equivalentes funcionales o derivados. Los organismos huéspedes se entiende que incluyen, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras o plantas o células animales. Los organismos preferidos son bacterias tales como aquellas del género Escherichia, tales como, por ejemplo, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus o Pseudomonas, microorganismos eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, y células eucariotas superiores de animales o plantas, por ejemplo, células Sf9 o CHO.
Si se desea, la expresión del producto génico puede ser también efectuada en organismos transgénicos tales como animales transgénicos tales como, en particular, ratones, ovejas, o plantas transgénicas. Los organismos transgénicos pueden ser también animales genéticamente desactivados o plantas en las cuales el gen endógeno correspondiente ha sido eliminado, tal como, por ejemplo, por mutación o supresión parcial o completa.
Los organismos exitosamente transformados pueden ser seleccionados por medio de genes marcadores que están así mismo contenidos en el vector o en el casete de expresión. Los ejemplos de tales genes marcadores son genes para resistencia a los antibióticos y para enzimas que catalizan una reacción de color, que causa la coloración de la célula transformada. Estas células transformadas pueden ser entonces seleccionadas utilizando selección celular automática. Los microorganismos que han sido transformados exitosamente con un vector y que portan un gen apropiado para resistencia a los antibióticos (por ejemplo G418 o higromicina) pueden ser seleccionados por medio del uso apropiado de medios o sustratos que contienen antibióticos. Las proteínas marcadoras que están presentes sobre la superficie de la célula pueden ser utilizadas por selección por medio de cromatografía de afinidad.
La combinación de los organismos huéspedes y los vectores apropiados para los organismos, tales como plásmidos, virus o fagos, tales como, por ejemplo, plásmidos con el sistema promotor/ARN polimerasa, fagos \lambda, \mu u otros fagos templados o transposones y/o otras secuencias reguladoras ventajosas forman un sistema de expresión. El término "sistema de expresión" significa, por ejemplo, una combinación de células de mamífero tales como células CHO, y vectores, tales como el vector pcDNA3neo, que son adecuados para células de mamífero.
Como se describió más arriba, el producto génico puede ser expresado también convenientemente en animales transgénicos, por ejemplo, ratones, ovejas, o plantas transgénicas. Es posible también programar sistemas de traducción libres de células con el ARN derivado del ácido nucleico.
La invención provee además un proceso para preparar una monooxigenasa de acuerdo con la invención, que comprende el cultivo de un microorganismo productor de monooxigenasa, si es apropiado induciendo la expresión de la monooxigenasa, y aislando la monooxigenasa del cultivo. Si se desea, la monooxigenasa de acuerdo con la invención puede por lo tanto ser también producida a escala industrial.
Los microorganismos pueden ser cultivados y fermentados por medio de métodos conocidos. Las bacterias, por ejemplo, pueden ser cultivadas en un medio TB o LB y a 20-40ºC y un pH de 6-9. Las condiciones de cultivo adecuadas están descritas en detalle en T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), por ejemplo.
Si la monooxigenasa no es secretada dentro del medio de cultivo, las células son entonces lisadas y se obtiene la monooxigenasa a partir del lisado utilizando métodos conocidos para el aislamiento de proteínas. Las células pueden ser lisadas alternativamente por medio de ultrasonido de alta frecuencia, por medio de alta presión, por ejemplo en una celda francesa de presión, por osmólisis, por medio de la acción de detergentes, de enzimas líticas o de solventes orgánicos, por medio de homogenización o por medio de una combinación de un pluralidad de los procesos mencionados. La purificación de la monooxigenasa puede ser lograda por medio de procesos cromatográficos conocidos, tales como cromatografía por tamiz molecular (filtración por gel), tal como cromatografía a través de Sefarosa Q, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba, y por medio de otros procesos habituales, tales como ultrafiltración, cristalización, precipitación por salado, diálisis y electroforesis nativa en gel. Los procesos adecuados son descritos, por ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Procedures], Verlag Walter de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlín.
Para aislar la proteína recombinante, es particularmente conveniente utilizar sistemas de vectores u oligonucleótidos que extienden el ADNc por ciertas secuencias de nucleótidos y así codificar para polipéptidos modificados o proteínas de fusión que sirven para simplificar la purificación. Las modificaciones adecuadas de este tipo son, por ejemplo, las así llamadas "etiquetas" que actúan como anclas, tal como, por ejemplo, la modificación conocida como ancla de hexa-histidina, o epítopos que pueden ser reconocidos como antígenos por anticuerpos (descrito, por ejemplo, en Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Estas anclas pueden ser utilizadas para unir las proteínas a un soporte sólido tal como, por ejemplo, a una matriz polimérica, que puede, por ejemplo, estar empacada en una columna cromatográfica, o a una placa de microtitulación o a otro soporte.
Estas anclas pueden ser utilizadas también al mismo tiempo para reconocer las proteínas. También es posible utilizarlas para el reconocimiento de los marcadores convencionales de proteínas tales como tintes fluorescentes, marcadores enzimáticos que forman un producto de reacción detectable después de la reacción con un sustrato, o marcadores radioactivos, solos o en combinación con las anclas para la formación de derivados de las proteínas.
La invención se relaciona además con un proceso para la oxidación microbiológica de compuestos orgánicos, por ejemplo compuestos aromáticos mono, di o polinucleares N-heterocíclicos de acuerdo con la definición anterior, que comprende
a1)
cultivar un microorganismo recombinante de acuerdo con la definición anterior en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno (añadido) o un sustrato intermedio formado, cuyo sustrato puede ser oxidado por la monooxigenasa de acuerdo con la invención, preferiblemente en presencia de oxígeno (esto es, aeróbicamente); o
a2)
incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una enzima de acuerdo con la invención, preferiblemente en presencia de oxígeno y un donante de electrones; y
b)
aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
\vskip1.000000\baselineskip
El oxígeno requerido para la reacción pasa o bien desde la atmósfera al medio de reacción o, si se requiere, puede ser añadido en una forma ya conocida.
El sustrato oxidable se selecciona preferiblemente de
a)
oxidación de compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos sustituidos o no sustituidos;
b)
oxidación de aromáticos mono o polinucleares sustituidos o no sustituidos;
c)
oxidación de alcanos y alquenos de cadena recta y ramificada; y
d)
oxidación de cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos o no sustituidos
\vskip1.000000\baselineskip
Una variante preferida del proceso está dirigida a la formación de índigo/indirubina y se caracteriza por el hecho de que el sustrato es indol formado como un intermedio en el cultivo y que el índigo y/o la indirubina formados en el medio de cultivo se aíslan por medio de oxidación de los intermediarios de hidroxiindol.
Si la oxidación de acuerdo con la invención se lleva cabo utilizando un microorganismo recombinante, el cultivo de los microorganismos se lleva a cabo primero preferiblemente en presencia de oxígeno y en un medio complejo, tal como, por ejemplo, medio TB o LB a una temperatura de cultivo de aproximadamente 20 a 40ºC y un pH de aproximadamente 6 a 9, hasta alcanzar una densidad celular adecuada. La adición de indol exógeno usualmente no es necesaria ya que el microorganismo lo forma en una etapa intermedia. Sin embargo, cuando se utilizan otros sustratos, se puede requerir la adición de sustrato exógeno. Con el propósito de poder controlar mejor la reacción de oxidación, se prefiere el uso de un promotor inducible, en particular un promotor inducible por temperatura. La temperatura se incrementa en este caso hasta la temperatura de inducción necesaria, por ejemplo 42ºC en el caso del promotor P_{r}P_{1}, esta se mantiene durante un período suficiente de tiempo, por ejemplo 1 a 10 ó 5 a 6 horas, para la expresión de la actividad de la monooxigenasa y la temperatura es luego reducida nuevamente hasta un valor aproximadamente de 30 a 40ºC. Se continúa luego con el cultivo en presencia de oxígeno durante 12 horas hasta 3 días. En el caso particular e la oxidación del indol, se puede incrementar el pH por medio de la adición de NaOH, por ejemplo hasta 9 ó 10, gracias al cual se promueve la formación adicional de índigo o de indirubina por medio de oxidación a la atmósfera de los productos de oxidación formados enzimáticamente 2 y 3-hidroxiindol.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página siguiente)
\newpage
La formación de índigo/indirubina de acuerdo con la invención se ilustra por medio del siguiente esquema de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, si se lleva a cabo la oxidación de acuerdo con la invención utilizando mutantes de la enzima purificados o enriquecidos, se disuelve la enzima de acuerdo con la invención en un medio que contiene sustrato exógeno, por ejemplo un medio que contiene indol (aproximadamente 0,01 a 10 mM, o 0,05 a 5 mM), y se lleva a cabo la reacción, preferiblemente en presencia de oxígeno, a una temperatura de aproximadamente 10 a 50ºC, tal como, por ejemplo, 30 a 40ºC, y un pH de aproximadamente 6 a 9 (tal como se estableció, por ejemplo, utilizando fosfato 100 a 200 mM o amortiguador tris), y en presencia de un reductor, el medio que contiene al sustrato conteniendo además, con relación al sustrato que va a ser oxidado, un exceso molar aproximadamente de 1 a 100 veces o de 10 a 100 veces de equivalentes de reducción. El reductor preferido es NADPH. Si se requiere, se puede añadir el agente reductor en porciones.
En forma similar, los sustratos oxidables que se utilizan preferiblemente son: n-hexano, n-octano, n-decano, n-dodecano, cumeno, 1-metilindol, 5-Cl-, o Br-indol, indeno, benzotiofeno, \alpha, \beta y \gamma-ionona, acridina, naftaleno, 6-metil- u 8-metilquinolina, quinolina y quinaldina.
\newpage
La reacción de oxidación enzimática de acuerdo con la invención se puede llevar acabo, por ejemplo, bajo las siguientes condiciones:
Concentración del sustrato:
desde 0,01 hasta 20 mM
Concentración de la enzima:
desde 0,1 hasta 10 mg/ml
Temperatura de reacción:
desde 10 hasta 50ºC
pH:
desde 6 hasta 8
Amortiguador:
desde 0,05 hasta 0,2 M de fosfato de potasio, o Tris/HCl
Donante de electrones:
es preferiblemente añadido en porciones (concentración inicial aproximadamente desde 0,1 hasta 2 mg/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla puede ser preincubada brevemente (de 1 a 5 minutos) (aproximadamente entre 20 y 40ºC) antes de que se inicie la reacción, por ejemplo por medio de la adición de los donantes de electrones (por ejemplo, NADPH). La reacción se lleva a cabo en forma aeróbica, si se requiere con la introducción adicional de oxígeno.
En el proceso de oxidación del sustrato de acuerdo con la invención, el oxígeno que está presente en, o que es añadido al medio de reacción es escindido en forma reductora por la enzima. Los equivalentes de reducción requeridos son suministrados por el agente de reducción añadido (donante de electrones).
El producto de oxidación formado puede ser separado entonces del medio y purificado en una forma convencional, tal como, por ejemplo, por medio de extracción o por cromatografía.
Los objetivos adicionales de la invención se relacionan con biorreactores, que incluyen una enzima de acuerdo con la invención o un microorganismo recombinante de acuerdo con la invención en forma inmovilizada.
Un último objetivo de la invención se relaciona con el uso de una citocromo P450 monooxigenasa de acuerdo con la invención o de un vector o microorganismo de acuerdo con la invención para la oxidación microbiológica de un sustrato de uno de los grupos a) hasta d), en particular de compuestos aromáticos mono, di o polinucleares N-heterocíclicos, y preferiblemente para la formación de índigo y/o indirubina.
La presente invención se describe ahora en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Asignación aleatoria de codones específicos de P450 BM-3
Los experimentos se llevaron a cabo esencialmente como se describe en (19). Se asignaron en forma aleatoria tres posiciones (Phe87, Leu188 y Ala74) con la ayuda de mutagénesis específica para el sitio utilizando el kit QuikChange de Stratagene (La Jolla, CA, EUA). Se utilizaron los siguientes iniciadores para PCR para las posiciones individuales:
Phe87:
5'-gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3' (SEQ ID NO: 3),
\quad
5'-cgtccagcttgtnnncaacccgtctcctgc-3' (SEQ ID NO: 4);
Leu188:
5'-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3' (SEQ ID NO: 5),
\quad
5'-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3' (SEQ ID NO: 6);
Ala74:
5'-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3' (SEQ ID NO: 7),
\quad
5'-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3' (SEQ ID NO: 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones para la PCR fueron idénticas para todas las tres posiciones. En particular, 17,5 pmol de uno de cada uno de los iniciadores, 20 pmol del ADN del plásmido molde, 3 U de la Pfu polimerasa y 3,25 nmol de cada dNTP fueron utilizados por 50 \mul del volumen de reacción. La reacción PCR se inició a 94ºC/1 min y se realizó el siguiente ciclo de temperatura 20 veces: 94ºC, 1 min; 46ºC, 2,5 min; 72ºC, 17 min. Después de 20 ciclos, se continuó la reacción a 72ºC durante 15 min. Después de la PCR, se digirió el ADN de molde a 37ºC durante 3 h utilizando 20 U de DpnI. Se transformaron luego las DH5\alpha de E. coli. Las células transformadas de DH5\alpha fueron sembradas en placa sobre placas de agar LB que contenían 150 \mug/ml de ampicilina. Se llevó a cabo luego la incubación a 37ºC durante 18 h.
Ejemplo 2 Expresión y purificación de la P450 BM-3 y sus mutantes y producción de un pigmento azul
El gen para la P450 BM-3 y los mutantes del mismo se expresaron bajo el control del promotor fuerte P_{R}P_{L} inducible por temperatura del plásmido pCYTEXP1 en células DH5\alpha de E. coli como ya se describió (20). Se recogieron las colonias utilizando palillos de dientes estériles y se las transfirió a placas de microtitulación de 96 pozos, que contenían 200 \mul de medio TB y 100 \mug/ml de ampicilina por pozo. Se llevó a cabo luego la incubación a 37ºC durante la noche. Se transfirieron luego 40 \mul del cultivo celular de cada uno de los pozos a un tubo de cultivo que contenía 2 ml de medio TB con 100 \mug/ml de ampicilina. Se llevó a cabo luego el cultivo a 37ºC durante 2 h. Se incrementó luego la temperatura hasta 42ºC durante 6 h para la inducción. Se continuó luego con el cultivo a 37ºC durante la noche, produciéndose un pigmento azul.
La producción preparativa de la enzima o del pigmento azul se llevó a cabo comenzando a partir de un cultivo celular de 300 ml (OD_{578} = 0,8 a 1,0). Para el aislamiento de la enzima, se centrifugaron las células a 4.000 rpm durante 10 min y se resuspendió en amortiguador de K_{x}PO_{4} 0,1 M, pH 7,4. Se rompieron cuidadosamente las células enfriadas con hielo con la ayuda de un sonicador W25 de Branson (Dietzenbach, Alemania) con una salida de energía de 80 W, tres veces por períodos de 2 min cada vez. Se centrifugaron las suspensiones a 32.570 x g durante 20 min. Se empleó el extracto crudo para la determinación de la actividad o para la purificación de la enzima. La purificación de la enzima fue llevada a cabo como ya se describió en (21), a la cual se hace referencia expresamente aquí. Se determinó la concentración de la enzima purificada por medio de la diferencia en extinción a 450 y 490 nm, como ya se describió en (11), utilizando un coeficiente de extinción \varepsilon de 91 mM^{-1} cm^{-1}.
Ejemplo 3 Aislamiento de mutantes que produce grandes cantidades de pigmento azul
Se aislaron 100 colonias en cada caso de los mutantes de cada una de las posiciones, las cuales fueron producidas por mutagénesis aleatoria del codón de la posición correspondiente. Estas colonias fueron cultivadas en tubos de cultivo para la producción de pigmento azul.
Después de lavar las células con agua y una cantidad de etapas lentas de centrifugación (500 rpm), se extrajo el pigmento azul utilizando dimetil sulfóxido (DMSO). La solubilidad del pigmento azul fue mayor en DMSO. Se determinó la absorción del extracto a 677 nm. Se utilizó ese mutante que produjo la mayor cantidad de pigmento azul, especialmente los mutantes de una posición específica , para la secuenciación del ADN (kit de secuenciación de ADN de ABI; secuenciador de ADN ABI Prism^{TM} 377) y además como molde para la mutagénesis aleatoria específica para el sitio.
Ejemplo 4 Análisis de la actividad para la hidroxilación del indol
Se analizó la actividad de hidroxilación del indol en una solución que contenía 8 \mul de una solución de indol 10-500 mM en DMSO, 850 \mul de amortiguador tris/HCl (0,1 M, pH 8,2) y 0,6 nmol de P450 BM-3 de tipo silvestre o de mutante en un volumen final de 1 ml. Se preincubó la mezcla durante 9 min antes de que se iniciara la reacción por medio de la adición de 50 \mul de una solución acuosa 1 mM de NADPH. Se detuvo la reacción después de 20 segundos por medio de la adición de 60 \mul de KOH 1,2 M. En el lapso de 5 a 30 segundos (bajo condiciones aeróbicas), se convirtieron completamente los productos de la enzima en índigo ([\Delta^{2,2'}-biindolin]-3,3'-diona) e indirubina ([\Delta^{2,3'}-biindolin]-2',3-diona). Se determinó la producción de índigo por medio de su absorción a 670 nm. Una curva de calibración utilizando índigo puro mostró un coeficiente de extinción de 3,9 mM^{-1} cm^{-1} a esta longitud de onda. Se obtuvo una curva lineal para la producción de índigo en un tiempo de reacción de 40 segundos utilizando 0,6 nmol del tipo silvestre o del mutante P450 BM-3 y de 0,5 hasta 5,0 mM de indol. La indirubina muestra una absorción muy débil a 670 nm y la cantidad de indirubina formada fue mucho más pequeña que la cantidad de índigo formado. La formación de indirubina fue despreciable en la determinación de los parámetros cinéticos. Se determinó el consumo de NADPH a 340 nm y se hizo el cálculo como se describe (17) utilizando un coeficiente de extinción de 6,2 mM^{-1} cm^{-1}.
Ejemplo 5 Purificación de índigo e indirubina
Después de lavar las células con agua y de centrifugación repetida a 500 g, se extrajo el precipitado azul formado utilizando tetrahidrofurano (THF). Se evaporó el sustrato casi hasta sequedad y se extrajo el pigmento rojo varias veces con 50 ml de etanol absoluto. Se disolvió el sólido azul residual en THF y se lo analizó por medio de cromatografía en capa delgada (TLC). Se evaporó la solución de etanol y se purificó por medio de cromatografía en gel de sílice (TLC 60, Merck, Darmstat, Alemania; 2 cm x 30 cm) antes de que fuera lavada con THF y éter de petróleo en una proporción de 1:2. Se evaporó la solución roja obtenida y se determinó su pureza por medio de TLC. Se determinaron los espectros de absorción del pigmento rojo y del pigmento azul en un rango de 400 a 800 nm con la ayuda de un espectrofotómetro Ultraspec 3000 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se analizaron adicionalmente el color rojo y el color azul por medio de espectrometría de masas y espectroscopía RMN ^{1}H.
Resultados experimentales 1. Incremento de la productividad para el pigmento azul por medio de mutagénesis de P450 BM-3
La P450 BM-3 nativa no tiene la habilidad para producir el pigmento que contiene índigo azul, o las sustancias precursoras 2 ó 3-hidroxiindol. Con el propósito de poder preparar una cantidad suficiente de pigmento azul, se sometió a P450 BM-3 a evolución en una forma controlada. Todos los mutantes que produjeron al pigmento azul fueron secuenciados. Se encontró que al menos una de las tres posiciones siguientes fue mutada: Phe87, Leu188 y Ala74. Por lo tanto se asumió que estas tres posiciones juegan un papel crucial para la actividad de P450 BM-3 en la producción de pigmento azul. A partir de la estructura del dominio hemo del citocromo P450 BM-3, acomplejado con ácido palmitoleico, se observó que Phe87 evita que el sustrato se acerque al grupo hemo (14). El mutante Phe87Val muestra una alta regioselectividad y estereoselectividad en la epoxidación del ácido (14S, 15R)-araquidónico (13) y el mutante Phe87Ala cambia la posición de la hidroxilación de \omega-1, \omega-2 y \omega-3 hasta \omega (22). Se seleccionó por lo tanto la posición 87como la primera para la mutagénesis aleatoria específica para el sitio con la ayuda de la PCR. En los cultivos en tubo, se obtuvieron 7 colonias que produjeron una pequeña cantidad de pigmento azul después de la inducción. Se seleccionó la colonia que produjo la mayor cantidad del pigmento azul para la secuenciación del ADN. Los datos de la secuencia mostraron la sustitución de Phe87 por Val. Se utilizó entonces al mutante Phe87Val como molde para la segunda vuelta de la mutagénesis aleatoria específica para el sitio sobre la posición Leu188. La estructura del dominio hemo, acomplejado con ácido palmitoleico, muestra que el reposicionamiento de las hélices F y G pone al residuo Leu188 en contacto directo con el sustrato (14). Esta posición puede jugar por lo tanto un importante papel en el enlazamiento o la orientación del sustrato. Después de la segunda pasada de selección, se observaron 31 colonias que produjeron al pigmento azul. El mutante que produjo la cantidad más grande de pigmento contenía las sustituciones Phe87Val y Leu188Gln. Se mutó luego a este mutante en posición Ala74 en la tercera pasada de mutagénesis aleatoria específica para el sitio. En este caso se obtuvo al mutante triple F87L188A74 (Phe87Val, Leu188Gln y Ala74Gly), que produjo varios mg de pigmento azul en un recipiente de 2 litros, que contenía 300 ml de medio TB. Esta cantidad fue suficiente para el aislamiento y la caracterización del pigmento azul.
2. Aislamiento e identificación del pigmento azul
Después de lavarlas células, se extrajo el precipitado azul residual con THF y se lo analizó por medio de TLC. Se separó el pigmento azul en un componente azul de rápida migración y en un componente rojo de migración más lenta. Ambos componentes mostraron exactamente los mismos parámetros de movilidad que los componentes de una muestra comercial de índigo.
Después de la purificación, se determinó el espectro de absorción de ambos componentes en DMSO. El componente azul mostró el mismo espectro que una muestra de índigo comercial. Los componentes azul y rojo purificados fueron analizados cada uno por medio de espectrometría de masas. El espectro de masas de ambos pigmentos mostró un pico fuerte de un ión molecular con una m/e = 262 y dos picos de fragmentos una m/e = 234 y 205 (intensidad relativa en cada caso 10%). Este patrón es típico de compuestos indigoides. La composición elemental de estos iones fue determinada por medio de espectrometría de masas de alta resolución como C_{16}H_{10}N_{2}O_{2}, C_{15}H_{10}N_{2}O y C_{14}H_{9}N_{2}. Esto es también característico de estructuras del tipo índigo. El pigmento azul fue entonces identificado como índigo y el pigmento rojo como indirubina. Para la confirmación de la estructura, se llevaron a cabo espectros de RMN ^{1}H de 500 MHz de ambos pigmentos en solución de DMSO-D_{6}. Los resultados están de acuerdo con los datos de la literatura (23).
3. Producción de índigo utilizando enzimas aisladas
Se sabe que el índigo se puede obtener a partir del indol por medio de transformación microbiana (24-26). Sin embargo, ninguno de estos sistemas microbianos contenía una P450 monooxigenasa. De acuerdo con la invención, se determinó primero la actividad catalítica de la enzima pura para el indol. Se mezcló al mutante F87L188A74 con indol. No se podía observar reacción de color. Únicamente después de la adición de NADPH a la mezcla de reacción se formó el pigmento azul aproximadamente después de 20 minutos. Por medio del ajuste del pH de la mezcla de reacción hasta un valor de aproximadamente 11, 30 segundos después de la adición de NADPH, se hizo visible la coloración azul en el lapso de unos pocos segundos. Los experimentos de control utilizando P450 BM-3 nativa fueron siempre negativos, incluso utilizando concentraciones crecientes de enzima, indol y NADPH. Se extrajo el pigmento azul utilizando acetato de etilo y se analizó por medio de TLC. El pigmento azul se separó nuevamente en un componente azul que corre más rápidamente y en un componente rojo que corre más lentamente. Los valores de Rf y el espectro de absorción fueron idénticos a aquellos valores de los extractos del caldo de fermentación. El mutante F87L188A74 de P450 BM-3 es por lo tanto una indol hidrolasa.
Se han descrito previamente dos rutas para la transformación enzimática del indol en índigo. Una ruta es catalizada por una dioxigenasa, la otra por una estireno monooxigenasa (24, 25). La estequiometría de NADPH es en ambos casos 2. Se asumió por lo tanto que en contraste con las dioxigenasas, el mutante F87L188A74 de acuerdo con la invención hidroxila al indol únicamente en una posición para formar oxiindol (2-hidroxiindol) o indoxilo (3-hidroxiindol).
4. Parámetros cinéticos de la hidroxilación del indol
Se utilizaron muestras puras de la enzima tipo silvestre P450 BM-3 y de los mutantes Leu188Gln, Phe87Val, F87L188 y F87L188A74 para la determinación de los parámetros cinéticos de la hidroxilación del indol. Los resultados se resumen en la Tabla 1 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Parámetros cinéticos de los mutantes de P450 BM-3 para la hidroxilación del indol
2 
\vskip1.000000\baselineskip
Aún con un exceso de enzima purificada y una alta concentración de indol, la enzima de tipo silvestre no es capaz de oxidar al indol. La Leu188Gln mutante muestra una baja actividad. La Phe87Val mutante muestra una actividad catalítica de 119 M^{-1} s^{-1} para la hidroxilación del indol. La eficiencia catalítica de la F87L188 doble mutante (Phe87Val, Leu188Gln) se incremento hasta 543 M^{-1} s^{-1} y se incremento hasta 1365 M^{-1} s^{-1} por medio de la introducción de la sustitución adicional Ala74Gly. Los valores de K_{cat} se incrementaron desde la Phe87Val hasta el mutante triple en un total del 35%, mientras que los valore de K_{m} disminuyeron aproximadamente en siete veces. Esto indica que Ala74Gly y Leu188Gln están involucradas principalmente en el enlazamiento del sustrato.
Para la F87L188A74 triple mutante, las velocidades de cambio del indol (K_{cat} = 2,73 s^{-1}) fueron más de diez veces superiores que para la mayoría de las enzimas P450 (18).
Ejemplo 6 Hidroxilación de n-octano utilizando citocromo P450 monooxigenasa modificada
Se llevaron a cabo las reacciones utilizando una P450 BM-3 monooxigenasa mutante que comprende las siguientes mutaciones: Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly.
El sustrato escogido fue n-octano. Para la hidroxilación del n-octano, se utilizó la siguiente mezcla de reacción aeróbica:
P450 BM-3 mutante:
17,5 mg (liofilizada)
Amortiguador de reacción:
9,1 ml (amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5)
Sustrato:
50 \mul de una solución 60 mM (en acetona)
Temperatura:
25ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió la enzima liofilizada en 500 \mul de amortiguador de reacción y se incubó inicialmente a temperatura ambiente con sustrato y amortiguador de reacción durante 5 minutos. Se añadieron entonces 300 \mul de solución de NADPH (5 mg/ml). Se repitió la adición de NADPH dos veces más. Se monitoreó el progreso de la reacción midiendo la absorción a 340 nm, lo que permite observar la disminución de NADPH. Se añade NADPH en alícuotas de 300 \mul, ya que una concentración muy alta de NADPH en la solución de la reacción resultaría en la inactivación de la enzima. Para aislar los productos, se extrajo entonces la solución de la reacción tres veces con 5 ml de éter dietílico. Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre MgSO_{4} y se concentró. Se caracterizaron entonces los productos por medio de TLC, GC/MS y RMN.
\newpage
El análisis por GC/MS de la mezcla de reacción produjo los siguientes resultados:
100 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Hidroxilación de compuestos aromáticos, heteroaromáticos y trimetil ciclohexenilo
a)
Se repitió el Ejemplo 6, pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato naftaleno. Los productos que fueron identificados fueron 1-naftol y cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidronaftaleno. 88% del material de partida naftaleno había sido convertido.
Métodos analíticos para reacciones con naftaleno.
GC:
Aparato: Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 sobre Inyector de Columna; Columna: DB5 30 m x 0,2 mm; Material: 5% de difenilo, 95% de dimetilpolisiloxano; Gas transportador: 0,5 bar de H_{2}; Programa de temperatura: 40ºC, 1 min isotérmico/10ºC/min hasta 300ºC. Rt (1-naftol) = 16,68.
RMN:
Se identificaron 1-naftol y cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-naftaleno en la RMN ^{1}H.
b)
Se repitió el Ejemplo 6 pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato 8-metilquinolina. Se identificó a la 5-hidroxi-8-metilquinolina como el producto principal, además de otros derivados (proporción de producto 5:1). 35% del material de partida utilizado había sido convertido.
c)
Se repitió el Ejemplo 6 pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato \alpha-ionona. Se identificó a la 3-hidroxi-\alpha-ionona como el producto principal, además de otros derivados (proporción de producto 76:24). 60% del material de partida utilizado había sido convertido.
d)
Se repitió el Ejemplo 6 pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato cumeno (isopropilbenceno). Se identificaron cinco productos monohidroxi y un producto dihidroxi. 70% del material de partida utilizado había sido convertido.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias
1. Yano, T., Oue, S., and Kagamiyama, H. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 95, 5511-5515.
2. Zhang, J.-H., Dawes, G., and Stemmer, W. P. C. (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94, 4504-4509.
3. Wan, L., Twitchett, M. B., Eltis, L. D., Mauk, A. G., and Smith, M. (1998) Proc. Natl. Acad Sci USA 95, 12825-12831.
4. Cronin, C. N. (1998) J. Biol. Chem 273, 24465-24469.
5. Wilks, H. M., Hart, K-W., Feeney, R., Dunn, C. R., Muirhead, H., Chia, W. N., Barstow, D. A., Atkinson, T., Clarke, A. R., Holbrook, I. J. (1988) Science 242, 1541-1544.
6. Hedstrom, L., Szilagyi, L., Rutter, W. J. (1992) Science 255, 1249-1253.
7. Tucker, C. L., Hurley, J. H., Miller, T. R., and Hurley, I. B. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 95, 5993-5997.
8. Quemeneur, E., Moutiez, J.-B. C., and Menez, A. (1998) Nature (London) 391, 301-303.
9. Marsden, A-F. A., Wilkinson, B., Cortes, J., Dunster, N. J., Staunton, I Leadlay, P. F. (1998) Science 279, 199-201.
10. Chen, R., Greer, A., and Dean, A. M. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 95, 11666-11670.
11. Boddupalli, S. S., Estabrook, R. W. and Peterson, J. A. (1990) J. Biol. Chem 265, 4233-4239.
12. Capdevila, J. H., Wie, S., Helvig, C., Falck, J. R., Belosludtsev, Y., Truan, G., Graham-Lorence, S. E., and Peterson, J. A. (1996) J. Biol. Chem 271, 22663-22671.
13. Graham-Lorence, S., Truan, G., Peterson, J. A., Flack, J. R., WeL S., Helvig, C., Capdevilla, J. H. (1997) J. Biol. Chem 272,1127-1135.
14. Li, H., Poulos, T. L. (1997) Nat. Structural Biol., 4, 140-146.
15. Ravichandran, K G., Sekhar, S., Boddupalli, S., Hasemann, C. A., Peterson, J. A., Deisenhofer, 1 (1993) Science 261,731-736.
16. Modi S., Sutcliffe, M. J., Primrose, W. U., Lian, L.-Y., Roberts, G. C. K (1996) Nat. Structural Biol. 3, 414-417.
17. Oliver, C. F., ModL S., Primrose, W. U., Lian, L. Y. and Roberts, G. C. K (1997) Biochem. J 327, 537-544.
18. Guengerich, F. G. (1991) J. Biol. Chem 266, 10019-10022.
19. Cherry, J. R., Lamsa, M. H., Schneider, P., Vind, J., Svendsen, A-, Jones, A., and Pedersen, A. H. (1999) Nature Biotechnology 17, 379-384.
20. Schwaneberg, U., Schmidt-\BoxDannert, C., Schmitt, J., and Schmid, R. D. (1999) Anal Biochem. 269, 359-366.
21. Schwaneberg, U, Sprauer, AL, Schmidt-\BoxDannert, C., and Schmid, R. D. J. of Chromatogr. A, en prensa.
22. Oliver, C. F., Modi, S., Sutcliffe, M. J., Primrose, W. U., Lian, L. Y. and Roberts, G. C. K (1997) Biochemistry 36, 1567-1572.
23. Hart, S., Koch, K. R., and Woods, D. R. (1992) J. Gen. Microbiol. 138,211-216
24. Murdock, D., Ensley, B. D., Serdar, C. and Thalen, M. (1993) Bio/Technology 11, 381-385.
25. O'Connor, ICE., Dobson, A-W. and Hartmans, S. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 4287-4291.
26. Eaton, R. W. and Chapman, P. J. (1995) J Bacteriol. 177, 6983-6988.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción
Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet GB 2294692 A [0005]
Literatura citada en la descripción que no es de patente
\bullet T. MANIATIS; E. F. FRITSCH; J. SAMBROOK. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0029] [0037]
\bullet T. J. SILHAVY; M. L. BERMAN; L. W. ENQUIST. Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, 1984 [0029]
\bulletAUSUBEL, F. M. y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, 1987 [0029]
\bulletPOUWELS P. H. y colaboradores, Cloning Vectors. Elsevier, 1985 [0030]
\bullet F. AUSUBEL y colaboradores, Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, 1997 [0031]
\bulletCOOPER, F. G. Biochemische Arbeitsmethoden. Verlag Walter de Gruyter [0038]
\bulletSCOPES, R. Protein Purification. Springer Verlag [0038]
\bulletHARLOW, E.; LANE, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press, 1989 [0039]
\bulletYANO, T.; OUE, S.; KAGAMIYAMA, H. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1998, vol. 95, 5511-5515 [0077]
\bulletZHANG, J.-H.; DAWES, G.; STEMMER, W. P. C. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1997, vol. 94, 4504-4509 [0077]
\bulletWAN, L.; TWITCHETT, M. B.; ELTIS, L. D.; MAUK, A. G.; SMITH, M. Proc. Natl. Acad Sci USA, 1998, vol. 95, 12825-12831 [0077]
\bulletCRONIN, C. N. J. Biol. Chem, 1998, vol. 273, 24465-24469 [0077]
\bulletWILKS, H. M.; HART, K-W.; FEENEY, R.; DUNN, C. R.; MUIRHEAD, H.; CHIA, W. N.; BARSTOW, D. A.; ATKINSON, T.; CLARKE, A. R.; HOLBROOK, I J. Science, 1988, vol. 242, 1541-1544 [0077]
\bulletHEDSTROM, L.; SZILAGYI, L.; RUTTER, W. J. Science, 1992, vol. 255, 1249-1253 [0077]
\bulletTUCKER, C. L.; HURLEY, J. H.; MILLER, T. R.; HURLEY, I B. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1998, vol. 95, 5993-5997 [0077]
\bulletQUEMENEUR, E.; MOUTIEZ, J.-B. C.; MENEZ, A. Nature (London, 1998, vol. 391, 301-303 [0077]
\bulletMARSDEN, A-F. A.; WILKINSON, B.; CORTES, J.; DUNSTER; N. J., STAUNTON; I LEADLAY, P. F. Science, 1998, vol. 279, 199-201 [0077]
\bulletCHEN, R.; GREER, A.; DEAN, A. M. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1998, vol. 4 (95), 11666-11670 [0077]
\bulletBODDUPALLI, S. S.; ESTABROOK, R. W.; PETERSON, J. A. J Biol. Chem, 1990, vol. 265, 4233-4239 [0077]
\bulletCAPDEVILA, J. H.; WIE, S.; HELVIG, C.; FALCK, J. R.; BELOSLUDTSEV, Y.; TRUAN, G.; GRAHAM-LORENCE, S. E.; PETERSON, J. A. J. Biol. Chem, 1996, vol. 271, 22663-22671 [0077]
\bulletGRAHAM-LORENCE, S.; TRUAN, G.; PETERSON, J. A.; FLACK, J. R.; WEL S.; HELVIG, C.; CAPDEVILLA, J. H. J. Biol. Chem, 1997, vol. 272, 1127-1135 [0077]
\bulletLI, H.; POULOS, T. L. Nat. Structural Biol., 1997, vol. 4, 140-146 [0077]
\bulletRAVICHANDRAN, K G.; SEKHAR, S.; BODDUPALLI, S.; HASEMANN, C. A.; PETERSON, J. A.; DEISENHOFER, 1. Science, 1993, vol. 261, 731-736 [0077]
\bulletMODI S.; SUTCLIFFE, M. J.; PRIMROSE, W. U.; LIAN, L.-Y.; ROBERTS, G. C. K. Nat. Structural Biol., 1996, vol. 3, 414-417 [0077]
\bulletOLIVER, C.F.; MODL S.; PRIMROSE, W.U.; LIAN, L.Y.; ROBERTS, G.C.K. Biochem. J, 1997, vol. 327, 537-544 [0077]
\bulletGUENGERICH, F.G. J. Biol. Chem, 1991, vol. 266, 10019-10022 [0077]
\bulletCHERRY, J. R.; LAMSA, M. H.; SCHNEIDER, P.; VIND, J.; SVENDSEN, A; JONES, A.; PEDERSEN, A. H. Nature Biotechnology, 1999, vol. 17, 379-384 [0077]
\bulletSCHWANEBERG, U.; SCHMIDT-DANNERT, C.; SCHMITT, J.; SCHMID, R. D. Anal Biochem., 1999, vol. 269, 359-366 [0077]
\bulletSCHWANEBERG, U; SPRAUER, AL; SCHMIDT-DANNERT, C.; SCHMID, R. D. J of Chromatogr. A [0077]
\bulletOLIVER, C.F.; MODI, S.; SUTCLIFFE, M.J.; PRIMROSE, W.U.; LIAN, L.Y.; ROBERTS, G. C. K. Biochemistry, 1997, vol. 36, 1567-1572 [0077]
\bulletHART, S.; KOCH, KR.; WOODS, D.R. J Gen. Microbiol., 1992, vol. 138, 211-216 [0077]
\bulletMURDOCK, D.; ENSLEY, B.D.; SERDAR, C.; THALEN, M. Bio/Technology, 1993, vol. 11, 381-385 [0077]
\bulletO'CONNOR, ICE.; DOBSON, A-W.; HARTMANS, S. Appl. Environ. Microbiol., 1997, vol. 63, 4287-4291 [0077]
\bulletEATON, R. W.; CHAPMAN, P. J. J Bacteriol., 1995, vol. 177, 6983-6988 [0077]
<110> BASF Aktiengesellschaft
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas citocromo P450 monooxigenasas y su uso para la oxidación de sustratos orgánicos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M/40241
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus megaterium 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(3150)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
3
4
5
6
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1048
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus megaterium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
9
10
11
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia sintética: iniciador PRC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia sintética: iniciador PRC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia sintética: iniciador PRC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia sintética: iniciador PRC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia sintética: iniciador PRC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia sintética: iniciador PRC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1049
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus megaterium 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
20
21
22
23

Claims (16)

1. Un proceso para la oxidación microbiológica de un compuesto aromático mono o polinuclear N- O- o S-heterocíclico, que comprende:
a1)
cultivar un microorganismo recombinante que produce al citocromo P450, transformado por medio de un vector que comprende al menos una construcción de expresión que porta, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de codificación para monooxigenasa, en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia; o
a2)
incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una citocromo P450 monooxigenasa de origen bacteriano; y
b)
aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87 de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en las posiciones 87, 188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia se selecciona de compuestos aromáticos mono o polinucleares N- O- o S-heterocíclicos opcionalmente sustitui-
dos.
3. Un proceso para la oxidación microbiológica de un compuesto seleccionado de aromáticos mono o polinucleares opcionalmente sustituidos; alcanos o alquenos de cadena recta o ramificados; y cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente sustituidos;
que comprende:
a1)
cultivar un microorganismo que produce al citocromo P450 recombinante, transformado por medio de un vector que comprende al menos una construcción de expresión que porta, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de codificación para monooxigenasa, en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia; o
a2)
incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una citocromo P450 monooxigenasa; y
b)
aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87 de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en las posiciones 87, 188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly.
4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia se selecciona de:
aromáticos mono o polinucleares opcionalmente sustituidos;
alcanos y alquenos de cadena recta o ramificados; y
cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente sustituidos.
5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde, como sustrato exógeno, al menos un compuesto seleccionado de los grupos de compuestos definidos anteriormente es añadido a un medio y se lleva a cabo la oxidación por medio de una reacción enzimática del medio que contiene al sustrato en presencia de oxígeno a una temperatura aproximadamente de 20 a 40ºC y un pH de aproximadamente 6 a 9, donde el medio que contiene al sustrato comprende adicionalmente un exceso molar de aproximadamente 10 a 100 veces de equivalentes de reducción con base en el sustrato.
6. El proceso de acuerdo a la reivindicación 5, en donde, como sustrato exógeno, se emplea un compuesto seleccionado de indol, n-hexano, n-octano, n-decano, n-dodecano, cumeno, 1-metilindol, 5-Cl-, o Br-indol, indeno, benzotiofeno, alfa, beta o gama-ionona, acridina, naftaleno, 6-metil- u 8-metilquinolina, quinolina y quinaldina.
7. Un proceso para la producción microbiológica de índigo y/o indirubina, que comprende:
a1)
cultivar un microorganismo recombinante que produce una citocromo P450 monooxigenasa que oxida al indol en un medio de cultivo, en presencia de indol exógeno o formado en una etapa intermedia; o
a2)
incubar un medio de reacción que contiene indol con una citocromo P450 monooxigenasa que oxida al indol; y
b)
aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87 de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en las posiciones 87, 188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly.
8. El proceso de acuerdo a la reivindicación 7, en donde el índigo y/o la indirubina obtenidos, que fueron producidos por oxidación del indol formado en una etapa intermedia, se aíslan del medio.
9. El proceso de acuerdo a la reivindicación 8, en donde la oxidación del indol se lleva a cabo por medio del cultivo de los microorganismos en presencia de oxígeno con una temperatura de cultivo de aproximadamente 20 a 40ºC y un pH de aproximadamente 6 a 9.
10. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el mutante tiene al menos una de las siguientes sustituciones de mono o poliaminoácidos:
a)
Phe87Val;
b)
Phe87Val, Leu188Gln; o
c)
Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly.
11. El uso de una citocromo P450 monooxigenasa, donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa BM-4 de Bacillus megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87 de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en las posiciones 87, 188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly para la
a)
oxidación de compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos opcionalmente sustituidos;
b)
oxidación de aromáticos mono o polinucleares opcionalmente sustituidos;
c)
oxidación de alcanos y alquenos de cadena recta o ramificada
d)
oxidación de cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente sustituidos.
12. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde la monooxigenasa comprende una de las siguientes sustituciones de múltiples aminoácidos:
a)
Phe87Val;
b)
Phe87Val, Leu188Gln; o
c)
Phe97Val, Leu188Gln, Ala74Gly.
13. El uso de un vector que comprende al menos una construcción de expresión que incluye, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de codificación que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una monooxigenasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12 o de un microorganismo recombinante que incluye al menos uno de tales vectores para la oxidación microbiológica de
a)
compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos opcionalmente sustituidos;
b)
aromáticos mono o polinucleares opcionalmente sustituidos;
c)
alcanos y alquenos de cadena recta o ramificada; y/o
d)
cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente sustituidos.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el microorganismo se selecciona de bacterias del género Escherichia.
15. El uso de un microorganismo que produce al citocromo P450 que oxida al indol de acuerdo con la definición en la reivindicación 13 ó 14 para la preparación de índigo y/o indirubina.
16. Un biorreactor que comprende una enzima de acuerdo con la definición en cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12 o un microorganismo recombinante de acuerdo a la definición en cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14 en forma inmovilizada, donde la enzima utilizada tiene mutaciones funcionales en las posiciones 87 y 188 o en las posiciones 87, 188 y 74.
ES00956319T 1999-07-27 2000-07-27 Nuevas citocromo p450 monooxigenasas y su uso para oxidar compuestos organicos. Expired - Lifetime ES2311470T3 (es)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19935115A DE19935115A1 (de) 1999-07-27 1999-07-27 Elektronendonorsystem für Enzyme
DE19935115 1999-07-27
DE19955605A DE19955605A1 (de) 1999-11-18 1999-11-18 Neue Cytochrom P450-Monoxygenasen und deren Verwendung zur Oxidation N-heterocyclischer Aromaten
DE19955605 1999-11-18
DE10014085A DE10014085A1 (de) 2000-03-22 2000-03-22 Neue Cytochrom P450-Monooxygenasen und deren Verwendung zur Oxidation von organischen Verbindungen
DE10014085 2000-03-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2311470T3 true ES2311470T3 (es) 2009-02-16

Family

ID=27213745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00956319T Expired - Lifetime ES2311470T3 (es) 1999-07-27 2000-07-27 Nuevas citocromo p450 monooxigenasas y su uso para oxidar compuestos organicos.

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7960155B1 (es)
EP (1) EP1196605B1 (es)
JP (1) JP4791664B2 (es)
KR (2) KR100740368B1 (es)
CN (1) CN1183252C (es)
AT (1) ATE409232T1 (es)
AU (1) AU780694B2 (es)
BR (1) BR0012772B1 (es)
CA (1) CA2380186C (es)
DE (1) DE50015373D1 (es)
EE (1) EE200200048A (es)
ES (1) ES2311470T3 (es)
HU (1) HU229450B1 (es)
IL (2) IL147580A0 (es)
MY (1) MY126592A (es)
NO (1) NO20020380L (es)
UA (1) UA76701C2 (es)
WO (1) WO2001007630A1 (es)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE371028T1 (de) * 1999-07-27 2007-09-15 Basf Ag Modifizierte cytochrom p450-monooxygenasen
CA2418155A1 (en) 2000-07-18 2002-01-24 National Research Council Of Canada Cloning, sequencing and expression of a comamonas cyclopentanone 1,2-monooxygenase-encoding gene in escherichia coli
DE10051175A1 (de) 2000-10-16 2002-05-02 Basf Ag Cytochrom P450 Monoxygenasen aus thermophilen Bakterien
DE10321082A1 (de) * 2003-05-09 2004-11-25 Basf Ag Verfahren zur Herstellung eines Hydroxylierungskatalysators und seine Verwendung
KR100564158B1 (ko) * 2004-07-23 2006-03-24 주식회사 진켐 싸이토크롬 ｐ450 효소 및 이를 코딩하는 유전자
DE102004042102A1 (de) * 2004-08-30 2006-03-09 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Verfahren zur regio-selektiven Oxidation
US8715988B2 (en) * 2005-03-28 2014-05-06 California Institute Of Technology Alkane oxidation by modified hydroxylases
CN100400652C (zh) * 2005-07-21 2008-07-09 南开大学 高效降解芘基因工程菌及其构建
CN100429314C (zh) * 2006-04-18 2008-10-29 浙江大学 能催化吲哚生成靛蓝的质粒pET28a(+)－P450 BM3－gdh0310、制备方法及其用途
JP5186497B2 (ja) * 2006-07-27 2013-04-17 チバ ホールディング インコーポレーテッド ポリオレフィンの生体触媒的な親水化
GB0719620D0 (en) 2007-10-08 2007-11-14 Isis Innovation Mutant Enzymes
KR100975404B1 (ko) * 2008-02-28 2010-08-11 주식회사 종합건축사사무소근정 블록담장용 지주 및 이의 시공방법
CN101333521B (zh) * 2008-04-25 2010-12-15 浙江大学 细胞色素p450bm-3d168w变体酶以及应用其制备靛玉红的方法
DE102008054918A1 (de) * 2008-12-18 2010-07-01 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur enzymatischen Umsetzung von Alkanen
CN101580821B (zh) * 2009-01-19 2011-04-27 广东省微生物研究所 用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶
EP2426198A1 (en) 2010-09-03 2012-03-07 B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG Cytochrome P450 monooxygenase variants
CN102154234A (zh) * 2011-01-18 2011-08-17 浙江大学 具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素p450单加氧酶
CN103146596A (zh) * 2012-12-14 2013-06-12 徐州工程学院 一种生产靛蓝色素的专用菌株
WO2014100251A1 (en) * 2012-12-18 2014-06-26 California Institute Of Technology A cytochrome p450-based biodesulfurization pathway
US10975243B2 (en) 2018-12-28 2021-04-13 Industrial Technology Research Institute Genetically modified microorganism and method for producing indigo dye
EP3858986A1 (en) 2020-02-03 2021-08-04 Bayer Aktiengesellschaft P450 bm3 monooxygenase variants for c19-hydroxylation of steroids
US11345818B1 (en) 2020-12-29 2022-05-31 Industrial Technology Research Institute Dye for fiber and dyeing method
WO2024004921A1 (ja) * 2022-06-27 2024-01-04 天野エンザイム株式会社 ポリペプチド、オキシゲナーゼ及びこれらの応用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9422205D0 (en) * 1994-11-03 1994-12-21 British Gas Plc Enzyme mutant and method
DE19507546C2 (de) * 1995-03-03 2001-05-03 Max Delbrueck Centrum Verfahren zur regioselektiven Hydroxylierung von langkettigen Alkanen, Fettsäuren und anderen Alkylverbindungen
US5691171A (en) * 1995-10-23 1997-11-25 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for production of indigo and indirubin dyes
CN1212015A (zh) * 1995-11-01 1999-03-24 Bg公开有限公司 突变单加氧酶细胞色素P450cam
AU5347999A (en) * 1998-08-12 2000-03-06 Maxygen, Inc. Dna shuffling of monooxygenase genes for production of industrial chemicals
GB9825421D0 (en) 1998-11-19 1999-01-13 Isis Innovation Process for oxidising terpenes
ATE371028T1 (de) * 1999-07-27 2007-09-15 Basf Ag Modifizierte cytochrom p450-monooxygenasen

Also Published As

Publication number Publication date
MY126592A (en) 2006-10-31
EP1196605B1 (de) 2008-09-24
US7960155B1 (en) 2011-06-14
JP2003521889A (ja) 2003-07-22
HUP0202074A3 (en) 2010-01-28
HUP0202074A2 (en) 2002-09-28
JP4791664B2 (ja) 2011-10-12
BR0012772A (pt) 2002-04-02
NO20020380L (no) 2002-03-22
KR20020016924A (ko) 2002-03-06
EE200200048A (et) 2003-04-15
IL147580A0 (en) 2002-08-14
IL147580A (en) 2013-12-31
BR0012772B1 (pt) 2013-05-28
KR20070041792A (ko) 2007-04-19
ATE409232T1 (de) 2008-10-15
KR100740368B1 (ko) 2007-07-16
WO2001007630A1 (de) 2001-02-01
NO20020380D0 (no) 2002-01-24
CA2380186A1 (en) 2001-02-01
AU6830700A (en) 2001-02-13
EP1196605A1 (de) 2002-04-17
CN1183252C (zh) 2005-01-05
DE50015373D1 (de) 2008-11-06
AU780694B2 (en) 2005-04-14
CA2380186C (en) 2012-03-13
CN1365393A (zh) 2002-08-21
HU229450B1 (hu) 2013-12-30
UA76701C2 (uk) 2006-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2311470T3 (es) Nuevas citocromo p450 monooxigenasas y su uso para oxidar compuestos organicos.
US7981652B2 (en) Modified cytochrome P450 monooxygenases
JPWO2004087909A1 (ja) ２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドおよびその応用
Koetsier et al. Characterization of a phenylacetate–CoA ligase from Penicillium chrysogenum
KR100807899B1 (ko) 방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산의 미생물학적 제조방법
KR20080011274A (ko) 활성 [ＦｅＦｅ] 수소화효소의 발현 및 과발현 유전자 및그 방법
US7553648B2 (en) Cytochrome P450 monooxygenases consisting of thermophilic bacteria
EP2611912B1 (en) Novel monooxygenase variants
US10036047B2 (en) Methods for hydroxylating phenylpropanoids
US7598065B2 (en) S-adenosylmethionine-6-N-lysine-methyltransferase from Neurospora crassa, a gene encoding the same, a vector and host cell containing the same, and method for producing trimethyllysine using the host cell
WO2008001700A1 (fr) Phosphatase alcaline
JP5911071B2 (ja) プロトイルデンシンターゼ
RU2285044C2 (ru) Новые цитохром р450-монооксигеназы и их применение для окисления органических соединений
WO2007023369A1 (en) Modified expandase-hydroxylase and its applications
US11807873B2 (en) Conversion of S-lignin compounds to useful intermediates
Tana et al. Expression of cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) in Escherichia coli and its functional characterization
Yu et al. Biochemical characterization of variants of canine CYP1A1 using heterologous expression
Gober Integration of Fermentation and Organic Synthesis: Studies of Roquefortine C and Biosynthetic Derivatives
Haas Substrate selectivity and kinetic mechanism of the stearoyl-acyl carrier protein Delta (9) desaturase
DE10014085A1 (de) Neue Cytochrom P450-Monooxygenasen und deren Verwendung zur Oxidation von organischen Verbindungen