CN100400652C - 高效降解芘基因工程菌及其构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物修复或生态恢复领域，具体地说是一种降解芘基因工程菌及其构建。本发明的高效降解芘基因工程菌是将白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的细胞色素P450单加氧酶pc-1基因，经逆转录-DNA扩增反应得到pc-1的cDNA，再将cDNA转化进大肠杆菌JM109中，构建成功能高效降解多环芳烃的基因工程菌，命名为JM413。构建的基因工程菌JM413，因具有氨苄青霉素抗性基因和单加氧酶基因，所以，适应性强，容易扩大培养，而且安全性高，不会对环境造成任何不良影响，因此，可以广泛应用于生物修复和生态恢复工程，降解难降解有机物，促进生态恢复，保持生态平衡。

Description

高效降解芘基因工程菌及其构建

技术领域

本发明涉及生物修复或生态恢复领域，具体地说是一种降解芘基因工程菌及其构建。

背景技术

在多环芳烃降解中限速步骤是开始的苯环加氧，一旦完成苯环加氧，随后再氧化降解就相对容易进行。但是常见微生物往往缺少单加氧酶基因，或者单加氧酶不能表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效降解芘基因工程菌及其构建方法。

本发明的高效降解芘基因工程菌是将白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的细胞色素P450单加氧酶pc-1基因，经逆转录-DNA扩增反应(RT-PCR)得到pc-1的cDNA(互补DNA)，再将cDNA转化进大肠杆菌JM109中，构建成功能高效降解多环芳烃的基因工程菌，命名为JM413。本发明人保证从申请日起20年内向公众提供该工程菌。白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)购于中国科学院微生物所菌种保存中心。

高效降解芘基因工程菌的构建方法，

1)引物设计根据白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的细胞色素P450单加氧酶pc-1的基因序列，选取其上下游保守序列设计上下游引物A和B，并在各引物的一端分别加上EcoR I和BamH I两个限制性内切酶的酶切位点序列。引物A和B的核苷酸序列如下，下划线部分为EcoRI和BamH I两个限制性内切酶的酶切位点序列。

引物A：5’-ATG GAA TTC ATG GTG ACT ACT TTT ACG AG-3’

引物B：5’-ATG GGA TCC GGA TTG CTT CTG C-3’

2)提取总RNA自白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的细胞提取总RNA

3)逆转录-DNA扩增反应(RT-PCR)采用一步RT-PCR的方法，由总RNA开始逆转录-扩增出单加氧酶基因pc-1的cDNA

4)重组质粒将载体pUC18与单加氧酶pc-1的cDNA在连接酶的作用下杂交为一个新的质粒。

5)转化将杂交的新质粒转化进大肠杆菌JM109中。(大肠杆菌JM109购于华美生物工程公司)

6)筛选和鉴别经进一步的筛选和鉴别确认单加氧酶pc-1的cDNA基因转化进了大肠杆菌JM109中，命名为JM413。

7)性能测定用邻苯三酚分光光度法测定基因工程菌JM413的氧化酶活性，实验证明JM413氧化酶活性比JM109提高135％；以典型的多环芳烃化合物-芘为降解目标物，检验基因工程菌JM413的降解特性，结果表明，在完全相同的条件下，在菌与芘作用48h后JM413的芘降解率是JM109的近20倍。

本发明将真核生物白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的细胞色素P450单加氧酶pc-1的基因，经RT-PCR技术得到cDNA，再将cDNA转化进原核生物大肠杆菌JM109中，构建成功具有单加氧酶活性的基因工程菌JM413。构建的基因工程菌JM413，除具有JM109的特性外，还具有单加氧酶基因，能高效表达产生氧化酶的特性。该菌具有高效降解多环芳烃的特性，在生物修复或生态恢复工程中具有重要应用价值和广阔的市场前景。

本发明的有益效果：

构建的基因工程菌JM413，因具有氨苄青霉素抗性基因和单加氧酶基因，所以，适应性强，容易扩大培养，而且安全性高，不会对环境造成任何不良影响，因此，可以广泛应用于生物修复和生态恢复工程，降解难降解有机物，促进生态恢复，保持生态平衡。

测试、检验结果：

(一).基因工程菌的氧化酶活性测定

1.实验原理

邻苯三酚比色法，基于用邻苯三酚(又称焦性没食子酸)为基质，在有空气氧的情况下，由于微生物的氧化酶的催化生成有色的没食子素。产生没食素在610nm波长下有最大吸光值，其含量与颜色深度(A_610nm)呈正相关。以7.5mg.mL^-1重铬酸钾水溶液的颜色对应于1mg.mL^-1的没食子素的乙酸乙酯溶液。以单位时间内生成没食子素的量表示氧化酶活性。

2.测定结果(表1-1)，柱状图(图1-1)

表1-1  JM413与JM109氧化酶活性

测定结果说明，基因工程菌JM413的氧化酶活性是JM109氧化酶活性135％。这是由于重组菌中转化进了白腐真菌细胞色素P450单加氧酶pc-1基因，并得到了高效表达，提高了JM413的氧化能力的结果。

(二).基因工程菌JM413与JM109对芘降解特性的比较

1、菌悬液的制备：

从JM109和JM413的保存斜面上各挑取一环菌体分别加入到10ml LB培养液中，在37℃下200r·min^-1振荡培养过夜，分别将其全部转接入90ml新鲜的LB培养液中，37℃下200r·min^-1恒温振荡培养约24h，至对数生长期A₆₀₀约为2.0时(每mL菌液菌落数约8.0×10⁸)，4000rpm离心10min，4℃，冰箱保存备用。

2.降解实验

移取200μL的芘-丙酮溶液(1g·L^-1)至100ml锥形瓶中，向其中加入36mL灭菌无机盐培养液，在无菌条件下分别加入JM109和JM413菌悬液4mL，最终芘浓度为5mg·L^-1，37℃200r·min^-1振荡培养。定时取样测定溶液中芘的浓度。

3.芘含量的测定

(1)取培养到一定时间的菌降解液，在超净工作台上将其全部转移到50mL离心管中，4800rpm离心10min，上清液加入20mL乙酸乙酯，沉淀加入10mL乙酸乙酯，室温振荡提取0.5h。

(2)将乙酸乙酯和上清液全部转移至分液漏斗中，剧烈混合，静置10min，待分层后，收集乙酸乙酯层(上层)，向水相中再加入10mL乙酸乙酯，重复上述提取步骤3次，收集乙酸乙酯层，定容至100mL。

(3)将沉淀用乙酸乙酯提取，4800rpm离心10min。将乙酸乙酯转移至50mL容量瓶中，反复提取三次。最后合并提取液乙酸乙酯定容至50mL。

(4)将乙酸乙酯提取液用旋转蒸发器蒸干，用色谱级甲醇定容至10mL，用液相色谱专用膜过滤(0.45μm)，高压液相色谱法(HPLC)测定芘的浓度。

(5)高压液相色谱法：Waters1525型高压液相色谱仪，Waters 2475 MultiλFluorescence Detector(荧光检测器)，Waters Symmetry Shield^TM RP₁₈色谱柱(5μm，3.9×150mm)，流动相为乙腈/H₂O(v∶v＝80∶20)，流速为1mL·min^-1；荧光检测器激发波长为333nm，荧光发射波长为390nm，灵敏度为2.0，进样量为20μ1，室温下测定，外标法定量。检出限为0.5μg·L^-1。

4.测定结果(表1-2，图1-2，图1-3)

表1-2芘降解试验结果

附图说明

图1-1是氧化酶活性对比图

图1-2是JM413降解芘的曲线图

图1-3是JM109与JM413降解量对比图

具体实施方式

实施例1

(一)总RNA的提取

1)将白腐真菌用马铃薯培养基培养至对数生长期，取菌体50mg加入500μL变性溶液和3.6μL β-巯基乙醇，混匀，用匀浆棒冰浴匀浆。

2).立即加入100μL醋酸钠(2mol/L，pH4.0)，200μL水饱和酚和200μL氯仿/异戊醇(24∶1)。加入每种组分后，盖上离心管盖，轻轻振摇充分混匀，冰浴15min。

3).在4℃下10000rpm离心10min，将含RNA的水相移入一新的离心管中。

4).加入与提取液等体积的异丙醇，充分混合，在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。在4℃下15000rpm离心15min

5).轻轻倒出异丙醇，加入100μl溶解RNA颗粒，并加入等体积异丙醇，在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。

6).于4℃下15000rpm离心15min，收集RNA沉淀。用75％的乙醇重复洗涤沉离心2次。吸出残存的乙醇，并打开盖子倒置几分钟，控干乙醇。

7).加100μLDEPC处理过的水溶解沉淀，将总RNA溶液贮存于-70℃。(实验中所有离心管取样器都要用DEPC处理)。

(二)逆转录-DNA扩增(RT-PCR)

为防止RNA被污染，反应皆在无菌条件下操作

1).取5支PCR专用0.5mL薄壁离心管(2支样品，3支对照)置于冰上，加入2*RT-PCR缓冲溶液                                  25μL

模板RNA(总RNA)           终浓度10pg-1ug

引物A                              1μL

引物B                              1μL

RT/TaqMix                          1μL

无菌双蒸水                  补足至50μL

阴性对照：

对照1：不加模板RNA

对照2：不加反转录酶用2U Taq替代RT/Taq Mix

对照3：不加引物

2).轻轻混匀，(瞬间离心，确保所有组分在管底)，上覆液体石蜡约50μl。

3).RT-PCR步骤与条件

第1个循环	37℃cDNA合成15-30min，94℃预变性2min
		第35-40个循环PCR扩增	94℃变性15s，55-60℃退火30s，68-72℃延伸40s
最后1个循环	72℃延伸5-10min，获得cDNA

(三)载体puc18DNA与cDNA的酶切与连接

1).酶切

(1)cDNA酶切：

BamH I          0.8μL

EcoR I          0.8μL

Buffer K        2.0μL

cDNA           大约1.0μL(终浓度为0.1μg·μL^-1)

无菌双蒸水H₂O  补足至20μL

37℃恒温水浴1h，加入50μL无水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm离心10min，弃去上清液，倒置20min，加入无菌双蒸水10μL。

(2)载体puc18DNA的酶切：

BamH I    0.8μL

EcoR I    0.8μL

Buffer K  2.0μL

pUC18DNA  大约1.0μL(终浓度为0.1μg·μL^-1)

ddH₂O    补足至20μL

37℃恒温水浴1h，加入50μl无水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm离心10min，弃去上清液，倒置20min，加入无菌双蒸水10μL，-20℃保存。

2)cDNA与pUC18DNA的连接

目的DNA      3.0μL

载体DNA      1.0μL

T₄连接酶     1.0μL

10*Buffer    1.0μL

无菌双蒸水   补足至10.0μL

恒温16℃，过夜，-20℃保存。

(四)感受态细胞的制备与转化

1)取100μL菌株E.coli JM109甘油保存菌液，接入3mL LB液体培养液中，37℃振摇过夜，将培养液转入25mL新鲜LB培养液中，37℃继续培养至A₆₀₀约为0.3～0.4，取1.5mL培养液于4℃下5000rpm离心10min，弃去上清，倒置控干。

2)加入0.5mL0.1mol·L^-1CaCl₂-MgCl₂，冰浴10min，于4℃下10000rpm离心10min，弃去上清。

3).再向菌体中加入1ml 0.1mol·L^-1CaCl₂-MgCl₂，混合均匀，分装成100μL/管，-20℃保存。

4).取cDNA与pUC18DNA的连接液5μL加入到100μL感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激90s，取出后立即冰浴1～2min。

5).向其中加入800μL含氨苄青霉素(0.1％)的LB培养液，37℃70r·min^-1恒温培养45min，4℃，10000rpm离心10min，弃去部分上清液，-20℃保存备用。

(五)用X-gal和IPTG筛选阳性重组子菌落——蓝白斑筛选

1).在含有氨苄青霉素的预制LB平板中央滴加40μL 2％X-gal和8μL 20％IPTG。

2).用一个灭菌的涂布器将X-gal和IPTG溶液涂布均匀，使之均匀分散于培养基表面。37℃放置0.5h至培养基表面无液体。

3).接种100μL(四)制备的转化菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀，待接种液完全吸收后，倒置培养板于37℃培养过夜。

4).取出培养板于4℃放置0.5～1h，使菌落显色充分。

5).筛选出白色的菌落，即为基因工程菌，命名为JM413。

实施例二

(一)总RNA的提取

1)将白腐真菌用马铃薯培养基培养至对数生长期，取菌体100mg

500μL变性溶液和3.6μLβ-巯基乙醇，混匀，用匀浆棒冰浴匀浆。

2).立即加入100μL醋酸钠(2mol/L，pH4.0)，200μL水饱和酚和200μL氯仿/异戊醇(24∶1)。加入每种组分后，盖上离心管盖，轻轻振摇充分混匀，冰浴15min。

3).在4℃下10000rpm离心10min，将含RNA的水相移入一新的离心管中。

4).加入与提取液等体积的异丙醇，充分混合，在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。在4℃下15000rpm离心15min

5).轻轻倒出异丙醇，加入100μl溶解RNA颗粒，并加入等体积异丙醇，在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。

6).于4℃下15000rpm离心15min，收集RNA沉淀。用75％的乙醇重复洗涤沉离心2次。吸出残存的乙醇，并打开盖子倒置几分钟，控干乙醇。

7).加100μLDEPC处理过的水溶解沉淀，将总RNA溶液贮存于-70℃。(实验中所有离心管取样器都要用DEPC处理)。

(二)逆转录-DNA扩增(RT-PCR)

为防止RNA被污染，反应皆在无菌条件下操作

1).取5支PCR专用0.5mL薄壁离心管(2支样品，3支对照)置于冰上，加入2*RT-PCR缓冲溶液                   25μL

模板RNA(总RNA)           终浓度10pg~1ug

引物A                              2μL

引物B                              2μL

RT/Taq Mix                         2μL

无菌双蒸水                  补足至50μL

阴性对照：

对照1：不加模板RNA

对照2：不加反转录酶用2U Taq替代RT/Taq Mix

对照3：不加引物

2).轻轻混匀，(瞬间离心，确保所有组分在管底)，上覆液体石蜡约50μl。

3).RT-PCR步骤与条件

第1个循环	37℃cDNA合成15～30min95℃预变性2min
		第35～40循环PCR扩增	95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸40s
最后1个循环	72℃延伸5-10min，获得cDNA

 (三)载体puc18DNA与cDNA的酶切与连接

1).酶切

(1)cDNA酶切：

BamH I         0.8μL

EcoR I         0.8μL

Buffer K       2.0μL

cDNA           大约1.0μL(终浓度为0.1μg·μL^-1)

无菌双蒸水H₂O  补足至20μL

37℃恒温水浴1h，加入50μL无水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm离心10min，弃去上清液，倒置20min，加入无菌双蒸水10μL。

(2)载体puc18DNA的酶切：

BamH I      0.8μL

EcoR I      0.8μL

Buffer K    2.0μL

pUC18DNA    大约1.0μL(终浓度为0.1μg·μL^-1)

ddH₂O       补足至20μL

37℃恒温水浴1h，加入50μl无水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm离心10min，弃去上清液，倒置20min，加入无菌双蒸水10μL，-20℃保存。

2)cDNA与pUC18DNA的连接

目的DNA       3.0μL

载体DNA       1.0μL

T₄连接酶      1.0μL

10*Buffer     1.0μL

无菌双蒸水    补足至10.0μL

恒温16℃，过夜，-20℃保存。

(四)感受态细胞的制备与转化

1)取100μL菌株E.coli JM109甘油保存菌液，接入3mL LB液体培养液中，37℃振摇过夜，将培养液转入25mL新鲜LB培养液中，37℃继续培养至A₆₀₀约为0.3～0.4，取1.5mL培养液于4℃下5000rpm离心10min，弃去上清，倒置控干。

2)加入0.5mL0.1mol·L^-1CaCl₂-MgCl₂，冰浴10min，于4℃下10000rpm离心10min，弃去上清。

3).再向菌体中加入1ml 0.1mol·L^-1CaCl₂-MgCl₂，混合均匀，分装成100μL/管，-20℃保存。

4)cDNA与pUC18DNA的连接液5μL加入到100μL感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激90s，取出后立即冰浴1～2min。

5)其中加入800μL含氨苄青霉素(0.1％)的LB培养液，37℃70r·min^-1恒温培养45min，4℃，10000rpm离心10min，弃去部分上清液，-20℃保存备用。

(五)用X-gal和IPTG筛选阳性重组子菌落——蓝白斑筛选

1).在含有氨苄青霉素的预制LB平板中央滴加40μL 2％X-gal和8μL 20％IPTG。

2).用一个灭菌的涂布器将X-gal和IPTG溶液涂布均匀，使之均匀分散于培养基表面。37℃放置0.5h至培养基表面无液体。

3).接种100μL(四)制备的转化菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀，待接种液完全吸收后，倒置培养板于37℃培养过夜。

4)将培养板于4℃放置0.5～1h，使菌落显色充分。

5).筛选出白色的菌落，即为基因工程菌，命名为JM413。

实施例三

(一)总RNA的提取

1)将白腐真菌用马铃薯培养基培养至对数生长期，取菌体80mg

500μL变性溶液和3.6μL β-巯基乙醇，混匀，用匀浆棒冰浴匀浆。

2).立即加入100μL醋酸钠(2mol/L，pH4.0)，200μL水饱和酚和200μL氯仿/异戊醇(24∶1)。加入每种组分后，盖上离心管盖，轻轻振摇充分混匀，冰浴15min。

3).在4℃下10000rpm离心10min，将含RNA的水相移入一新的离心管中。

4).加入与提取液等体积的异丙醇，充分混合，在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。在4℃下15000rpm离心15min

5).轻轻倒出异丙醇，加入100μl溶解RNA颗粒，并加入等体积异丙醇，在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。

6).于4℃下15000rpm离心15min，收集RNA沉淀。用75％的乙醇重复洗涤沉离心2次。吸出残存的乙醇，并打开盖子倒置几分钟，控干乙醇。

7).加100μLDEPC处理过的水溶解沉淀，将总RNA溶液贮存于-70℃。(实验中所有离心管取样器都要用DEPC处理)。

(二)逆转录-DNA扩增(RT-PCR)

为防止RNA被污染，反应皆在无菌条件下操作

1).取5支PCR专用0.5mL薄壁离心管(2支样品，3支对照)置于冰上，加入2*RT-PCR缓冲溶液                  25μL

模板RNA(总RNA)       终浓度10pg~1ug

引物A                          2μL

引物B                          2μL

RT/Taq Mix                     2μL

无菌双蒸水              补足至50μL

阴性对照：

对照1：不加模板RNA

对照2：不加反转录酶用2U Taq替代RT/Taq Mix

对照3：不加引物

2).轻轻混匀，(瞬间离心，确保所有组分在管底)，上覆液体石蜡约50μl。

3).RT-PCR步骤与条件

第1个循环	37℃cDNA合成15～30min95℃预变性3min
		第35～40循环PCR扩增	95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸40s
最后1个循环	72℃延伸5～8min获得cDNA

(三)载体puc18DNA与cDNA的酶切与连接

1).酶切

(1)cDNA酶切：

BamH I           0.8μL

EcoR I         0.8μL

Buffer K       2.0μL

cDNA           大约1.0μL(终浓度为0.1μg·μL^-1)

无菌双蒸水H₂O   补足至20μL

37℃恒温水浴1h，加入50μL无水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm离心10min，弃去上清液，倒置20min，加入无菌双蒸水10μL。

(2)载体puc18DNA的酶切：

BamH I      0.8μL

EcoR I      0.8μL

Buffer K    2.0μL

pUC18DNA    大约1.0μL(终浓度为0.1μg·μL^-1)

ddH₂O       补足至20μL

37℃恒温水浴1h，加入50μl无水乙醇，-20℃放置30min以上，4℃，15000rpm离心10min，弃去上清液，倒置20min，加入无菌双蒸水10μL，-20℃保存。

2)cDNA与pUC18DNA的连接

目的DNA      3.0μL

载体DNA      1.0μL

T₄连接酶     1.0μL

10*Buffer    1.0μL

无菌双蒸水   补足至10.0μL

恒温16℃，过夜，-20℃保存。

(四)感受态细胞的制备与转化

1)取100μL菌株E.coli JM109甘油保存菌液，接入3mL LB液体培养液中，37℃振摇过夜，将培养液转入25mL新鲜LB培养液中，37℃继续培养至A₆₀₀约为0.3～0.4，取1.5mL培养液于4℃下5000rpm离心10min，弃去上清，倒置控干。

2)加入0.5mL0.1mol·L^-1CaCl₂-MgCl₂，冰浴10min，于4℃下10000rpm离心10min，弃去上清。

3).再向菌体中加入1ml 0.1mol·L^-1CaCl₂-MgCl₂，混合均匀，分装成100μL/管，-20℃保存。

4)cDNA与pUC18DNA的连接液5μL加入到100μL感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激90s，取出后立即冰浴1～2min。

5)向其中加入800μL含氨苄青霉素(0.1％)的LB培养液，37℃70r·min^-1恒温培养45min，4℃，10000rpm离心10min，弃去部分上清液，-20℃保存备用。

(五)用X-gal和IPTG筛选阳性重组子菌落——蓝白斑筛选

1).在含有氨苄青霉素的预制LB平板中央滴加40μL 2％X-gal和8μL 20％IPTG。

2).用一个灭菌的涂布器将X-gal和IPTG溶液涂布均匀，使之均匀分散于培养基表面。37℃放置0.5h至培养基表面无液体。

3).接种100μL(四)制备的转化菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀，待接种液完全吸收后，倒置培养板于37℃培养过夜。

4)将培养板于4℃放置0.5～1h，使菌落显色充分。

5)筛选出白色的菌落，即为基因工程菌，命名为JM413。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>高效降解芘基因工程菌及其构建

<130>20050720

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>JM413

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(29)

<223>

<400>1

atggaattca tggtgactac ttttacgag                          29

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>JM413

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<223>

<400>2

atgggatccg gattgcttct gc           22

Claims (2)

1.一种降解芘基因工程菌，其特征在于，它是将白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)的细胞色素P450单加氧酶pc-1基因，经逆转录-DNA扩增反应得到pc-1的cDNA，再将cDNA转化进大肠杆菌JM109中，构建成能降解多环芳烃的基因工程菌，命名为JM413。

2.一种降解芘基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)引物设计根据白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的细胞色素P450单加氧酶pc-1的基因序列，选取其上下游保守序列设计上下游引物A和B，并在各引物的一端分别加上EcoR I和BamH I两个限制性内切酶的酶切位点序列，引物A和B的核苷酸序列如下，下划线部分为EcoR I和BamH I两个限制性内切酶的酶切位点序列；

引物A：5’-ATG GAATTC ATG GTGACTACTTTTACGAG-3’

引物B：5’-ATG GGATCCGGATTG CTT CTG C-3’

2)提取总RNA自白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)的细胞提取总RNA；

3)逆转录-DNA扩增反应采用一步RT-PCR的方法，由总RNA开始逆转录-扩增出单加氧酶基因pc-1的cDNA；

4)重组质粒将载体pUC18与单加氧酶pc-1的cDNA在连接酶的作用下杂交为一个新的质粒；

5)转化将杂交的新质粒转化进大肠杆菌JM109中；

6)筛选和鉴别经进一步的筛选和鉴别确认单加氧酶pc-1的cDNA基因转化进了大肠杆菌JM109中，命名为JM413。

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