JP4800000B2 - 改変型芳香環ジオキシゲナーゼ及び水酸化フラボン類化合物の製造法 - Google Patents
改変型芳香環ジオキシゲナーゼ及び水酸化フラボン類化合物の製造法 Download PDFInfo
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Description
(1)以下の(a)又は(b)のポリペプチド。
(a)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(b)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、前記ポリペプチドと芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)とからなる酵素、及び芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)を、順次作用させて、7−ヒドロキシフラボン、5,7−ジヒドロキシフラボン又は1−フェニルナフタレンのフラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有するポリペプチド
(2)以下の(a)又は(b)の核酸。
(a)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、又は
(b)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸であって、かつ、前記ポリペプチドと芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)とからなる酵素、及び芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)を、順次作用させて、7−ヒドロキシフラボン、5,7−ジヒドロキシフラボン又は1−フェニルナフタレンのフラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
(3)配列番号1又は3に示される塩基配列からなる核酸。
(5)上記(4)の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
(6)上記(5)の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド(BphA1)の製造方法。
(9)上記(4)又は(7)の組換えベクターで形質転換されたものである、上記(8)の微生物。
(10)フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換できるものである、上記(8)又は(9)の微生物。
(11)微生物が大腸菌であることを特徴とする上記(8)〜(10)のいずれかの微生物。
(a)上記(1)のポリペプチド(BphA1)及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(BphB)
(b)上記(8)〜(11)のいずれかの微生物
(c)上記(8)〜(11)のいずれかの微生物の培養物
の少なくとも1つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。
(14)フラボン類化合物が、フラボン、6−ヒドロキシフラボン、7−ヒドロキシフラボン、5,7−ジヒドロキシフラボン、6−ヒドロキシフラバノン、7−ヒドロキシフラバノン、カルコン、1−フェニルナフタレン、及び2−フェニルナフタレンからなる群より選択される、上記(13)の方法。
(15)水酸化フラボン類化合物が、フラボン類化合物のフェニル基の2位及び3位に2つの水酸基が導入されたジオール体である、上記(13)又は(14)の方法。
(a)上記(1)のポリペプチド(BphA1)及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(BphB)
(b)上記(8)〜(11)のいずれかの微生物
(c)上記(8)〜(11)のいずれかの微生物の培養物
の少なくとも1つを、カルコンを含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から上記式IIで表わされる化合物を得ることを特徴とする、式IIで表わされる化合物の製造方法。
(18)下記式IIで表わされる化合物を含むことを特徴とする抗酸化剤。
本発明に係る水酸化フラボン類化合物の製造方法は、フェニル基(ベンゼン環)を有するフラボン類化合物に、本発明に係る芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチドと公知の芳香環分解系酵素とを作用させることにより、そのフェニル基(ベンゼン環)を水酸化して、水酸化フラボン類化合物に変換することを特徴とするものである。
本発明では、芳香環(ビフェニル)分解系の最初の酵素、すなわち、芳香環(ビフェニル)ジオキシゲナーゼ(BphA;本明細書中、単に「芳香環ジオキシゲナーゼ」とも記載する)を遺伝子工学的に改変した改変型芳香環ジオキシゲナーゼ(改変型BphA)、及び2番目の酵素ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)の活性を利用している。BphAは4つのサブユニット(BphA1,BphA2,BphA3及びBphA4;又はBphA1,BphE,BphF及びBphG)から構成されており、本発明において「改変型芳香環ジオキシゲナーゼ」とは、そのうちの大サブユニット(BphA1)を遺伝子工学的に改変したものである。
本発明において、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ(改変型BphA)としては、限定されるものではないが、その大サブユニットがBphA1(1−22)(配列番号2)及びBphA1(2−2)(配列番号4)のものを用いることができる。これらの改変型BphA1は、限定されるものではないが、それぞれbphA1(1−22)遺伝子(配列番号1)及びbphA1(2−2)遺伝子(配列番号3)によりコードされる。
ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)は、天然に該酵素を産生する微生物、又は該酵素をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。あるいは、該酵素の変異体又は分子進化工学的手法による改変体をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。例えば限定されるものではないが、シュードモナス・シュードアルカリゲネスKF707株のBphBのアミノ酸配列はDDBJ/Genbank登録番号M83673に示されている。また、バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)LB400株のシュードモナス・シュードアルカリゲネスKF707株のBphBのアミノ酸配列は、DDBJ/Genbank登録番号M86348に示されている。
上述した改変型芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子(改変型bphA)は、改変型bphA1、bphA2、bphA3、及びbphA4、又は改変型bphA1、bphE、bphF、及びbphGからなり、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はbphBからなる。
本発明では、改変型芳香環ジオキシゲナーセ遺伝子(改変型bphA)とジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子(bphB)とを発現し、フラボン類化合物を水酸化することができる微生物を作製し、該微生物又は該微生物により産生される酵素をフラボン類化合物の水酸化に用いることができる。
本発明においては、後述する変換反応のために、芳香環分解系酵素(改変型BphA及びBphB)を生成する微生物から当該酵素群を単離及び精製し、それを使用することができる。
本発明においては、上記改変型芳香環ジヒドロゲナーゼ(改変型BphA)及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)を用いて、フラボン類化合物を水酸化することができる。
また例えば、上記フラボン類化合物とともに、改変型芳香環ジオキシゲナーゼ(改変型BphA)及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)を産生する微生物を培養する方法は以下のようにして行うことができる。
BphA1SacIF: 5'- CCGAATTCAAGGAGACGTTGAATCATGAGCTCAGC -3'(配列番号5)
BphA1BglIIR: 5'- TTGAATTCTTCCGGTTGACAGATCT-3'(配列番号6)
715TINNK-F: 5'-GCATGTTCGGCCAGCACATGNNKNNKTTCCCGACCTGTTC -3'(配列番号7)
715TINNK-R: 5'-CATGTGCTGGCCGAACATGC -3'(配列番号8)
実施例1において作製したプラスミドpBPA(1−22)B又はpBPA(2−2)Bを有する大腸菌JM109と、実施例1で変換が確認された基質の混合培養液700ml〜1400mlに等量のメタノールを添加し、室温で2時間撹拌した。これを7,000rpmにて10分遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下300ml〜500mlまで濃縮し、等量の酢酸エチルで2度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキスを得た。エキスをシリカゲル[0.25nm Silica Gel 60(Merck)]を用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム[20×250mm,Silica Gel 60(Merck)]を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、純品を得た。
カルコン,ヘキサン−EtOAc(4:1);7−ヒドロキシフラボン,CH2Cl2−MeOH(10:1);クリシン,CH2Cl2−MeOH(20:1)
また、各基質におけるカラムクロマトグラフィーの展開溶媒は以下の通りである:
カルコン,ヘキサン−EtOAc(3:1);7−ヒドロキシフラボン,CH2Cl2−MeOH(15:1);クリシン,CH2Cl2−MeOH(20:1)
プラスミドpBPA(1−22)B又はpBPA(2−2)Bを有する大腸菌JM109によりそれぞれ[(トランス−)カルコン]の変換実験を行った粗抽出物(105.8mg)をTLCに供したところ、両方についてRf値0.2及びRf値0.1の産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物1(27.6mg)及び化合物2(5.2mg)の純品を得た。
プラスミドpBPA(1−22)B又はpBPA(2−2)Bを有する大腸菌JM109によりそれぞれ7−ヒドロキシフラボンの変換実験を行った粗抽出物(93.2mg)をTLCに供したところ、両方についてRf値0.5の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物3(4.5mg)の純品を得た。
プラスミドpBPA(1−22)B又はpBPA(2−2)Bを有する大腸菌JM109によりクリシンの変換実験を行った粗抽出物(126.3mg)をTLCに供したところ、両方についてRf値0.3の産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物4(4.2mg)の純品を得た。
(5−1)フラバノン(Flavanone)
TLC CH2Cl2−MeOH(20:1)Rf0.6
酢酸エチル抽出物重量 212.1mg
シリカカラムCH2Cl2−MeOH(20:1)68.6mg
TLC CH2Cl2−MeOH(10:1)Rf0.3
酢酸エチル抽出物重量 77.0mg
シリカカラムCH2Cl2−MeOH(10:1)20.3mg
TLC CH2Cl2−MeOH(20:1)Rf0.3
酢酸エチル抽出物重量 155.9mg
シリカカラムCH2Cl2−MeOH(20:1)60.3mg
TLC CH2Cl2−MeOH(20:1)Rf0.5
酢酸エチル抽出物重量 149.3mg
シリカカラムCH2Cl2−MeOH(20:1)31.5mg
TLC CH2Cl2−MeOH(50:1)Rf0.3
酢酸エチル抽出物重量 114.9mg
シリカカラムCH2Cl2−MeOH(50:1)60.9mg
TLC CH2Cl2−MeOH(50:1)Rf0.2
酢酸エチル抽出物重量 114.9mg
シリカカラムCH2Cl2−MeOH(50:1)65.5mg
変換反応進行せず。
活性酸素により最も傷害を受ける生体成分は脂質(特に極性脂質)である。ラット脳組織は極性脂質に富み、また活性酸素の反応に関与する酸化還元酵素系も含むため、活性酸素の生体脂質への傷害(動脈硬化の原因)を検討するのに優れた材料である。
化合物2 0.7μM
化合物3 2.9μM
化合物4 4.8μM
上記結果から、化合物2〜4が、抗酸化活性、特に脂質に対する抗酸化活性を有することが示された。
配列番号2及び4:合成ポリペプチド
配列番号5〜8:合成オリゴヌクレオチド
配列番号7におけるNは任意のヌクレオチドを表わす。
Claims (18)
- 以下の(a)又は(b)のポリペプチド。
(a)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(b)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、前記ポリペプチドと芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)とからなる酵素、及び芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)を、順次作用させて、7−ヒドロキシフラボン、5,7−ジヒドロキシフラボン又は1−フェニルナフタレンのフラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有するポリペプチド - 以下の(a)又は(b)の核酸。
(a)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、又は
(b)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸であって、かつ、前記ポリペプチドと芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)とからなる酵素、及び芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(BphB)を、順次作用させて、7−ヒドロキシフラボン、5,7−ジヒドロキシフラボン又は1−フェニルナフタレンのフラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする核酸 - 配列番号1又は3に示される塩基配列からなる核酸。
- 請求項2又は3記載の核酸を含む組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項5記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット活性を有するポリペプチド(BphA1)の製造方法。
- さらに芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)をコードする核酸、及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(BphB)をコードする核酸を含む、請求項4記載の組換えベクター。
- 請求項1記載のポリペプチド(BphA1)を発現し、かつ芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)及びジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(BphB)を発現することを特徴とする微生物。
- 請求項4又は7記載の組換えベクターで形質転換されたものである、請求項8記載の微生物。
- フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換できるものである、請求項8又は9記載の微生物。
- 微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項8〜10のいずれか1項に記載の微生物。
- 請求項8〜11のいずれか1項に記載の微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、フラボン類化合物を水酸化フラボン類化合物に変換する活性を有する酵素群の製造方法。
- 以下の(a)〜(c):
(a)請求項1記載のポリペプチド(BphA1)及び芳香環ジオキシゲナーゼサブユニット活性を有するポリペプチド(BphA2A3A4又はBphEFG)、並びにジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(BphB)
(b)請求項8〜11のいずれか1項に記載の微生物
(c)請求項8〜11のいずれか1項に記載の微生物の培養物
の少なくとも1つを、フラボン類化合物を含むサンプルに添加して混合又は培養し、得られる混合物又は培養物から水酸化されたフラボン類化合物を得ることを特徴とする、水酸化フラボン類化合物の製造方法。 - フラボン類化合物が、フラボン、6−ヒドロキシフラボン、7−ヒドロキシフラボン、5,7−ジヒドロキシフラボン、6−ヒドロキシフラバノン、7−ヒドロキシフラバノン、カルコン、1−フェニルナフタレン、及び2−フェニルナフタレンからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
- 水酸化フラボン類化合物が、フラボン類化合物のフェニル基の2位及び3位に2つの水酸基が導入されたジオール体である、請求項13又は14記載の方法。
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