DE69729097T2

DE69729097T2 - Cytochrom p450 expression in enterobakterien

Info

Publication number: DE69729097T2
Application number: DE69729097T
Authority: DE
Inventors: Charles Roland Wolf; Thomas Herbert Friedberg; Michael Patrick Pritchard
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2017-07-18
Also published as: AU730155B2; JP2008043338A; EP0914446A2; GB9615032D0; AU3551897A; AU730155C; JP4117852B2; US6566108B1; ATE266730T1; DE69729097D1; WO1998002554A2; CA2259619C; EP0914446B1; JP2001522221A; ES2224257T3; CA2259619A1; DK0914446T3; WO1998002554A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Expression von Cytochrom P450 in Bakterien; insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Expression eines aktiven eukaryontischen Cytochrom-P450-Enzymsystems in Bakterien, vor allem in Enterobakterien.
Hintergrund und Stand der Technik
Cytochrom-P450-Mono-Oxygenasen (P450s) bilden eine Superfamilie von Haemoproteinen, die den Stoffwechsel einer breiten Gruppe von Verbindungen katalysieren. Sie katalysieren die Oxidation lipophiler Chemikalien durch den Einbau eines Atoms molekularen Sauerstoffs in das Substrat (Porter & Coon (1991) J. Biol. Chem. 261, 13469–13472). Säugetier-P450s katalysieren den Stoffwechsel endogener und exogener Verbindungen, zu denen Steroide, therapeutische Arzneimittel und krebserregende Stoffe gehören (Guengerich (1987) in „Enzymology of rat liver cytochromes P450", ed. Guengerich, F. P., CRC Press, Boca Raton FL, Vol. 1, S. 1–54; Guengerich & Shimada (1991) Chem. Res. Toxicol. 4, 391–407; Gonzalez (1992) Trends in Pharmacol. Sci. 12, 346–352). Die verschiedenen Säugetier-P450s zeigen eine einzigartige aber sich dennoch überschneidende Substratspezifität und besitzen eine hohe Regio- und Stereoselektivität (Crespi et al (1993) Toxicology 82, 89–104). Auf der Basis ihrer hauptsächlichen Funktionen können Säugetier-P450s in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: In solche, die hauptsächlich am Stoffwechsel von Steroiden und Gallensäuren beteiligt sind, und in solche, die hauptsächlich Xenobiotika metabolisieren. Die Xenobiotika metabolisierenden P450s sind typischerweise im endoplasmatischen Retikulum bestimmter Säugetierzellen, wie z. B. Leberzellen, lokalisiert und werden mikrosomale P450s genannt.
Zu den von der zuletzt genannten Gruppe von P450s metabolisierten Verbindungen gehören therapeutische Arzneimittel, wie z. B. Cyclosporin, Nifedipin und Debrisoquin, genau so wie krebserregende Stoffe, wie z. B. polyaromatische Hydrocarbone, Nitrosamine und Arylamine. Um katalytisch aktiv sein zu können, benötigen mikrosomale P450s eine Versorgung mit Elektronen, die von NADPH- über die prosthetischen FMN- und FAD-Gruppen der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase transportiert werden (P450-Reduktase; EC 1.6.2.4) (Smith et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8710–8714).
Vergleiche der Primärstrukturen der P450s zeigen, dass diese einander strukturell ähnlich sind und höchstwahrscheinlich von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen. Auf der Basis ihrer primären Struktur werden die P450s in Familien wie CYP1, CYP2, usw. eingeteilt (Nelson et al (1996) Pharmacogenetics 6, 1–42).
Da Säugetier-P450s im Stoffwechsel therapeutischer Verbindungen und krebserregender Stoffe sehr wichtig sind, wurden Versuche unternommen, Säugetier-P450s in heterologen Systemen zu exprimieren. Zum Beispiel wurden Säugetierzellen benutzt, um P450s heterolog zu exprimieren, wie dies von Doehmer et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5769–5773; Aoyama et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4790–4793; und Crespi et al (1991) Carcinogenesis 12, 355–359 beschrieben wird.
Auch Hefezellen wurden für die heterologe Expression von Cytochrom P450 benutzt, z. B. von Renaud et al (1993) Toxicology 82, 39–52 und Bligh et al (1992) Gene 110, 33–39.
Seit neuestem werden Säugetier-P450s in Escherichia coli exprimiert.
Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131 beschreiben die Expression von modifiziertem humanem Cytochrom P450 3A4 in E. coli, sowie die Aufreinigung und Wiederherstellung des Enzyms.
Barnes et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5597–5601 beschreiben die Expression und enzymatische Aktivität rekombinanter Cytochrom P450 17α-Hydroxylase in E. coli.
Larson et al (1991) J. Biol. Chem. 266, 7321–7324 beschreiben, dass bei der Expression von Cytochrom P450 IIE1, dem das hydrophobe NH₂-terminale Segment fehlt, die katalytische Aktivität beibehalten wird.
Shimada et al (1994) Carcinogenesis 15, 2523–2529 beschreiben die Aktivierung von Vorläufern krebserregender Stoffe durch in E. coli exprimierten humanen Cytochrom-P450-Enzymen.
Shet et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11748–11752 beschreiben die enzymatischen Eigenschaften eines aufgereinigten, rekombinanten Fusionsproteins, das die NADPH-P450-Reduktase enthält.
Shet et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 318, 314–321 beschreiben einige Eigenschaften eines rekombinanten Fusionsproteins, das die Haem-Domäne von humanem P450 3A4 und die Flavin-Domänen der Ratten-Cytochrom-P450-Reduktase enthält.
Jenkins & Waterman (1994) J. Biol. Chem. 269, 27401–27408 beschreiben, dass die Flavodoxin- und die NADPH-Flavodoxin-Reduktase aus E. coli die Aktivitäten der Rinder-Cytochrom-P450-c17-Hydroxylase unterstützen.
Fisher et al (1992) FASEB J. 6, 759–764 beschreiben die Expression von humanem Cytochrom P450 1A2 in E. coli.
Fisher et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10817–10821 beschreiben die in E. coli stattfindende Expression von Fusionsproteinen, welche die Domänen der Säugetier-Cytochrome P450 und des NADPH-P450-Reduktase-Flavoproteins enthalten.
Chun & Chiang (1991) J. Biol. Chem. 266, 19186–19191 beschreiben die Expression des Cholesterol-7α-Hydroxylase Cytochroms P450 in E. coli.
Richardson et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 323, 87–96 beschreiben die Expression von humanen sowie von Hasen P450 Cytochromen der 2C-Unterfamilie in E. coli.
Gillam et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 319, 540–550 beschreiben die Expression von Cytochrom P450 2D6 in E. coli.
Dong & Porter (1996) Arch. Biochem. Biophys. 327, 254–259 beschreiben eine Studie, in der eine P450-Reduktase, die ein N-terminal fusioniertes ompA-Signalpeptid enthält, zusammen mit humanem P450 2E1, in dem das zweite Codon des P450 (Serin) durch ein Alanin ersetzt ist, in E. coli co-exprimiert wird; weitere Veränderungen an P450 wurden nicht vorgenommen. Eine in vivo Aktivität mit ganzen Zellen konnte nicht gezeigt werden.
WO 94/01568 beschreibt die Expression der P450_17α-Hydroxylase in E. coli sowie deren Fusion an eine P450-Reduktase-Enzym-Domäne und die Expression des Fusionsproteins in E. coli. Es werden auch Hybride des P450 Enzyms beschrieben, welche die neun amino-terminalen Aminosäuren der Rinder-P450_17α-Hydroxylase enthalten.
US 5,240,831 beschreibt die Expression der P450_17α-Hydroxylase in E. coli in einer biologisch aktiven Form, ohne dass hierfür eine Cytochrom-P450-Reduktase co-exprimiert oder beigemischt werden müsste.
Gillam et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 317, 374–384 beschreiben die Expression von Cytochrom P450 3A5 in E. coli.
Gillam et al (1994) Arch. Biochem. Biophys. 312, 59–66 beschreiben die Expression von modifiziertem, humanem Cytochrom P450 2E1 in E. coli.
Shet et al (1994) Arch. Biochem. Biophys. 311, 402–417 beschreiben ein rekombinantes Fusionsprotein, das in E. coli exprimiert wird und die Domänen der Rinder-P450-17A- und der Ratten-NADPH-P450-Reduktase enthält.
Joshephy et al (1995) Cancer Res. 55, 799–802 beschreiben die Bioaktivierung von aromatischen Aminen durch das in Salmonella typhimurium exprimierte rekombinante humane Cytochrom P450 1A2.
Trotz der großen Bemühungen, ein gut funktionierendes eukaryontisches, vor allem Säuger-P450-Mono-Oxygenase-Enzymsystem in Bakterien zu exprimieren wurde bis heute noch kein System angegeben, das in der Lage ist, Verbindungen in ganzen Zellen zu verstoffwechseln. Dies ist insbesondere der Fall für Xenobiotika verstoffwechselnde P450s, die für ihre enzymatische Aktivität eine P450-Reduktase benötigen. Vor allem wurde bisher noch kein bakterielles Zellsystem angegeben, in dem Cytochrom P450 und die Cytochrom P450-Reduktase ein funktionelles Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System bilden können, wenn diese zwar in derselben bakteriellen Zelle aber getrennt voneinander exprimiert werden. Ebenso konnte bisher trotz beträchtlicher Bemühungen Bakterien zu produzieren, die in hohem Maße ein eukaryontisches, Xenobiotika metaboliserendes P450 exprimieren, noch kein zufriedenstellendes System angegeben werden. Ein Ziel dieser Erfindung besteht darin, hochwertige Systeme für die Expression einer funktionellen Form von P450s in intakten bakteriellen Zellen zu liefern.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein verbessertes System für die Expression von P450s, entweder mit oder unabhängig von der P450-Reduktase, zu liefern.
Bakterielle Systeme, die funktionelle P450-Enzymsysteme in ganzen Zellen exprimieren, sind nützliche „Bioreaktoren". Man könnte sie auch zu verschiedenen Zwecken in der Arzneimittelforschung, bei Testsystemen für krebserregende Stoffe, als Biosensoren, für die Umweltsanierung oder bei der Produktion von Hormonen usw. einsetzen. Die starke Expression eukaryontischer P450s in Bakterien bietet eine P450-Quelle für Strukturanalysen.
Zusammenfassung der Erfindung
Einen ersten Gesichtspunkt der Erfindung bildet eine bakterielle Zelle, die ein funktionelles Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System enthält, wobei besagte Zelle ein genetisches Konstrukt enthält, das ein Cytochrom P450 exprimieren kann, sowie ein genetisches Konstrukt, das unabhängig von besagtem Cytochrom P450 eine Cytochrom-P450-Reduktase exprimieren kann, wobei der N-Terminus des Cytochrom P450 sowie der N-Terminus der Cytochrom-P450-Reduktase jeweils so angepasst sind, dass sie eine funktionelle Interaktion des besagten Cytochrom P450 und der besagten Cytochrom-P450-Reduktase innerhalb der besagten Zelle ermöglichen.
Die bakterielle Zelle exprimiert ein Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System, das vorzugsweise eine spezifische Aktivität von mindestens 50 pmol/min/mg Protein, oder in stärker bevorzugter Weise von mindestens 250 pmo/min/mg Protein, oder in noch stärker bevorzugter Weise von mindestens 500 pmol/min/mg Protein besitzt. Diese Raten werden bei Benutzung eines geeigneten und effektiven Substrates für das Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System gemessen. Vorzugsweise handelt es sich bei den besagten bevorzugten spezifischen Aktivitäten um die von ganzen Zellen, es kann sich aber auch um die Aktivitäten handeln, die in Fraktionen der Zellen, wie z. B. der Membranfraktion gefunden werden.
Es wird also eine bakterielle Zelle beschrieben, die ein funktionelles Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System enthält, wobei besagte Zelle außerdem ein genetisches Konstrukt enthält, das ein Cytochrom P450 exprimiert und ein genetisches Konstrukt, das, unabhängig von besagtem Cytochrom P450, eine Cytochrom-P450-Reduktase exprimiert, wobei das besagte Cytochrom P450 und die besagte Cytochrom-P450-Reduktase in besagter Zelle funktionell miteinander interagieren.
Mit dem Begriff „Cytochrom P450" meinen wir alle Haem enthaltenden Polypeptide, deren Absorptionsmaximum in einem reduzierten CO-Differenzspektrum aufgrund der Bildung einer CO-Anziehung des Fe(II) von besagtem Haem, in dem Berich von 450 nm ± 5 nm liegt.
Es ist vorstellbar, dass sich die Erfindung auf jedes Cytochrom P450 anwenden läßt.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Cytochrom P450 um ein eukaryontisches Cytochrom P450; es ist noch bevorzugter, dass es sich bei dem Cytochrom P450 um ein Säugetier-Cytochrom P450 handelt, und am meisten bevorzugt, dass es sich bei dem Cytochrom P450 um ein menschliches Cytochrom P450 handelt.
Eine Vielzahl von Cytochrom P450 cDNAs oder Genen, einschließlich einer Vielzahl eukaryontischer Cytochrom P450 DNAs, insbesondere Säugetier-Cytochrom P450 cDNAs wurden kloniert. Nelson et al (1996) Pharmacogenetics 6, 1–42, dessen Artikel hier durch Bezugnahme mit aufgenommen werden soll, listet z. B. die bekannten Cytochrom P450 cDNAs und Gene auf und gruppiert diese aufgrund ihres Grades an Sequenzähnlichkeit und bis zu einem gewissen Ausmaß aufgrund ihrer chromosomalen Lokalisation in Genfamilien und Unterfamilien. Details der Cytochrom P450-Sequenzen sind auch auf der WorldWideWebsite http://drnelson.utmem.edu/homegape.html abrufbar.
Diese Cytochrom P450 cDNAs und Gene können leicht unter Einsatz von in der Fachwelt wohlbekannten Klonierungsmethoden gewonnen werden. Einige dieser Methoden werden im Folgenden beschrieben und sind z. B. auch in Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, einem Laborhandbuch dargestellt, das bei Cold Spring Harbor Press, Cold Spring House, New York erschienen ist.
Es ist besonders bevorzugt, dass das Cytochrom P450 Mitglied einer der Cytochrom P450-Familien CYP1, CYP2, CYP3 oder CYP4 ist. Es ist weiter bevorzugt, dass es sich bei dem Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System um ein solches handelt, das Xenobiotika metabolisiert.
Zumindest einige Mitglieder der Cytochrom-P450-Familien CYP1, CYP2 und CYP3 sind am Stoffwechsel xenobiotischer Verbindungen, wie z. B. therapeutischer Arzneimittel beteiligt. Mitglieder der Cytochrom-P450-CYP1-Familie sind am Stoffwechsel von, z. B. Koffein, Benzphetamin, Phenacetin, Theophyllin, Acetaminophen, Antipyrin, 2-Hydroxyestradiol, Imipramin, Tamoxifen und Zoxazolamin beteiligt. Mitglieder der Cyto chrom-P450-CYP2-Familie sind am Stoffwechsel von, z. B. Testosteron, Aflatoxin, Benzphetamin, Cyclophosphamid, Hexobarbital, 6-Aminochrysen, Retinol, Tolbutamid(methyl), Phenytoin, S-Warfarin, Tienilsäure, Diazepam, Propanalol, Amitryptylin, Bufuralol, Bupranolol, Clozapin, Codein, Debrisoquin, Desipramin, Dextromorphan, Ethylmorphin, Flecainid, Haloperidol, Lidocain, Nortryptillin, Propanolol, Spartein, Taxol, Tetrahydrocannabinol, Progesteron und Mephenytoin beteiligt.
Mitglieder der Cytochrom-P450-CYP3-Familie sind am Stoffwechsel von, z. B. Lovastatin, Nifedipin, Taxol, Teniposid, Testosteron, Verapamil, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Benzphetamin, Cortisol, Cyclosporin A & G, Diazepam, Dihydroergotamin, Estradiol, Ethynylestradiol, Imipramin und Lidocain beteiligt.
Das Cytochrom P450 sollte am bevorzugtesten eines der P450s CYP3A4, CYP2D6, CYP2A6, CYP2E1, CYP2D9 oder CYP2C9 sein.
Geeigneter Weise besteht das Cytochrom P450, abgesehen von der Anpassung seines Endterminus, im Wesentlichen aus derselben Polypeptid-Sequenz wie das native Cytochrom P450. Dennoch schließt die Bezeichnung „Cytochrom P450" ausdrücklich Modifikationen des nativen Cytochrom P450 mit ein. Dies sind z. B. Modifikationen, welche die Länge oder andere Eigenschaften eines beliebigen hydrophoben, N-terminalen Teils verändern, der in nativem Cytochrom P450 vorkommen kann, oder Modifikationen wie z. B. einzelne oder mehrfache Punktmutationen oder Deletionen, weiche die Substratspezifizität des Cytochrom P450 in Vergleich zu nativem Cytochrom P450 verändern.
Mit dem Begriff „Cytochrom-P450-Reduktase" bezeichnen wir jede NADPH-Cytochrom-P450-Oxido-Reduktase, die in der Lage ist, von NADPH Elektronen auf Cytochrom P450 zu übertragen. Die Säugetier-Cytochrom-P450-Reduktase enthält eine der beiden prosthetischen Gruppen FMN und FAD. Es ist von Vorteil, wenn die Cytochrom-P450-Reduktase aus derselben Gattung stammt, wie das in den bakteriellen Zellen exprimierte Cytochrom P450. Es ist von besonderem Vorteil, wenn es sich bei der Cytochrom-P450-Reduktase um eine Säugetier-Cytochrom-P450-Reduktase handelt; die Cytochrom-P450-Reduktase der Ratte oder des Menschen ist dabei besonders bevorzugt. Die cDNA der humanen Cytochrom-P450-Reduktase wird von Smith et al (1994) in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8710–8714 beschrieben. Die cDNA der Cytochrom-P450-Reduktase der Ratte wird von Porter et al (1990) in Biochemistry 29, 9814–9818 beschrieben.
Die cDNAs und Gene der Cytochrom-P450-Reduktase können leicht durch Anwendung von in der Fachwelt wohlbekannten Klonierungsmethoden gewonnen werden, von denen einige im Folgenden beschrieben werden.
Geeigneterweise besteht die Cytochrom-P450-Reduktase, abgesehen von der Anpassung ihres N-Terminus, im wesentlichen aus derselben Polypeptid-Sequenz wie die native Cytochrom-P450-Reduktase. Dennoch schließt die Bezeichnung „Cytochrom-P450-Reduktase" ausdrücklich Modifikationen des nativen Cytochrom P450 mit ein, wie z. B. einzelne oder mehrfache Punktmutationen oder Deletionen, die die Bindung des Co-Faktors verändern.
Falls es sich bei dem Cytochrom P450 um humanes Cytochrom P450 handelt, ist es bevorzugt, dass es sich bei der Cytochrom-P450-Reduktase um humane Cytochrom-P450-Reduktase handelt.
Unter dem Ausdruck „funktionelles Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System" verstehen wir, dass die bakterielle Zelle, sobald das Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase in der Zelle exprimiert werden, aufgrund der Anwesenheit des besagten Cytochrom P450 und der besagten Cytochrom-P450-Reduktase, in der Lage ist, ein Substrat des Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-Systems unter der Voraussetzung in ein Produkt umzuwandeln, dass ausreichende Co-Faktoren, wie NADPH und Sauerstoff zur Verfügung stehen.
Unter der Bezeichnung „funktionelle Interaktion des besagten Cytochrom P450 und der besagten Cytochrom-P450-Reduktase innerhalb der Zelle" verstehen wir, dass das Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase innerhalb der Zelle so in unmittelbare Nähe zueinander gebracht werden, dass die Cytochrom-P450-Reduktase während der Katalyse dem Cytochrom P450 entweder direkt oder indirekt Elektronen zur Verfügung stellen kann. Die Anpassung an den N-Terminus des Cytochrom P450 oder den N-Terminus der Cytochrom-P450-Reduktase sind lediglich derart, dass funktionelle Expression und Interaktion des besagten Cytochrom P450 und der besagten Cytochrom-P450-Reduktase innerhalb der Zelle ermöglicht werden. Die Anpassung kann derart sein, dass durch sie die Positionierung von Cytochrom P450 und der Cytochrom-P450-Reduktase in unmittelbarer räumlicher Nähe ermöglicht wird.
Unter der Bezeichnung „innerhalb der Zelle" schließen wir ausdrücklich ein, dass die funktionelle Interaktion entweder innerhalb der Zelle oder unter Beteiligung einer Membran oder eines Kompartiments der Zelle, einschließlich des periplasmatischen Raumes oder einer mit dem Periplasma in Verbindung stehenden Membran erfolgen kann.
Es ist bevorzugt, dass der Cytochrom-P450-Gehalt einer Kultur bakterieller Zellen, die das Cytochrom P450 optimal exprimieren, wenigstens 100 nmol/l Kultur ganzer Zellen beträgt, bevorzugter jedoch wenigstens 150 nmol/l Kultur ganzer Zellen, noch bevorzugterer fast 250 nmol/l Kultur ganzer Zellen, wesentlich bevorzugterer etwa 500 nmol/l Kultur ganzer Zellen und am bevorzugtesten etwa 1000 nmol/l. Typischerweise liegt der Cytochrom-P450-Gehalt bei etwa 200 nmol/l Kultur ganzer Zellen.
Anpassungen an die N-Termini sowohl des Cytochrom P450 als auch der Cytochrom-P450-Reduktase, welche die funktionelle Interaktion des besagten Cytochrom P450 und der Cytochrom-P450-Reduktase ermöglichen, werden im Folgenden diskutiert.
Obwohl nicht unbedingt nötig, ist es bevorzugt, dass das Cytochrom P450 oder die Cytochrom-P450-Reduktase die ihnen eigene N-terminale Sequenz behalten und dass ein weiteres Fragment, wie z. B. ein im Folgenden beschriebenes Signalpeptid dem N-Terminus des Cytochrom P450 oder dem der Cytochrom-P450-Reduktase oder beiden angefügt wird.
Obwohl es vorstellbar ist, dass jede aerobe oder fakultativ anaerobe bakterielle Zelle passend ist, ist es dennoch bevorzugt, dass es sich bei der bakteriellen Zelle um eine Gram-negative, und in noch stärker bevorzugter Weise, dass es sich bei der bakteriellen Zelle um die Zelle eines Bakteriums der Familie der Enterobacteriaceae, z. B. Escherichia coli, handelt. Zu den am Nächsten mit E. coli verwandte Enterobakterien gehören die Gattungen Salmonella und Shigella, weniger nah verwandt sind die Gattungen Enterobacter, Serratia, Proteus und Erwinia. E. coli und S. typhimurium sind die am meisten für die vorliegende Erfindung bevorzugten bakteriellen Wirtszellen. E. coli K12-Stämme sind am Besten geeignet, da es sich bei E. coli K12 um einen nicht-pathogenen Standardlaborstamm handelt.
Obwohl bestimmte Cytochrom-P450-Substrate in der Lage sind, in die bakterielle Zelle einzudringen, um dort dann mit dem Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System in Interaktion zu treten, ist es bevorzugt, dass die bakterielle Zelle der Erfindung eine erhöhte Substratpermeabilität besitzt, oder eine Zelle ist, deren Substratpermeabilität sich erhöht, wenn die bakterielle Zelle in ein geeignetes Medium gebracht wird. Zusätzlich oder alternativ dazu wird bevorzugt, dass die bakterielle Zelle veränderte Membraneigenschaften oder eine Membran besitzt, deren Eigenschaften geändert werden können, um das Eindringen des Substrates durch die Membran zu erleichtern. Zum Beispiel besitzt die E. coli Mutante tolC eine Membran, die permeabler ist als die vom Widltyp E. coli (Chatterjee (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8950–8954), und die TA-Serien der S. typhimurium Stämme besitzen aufgrund einer „Deep-Rough"-Mutation eine erhöhte Permeabilität und werden regelmäßig für Mutagenitätstests benutzt (siehe z. B. Simula et al (1993) Carcinogesis 14, 1371–1376). S. typhimurium TA 97, 98, 100 und 102 sowie TA 1535 und TA 1538 werden in der pharmazeutischen Industrie für Mutagenitätstests zur Beurteilung der Sicherheit von Arzneimitteln verwendet. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die vorliegende Erfindung bei Verwendung dieser und anderer geeigneter Bakterienstämme zur Verbesserung dieser Verfahren beiträgt, da diese Stämme ein an den Menschen angepasstes Mutagenitätssystem zur Verfügung stellen und nicht auf Leberextrakte von Nagetieren (SN9-Fraktion aus Nagetierleber) als metabolisch aktivierendes System angewiesen sind. Die auf der vorliegenden Anmeldung basierenden Systeme haben des weiteren den Vorteil, dass das metabolisch aktivierende System und das Ziel der Mutagenizität, nämlich die DNA, sich innerhalb derselben Zelle befinden, und nicht in physisch voneinander getrennten Einheiten vorliegen, wie dies beim standardisierten Ames-Test der Fall ist. Dies hat den Vorteil, dass kurzlebige Metabolite besser bestimmt werden können und dass reaktive Metabolite nicht von der Membranbarriere davon abgehalten werden, ihr DNA-Ziel zu erreichen. Dieser und andere Aspekte der Erfindung werden im Folgenden genauer diskutiert.
Es ist außerdem bevorzugt, dass sich die Permeabilität der Zelle durch Überführung in eine geeignete Umgebung erhöhen läßt. Obwohl viele geeignete Puffersysteme bekannt sind, ist es von Vorteil, wenn im Anschluss an die Expressionsphase die bakteriellen Zellen, insbesondere die E. coli Zellen in Tris-Sucrose-EDTA oder TSE re-suspendiert werden. TSE besteht aus 50 mM Tris-Acetat (pH 7,6), 0,25 M Sucrose und 0,25 mM EDTA. Dadurch kann die Permeabilität der Zelle auf verschiedenen Wegen erhöht werden. Erstens werden die Zellen zu Beginn in 2-fach konzentriertem Puffer re-suspendiert und dann rasch mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt. Dadurch wird die Freisetzung periplasmatischer Proteine durch kurzzeitiges Zerrreissen der äußeren Membran ausgelöst. Zweitens ist bekannt, dass EDTA die Permeabilität direkt beeinflusst und die Sensitivität der Zellen für bestimmte hydrophobe Stoffe erhöht. Drittens kann das Tris im Puffer die Struktur der Lipopolysaccharide in der äußeren Membran beeinflussen und dadurch wiederum die Permeabilität ändern. Weitere Einzelheiten über Möglichkeiten zur Erhöhung der Permeabilität der äußeren Membran von E. coli und Salmonella typhimurium sind zu finden bei Nikaido & Vaara (1987), Seiten 7–22 in „Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology", Vol. 1. Ed. Neidhardt, F. C., Am. Soc. Microbiol., Washington, D. C.
Vorteilhafterweise sollten die bakteriellen Zellen, besonders dann, wenn sie in einem Bioreaktor verwendet werden, lösungsmittelresistent sein. Lösungsmittelresistente E. coli Zellen sind in der Fachwelt bekannt, z. B. aus Ferrante et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7617–7621.
Es ist bevorzugt, dass die Cytochrom-P450-Reduktase ein N-terminales Fragment enthält, welches die Cytochrom-P450-Reduktase zu einem zellulären Kompartiment oder einer Membran der bakteriellen Zelle dirigiert. Es ist besonderes bevorzugt, dass das besagte N-terminale Fragment die Cytochrom-P450-Reduktase zu einer Membran dirigiert.
Es ist bevorzugt, dass sowohl das Cytochrom P450 als auch die Cytochrom-P450-Reduktase in der bakteriellen Zelle mit einer Membran assoziiert vorliegen. Es ist besonders bevorzugt, dass das Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase mit der inneren bakteriellen Membran derart assoziiert sind (besonders im Fall von E. coli und S. typhimurium), dass ihre aktiven Zentren im Cytoplasma lokalisiert vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem N-terminalen Fragment um ein solches, das von dem N-terminalen Fragment eines bakteriellen Proteins abgeleitet oder darauf basiert ist, wobei das besagte bakterielle Protein eines ist, das in den periplasmatischen Raum dirigiert wird, oder eines, das für die Sezernierung aus der bakteriellen Zelle bestimmt ist. Die E. coli Proteine z. B., die von den Genen ompA, pelB, malE oder phoA codiert werden, stellen solche bakteriellen Proteine dar. Es ist wünschenswert, dass die Anwesenheit des N-terminalen Fragments die korrekte Faltung des Cytochrom P450 oder der Cytochrom-P450-Reduktase unterstützt.
Es ist bereits gelungen, bakterielle „Leader-Sequenzen" oder Signalpeptide, die bakterielle Proteine normalerweise in das Periplasma dirigieren, mit dem N-Terminus einiger weniger Säugetierproteine mit der Absicht zu fusionieren, die resultierenden Fusionsproteine in die oxidierende Umgebung im Periplasma zu exportieren. Solche bakteriellen „Leader-Sequenzen" oder Signalpeptide wurden auf diese Weise bei der Expression von sezernierten Säugetierproteinen, wie z. B. Immunoglobulinen oder Fragmenten davon benutzt. Xenobiotika verstoffwechselnde Säugetier-Cytochrom-P450s sind im Gegensatz dazu, wenn sie in der Natur im endoplasmatischem Retikulum gefunden werden, normalerweise einer reduzierenden Umgebung ausgesetzt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das N-terminale Fragment demnach eines der ompA, pelB, malE oder phoA Signalpeptide oder „Leader-Sequenzen", oder eine funktionell äquivalente Variante der zuvor genannten.
Mit der Bezeichnung „funktionell äquivalente Variante der zuvor Genannten" beschreiben wir jede Peptidsequenz, die, wenn sie an der richtigen Stelle in besagtem nativen bakteriellem Protein vorhanden ist, das besagte Protein zur selben zellulären Lokalisation wie das natürliche Signalpeptid dirigieren würde.
Es ist bevorzugt, dass es sich bei dem N-terminalen Fragment, sowohl des Cytochrom P450 als auch der Cytochrom-P450-Reduktase, um ein Signalpeptid oder ein dem Signalpeptid ähnliches N-terminales Fragment handelt.
Es ist besonders bevorzugt, dass es sich bei dem N-terminalen Fragment um ein solches handelt, das mit dem ompA Leader um den allgemeinen Sekretionsmechanismus konkurriert oder das mit ompA um die Signalerkennungsmaschinerie einschließlich des ,signal recognition particle' und des auslösenden Faktors konkurriert.
Der allgemeine Sekretionsmechanismus und seine Bestandteile werden beschrieben in Pugsley (1993) Microbiol. Rev 57, 50–108, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme mit aufgenommen wird, und der ,signal recognition particle und trigger factor' werden beschrieben in Valent et al (1995) EMBO J. 14, 5494–5505, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme mit aufgenommen wird. Untersuchungen des Verdrängungsverhaltens zwischen dem ompA Signalpeptid und einem mutmaßlichem Signalpeptid können mit in der Fachwelt bekannten Methoden unter Verwendung der Lehre von Pugsley und Valent et al, durchgeführt werden.
Die pelB Leader-Sequenz besteht aus der Amino-Säure-Sequenz
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID No. 1).
Die ompA Leader-Sequenz besteht aus der Amino-Säure-Sequenz
MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID No. 2).
Signalpeptide besitzen bestimmte erkennbare allgemeine Eigenschaften, die detailliert bei von Heijne (1986) Nucl Acids Res 14, 4683–4690; Gierasch (1989) Biochemistry 28, 923–930; und in dem Kapitel von Oliver (1987) über Perisplasm and Protein Secretion, Seiten 56–69, dargestellt werden. Oliver (1987) in: „Escherichia coli und Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology", Vol. 1, Ed. Neidhardt, F. C., Am. Soc. Microbiol, Washington D. C. Erstens gibt es ein N-terminales Fragment variabler Länge mit einer positiven Gesamtladung (N-Region). Diesem folgt ein hydrophobes Zentrum (h-Region), von 10 ± 3 Aminosäuren, das mit Leu-, Ala-, Met-, Val-, Ile-, Phe- und Trp-Resten angeeichert ist. Schließlich folgt die c-Region von üblicherweise 5 bis 7 Aminosäuren, die im Allgemeinen eine etwas stärkere Polarität als die Aminosäuren in der h-Region aufweisen. Die wichtigsten Aminosäuren in dieser c-Region sind die an den Positionen –3 und –1, relativ zur Signalschnittstelle gesehen (die „–3, –1 Regel") – es scheint massive Beschränkungen in Bezug darauf zu geben, welche Aminosäuren an diesen Positionen vorkommen können: Nur solche mit kleinen Seitenketten werden toleriert. Es wurden daher an der –3-Position nur Ala, Gly, Leu, Ser, Thr und Val gefunden (wobei Ala stark bevorzugt wird) und an der –1-Position nur Ala, Gly, Ser und Thr (wobei Ala wieder stark bevorzugt wird). Es gibt sehr deutliche Hinweise dafür, dass die Bildung eines „Better-Turns" in diesem das Signal verarbeitenden Bereich wichtig ist, damit die Abspaltung des Signals stattfinden kann (siehe z. B. Barkocy-Gallagher et al (1994) J Biol Chem 269, 13609–13613 und Duffaud and Inouye (1988) J Biol Chem 263, 10224–10228.
Es ist bevorzugt, dass eine Abspaltung des Signalpeptides erfolgt. Es ist daher bevorzugt, dass unmittelbar stromab von dem Signalpeptid, d. h. in dem zu exprimierenden Protien, eine entsprechende Aminosäure-Sequenz enthalten ist, da diese trotzdem noch einen Teil der „Cleavage-Site" bildet. Ein Prolin in Position +1 z. B. verhindert die Entfernung des Signals (Barkocy-Gallagher et al (1992) J. Biol. Chem. 267, 1231–1238). Nimmt man ompA als Beispiel, so besteht hier die Möglichkeit, dass, falls dies gewünscht ist, die ersten wenigen Aminosäuren des reifen ompA Proteins in dem Konstrukt direkt hinter dem ompA Leader und direkt vor der P450- oder der Reduktase-Sequenz enthalten sein muss, um eine vollständige Abspaltung sicherzustellen. Die Abspaltung des Signalpeptids wird durch ein spezielles Signalpeptidase-Enzym, z. B. die Signalpeptidase 1, bewirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Signalpeptidase 1 in der bakteriellen Zelle (z. B. E. coli) überexprimiert, um die Abspaltung des Signalpeptides gewünschtenfalls zu unterstützen (siehe van Dijl et al (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40–48).
Es ist besonders bevorzugt, dass die ersten beiden Aminosäuren des reifen Proteins OmpA (d. h. Ala Pro) direkt stromab vom ompA Signalpeptid und vor dem N-Terminus des P450 eingefügt werden.
Andere vorteilhafte Möglichkeiten zu Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer Abspaltung des Signalpeptides, bestehen darin, eine kurze „linker-sequence" zwischen das Signalpeptid und das P450 einzubringen. Auch die Expression in verschiedenen Stämmen kann verglichen mit der Expression in, z. B. DH5α zu einer erhöhten oder reduzierten Abspaltung des Signalpeptides führen.
Man sieht, dass es bevorzugt ist, dass es sich bei dem N-terminalen Fragment um ein Signalpeptid handelt, das dann, wenn es in seinem natürlichen Polypeptid vorhanden ist, die Funktion hat, die Membraninsertion sowie den Export des nativen Polypeptids durch die Cytoplasma-Membran in den periplasmatischen Raum zu vermitteln. Die Sequenz der Leader-Sequenz oder des Signalpeptids besteht normalerweise aus bis zu 40 Aminosäureresten. Es ist also vorstellbar, dass solche „Leaders" modifiziert werden können, ohne dabei ihre funktionellen Eigenschaften zu verändern.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es außerdem bevorzugt, dass das Cytochrom P450 ein N-terminales Fragment enthält, das das Cytochrom P450 zu einem zellulären Kompartiment oder zu einer Membran der bakteriellen Zelle dirigiert. Es ist besonders bevorzugt, dass das besagte N-terminale Fragment das Cytochrom P450 zu einer Membran dirigiert.
Die bevorzugten N-terminalen Fragmente in dieser Ausführungsform sind dieselben wie die bevorzugten N-terminalen Fragmente für die Cytochrom-P450-Reduktase. Es ist besonders bevorzugt, dass das N-terminale Fragment des Cytochrom P450 eines der ompA, pelB, malE oder phoA Signalpeptide oder eine der eben genannten Leader-Sequenzen bzw. eine funktionell äquivalente Variante dieser enthält. Das ompA Signalpeptid ist besonders bevorzugt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform dirigieren das N-terminale Fragment des Cytochrom P450 und das N-terminale Fragment der Cytochrom-P450-Reduktase jeweils das besagte Cytochrom P450 oder die besagte Cytochrom-P450-Reduktase zum selben zellulären Kompartiment oder zur selben zellulären Membran. Dies ist besonders vorteilhaft, da hierdurch die funktionelle Interaktion des besagten Cytochrom P450 und der besagten Cytochrom-P450-Reduktase innerhalb der Zelle erhöht oder verbessert wird. Es ist von besonderem Vorteil, wenn das Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase zur cytoplasmatischen Seite der inneren Membran hin dirigiert werden, da dort Zugang zum bakteriellen cytoplasmatischen NADPH-Vorrat gewährt wird.
Es ist außerdem bevorzugt, dass es sich bei dem N-terminalen Fragment des Cytochrom P450 im Wesentlichen um dasselbe N-terminale Fragment wie bei der Cytochrom-P450-Reduktase handelt.
In einer weiteren Ausführungsform enthält das Cytochrom P450 ein N-terminales Fragment, welches derart verändert wurde, dass es die Translatierbarkeit oder die korrekte Faltung des besagten Cytochrom P450 in besagter Bakterienzelle erhöht.
Vorzugsweise ist das Cytochrom P450 also im Vergleich zu seiner nativen Sequenz an seinem N-Terminus verändert.
Unter dem Begriff „Translatierbarkeit" verstehen wir die Effizienz, mit der ein gegebenes RNA-Molekül zu einem Polypeptid translatiert werden kann.
Es gibt verschiedene Eigenschaften der optimierten CYP3A4-Sequenz, die die Translatierbarkeit erhöhen.
Diese Eigenschaften beinhalten:

1. Eine Veränderung des zweiten Codons um der Präferenz von E. coli zu genügen (oft GCT, was für Ala codiert). Dies wird gezeigt bei Looman et al (1987) EMBO J 6, 2489–2492.
2. Eine Anreicherung von A- und T-Resten in den Codons 4 und 5 (wo möglich), um die Möglichkeit der Bildung einer mRNA Sekundärstruktur in der Nähe des Startcodons zu minimieren. Die Minimierung von mRNA-Strukturen in der Nähe der ribosomen Bindungsstelle und des Startcodons kann großen Einfluss auf die „Translatierbarkeit" haben (siehe z. B. Wang et al (1995) Protein Expr Purif 6, 284–290).

Was die Verwendung von Leader-Sequenzen betrifft, so liegt der prinzipielle Vorteil darin, dass sie aufgrund ihrer natürlichen Eigenschaften bereits für bakterielle Expression „optimiert" sind, da sie von bakteriellen Genen stammen. Dies beinhaltet oft die zwei oben beschriebenen Eigenschaften; z. B. enthalten sowohl der pelB- als auch der ompA-Leader AAA (Lys) als zweites Codon, das in der Veröffentlichung von Looman et al das leistungsfähigste zweite Codon in Bezug auf „Translatierbarkeit" darstellt. Zusätzlich dazu weisen sie oft eine reduzierte Sekundärstruktur im Bereich der ribosomen Bindungsstelle und des Startcodons auf (siehe z. B. Movva et al (1980) J Mol Biol 143, 317–328 über die ompA Genstruktur).
Ein weiterer Vorteil bei der Benutzung einer N-terminalen Signalpeptid-Fusion liegt in der Minimierung von Effekten, die durch seltene Codons in der P450 oder Reduktase cDNA verursacht werden. Das AGA/AGG Codon z. B. ist das in E. coli am wenigsten verwendete (Chen and Inouye (1990) Nucl Acids Res 18, 1465–1473) und verlangsamt die Translation als Ergebnis der begrenzten Verfügbarkeit des entsprechenden beladenen tRNA-Moleküls. Die negative Auswirkung eines solchen seltenen Codons reduziert sich jedoch in dem Maße, in dem sein Abstand vom Startcodon zunimmt (Chen & Inouye, siehe oben). Durch Anfügen einer „optimierten" bakteriellen Leader-Sequenz (üblicherweise 20 bis 25 Aminosäuren lang) an den N-Terminus des P450 (oder der Reduktase) wird jedes dem 5'-Ende der P450 cDNA nahe gelegene, seltene Codon viel weiter vom Startcodon entfernt positioniert und hat dadurch wesentlich weniger Einfluss.
Daher ist es von Vorteil, wenn die „Translatierbarkeit" durch eines oder mehrere der im Folgenden genannten Mittel verbessert wird:

1. Das Entfernen seltener Codons (Chen & Inouye, siehe oben, wie z. B. AGG/AGA (Arg), CUA (Leu), AUA (Ile), CCC (Pro), und GGA/GGG (Gly)) aus der P450 oder Reduktase cDNA, besonders solcher, die weniger als 25 bis 30 Codons vom Startcodon entfernt liegen.
2. Als Alternative zu oder in Verbindung mit dem oben Genannten die Einführung von Genen, die seltene tRNA-Synthasen codieren, z. B. das dnaY Gen für AGG/AGA.
3. Die Durchführung weiterer Veränderungen der DNA-Sequenz, welche den Vorlieben von E. coli genügen, z. B. die nicht zufällige Verwendung von Codon-Paaren (Gutman & Hatfield (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 3699–3703).
4. Die Durchführung von Veränderungen an der Promotor/Ribosomen-Bindungsstelle innerhalb des Expressionsvektors, um die Möglichkeit der Bildung von Sekundärstrukturen zu minimieren und um den Abstand zwischen der ribosomen Bindungsstelle und dem Startcodon zu optimieren (siehe oben, Wang et al (1995)).

Es ist außerdem bevorzugt, dass der N-Terminus des Cytochrom P450 entsprechend der US 5,240,831 oder z. B. durch die allgemeine Methode von Gillam et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 317, 374–384 verändert wird, die hier beide durch Bzugnahme mit aufgenommen werden sollen.
Die bakterielle Zelle der Erfindung umfasst ein genetisches Konstrukt, das in der Lage ist, ein Cytochrom P450 zu exprimieren, sowie ein genetisches Konstrukt, das in der Lage ist, eine Cytochrom-P450-Reduktase zu exprimieren.
Geeigneterweise kann die Zelle ein genetisches Konstrukt enthalten, das in der Lage ist, sowohl ein Cytochrom P450 als auch eine Cytochrom-P450-Reduktase zu exprimieren. Gleichwohl können das Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase von getrennten genetischen Konstrukten exprimiert werden.
Das genetische Konstrukt kann aus DNA oder aus RNA bestehen. DNA ist bevorzugt.
Bei dem genetischen Konstrukt handelt es sich normalerweise um ein extrachromosomales genetisches Element wie z. B. ein Plasmid oder das Genom eines Bakteriophagen. Der Ausdruck „genetisches Konstrukt" beinhaltet jedoch ausdrücklich, dass das genetische Konstrukt ein Teil des bakteriellen Chromosoms darstellen kann. Das genetische Konstrukt kann beispielsweise Teil eines Bakterieophagen sein, der das bakterielle Chromosom lysogenisiert hat.
Das genetische Konstrukt enthält jene genetischen Elemente, die für die Expression des Cytochrom P450 oder der Cytochrom-P450-Reduktase in der bakteriellen Zelle nötig sind.
Zu den für die Transskription und Translation in der bakteriellen Zelle benötigten Elementen gehören ein Promotor, eine ribosome Bindungsstelle sowie eine codierende Region für das Cytochrom P450 oder die Cytochrom-P450-Reduktase.
In Bezug auf den Promotor geht man davon aus, dass nahezu jeder in der selektierten bakteriellen Zelle funktionsfähige Promotor eingesetzt werden kann. Zu den bevorzugten Promotoren zählen jedoch der lac, lac UV5, tac, trc, λP_L, T7, lpp, lpp-lac oder T3 Promotor. Natürlich sind die λP_L, T7 und T3 Promotoren von Bakteriophargen abgeleitet und es ist bekannt, dass sie in Bakterien E. coli funktionieren.
Die Verwendung eines regulierbaren Promotors, wie dem lac Promotor, ist bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass ein starker Promotor, wie der T7 Promotor, nicht verwendet wird.
Es wird oft wünschenswert sein, eine passende Ribosomen-Bindungsstelle in das Gen einzufügen, das die eukaryontische Cytochrom P450-Domäne enthält, um die bakterielle Expression zu beeinflussen. Oft können die Ribosomen-Bindungsstelle und der Promotor als „Kassette" eingebaut werden. Eine „Kassette" ist definiert als zusammenhängendes, vorgefertigtes DNA-Segment, welches die gewünschten Elemente umfasst und an seinen beiden Termini nützliche Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme besitzt, die ein leichtes Einfügen an einer geeigneten Stelle innerhalb des gewünschten Cytochrom-P450-Gens oder der cDNA oder der Cytochrom-P450-Reduktase durch einfache genetische Manipulation ermöglichen.
Auch kann es wünschenswert sein, den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle eines homologen Systems, wie die des lac Promotors und seiner assoziierten RBS einzusetzen. Im allgemeinen ist jedoch vorgesehen, dass man eine effektive bakterielle ribisomale Bindungsstelle verwendet, wobei die RBS aus E. coli, λ, T7 oder T3 zu bevorzugen sind. Noch mehr bevorzugt sind die ribosomalen Bindungsstellen des T7 Gens 10 oder die der E. coli lac A, lac Z, trp A, trp B, trp C, trp D, trp E, trp L, trp R oder trp S Gene. Eine besonders bevorzugte Ribosomen-Bindungsstelle und „Spacer Region" enthält die Sequenz 5'-AGGAGGTCAT-3' (SEQ ID No. 3), wobei der unterstrichene Bereich die Ribosomen-Bindungsstelle und die benachbarte CAT-Sequenz die „Spacer Region" enthält. (Die „Spacer Region" ist die Sequenz, die zwischen der Ribosomenstelle und dem ATG-Initiationscodon liegt).
Üblicherweise wird man einen geeigneten bakteriellen Transkriptionsterminator verwenden, der die Funktion der bakteriellen RNA-Polymerasen beendet, nämlich der Enzyme, die für die Transkription der DNA in RNA in einem gemäß der Erfindung präparierten Gen verantwortlich sind. Die Anforderungen an einen funktionellen bakteriellen Transkriptionsterminator sind recht einfach und werden für gewöhnlich durch eine Folge von T-Resten charakterisiert, denen eine GC-reiche, dyadisch symmetrische Region vorausgeht. Bevorzugtere Terminatoren sind solche der TRP-Gene, die ribosomalen Terminatoren, rrnB, oder die Terminatorsequenzen des T7-Phagen. Tatsächlich enthalten die T7-Termi natorsequenzen Rnase-III-Schnittstellen mit einer „Stem-loop"-Struktur an den 3'-Enden der mRNAs, wodurch offensichtlich der Abbau der Botschaft verlangsamt wird.
Das genetische Konstrukt ist in der Lage, sich in der bakteriellen Zelle zu vermehren und wird stabil an zukünftige Generationen weitergegeben.
Eine Vielzahl von Methoden wurde entwickelt, um DNA über komplementäre, anhaftende Enden in funktionsfähiger Weise mit Vektoren zu verbinden. Zum Beispiel können an das in die Vektor DNA zu inserierende DNA-Segment komplementäre, homopolymere Teile angefügt werden. Das Vektor- und das DNA-Segment werden dann über Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären, homopolymeren Enden miteinander verbunden und bilden auf diese Weise rekombinante DNA-Moleküle.
Synthetische „Linker", die eine oder mehrere Restriktions-Schnittstellen enthalten, bieten eine alternative Methode, um das DNA-Segment mit Vektoren zu verbinden. Das DNA-Segment, das, wie zuvor beschrieben, durch den Verdau mit Restriktions-Endonukleasen hergestellt wurde, wird mit bakteriophager T4-DNA-Polymerase oder mit E. coli Polymerase I behandelt. Diese Enzyme entfernen mit ihren 3'-5'-Exonuklease-Aktivitäten überstehende, einzelsträngige 3'-Enden und füllen ausgesparte 3'-Enden durch ihre Polymerase-Aktivitäten auf.
Die Kombination dieser Aktivitäten führt somit zur Entstehung von DNA-Segmenten mit glatten Enden. Die Segmente mit den glatten Enden werden dann mit hohem molarem Überschuss an „Linker"-Molekülen in der Gegenwart eines Enzyms, wie der bakteriophagen T4-DNA-Ligase inkubiert, das in der Lage ist, die Ligation von DNA-Molekülen mit glatten Enden zu katalysieren. Die Produkte der Reaktion sind demzufolge DNA-Segmente, die polymere „Linker"-Sequenzen an ihren Enden tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und in einen Expressionsvektor ligiert, der mit einem Enzym geschnitten wurde, das Enden produziert, welche mit denen des DNA-Segments kompatibel sind.
Synthetische „Linker", die eine Vielzahl von Endonuklease-Schnittstellen enthalten, sind über eine Vielzahl von Quellen käuflich zu erwerben, zu denen auch die International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA gehört.
Eine wünschenswerte Methode, die DNA zu modifizieren, die das Polypeptid der Erfindung codiert, stellt die polymerase Kettenreaktion dar, wie sie von Saiki et al (1988) in Science 239, 487–491 beschrieben wird.
Bei dieser Methode wird die enzymatisch zu amplifizierende DNA von zwei spezifischen Oligonukleotid-Primern flankiert, die selbst mit in die amplifizierte DNA eingebaut werden. Die besagten spezifischen Primer können Erkennungsstellen für Restriktions-Endonukleasen enthalten, die unter Verwendung von in der Fachwelt bekannten Methoden für die Klonierung in Expressionsvektoren verwendet werden können.
Geeigneterweise enthalten die Vektoren ein prokaryontisches Replikon, wie z. B. das ColE1 ori für die Vermehrung in einem Prokaryonten. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promotor enthalten, wie z. B. einen prokaryontischen Promotor, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) der Gene in einer bakteriellen Wirtszelle, wie z. B. E. coli, die mit den Vektoren transformiert wurde, zu steuern.
Ein Promotor ist ein Kontrollelement der Expression, das von einer DNA-Sequenz gebildet wird, die das Binden der RNA-Polymerase und den Ablauf der Transkription erlaubt. Promotor-Sequenzen, die mit exemplarischen bakteriellen Wirten kompatibel sind, liegen typischerweise in Plasmidvektoren vor, die passende Schnittstellen für die Insertion eines DNA-Segments der vorliegenden Erfindung enthalten.
Typische prokaryontische Vektorplasmide sind pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, erhältlich bei Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA) und pTrc99A und pKK223-3, erhältlich bei Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.
Die Transformation geeigneter Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung wird über gut bekannte Verfahren erreicht, die typischerweise von dem verwendeten Vektortyp abhängen. In Bezug auf die Transformation bakterieller Wirtszellen siehe z. B. Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 und Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Elektroporation ist für die Transformation von Zellen ebenfalls nützlich und in der Fachwelt zur Transformation bakterieller Zellen wohl bekannt.
Zum Beispiel können viele bakterielle Spezies mit Methoden transformiert werden, wie sie von Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637–646 beschrieben werden. Der Inhalt dieser Schrift wird hier durch Bezugnahme mit aufgenommen. Die größte Zahl an Transformanten wird immer wieder durch Elektroporation des DNA-Zellgemisches, das in 2,5X PEB vorliegt, unter der Verwendung von 6250 V/cm bei 25 μFD erreicht.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt enthaften, welches in der Lage ist, besagtes Cytochrom P450 oder besagte Cytochrom-P450-Reduktase zu exprimieren, können mit gut bekannten Techniken identifiziert werden. So können z. B. Zellen, die aus der Einführung eines Expressionskonstruktes der vorliegenden Erfindung resultieren, gezüchtet werden, um das Cytochrom P450 oder die Cytochrom-P450-Reduktase zu produzieren. Die Zellen können geerntet und lysiert werden, und ihr DNA-Gehalt kann auf das Vorhandensein der DNA unter Verwendung einer Methode untersucht werden, wie sie von Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 oder von Berent et al (1985) Biotech. 3, 208 beschrieben wird. Alternativ dazu kann das Vorhandensein des Proteins im Überstand unter der Verwendung von Antikörpern, nachgewiesen werden, wie im Folgenden beschrieben wird.
Zusätzlich zum direkten Nachweis des Vorkommens rekombinanter DNA kann eine erfolgreiche Transformation auch durch gut bekannte immunologische Methoden bestätigt werden, wenn die rekombinante DNA dazu in der Lage ist, die Expression des Proteins zu steuern. Zum Beispiel können Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, Proteine produzieren, die geeignete Antigen-Eigenschaften zeigen. Proben von vermutlich transformierten Zellen werden geerntet und unter Verwendung geeigneter Antikörper auf das Protein hin untersucht.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst auch eine Kultur dieser Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur oder eine von einer monoklonalen Kultur abstammende Kultur in einem Nährmedium.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform enthält die bakterielle Zelle außerdem ein genetisches Konstrukt, das in der Lage ist, einen Polypeptid-Co-Faktor zu exprimieren, der die korrekte Faltung des Cytochrom P450 oder der Cytochrom-P450-Reduktase unterstützt.
Die Anwesenheit eines solchen Polypeptid-Co-Faktors ist besonders dann bevorzugt, wenn das Cytochrom P450 oder die Cytochrom-P450-Reduktase von einem starken Promotor ausgehend exprimiert wird, wobei es in Abwesenheit des Polypeptid-Co-Faktors dazu kommen kann, dass das Cytochrom P450 oder die Cytochrom-P450-Reduktase nicht-funktionelle „inclusion bodies" bildet.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polypeptid-Co-Faktor um ein molekulares Chaperon, wie z. B. den Gro ELS Komplex, SecB, SecD, SecF, den DnaJ/DanK/GrpE Komplex, Peptidylprolyl-cis, trans Isomerasen, protein-disulfid-isomerasen-ähnlichen Proteinen, die von den dsbA, dsbB, dsbC und dsbD Genen codiert werden, das periplasmatische Chaperon, das von clpB codiert wird, oder Thioredoxin. Die Löslichkeit fremder in E. coli exprimierter Proteine wurde durch die Coproduktion von bakteriellem Thioredoxin erhöht (Yasukawa et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 25328–25331; dessen Inhalt durch Bezugnahme hier mit aufgenommen wird).
Es kann auch nützlich sein, die folgenden Systeme oder Wirts- oder Expressionssysteme zu verwenden.

1. Die Verwendung protease-defizienter E. coli Stämme (z. B. ompT^–, Ion^–, degP^–) wodurch sich möglicherweise der Abbau des exprimierten Proteins bzw. der exprimierten Proteine reduzieren läßt. Eine Zusammenstellung von E. coli Stämmen, die für alle bekannten Loci defizient sind, die die Proteloyse sezernierter rekombinanter Proteine betreffen, wird in Meerman & Georgion (1994) Biotechnology 12, 1107–1110 beschrieben.
2. Die Expression des P450 und/oder der Reduktase als Fusionsprotein mit z. B. Ubiquitin (Baker et al (1994) J. Biol. Chem. 269, 25381–25386), Thioredoxin (z. B. pTrxFus-Vektor von Invitrogen), Glutathion-S-Transferase (z. B. pGEX-Vektoren von Pharmacia) oder Protein A (z. B. rPIT2T-Vektor von Pharmacia), von denen jedes die Expression verstärken kann.

In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform enthält die bakterielle Zelle außerdem ein genetisches Konstrukt, das in der Lage ist, einen Polypeptid-Co-Faktor zu exprimieren, der in der Lage ist, den Transfer von Elektronen zwischen dem Cytochrom P450 und der Cytochrom-P450-Reduktase zu unterstützen. Vorzugsweise handelt es sich bei besagtem Co-Faktor um das Cytochrom b₅ oder die FMN-Domäne einer Cytochrom-P450-Reduktase.
Zu weiteren Co-Faktoren, die den Transfer von Elektronen unterstützen können, gehören Adrenodoxin/die Adrenodoxin-Reduktase sowie die NADH-Cytochrom-b₅-Reduktase (in Verbindung mit Cytochrom b₅). Man geht davon aus, dass für die vorliegende Erfindung die Benutzung eines Co-Faktors, der Elektronen direkt von NADH statt von NADPH aufnimmt, oder sogar die Benutzung beider Co-Faktoren zusammen besonders dann von ausdrücklichem Vorteil ist, wenn man mit dem Stoffwechsel ganzer Zellen („Bioreaktoren") arbeitet. Das liegt daran, dass das intrazelluläre Verhältnis von (NAD + NADH) zu (NADP + NADPH) in E. coli ungefähr 4 : 1 beträgt. Deswegen liegt ein wesentlich größeres Reduktionspotential (und somit Enzymaktivität) für P450 vor, wenn es sich bei dem Reduktionsäquivalent um NADH statt um NADPH handelt. In diesem Zusammenhang schließt die Erfindung Zusätze oder Veränderungen ein, die zu einer Erhöhung des cytoplasmatischen Vorrats von NADH und/oder NADPH führen können und dazu dienen, die enzymatische Aktivität in ganzen Zellen zu erhöhen. Dies umfasst die Zugabe von Vorläuferproteinen zu dem extrazellulären Medium (solche, für die ein Aufnahmemechanismus existiert, wie Nikotinamid) oder die Hemmung von Enzymen, die NADPH zerstören.
Die FMN-Domäne der Cytochrom-P450-Reduktase kann exprimiert werden, wie dies in Smith et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8710–8714 beschrieben wird, und Cytochrom b₅ kann exprimiert werden, wie dies in Holmans et al (1994) Arch. Biochem. Biophys. 312, 554–565 beschrieben wird. Es ist bevorzugt, dass ein Polypeptid-Co-Faktor, der den Transfer von Elektronen unterstützt, beinhaltet ist, wenn es sich um eines der Cytochrome P450 CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP2E1 oder CYP1A1 handelt. Es ist besonders bevorzugt, dass Cytochrom b₅ entweder mit CYP3A4 oder CYP3A5 oder CYP3A7 oder CYP2E1 co-exprimiert wird.
Es ist außerdem besonders bevorzugt, dass die FMN-Domäne zusammen mit CYP1A1 co-exprimiert wird.
Obwohl es denkbar ist, dass der besagte Co-Faktor in manchen Fällen ein N-terminales Fragment enthält, das den Co-Faktor zu einem zellulären Kompartiment oder einer Membran der Bakterienzelle dirigiert, ist es bevorzugt, dass solche Modifikationen an Cyto chrom b₅ oder der FMN-Domäne der Cytochrom-P450-Reduktase nicht durchgeführt werden, wenn diese in bakteriellen Zellen exprimiert werden.
Eine weitere Ausführungsform umfasst eine bakterielle Zelle im Sinne der Erfindung, die außerdem ein genetisches Konstrukt enthält, das in der Lage ist, ein beliebiges Enzym zu exprimieren, welches in der Lage ist, das Produkt einer vom Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System katalysierten Reaktion zu verstoffwechseln.
Um zu versuchen, den Stoffwechsel einer Bindung durch eine eukaryontische, im Besonderen eine Säugetierzelle oder durch ein Organ eines Tiers, besonders eines Säugetiers zu immitieren, ist es wünschenswert, in der bakteriellen Zelle im Sinne der Erfindung ein weiteres oder mehrere weitere Polypeptide zu exprimieren, die in der eukaryontischen Zelle oder dem Tier das Produkt des Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-Systems weiter verstoffwechseln können. Dies ist besonders dann nützlich, wenn die bakterielle Zelle im Sinne der Erfindung für Mutagenitätstests oder als Modell für die Verstoffwechselung von Arzneimitteln verwendet wird.
Geeigneterweise handelt es sich bei dem Enzym entweder um eine Glutathion-S-Transferase, eine Epoxidhydrolase oder um eine UDP-Glucuronosyl-Transferase. Zu weiteren Enzymen gehören Sulfotransferase, N-Acetyltransferase, Alkoholdehydrogenase, γ-Glutamyltranspeptidase, Cystein Conjugat β-Lyase, Methyltransferase, Thioltransferase, DT-Diaphorase, Chinon-Reduktase oder Glyoxylase.
Es sei darauf hingewiesen, dass es deswegen, weil in ein und derselben bakteriellen Zelle mehrere genetische Konstrukte vorliegen können, z. B. Konstrukte die Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase und manchmal auch Cytochrom b₅ oder eine FMN-Domäne der Cytochrom-P450-Reduktase oder ein weiteres Enzym exprimieren, günstig ist, wenn Bakterienstämme vorgesehen sind, die in ihr Chromosom ein oder mehrere genetische Konstrukte integriert tragen, und dass diese Stämme dann als „Master"-Stamm für die Einführung weiterer genetischer Elemente verwendet werden können. Es ist z. B. besonders bevorzugt, dass die bakteriellen „Master"-Stämme ein genetisches Cytochrom-P450-Reduktase-Konstrukt enthalten, das in das bakterielle Chromosom integriert vorliegt. Es ist des Weiteren bevorzugt, dass die bakteriellen „Master"-Stämme ein genetisches Konstrukt oder Konstrukte enthalten, die sowohl die Cytochrom-P450-Reduktase als auch das Cytochrom b₅ vom bakteriellen Chromosom aus exprimieren. Diese „Master"-Stämme werden dann mit einem genetischen Konstrukt transformiert, das in der Lage ist, ein Cytochrom P450 zu exprimieren.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung einer Zelle gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung. Jedes geeignete Kulturmedium kann verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass eine nährstoffreiche Brühe, wie z. B. „Terrific Broth", verwendet wird. Es ist des weiteren bevorzugt, dass das Kulturmedium eine Verbindung enthält, die die Haem-Synthese fördert; δ-Amino-Lävulinsäure (ALA) ist besonders bevorzugt.
Es sei darauf hingewiesen, dass in allen Aspekten der Erfindung, in denen eine bakterielle Zelle zwei oder mehr genetische Konstrukte enthält, diese genetischen Konstrukte in derselben bakteriellen Zelle miteinander kompatibel sind. Im Allgemeinen sind genetische Konstrukte, die im Chromosom integriert vorliegen, miteinander kompatibel, und zwei genetische Konstrukte sind normalerweise miteinander kompatibel, wenn das eine in das Chromosom integriert ist und das andere als autonomes Replicon, z. B. als Plasmid vorliegt. Wenn zwei oder mehr unterschiedliche Plasmide, die die genetischen Konstrukte der Erfindung bilden, außerhalb derselben Zelle vorliegen, ist es im allgemeinen wünschenswert, dass es sich um kompatible Plasmide handelt, z. B. Plasmide, die unterschiedliche Replikationsursprünge besitzen. Es ist des weiteren wünschenswert, dass die unterschiedlichen Plasmide Gene für unterschiedliche Antibiotikaresistenten codieren, so dass jedes der unterschiedlichen Plasmide selektiert werden kann, wenn die bakterielle Zelle in Kultur gezüchtet wird.
Ein zweiter Gesichtspunkt der Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Konvertierung eines Substrates für Cytochrom P450 in ein Produkt, wobei das Verfahren das Vermischen des besagten Substrates mit bakteriellen Zellen entsprechend dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung umfasst, wobei die besagten Zellen ein funktionelles Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System enthalten, das das besagte Substrat konvertieren kann.
Ein dritter Gesichtspunkt der Erfindung beschreibt die Verwendung einer bakteriellen Zelle im Sinne des ersten Gesichtspunkts der Erfindung zur Konvertierung eines Substrats eines Cytochroms P450 in ein Produkt.
Die bakteriellen Zellen der Erfindung finden in vielen Technologiebereichen Einsatz, besonders jene Zellen gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung, die ein funktionelles Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System exprimieren.
Es folgen einige spezifische Anwendungsmöglichkeiten, für die die bakteriellen Zellen der Erfindung eingesetzt werden können. Es ist jedoch abzusehen, dass es viele andere Anwendungsmöglichkeiten gibt, z. B. immer dann, wenn die Konvertierung eines Cytochrom-P450-Substrates in ein Produkt gewünscht wird.
a) Arzneimittelentwicklung und Arzneimitteltests
Neue sichere Arzneimittel auf den Markt zu bringen ist teuer, kompliziert und langwierig. Die Wirksamkeit und Sicherheit des auf dem Markt befindlichen Produktes, in Bezug auf pharmakokinetische Parameter, Medikamenten-Wechselwirkungen und Toxizität hängen entscheidend von den für die Medikamententwicklung eingesetzten Modellen ab. Für die Arzneimittelentwicklung würde sich ein entscheidender Vorteil ergeben, wenn die Mängel von Vorlaufpräparaten bereits im frühesten Entwicklungsstadium vorhergesagt werden könnten.
Es existieren ernsthafte Schwierigkeiten bei der Extrapolation pharmakotoxikologischer Daten von Tiermodellen auf den Menschen. Diese beruhen oft darauf, dass zwischen den Arten ausgeprägte Unterschiede bei den katalytischen Eigenschaften der die Arzneimittel verstoffwechselnden Enzyme bestehen, die wiederum die pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften der meisten therapeutischen Arzneimittel bestimmen.
Die bakteriellen Zellen, insbesondere E. coli und S. typhimurium Zellen, die einen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen und die funktionelle P450-Mono-Oxygenase-Systeme exprimieren, sind ideale Modelle, um den menschlichen Arzneimittel-Stoffwechsel zu imitieren, und lassen sich wesentlich leichter handhaben als Modelle, die auf Hefe- und Säugetierzellen aufgebaut sind. Diese Zellen ermöglichen ein Screening mit hohem Durchsatz von Arzneimitteln in Bezug auf optimierte Arzneimittel-Stoffwechsel-Eigenschaften. Dies wird mit dem Aufkommen kombinatorischer chemischer Bibliotheken besonders wichtig, die die Evaluierung der Arzneimittel-Stoffwechsel-Eigenschaften mehrerer hundert Verbindungen innerhalb kurzer Zeit erfordern.
Bei dieser Ausführungsform ist es nützlich; wenn die bakteriellen Zellen auch Enzyme exprimieren, die andere als die hier beschriebenen Arzneimittel metabolisieren.
b) Bioreaktoren
Die Bakterienzellen der Erfindung sind aufgrund der hohen Substrat-, Regio- und Stereo-Selektivität der von den P450ern katalysierten oxidativen Reaktionen nützlich für die Synthese von Fein- oder Massenchemikalien und für die Synthese von Zwischenprodukten chemischer Reaktionen.
Bei dieser Ausführungsform ist klar, dass eine bakterielle Zelle im Sinne der Erfindung selektiert wird, die ein Cytochrom P450 mit der geeigneten Substratspezifität exprimiert. Die Substratspezifität vieler Cytochrome P450 ist in der Fachwelt bekannt, so dass das geeignete Cytochrom P450 leicht selektiert werden kann. Da jedoch immer mehr Cytochrom-P450-Gene gefunden werden, ist es möglich, diese in der Erfindung zu verwenden; dann können die bakteriellen Zellen der Erfindung, die ein neues Cytochrom P450 exprimieren, tatsächlich dafür verwendet werden, dessen Substratspezifität zu bestimmen.
Es sei darauf hingewiesen, dass deswegen, weil einige Cytochrome P450 in der Lage sind, Alkane zu Alkoholen oder aromatische Verbindungen zu phenolischen Verbindung umzuwandeln, bakterielle Zellen der Erfindung in der Massen-Chemikalienindustrie nützlich sind, in der solche Alkohole und phenolische Verbindungen benötigt werden. Dennoch machen viele von den Cytochromen P450 katalysierten Reaktionen die Zellen im Sinne der Erfindung für die Feinchemikalien-Industrie und die pharmazeutische Industrie nützlich, wo oft eine selektive Oxidation (inklusive Hydroxylierung) von komplexen Strukturen benötigt wird. Es wird angenommen, dass die Zellen im Sinne der Erfindung speziell für die Synthese von Steroidhormonen und deren Analoge geeignet sind.
c) Biokatalyse
Die in der vorliegenden Erfindung entwickelten Systeme ermöglichen schnelle Untersuchungen der Funktionalität von P450-Varianten, die durch zielgerichtete Mutagenese hergestellt wurden. Es ist somit möglich, innerhalb kurzer Zeit, neue P450s mit verbesserten katalytischen Eigenschaften zu entwickeln.
d) Bio- und Chemosensoren
Die bakteriellen Zellen im Sinne der Erfindung sind auch als Bio- oder Chemosensoren nützlich. Insbesondere sind aus den Zellen isolierte Membranen nützlich. Das Binden eines Substrates (das sind Moleküle, die gemessen oder aufgespürt werden sollen) kann eine Veränderung des Potentials verursachen, wenn die bakterielle Zelle oder die aus der Zelle isolierten Membranen auf einer Elektrodenoberfläche vorliegen, und dadurch das Aufspüren des Substratmoleküls erlauben. Die Verwendung immobilisierter Zellen zum Aufspüren und zur Analyse wird beschrieben bei Kambe & Nakanishi (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 54–59.
e) Biosanierung
Die Bakterienzellen im Sinne der Erfindung sind auch im Bereich der Biosanierung nützlich. Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-Systeme sind z. B. in der Lage, schädliche Verbindungen zu entgiften. Die geeigneten bakteriellen Zellen, die ein geeignetes Cytochrom P450 exprimieren, welches eine schädliche Verbindung oxidieren kann, sind nützlich, um die Schädlichkeit besagter Verbindung zu verringern.
f) Carcinogenitätstests
Wie an anderer Stelle ausführlicher beschrieben, sind die Zellen im Sinne der Erfindung, insbesondere S. typhimurium Zellen bei Carcinogenitätstests nützlich.
Zwar sind Zellen im Sinne der Erfindung deswegen besonders nützlich, weil sie ein funktionelles Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System innerhalb einer intakten Zelle bieten, doch beinhaltet die Erfindung auch, dass Membranen von besagten Zellen isoliert werden und dass besagte Membranen, im Vergleich mit ganzen Zellen, mit dem Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-System angereichert sind. Die Membranisolation aus bakteriellen Zellen ist in der Fachwelt wohlbekannt. Die Membranisolation aus Zellen im Sinne der Erfindung wird in den Beispielen genauer beschrieben.
Gemäß einem vierten Gesichtspunkt schafft Erfindung eine bakterielle Zelle, die ein Cytochrom P450 enthält, wobei besagte Zelle in der Lage ist, ein genetisches Konstrukt zu exprimieren, das besagte Cytochrom P450, wobei das Cytochrom P450 ein N-terminales Fragment enthält, welches das Cytochrom P450 zu einem zellulären Kompartiment oder zu einer Membran der bakteriellen Zelle dirigiert.
Es ist bevorzugt, dass das N-terminale Fragment das Cytochrom P450 zu einer Membran dirigiert.
Es ist weiter bevorzugt, dass das N-terminale Fragment das ompA, pelB, malE oder phoA Signalpeptid oder eine funktionelle äquivalente Variante der eben Genannten enthält.
Die bevorzugten Eigenschaften des N-terminalen Fragments, besonders die der Signalpeptide oder der Leader-Sequenzen sind jene, die auch gemäß vorhergehender Gesichtspunkte der Erfindung bevorzugt werden.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Cytochrom P450 außerdem eine Peptidsequenz enthält, die die Reinigung des Cytochrom P450 aus der Bakterienzelle erleichtert; es ist noch mehr bevorzugt, dass besagte Peptidsequenz eine Bindestelle für eine Verbindung enthält.
Es ist ganz ausdrücklich bevorzugt, dass es sich bei besagter Peptidsequenz um ein -(His-)_n handelt, wobei n ≥ 4 und besagte Verbindung Nickel ist.
Es wird davon ausgegangen, dass der vierte Gesichtspunkt der Erfindung sowohl für solche Cytochrome P450, die ganz gewöhnlich mit der Cytochrom-P450-Reduktase interagieren, als auch für andere Cytochrome P450, wie z. B. solche nützlich ist, die mit Adrenodoxin/der Adrenodoxin-Reduktase oder äquivalenten, Elektronen übertragenden Verbindungen interagieren. Deswegen enthält die Zelle in einer zu bevorzugenden Ausführung des vierten Teils der Erfindung ein genetisches Konstrukt, das in der Lage ist, Adrenodoxin oder die Adrenodoxin-Reduktase von äquivalenten, Elektronen übertragenden Verbindungen zu exprimieren. Mit der Bezeichnung „äquivalente, Elektronen übertragende Verbindungen" schließen wir alle anderen funktionell äquivalenten Verbindungen ein, die Elektronen von NADH auf Cytochrom P450 übertragen können, insbesondere solche Verbindungen, deren natürliche Funktion darin besteht, Elektronen von NADH auf einzelne Cytochrome P450 zu übertragen.
Gemäß einem fünften Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Aufreinigung von Cytochrom P450 beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte a) eine ausreichende Menge an Zellen, entsprechend dem vierten Gesichtspunkt der Erfindung zu liefern, und b) das Cytochrom P450 von anderen zellulären Kompartimenten abzutrennen.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein genetisches Konstrukt beschrieben, das in der Lage ist, ein Cytochrom P450 zu exprimieren, wobei das Cytochrom P450 ein N-terminales Fragment enthält, das das Cytochrom P450 zu einem zellulären Kompartiment oder einer Membran der bakteriellen Zelle dirigiert. Die bevorzugten Eigenschaften des N-terminalen Fragments sind jene, die auch in Bezug auf die anderen Gesichtspunkte der Erfindung bevorzugt werden. Es ist besonders bevorzugt, dass das N-terminale Fragment das ompA, pelB, melE oder phoA Signalpeptid oder eine funktionell äquivalente Variante der eben genannten umfasst. Die anderen zu bevorzugenden Eigenschaften des genetischen Konstruktes sind jene, die auch bei den vorangegangenen Gesichtspunkten der Erfindung bevorzugt werden. Noch ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung schaft eine Vielzahl von bakteriellen Zellen, entsprechend dem ersten oder vierten Gesichtspunkt der Erfindung, wobei jede Zelle ein genetisches Konstrukt enthält, das in der Lage ist, ein anderes Cytochrom P450 zu exprimieren oder ein genetisches Konstrukt oder Konstrukte enthält, die verschiedene Kombinationen von Cytochrom P450 und der Cytochrom-P450-Reduktase codieren und, falls angebracht, andere Polypeptide, wie z. B. solche, die den Elektronentransfer erleichtern oder solche, die Produkte der Reaktion des Cytochrom-P450-Mono-Oxygenase-Systems mit einem Substrat weiter verstoffwechseln.
Eine solche Vielzahl (oder Bibliothek) von Zellen kann in geeigneter Weise gelagert werden, z. B. unter geeigneten Bedingungen in einem Gefrierschrank und z. B. in einer Mikrotiterplatte, wobei jede Vertiefung eine andere bakteriellen Zelle enthält. Die Vielzahl von Zellen kann für Arzneimitteltests oder Carcinogenitätstests und für andere Zwecke, wie jene die oben beschrieben wurden, nützlich sein.
Die Erfindung wird im Folgenden genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren beschrieben.
1: Die Konstruktion von pB216
Das Plasmid NF14 wurde durch Ersetzen eines bestehenden Transkriptionsterminators durch ein angelagertes Oligonucleotid-Paar modifiziert, das aus einem trpA Terminator mit SalI- und BglII-Enden besteht. Diese Modifikation entfernte eine zweite BglII-Stelle, wodurch die darauffolgende Klonierung an der verbleibenden BglII-Stelle ermöglicht und das Plasmid pB215 erzeugt wurde. Ein BglI-BglII-Fragment, das die pelB-Reduktase mit einem P_tacP_tac-Promotor enthält, wurde aus pB207 in die BglII-Stelle von pB215 subkloniert, um das Co-Expressionsplasmid pB216 zu erzeugt. Es wurde gefunden, dass die Orientierung des pelB-Reduktase-Inserts in der dargestellten Weise vorliegt.
2: Western Blot von Membranfraktionen, die in E. coli exprimierte Reduktase und in E. coli exprimiertes CYP3A4 enthaften
10 μg jeder Membranfraktion wurde in jede Spur geladen. Die Reihenfolge beim Beladen ist entlang der Oberkante des Blots dargestellt. Jede Expressionsprobe ist neben ihrem nicht induzierten Pendant dargestellt. Die Immunodetektion wurde unter Verwendung von Antikörpern gegen die Reduktase und gegen CYP3A durchgeführt. Eine Spur mit menschlichen Lebermikrosomen (10 μg mikrosomales Protein) wurde als Referenzspur beigefügt.
3: Eine Wiedergabe der beiden in dieser Studie verwendeten Expressions-Vektoren
Das Plasmid pCW (3A) enthält einen colE1-Replikationsursprung und das Betalactamase-Gen, welches Resistenz gegen Antibiotika wie Ampezillin und Carbenizillin verleiht. Es wurde für die Expression der P450 cDNAs verwendet. Das Plasmid pACYC184 (3B) enthält einen p15A-Replikationsursprung und wurde für die Expression der P450-Reduktase cDNA verwendet, wobei eine P450 cDNA gleichzeitig von pCW aus exprimiert wurde. Bei dem für die Selektion von pACYC184 verwendeten Antibiotikum handelt es sich um Chloramphenicol. Nur einmal vorkommende Restriktions-Schnittstellen sind in Fettschrift dargestellt.
4: Western Blot, der die Expression der P450-Reduktase in bakteriellen Membranen darstellt
Die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert und dann mit einem Rabbit-Anti-Reduktase-Primärantikörper und einem Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Anti-Rabbit-IgG-Sekundär-Antikörper inkubiert. Die Detektion erfolgte durch Chemolumineszenz. Es wurden 10 μg Protein pro Spur geladen. Die Expression der Wild-Typ P450-Reduktase-cDNA unter nicht-induzierenden und induzierenden Bedingungen ist in den Spuren 1 bzw. 2 dargestellt. Die zugehörige Expression eines N-terminalen Fusionsproteins des bakteriellen pelB Leaders mit der P450-Reduktase ist in den Spuren 3 und 4 gezeigt. Eine Probe menschlicher Lebermikrosomen ist zum Vergleich in Spur 5 dargestellt. Die Reduktase-Aktivitäten (Angaben in nmol reduziertem Cytochrom c pro Minute und pro mg Protein) sind unter der Figur angegeben.
5: Western Blot, der die Expression von pelB- und ompA-CY3A4 in bakteriellen Membranen zeigt
Die Proteine wurden durch SDS-PAGE auf einem 9% Acrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit einem Rabbit-Anti-CYP3A-Primärantikörper und einem meerrettich-peroxidase-gekoppelten Anti-Rabbit-IgG-Sekundär-Antikörper inkubiert. Die Detektion erfolgte durch Chemolumineszenz. Die Spuren 2 und 3 enthalten Membranen, die aus Bakterien isoliert wurden, die entweder pelB-CYP3A4 bzw. ompA-CYP3A4 exprimierten (24 μg Protein pro Spur). Spur 1 enthält eine Probe menschlicher Lebermikrosomen zum Vergleich (8 μg Protein).
6: Spektren von reduziertem Fe-CO, erhalten von ganzen Bakterien, die pelB-CYP3A4 (6A) oder ompA-CYP3A4 (6B) exprimieren, oder von aus diesen Zellen gewonnene Membranen
Aliquots von Zellen oder Membranen wurden 1 : 20 verdünnt mit 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, das 20% Glycerol enthält, 10 mM CHAPS und 1 mM EDTA, durch die Zugabe einiger Natriumdithionitkristalle reduziert und anschließend gleichmäßig auf zwei zusammenpas sende Glasküvetten verteilt. Nach der Bestimmung eines Grundlinienspektrums über den Bereich von 500 bis 400 nm wurde die Probenküvette für etwa 1 Minute sanft mit CO durchperlt. Dann wurde die Messung wiederholt und der P450-Gehalt unter Verwendung eines Extinktions-Koeffizienten von 91 mM^–1 cm^–1 abgeschätzt.
7: Zusammenfassung der CYP3A4-Expressionsniveaus verschiedener Konstrukte in E. coli, wie sie aufgrund der Differenzspektren von reduziertem Fe-CO abgeschätzt wurden (siehe oben)
Die Resultate sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt, mit der Anzahl der Bestimmungen in Klammern. Die Zellen wurden unter standardisierten Bedingungen kultiviert (Terrific Broth, 30°C, 24 Stunden Induktion) ± 0,5 mM δ-ALA.
8: Western Blot, der die Expression von ompA-CYP2D6 in bakteriellen Membranen zeigt
Die Proteine wurden durch SDS-PAGE auf einem 9% Acrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert, und dann mit einer Mischung aus Rabbit-Anti-CYP2D6 und Anti-Reduktase-Primärantikörpern inkubiert, gefolgt von meerrettich-peroxidase-gekoppelten Anti-Rabbit-IgG-Sekundär-Antikörpern. Die Detektion erfolgte durch Chemolumineszenz. Die Spuren 1 bis 4 enthalten jeweils 2,5 μg bakterielles Membranprotein. Spur 5 enthält 10 μg menschliche Lebermikrosomen und Spur 6 Proteinstandards. Die Membranen wurden aus Zellen isoliert, die den leeren Expressions-Vektor, pCW (Spur 1), ompA-2D6 alleine (Spur 2), oder ompA-2D6 plus P450-Reduktase trugen und entweder in der Abwesenheit (Spur 3) oder der Anwesenheit (Spur 4) des Haem-Vorläufers Delta-Aminolävulinsäure kultiviert wurden.
9: Spektren von reduziertem Fe-CO, die von ganzen Bakterien erhalten wurden, die ompA-CYP2D6 alleine exprimieren (4A), ompA-CYP2D6 zusammen mit P450-Reduktase co-exprimieren (4B) oder von aus diesen Zellen gewonnenen Membranen
Aliquots von Zellen oder Membranen wurden 1 : 20 verdünnt in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, das 20% Glycerol enthielt, 10 mM CHAPS und 1 mM EDTA, durch die Zugabe einiger Natriumdithionitkristalle reduziert und dann gleichmäßig auf zwei passende Glasküvetten verteilt. Im Anschluss an die Bestimmung eines Grundlinienspektrums zwischen 500 und 400 nm wurde die Probenküvette für etwa 1 Minute vorsichtig mit CO durchperlt. Die Messung wurde anschließend wiederholt und der P450-Gehalt unter Verwendung eines Extinktions-Koeffizienten von 91 mM^–1 cm^–1 abgeschätzt.
10: Zusammenfassung der beobachteten Niveaus von ompA-CYP2D6 alleine oder zusammen mit P450-Reduktase co-exprimiert in E. coli, wie aus den Spektren des reduzierten Fe-CO abgeschätzt (siehe oben)
Die Resultate sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt, mit der Anzahl an Bestimmungen in Klammern. Die Zellen wurden unter standardisierten Bedingungen kultiviert (Terrific Broth, 30°C, 24 Stunden Induktion) ± 0,5 mM δ-ALA.
11: Kinetische Parameter, die für die 1'-Hydroxylierung von Bufuralol in bakteriellen Membranen bei der Co-Expression von ompA-CYP2D6 und P450-Reduktase bestimmt wurden
Die Membranen wurden bei 37°C mit variierenden Substratkonzentrationen (0–100 μM) in der Anwesenheit eines NADPH generierenden Systems, unter Bedingungen inkubiert, die eine lineare Produktbildung in Bezug auf Protein und Zeit (nicht dargestellt) ergeben. Das Ausmaß der Produktbildung wurde durch „Reversed-phase HPLC" unter Bezug auf Authentic Standard bemessen. Die kinetischen Parameter wurden von einer doppelt reziproken graphischen Darstellung der Anfangsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration abgeschätzt.
12: Der in E. coli erzielte P450-Ertrag unter Verwendung der Gen-Fusionsstrategie in Vergleich zu dem von anderen erhaltenen Ertrag nach Modifikation des P450 N-Terminus durch Deletionen oder Mutationen
13: Spektren von reduziertem Fe-CO, das aus ganzen Bakterien ompA-CYP2A6 Expressionen erhalten wurde, oder von aus diesen Zellen gewonnenen Membranen
Aliquots von Zellen oder Membranen wurden 1 : 20 verdünnt in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, das 20% Glycerol enthielt, 10 mM CHAPS und 1 mM EDTA, durch Zugabe einiger Natriumdithionitkristalle reduziert und dann gleichmäßig auf zwei passende Glasküvetten aufgeteilt. Im Anschluss an die Bestimmung eines Grundlinienspektrums zwischen 500 und 400 nm wurde die Probenküvette sanft für 1 Minute mit CO durchperlt. Dann wurde die Messung wiederholt und der P450-Gehalt unter Verwendung eines Extinktionsfaktors von 91 mM^–1 cm^–1 abgeschätzt.
14: Zusammenfassung der beobachteten Niveaus von in E. coli exprimiertem ompA-CYP2A6, wie aufgrund des Spektren von reduziertem Fe-CO abgeschätzt (siehe oben)
Die Resultate sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, n = 3. Die Zellen wurden unter standardisierten Bedingungen (Terrific Broth, 30°C, 24 Stunden Induktion) in der Anwesenheit von δ-Aminolaevullinsäure (0,5 mM) kultiviert.
15: Western Blot, der die Expression von ompA-CYP2E1 in bakteriellen Membranen darstellt
Die Proteine wurden durch SDS-PAGE auf einem 9% Acrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit Sheep-Anti-CYP2E1-Primärantikörpern und meerrettichperoxidase-gekoppelten Anti-Sheep-IgG-Sekundär-Antikörpern inkubiert. Die Detektion erfolgte durch Chemolumineszenz. Spur 2 enthält Membranen, die aus Kontrollbakterien isoliert wurden, welche das leere Expressionsplasmid, pCW beherbergen und Spur 3 enthält Membranen, die aus Bakterien isoliert wurden, die ompA-CYP2E1 exprimieren (jedes Mal 24 μg Protein pro Spur). Spur 1 enthält eine Probe menschlicher Lebermikrosomen zum Vergleich (8 μg Protein).
16: Ein Spektrum von reduziertem Fe-CO, das von ganzen Bakterien erhalten wurde, die ompA-CYP2E1 exprimieren
Aliquots der Zellen wurden 1 : 20 verdünnt in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, das 20% Glycerol enthielt, 10 mM CHAPS und 1 mM EDTA, durch die Zugabe einiger Natriumdithionitkristalle reduziert und dann gleichmäßig auf zwei passende Glasküvetten aufgeteilt. Im Anschluss an die Bestimmung einer Grundlinienmessung von 500–400 nm wurde die Probe für 1 Minute sanft mit CO durchperlt. Die Messung wurde wiederholt und der P450-Gehalt unter Verwendung eines Extinktions-Koeffizienten von 91 mM^–1 cm^–1 abgeschätzt.
Expressions-Level: 451 nmol/l Kultur in ganzen Zellen.
17: Verstoffwechselung von Nifedipin durch CYP3A4 in intakten JM109-, Ab1157-, NS3678- und TA1535[pB216]-Zellen
Die Inkubationen wurden in mit Glukose (10 mM) suplementierten M9-Salzen bei 37°C und unter Schütteln (200 U/min) durchgeführt. 0,5 ml von 10× konzentrierten Zellen wurden zu 4,5 ml Puffer gegeben und bei 37°C für 5 bis 10 Minuten vor-equillibriert, bevor die Zugabe von Nifedipin zu einer Endkonzentration von 200 μM erfolgte. 200 μl Aliquots wurden in Intervallen entnommen und für die im Material- und Methodenteil in Beispiel 4 beschriebene HPLC-Analyse vorbereitet.
18: Verstoffwechselung von Testosteron durch CYP3A4 in intakten JM109-, AB1157-, NS3678- und TA1535[pB216]-Zellen
Die Inkubationen wurden in durch Glukose (10 mM) suplementierten M9-Salzen bei 37°C und unter Schütteln (200 U/min) durchgeführt. 0,5 ml von 10× konzentrierten Zellen wurden zu 4,5 ml Puffer gegeben und bei 37°C für 5 bis 10 Minuten prä-equillibriert bevor die Zugabe von Testosteron zu einer Endkonzentration von 200 μM erfolgte. 200 μl Aliquots wurden in Intervallen entnommen und für die im Material- und Methodenteil in Beispiel 4 beschriebene HPLC-Analyse vorbereitet.
Beispiel 1
Materialien und Methoden
Bakterienstämme und Plasmide
Die Co-Expression wurde in den E. coli K12 Stämmen JM109 (Yanisch et al (1985) Gene 33, 103–19) und DH5α (Woodcock et al (1989) Nucleic Acids Res 17, 3459–78) miteinander verglichen. Der Stamm JM109 wurde selektiert und durchgehend benutzt. Der Vektor pCW wurde für die Expression der Reduktase benutzt, da dieser bereits zuvor erfolgreich für die Expression vieler Säugetier-P450-cDNAs inklusive CYP3A4 benutzt worden war (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Das Plasmid pB207 umfaßt den pCW-Vektor, der die translational an die bakterielle pelB-Signalsequenz fusionierte, humane Reduktase cDNA enthält. Die Sequenz des 5'-Endes der cDNA lautet:
[ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCC GGCGATGGCCATGGATATCGGATCCGAATTCCGCAACATG-humane Reduktase cDNA (~2 kb)] (SEQ ID No. 4), wobei die pelB Leader-Sequenz unterstrichen und das native Reduktase ATG in Fettschrift dargestellt ist. NF14 (pCW, der eine optimierte CYP3A4-Sequenz enthält) wurde auf identische Weise wie bei Gillam et al hergestellt (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Die Konstruktion des Plasmides pB215 erfolgte durch Ersetzen des SalI-BglII-Fragmentes von NF14, das einen Transkriptionsterminator enthält, durch ein doppelsträngiges SalI-BglII-Oligonucleotid, das einen trpA-Transkriptionsterminator mit der folgenden Sequenz enthält (nur der obere Strang ist dargestellt):
TCGACAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTA (SEQ ID No. 5). Um pB216 zu erzeugen wurde ein BglI-BglII-Fragment aus pB207, das die pelB-Reduktase cDNA mit ihem eigenen Expressionsignal enthält, an der einzelnen BglII-Stelle in pB215 hinein sub-kloniert.
Co-Expression von CYP3A4 und Reduktase in E. coli
Bei den Expressionsbedingungen handelte es sich um eine Modifikation der zuvor beschriebenen (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). JM109-Zellen wurden wie beschrieben (Inoue et al (1990) Gene 96, 23–8) mit pB216 transformiert und die Transformanten auf LB-Agar-Platten, die 50 μg/ml Ampecillin enthielten, isoliert. Einzelkolonien wurden präpariert und zum Inoculieren von 5 ml Starterkulturen in LB Broth benutzt, welches Ampecillin enthielt. Die Sarterkulturen wuchsen über Nacht bei 37°C und unter Schütteln. Bei den Expressionskulturen handelte es sich für gewöhnlich um 100 ml Kulturen (in 1 l Kulturflaschen), die Terrific Broth enthielten, das wie beschrieben verändert und suplementiert war (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Die Expressionskulturen wurden mit 1 ml der über Nacht gewachsenen Kultur inoculiert und unter Schütteln bei 200 U/min, 30°C für 4 bis 5 Stunden wachsen gelassen, bevor die Induktion mit 1 mM IPTG und die Zugabe von 0,5 mM δ-Aminolävulinsäure erfolgten. Wachstum und Expression heterologer Proteine wurden dann für 20 bis 24 Stunden bei 30°C und unter 200 U/min Schütteln fortgesetzt.
Ernte der Kulturen und Bestimmung der Expressionsniveaus
Die Zellen wurden geerntet und re-suspendiert in 5 ml 100 mM Tris. Acetat (pH 7,6), 0.5 M Sacharose, 0,5 mM EDTA (2 × TSE), wie beschrieben (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Danach wurde ein gleiches Volumen eiskaltes, destilliertes Wasser zugegeben. Der CYP3A4-Gehalt wurde unter Verwendung von Fe²⁺-CO gegen Fe²⁺-Differenzspektren, durch Zugabe von 50 μl Suspension ganzer Zellen in 1 × TSE zu 950 μl 100 mM Tris.Cl (pH 7,4), 10 mM CHAPS, 20% v/v Glycerol, 1 mM EDTA und Reduktion durch Zugabe einiger Körner Natriumdithionit bestimmt. Es wurde eine Grundlinie von Null Absorption zwischen 500 und 400 nm aufgezeichnet und die Probenküvette dann für etwa 1 Minute mit einem konstanten CO2-Strom durchperlt. Danach wurde ein Spektrum aufgezeichnet und der Ertrag von Spektralaktivem CYP3A4/l Kultur bestimmt. In diesem Stadium wurde ein Aliquot ganzer Zellen für Stoffwechselstudien entnommen. Von den verbleibenden Zellen wurden Membranfraktionen isoliert, wie beschrieben (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Der CYP3A4- und Reduktase-Gehalt der Membranen wurde bestimmt. Der Ertrag aktiver Reduktase wurde, wie folgt, durch eine spektrofotometrische Untersuchung evaluiert. Zu 990 μl 50 mM Cytochrom C in 0,3 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,7) wurden 1–10 μg Protein zugegeben und eine Grundlinie aufgezeichnet. 50 μM NADPH wurden zugegeben und δA_550nm wurde über die Zeit aufgezeichnet. Um den P450-Gehalt der Membranen zu ermitteln, wurden Spektren wie für ganze Zellen erstellt.
Immunodetektion von heterolog exprimiertem CYP3A4 und von Reduktase
Pro Spur wurden 10 μg Membranprotein auf ein 9%-iges SDS-Polyacrylamidgel geladen und die Proteine durch Elektrophorese aufgetrennt. Die Proteine wurden dann auf eine ECL-Nitrocellulose-Membran (Amersham) transferriert, mit 10% Milchpulver in TBS-T [50 mM Tris. Cl (pH 7,9), 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20] für 20 Minuten blockiert und dann für bis zu einer Stunde mit verdünnten primären Antikörpern inkubiert (eine Mischung aus Rabbit-Anti-CYP3A und Anti-Reduktase-Immunoglobulinen wurde benutzt). Die Membran wurde dann in TBS-T gewaschen und in verdünnten HRP-gekoppelten Esel-Anti-Rabbit-Antisera für ungefähr 45 Minuten inkubiert. Nach Waschen wurden Reduktase und CYP3A4 unter Verwendung von ECL-Reagenzien (Amersham) detektiert. Anti-Reduktase und Anti-CYP3A4-Antisera wurden von der ICRF Clare Hall Facility zur Verfügung gestellt, wohingegen HRP-gekoppelte Esel-Anti-Rabbit-Antikörper von der Scottisch Antibody Production Unit bezogenwurden.
Testosteron 6β-Hydroxylase Studien
Studien wurden sowohl mit Zellen als auch mit Membranfraktionen durchgeführt. In beiden Fällen wurden etwa 100 pmol P450 unter Schütteln in TSE, das 30 mM MgCl₂ ent hielt, inkubiert. Die Testosteron-Endkonzentration betzug 0,2 mM. Wo Membranen benutzt wurden, erfolgte die Zugabe eines NDAPH generierenden Systems (Endkonzentration 1 mM NADP, 5 mM Glucose-6-Phosphat, 1 Unit Glucose 6-Phosphat-Dehydrogenase). Die Reaktionen wurden bei 37°C für 5 Minuten durchgeführt, dann durch die Zugabe von 1 ml eiskalten Methanol angehalten und für 10 Minuten auf Eis gestellt. Im Anschluss an die Zentrifugation wurden die Überstände mit einem gleichen Volumen eiskalten Wassers verdünnt und die Testosteron-Metabolite unter Verwendung von Isolute C18-Säulen (IST Ltd.) extrahiert und in 1 ml Methanol eluiert. Das Methanol wurde in einer SpeedVac verdampft und die Metabolite dann in 200 μl 35% v/v Methanol re-suspendiert und in HPLC-Fläschchen transferiert. Die Metabolite wurden durch HPLC auf einer Spherisorb ODS-2 (5 μm) 250 × 4,6 mm Säule aufgetrennt, unter Verwendung eines auf Wasser, Methanol und Acetonitril basierenden Gradienten, bei einer Durchflussrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 240 nm. Der Ertrag des 6β-Hydroxytestosteron wurde, mit einem Standard bekannter Konzentration als Referenz, berechnet und dies ermöglichte die Ermittlung der spezifischen Aktivität des re-kombinanten CYP3A4 bezüglich des Testosterons. Die HPLC-Methode wurde von Glaxo-Wellcome und die Testosteron-Metabolite von Steraloids Inc. (ein Geschenk von Sterlin Winthrop) zur Verfügung gestellt.
Erythromycin N-Demethylase Studien
Bakterielle Membranfraktionen wurden mit 0,5 mM Enthromycin in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,5), der 150 mM KCl und 10 mM MgCL₂ enthielt, in Anwesenheit eines NADPH generierenden Systems (wie oben), für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 7,5% w/v Trichloroacetsäure abgebrochen und das precipitierte Protein durch Zentrifugation gesammelt. Die Erythromycin N-Demethylase-Aktivität wurde dann durch eine spektrofotometrische Untersuchung bestimmt, die unter Verwendung der Nash-Reagenz [6 M Amoniumacetat, 60 mM Acetylaceton, 150 mM Essigsäure; (Nash (1953) Biochem. J 55, 416–421)] durchgeführt wurde, sowie durch Messung der A_414nm.
Nifedipin-Oxidase Assays
Zellen oder Membranfraktionen wurden mit 0,2 mM Nifedipin, das in TSE vorlag und 30 mM MgCL₂ enthielt, unter Schütteln für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Wenn Membranfraktionen verwendet wurden, war ein NADPH generierendes System enthalten (wie oben). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von eiskaltem Methanol (30% v/v Endkonzentration) und Perchlorsäure (1,5 v/v Endkonzentration) angehalten und das ausgefällte Protein durch Zentrifugation gesammelt. Die Überstände wurden in HPLC-Fläschchen transferiert und sowohl Nifedipin als auch sein oxidiertes Metabolit wurden isokratisch auf einer Spherisorb ODS-2 (50 μm) 250 × 4,6 mm Säule unter Verwendung einer mobilen Phase aus Methanol, Acetonitril und Wasser (25 : 30 : 45 Volumenverhältniss) aufgetrennt und bei 254 nm durch HPLC detektiert. Die Menge an gebildetem Produkt wurde durch Bezugnahme auf einen Standard, der eine bekannte Konzentration von oxidiertem Nifedipin enthält, berechnet.
Ergebnisse
Konstruktion eines Plasmids für die Co-Expression von CYP3A4 und Reduktase
Vorversuche zur Optimierung der Expression von Reduktase in E. coli hatten ergeben, dass hohe Raten kontrollierbarer Expression erreicht werden konnten, wenn die humane Reduktase cDNA an ihrem N-Terminus translational an die bakterielle pelB Leader Sequenz fusioniert und von dem P_tacP_tac-Promotor von pCW ausgehend, in dem mit pB207 bezeichneten Plasmid, exprimiert wurde; diese Expressionsraten waren wesentlich höher als jene, die man mit dem vergleichbaren Konstrukt, dem der pelB Leader fehlt, erhalten hatte (Daten nicht gezeigt). Diese Daten stimmen überein mit der vorhergegangenen Expression von Ratten-Reduktase, die mit einer anderen bakteriellen Signalsequenz, ompA, fusioniert worden war (Shen et al (1989) J. Biol. Chem. 264, 7584–7589). Ein Co-Expressionsplasmid wurde durch Subklonieren der pelB-Reduktase cDNA in das optimierte CYP3A4-Expressionsplasmid NF14 (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131) (das für die vorliegende Arbeit rekonstruiert wurde) wie folgt konstruiert. NF14 wurde durch Entfernen einer der BglII-Schnittstellen innerhalb des Vektors modifiziert, wodurch die Benutzung der Downstream BglII-Stelle für die folgende Klonierung der Reduktase ermöglicht wurde, unter Beibehalten des Terminators der CYP3A4-Expression (für Einzelheiten siehe Methoden und Materialien und 1; pB215). Ein BglI-BglII-Fragment aus pB207, das die pelB-Reduktase cDNA und ihren P_tacP_tac-Promotor enthält, wurde dann an der BglII-Stelle im pB215 subkloniert, wodurch ein Plasmid pB216 entstand, in dem die beiden cDNAs, die jede den P_tacP_tac-Promotor tragen, Kopf an Fuß angeordnet wurden (siehe 1).
Optimierung der Co-Expression von Reduktase und CYP3A4 von pB216 aus
Es stellte sich heraus, dass die idealen Kultivierungsbedingungen denen ähnlich waren, die ausgehend von NF14 für die Expression von CYP3A4 als optimal etabliert sind (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131), mit der Ausnahme, dass festgestellt wurde, dass die Supplementation der Kulturen mit β-Aminolävulinsäure die Expression von CYP3A4 wesentlich erhöht (unveröffentlichte Daten) und demzufolge nun routinemäßig benutzt wird. Die Expressionsraten in den E. coli Stämmen JM109 und DH5α wurden miteinander verglichen und es wurde festgestellt, dass, während die Expressionsrate der Reduktase in DH5α leicht höher als in JM109 lag, dies auf Kosten der CYP3A4-Rate ging (Daten nicht dargestellt). Demzufolge wurde JM109 als Expressionsstamm ausgewählt, da man entschieden hatte, dass die Rate der CYP3A4-Expression Priorität haben sollte.
Aus früheren Berichten über die Expression von Reduktase in E. coli geht hervor, dass das Wachstumsmedium mit Riboflavin supplementiert wurde (Shen et al (1989) J. Biol. Chem. 264, 7584–7589). Wir stellten fest, dass die Zugabe von Riboflavin bezüglich der Expressionsrate der aktive Reduktase zu einem vernachlässigbaren Unterschied führt, so dass Riboflavin den Expressionskulturen nicht zugegeben wurde.
Bestimmung der Expressionsraten
In ganzen Baterienzellen kann der CYP3A4-Gehalt unter Verwendung von Fe²⁺-CO gegen Fe²⁺-Differenzspektren bestimmt werden, aber für die Einschätzung der Reduktase-Expressionsraten wurden bakterielle Membranfraktionen hergestellt, wie beschrieben (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Dies war notwendig, da die Reduktase-Untersuchung die Reduktionsrate von Cytochrom C misst und die in JM109-Zellen gemessene Hintergrundaktivität so hoch ist, dass sie die direkte Bestimmung aus Zellen oder Spheroplasten ausschließt. Bei der Expression von Reduktase von pB216 ausgehend, lag die für die Reduktase erhaltene spezifische Aktivität im Bereich von 400 pmol Reduktase/mg Membranprotein, wie aus den Cytochrom C Reduktionsraten von präparierten Membranen berechnet. Der in Membranen gemessene CYP3A4-Gehalt lag typischerweise bei ungefähr 200 pmol/mg Membranprotein. Nach der von pB216 ausgehenden Co-Expression von CYP3A4 und Reduktase enthalten die bakteriellen Membranen folglich P450-Reduktase und P450 in einem Verhältnis von näherungsweise 2 : 1.
Immunodetektion von heterolog exprimiertem CYP3A4 und von heterolog exprimierter Reduktase
In 2 ist ein typischer Western Blot dargestellt, der heterolog exprimierte Reduktase und heterolog exprimiertes CYP3A4 zeigt. Spuren, die der Reduktase bzw. dem CYP3A4 entsprechen, können in den von pB216 abgeleiteten Membranfraktionen detektiert werden (Spuren 5 und 6), während Reduktase alleine bzw. CYP3A4 alleine in jenen Proben nachgewiesen werden können, die von pB207 (Spuren 1 und 2) bzw. von NF14 (Spuren 3 und 4) abstammen. Unter nicht-induzierenden Bedingungen wurde die Expression nicht vollständig reprimiert, was an dem Auftreten von Reduktase und CYP3A4-Banden in Spuren beobachtet wurde, die von bakteriellen Kulturen stammen, in denen ihre Expression nicht durch die Zugabe von IPTG induziert worden war (Spuren 4 und 6). Jedoch wurden die aus diesen Fraktionen stammenden Mengen von aktiver Reduktase und von spektral aktivem CYP3A4 als wesentlich geringer befunden, als jene, die aus induzierten Kulturen stammten (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeuten könnte, dass die Detektion der Banden keine lineare Antwort auf den Gehalt von CYP3A4 und Reduktase in den Proben ist. Die Mengen von heterolog exprimiertem CYP3A4 und von heterolog exprimierter Reduktase in den JM109 pB216 Membranfraktionen schien denen ähnlich zu sein, die in einer Probe humaner Lebermikrosomen nachgewiesen wurden (Spuren 6 und 9).
Untersuchungen von CYP3A4-Aktivität in ganzen Zellen
Es wurde festgestellt, dass ganze JM109 pB216 Zellen Testosteron verstoffwechseln. Nach Inkubation der negativen Kontrollstämme JM109 pCW (nur Vektor) oder JM 109 pB207 (nur Reduktase-Expression) mit Testosteron konnte kein 6β-Hydroxytestosteron nachgewiesen werden. Dies zeigt, dass E. coli unfähig ist, in Abwesenheit von CYP3A4 die 6β-Hydroxylierung von Testosteron zu katalysieren. Zellen, die CYP3A4 alleine ex primieren (JM109 NF14), produzierten auch keine nachweisbaren Mengen an Metabolit, was zeigt, dass es in JM109 kein endogenes Protein gibt, das CYP3A4 mit Elektronen versorgen kann und dadurch eine katalytische Funktion ermöglicht. Wenn zu einer Reaktion, die JM109 NF14 Zellen enthielt, jedoch 100 μM Cumolhydroperoxid zugegeben wurden, wurde 6β-Hydroxytestosteron gebildet. Daraus folgt, dass das CYP3A4 in den JM109 NF14 Zellen funktional vorliegt, dass dort aber keine intrazelluläre Versorgung mit Elektronen zur Verfügung steht. Die geringe erreichte Aktivität könnte die Unzugänglichkeit des P450 für Cumolhydroperoxid innerhalb der ganzen Zellen wiederspiegeln. Bei Co-Expression von CYP3A4 und Reduktase zeigt sich eine relativ hohe Rate des Testosteron-Metabolismus (JM109 pB216 Probe). Dies zeigt, dass die Reduktase und das CYP3A4, wenn sie co-exprimiert werden, in ganzen Zellen zur Bildung eines funktionellen Mono-Oxygenase-Systems interagieren.
In diesem Experiment wurde berechnet, dass die 6β-Hydroxylase-Aktivität pro Minute und pro nmol P450 ~17,3 nmol produziertes 6β-Hydroxytestosteron betrug. Frühere Ergebnisse mit einem wieder hergestellten System, das bakteriell exprimiertes CYP3A4 enthielt, erzielten Umsatzraten von bis zu 10 nmol 6β-Hydroxytestosteron/min/nmol P450 (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131).
Metabolismus von Testosteron, Erythromycin und Nifedipin durch JM109 pB216 Membranen
Es wurde festgestellt, dass aus pB216 gewonnene Membranfraktionen den Stoffwechsel der CYP3A4-Substrate Testosteron, Nifedipin und Erythromycin ohne die Supplementation von Phospholipiden, Detergents, Glutathion oder Cytochrom b₅ vermitteln. Bei diesen Untersuchungen wurden Membranfraktionen, die 100 pmol CYP3A4 enthielten, in Anwesenheit eines NADPH generierenden Systems einfach mit Substrat inkubiert. Typische Aktivitäten sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass JM109 pB216 Membranfraktionen für den Stoffwechsel von drei CYP3A4-Substraten kompetent sind. Die Erythromycin N-Demethylase-Aktivität war ~2,5-fach geringer als zuvor in wieder hergestellten Systemen beobachtet, die bakteriell exprimiertes CYP3A4 enthielten (Gillam et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 317, 374–384). Im Gegensatz dazu war die Nifedipin-Oxydase-Aktivität jedoch ähnlich der zuvor in einem wieder hergestellten System beobachteten (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Tabelle 1 Cytochrom P450-Gehalt und Cytochrom C-Reduktase-Aktivitäten von JM109 NF14 und JM109 pB216 Zellen und/oder Membranen

n. d.: Keine nachweisbare Aktivität

Die P450-Gehalte wurden durch Differenzspektren von Fe²⁺-CO gegen Fe²⁺ gemessen. Die Gehalte sind als Mittelwerte von vier Experimenten ± Standardabweichung dargestellt.
Die Reduktase-Aktivitäten wurden durch Messung der Reduktionsrate von Cytochrom C pro mg Protein in Membranfraktionen berechnet und die Werte sind als Mittelwerte aus vier Experimenten ± Standardabweichung angegeben.
Tabelle 2 CYP3A4 abhängiger Metabolismus von Testosteron, Nifedipin und Erythromycin durch JM109 pB216 Zellen und Membranen
Der Metabolismus von drei bekannten CYP3A4-Substraten durch Zellen oder Membranen, die rekombinantes CYP3A4 und P450-Reduktase enthalten, wurde bewertet. Umsatzzahlen wurden als nmol des gebildeten Produkts pro Minute und pro nmol P450 aufgezeichnet und sind mit der ± Standardabweichung dargestellt. Bei den detektierten Pro dukten handelte es sich um 6β-Hydroxytestosteron, oxidiertes Nifedipin und Formaldehyd. Wo keine Aktivitäten nachgewiesen werden konnten, sind die Nachweisraten dargestellt. Beim Testosteron-Stoffwechsel wurde kein 6β-Hydroxytestosteron gebildet, auch nicht nach 60 Minuten Inkubation der Zellen oder Membranen, denen entweder CYP3A4 oder die P450-Reduktase fehlten (Daten nicht dargestellt).
Diskussion
In diesem Beispiel beschreiben wir die Bildung eines funktionellen P450-Mono-Oxygenase-Systems in E. coli durch Co-Expression der cDNAs, die humanes CYP3A4 und die P450-Reduktase codieren. Nach unserem Wissensstand handelt es sich hierbei um den ersten Fall, in dem gezeigt wurde, dass ein von einem Säugetier stammendes, Xenobiotika verstoffwechselndes P450 in intakten E. coli Zellen katalytisch aktiv ist Während die steroidogene P450 17α-Hydroxylase/17-20-lyase (P450c17) in E. coli aufgrund ihrer Fähigkeit Elektronen vom bakteriellen Flavodoxin/NADPH-Flavodoxin-Reduktase-System anzunehmen (Jenkins et al (1994) J. Biol. Chem. 269, 27401–27408) funktional ist, metabolisierten E. coli Zellen, die CYP3A4 alleine exprimieren (JM109 NF14 Zellen) das CYP3A4-Substrat Testosteron in der Abwesenheit eines exogenen Elektronenlieferanten (in diesem Fall Cumolhydraperoxid) nicht. Wir schließen daraus, dass CYP3A4 nicht mit dieser oder einer anderen bakteriellen Reduktase interagieren kann.
Wir haben ein System zur Co-Expression von CYP3A4 und humaner P450-Reduktase in E. coli entwickelt, mit der Zielsetzung, dass diese Zellen als Biokatalysatoren für die Produktion wertvoller P450-Metabolite benutzt werden könnten. Beide cDNAs wurden unter getrennten P_tacP_tac-Promotoren in einem einzelnen Plasmid, pB216, exprimiert, so dass koordinierte Expression des CYP3A4 und der Reduktase durch IPTG induziert werden konnten. Um optimale Expressionsraten erreichen zu können, wurde die ursprüngliche Form beider cDNAs modifiziert. Das 5'-Ende beider CYP3A4 cDNAs wurde wie zuvor beschrieben, verändert (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). Wir fanden heraus, dass es für die Effizienz der Expression der P450-Reduktase notwendig war, das 5'-Ende der cDNA durch Fusion mit der Sequenz, die das bakterielle pelB Signalpeptid codiert, zu verlängern. CYP3A4-Erträge von 200 pmol/mg Membran-Protein und Reduktaseerträge von 400 pmol/mg Membran-Protein wurden erzielt.
Wir glauben, dass CYP3A4 das mit pelB-Reduktase co-exprimiert wird, auf derselben Seite der cytoplasmatischen bakteriellen Membran lokalisiert sein könnte, da sowohl JM109 pB216 Zellen als auch die aus ihnen isolierten Membranen gegenüber CYP3A4-Substraten aktiv sind, was anzeigt, dass die Proteine in der Lage sein müssen, effektiv zu interagieren. Es wurde festgestellt, dass in Bezug auf die Substrate gemessene Aktivitäten sich als höher erwiesen als frühere Ergebnisse, die mit gereinigtem, bakteriell expri miertem CYP3A4 in einem wieder hergestellten System erhalten worden waren (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131; Gillam et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 317, 374–384). Solche wieder hergestellten Systeme enthalten gereinigtes CYP3A4, Reduktase, Cytochrom b₅, Glutathion, Detergents und eine optimierte Phosphlipid-Zusammensetzung. Es wurde gezeigt, dass Cytochrom b₅ wichtig ist, um maximale CYP3A4-Aktivitäten gegen spezifische Substrate für ein CYP3A4-Reduktase-Fusionsprotein zu erhalten (Shet et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11748–11752), während gezeigt werden konnte, dass in einem wieder hergestellten System, welches CYP3A4 enthält, auch die Phospholipid-Zusammensetzung und die Glutathion-Konzentration entscheidend sind (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131). In Abwesenheit dieser ergänzenden Faktoren waren sowohl in ganzen Zellen als auch in Membranen in dem hier verwendeten einfachen Puffersystem CYP3A4-Aktivitäten an Testosteron eher nicht zu erwarten. Es war daher extrem interessant, dass, in unseren Studien, hohe Raten von CYP3A4-Aktivität an diesen Substraten in der Abwesenheit von exogen zugefügtem Cytochrom b₅ beobachtet wurden.
Zusammenfassend haben wir mit Erfolg hohe Co-Expressionsraten von CYP3A4 und humaner P450-Reduktase in E. coli erreicht. Der resultierende Stamm ist kompetent für den Stoffwechsel von Testosteron und Nifedipin in ganzen Zellen, selbst in der Abwesenheit von exogen angewandtem NADPH, was nahelegt, dass (zumindest) das aktive Zentrum der Reduktase zytoplasmatisch orientiert ist. Von den Bakterien gewonnene Membranen verstoffwechseln Testosteron, Nifedipin und Enthromycin in einem einfachen Puffer, der nur mit NADPH supplementiert wurde. Die spezifischen Aktivitäten, die wir mit unserem Co-Expressionsstamm erzielt haben, sind höher als zuvor mit wieder hergestellten Systemen erreichte. Wir hoffen, die möglichen Gründe für diese Abweichungen zu erforschen, um die Umsatzraten zu verbessern. Der im vorliegenden Beispiel beschriebene Stamm wird als biotechnologisches Werkzeug für die Produktion von CYP3A4-Metaboliten Verwendung finden und wird als Modellsystem für die zukünftige Co-Expression von alternativen P450-Isoformen zusammen mit P450-Reduktase in E. coli verwendet werden.
Beispiel 2
Materialien und Methoden
Bakterielle Stämme und Plasmide
Es wurde durchweg der E. coli Stamm K-12 JM109 (Yanisch et al (1985) Gene 33, 103–19) benutzt. Cytochrom P450 cDNAs wurden vom Plasmid pCW ausgehend exprimiert. Dieses Plasmid enthält ein β-Lactamase-Gen und kann deshalb stabil in bakteriellen Zellen gehalten werden, die in der Anwesenheit eines Agenten, wie z. B. Ampecillin oder Carbenicillin wachsen. Die cDNA der humanen P450-Reduktase wurde ausgehend von dem Plasmid pACYC184 exprimiert, welches in der Anwesenheit von Chloramphenicol stabil in bakteriellen Zellen gehalten werden kann.
Isolation von bakterielle Signalpeptide codierenden Sequenzen und Herstellung von Expressions-Konstrukten
Die Quelle der codierenden Sequenz des bakteriellen pelB Signalpeptides war der kommerzielle Vektor pET-20b (Novagen). Chromosomale DNA wurde aus dem E. coli Stamm JM109 extrahiert und als Matritze für die Isolation der ompA Leader Sequenz durch PCR, unter Verwendung spezifischer Oligonucleotid Primer, verwendet. Dieses PCR-Produkt wurde subkloniert und der Didedoxy-Sequenzierung unterzogen und als identisch mit einer ompA Leader Sequenz, die bereits in der GenEMBL-Datenbank (Accession Number: v00307) registriert ist, gefunden, nämlich:
5'ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC-3' (SEQ ID No. 6).
Eine PCR-Fusionstechnik (Yon et al (1989) Nucleic Acids Res. 17; 4895) wurde benutzt, um die codierende Sequenz für das bakterielle pelB- oder ompA-Signalpeptid in Frame an das 5'-Ende der Volllängen-P450 cDNA zu fusionieren. Diese Methode verwendend stellten wir die pelB-CYP3A4, ompA-CYP3A4, ompA-CYP2D6, ompA-CYP2A6 und ompA-CYP2E1-Fusionen her, wobei in jedem einzelnen Fall eine NdeI-Schnittstelle am 5'-Ende des Konstruktes eingebaut wurde, um die Subklonierung in pCW hinein zu ermöglichen. Alle durch PCR erhaltenen Fragmente wurden durch die Dideoxy-Sequenzierung verifiziert.
Das zuvor beschriebene humane pelB-Reduktasekonstrukt wurde zusammen mit einer Abstreem (tac)₂-Promotor-Kassette, als ein BglI-BglII-Fragment, in die einzige BamHI-Stelle des Plasmids pACYC184 subkloniert, um das Plasmid pJR7 zu produzieren.
Expression von humanen, an bakterielle Leader Sequenzen fusionierten P450 in E. coli
JM109 Zellen wurden mit pCW/pelB-CYP3A4, pCW/ompA-CYP3A4, pCW/ompA-CYP2D6-, pCW/ompA-CYP2A6 oder pCW/ompA-CYP2E1 (Inoue et al (1990) Gene 96, 23–28) transformiert. Transformierte Zellen wurden mit Ampicillin selektiert und für weitere Studien amplifiziert. Für die Co-Expression wurden JM109 Zellen mit den Plasmiden pCW/ompA-CYP2D6 und JR7 co-transformiert und sowohl auf Ampecillin als auch Chloramphenicol selektiert.
Für alle Expressions- und Co-Expressionsexperimente wurde ein Standardprotokoll verwendet. Die Transformanden wurden aus einem gefrorenen Glycerolstock auf LB Agar-Platten, die entweder Ampecillin alleine (für die P450-Expression) oder Ampecillin plus Chloramphenicol (für die Co-Expression von P450 und der Reduktase) enthielten, ausgestrichen und bei 37°C für 12–14 Stunden inkubiert. Isolierte Einzelkolonien wurden dann in einigen ml LB Broth (das das passende Antibiotikum bzw. die passenden Antibiotika enthielt) inokuliert und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Diese Starterkultur wurde in einem konischen 1 l Kolben 1 : 100 in 100 ml Terrific Broth verdünnt, die wie beschrieben modifiziert und supplementiert worden war (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131), allerdings unter der Zugabe von Chloramphenicol (25 μg/ml), wenn Reduktase co-exprimiert wurde. Diese Kulturen wurden bei 30°C für 4–5 Stunden unter Schütteln inkubiert. Der Haem-Vorläufer, δ-Aminolävulinsäure, wurde dann zu einer Endkonzentration von 0,5 mM und das induzierende Agens IPTG zu 1 mM zugegeben. Die Expression heterologer Proteine durfte dann für 22–23 Stunden bei 30°C stattfinden.
Ernte der Kulturen und Bestimmung der Expressionsraten – wie zuvor beschrieben
Immunodetektion von heterolog exprimiertem P450 und heterolog exprimierter Reduktase
Die Proteine wurden auf 9%-igen SDS-Acrylamidgelen aufgetrennt und dann auf Hybond-ECL-Membranen (Amersham, GB) transferiert. Die Membran wurde für 1 Stunde mit 5% Milchpulver in TBS-X [50 mM Tris Cl (pH 7,9), 150 mM NaCl, 0,10% Triton X-100] blockiert, dann mit verdünnten primären Antikörpern für 45–60 Minuten inkubiert. Bei den benutzten primären Antikörpern handelte es sich um Rabbit-Anti-CYP3A, Rabbit-Anti-CYP2D6, Rabbit-Anti-Reduktase oder Sheep-Anti-CYP2E1-Immunoglobuline. Die Membran wurde in vier Durchgängen in TBS-X gewaschen und dann für 25–35 Minuten mit dem sekundären Antikörper (HRP-gekoppelte Esel, Anti-Rabbit- oder Anti-Sheep IgG, wie jeweils angemessen) inkubiert. Nach vier Waschschritten mit TBS-X wurden die rekombinanten Proteine durch Chemolumineszenz unter Verwendung von ECL (Amersham, GB) detektiert. Die sekundären Antikörper wurden von der Scottisch Antibody Production Unit bezoge.
Bufuralol 1'-Hydroxylase Studien
Untersuchungen bakterieller Membranfraktionen wurden bei 37°C in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4 durchgeführt, der 20 oder 50 pmol CYP2D6, 50 μM (±)-Bufuralol und ein NADPH regenerierendes System (siehe Beispiel 1) in einem Gesamtvolumen von 300 μl enthielt. Bei Membranen, die aus Zellen isoliert wurden, die nur pCW/ompA-CYP2D6 in sich tragen (d. h. Reduktase wird nicht co-exprimiert) wurde das NADPH regenerierende System durch 100 μM Cumolhydroperoxid ersetzt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 15 μl 60%-iger Perchlorsäure abgebrochen und für 5–10 Minuten auf Eis gestellt. Die ausgefällten Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt und die Überstände wurden auf 1'-Hydroxybufuralol durch Reversed-Phase-HPLC, mit Bezug auf Authentic Standard, untersucht. Die Auftrennung wurde durch Verwendung einer Spherisorb 5 μm ODS-2 Säule 25 cm × 4,6 mm und einer mobilen Phase von 0,1 M Ammoniumacetat (pH 5,0) mit einem linearen Acetonitril-Gradienten (27 bis 51% in 12 Minuten) erreicht. Die Detektion erfolgte durch Fluoreszenz unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängen von 252 bzw. 302 nm.
Untersuchungen an ganzen Zellen wurden bei 37°C in konischen 50 ml Glaskolben durchgeführt und enthielten 50 pmol CYP2D6, 50 μM (±)-Bufuralol und 1 × TSE-Puffer in einem Gesamtvolumen von 5 ml. Proben (300 μl) wurden nach 0, 2, 5 und 10 Minuten entnommen und in Reaktionsgefäße, die 15 μl 60%-ige Perchlorsäure enthielten, auf Eis überführt. Die Analysen gingen dann in identischer Manier wie bei den Membranuntersuchungen (siehe oben) weiter.
Für die Bestimmung der Parameter der Michaelis-Menten-Kinetik wurden die Inkubationen für 5 Minuten mit 20 pmol CYP2D6 und variierenden Substratkonzentrationen (0–100 μM) durchgeführt. K_m und V_max wurden aus doppelt reziproken Auftragungen der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration bestimmt.
Ergebnisse
Isolation der P450 und der P450-Reduktase cDNAs
Die cDNAs für CYP3A4, CYP2D6, CYP2A6 und CYP2E1 sowie für die P450-Reduktase wurden durch RT-PCR unter Verwendung von Amplimeren, die auf Grundlage der publizierten Sequenzinformationen synthetisiert worden waren, isoliert. Die cDNAs wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert und es wurde befunden, dass sie Proteine codieren, deren Primärstrukturen identisch sind mit jenen, die für CYP3A4, CYP2D6, CYP2A6 und CYP2E1 sowie für die humane P450-Reduktase publiziert wurden.
Konstruktion und Expression von an die pelB Leader Sequenz fusionierter humaner P450-Reduktase
P450-Reduktase ist für die katalytische Aktivität von humanen P450s notwendig und in E. coli nicht vorhanden. Wir haben versucht, die native P450-Reduktase oder die P450-Reduktase, die an ihem N-Terminus mit der pelB Leader Sequenz (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-) (SEQ ID No. 1) fusioniert ist, in E. coli zu exprimieren. Anfänglich versuchten wir beide Proteine unter der Kontrolle des IPTG (Isopropylthioglactosid) induzierbaren (tac)₂-Promotors in dem Plasmid pCW zu exprimieren (3). Membranen, die die native P450-Reduktase und die pelB-Reduktase beherbergen, wurden aus E. coli isoliert und durch Immunoblotting analysiert (4). In der Abwesenheit von IPTG wurden vernachlässigbare Mengen von P450-Reduktase detektiert und nach Zugabe von IPTG wurde eine deutliche Induktion des rekombinanten Proteins beobachtet. Die Expression der nativen P450-Reduktase von dem Plasmid pJR1 aus war niedrig, wohingegen große Mengen an pelB-P450-Reduktase von dem Plasmid pJR2 erhalten wurden. Diese Unterschiede wurden auch in der P450-Reduktase-Aktivität an Cytochrom C wiedergespiegelt, die in Membranen gemessen wurde, die diese beiden rekombinanten Proteine enthalten. In diesen Ansätzen zeigte die pelB-Reduktase eine fast 10-fach höhere Reduktase-Aktivität verglichen mit der nativen P450-Reduktase (4). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die optimale Expression funktioneller P450-Reduktase in E. coli nur nach Fusion dieses Proteins mit einer bakteriellen Leader Sequenz möglich ist.
Konstruktion und Expression von an eine bakterielle Leader-Sequenz fusioniertem CYP3A4
CYP3A4 ist das menschliche hepatische Haupt-P450 (Shimada et al (1994) J. Pharmacol. Exp. Ther. 270, 414–423) und ist in den Stoffwechsel sowohl breit gefächerter therapeutischer Arzneimittel als auch chemischer krebserregender Stoffe involviert. Um eine effiziente Expression dieses wichtigen P450 zu erreichen, konstruierten wir eine Serie modifizierter CYP3A4 cDNAs, die das CYP3A4 codieren, welches an seinem N-Terminus entweder an die bakterielle pelB oder die bakterielle ompA Leader Sequenz (MKKTAIAIAVALAGFATVAQA) (SEQ ID No. 2) fusioniert worden war, unter Verwendung einer PCR basierten Strategie, von der gezeigt wurde, dass sie die Fusion von zwei beliebigen Sequenzen an beliebigen Stellen ermöglicht (Yon et al (1989) Nucleic Acids. Res. 17, 4895). Die resultierenden cDNA-Konstrukte wurden sequenziert, in den Vektor pCW kloniert und zur Expression in den E. coli Stamm JM109 transformiert.
Kolonien, die in der Anwesenheit von Ampecillin wuchsen, wurden für weitere DNA- und Protein-Analysen selektiert. Die Expressionskonstrukte beherbergende E. coli wurden in Teriffic Broth wachsen gelassen und die P450-Expression wurde, wie in Materialien und Methoden beschrieben, durch IPTG induziert. Die CYP3A4-Expression wurde durch Immunoblot-Analyse bakterieller Membranen detektiert (5), sowie durch Spektralanalyse ganzer Zellen oder Membranen (6). Wie aus 5 ersichtlich, war die Rate von immunoreaktivem pelB-CYP3A4 ähnlich der Rate von in humanen Lebermikrosomen gefundenem CYP3A4, wohingegen die Rate von immunoreaktivem ompA-CYP3A4 um mindestens eine Größenordnung höher war. Interessanterweise lieferte pelB-CYP3A4 zwei nah beieinander wandernde immunoreaktive Proteine. Ein ähnliches Ergebnis wurde auch nach Reinigung eines His-gekennzeichnetem pelB-3A4 durch Nickel-Agarose-Affinitätschromatographie erhalten, wohingegen ompA-3A4, das auf ähnliche Weise gereinigt worden war, ein homogenes Protein ergab. Sowohl pelB-CYP3A4 als auch ompA-3A4 zeigten ein für P450 Haemoproteine typisches Spektrum von Fe²⁺ gegen Fe²⁺-CO (6). Der Erhalt von spektralaktivem pelB-CYP3A4-, jedoch nicht von ompA-CYP3A4-Protein wurde stark durch die Anwesenheit von δ-Aminolävulinsäure (ALA) im Wachstumsmedium stimuliert (7). Unter diesen Bedingungen lieferte ompA-3A4 mehr spektralaktives P450 im Vergleich zu pelB-CYP3A4 (500 nmol/l Kultur bzw. 143 nmol/l Kultur), obwohl der Unterschied weniger stark betont ausfiel, als aufgrund der Immunoblot-Analyse erwartet. Die Anwesenheit von ALA im Kulturmedium führte zum Auftreten eines Absorptionsmaximums bei 420 nm in den Spektralanalysen der rekombinanten P450 (siehe 6, pelB-3A4 exprimiert in der Anwesenheit von ALA und ompA-3A4 exprimiert in der Abwesenheit von ALA).
Die direkte Bestimmung der katalytischen Aktivität des exprimierten Proteins war aufgrund der Abwesenheit von P450-Reduktase in bakteriellen Membranen nicht möglich. Die Enzymaktivität von P450 wurde deshalb in der Anwesenheit von Cumolhydroperoxid bestimmt, das als künstlicher Sauerstoffdonor für P450 dient. Bei dieser Untersuchung stellten wir fest, dass die Umsatzzahlen des pelB-CYP3A4 bzw. des ompA-3A4 für die 6β-Hydroxylierung von Testosteron 4,2 min^–1 bzw. 3,2 min^–1 betrugen. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass diese P450 sich in E. coli korrekt zu spektral und katalytisch aktiven Enzymen falten.
Konstruktion und Expression von an die ompA Leader-Sequenz fusioniertem CYP2D6
Da wir heraus gefunden hatten, dass der von ompA-CYP3A4 erhaltene Ertrag wesentlich größer war, als der für pelB-CYP3A4, entschieden wir uns, ausschließlich die ompA-Sequenz an den N-Terminus von CYP2D6 zu fusionieren, das ein P450 darstellt, das in den Stoffwechsel einer Vielzahl von therapeutisch bedeutenden Verbindungen involviert ist.
Die für die Fusion der ompA-Signalsequenz an die CYP2D6 cDNA verwendete PCR-Technik war ähnlich der für die Konstruktion von ompA-CYP3A4 verwendeten Strategie. Dieses Konstrukt wurde vom pCW-Vektor aus exprimiert. 8 zeigt einen Immunoblot bakterieller Membranen, die aus E. coli stammen, die das ompA-CYP2D6 cDNA-Konstrukt beherbergen (Spur 2). Eine dem rekombinanten CYP2D6 entsprechende, immunoreaktive Bande wurde in diesen Membranen detektiert. Diese Bande fehlte in Membranen, die aus Bakterien isoliert wurden, die das leere Expressionsplasmid, pCW, trugen (Spur 1). Das ompA-CYP2D6 ergab ein für P450 typisches Spektrum von Fe²⁺ gegen Fe²⁺-CO (9). Der Ertrag von spektral aktivem CYP2D6 (481 nmol/l Kultur, 10) war ähnlich dem mit ompA-CYP3A4 erhaltenen Ertrag und resultierte in einer deutlich erkennbaren Rotfärbung der Bakterien, die das zuvor genannten Haemoprotein exprimieren. Die ALA abhängige Zunahme von spektral aktivem ompA-CYP2D6 war wesentlich stärker als bei pelB-CYP3A4. In der Anwesenheit von Cumolhydroperoxid katalysierte ompA-CYP2D6 die Hydroxylierung des typischen CYP2D6-Substrates Bufuralol bei einer Umsatzzahl von 50 ± 3 min^–1.
Die Co-Expression von P450 und der P450-Reduktase, die an eine bakterielle Leader-Sequenz fusioniert wurden, erzeugt ein funktionelles Mono-Oxygenase-System in E. coli
Um ein funktionelles P450-Mono-Oxygenase-System zu erzeugen versuchten wir P450 und die P450-Reduktase in E. coli zu co-exprimieren. Es ist möglich, sich drei wesentliche Wege vorzustellen, um die Co-Expression von zwei Proteinen in E. coli zu erreichen. Erstens können zwei cDNAs von getrennten kompAtiblen Plasmiden aus in der selben Zelle exprimiert werden: Zum Beispiel könnte P450 von pCW aus und die P450-Reduktase von einem weiteren Vektor aus exprimiert werden. Zweitens könnten beide cDNAs in dasselbe Plasmid sub-kloniert werden. Drittens könnte eine oder beide der cDNAs, die P450 oder die P450-Reduktase codieren, in das bakterielle Chromosom integriert werden. Wir haben die erste Strategie gewählt, da diese technisch am wenigsten anspruchsvoll ist.
Die pelB-Reduktase cDNA wurde in den Vektor pACYC184 (3) kloniert, woraus der Vektor pJR7 hervor ging. Der Vorteil dieses Konstrukts liegt darin, dass pACYC184 einen Replikationsursprung enthält, der anders ist als bei pCW. Zusätzlich enthalten diese Vektoren unterschiedliche Selektionsmarker, die eine stabile Co-Transformation mit zwei getrennten Plasmiden, eines für die Expression der P450-Reduktase (pACYC184) und das andere (pCW) für die Expression von P450 erlauben. E. coli wurde mit pJR7 und pCW, die die ompA-CYP2D6 cDNA tragen, transformiert. Transformanten wurden auf Ampicillin und auf Chloramphenicol selektiert und für weitere Untersuchunen vermehrt. Immunoblotting ergab immunoreaktive Banden (8), die der rekombinanten P450-Reduktase und dem CYP2D6 in Membranen entsprechen, die aus den co-exprimierenden Stämmen isoliert wurden, (Spuren 3 und 4). Diese waren beide in Membranen nicht vorhanden, die aus Bakterien isoliert wurden, die den leeren Expressionsvektor pCW tragen (Spur 1). ompA-CYP2D6 und die pelB-Reduktase co-exprimierende E. coli zeigten ein typisches Fe²⁺ gegen Fe²⁺-CO-Spektrum (9). Der gesamte zelluläre Ertrag an spektral aktivem ompA-CYP2D6 betrug 365 nmol/l Kultur in dem co-exprimierenden Stamm, was nur 25% unter dem von E. coli lag, die CYP2D6 alleine exprimieren (10). Membranen, die das ompA-CYP2D6 und die P450-Reduktase enthalten, zeigten eine Cytochrom C-Reduktase-Aktivität von 530 nmol/min/mg, was zwei Mal höher ist als der für humane Lebermikrosomen berichtete Wert. Am wichtigsten ist, dass sowohl intakte Bakterien, die ompA-CYP2D6 und die pelB-Reduktase co-exprimieren als auch aus ihnen gewonnene Membranen die Hydroxylierung des typischen CYP2D6-Substrates Bufuralol extrem effizient mit Umsatzzahlen von 4,6 min^–1 bzw. 5,7 min^–1 und einer spezifischen Aktivität (1,2 nmol/min/mg Membranprotein) katalysierten, was vierzig Mal höher als der für humane Lebermikrosomen berichtete Wert ist. Es wurde gefunden, dass V_max und die K_m für die CYP2D6-katalysierte Bufuralol 1'-Hydroxylierung bei 13,3 min^–1 bzw. 11,1 μM (11) liegen.
Konstruktion und Expression von mit dem ompA-Signalpeptid fusioniertem CYP2A6
Das ompA-Signalpeptid wurde durch PCR mit dem N-Terminus des Vollängen-CYP2A6 fusioniert. Das von pCW aus exprimierte, rekombinante ompA-CYP2A6 zeigte sowohl in ganzen Zellen als auch in von ihnen erhaltenen Membranen ein typisches Fe²⁺ gegen Fe²⁺-CO-Differenzspektrum (13). Der Ertrag an spektral aktivem CYP2A6 in ganzen Zellen (193 nmol/l Kultur, 14) war etwas geringer als die Erträge von entweder CYP3A4 oder CYP2D6, die von analogen Konstrukten exprimiert wurden. Trotzdem überstieg der spezifische CYP2A6-Gehalt, der aus diesen Zellen isolierten Membranen, bei Weitem den Pegel, der in humanen Lebermikrosomen gefunden werden würde.
Konstruktion und Expression von an das ompA-Signalpeptid fusioniertem CYP2E1
Dieselbe, auf PCR basierende Strategie wurde benutzt, um das ompA-Signalpeptid an den N-Terminus des humanen Volllängen-CYP2E1 zu fusionieren. Die Expression von pCW aus hatte das Erscheinen eines Proteins in bakteriellen Membranen zur Folge, das durch Immunoblotting unter Verwendung spezifischer Anti-CYP2E1-Antikörper nachweisbar war (15, Spur 3) und das offensichtlich von derselben Größe wie CYP2E1 in einer Probe humaner Lebermikrosomen war (15, Spur 1). Dieses Protein war in einer Probe von Membranen, die aus E. coli isoliert wurden, welche das leere Expressionsplasmid, pCW, tragen, nicht vorhanden (Spur 2). Die relativen Bandenstärken (siehe Spuren 1 und 3) lassen vermuten, dass in diesem Bakterienstamm ein sehr hohes Niveau von rekombinantem CYP2E1 produziert wurde.
Des weiteren lieferte die Expression von pCW/ompA-CYP2E1 ein typisches Differenzspektrum für reduziertes Fe-CO in ganzen Bakterienzellen (16), obwohl in diesem Fall das Absorptionsmaximum bei etwa 420 nm eher stärker betont war als für die anderen P450 exprimierenden Konstrukte. Der Ertrag an spektral aktivem CYP2E1 in ganzen E. coli, die pCW/ompA-CYP2E1 tragen, wurde auf 451 nmol/l Kultur geschätzt – näherungsweise dasselbe Maß, das auf von CYP3A4 und von CYP2D6 in ganzen Zellen von den analogen ompA-Konstrukten produziert wurde.
Diskussion
Dieses Beispiel demonstriert, dass ein hoch funktionelles Mono-Oxygenase-System in E. coli durch die Fusion sowohl von P450 als auch der P450-Reduktase mit bakteriellen Leader Sequenzen, wie z. B. pelB und ompA geschaffen werden kann. Dies wird deutlich veranschaulicht durch die fast 10-fache Zunahme des Niveaus funktioneller P450-Reduktase, erhalten nach der Fusion der nativen P450-Reduktase mit der pelB Leader Sequenz und der Expression dieses Konstrukts vom Vektor pCW aus (1). Die Expression der pelB-Reduktase vom Vektor pACYC184 aus, den wir für die Co-Expression der P450 zusammen mit der P450-Reduktase einsetzten, lieferte P450-Reduktase-Niveaus in E. coli Membranen ähnlich denen, die in humanen Lebermikrosomen gefunden wurden (100 pmol P450-Reduktase/mg Protein). Die Anwendbarkeit unserer Methode ist nicht nur auf die Expression der P450-Reduktase in E. coli beschränkt, da wir herausgefunden haben, dass die pelB-P450-Reduktase auch in S. typhimurium auf einem Niveau, ähnlich dem in E. coli erreichten, exprimiert werden kann (Daten nicht dargestellt).
Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass mit bakteriellen Leader Sequenzen fusionierte P450 in E. coli effizient exprimiert werden können, ohne dabei auf die aufwendigen Modifikationen der P450 N-Termini angewiesen zu sein, die bisher für die optimale Expression von P450 für nötig gehalten wurden (Barnes et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5597–5601; Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131; Larson et al (1991) J. Biol. Chem. 266, 7321–7324). Unsere Methode zur Genfusion ist für P450 anwendbar, die zu verschiedenen Genfamilien gehören, da wir in der Lage waren zu zei gen, dass CYP3A4, CYP2D6, CYP2A6 und CYP2E1 (5, 8 und 15) unter Verwendung dieser Strategie alle in E. coli exprimiert werden können. Kürzlich haben wir diese Methode auch auf die Expression von CYP2C9 und CYP2D9 erweitert.
Bisher wurden CYP3A4 und CYP2D6 cDNAs in E. coli exprimiert nachdem ihre 5'-Enden modifiziert worden waren um Regionen zu entfernen, die das Potential zur Bildung von Sekundärstrukturen besitzen (Gonzalez et al (1995) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35, 369–390). Diese Modifikationen erwiesen sich als aufwendige Veränderungen in den N-terminalen Regionen von CYP3A4 und CYP2D6 (im Folgenden werden diese modifizierten Proteine als 17α-CYP3A4 bzw. 17α-CYP2D6 bezeichnet). In Bezug auf den P450-Ertrag ist unsere Strategie der Genfusion dieser Methode überlegen, zumindest für die von uns ausprobierten P450, da die Erträge des vom Vektor pCW aus exprimierten ompA-CYP3A4 und des ompA-CYP2D6 mindestens um den Faktor 1,7 bzw. 4,8 höher lagen als die für, vom selben Vektor aus exprimierten, 17α-CYP3A4 und 17α-CYP2D6 publizierten Werte (12). Wir untermauerten diese Beobachtung, indem wir die Expression von 17α-CYP3A4 und 17α-CYP2D6 von Konstrukten aus, die in unseren Laboren laut den publizierten Verfahren hergestellt worden waren, wiederholten (Gillam et al (1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123–131; Gillam et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 319, 540–550). Wir haben pelB-CYP3A4 und ompA-CYP3A4 mit C-terminalen Verlängerungen, die eine Reihe von Histiginresten enthalten, exprimiert. Wir waren in der Lage, von diesen Proteinen Mengen im mg-Bereich für Strukturanalysen zu reinigen durch die Verwendung von Nickelagarose-Affinitätschromatographie.
Wir haben unsere ompA Leader Fusionsstrategie erweitert um die Expression von zwei weiteren humanen Cytochromen P450, nämlich CYP2A6 und CYP2E1 in E. coli zu ermöglichen. Für CYP2E1 ist unsere Expressionsrate von 451 nmol/l Kultur (16) um eine Größenordnung größer als die zuvor publizierte Expressionsrate für dieses Enzym in E. coli (40 nmol/l, Gillam et al (1994) Arch. Biochem. Biophys. 312, 59–66) unter Verwendung konventioneller Sequenzoptimierungsverfahren. Soweit wir wissen, wurde über die Expression von CYP2A6 in E. coli zuvor noch nie berichtet. Somit waren wir in der Lage, die Einfachheit und Vielseitigkeit unseres Systems zu demonstrieren.
Am wichtigsten ist, dass wir zeigen, dass die Genfusionsmethode verwendet werden kann, um ein hochfunktionelles humanes P450-Mono-Oxygenase-System in E. coli zu erzeugen. Dies wird deutlich demonstriert durch die hohe Bufuralol 1'-Hydroxylase-Aktivität, die bei intakten E. coli, die ompA-CYP2D6 und die pelB-P450-Reduktase co-exprimieren, beobachtet wurde. Diese Aktivität (1,2 nmol/min/mg Protein) ist etwa 20-fach höher, als die durchschnittliche, für ein Paneel humaner Lebermichrosomen berichtete, Bufuralol-Hydroxylase-Aktivität. Auch aus diesem E. coli Stamm isolierte bakterielle Membranen zeigen eine ähnlich hohe P450-Enzym-Aktivität. ompA-CYP2D6 zeigt eine höhere Substratumsatzzahl (4,6 min^–1), als der für humane Lebermichrosomen berechnete Wert (1 min^–1) und auch als die für in einem optimierten zellfreien System wieder hergestelltes CYP2D6 berichteten Werte. Dieses Ergebnis demonstriert deutlich, dass ompA-CYP2D6 und die pelB-Reduktase in E. coli sehr effizient interagieren und legt nahe, dass beide Proteine auf derselben Seite der bakteriellen Membran in einer Phospholipid-Umgebung lokalisiert sind, die mindestens so optimal ist, wie die komplexen in wieder hergestellten Systemen eingesetzten Phospholipid-Zusammensetzungen.
Es ist wichtig zu beachten, dass E. coli, die ompA-CYP2D6 und pelB-Reduktase exprimieren, endogenes NADPH als Quelle für Reduktionsäquivalente benutzen, da sie in der Abwesenheit von exogen zugefügtem NADPH P450-Enzym-Aktivität zeigten. Diese Feststellung legt nahe, dass das aktive Zentrum der Reduktase auf der cytoplasmatischen Seite der inneren Membran lokalisiert ist, wo es in der Lage ist, den intrazellulären NADPH-Vorrat zu benutzen. Diese Eigenschaft, kombiniert mit dem hohen Ertrag an rekombinantem Protein und der technisch einfachen Wartung, führt dazu, dass das System ideal für Bioreaktorzwecke geeignet ist. Wir haben jedoch festgestellt, dass P450-Substrate von E. coli, die P450 und die P450-Reduktase co-exprimieren, schlecht verstoffwechselt werden, wenn sie in Kultur-Broth statt in dem in der vorliegenden Studie verwendeten Puffer gehalten werden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Substrate unter den bisherigen Bedingungen nicht in der Lage waren, die bakterielle Zellwand und die bakteriellen Membranen zu durchdringen. Wir haben deswegen unsere Strategie erweitert und ein funktionelles P450-Mono-Oxygenase-System in der TA-Reihe von S. typhimurium Stämmen exprimiert. Diese Stämme wurden oft für Mutagenitätstests benutzt, da sie eine „Deep Rath" Mutation enthalten, die zu einer permeablen Zellwand führt, die von einem großen Paneel strukturell unterschiedlicher Verbindungen durchdrungen werden kann (Ames et al (1975) Mutat. Res. 31, 347–364; Simula et al (1993) Carcinogenesis 14, 1371–1376). Wir waren in der Lage, zu zeigen, dass unter Verwendung unserer Genfusionsstrategie ein funktionelles P450-Mono-Oxygenase-System in S. typhimurium erzeugt werden konnte.
Es ist abzusehen, dass die P450 und die P450-Reduktase Expressionsraten in E. coli durch Verwendung anderer Vektoren oder anderer bakterieller Wirte noch weiter gesteigert werden können. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass etwas von dem bakterielle exprimierten ompA-CYP2D6 falsch gefaltet war und „Inclusion Bodies" gebildet haben könnte. Seit kurzem stehen E. coli Stämme zur Verfügung, die molekulare chaperone und Thioredoxin exprimieren (Yasukawa et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 25328–25331). Die Expression dieser Proteine, die die falsche Faltung neu synthetisierter Proteine verhindern, führte zu einem wesentlich höheren Ertrag vieler rekombinanter Proteine. Diese Stämme könnten auch für die Expression von P450 verwendet werden, ausgehend von Expressionsvektoren, die einen stärkeren bakteriellen Promotor als pCW enthalten. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass große Mengen an rekombinantem CYP3A4 in E. coli, unter der Kontrolle des starken T7-Polymerase-Promotors in der Serie der pET-Vektoren exprimiert werden können. Jedoch war nur ein kleiner Bruchteil des rekombinanten CYP3A4 spektral aktiv. Desweiteren ist abzusehen, dass die Interaktion der P450 mit der P450-Reduktase noch weiter durch die Co-Expression der P450-Reduktase FMN-Domäne verbessert werden kann, von der kürzlich gezeigt wurde, dass sie die P450-Enzymaktivität in einem wieder hergestellten System stimuliert, das P450 und die P450-Reduktase enthält.
Zusammengefaßt haben wir eine allgemein gültige Methode für die effiziente bakterielle Expression von P450 entwickelt und gezeigt, dass diese Methode verwendet werden kann, um Bakterien zu erschaffen, die ein hoch funktionelles P450 abhängiges Mono-Oxygenase-System beinhalten. Diese Modelle werden wichtige kommerzielle Verwendung in der Arzneimittelentwicklung und der Biokatalyse finden.
Beispiel 3
Expression in Salmonella typhimurium
Die Co-Expression von P450 und den P450ern in bestimmten S. typhimurium Stämmen, wie z. B. TA1538 und TA1535, kann leicht von dem oben beschriebenen E. coli System übernommen werden. In beiden Spezies kann das selbe Vektorsystem eingesetzt werden. Der Vektor wird als erstes von den E. coli Stämmen, die für die Expression von P450 benutzt werden (z. B. JM109 oder DH5α), durch den E. coli Stamm LA5000 und von dort auf die S. typhimurium Stämme weitergegeben. Jedoch muß die Strategie für die Expression der P450er in den S. typhimurium Stämmen TA98 und TA100, die häufig für Mutagenitätstests verwendet werden, möglicherweise leicht modifiziert werden. TA98 und TA100 tragen das Plasmid pKM101, das die SOS-Reparatur in diesen Stämmen erhöht und damit gleichzeitig auch deren Sensitivität für Mutagene. Jedoch codiert dieses Plasmid auch für die Ampicillinnase. Für die Expression der P450er von dem Expressionsplasmid pCW ausgehend in diesen Stämmen muß der Ampicillinase-Marker auf pCW durch einen Tetracyclin-Resistenzmarker ersetzt werden. Ansonsten sind die Wachsumsbedingungen für und die Induktion der P450-Expression in S. typhimurium ähnlich dem E. coli System. Wir haben jedoch heraus gefunden, dass es wünschenswert ist, das Tetracyclin während der P450-Induktionsphase aus dem Wachstumsmedium weg zu lassen.
Beispiel 4
Expression von CYP3A4 und der P450-Reduktase in Escherichia coli und Salmonella typhimurium Stämmen mit veränderter Permeabilität der äußeren Membran
Materialien und Methoden
Bakterienstämme und Plasmide
Bei den benutzten E. coli K12 Stämmen handelte es sich um JM109 (Yanisch et al (1985) Gene 33, 103–19), AB1157 (Howard-Flanders et al (1964) Genetics 49, 237–246) und NS3878 (Chaterjee und Sternberg (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 8950–8954). Der S. typhimurium Stamm war TA1535 (Ames et al (1975) Mutat. Res. 31, 347–352) benutzt. NS3678 ist der Stamm AB1157 tolC (λLP1) und die tolC-Mutation beruht auf einer Tn/Otet^r-Insertion. TolC^–Mutanten sind extrem sensitiv gegen hydrophobe Agentien (Whitney (1970) Genetics 30, 39–59) und es wird vorgeschlagen, dass dieses Protein bei dem Zusammenbau von Lipopolysacchariden (LPS) in der äußeren Membran eine Rolle spielt (Schnaitmann und Klena (1993) Microbiol. Rev 57, 655–682). Der S. typhimurium Stamm TA1535 trägt eine rfa-Mutation und hat eine fehlerhafte äußere Membran. Die Co-Expression von CYP3A4 und der P450-Reduktase wurde durch die Verwendung des in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen pB216-Plasmides erreicht.
Co-Expression von CYP3A4 und der P450-Reduktase
Das für die Expression verwendete Protokoll war identisch mit den zuvor beschriebenen, mit der Ausnahme, dass für NS3678 [pB216] Tetracyclin (10 μg/l) in den Ausstrichplatten und in den über Nacht LB-Kulturen aber nicht in der „Terrific Broth" enthalten war. Der CYP3A4-Gehalt wurde in ganzen bakteriellen Zellen unter Verwendung von Fe²⁺-CO gegen Fe²⁺-Differenzspektren bestimmt.
Inkubation intakter Zellen mit CYP3A4-Substraten
Nach der üblichen 20–24 Stunden Induktion wurden die Zellen für 10 Minuten auf Eis gekühlt, bevor die Ernte durch Zentrifugation erfolgte. Die Zellen wurden dann ein Mal in einem gleichen Volumen einer eiskalten Lösung von 1 × M9-Salzen gewaschen, bevor sie in einem 1/10 Volumen von M9 + Glucose (10 mM) resuspendiert wurden. Es wurde die ganze Zeit darauf geachtet, die Zellen nicht heftigem Pepizieren auszusetzen. Die Zellsuspensionen wurden auf Eis gelagert, bis sie für die Inkubation mit CYP3A4-Substraten benötigt wurden, 50 μl wurden entnommen und einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen zugegeben, das 4,5 ml M9 + Glucose enthielt. Die Röhrchen wurden für 5–10 Minuten in einem Kreisschüttler bei 37°C vor-inkubiert, bevor die Reaktionen durch Zugabe von entweder Testosteron oder Nifedipin zu einer Endkonzentration von 200 μM initiiert wurden. Wenn benötigt, wurden 200 μl Zellsuspension entnommen und in 1,5 ml Eppendorf-Mikrozentrifugen-Reaktionsgefäß überführt, das 100 μl Methanol und 5 μl 60%-ige Perchlorsäure enthielt. Die Reaktionsgefäße wurden durch Invertieren gemischt und für 10 Minuten auf Eis gestellt, bevor die Zentrifugation zum Entfernen der Precipitate erfolgte. Die Überstände wurden in Mikrofläschchen für die HPLC-Analyse überführt. Die Metabolite wurden wie zuvor beschrieben aufgetrennt und der Gehalt an 6β-OHT oder an Nifedipinoxid in Bezug auf bekannte Standards berechnet.
Ergebnisse
Die Expression von CYP3A4 und der P450-Reduktase in den vier Stämmen
Die Raten der P450-Expression und der P450-Reduktase-Aktivität sind in Tabelle A dargestellt. Der CYP3A4-Gehalt in NS3678 [pB216] Zellen ist signifikant niedriger als in den anderen drei Stämmen, typischerweise um 30 nmol/l. Die Gründe hierfür sind unklar und für die Expression in diesem Stamm ist weitere Optimierung nötig.
Tabelle A Expressionsraten von CYP3A4 in und CYP3A4 abhängiger Stoffwechsel von Testosteron und Nifedipin durch intakte JM109, AB1157, NS3678 und TA1535 pB216 Zellen
Der P450-Gehalt wurde mit Fe²⁺-CO gegen Fe²⁺-Differenzspektren gemessen. Die Gehalte sind als Mittelwerte aus mindestens drei Experimenten ± Standardabweichung dargestellt.
Die Umsatzzahlen wurden in nmol des gebildeten Produkts pro Minute und pro nmol P450 aufgezeichnet und sind ± Standardweichung dargestellt. Bei den detektierten Produkten handelte es sich um 6β-Hydroxytestosteron und Nifedipinoxid.
Stoffwechsel von Testosteron und Nifedipin durch intakte E. coli und S. typhimurium Stämme, die CYP3A4 und die P450-Reduktase exprimieren
Die Umsätze von Testosteron und Nifedipin durch die vier Stämme sind in Tabelle A dargestellt. In vorangegangenen Arbeiten war unter Verwendung von JM109 [pB216] gezeigt worden, dass der Metabolismus von Testosteron zu vernachlässigen war, falls die Zellen nicht in einem EDTA enthaltenden Puffer (TSE) re-suspendiert und anschließend osmotischem Schock ausgesetzt wurden. Dies wurde hier bestätigt, da der Umsatz nach 10 Minuten Inkubation lediglich 0,15 nmol 6β-OHT/nmol P450/min betrug. Im Gegensatz dazu waren die Testosteron-Stoffwechsel in den beiden anderen E. coli Stämmen wesentlich umfangreicher, wobei NS3678 [pB216] mit einem Umsatz von 15,3, der 100-fach höher als in JM109 [pB216] ist, besonders eindrucksvoll war. Auch der S. typhimurium Stamm TA1535 [pB216] zeigte mehr Aktivität an Testosteron als JM109 [pB216], jedoch nur um einen Faktor 3 bis 4. Die Umsätze von Nifedipin folgten einem ähnlichen Muster, obwohl die Unterschiede zwischen den Stämmen nicht so markant wie mit Testosteron ausfielen. Die E. coli Stämme NS3678 [pB216] und AB1157 [pB216] zeigten wieder die höchsten Aktivitäten bei etwa 18 nmol Nifedipinoxid/nmol P450/min, wobei die Umsätze von TA1535 [pB216] bzw. JM109 [pB216] etwa um das 3 bzw. 15-fache niedriger ausfielen.
Die Ergebnisse der Inkubationen über den Verlauf der Zeit mit den beiden Substraten Nifedipin bzw. Testosteron sind in den 17 bzw. 18 dargestellt. In den beiden am umfangreichsten metabolisierenden Stämmen, AB1157 und NS3678 dauert die Ansammlung der Stoffwechselprodukte für 1–2 Stunden an und liefert eine Metabolit-Endkon zentration im Bereich von 30–40 μM, was einen Ertrag von 20–30% darstellt. Der Verlust der Linearität nach näherungsweise 1 Stunde Inkubation kann möglicherweise auf den Verlust von CYP3A4 oder auf Metabolitinhibition zurückgeführt werden.
Diskussion
Die in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Arbeiten zeigen, dass JM109, der routinemäßig für die Expression eingesetzte E. coli Stamm, unfähig war, während der Co-Expression von CYP3A4 und der Reduktase die Hydroxylierung von Testosteron zu katalysieren, es sei denn, die Zellen wurden einem osmotischen Schock in TSE-Puffer ausgesetzt. Dieses Fehlen von Stoffwechsel beruht fast mit Sicherheit auf der Undurchlässigkeit der äußeren E. coli Membran für große hydrophobe Moleküle (Nikaido und Vaara (1985) Microbiol. Rev 49, 1–32) und macht diesen Stamm ungeeignet für die Bildung großer Mengen von bestimmten P450-Metaboliten in Bioreaktorsystemen. Es ist abzusehen, dass die Permeabilität der äußeren Membran nicht für alle P450-Substrate problematisch sein wird, z. B. haben wir festgestellt, dass der Umsatz von 7-Ethoxyresorufin in intakten JM109, die CYP1A2 und die P450-Reduktase exprimieren, vergleichbar mit dem in osmotisch geschockten Zellen ist (Daten nicht gezeigt). Es ist bekannt, dass E. coli Stämme, wie z. B. NS3678, die eine Mutation im tolC-Gen tragen, hypersensitiv auf hydrophobe Agentien sind und es wurde vorhergesagt, dass auch die Permeabilität für P450-Substrate erhöht werden würde. Basierend auf den extrem hohen Umsätzen von Testosteron und Nifedipin durch NS3678 [pB216] im Verhältnis zu JM109 [pB216] scheint dies der Fall zu sein. Zur Zeit sind die P450-Expressionsraten im Stamm NS3678 relativ niedrig. Wir gehen davon aus, dass diese durch Optimierung der Wachstumsbedingungen verbessert werden können. Jedoch sind die Expressionsraten im Elternstamm AB1157 [pB216] vergleichbar mit denen in JM109 [pB216] mit dem Vorteil, dass der Substratumsatz wesentlich höher ist. Wir glauben, dass dies auf der von diesem Stamm getragenen rfbD1-Mutation beruht, die eine teilweise deffekte äußere Membran verleiht. Unsere Arbeiten stellen das erste Beispiel für die Expression eines funktionellen P450-Mono-Oxygenase-Systems in „permeablen" E. coli Stämmen dar. Das hier beschriebene System wird für die Expression aller P450 anwendbar sein und wird die Produktion einer großen Bandbreite von P450-Metaboliten in „Bioreaktor"-Systemen ermöglichen.
Zusammenfassung
E. coli JM109 oder DH5α, die P450 zusammen mit der P450-Reduktase co-exprimieren, verstoffwechselten Substrate nur nach Behandlung mit Puffer (TSE), der die Permeabilität der Membranen veränderte. Wir haben diese Enzyme nun in S. typhimurium TA1535 und in E. coli Stämmen mit permeablen Zellwänden exprimiert. Wir konnten desweiteren zeigen, dass der Stoffwechsel von Substraten in der Anwesenheit einer physiologischen Brühe (Minimalmedium + Glucose) für mehr als 60 Minuten linear verläuft, bei Umsatzraten, die sich jenen annähern, die bei der Verwendung von in TSE-Puffer re-suspendierten Zellen gefunden wurden.
Beispiel 5
Co-Expression von ompA- und ompA(+2)-P450 mit Reduktase
Materialien und Methoden
Plasmide
Zwei P450-Expressions-Plasmide, pCW/ompA(+2)-CYP3A4 und pCW/ompA(+2)-CYP2A6 wurden konstruiert. In beiden Fällen wurde PCR benutzt, um zwischen dem OmpA-Signalpeptid und dem P450 N-Terminus einen Dipeptid-„Linker" (-Ala-Pro-) einzufügen, der den ersten beiden Aminosäuren des reifen OmpA-Proteins entspricht. Um für die N-terminale Sequenzanalyse eine einfache Reinigung des rekombinanten CYP3A4 durch Affinitätschromatographie (siehe unten) zu ermöglichen, wurden auch noch zwei weitere Plasmide, pCW/ompA-CYP3A4(His)₆ und pCW/ompA(+2)-CYP3A4(his)₆ konstruiert, in denen sechst Histidinreste an den C-Terminus des P450 angehängt wurden.
Methodik der Co-Expression
Die grundlegenden Techniken für die Co-Expression von P450 und der Reduktase von getrennten kompAtiblen Plasmiden aus, wurden bereits in den vorhergehenden Beispielen beschrieben.
Coumarin 7-Hydroxylat Studie
Membran-Studien wurden in einem Gesamtvolumen von 500 μl in 100 mM Tris-HCl (pH 7,4) durchgeführt, das 20 pmol CYP2A6, 50 μM Coumarin und ein NADPH generierendes System (zuvor beschrieben in Beispiel 1) enthielt. Untersuchungen bakterieller Zellen wurden in TSE-Puffer in einem Gesamtvolumen von 5 ml durchgeführt und enthielten 50 pmol CYP2A6 pro ml Inkubation und 50 μM Coumarin. Proben (500 μl) wurden in Intervallen entnommen und auf Metabolitbildung hin untersucht. Die Bearbeitung der Proben aus Zell- und Membranuntersuchungen verlief identisch: Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 72 μl 12,5%-iger Trichloressigsäure unterbrochen und wurden dann auf Eis gestellt. Danach wurde Dichloromethan zugegeben (1 ml) und die Röhrchen wurden kräftig gevortexed. Im Anschluß an die Zentrifugation zur Trennung der beiden Phasen wurde die obere (wässrige) Schicht verworfen. Ein Aliquot (500 μl) der unteren, organischen Phase wurde dann in ein frisches Röhrchen überführt, welches 3 ml 30 mM Natriumborat-Puffer (pH 9,0) enthielt. Die Röhrchen wurden dann erneut gevortexed und zentrifugiert. Das Metabolit in der oberen (wässrigen) Phase wurde dann fluorometrisch quantifiziert unter Verwendung von Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen von 358 bzw. 458 nm, mit „Authentic Standard" als Referenz (Umbelliferone, Sigma).
Reinigung von rekombinantem P450 und N-terminale Sequenzanalyse
Die Expression ausgehend von pCW/ompA-CYP3A4(His)₆ und pCW/ompA(+2)-CYP3A4(His)₆ wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Im Anschluß an die Lysozym-Behandlung und die Zentrifugation der Zellen wurden die Spheroplasten in Bindepuffer re-suspendiert (20 μM Kaliumphosphat, pH 7,4, das 500 μM Kaliumchlorid und 20% Glycerol (v/v) enthielt) und bei –70°C gelagert. Aus 125 ml Kutlur stammende Spheroplasten wurden typischerweise in 9 ml Puffer re-suspendiert. Für die P450-Reinigung wurden die Spheroplasten auf Eis aufgetaut und in der Gegenwart der Protease-Inhibitoren Aprotinin (1 μg/ml), Leupeptin (1 μg/ml) und PMSF (1 mM), unter Verwendung eines MSE SoniPrep 150 Sonicators bei 70% Leistung sonifiziert. Nach der Zentrifugation (1,2 × 10⁴ g 12 min, 4°C) wurden die Proteine im Überstand durch Rühren in der Anwesenheit von Emulgen 911 (1 mg/mg Protein) bei 4°C für 60 Minuten löslich gemacht. Die Mischung wurde durch Zentrifugation (10⁵ g, 60 min, 4°C) klar gemacht und dann auf eine Hi-Trap Chelat bildende Säule (Pharmacia) geladen, die mit Nickelionen geladen und dann mit Bindepuffer, der 0,10% Emulgen 911 (w/v) enthält, pre-equillibriert worden war. Die Säule wurde mit zehn weiteren Säulen-Volumen-Bindepuffer (enthält Emulgen 911) gewaschen und dann wurden schwach bindende Proteine mit fünf Säulen-Volumen-Waschpuffer (Bindepuffer, der 0,10% Emulgen 911 (w/v) und 75 mM Imidazol enthält) entfernt. Die rote P450-Bande wurde mit Elutionspuffer (Bindepuffer, der 0,10% Emulgen 911 (w/v) und 1 M Imidazol enthält) eluiert – die Imidazolkonzentration wurde hoch gehalten, um P450 in ein Volumen so klein wie möglich zu eluieren. Die Proteinprobe wurde über Nacht bei 4°C gegen mehrfach gewechselten Anionaustauschpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, der 20% Glycerol (v/v), 0.2 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA und 0,10% Emulgen 911 (w/v) enthält) dialysiert und dann auf eine Hi-Trap Q-Säule (Pharmacia) geladen. Die das P450 enthaltende Durchflussfraktion wurde dann auf eine Econo-Pac^® HTP-Kartusche (Bio-Rad), die mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 20% Glycerol (v/v), 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 0,05% Natriumchelat (w/v) enthält, equillibriert worden war. Die Natriumphosphatkonzentration wurde während dem Waschen der Säule zunächst auf 25 mM und dann auf 100 mM erhöht, wobei P450 bei 400 mM Phosphat eluiert. Die Reinheit der P450-Präparation wurde für jedes Stadium der Prozedur durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese bewertet, auf 9% Acrylamid (w/v) Gelen, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue R-250. Das N-terminale Sequenzieren, gereinigte Proteine wurden dann auf Pro-Blot Polyvinylidenfluorid-Membranen (Applied Biosystems) transferiert und gefärbt. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse wurde im Department of Biochemistry, University of Dundee, unter Verwendung eines Modell 476A-Gerätes (Applied Biosystems) mit vier bis 6 Zyklen Edman-Abbau durchgeführt.
Ergebnisse
Co-Expression von ompA-P450 mit Reduktase
Wie zuvor berichtet, interagiert das von pCW/ompA-CYP2D6 aus exprimierte P450 gut mit der co-exprimierten Reduktase, wodurch typische CYP2D6-abhängige Aktivitäten katalysiert werden (siehe Beispiel 2). Für ompA-CYP2D6 gemessene Umsätze waren, für gewöhnlich, leicht höher als die für das entsprechende pCW/17α-CYP2D6-Konstrukt gemessenen (Daten nicht gezeigt).
Wir haben seither eine Anzahl anderer ompA-P450er zusammen mit Reduktase in E. coli co-exprimiert, auch CYP3A4 und CYP2A6. Im Gegensatz zu CYP2D6 scheinen diese beiden ompA-P450er nicht so effizient wie die entsprechenden 17α-P450er mit der Reduktase zu interagieren, da die Enzym-Aktivitäten in Bezug auf Testsubstrate für gewöhnlich geringer ausfallen. Zum Beispiel sind die Coumarin 7-Hydroxylat-Aktivitäten sowohl für Zellen als auch für Membranen mit ompA-CYP2A6 um mehr als eine Größenordnung geringer, als vergleichsweise mit 17α-CYP2A6 (Tabelle B). In ähnlicher Weise ist bei CYP3A4 die Testosteron 6β-Hydroxylase-Aktivität in den Membranfraktionen mit dem ompA-Konstrukt reduziert (Tabelle C). Interessanterweise kann jedoch bemerkt werden, dass dieser Unterschied zwischen den beiden Konstrukten nicht mehr vorhanden ist, wenn Nifedipin, ein anderes Testsubstrat benutzt wird (Tabelle C). Dies betont die Notwendigkeit, wann immer möglich, mehrerer Markeraktivitäten zu benutzen.
Tabelle B Erträge und Aktivitäten von CYP2A6, das mit Reduktase in zwei Plasmidsystemen co-exprimiert wurde
Soweit möglich, sind die Werte basierend auf mindestens drei unabhängigen Bestimmungen als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt.
Cytochrom P450 wurde durch Fe²⁺-CO gegen Fe²⁺-Differenzspektroskopie quantifiziert in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, das 20% (v/v) Glycerol, 10 mM CHAPS und 1 mM EDTA enthält.
Um zu versuchen, eine Erklärung für den relativen Mangel an Interaktion zwischen den ompA-P450ern mit der Reduktase zu finden, wurden sechs Histidinreste an den C-Terminus des von pCW/ompA-CYP3A4 aus exprimierten P450 angehängt. Dies erlaubte eine einfache Reinigung des rekombinanten Proteins durch Nickelchelat-Affinitätschro matographie (beschrieben in Materialien und Methoden). Dies zeigte, dass das ompA-P450 nicht die erwartete Verarbeitung durch die bakterielle Signalpeptidase durchlief und dass das Signalpeptid beibehalten wurde. Darin könnte sich die allgemeine Rate der Überexpression von P450 wiederspiegeln, da bekannt ist, dass die Verfügbarkeit der Signalpeptidase besonders für Hybridvorläufer mit niedrigen Prozessierungseffizienzen limitierend sein kann (Van Dijl et al (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40–48).
Ein weiterer Faktor der die Aktivität der Signalpeptidase stark beeinflusst, ist die Struktur um die Stelle der Signalabtrennung (Duffaud und Inoyue (1988) J. Biol. Chem. 263, 10224–10228; Barkocy-Gallagher et al (1994) J. Biol. Chem. 269, 13609–13613), die auch die ersten paar Aminosäuren nach dem Signalpeptid beinhaltet (Barkocy-Gallagher und Bassford (1992) J. Biol. Chem. 267, 1231–1238; Nilsson und von Heijne (1992) FEBS Lett. 299, 243–246). Die Überexpression von Proteinen mit nicht abtrennbaren Signalpeptiden kann den Translokationsapparat einer Zelle komplett blockieren, was zu einer Ansammlung von Proteinvorläufern führt (Barkocy-Gallagher und Bassford (1992) J. Biol. Chem. 267, 1231–1238). Bei unseren Konstrukten handelt es sich bei der Sequenz, die unmittelbar auf das Signalpeptid folgt, um den CYP3A4 N-Terminus. Bei der Aminosäure an Position +1, relativ zur Schnittstelle, wird es sich demzufolge um Methionin handeln, wohingegen in bakteriellen Genen Alanin an dieser Position stark bevorzugt wird (von Heijne (1986) Nucl. Acids Res. 14, 4683–4690).
Wir können daher drei mögliche Strategien in Aussicht stellen, um die Wahrscheinlichkeit der Abtrennung des Signalpeptides zu verbessern. Erstens könnte die bakterielle Signalpeptidase von einem separaten, kompAtiblen Plasmid aus, von denen bereits einige beschrieben wurden (van Dijl et al (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40–48; Dalbey und Wickner (1985) J. Biol. Chem. 260, 15925–15931; March und Inouye (1985) J. Biol. Chem. 260, 7206–7213) überexprimiert werden. Als Alternative zu oder möglicherweise in Verbindung mit dieser ersten Methode könnte es auch ratsam sein, eine kurze „Linker" Sequenz zwischen das Signalpeptid und das P450 einzuführen, obwohl dies Nachteile bei der Produktion eines P450 mit einer kurzen N-terminalen Verlängerung ergeben könnte. Schließlich könnten wir die Expression in einem anderen Bakterienstamm versuchen, da bereits gezeigt wurde, dass dies das Ausmaß der Entfernung von Signalpeptiden von Hybridfusionsproteinen beeinflusst (Monteilhet et al (1993) Gene 125, 223–228).
Um zu versuchen, dieses Problem der Signalzurückhaltung zu umgehen, haben wir uns deshalb entschieden, die Schnittstelle durch Einführung der ersten beiden Aminosäuren des reifen OmpA-Proteins (-Ala-Pro-) zwischen dem ompA Leader und dem N-Terminus des P450 zu modifizieren. Dies führte zu den Konstrukten pCW/ompA(+2)+CYP2A6 und pCW/ompA(+2)-CYP3A4 (oben beschrieben). Im Gegensatz zu den ompA-P450ern schienen diese ompA(+2)-P450er effektiver mit der co-exprimierten Reduktase zu interagieren, was zu höheren Substratumsätzen führte (Tabellen B und C). Das von pCW/ompA(+2)-CYP3A4(His)₆ aus exprimierte rekombinante Protein wurde anschließend gereinigt und der N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen. Dabei zeigte sich, dass das Protein nun von der bakteriellen Signalpeptidase korrekt prozessiert wurde, was zu einer Anhäufung von nativem CYP3A4, welches Ala-Pro- am N-Terminus enthielt, in bakteriellen Membranen führte.
Tabelle C Erträge und Aktivitäten von CYP3A4, das zusammen mit Reduktase in zwei Plasmidsystemen exprimiert wurde
Soweit möglich, sind die Werte basierend auf mindestens drei unabhängigen Experimenten als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt.
Cytochrom P450 wurde durch Fe²⁺-CO gegen Fe²⁺-Differenzspektroskopie quantifiziert, in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, das 20% (v/v) Glycerol, 10 mM CHAPS und 1 mM EDTA enthält.
Zusammenfassung
Die direkte Fusion der ompA Leader Sequenz mit P450 resultiert nicht immer in einem P450-Isoenzym, das mit co-exprimierter Reduktase interagiert. Die Veränderung der Aminosäurereste an der potentiellen Schnittstelle der, an die P450-Sequenz fu-ionierten, ompA-Sequenz, resultiert in Interaktion und in effizienter Entfernung der Leader Sequenz.

Claims

Bakterielle Zelle, die ein funktionales Cytochrom-P450-Monooxygenase-System enthält, wobei die Zelle ein genetisches Konstrukt enthält, das in der Lage ist, ein Cytochrom P450 zu exprimieren, und ein genetisches Konstrukt, das in der Lage ist, getrennt vom Cytochrom P450 eine Cytochrom-P450-Reduktase zu exprimieren, wobei sowohl das Cytochrom P450 als auch die Cytochrom-P450-Reduktase an ihrem N-Terminus ein bakterielles Signalpeptid aufweisen.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 1, bei der die Zelle eine bakterielle Zelle aus der Familie der Enterobacteriaceae ist.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Cytochrom P450 ein Mitglied einer der Cytochrom-P450-Familien CYP1, CYP2, CYP3 oder CYP4 ist.
Bakterielle Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das Cytochrom P450 eines aus den Cytochrom-P450-Subfamilien CYP1A, CYP1B, CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2D, CYP2E, CYP3A, CYP4A oder CYP4B ist.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 4, bei der das Cytochrom P450 eines der Cytochrome P450 CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2D9, CYP2A6 und CYP2E1 ist.
Bakterielle Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Cytochrom-P450-Reduktase eine menschliche Cytochrom-P450-Reduktase ist.
Bakterielle Zelle nach einem der Ansprüche 2 bis 6, bei der die Zelle eine Escherichia coli Zelle oder eine Salmonella typhimurium Zelle ist.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 1, bei der das bakterielle Signalpeptid eines der Signalpeptide ompA, pelB, malE oder phoA oder eine funktional äquivalente Variante hiervon ist.
Bakterielle Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das bakterielle Signalpeptid an dem Cytochrom P450 das gleiche ist wie das bakterielle Signalpeptid an der Cytochrom-P450-Reduktase.
Bakterielle Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weiterhin ein genetisches Konstrukt enthält, das in der Lage ist, einen Polypeptid-Kofaktor zu exprimieren, der die korrekte Faltung des Cytochroms P450 oder der Cytochrom-P450-Reduktase unterstützt.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 10, bei der der Polypeptid-Kofaktor ein molekulares Chaperon ist.
Bakterielle Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weiterhin ein genetisches Konstrukt enthält, das in der Lage ist, einen Polypeptid-Kofaktor zu exprimieren, der den Transfer von Elektronen zwischen dem Cytochrom P450 und der Cytochrom-P450-Reduktase unterstützt.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 12, bei der der Kofaktor, der den Transfer von Elektronen zwischen dem Cytochrom P450 und der Cytochrom-P450-Reduktase unterstützt, Cytochrom b₅ oder die FMN-Domäne einer Cytochrom-P450-Reduktase ist.
Bakterielle Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weiterhin ein genetisches Konstrukt enthält, das in der Lage ist, irgend ein Enzym zu exprimieren, das in der Lage ist, das Produkt einer durch das Cytochrom-P450-Monooxygenase-System katalysierten Reaktion zu metabolisieren.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 14, bei der das Enzym eine Glutathion-S-Transferase, eine Epoxyd-Hydrolase oder eine UDP-Glucuronosyl-Transferase ist.
Bakterielle Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase durch unterschiedliche genetische Konstrukte kodiert werden.
Bakterielle Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei der das Cytochrom P450 und die Cytochrom-P450-Reduktase durch das gleiche genetische Konstrukt kodiert werden.
Bakterielle Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Zelle für eine Verbindung durchlässig ist, die ein Substrat des Cytochrom-P450-Monoxygenase-Systems ist.
Verfahren zum Umwandeln eines Substrats für Cytochrom P450 in ein Produkt, wobei das Verfahren das Zusammenmischen des Substrats und einer bakteriellen Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfasst, wobei diese Zelle ein funktionales Cytochrom-P450-Monooxygenase-System enthält, das dieses Substrat umwandeln kann.
Verwendung einer bakteriellen Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Umwandlung eines Substrats eines Cytochroms P450 in ein Produkt.
Bakterielle Zelle, die ein Cytochrom P450 enthält, das ein genetisches Konstrukt umfasst, das das Cytochrom P450 kodiert und in der Lage ist, dieses zu exprimieren, wobei das Cytochrom P450 an seinem N-Terminus ein bakterielles Signalpeptid aufweist.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 21, bei der das bakterielle Signalpeptid eines der Signalpeptide ompA, pelB, malE oder phoA oder eine funktional äquivalente Variante hiervon ist.
Bakterielle Zelle nach einem der Ansprüche 21 oder 22, bei der das Cytochrom P450 weiterhin eine Peptidsequenz umfasst, die die Reinigung des Cytochrom P450 aus der bakteriellen Zelle unterstützt.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 23, bei der die Peptidsequenz eine Bindungsstelle für eine Verbindung aufweist.
Bakterielle Zelle nach Anspruch 24, bei der die Peptidsequenz -(His)_n ist, wobei n ≥ 4 gilt und die Verbindung Nickel ist.
Bakterielle Zelle nach einem der Ansprüche 21 bis 25, bei der die Zelle eine bakterielle Zelle der Familie der Enterobacteriaceae ist.
Bakterielle Zelle nach einem der Ansprüche 21 bis 26, bei der das Cytochrom P450 ein in einem der Ansprüche 3 bis 5 definiertes Cytochrom P450 ist.
Verfahren zur Aufbereitung von Cytochrom P450, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer ausreichenden Menge von Zellen nach einem der Ansprüche 21 bis 27 und (b) Abtrennen des Cytochrom P450 von den anderen zellulären Kompartimenten.
Genetisches Konstrukt, das in der Lage ist, ein Cytochrom P450 zu exprimieren, wobei das Cytochrom P450 an seinem N-Terminus ein bakterielles Signalpeptid aufweist.
Vielzahl von bakteriellen Zellen nach Anspruch 1, wobei jede Zelle ein genetisches Konstrukt oder genetische Konstrukte enthält, die verschiedene Kombinationen von Cytochrom P450 und Cytochrom-P450-Reduktase oder weitere Kombinationen von anderen Polypeptiden kodieren.
Vielzahl von bakteriellen Zellen nach Anspruch 21, wobei jede Zelle ein genetisches Konstrukt enthält, das ein anderes Cytochrom P450 kodiert.