DE19955605A1

DE19955605A1 - Neue Cytochrom P450-Monoxygenasen und deren Verwendung zur Oxidation N-heterocyclischer Aromaten

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Publication number: DE19955605A1
Application number: DE19955605A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Hauer; Juergen Pleiss; Ulrich Schwaneberg; Jutta Schmitt; Markus Fischer; Rolf Schmid; Quing-Shan Li
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 1999-11-18
Publication date: 2001-05-23

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Cytochrom P450-Monoxygenasen, welche zur Oxidation N-heterocyclischer aromatischer Verbindungen befähigt sind, dafür kodierende Nukleotidsequenzen, diese Sequenzen enthaltende Expressionskonstrukte und Vektoren, damit transformierte Mikroorganismen, Verfahren zur mikrobiologischen Oxidation N-heterocyclischer aromatischer Verbindungen und insbesondere Verfahren zur Herstellung von Indigo und Indirubin.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Cytochrom P450-Mo noxygenasen, welche zur Oxidation N-heterocyclischer aromati scher Verbindungen befähigt sind, dafür kodierende Nukleotid sequenzen, diese Sequenzen enthaltende Expressionskonstrukte und Vektoren, damit transformierte Mikroorganismen, Verfahren zur mikrobiologischen Oxidation N-heterocyclischer aromati scher Verbindungen und insbesondere Verfahren zur Herstellung von Indigo und Indirubin.

Enzyme mit neuartigen Funktionen und Eigenschaften können ent weder durch Screening natürlicher Proben oder durch Protein Engineering bekannter Enzyme bereitgestellt werden. Die letzt genannte Methode kann unter Umständen die geeignetere sein, um Eigenschaften zu induzieren, deren Generierung auf dem Wege natürlicher Selektion unwahrscheinlich ist. Trotz zahlreicher Anstrengungen zum Engineering von Enzymen gibt es bisher nur wenige erfolgreiche Studien zur Förderung der katalytischen Aktivität von Enzymmutanten bezüglich eines bestimmten Sub strates (1-10). In diesen bekannten Fällen sind die Substrate strukturell eng verwandt mit dem nativen Substrat des jeweili gen Enzyms. Bisher gibt es keine Berichte über ein erfolgrei ches Engineering von Enzymen, welche nach der Modifikation die Umsetzung einer Verbindung katalysieren, welche strukturell völlig verschieden vom nativen Substrat des Enzyms ist.

Die aus dem Bakterium Bacillus megaterium isolierbare Cyto chrom P450-Monoxygenase katalysiert gewöhnlich die subtermina le Hydroxylierung langkettiger, gesättigter Säuren und der entsprechenden Amide und Alkohole davon oder die Epoxydation ungesättigter langkettiger Fettsäuren oder gesättigter Fett säuren mit mittlerer Kettenlänge (11-13). Die optimale Ketten länge gesättigter Fettsäuren beträgt 14 bis 16 Kohlenstoff atome. Fettsäuren mit einer Kettenlänge von weniger als 12 werden nicht hydroxyliert (11).

Die Struktur der Häm-Domäne von P450 BM-3 wurde durch Röntgen strukturanalyse bestimmt (14-16). Die Substratbindungsstelle liegt in Form einer langen tunnelartigen Öffnung vor, welche von der Moleküloberfläche bis hin zum Häm-Molekül reicht und wird fast ausschließlich von hydrophoben Aminosäureresten be grenzt. Die einzigen geladenen Reste an der Oberfläche der Häm-Domäne sind die Reste Arg47 und Tyr51. Man nimmt an, daß diese an der Bindung der Carboxylatgruppe des Substrates durch Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind (14). Die Mutation von Arg47 zu Glu bewirkt eine Inaktivierung des Enzyms für Arachidonsäure (13), erhöht jedoch dessen Aktivität gegenüber C₁₂-C₁₄-Alkyltrimethylammonium-Verbindungen (17). Eine Substratnutzung für aromatische Verbindungen, insbesondere zwei- oder mehrkernige N-heterocyclische Aromaten, wurde für dieses Enzym nicht beschrieben. Es wurde deshalb bisher in der Fachwelt angenommen, daß Indol aufgrund der deutlichen strukturellen Unterschiede zu den nativen Substraten von P450 BM-3, insbesondere aufgrund des Fehlens funktioneller Gruppen, welche an die oben erwähnten Reste in der Substrattasche bin den könnten, kein Substrat darstellen.

Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Cyto chrom P450 Monoxygenasen mit veränderter Substratspezifität bereit zu stellen. Insbesondere sollten Monoxygenase-Mutanten bereitgestellt werden, welche im Vergleich zu dem nichtmutier ten Enzym mit strukturell deutlich anderen Substraten enzyma tisch aktiv sind.

Diese Aufgabe konnte überraschenderweise gelöst werden durch Cytochrom P450 Monoxygenasen, welche zur Oxidation N-heterocy clischer zwei- oder mehrkerniger aromatischer Verbindungen be fähigt ist.

Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung solche Monoxygena sen, deren Substrat-bindender Bereich durch ortsspezifische Mutagenese zur funktionalen Aufnahme des N-heterocyclischen Substrats befähigt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die neuen Monoxygenase löslich, d. h. in nicht-membrangebundener Form existent, und in dieser Form enzymatisch aktiv.

Die erfindungsgemäßen Monoxygenasen sind vorzugsweise abgelei tet von Cytochrom P450 Monoxygenasen bakteriellen Ursprungs, wie insbesondere abgeleitet von Cytochrom P450 Monoxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, welche wenigstens eine funktionelle, d. h. die Oxidation N-heterocyclischer zwei- oder mehrkerniger armoti scher Verbindungen fördernde Mutation, in einem der Aminosäu resequenzbereiche 172-224 (F/G-loop-Bereich), 39-43 (β-strand 1), 48-52 (β-strand 2), 67-70 (β-strand 3), 330-335 (β-strand 5), 352-356 (β-strand 8), 73-82 (helix 5) und 86-88 (helix 6) aufweist.

Besonders bevorzugten Monoxygenase-Mutanten dieses Typs sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der folgenden ein- oder mehrfachen Aminosäuresubstitutionen aufweist:

a) Phe87Val;
b) Phe87Val, Leu188Gln; oder
c) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;

sowie funktionale Äquivalente davon. Funktionale Analoga sind in diesem Zusammenhang davon verschiedene Mutanten, welche weiterhin die gewünschte Substratspezifität gegenüber hetero zyklischen Aromaten besitzen und insbesondere Indol hydroxylieren.

Erfindungsgemäß oxidierbare, insbesondere hydroxylierbare N- heterocyclische zwei- oder mehrkernige aromatische Verbindun gen umfassen vorzugweise zwei oder drei, insbesondere zwei, vier- bis siebengliedrigen, insbesondere sechs- oder fünf gliedrige, kondensierte Ringe, wobei wenigstens einer, vor zugsweise alle Ringe aromatischen Charakter besitzen und wobei wenigstens einer der Ringe ein bis drei, vorzugsweise ein N- Heteroatom trägt. In der Ringstruktur können gegebenenfalls ein oder zwei weitere Heteroatome, wie O und S, enthalten sein. Die aromatischen Verbindungen können weiterhin 1 bis 5 Substituenten an den Ring-Kohlenstoff- oder an den Heteroato men tragen. Beispiele für geeignete Substituenten sind Methyl, Hydroxyl und Halogen, wie F, C1, und Br. Nichtlimitierende Beispiele für geeignete Substrate sind Indol, N-Methyl-indol und die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, ko dierend für eine der obigen Monoxygenasen. Bevorzugte Nuklein säuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO: 1, welche wenig stens eine Nukleotidsubstitution aufweist, die zu einer der oben beschriebenen funktionellen Aminosäuremutationen führt. Außerdem sind die davon abgeleiteten, an die Kodonnutzung ver schiedener Wirtsorganismen angepaßten Sequenzen Gegenstand der Erfindung. Gegenstand der Erfindung sich außerdem durch Addi tion, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide erhaltenen funktionalen Analoga der Nu kleinsäuren, welche weiterhin für eine Monoxygenase mit der gewünschten Substratspezifität, insbesondere mit Indol-oxidie render Aktivität, kodieren.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nu kleinsäuresequenzen, wie einem 5'-stromaufwärts gelegenen konstitutiven oder nicht-konstitutiven Promotor und 3'-strom abwärts gelegenen Terminator, eine kodierende Sequenz, welche eine Nukleinsäuresequenz gemäß obiger Definition umfasst. Be sonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperaturinduztierbarer Pro motoren, wie der P_rP_l-Promotor. Weitere regulative Elemente umfassen Enhancer, selektierbare Marker, Amplifikationssigna le, Replikationsursprünge, Polyadenylierungssignale und der gleichen.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Vektoren, wie z. B. Vi ren und Plasmide, umfassend wenigstens eines der erfindungs gemäßen Expressionskonstrukte. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin rekombinante Mikroorganismen, transformiert mit we nigstens einem solchen Vektor. Bevorzugte Mikroorganismen sind ausgewählt unter Bakterien der Gattung Escherichia, wie z. B. E. coli.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikrobiolo gischen Oxidation N-heterocyclischer zwei- oder mehrkerniger armotischer Verbindungen gemäß obiger Definition, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

1. einen rekombinanten Mikroorganismus gemäß obiger Defini tion in einem Kulturmedium, gegebenenfalls in Gegenwart eines Substrats, kultiviert; oder
2. ein Substrat-haltiges Reaktionsmedium mit einem erfin dungsgemäßen Enzym inkubiert; und
3. das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgeprodukt davon aus dem Medium isoliert.

Eine bevorzugte Verfahrensvariante ist auf die Bildung von Indol/Indirubin gerichtet und dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Medium das gebildete Indol und/oder Indirubin isoliert.

Wird die Umsetzung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivie rung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z. B. TB- oder LB-Medium bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 30 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 kultiviert, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist. Die Zugabe von Indol ist gewöhnlich nicht er forderlich, da dieses vom Mikroorganismus intermediär gebildet wird. Im die Oxidationsreaktion besser steuern zu können, be vorzugt man die Verwendung eines induzierbaren, insbesondere temperaturinduzierbaren, Promotors. Man erhöht dabei die Tem peratur auf die erforderliche Induktionstemperatur, z. B. 42°C beim P_rP_l-Promotor, behält dies über einen ausreichenden Zeit raum, z. B. 1 bis 10 oder 5 bis 6 Stunden, zur Expression der Monoxygenase-Aktivität bei und verringert anschließend der Temperatur wieder einer Wert von etwa 30 bis 40°C. Die Kulti vierung wird dann in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt. Der pH-Wert kann dabei durch Zugabe von NaOH, z. B. auf 9 bis 10, erhöht werden, wodurch die Indigobil dung bzw. Indirubinbildung durch Luftoxidation der enzymatisch gebildeten Oxidationsprodukte 2- und 3-Hydroxyindol zusätzlich gefördert wird.

Wird die Umsetzung dagegen mit gereinigtem oder angereichertem Enzym durchgeführt so löst man das erfindungsgemäße Enzym in einem Indol-haltigen Medium (etwa 0,01 bis 10 mM, oder 0,05 bis 5 mM), und führt die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 10 bis 50°C, wie z. B. 30 bis 40°C, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 (wie z. B. eingestellt mit 100 bis 200 mM Phosphat- oder Tris-Puffer), sowie in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch, wobei das Indol-haltige Medium außer dem bezogen auf Indol einen etwa 10- bis 100fachen molaren Überschuß an Reduktionsäquivalenten enthält. Bevorzugtes Re duktionsmittel ist NADPH.

Das gebildete Oxidationsprodukt kann dann in herkömmlicher Weise, wie z. B. durch Extraktion oder Chromatographie, vom Medium abgetrennt und gereinigt werden.

Weitere Gegenständer der Erfindung betreffen Bioreaktoren, umfassend ein erfindungsgemäßes Enzym oder einen erfindungs gemäßen rekombinanten Mikroorganismus in immobilisierter Form.

Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Cytochrom P450 Monoxygenase oder eines erfindungsgemäßen Vektors oder Mikroorganismus zur mikrobiolo gischen Oxidation N-heterocyclischer zwei- oder mehrkerniger armotischer Verbindungen, insbesondere im Rahmen der Bildung von Indigo und/oder Indirubin.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1 Randomisierung spezieller Codons von P450 BM-3

Die Versuche wurden im wesentlichen wie beschrieben in (19) durchgeführt. Drei Positionen (Phe87, Leu188 und Ala74) wurden mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese unter Verwendung des Stratagene QuikChange kit (La Jolla, CA, USA) randomisiert. Folgende PCR-Primer wurden für die einzelnen Positionen ver wendet: Phe87: 5'-gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3' (SEQ ID NO: 3), 5'-cgtccagcttgtnnncaacccgtctcctgc-3', (SEQ ID NO: 4) Leu188: 5'-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3' (SEQ ID NO: 6); Ala74: 5'-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3' (SEQ ID: NO: 7), 5'-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3' (SEQ ID NO: 6).

Die Bedingungen für die PCR waren für alle drei Positionen identisch. Insbesondere wurden je 50 µl Reaktionsvolumen 17,5 pmol eines jeden Primers, 20 pmol Template-Plasmid-DNA, 3 U der Pfu Polymerase und 3,25 nmol von jedem dNTP verwendet. Die PCR Reaktion wurde bei 94°C/l min gestartet und dann wurde folgender Temperaturzyklus 20 mal durchgeführt: 94°C, 1 min. 46°C, 2,5 min. 72°C, 17 min. Nach 20 Zyklen wurde die Reaktion 15 min bei 72°C fortgesetzt. Nach der PCR wurde die Template DNA mit 20 U DpnI bei 37°C 3 h verdaut. Anschließend wurde E. coli DH5α transformiert. Die transformierten E. coli DH5α-Zel len wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, welche 150 µg/ml Ampicillin enthielten. Anschließend wurde 18 h bei 37°C inku biert.

Beispiel 2 Expression und Reinigung der P450 BM-3 und dessen Mutanten und Produktion eines blauen Pigmentes

Das P450 BM-3-Gen und die Mutanten davon wurden unter der Kon trolle des starken, Temperatur-induzierbaren P_RP_L-Promotors des Plasmids pCYTEXP1 in E. coli DH5α wie bereits beschrieben (20), exprimiert. Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, ent haltend je Vertiefung 200 µl TB-Medium und 100 µg/ml Ampicil lin transferiert. Anschließend wurde über Nacht bei 37°C inku biert. 40 µl der Zellkultur einer jeden Vertiefung wurden an schließend in ein Kulturröhrchen überführt, das 2 ml TB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin enthält. Anschließend wurde 2 h bei 37°C kultiviert. Dann wurde die Temperatur zur Induktion 6 h auf 42°C erhöht. Dann wurde die Kultivierung über Nacht bei 37°C fortgesetzt, wobei ein blaues Pigment produziert wurde.

Die präparative Herstellung von Enzym oder blauem Pigment wur de ausgehend von einer 300 ml Zellkultur (OD_{578 nm} = 0,8 bis 1,0) durchgeführt. Zur Isolierung des Enzymes wurden die Zellen 10 min bei 4000 Upm abzentrifugiert, in 0,1 M K_xPO₄-Puffer, pH 7,4 resuspendiert. Die eisgekühlten Zellen wurden mit Hilfe eines Branson Sonifiers W25 (Dietzenbach, Deutschland) bei einer Energieoutput von 80 W durch dreimalige Beschallung von 2 min vorsichtig aufgeschlossen. Die Suspensionen wurden 20 min bei 32 570 × g zentrifugiert. Der Rohextrakt wurde zur Aktivitäts bestimmung bzw. zur Enzymreinigung eingesetzt. Die Enzymreini gung erfolgte wie in (21) bereits beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Die Konzentration an gerei nigtem Enzym wurde über die Extinktionsdifferenz bei 450 und 490 nm, wie in (11) bereits beschrieben, unter Verwendung ei nes Extinktionskoeffizienten ∈ von 91 mM^-1 cm^-1 bestimmt.

Beispiel 3 Isolierung von Mutanten, welche große Mengen an blauem Pigment produzieren

Jeweils 100 Kolonien wurden von den Mutanten einer jeden Posi tion isoliert, welche durch randomisierte Mutagenese des Co dons der entsprechenden Position erzeugt wurden. Diese Kolo nien wurden in Kulturröhrchen zur Produktion von blauem Pig ment kultiviert. Nach dem Waschen der Zellen mit Wasser und mehreren langsamen Zentrifugationsschritten (500 Upm) wurde das blaue Pigment mit Dimethylsulfoxid (DMSO) extrahiert. Die Löslichkeit des blauen Pigmentes war in DMSO am größten. Die Absorption des Extraktes wurde bei 677 nm bestimmt. Diejenige Mutante, welche die größte Menge an blauem Pigment von allen Mutanten einer bestimmten Position produzierte, wurde für eine DNA-Sequenzierung (ABI DNA Sequenzierungs-Kit; ABI Prisma™ 377 DNA Sequencer) verwendet und außerdem als Template für orts spezifische randomisierte Mutagenese verwendet.

Beispiel 4 Aktivitätstest für die Indol-Hydroxylierung

Die Indol-Hydroxylierungsaktivität wurde in einer Lösung gete stet, die 8 µl einer 10-500 mM Indollösung in DMSO, 850 µl Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 8,2) und 0,6 nmol P450 BM-3 Wildtyp oder Mutante in einem Endvolumen von 1 ml enthielt. Das Ge misch wurde 9 min vorinkubiert, bevor man die Reaktion durch Zugabe von 50 µl einer wässrigen 1 mM Lösung von NADPH starte te. Die Reaktion wurde nach 20 sec durch Zugabe von 60 µl 1,2 M KOH gestoppt. Innerhalb von 5 bis 30 sec (unter aeroben Be dingungen) wurden die Enzymprodukte vollständig in Indigo ([Δ^2,2'-Biindolin]-3,3'-dion) und Indirubin ([Δ^2,3'-Biindolin]- 2',3-dion) überführt. Die Indigoproduktion wurde über dessen Absorption bei 670 nm bestimmt. Eine Eichkurve mit reinem In digo zeigte einen Extinktionskoeffizienten von 3,9 mM^-1 cm^-1 bei dieser Wellenlänge. Ein linearer Kurvenverlauf wurde für die Indigoproduktion in einer Reaktionszeit von 40 sec unter Ver wendung von 0,6 nmol Wildtyp bzw. P450 BM-3-Mutante und 0,05 bis 5,0 mM Indol erhalten. Indirubin zeigt eine sehr schwache Absorption bei 670 nm und die gebildete Indirubinmenge war sehr viel geringer als die gebildete Indigomenge. Die Bildung von Indirubin wurde bei der Bestimmung der kinetischen Para meter vernachlässigt. Der NADPH-Verbrauch wurde bei 340 nm bestimmt und unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 6,2 mM^-1 cm^-1 wie beschrieben (17) berechnet.

Beispiel 5 Reinigung von Indigo und Indirubin

Nach Waschen der Zellen mit Wasser und wiederholter Zentrifu gation bei 500 g wurde das gebildete blaue Pellet mit Tetra hydrofuran (THF) extrahiert. Der Extrakt wurde bis fast zur Trockene eingedampft und das rote Pigment wurde mehrmals mit 50 ml absolutem Ethanol extrahiert. Der verbleibende blaue Feststoff wurde in THF gelöst und durch Dünnschichtchromato graphie (TLC) analysiert. Die Ethanollösung wurde eingedampft und durch Silicagelchromatographie (DC 60, Merck, Darmstadt, Deutschland; 2 cm × 30 cm) gereinigt, bevor sie mit THF und Petrolether in einem Verhältnis von 1 : 2 gewaschen wurde. Die erhaltene rote Lösung wurde eingedampft und deren Reinheit wurde durch TLC bestimmt. Die Absorptionsspektren des blauen und des roten Pigmentes wurden mit Hilfe eines Ultraspec 3000 Spektrophotometers (Pharmacia, Uppsala, Sweden) in einem Be reich von 400 bis 800 nm bestimmt. Außerdem wurde der blaue und der rote Farbstoff durch Massenspektrometrie und ¹H-NMR Spektroskopie analysiert.

Versuchsergebnisse 1. Erhöhung der Produktivität für blaues Pigment durch P450 BM-3-Mutagenese

Natives P450 BM-3 besitzt nicht die Fähigkeit zur Produktion des blauen Indigo-enthaltenden Pigments, bzw. der Vorläufer substanten 2- bzw 3-Hydroxyindol. Um eine ausreichende Menge an blauem Pigment herstellen zu können, wurde P450 BM3 einer gezielten Evolution ausgesetzt. Sämtliche Mutanten, welche das blaue Pigment produzierten, wurden sequenziert. Es wurde fest gestellt, daß wenigstens eine der folgenden drei Positionen mutiert waren: Phe87, Leu188 und Ala74. Es wurde deshalb an genommen, daß diese drei Positionen eine entscheidende Rolle für die Aktivität von P450 BM-3 bei der Produktion von blauem Pigment spielen. Aus der Struktur der Häm-Domäne von Cytochrom-P450-BM-3, komplexiert mit Palmitoleinsäure sieht man, daß Phe87 das Substrat an einem näheren Heranrücken an die Häm-Gruppe hindert (14). Die Mutante Phe87Val zeigt eine hohe Regio- und Stereoselektität bei der Epoxidation von (14S, 15R)-Arachidonsäure (13) und die Mutante Phe87Ala verschiebt die Hydroxylierungsposition von ω-1, ω-2 und ω-3 zu ω (22). Die Position 87 wurde deshalb als erste für die ortspezifische randomisierte Mutanese mit Hilfe von PCR ausgewählt. In Röhr chenkulturen wurden 7 Kolonien erhalten, welche eine geringe Menge an blauem Pigment nach Induktion produzierten. Die Kolo nie, welche die größte Menge des blauen Pigments produzierte, wurde für die DNA-Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenzdaten ergaben eine Substitution von Phe87 durch Val. Die Mutante Phe87Val wurde anschließend als Template für die zweite Runde der ortsspezifischen randomisierte Mutagenese an Position Leu188 verwendet. Die Struktur der Häm-Domäne, komplexiert mit Palmitoleinsäure zeigt, daß die Repositionierung der F- und G- Helices den Rest Leu188 in direkten Kontakt mit dem Substrat bringt (14). Diese Position könnte deshalb eine wichtige Rolle bei der Substratbindung oder -orientierung spielen. Nach dem zweiten Screeningdurchgang wurden 31 Kolonien beobachtet, wel che das blaue Pigment produzierten. Die Mutante, welche die größte Pigmentmenge produzierte, enthielt die Substitutionen Phe87Val und Leu188Gln. Diese Mutante wurde anschließend in Position Ala74 im dritten Durchgang der ortspezifischen rando misierten Mutagenese mutiert. Man erhielt dabei die Dreifach mutante F87L188A74 (Phe887Val, Leu188Gln und Ala76Gly), welche mehrere mg blaues Pigment in einem 2-Liter-Kolben, enthaltend 300 ml TB-Medium, produzierte. Diese Menge reichte zur Isolie rung und Charakterisierung des blauen Pigmentes aus.

2. Isolierung und Identifizierung des blauen Pigments

Nach dem Auswaschen der Zellen wurde das verbleibende blaue Pellet mit THF extrahiert und TLC analysiert. Das blaue Pig ment wurde in eine schneller wandernde blaue Komponente und in eine langsamer wandernde rote Komponente aufgetrennt. Beide Komponenten zeigten exakt die gleichen Mobilitätsparameter wie die Komponenten einer kommerziellen Indigo-Probe.

Nach der Reinigung wurden die Absorptionsspektra beider Kompo nenten in DMSO bestimmt. Die blaue Komponente zeigte das glei che Spektrum wie eine kommerzielle Indigoprobe. Die gereinigte blaue und rote Komponente wurden jeweils durch Massenspektro metrie analysiert. Die Massenspektra beider Pigmente zeigten einen starken Molekülionenpeak bei m/z = 262 und zwei Fragmen tionenpeaks bei m/z = 234 und 205 (relative Intensität jeweils 10%). Dieses Muster ist typisch für indigoide Verbindungen. Die Elementarzusammensetzung dieser Ionen wurde durch hoch auflösende Massenspektrometrie bestimmt als C₁₆H₁₀N₂O₂, C₁₅H₁₀N₂O bzw. C₁₄H₉N₂. Dies ist ebenfalls charakteristisch für Strukturen vom Indigotyp. Das blaue Pigment wurde somit als Indigo und das rote Pigment als Indirubin bestimmt. Zur Bestätigung der Struktur wurden 500 MHz ¹H-NMR-Spektren beider Pigmente in DMSO-D₆-Lösung durchgeführt. Die Ergebnisse stimmten mit den Literaturangaben (23) überein.

3. Produktion von Indigo mit isolierten Enzymen

Es ist bekannt, daß Indigo aus Indol durch mikrobielle Trans formation zugänglich ist (24-26). Keines dieser mikrobiellen Systeme enthielt jedoch eine P450 Monoxygenase. Erfindungs gemäß wurde zunächst die katalytische Aktivität des reinen Enzyms für Indol bestimmt. Die Mutante F87L188A74 wurde mit Indol vermischt. Keine Farbreaktion war zu beobachten. Erst nach Zugabe von NADPH zum Reaktionsgemisch bildete sich das blaue Pigment nach etwa 20 min. Durch Einstellung des pH-Werts der Reaktionsmischung auf einen Wert von etwa 11, 30 sec nach Zugabe von NADPH, wurde die blaue Färbung innerhalb von weni gen Sekunden sichtbar. Kontrollversuche unter Verwendung von nativem P450 BM-3 waren immer negativ, selbst unter Verwendung erhöhter Konzentrationen an Enzym, Indol und NADPH. Das blaue Pigment wurde mit Ethylacetat extrahiert und durch TLC analy siert. Das blaue Pigment trennte sich wieder in eine schneller laufende blaue Komponente und in eine langsamer laufende rote Komponente auf. Die R_f-Werte und die Absorptionsspektren waren identisch mit denjenigen Werten der Extrakte aus der Fermenta tionsbrühe. Die F87L188A74-Mutante von P450 BM-3 stellt somit eine Indolhydroxylase dar.

Es sind bisher zwei Wege für die enzymatische Transformation von Indol zu Indigo beschrieben worden. Ein Weg wird durch eine Dioxygenase, der andere durch eine Styrolmonoxygenase katalysiert (24, 25). Die NADPH-Stöchiometrie beträgt in beiden Fällen 2. Es wurde deshalb angenommen, daß im Gegensatz zu den Dioxygenasen die erfindungsgemäße Mutante F87L188A74 Indol in nur einer Position hydroxyliert, um Oxindol (2-Hydroxyindol) oder Indoxyl (3-Hydroxyindol) zu bilden.

4. Kinetische Parameter der Indolhydroxylierung

Reine Proben des Wildtyp-Enzyms P450 BM-3 und der Mutanten Leu188Gln, Phe87Val, F87L188 und F87L188A74 wurden zur Bestim mung der kinetischen Parameter der Indolhydroxylierung verwen det. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 1 zusammenge faßt.

Tabelle 1

Kinetische Parameter der P450 BM-3 Mutanten für In dolhydroxylierung

Selbst beim Überschuß an gereinigtem Enzym und hoher Indolkon zentration ist das Wildtyp-Enzym nicht in der Lage, Indol zu oxidieren. Die Mutante Leu188Gln zeigt eine geringe Aktivität. Die Mutante Phe87Val zeigt eine katalytische Wirksamkeit von 119 M^-1s^-1 für die Indolhydroxylierung. Die katalytische Effi zienz der Doppelmutante F87L188 (Phe87Val, Leu188Gln) erhöhte sich auf 543 M^-1s^-1 und wurde durch Einführung der weiteren Sub stitution Ala74Gly auf 1365 M^-1s^-1 erhöht. Die K_cat-Werte erhöh ten sich von Phe87Val zur Dreifachmutante hin um insgesamt 35%, während die K_m-Werte etwa um das Siebenfache abnahmen. Dies weist darauf hin, daß Ala74Gly und Leu188Gln vorwiegend an der Substatbindung beteiligt sind.

Die Indol-Turnover-Rate (K_cat = 2,73 s^-1) war für die Dreifachmu tante F87L188A74 mehr als zehnfach höher als für die meisten P450-Enzyme (18).

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Cytochrom P450 Monoxygenase, welche zur Oxidation N-hete rocyclischer zwei- oder mehrkerniger aromatischer Verbin dungen befähigt ist. (LÖSLICH)

2. Monoxygenase nach Anspruch 1, deren Substrat-bindender Bereich durch ortsspezifische Mutagenese zur funktionalen Aufnahme des N-heterocyclischen Substrats befähigt ist.

3. Monoxygenase nach Anspruch 1 oder 2, abgeleitet von Cyto chrom P450 Monoxygenasen bakteriellen Ursprungs.

4. Monoxygenase nach Anspruch 3, abgeleitet von Cytochrom P450 Monoxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, welche wenigstens eine funktionelle Mutation in einem der Aminosäurese quenzbereiche 172-224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356, 73-82 und 86-88 aufweist.

5. Monoxygenase nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der folgenden ein- oder mehrfachen Aminosäuresubstitutionen aufweist:

a) Phe87Val;
b) Phe87Val, Leu188Gln; oder
c) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;

sowie funktionale Äquivalente davon.

6. Nukleinsäuresequenz, kodierend für eine Monoxygenase nach einem der vorherigen Ansprüche.

7. Expressionskonstrukt, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine kodie rende Sequenz, welche eine Nukleinsäuresequenz nach An spruch 6 umfasst.

8. Vektor, umfassend wenigstens ein Expressionskonstrukt nach Anspruch 7.

9. Rekombinanter Mikroorganismus, transformiert mit wenig stens einem Vektor nach Anspruch 8.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, ausgewählt unter Bakte rien der Gattung Escherichia.

11. Verfahren zur mikrobiologischen Oxidation N-heterocycli scher zwei- oder mehrkerniger aromatischer Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man

1. einen rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder 10 in einem Kulturmedium, gegebenenfalls in Gegenwart eines Substrats, kultiviert; oder
2. ein Substrat-haltiges Reaktionsmedium mit einem En zym nach einem der Ansprüche 1 bis 5 inkubiert; und
3. das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgepro dukt davon aus dem Medium isoliert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Medium das gebildete Indol und und/oder Indi rubin isoliert.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeich net, daß man die Indoloxidation durch Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 30 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 kultiviert.

14. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeich net, daß man die Indoloxidation durch enzymatische Umset zung eines Indol-haltiges Mediums bei einer Temperatur von etwa 30 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 durchführt, wobei das Indol-haltige Medium außerdem bezo gen auf Indol einen etwa 10- bis 100fachen molaren Über schuß an Reduktionsäquivalenten enthält.

15. Bioreaktor, umfassend ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einen rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 9 oder 10 in immobilisierter Form.

16. Verwendung einer Cytochrom P450 Monoxygenase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Vektors nach Anspruch 8, oder eines Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder 10 zur mikrobiologischen Oxidation N-heterocyclischer zwei- oder mehrkerniger aromatischer Verbindungen.

17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Herstellung von Indigo und/oder Indirubin.