DE10014085A1 - Neue Cytochrom P450-Monooxygenasen und deren Verwendung zur Oxidation von organischen Verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Cytochrom P450-Monoxygenasen mit verändertem Substratprofil, dafür kodierende Nukleotidsequenzen, diese Sequenzen enthaltende Expressionskonstrukte und Vektoren, damit transformierte Mikroorganismen, Verfahren zur mikrobiologischen Oxidation verschiedener organischer Substrate wie beispielsweise Verfahren zur Herstellung von Indigo und Indirubin.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Cytochrom P450-Monoxy­ genasen, welche zur Oxidation verschiedener organischer Sub­ strate, wie z. B. N-heterocyclischer aromatischer Verbindungen, befähigt sind, dafür kodierende Nukleotidsequenzen, diese Se­ quenzen enthaltende Expressionskonstrukte und Vektoren, damit transformierte Mikroorganismen, Verfahren zur mikrobiologi­ schen Oxidation N-heterocyclischer aromatischer Verbindungen und insbesondere Verfahren zur Herstellung von Indigo und In­ dirubin.

Enzyme mit neuartigen Funktionen und Eigenschaften können ent­ weder durch Screening natürlicher Proben oder durch Protein Engineering bekannter Enzyme bereitgestellt werden. Die letzt­ genannte Methode kann unter Umständen die geeignetere sein, um Eigenschaften zu induzieren, deren Generierung auf dem Wege natürlicher Selektion unwahrscheinlich ist. Trotz zahlreicher Anstrengungen zum Engineering von Enzymen gibt es bisher nur wenige erfolgreiche Studien zur Förderung der katalytischen Aktivität von Enzymmutanten bezüglich eines bestimmten Sub­ strates (1-10). In diesen bekannten Fällen sind die Substrate strukturell eng verwandt mit dem nativen Substrat des jeweili­ gen Enzyms. Bisher gibt es keine Berichte über ein erfolgrei­ ches Engineering von Enzymen, welche nach der Modifikation die Umsetzung einer Verbindung katalysieren, welche strukturell völlig verschieden vom nativen Substrat des Enzyms ist.

Die aus dem Bakterium Bacillus megaterium isolierbare Cyto­ chrom P450-Monoxygenase katalysiert gewöhnlich die subtermina­ le Hydroxylierung langkettiger, gesättigter Säuren und der entsprechenden Amide und Alkohole davon oder die Epoxydation ungesättigter langkettiger Fettsäuren oder gesättigter Fett­ säuren mit mittlerer Kettenlänge (11-13). Die optimale Ketten­ länge gesättigter Fettsäuren beträgt 14 bis 16 Kohlenstoff­ atome. Fettsäuren mit einer Kettenlänge von weniger als 12 werden nicht hydroxyliert (11).

Die Struktur der Häm-Domäne von P450 BM-3 wurde durch Röntgen­ strukturanalyse bestimmt (14-16). Die Substratbindungsstelle liegt in Form einer langen tunnelartigen Öffnung vor, welche von der Moleküloberfläche bis hin zum Häm-Molekül reicht und wird fast ausschließlich von hydrophoben Aminosäureresten be­ grenzt. Die einzigen geladenen Reste an der Oberfläche der Häm-Domäne sind die Reste Arg47 und Tyr51. Man nimmt an, daß diese an der Bindung der Carboxylatgruppe des Substrates durch Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind (14). Die Mutation von Arg47 zu Glu bewirkt eine Inaktivierung des Enzyms für Arachidonsäure (13), erhöht jedoch dessen Aktivität gegenüber C₁₂-C₁₄-Alkyltrimethylammonium-Verbindungen (17). Eine Substratnutzung für aromatische Verbindungen, insbesondere ein-, zwei- oder mehrkernige, gegebenenfalls heterocyclische, Aromaten, Alkane, Alkene, Cycloalkane und -alkene, wurde für dieses Enzym nicht beschrieben. Es wurde deshalb bisher in der Fachwelt angenommen, daß andere als die bisher beschriebenen organischen Substrate, wie z. B. Indol, aufgrund der deutlichen strukturellen Unterschiede zu den nativen Substraten von P450 BM-3, insbesondere aufgrund des Fehlens funktioneller Gruppen, welche an die oben erwähnten Reste in der Substrattasche bin­ den könnten, keine Substrat darstellen.

Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Cyto­ chrom P450 Monoxygenasen mit veränderter Substratspezifität oder verändertem Substratprofil bereit zu stellen. Insbesonde­ re sollten Monoxygenase-Mutanten bereitgestellt werden, welche im Vergleich zu dem nichtmutierten Enzym mit strukturell deut­ lich anderen Substraten enzymatisch aktiv sind.

Diese Aufgabe konnte überraschenderweise gelöst werden durch neuartige Cytochrom P450 Monoxygenasen, welche z. B. zur Oxida­ tion N-heterocyclischer zwei- oder mehrkerniger armotischer Verbindungen befähigt sind.

Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung solche Monoxygenasen, deren Substrat-bindender Bereich durch ortsspezifische Mutagenese zur funktionalen Aufnahme neuer, wie z. B. N-hetero­ cyclischenr Substrate, befähigt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die neuen Monoxygenase löslich, d. h. in nicht-membrangebundener Form existent, und in dieser Form enzymatisch aktiv.

Die erfindungsgemäßen Monoxygenasen sind vorzugsweise abgelei­ tet von Cytochrom P450 Monoxygenasen bakteriellen Ursprungs, wie insbesondere abgeleitet von Cytochrom P450 Monoxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, welche wenigstens eine funktionelle, d. h. die Oxidation neuer organischer Substrate, wie z. B. N-heterocycli­ scher zwei- oder mehrkerniger armotischer Verbindungen, för­ dernde Mutation, in einem der Aminosäuresequenzbereiche 172-224 (F/G-loop-Bereich), 39-43 (β-strand 1), 48-52 (β-strand 2), 67-70 (β-strand 3), 330-335 (β-strand 5), 352-356 (β- strand 8), 73-82 (helix 5) und 86-88 (helix 6) aufweist.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Cytochrom P450 Monoxygenase-Mutanten, sind bevorzugt zu wenigstens einer der folgenden Reaktionen befähigt:

• a) Oxidation gegebenenfalls substituierter N-, O- oder S-heterocyclischer ein-, zwei- oder mehrkerniger armotischer Verbindungen;
• b) Oxidation gegebenenfalls substituierter ein- oder mehrkerniger Aromaten;
• c) Oxidation geradkettiger oder verzweigter Alkane und Alkene; und
• d) Oxidation gegebenenfalls substituierter Cycloalkane und Cycloalkene

Besonders bevorzugten Monoxygenase-Mutanten dieses Typs sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der folgenden ein- oder mehrfachen Aminosäuresubstitutionen aufweist:

• 1. Phe87Val;
• 2. Phe87Val, Leu188Gln; oder
• 3. Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;

sowie funktionale Äquivalente davon. Der Zahlenwert gibt dabei die Position der Mutation an; vor dem Zahlenwert steht die ursprüngliche, hinter dem Zahlenwert die neu eingeführte Ami­ nosäure.

Funktionale Äquivalente oder Analoga der konkret offenbarten Mutanten sind in diesem Zusammenhang davon verschiedene Mutan­ ten, welche weiterhin die gewünschte Substratspezifität im Rahmen wenigstens einer der oben bezeichneten Oxidationsreak­ tionen a) bis d), also beispielsweise gegenüber heterozykli­ schen Aromaten, besitzen und z. B. Indol hydroxylieren.

Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß auch Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Amino­ säuresubstitution aufweisen, aber trotzdem zu einer Mutante führen, die ebenso wie die konkret genannte Mutante ein gegen­ über dem Wildtypenzym "verändertes Substratprofil" zeigen und wenigstens eine der oben genannten Oxidationsreaktionen kata­ lysieren. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Veränderungen im Reaktivitätsmuster qualita­ tiv übereinstimmen, d. h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch P450- Monooxygenase-Mutanten, welche in gleicher Weise wie die kon­ kret genannten P450 BM3-Mutanten durch Mutation von P450-Enzy­ men aus anderen Organismen zugänglich sind. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenz­ regionen festlegen. Mit den modernen Methoden des Molecular Modeling können dann in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente, das Reaktionsmuster beeinflussende Mutationen vorgenommen werden.

"Funktionale Äquivalente" umfassen ebenso die durch eine oder mehrere zusätzliche Aminosäure-Additionen, -Substituenten, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten zusätzlichen Veränderungen in jeglicher Sequenz­ position auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit "verändertem Substratprofil" im obigen Sinne führen.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe a) sind gege­ benenfalls substituierte heterocyclische ein-, zwei- oder mehrkernigen armotischen Verbindungen; insbesondere oxidier­ bare oder hydroxylierbare N-, O- oder S-heterocyclische ein-, zwei- oder mehrkernige aromatische Verbindungen. Sie umfassen vorzugweise zwei oder drei, insbesondere zwei, vier- bis sie­ bengliedrige, insbesondere sechs- oder fünfgliedrige, konden­ sierte Ringe, wobei wenigstens einer, vorzugsweise alle Ringe aromatischen Charakter besitzen und wobei wenigstens einer der aromatischen Ringe ein bis drei, vorzugsweise ein N-, O- oder S-Heteroatom im Ring trägt. In der gesamten Ringstruktur kön­ nen gegebenenfalls ein oder zwei weitere gleiche oder ver­ schiedene Heteroatome enthalten sein. Die aromatischen Verbin­ dungen können weiterhin 1 bis 5 Substituenten an den Ring- Kohlenstoff- oder an den Heteroatomen tragen. Beispiele für geeignete Substituenten sind C₁ bis C₄-Alkyl, wie Methyl, Et­ hyl, n- oder i-Propyl oder n-, i- oder t-Butyl oder C₂ bis C₄- Alkenyl, wie Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2- Butenyl oder 3-Butenyl, Hydroxyl und Halogen, wie F, Cl, und Br. Die genannten Alkyl- oder Alkenylsubstituenten können ge­ gebenenfalls auch eine Keto- oder Aldehydgruppe aufweisen; Beispiele hierfür sind Propan-2-on-3-yl, Butan-2-on-4-yl, 3- Buten-2-on-4-yl. Nichtlimitierende Beispiele für geeignete heterocyclische Substrate sind insbesondere zweikernige Hete­ rocyclen, wie Indol, N-Methylindol und die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga da­ von, wie z. B. 5-Chlor- oder 5-Brom-indol; sowie Chinolin und Chinolinderivate, wie z. B. 8-Methylchinolin, 6-Methylchinolin und Chinaldin; und Benzothiophen und die mit ein bis drei Sub­ stituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon. Außerdem seien genannt dreikernige Heteroaromaten wie Acridin und die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe b) sind gegebenenfalls substituierte ein- oder mehrkernige, insbeson­ dere ein- oder zweikernige Aromaten, wie Benzol und Naphtha­ lin. Die aromatischen Verbindungen können gegebenenfalls ein oder mehrfach substituiert sein und z. B. 1 bis 5 Substituenten an den Ring-Kohlenstoffatomen tragen. Beispiele für geeignete Substituenten sind C₁ bis C₄-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, n- oder i-Propyl oder n-, i- oder t- Butyl, oder C₂ bis C₄-Alkenyl, wie Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl oder 3- Butenyl, Hydroxyl und Halogen, wie F, Cl, und Br. Die genann­ ten Alkyl- oder Alkenylsubstituenten können gegebenenfalls auch eine Keto- oder Aldehydgruppe aufweisen; Beispiele hier­ für sind Propan-2-on-3-yl, Butan-2-on-4-yl, 3-Buten-2-on-4-yl. Der Aromat kann gegebenenfalls mit einem vier- bis sieben­ gliedrigen, nichtaromatischen Ring kondensiert sein. Der nich­ taromatische Ring kann gegebenenfalls eine oder zwei C-C-Dop­ pelbindungen aufweisen, ein- oder mehrfach mit oben genannten Substituenten substituiert sein und gegebenenfalls ein oder zwei Ringheteroatome tragen. Beispiele für besonders brauch­ bare Aromaten sind einkernige Aromaten, wie Cumol, sowie zwei­ kernige Substrate, wie Inden und Naphthalin, sowie die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe c) sind ge­ radkettige oder verzweigte Alkane oder Alkene mit 4 bis 15, vorzugsweise 6 bis 12 Kohlenstoffatomen. Als Beispiele können genannt werden n-Pentan, n-Hexan, n-Heptan-, n-Oktan, n-Nonan, n-Decan, n-Undecan und n-Dodecan, sowie die ein- oder mehrfach verzweigten Analoga dieser Verbindungen, wie z. B. analoge Ver­ bindungen mit 1 bis 3 Methyl-Seitengruppen; oder die ein- oder mehrfach, beispielsweise einfach ungesättigten Analoga der oben genannten Alkane.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe d) sind gege­ benenfalls substituierte Cycloalkane und Cycloalkene. Beispie­ le hierfür sind Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Cyclohe­ xen, Cycloheptan und Cyclohepten. Die Ringstruktur kann dabei ein- oder mehrfach, wie z. B. 1 bis 5 Substituenten gemäß obi­ ger Definition für Verbindungen der Gruppen a) und b) tragen. Nichtlimitierendes Beispiel hierfür sind Ionone, wie α-, β- und γ-Ionon, sowie die entsprechenden Methylionone und Iso­ methylionone. Besonders bevorzugt sind α- und β-Ionon.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, ko­ dierend für eine der obigen Monoxygenasen. Bevorzugte Nuklein­ säuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO: 1, welche wenig­ stens eine Nukleotidsubstitution aufweist, die zu einer der oben beschriebenen funktionellen Aminosäuremutationen führt. Gegenstand der Erfindung sich außerdem durch Addition, Sub­ stitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide erhaltenen funktionalen Analoga der Nukleinsäuren, welche weiterhin für eine Monoxygenase mit der gewünschten Substratspezifität, insbesondere mit Indol-oxidierender Akti­ vität, kodieren.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequen­ zen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entspre­ chend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirts­ organismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten davon.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nu­ kleinsäuresequenzen eine für eine erfindungsgemäße Mutante kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend we­ nigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Konstrukte 5'- stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie ge­ gebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass je­ des der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Bei­ spiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Se­ quenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylie­ rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente um­ fassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replika­ tionsursprünge und dergleichen.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkon­ strukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Struktur­ gen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regula­ tion wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keiner Regulation mehr er­ folgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder im l-PL-Promotor, die vor­ teilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepro­ motoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzen­ promotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperaturinduztierbarer Promotoren, wie der P_rP_l-Promotor.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regu­ lationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vor­ zugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch er­ höhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulato­ rischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptions­ ebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Pro­ motoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei­ spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Monooxygenase- Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylie­ rungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing As­ soc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhaf­ terweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vek­ toren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann be­ kannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verste­ hen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repli­ ziert oder chromosomal repliziert werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenig­ stens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der Mutanten eingesetzt werden können. Vorteil­ hafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem einge­ bracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden ver­ wendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expres­ sionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme wer­ den beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakte­ rien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu ver­ stehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomy­ ces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryoti­ sche Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Orga­ nismen wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere oder Pflanzen handeln, in denen das korrespon­ dierende endogene Gen ausgeschaltet wurde, wie z. B. durch Mutation oder partielle oder vollständige Deletion.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikrobiolo­ gischen Oxidation N-heterocyclischer zwei- oder mehrkerniger armotischer Verbindungen gemäß obiger Definition, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• 1. einen rekombinanten Mikroorganismus gemäß obiger Defini­ tion in einem Kulturmedium in Gegenwart eines exogenen (von außen zugesetzten) oder intermediär gebildeten Sub­ strats, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff, kulti­ viert; oder
• 2. ein Substrat-haltiges Reaktionsmedium mit einem erfin­ dungsgemäßen Enzym, vorzugsweise in Gegenwart von Sauer­ stoff und einem Elektronendonor, inkubiert; und
• 3. das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgeprodukt davon aus dem Medium isoliert.

Bevorzugt ist das exogene oder intermediär gebildete Substrat ausgewählt unter

• a) gegebenenfalls substituierten N-heterocyclischen ein-, zwei- oder mehrkernigen armotischen Verbindun­ gen;
• b) gegebenenfalls substituierten ein- oder mehrkernigen Aromaten;
• c) geradkettigen oder verzweigten Alkanen und Alkenen;
• d) gegebenenfalls substituierten Cycloalkanen und Cy­ cloalkenen.

Eine bevorzugte Verfahrensvariante ist auf die Bildung von Indol/Indirubin gerichtet und dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat intermediär gebildetes Indol ist und man aus dem Me­ dium das anfallende Indigo und/oder Indirubin isoliert, wel­ ches durch Oxidation von intermediär gebildetem Indol erzeugt wurde.

Wird die Umsetzung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivie­ rung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z. B. TB- oder LB-Medium bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist. Die Zugabe von Indol ist gewöhnlich nicht erforderlich, da dieses vom Mikroorganismus intermediär gebildet wird. Um die Oxidationsreaktion besser steuern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren, insbesondere temperaturin­ duzierbaren, Promotors. Man erhöht dabei die Temperatur auf die erforderliche Induktionstemperatur, z. B. 42°C beim P_rP_l- Promotor, behält dies über einen ausreichenden Zeitraum, z. B. 1 bis 10 oder 5 bis 6 Stunden, zur Expression der Monoxygenase-Aktivität bei und verringert anschließend der Temperatur wieder einer Wert von etwa 30 bis 40°C. Die Kulti­ vierung wird dann in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt. Der pH-Wert kann dabei durch Zugabe von Na- OH, z. B. auf 9 bis 10, erhöht werden, wodurch die Indigobil­ dung bzw. Indirubinbildung durch Luftoxidation der enzymatisch gebildeten Oxidationsprodukte 2- and 3-Hydroxyindol zusätzlich gefördert wird.

Wird die erfindungsgemäße Umsetzung (Mono- und/oder Di-Hydrox­ ylierung) dagegen mit gereinigtem oder angereichertem Enzym durchgeführt so löst man das erfindungsgemäße Enzym in einem exogenes Substrat enthaltenden, wie z. B. Indol enthaltenden, Medium (etwa 0,01 bis 10 mM, oder 0,05 bis 5 mM), und führt die Umsetzung, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff, bei einer Temperatur von etwa 10 bis 50°C, wie z. B. 30 bis 40°C, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 (wie z. B. eingestellt mit 100 bis 200 mM Phosphat- oder Tris-Puffer), sowie in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch, wobei das Substrat-haltige Me­ dium außerdem bezogen auf das zu oxidierende Substrat einen etwa 10- bis 100-fachen molaren Überschuß an Reduktionsäquiva­ lenten enthält. Bevorzugtes Reduktionsmittel ist NADPH.

Beim erfindungsgemäßen Substratoxidationsprozess wird im Re­ aktionsmedium enthaltener oder zugesetzter Sauerstoff reduktiv enzymatisch gespalten. Die erforderlichen Reduktionsäquivalen­ te werden von dem zugesetzten Reduktionsmittel (Elektronendo­ nor) zur Verfügung gestellt.

Das gebildete Oxidationsprodukt kann dann in herkömmlicher Weise, wie z. B. durch Extraktion oder Chromatographie, vom Medium abgetrennt und gereinigt werden.

Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen Bioreaktoren, um­ fassend ein erfindungsgemäßes Enzym oder einen erfindungsgemä­ ßen rekombinanten Mikroorganismus in immobilisierter Form.

Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Cytochrom P450 Monoxygenase oder eines erfindungsgemäßen Vektors oder Mikroorganismus zur mikrobiolo­ gischen Oxidation eines Substrates aus einer der Gruppen a) bis d), insbesondere N-heterocyclischer zwei- oder mehrkerni­ ger armotischer Verbindungen, und bevorzugt zur Bildung von Indigo und/oder Indirubin.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1 Randomisierung spezieller Codons von P450 BM-3

Die Versuche wurden im wesentlichen wie beschrieben in (19) durchgeführt. Drei Positionen (Phe87, Leu188 und Ala74) wurden mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese unter Verwendung des Stratagene QuikChange kit (La Jolla, CA, USA) randomisiert. Folgende PCR-Primer wurden für die einzelnen Positionen ver­ wendet: Phe87: 5'-gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3' (SEQ ID NO: 3), 5'-cgtccagcttgtnnncaacccgtctcctgc-3', (SEQ ID NO: 4) Leu188: 5'-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3' (SEQ ID NO: 6; Ala74: 5'-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3' (SEQ ID: No: 7, 5'-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3' (SEQ ID NO: 8)

Die Bedingungen für die PCR waren für alle drei Positionen identisch. Insbesondere wurden je 50 µl Reaktionsvolumen 17,5 pmol eines jeden Primers, 20 pmol Template-Plasmid-DNA, 3 U der Pfu Polymerase und 3,25 nmol von jedem dNTP verwendet. Die PCR Reaktion wurde bei 94°C/1 min gestartet und dann wurde folgender Temperaturzyklus 20 mal durchgeführt: 94°C, 1 min; 46°C, 2,5 min; 72°C, 17 min. Nach 20 Zyklen wurde die Reaktion 15 min bei 72°C fortgesetzt. Nach der PCR wurde die Template DNA mit 20 U DpnI bei 37°C 3 h verdaut. Anschließend wurde E. coli DH5α transformiert. Die transformierten E. coli DH5α-Zel­ len wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, welche 150 µg/ml Ampicillin enthielten. Anschließend wurde 18 h bei 37°C inku­ biert.

Beispiel 2 Expression und Reinigung der P450 BM-3 und dessen Mutanten und Produktion eines blauen Pigmentes

Das P450 BM-3-Gen und die Mutanten davon wurden unter der Kon­ trolle des starken, Temperatur-induzierbaren P_RP_L-Promotors des Plasmids pCYTEXP1 in E. coli DH5α wie bereits beschrieben (20), exprimiert. Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, ent­ haltend je Vertiefung 200 µl TB-Medium und 100 µg/ml Ampicil­ lin transferiert. Anschließend wurde über Nacht bei 37°C inku­ biert. 40 µl der Zellkultur einer jeden Vertiefung wurden an­ schließend in ein Kulturröhrchen überführt, das 2 ml TB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin enthält. Anschließend wurde 2 h bei 37°C kultiviert. Dann wurde die Temperatur zur Induktion 6 h auf 42°C erhöht. Dann wurde die Kultivierung über Nacht bei 37°C fortgesetzt, wobei ein blaues Pigment produziert wurde.

Die präparative Herstellung von Enzym oder blauem Pigment wur­ de ausgehend von einer 300 ml Zellkultur (OD_{578 nm} = 0,8 bis 1,0) durchgefürht. Zur Isolierung des Enzymes wurden die Zellen 10 min bei 4000 Upm abzentrifugiert, in 0,1 M K_xPO₄-Puffer, pH 7,4 resuspendiert. Die eisgekühlten Zellen wurden mit Hilfe eines Branson Sonifiers W25 (Dietzenbach, Deutschland) bei einer Energieoutput von 80 W durch dreimalige Beschallung von 2 min vorsichtig aufgeschlossen. Die Suspensionen wurden 20 min bei 32570 × g zentrifugiert. Der Rohextrakt wurde zur Aktivitäts­ bestimmung bzw. zur Enzymreinigung eingesetzt. Die Enzymreini­ gung erfolgte wie in (21) bereits beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Die Konzentration an gerei­ nigtem Enzym wurde über die Extinktionsdifferenz bei 450 und 490 nm, wie in (11) bereits beschrieben, unter Verwendung ei­ nes Extinktionskoeffizienten ∈ von 91 mM^-1cm^-1 bestimmt.

Beispiel 3 Isolierung von Mutanten, welche große Mengen an blauem Pigment produzieren

Jeweils 100 Kolonien wurden von den Mutanten einer jeden Posi­ tion isoliert, welche durch randomisierte Mutagenese des Co­ dons der entsprechenden Position erzeugt wurden. Diese Kolo­ nien wurden in Kulturröhrchen zur Produktion von blauem Pig­ ment kultiviert. Nach dem Waschen der Zellen mit Wasser und mehreren langsamen Zentrifugationsschritten (500 Upm) wurde das blaue Pigment mit Dimethylsulfoxid (DMSO) extrahiert. Die Löslichkeit des blauen Pigmentes war in DMSO am größten. Die Absorption des Extraktes wurde bei 677 nm bestimmt. Diejenige Mutante, welche die größte Menge an blauem Pigment von allen Mutanten einer bestimmten Position produzierte, wurde für eine DNA-Sequenzierung (ABI DNA Sequenzierungs-Kit; ABI Prism^TM 377 DNA Sequencer) verwendet und außerdem als Template für orts­ spezifische randomisierte Mutagenese verwendet.

Beispiel 4 Aktivitätstest für die Indol-Hydroxylierung

Die Indol-Hydroxylierungsaktivität wurde in einer Lösung gete­ stet, die 8 µl einer 10-500 mM Indollösung in DMSO, 850 µl Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 8,2) und 0,6 nmol P450 BM-3 Wildtyp oder Mutante in einem Endvolumen von 1 ml enthielt. Das Ge­ misch wurde 9 min vorinkubiert, bevor man die Reaktion durch Zugabe von 50 µl einer wässrigen 1 mM Lösung von NADPH starte­ te. Die Reaktion wurde nach 20 sec durch Zugabe von 60 µl 1,2 M KOH gestoppt. Innerhalb von 5 bis 30 sec (unter aeroben Be­ dingungen) wurden die Enzymprodukte vollständig in Indigo [Δ^2,2'-Biindolin]-3,3'-dion) und Indirubin ([Δ^2,3'-Biindolin]- 2',3-dion) überführt. Die Indigoproduktion wurde über dessen Absorption bei 670 nm bestimmt. Eine Eichkurve mit reinem In­ digo zeigte einen Extinktionskoeffizienten von 3,9 mM^-1cm^-1 bei dieser Wellenlänge. Ein linearer Kurvenverlauf wurde für die Indigoproduktion in einer Reaktionszeit von 40 sec unter Ver­ wendung von 0,6 nmol Wildtyp bzw. P450 BM-3-Mutante und 0,05 bis 5,0 mM Indol erhalten. Indirubin zeigt eine sehr schwache Absorption bei 670 nm und die gebildete Indirubinmenge war sehr viel geringer als die gebildete Indigomenge. Die Bildung von Indirubin wurde bei der Bestimmung der kinetischen Para­ meter vernachlässigt. Der NADPH-Verbrauch wurde bei 340 nm bestimmt und unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten, von 6,2 mM^-1cm^-1 wie beschrieben (17) berechnet.

Beispiel 5 Reinigung von Indigo und Indirubin

Nach Waschen der Zellen mit Wasser und wiederholter Zentrifu­ gation bei 500 g wurde das gebildete blaue Pellet mit Tetra­ hydrofuran (THF) extrahiert. Der Extrakt wurde bis fast zur Trockene eingedampft und das rote Pigment wurde mehrmals mit 50 ml absolutem Ethanol extrahiert. Der verbleibende blaue Feststoff wurde in THF gelöst und durch Dünnschichtchromato­ graphie (TLC) analysiert. Die Ethanollösung wurde eingedampft und durch Silicagelchromatographie (DC 60, Merck, Darmstadt, Deutschland; 2 cm × 30 cm) gereinigt, bevor sie mit THF und Petrolether in einem Verhältnis von 1 : 2 gewaschen wurde. Die erhaltene rote Lösung wurde eingedampft und deren Reinheit wurde durch TLC bestimmt. Die Absorptionsspektren des blauen und des roten Pigmentes wurden mit Hilfe eines Ultraspec 3000 Spektrophotometers (Pharmacia, Uppsala, Sweden) in einem Be­ reich von 400 bis 800 nm bestimmt. Außerdem wurde der blaue und der rote Farbstoff durch Massenspektrometrie und ¹H-NMR Spektroskopie analysiert.

Versuchsergebnisse 1. Erhöhung der Produktivität für blaues Pigment durch P450 BM-3-Mutagenese

Natives P450 BM-3 besitzt nicht die Fähigkeit zur Produktion des blauen Indigo-enthaltenden Pigments, bzw. der Vorläufer­ substanten 2- bzw 3-Hydroxyindol. Um eine ausreichende Menge an blauem Pigment herstellen zu können, wurde P450 BM3 einer gezielten Evolution ausgesetzt. Sämtliche Mutanten, welche das blaue Pigment produzierten, wurden sequenziert. Es wurde fest­ gestellt, daß wenigstens eine der folgenden drei Positionen mutiert waren: Phe87, Leu188 und Ala74. Es wurde deshalb an­ genommen, daß diese drei Positionen eine entscheidende Rolle für die Aktivität von P450 BM-3 bei der Produktion von blauem Pigment spielen. Aus der Struktur der Häm-Domäne von Cytochrom-P450-BM 3, komplexiert mit Palmitoleinsäure sieht man, daß Phe87 das Substrat an einem näheren Heranrücken an die Häm-Gruppe hindert (14). Die Mutante Phe87Val zeigt eine hohe Regio- und Stereoselektität bei der Epoxidation von (14S, 15R)-Arachidonsäure (13) und die Mutante Phe87Ala verschiebt die Hydroxylierungsposition von ω-1, ω-2 und ω-3 zu ω (22). Die Position 87 wurde deshalb als erste für die ortspezifische randomisierte Mutanese mit Hilfe von PCR ausgewählt. In Röhr­ chenkulturen wurden 7 Kolonien erhalten, welche eine geringe Menge an blauem Pigment nach Induktion produzierten. Die Kolo­ nie, welche die größte Menge des blauen Pigments produzierte, wurde für die DNA-Sequenzierung ausgewählt. Die Sequenzdaten ergaben eine Substitution von Phe87 durch Val. Die Mutante Phe87Val wurde anschließend als Template für die zweite Runde der ortsspezifischen randomisierte Mutagenese an Position Leu188 verwendet. Die Struktur der Häm-Domäne, komplexiert mit Palmitoleinsäure zeigt, daß die Repositionierung der F- und G- Helices den Rest Leu188 in direkten Kontakt mit dem Substrat bringt (14). Diese Position könnte deshalb eine wichtige Rolle bei der Substratbindung oder -orientierung spielen. Nach dem zweiten Screeningdurchgang wurden 31 Kolonien beobachtet, wel­ che das blaue Pigment produzierten. Die Mutante, welche die größte Pigmentmenge produzierte, enthielt die Substitutionen Phe87Val und Leu188Gln. Diese Mutante wurde anschließend in Position Ala74 im dritten Durchgang der ortspezifischen rando­ misierten Mutagenese mutiert. Man erhielt dabei die Dreifach­ mutante F87L188A74 (Phe87Val, Leu188Gln und Ala74Gly), welche mehrere mg blaues Pigment in einem 2-Liter-Kolben, enthaltend 300 ml TB-Medium, produzierte. Diese Menge reichte zur Isolie­ rung und Charakterisierung des blauen Pigmentes aus.

2. Isolierung und Identifizierung des blauen Pigments

Nach dem Auswaschen der Zellen wurde das verbleibende blaue Pellet mit THF extrahiert und TLC analysiert. Das blaue Pig­ ment wurde in eine schneller wandernde blaue Komponente und in eine langsamer wandernde rote Komponente aufgetrennt. Beide Komponenten zeigten exakt die gleichen Mobilitätsparameter wie die Komponenten einer kommerziellen Indigo-Probe.

Nach der Reinigung wurden die Absorptionsspektra beider Kompo­ nenten in DMSO bestimmt. Die blaue Komponente zeigte das glei­ che Spektrum wie eine kommerzielle Indigoprobe. Die gereinigte blaue und rote Komponente wurden jeweils durch Massenspektro­ metrie analysiert. Die Massenspektra beider Pigmente zeigten einen starken Molekülionenpeak bei m/z = 262 und zwei Fragmen­ tionenpeaks bei m/z = 234 und 205 (relative Intensität jeweils 10%). Dieses Muster ist typisch für indigoide Verbindungen. Die Elementarzusammensetzung dieser Ionen wurde durch hoch­ auflösende Massenspektrometrie bestimmt als C₁₆H₁₀N₂O₂, C₁₅H₁₀N₂O bzw. C₁₄H₉N₂. Dies ist ebenfalls charakteristisch für Strukturen vom Indigotyp. Das blaue Pigment wurde somit als Indigo und das rote Pigment als Indirubin bestimmt. Zur Bestätigung der Struktur wurden 500 MHz ¹H-NMR-Spektren beider Pigmente in DMSO-D₆-Lösung durchgeführt. Die Ergebnisse stimmten mit den Literaturangaben (23) überein.

3. Produktion von Indigo mit isolierten Enzymen

Es ist bekannt, daß Indigo aus Indol durch mikrobielle Trans­ formation zugänglich ist (24-26). Keines dieser mikrobiellen Systeme enthielt jedoch eine P450 Monoxygenase. Erfindungs­ gemäß wurde zunächst die katalytische Aktivität des reinen Enzyms für Indol bestimmt. Die Mutante F87L188A74 wurde mit Indol vermischt. Keine Farbreaktion war zu beobachten. Erst nach Zugabe von NADPH zum Reaktionsgemisch bildete sich das blaue Pigment nach etwa 20 min. Durch Einstellung des pH-Werts der Reaktionsmischung auf einen Wert von etwa 11, 30 sec nach Zugabe von NADPH, wurde die blaue Färbung innerhalb von weni­ gen Sekunden sichtbar. Kontrollversuche unter Verwendung von nativem P450 BM-3 waren immer negativ, selbst unter Verwendung erhöhter Konzentrationen an Enzym, Indol und NADPH. Das blaue Pigment wurde mit Ethylacetat extrahiert und durch TLC analy­ siert. Das blaue Pigment trennte sich wieder in eine schneller laufende blaue Komponente und in eine Langsamer laufende rote Komponente auf. Die R_f-Werte und die Absorptionsspektren waren identisch mit denjenigen Werten der Extakte aus der Fermenta­ tionsbrühe. Die F87L188A74-Mutante von P450 BM-3 stellt somit eine Indolhydroxylase dar.

Es sind bisher zwei Wege für die enzymatische Transformation von Indol zu Indigo beschrieben worden. Ein Weg wird durch eine Dioxygenase, der andere durch eine Styrolmonoxygenase katalysiert (24, 25). Die NADPH-Stöchiometrie beträgt in beiden Fällen 2. Es wurde deshalb angenommen, daß im Gegensatz zu den Dioxygenasen die erfindungsgemäße Mutante F87L188A74 Indol in nur einer Position hydroxyliert, um Oxindol (2-Hydroxyindol) oder Indoxyl (3-Hydroxyindol) zu bilden.

4. Kinetische Parameter der Indolhydroxylierung

Reine Proben des Wildtyp-Enzyms P450 BM-3 und der Mutanten Leu188Gln, Phe87Val, F87L188 und F87L188A74 wurden zur Bestim­ mung der kinetischen Parameter der Indolhydroxylierung verwen­ det. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Kinetische Parameter der P450 BM-3 Mutanten für In­ dolhydroxylierung

Selbst beim Überschuß an gereinigtem Enzym und hoher Indolkon­ zentration ist das Wildtyp-Enzym nicht in der Lage, Indol zu oxidieren. Die Mutante Leu188Gln zeigt eine geringe Aktivität. Die Mutante Phe87Val zeigt eine katalytische Wirksamkeit von 119 M^-1s^-1 für die Indolhydroxylierung. Die katalytische Effi­ zienz der Doppelmutante F87L188 (Phe87Val, Leu188Gln) erhöhte sich auf 543 M^-1s^-1 und wurde durch Einführung der weiteren Sub­ stitution Ala74Gly auf 1365 M^-1s^-1 erhöht. Die K_cat-Werte erhöh­ ten sich von Phe87Val zur Dreifachmutante hin um insgesamt 35%, während die K_m-Werte etwa um das Siebenfache abnahmen. Dies weist darauf hin, daß Ala74Gly und Leu188Gln vorwiegend an der Substatbindung beteiligt sind.

Die Indol-Turnover-Rate (K_cat = 2,73 s^-1) war für die Dreifachmu­ tante F87L188A74 mehr als zehnfach höher als für die meisten P450-Enzyme (18).

Beispiel 6 n-Oktanhydroxylierung mit modifizierter Cytochrom P450 Mono­ oxygenase

Die Umsetzungen wurden mit einer P450 BM-3-Monooxygenase Mu­ tante durchgeführt, die folgende Mutationen enthält: Phe87Val Leu188Gln Ala74Gly

Als Substrat wurde n-Octan gewählt. Für die Hydroxylierung des n-Octans wurde folgender aerober Reaktionsansatz verwendet:
P450 BM-3 Mutante: 17,5 mg
Reaktionspuffer: 9,1 ml (Kaliumphosphat-Puffer 50 mM, pH 7.5)
Substrat: 50 µl einer 60 mM Lösung (in Aceton)
Temperatur: 25°C

Enzymlyophylisat wurde in 500 µl Reaktionspuffer gelöst und zunächst mit Substrat und Reaktionspuffer 5 min bei Raumtempe­ ratur inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 300 µl NADPH-Lösung (5 mg/ml). Die NADPH Zugabe wurde noch zweimal wiederholt. Der Reaktionsverlauf wurde durch Absorptionsmes­ sungen bei 340 nm verfolgt, wobei die NADPH Abnahme beobachtet werden kann. NADPH wird dabei in 300 µl-Schritten zugegeben, da eine zu hohe Konzentration an NADPH in der Reaktionslösung zu einer Inaktivierung des Enzyms führt. Zur Isolierung der Produkte wurde anschließend die Reaktionslösung 3 mal mit 5 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Anschließend wurden die Produkte über DC, GC/MS und NMR charakterisiert.

Die GC/MS Analyse des Reaktionsgemisches führte zu folgendem Ergebnis:

Edukt wurde nicht mehr gefunden.

Beispiel 7 Hydroxylierung von Aromaten, Heteroaromaten und Trimethylcy­ clohexenylverbindungen

• a) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n- Oktan als Substrat Naphthalin eingesetzt wurde. Als Pro­ dukte wurden 1-Naphthol und cis-1,2-Dihydroxy-1,2-dihy­ dronaphthalin identifiziert. Vom eingesetzten Naphthalin wurden 88% umgesetzt.
  Analytik für Umsetzungen mit Naphthalin
  GC:
  Apparatur: Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 on Co­ lumn Injector; Säule: DB5 30 m × 0,2 mm; Material: 5% Diphenyl- 95% Dimethylpolysiloxan; Trägergas: 0,5 bar H₂; Temperaturprogramm: 40°C 1 min isotherm/10°C/min bis 300°C
  Rt(1-Naphthol) = 16.68
  NMR:
  Im ¹H-NMR konnte 1-Naphthol und cis-1,2-Dihydroxy-1,2-di­ hydronaphthalin identifiziert werden.
• b) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n- Oktan als Substrat 8-Methylchinolin eingesetzt wurde. Als Hauptprodukt wurde 5-Hydroxy-8-methylchinolin neben weiteren Derivaten (Produktverhältnis 5 : 1) identifiziert. Vom eingesetzten Edukt wurden 35% umgesetzt.
• c) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n- Oktan als Substrat α-Ionon eingesetzt wurde. Als Haupt­ produkt wurde 3-Hydroxy-α-ionon neben weiteren Derivaten (Produktverhältnis 76 : 24) identifiziert. Vom eingesetzten Edukt wurden 60% umgesetzt.
• d) Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von n- Oktan als Substrat Cumol (i-Propylbenzol) eingesetzt wur­ de. Es wurden fünf Monohydroxyprodukte und ein Dihydrox­ yprodukt identifiziert. Vom eingesetzten Edukt wurden 70% umgesetzt.

LITERATUR

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (19)

1. Cytochrom P450 Monoxygenase, welche zu wenigstens einer der folgenden Reaktionen befähigt ist:

• a) Oxidation gegebenenfalls substituierter N-, O- oder S-heterocyclischer ein-, zwei- oder mehrkerniger armotischer Verbindungen;
• b) Oxidation gegebenenfalls substituierter ein- oder mehrkerniger Aromaten;
• c) Oxidation geradkettiger oder verzweigter Alkane und Alkene;
• d) Oxidation gegebenenfalls substituierter Cycloalkane und Cycloalkene

2. Monoxygenase nach Anspruch 1, deren Substrat-bindender Bereich durch ortsspezifische Mutagenese zur funktionalen Aufnahme des zu oxidierenden Substrats befähigt ist.

3. Monoxygenase nach Anspruch 1 oder 2, abgeleitet von Cytochrom P450 Monoxygenasen bakteriellen Ursprungs.

4. Monoxygenase nach Anspruch 3, abgeleitet von Cytochrom P450 Monoxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, welche wenigstens eine funktionelle Mutation in einem der Aminosäurese­ quenzbereiche 172-224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356, 73-82 und 86-88 aufweist.

5. Monoxygenase nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der folgenden ein- oder mehrfachen Aminosäuresubstitutionen aufweist:

• a) Phe87Val;
• b) Phe87Val, Leu188Gln; oder
• c) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;

sowie funktionale Äquivalente davon.

6. Nukleinsäuresequenz, kodierend für eine Monoxygenase nach einem der vorherigen Ansprüche.

7. Expressionskonstrukt, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine kodierende Sequenz, welche eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 umfasst.

8. Vektor, umfassend wenigstens ein Expressionskonstrukt nach Anspruch 7.

9. Rekombinanter Mikroorganismus, transformiert mit wenigstens einem Vektor nach Anspruch 8.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, ausgewählt unter Bakterien der Gattung Escherichia.

11. Verfahren zur mikrobiologischen Oxidation einer Verbindung gemäß der Definition von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

• 1. einen rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder 10 in einem Kulturmedium, in Gegenwart eines exogenen oder intermediär gebildeten Substrats, kultiviert; oder
• 2. ein Substrat-haltiges Reaktionsmedium mit einem Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5 inkubiert; und
• 3. das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgeprodukt davon aus dem Medium isoliert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das exogene oder intermediär gebildete Substrat ausgewählt ist unter

• a) gegebenenfalls substituierten N-, O- oder S- heterocyclischen ein-, zwei- oder mehrkernigen armotischen Verbindungen;
• b) gegebenenfalls substituierten ein- oder mehrkernigen Aromaten;
• c) geradkettigen oder verzweigten Alkanen und Alkenen;
• d) gegebenenfalls substituierten Cycloalkanen und Cycloalkenen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat intermediär gebildetes Indol ist und man aus dem Medium das anfallende Indigo und/oder Indirubin isoliert, welches durch Oxidation von intermediär gebildetem Indol erzeugt wurde.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Indoloxidation durch Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 durchführt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als exogenes Substrat wenigstens eine Verbindung, ausgewählt unter den oben definierten Gruppen a) bis d), einem Medium zusetzt und die Oxidation durch enzymatische Umsetzung des substrathaltiges Mediums in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 durchführt, wobei das substrathaltige Medium außerdem bezogen auf das Substrat einen etwa 10- bis 100-fachen molaren Überschuß an Reduktionsäquivalenten enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als exogenes Substrat eine Verbindung, ausgewählt unter Indol, n-Hexan, n-Octan, n-Decan, n-Dodecan, Cumol, 1-Methylindol, 5-Cl- oder Br-Indol, Inden, Benzothiophen, α-, β- und γ-Ionon, Acridin, Naphthalin, 6-Methyl- oder 8-Methylchinolin, Chinolin und Chinaldin, einsetzt.

17. Bioreaktor, umfassend ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einen rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 9 oder 10 in immobilisierter Form.

18. Verwendung einer Cytochrom P450 Monoxygenase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Vektors nach Anspruch 8, oder eines Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder 10 zur mikrobiologischen Oxidation von

• a) gegebenenfalls substituierten N-, O- oder S- heterocyclischen ein-, zwei- oder mehrkernigen armotischen Verbindungen;
• b) gegebenenfalls substituierten ein- oder mehrkernigen Aromaten;
• c) geradkettigen oder verzweigten Alkanen und Alkenen; und/oder
• d) gegebenenfalls substituierten Cycloalkanen und Cycloalkenen.

19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Herstellung von Indigo und/oder Indirubin.