UA76701C2 - Спосіб мікробіологічного окиснення n-, o- або s-гетероциклічних одно- або багатоядерних ароматичних сполук, спосіб мікробіологічного окиснення заміщених одно- або багатоядерних ароматичних вуглеводнів, нерозгалужених або розгалужених алканів і алкенів, спосіб мікробіологічного виробництва індиго і/або індирубіну та мутована цитохром р450-монооксигеназа - Google Patents

Abstract

Винахід належить до способу мікробіологічного окиснення N-, O- або S- гетероциклічних одно- або багатоядерних ароматичних сполук, способу мікробіологічного окиснення заміщених одно- або багатоядерних ароматичних вуглеводнів, нерозгалужених або розгалужених алканів і алкенів, способу мікробіологічного виробництва індиго і/або індирубіну за допомогою мутованої цитохром Р450-монооксигенази.

Description

в присутності екзогенного або проміжного субстра- МО:2, що має щонайменше одну функціональну ту, що утворюється; або мутацію в області амінокислотної послідовності аг) інкубують реакційне середовище, що містить 86-88, і, в разі необхідності, додатково має що- субстрат, з цитохром Р450-монооксигеназою бак- найменше одну функціональну мутацію в одній з теріального походження; і областей амінокислотної послідовності 73-82, 172- б) виділяють продукт окиснення, що утворився, 224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. або його наступний продукт з середовища; 7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що екзо- причому монооксигеназа є похідною від цитохром генний або проміжний субстрат, що утворюється,

Ра5О-монооксигенази ВМ-3 з Васіййсив тедасенйт вибирають серед з амінокислотною послідовністю згідно з 5ЕО ІЮ а) у разі необхідності, заміщених одно- або бага-

МО:2, що має щонайменше одну функціональну тоядерних ароматичних вуглеводнів; мутацію в області амінокислотної послідовності б) нерозгалужених або розгалужених алканів і ал- 86-88 і, в разі необхідності, додатково має щонай- кенів; менше одну функціональну мутацію в одній з об- в) у разі необхідності, заміщених циклоалканів і ластей амінокислотної послідовності 73-82, 172- циклоалкенів. 224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. 8. Спосіб за п. 6 або 7, який відрізняється тим, 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що екзо- що використовують мутант, що має щонайменше генний або проміжний субстрат, що утворюється, наступні одно- або багатократні замінення аміно- вибирають серед, у разі необхідності, заміщених кислот:

М-, О- або 5-гетероциклічних одно- або багатояде- а) Рпе87Маї; рних ароматичних сполук. б) Рпе87Маї, І еш18851іп; або 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, в) Рпев87Ммаї, Геи18801п; АІа74 су. що використовують мутант, що має щонайменше 9. Спосіб за одним з пп. 6 - 8, який відрізняється наступні одно- або багатократні замінення аміно- тим, що як екзогенний субстрат вибирають, як мі- кислот: німум, одну сполуку серед вищевизначених груп, в а) Рпев7маї; разі необхідності, заміщених одно- або багатояде- б) Рпе87Маї, І еи188501Іп; або рних ароматичних вуглеводнів, нерозгалужених в) Рпев87Маї, Геи 1885Іп, АІа74с1у. або розгалужених алканів і алкенів, в разі необхід- 4. Спосіб за одним з пп. 1 - 3, який відрізняється ності заміщених циклоалканів і циклоалкенів, до- тим, що як екзогенний субстрат вибирають, як мі- дають у середовище, а окиснення проводять шля- німум, одну сполуку групи в разі необхідності за- хом ензиматичного перетворення середовища, міщених М-, О- або 5-гетероциклічних одно-, дво- що містить субстрат, в присутності кисню при тем- або багатоядерних ароматичних сполук, додають пературі від приблизно 20"С до 40"С і значенні рН у середовище, а окиснення проводять шляхом від приблизно 6 до 9, причому середовище, що ензиматичного перетворення середовища, що містить субстрат, містить крім того відносно субс- містить субстрат, в присутності кисню при темпе- трату приблизно 10-100-кратний молярний надли- ратурі приблизно від 20"С до 40"С і значенні рн шок відновних еквівалентів. приблизно від б до 9, причому середовище, що 10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що як містить субстрат, містить крім того відносно субс- екзогенний субстрат використовують сполуку, ви- трату приблизно 10-100-кратний молярний надли- брану серед наступних: н-гексан, н-октан, н-декан, шок відновних еквівалентів. н-додекан, кумол, ру -іонон, нафталін. 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що як 11. Спосіб мікробіологічного виробництва індиго екзогенний субстрат використовують сполуку, ви- і/або індирубіну, який відрізняється тим, що брану серед наступних: індол, 1-метиліндол, 5- ат) культивують рекомбінантний мікроорганізм, що хлор або 5-броміндол, інден, бензотіофен, акри- виробляє у культуральному середовищі цитохром дин, 6б-метил або 8-метилхінолін, хінолін і хіналь- РА5О-монооксигеназу, що окислює індол у присут- дин. ності екзогенного або проміжного індолу, що утво- 6. Спосіб мікробіологічного окислення, в разі необ- рюється; або хідності, заміщених одно- або багатоядерних аро- аг) інкубують реакційне середовище, що містить матичних вуглеводнів, нерозгалужених або розга- індол, з цитохром РА50-монооксигеназою, що оки- лужених алканів і алкенів, або, в разі необхідності, слює індол; і заміщених циклоалканів і циклоалкенів, який від- б) виділяють продукт окиснення, що утворився, різняється тим, що або його наступний продукт з середовища; причо- ат) культивують рекомбінантний мікроорганізм, що му монооксигеназа є похідною від цитохром Р450- виробляє цитохром Ра50-монооксигеназу, у куль- монооксигенази ВМ-3 з Васіїйси5 тедаїепит з амі- туральному середовищі в присутності екзогенного нокислотною послідовністю згідно з ЗЕО ІЮ МО2, або проміжного субстрату, що утворюється; або що має щонайменше одну функціональну мутацію аг) інкубують реакційне середовище, що містить в області амінокислотної послідовності 86-88, і,в субстрат, з цитохром Р450-монооксигеназою, зда- разі необхідності, додатково має щонайменше тною до окиснення вищевизначених сполук 1 одну функціональну мутацію в одній 3 областей б) виділяють продукт окиснення, що утворився, амінокислотної послідовності 73-82, 172-224, 39- або його наступний продукт з середовища; 43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. причому монооксигеназа є здатною до окиснення 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що з вищевизначених сполук І є похідною від цитохром середовища виділяють індиго і/або індирубін, оде-

РАа50О-монооксигенази ВМ-3 з Васійсив тедагейт ржаний шляхом окиснення проміжного індолу, що з амінокислотною послідовністю згідно з зЕО ІЮ утворюється.

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що З з Васіїїйси5 тедай(егпйт з амінокислотною послі- окиснення індолу проводять шляхом культивуван- довністю згідно з ЗЕО ІЮ МО:2, що має щонайме- ня мікроорганізму у присутності кисню при темпе- нше одну функціональну мутацію в області аміно- ратурі приблизно 20-402С і значенні рН від 6 до 9. кислотної послідовності 86-88, і щонайменше одну 14. Спосіб за одним з пп. 11-13, який відрізняєть- функціональну мутацію в одній з областей аміно- ся тим, що використовують мутант, що має що- кислотної послідовності 73-82 і 172-224, і, в разі найменше наступні одно- або багатократні замі- необхідності, додатково має одну функціональну нення амінокислот: мутацію в одній з областей амінокислотної послі- а) Рпев7Ммаї; довності 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356. б) Рпе87Маї, І еи188501Іп; або 16. Монооксигеназа за п. 15, яка відрізняється в) Рпев7маї, Геи18801Іп; Аіа74 су. тим, що вона має щонайменше одну функціональ- 15. Цитохром Р4.50-монооксигеназа, що, як міні- ну мутацію в області амінокислотної послідовності мум, здатна до однієї з наступних реакцій: 86-88 і має щонайменше одну функціональну му- а) окиснення, в разі необхідності, заміщених М-, О- тацію в одній з областей амінокислотної послідов- або 5-гетероциклічних одно-, дво- або багатояде- ності 73-82 і 172-224. рних ароматичних сполук; 17. Монооксигеназа за п. 15, яка відрізняється б) окиснення, в разі необхідності, заміщених одно- тим, що вона має щонайменше багатократні замі- або багатоядерних ароматичних вуглеводнів; щення амінокислот: в) окиснення нерозгалужених або розгалужених а) Рпе87Маї, Геш18801іп; або алканів і алкенів і б) Рпе87Маї, Геи18801Іп, АІа74Сху; г) окислення, в разі необхідності, заміщених цик- а також їх функціональні еквіваленти, що здатні, як лоалканів і циклоалкенів, причому монооксигеназа мінімум, до однієї з вищевказаних реакцій окис- є похідною від цитохром Рі450-монооксигенази ВМ- нення.

Даний винахід стосується нових цитохром Структура гем-домену Р450 ВМ-3 визначала-

РА5О-монооксигеназ зі зміненою специфічністю ся за допомогою рентгеноструктурного аналізу субстрату, придатних для оксидування органічних (14-16). Місця зв'язування субстрату мають фор- субстратів, наприклад, М-гетероциклічних арома- му довгого тунелеподібного отвору, що від пове- тичних сполук, кодованих для цього послідовнос- рхні молекули йде до гем-молекули й обмежуєть- тей нуклеотидів, що містять цю послідовність ся майже винятково гідрофобними залишками експресійних конструктів і векторів, і тим самим амінокислот. Окремі заряджені залишки на пове- трансформованих мікроорганізмів, способу мік- рхні гем-домену є залишками Аг947 і Туг51. робіологічного оксидування різних органічних Приймається, що вони беруть участь в зв'язуван- субстратів, таких як М-гетероциклічних ароматич- ні карбоксилатної групи субстрату шляхом утво- них сполук і, зокрема, способу виготовлення інди- рення водневого зв'язку (14). Мутація Агд47 до го і індирубіну. Спи викликає дезактивацію ензиму арахідонової

Ензими з новими функціями і властивостями кислоти (13), але підвищує його активність в від- можуть бути отримані або шляхом відсівання ношенні Сі2-Сі4-СПолук алкілтриметиламіаку. Ви- природних проб або шляхом зміни білка відомих користання субстрату для ароматичних сполук, ензимів. При визначених обставинах останній зокрема, для одно-, дво- або поліциклічних, зок- метод може бути більш кращим в одержанні вла- рема, гетероциклічних ароматичних вуглеводнів, стивостей, що неймовірні на шляху природної алканів, алкенів, циклоалканів і циклоалкенів від- селекції. Незважаючи на різні спроби по створен- носно цього ензиму не було описано. Досі серед ню ензимів, досі мало вдалих досліджень по сти- фахівців було прийнято, що інші, ніж описані тут мулюванню каталітичної активності мутантів ен- органічні субстрати, як, наприклад, індол, не мо- зимів відносно визначеного субстрату (1-10). В жуть бути субстратами через очевидні структурні цих відомих випадках субстрати структурно тісно розходження з природними субстратами Р4А5бО зв'язані з природними субстратами відповідного ВМ-3, зокрема, через відсутність функціональних ензиму. Досі немає повідомлень про успішне груп, що могли б зв'язувати вищезгадані залишки створення ензимів, що після модифікації каталі- в кармані субстрату. зували б перетворення сполуки, що повністю Тому задачею даного винаходу є підготовка відрізняється від природного субстрату ензиму. нових цитохром Р450 монооксигеназ зі зміненою

Виділена з бактерії ВасшШіив тедаїетпйт цито- специфічністю субстрату або зміненим профілем хром Р4і50-монооксигеназа звичайно каталізує субстрату. Зокрема, повинні бути підготовлені субтермінальне гідроксилювання довголанцюж- мутанти монооксигенази, що в порівнянні з при- кових насичених кислот і відповідних амідів і родним ензимом, що не підлягає мутації повинні спиртів з них або епоксидування ненасичених бути ензиматично активні зі субстратами, що довголанцюжкових жирних кислот з середньою структурно суттєво відрізняються. довжиною ланцюга (11-13). Оптимальна довжина "Змінений профіль субстрату" слід відрізняти ланцюга насичених жирних кислот складає від 14 в заявлених мутантів відносно природних ензи- до 16 атомів вуглецю. Жирні кислоти з довжиною мів. Для відповідних мутантів спостерігається, ланцюга менш 12 не гідроксилюються (11). зокрема, поліпшення реакційної здатності, напри-

клад, підвищення питомої активності (вираженої Кращі мутанти монооксигенази мають, що- в нмоль перетвореного субстрату/в хвилину/до найменше, одну функціональну мутацію, зокре- нмоль ензиму Р450), і/або, як мінімум, кінетично- ма, заміщення амінокислоти, як мінімум, в одній з го параметра, обраного серед Ксаі, Кт або Кса/Кт областей послідовності 73-82, 86-88 і 172-224. (наприклад, як мінімум, 195, від 1090 до 1000905, Так, наприклад, Рпе87 може бути заміщена амі- від 1095 до 50095 або від 1095 до 100905) при пере- нокислотою з аліфатичним боковим ланцюгом, творенні, як мінімум, однієї визначеної в групах як, наприклад, Аїа, Маї, Геиц, зокрема, Маї, Геи 188 від а) до а) сполуки, що оксидують. Заявлена може бути заміщений амінокислотою з амідним реакція оксидування охоплює ензимно- боковим ланцюгом, як, наприклад, Азп або, зок- каталітичне оксидування, як мінімум, однієї екзо- рема, Сп; а АІа74 може заміщатися іншою аміно- генної (тобто такої, що додають в реакційне се- кислотою з аліфатичним боковим ланцюгом, як, редовище) або ендогенної (вже наявної в реак- наприклад, Маї і, зокрема, Су. ційному середовищі) сполуки. Зокрема, заявлена Особливо кращі мутанти монооксигенази реакція оксидування охоплює моно- або полігід- цього типу відрізняються тим, що вони мають, роксилювання, як, наприклад, моно- і/або дигід- щонайменше, одно- або багатократні заміщення роксилювання відносно аліфатичної або арома- амінокислот: тичної С-Н-групи, або епоксидування відносно 1) Рпе87Маї; переважно неароматичної С-С-групи. Можливі 2) Рпе87Маї, І ен18801п; або також комбінації вищевказаних реакцій. Безпосе- З) Рпе87Маї еи1882с1Іп; Аіа74Ссу; редній продукт реакції може перетворюватися, а також їх функціональні еквіваленти. Число- крім того, в рамках неензиматичної послідовної ве значення тут позначає позицію мутації; перед або побічної реакції. Комбінації такого роду ензи- числовим значенням стоїть первісна, за число- матичних і неензиматичних процесів також є об'- вим значенням - нововведена амінокислота. єктом винаходу. "Функціональні еквіваленти" або аналоги му-

Вищезгадані задачі неочевидним чином мо- тантів, що конкретно виявляються в цьому зв'язку жуть бути вирішені шляхом використання нових - різні мутанти, що надалі мають бажану специ- цитохром Ра5О-монооксигеназ, що, наприклад, фічність субстрату в рамках, як мінімум, однієї здатні оксидувати М-гетероциклічні дво- або ба- вищезгаданої реакції оксидування а)-4), тобто, гатоланкові ароматичні сполуки. наприклад, відносно гетероциклічних ароматич-

Зокрема, об'єктом винаходу є такі моноокси- них вуглеводнів і, наприклад, гідроксилюють ін- генази, в яких область, що з'єднує субстрат, зда- дол, або надалі в порівнянні з природними ензи- тна шляхом місцевого специфічного мутагенезу мами виявляють "змінений профіль субстрату". функціонально сприймати нові, наприклад, М- Під "функціональними еквівалентами" розу- гетероциклічні субстрати. міють відповідно до винаходу також мутанти, що

В кращій формі виконання винаходу нові мо- виявляють, як мінімум, в одній з вищезгаданих нооксигенази розчинні, тобто існують не в мем- позицій послідовності інше, ніж конкретно назва- бранно-зв'язаній формі й в цій формі ензиматич- не заміщення амінокислоти, але, незважаючи на но активні. це таке, що приводить до мутанта, що також, як

Заявлені монооксигенази переважно похідні з конкретно названі мутанти в порівнянні з природ- цитохром Ра5О-монооксигеназ бактеріального ними ензимами демонструють "змінений профіль походження, як, зокрема, похідна з цитохром субстрату" і каталізують, як мінімум, одну з вище-

Ра5О-монооксигенази вмМ-з3 З Васійййсив згаданих реакцій оксидування. Функціональний тедаїйегійт з послідовністю амінокислот згідно з еквівалент задається, зокрема, також тоді, коли

ЗЕО І МО:2, що має, щонайменше, одну функ- зміни в профілі субстрату якісно співпадають, ціональну, тобто таку, що сприяє оксидуванню тобто, наприклад, коли однакові субстрати пере- нових органічних субстратів (див., зокрема, ви- творюються з різною швидкістю. значені від а) до 4) групи сполук), як, наприклад, "Функціональні еквіваленти" охоплюють, зви-

М-гетероциклічні одно-, дво- або багатоланкові чайно, також мутанти Р450-монооксигенази, що ароматичні сполуки, мутацію в області послідов- доступні шляхом мутації ензимів Р450 з інших ності амінокислот 172-224 (замкнута область організмів тим же способом, як конкретно названі

Е/с), 39-43 (р-смуга 1), 48-52 (р-смуга 2), 67-70 (р- Р.50 ВМ-3. Наприклад, шляхом послідовного смуга 3), 330-335 (р-смуга 5), 352-356 (р-смуга 8), порівняння областей можна установити гомологі- 73-82 (спіраль 5), 86-88 (спіраль 6). чні регіони послідовностей. За допомогою сучас-

Виготовлені відповідно до винаходу мутанти них методів молекулярного моделювання тоді цитохром Р.і50-монооксигеназ переважно, як можна, грунтуючись на конкретних задачах вина- мінімум, здатні до однієї з наступних реакцій: ходу, прийнятися за еквівалентні, що впливають а) оксидування в разі необхідності заміщених на зразок реакції мутації.

М-, О-, або 5-гетероциклічних одно-, дво- або "Функціональні еквіваленти" охоплюють та- багатоланкових ароматичних сполук; кож мутанти, отримані шляхом однієї або бага- р) оксидування в разі необхідності заміщених тьох добавок, заміщень, видалень і/або перетво- одно- або багатоланкових ароматичних вуглево- рень амінокислот, причому названі додаткові днів; зміни можуть з'являтися в кожній позиції послідо- с) оксидування нерозгалужених або розгалу- вності, поки вони приводять до мутанта зі зміне- жених алканів і алкенів і ним профілем субстрату в вищезазначеному а) оксидування в разі необхідності заміщених смислі. циклоалканів і циклоалкенів. Субстрати групи а), що оксидуються відпо-

відно до винаходу, в разі необхідності є заміще- алкани й алкени з 4-15, переважно з 6-12 атома- ними гетероциклічними одно-, дво- або багатола- ми вуглецю. Як приклади можуть бути названі н- нковими ароматичними сполуками; зокрема, та- бутан, н-пентан, н-гексан, н-гептан, н-октан, н- кими, що оксидуються або гідроксилюються М-, нонан, н-декан, н-ундекан і н-додекан, а також

О-, або 5-гетероциклічними одно-, дво- або бага- одно- або багатократно розгалужені аналоги цих толанковими ароматичними сполуками. Вони сполук, як, наприклад, аналоги сполук з 1-3 боко- охоплюють переважно двох або три, зокрема, вими метильними групами; або однократно або дво, від чотири до семиланкових, зокрема, шести багатократно, наприклад, однократно ненасичені або п'ятиланкові конденсовані кільця, причому, як аналоги вищеназваних алканів. мінімум, одно, переважно всі кільця мають аро- Субстратами групи а), що оксидують відпо- матичний вигляд і, як мінімум, одно з ароматич- відно до винаходу є в разі необхідності заміщені них кілець несе в собі від одного до трьох, пере- циклоалкани і циклоалкени з 4-8 кільцевими ато- важно один М-, О-, або 5-гетероатом. У загальній мами вуглецю. Приклади такого роду представ- кільцевій структурі можуть бути в разі необхідно- ляють циклопентан, циклопентен, циклогексан, сті один або два інших однакових або різних ге- циклогексен, циклогептан і циклогептен. Кільцева тероатоми. Ароматичні сполуки можуть нести структура при цьому може містити один або декі- також від 1 до 5 замісників кільцевого вуглецю лька, наприклад, від 1 до 5 замісників відповідно або гетероатомів. Прикладами придатних заміс- до вищевказаного визначення для сполук групи ників є від Сі- до С--алкіл, як метил, етил, п- або а) і Б). Необмежуючими прикладами для цього є і-пропіл, або п-, і- або Іі-бутил, або від Со- до С4- іонони, як о-, Д- і у-іонон, а також відповідні мети- алкеніл, як етеніл, 1-пропеніл, 2-пропеніл, 1- ліонони і ізометиліонони. Особливо кращі с- і р- бутеніл, 2-бутеніл або 3-бутеніл, гідроксили і га- іонон. логени, як Е, СІ або Вг. Названі алкілові або ал- Об'єктом винаходу є також послідовності ну- кенілові замісники в разі необхідності можуть клеїнових кислот, кодовані для заявленої моноо- мати також кето- або альдегідну групу, як, напри- ксигенази. Кращі послідовності виведені з ЗЕО 10 клад, пропан-2-он-3-іл, бутан-2-ол-4-іл, З-бутен-2- МО:1, що, як мінімум, має одно нуклеотидне за- ол-4-іл. Необмежуючими прикладами придатних міщення, що веде до однієї з вищеописаних фун- гетероциклічних субстратів є, зокрема, дволанко- кціональних амінокислотних мутацій. Об'єктом ві гетероцикли, як індол, М-метиліндол і їх анало- винаходу є, крім того, функціональні аналоги нук- ги, заміщені від одного до трьох вищевизначени- леїнових кислот, що одержуються шляхом дода- ми замісниками атомів вуглецю, як, наприклад, 5- вання, заміщення, вставки і/або видалення оди- хлор-або 5-бром-індол; а також хінолін і похідні ночних або декількох нуклеотидів, що надалі хіноліну, як, наприклад, 8-метилхінолін, 6- кодують монооксигеназу з бажаною специфічніс- метилхінолін і хінальдин; бензотіофен і його ана- тю субстрату, як, наприклад, з окислюючою індол логи, заміщені від одного до трьох вищевизначе- активністю. ними замісниками атомів вуглецю. Відповідно до винаходу охоплюються також

Субстрати групи Б), що оксидують відповідно такі послідовності нуклеотидів, що включають так до винаходу, в разі необхідності є заміщеними називані німі мутації, або змінені відповідно до одно- або багатоланковими ароматичними вугле- використання для кодування спеціального органі- воднями, як бензол і нафталін. Ароматичні спо- зму походження або організму хазяїна в порів- луки в разі необхідності можуть бути однократно нянні з конкретно названою послідовністю, також або багатократно заміщеними і, наприклад, мати як і попередні природні варіанти. Винахід охоп- від 1 до 5 замісників атомів вуглецю кільця. При- лює, крім того, також різновиди послідовностей кладами придатних замісників є від й- до Са4- нуклеїнових кислот, отримані шляхом дегенерації алкіл, як метил, етил, н- або ізо-пропіл, або н-, генетичного коду (тобто без зміни кореспондую- ізо- або трет-бутил, або від Сг2- до Са-алкеніл, як чої послідовності амінокислот) або консерватив- етеніл, 1-пропеніл, 2-пропеніл, 1-бутеніл, 2- ного заміщення нуклеотидів (тобто кореспондую- бутеніл або 3-бутеніл, гідроксили і галогени, як Е, чі амінокислоти заміняються іншими

СІ або Вг. Вищевказані алкілові або алкенілові амінокислотами того ж заряду, величини, поляр- замісники в разі необхідності можуть мати також ності і/або розчинності), а також змінені шляхом кето- або альдегідну групу, як, наприклад, про- додавання, вставки, інверсії або видалення нук- пан-2-он-З-іл, бутан-2-ол-4-іл, З-бутен-2-ол-4-іл. леотидів послідовності, що кодують заявлену

Ароматичний вуглеводень в разі необхідності монооксигеназу "зі зміненим профілем субстра- може бути конденсований чотири - семичленним ту", а також кореспондуючі комплементарні пос- неароматичним кільцем. Неароматичне кільце в лідовності. разі необхідності може виявляти один або два Об'єктом винаходу є, крім того, експресійні подвійних зв'язки С-С, одно або багатократно конструкти, що містять при генетичному контролі бути заміщене вищезгаданими замісниками й в регулятивних послідовностей нуклеїнових кислот, разі необхідності нести один або два кільцевих як мінімум, одну послідовність, що кодує заявлені гетероатоми. Прикладами особливо вживаних мутанти нуклеїнових кислот, а також вектори, що ароматичних вуглеводнів є одноланкові, як ку- охоплюють, як мінімум, один з цих експресійних мол, а також дволанкові субстрати, як інден і на- конструктів. фталін, а також заміщені від одного до трьох ви- Відповідні до винаходу конструкти охоплю- щевизначеними замісниками атомів вуглецю. ють промотор 5'-вверх по довжині відповідної

Субстрати групи с), що оксидують відповідно послідовності, що кодує, і термінаторну послідов- до винаходу - нерозгалужені або розгалужені ність 3і-вниз по довжині, а також, у разі необхід-

ності, інші звичайні регулятивні елементи, а саме, генази, а також сигналом термінатора або поліа- оперативно зв'язані з послідовністю, що кодує. денілювання. Для цього застосовують доступну

Під оперативним зв'язуванням розуміють послі- техніку рекомбінації і клонування, описану в |(Т. довне розташування промотору, що кодує послі- Маньятіс, Е.Ф. Фрітш і Дж. Сембрук, Молекьюла довності, термінатора і, в разі необхідності, інших Клонін: Е Лабораторі Меньюал, Колд Спрінг Хар- регулятивних елементів такого роду, щоб кожний бор Лабораторі, Колд Спрінг Харбор, Нью Йорк з регулятивних елементів міг узгоджено викону- (1989) (Т. Мапіаїйі5, Е.Р. Ргйб5сп па 9.Затюгоок, вати свою функцію при експресії послідовності, МоїІесшаг Сіопіпд: А Іабрагагу Мапиаї!, Соїй що кодує. Прикладами оперативно зв'язаних пос- Зрііпд Натог І абогайїюгу, Соїа бргіпд Наїбог, МУ лідовностей є послідовності мішеней, а також (1989)), а також у Т.Ж. Сільхеві, М.Л. Берман і трансляційний підсилювач, помножувач, сигнали Л.В. Енкуїст, Ікспіріментс уїз Джині Фьюжнс, Колд поліаденілювання й інші. Інші регулятивні елеме- Спрінг Харбор Лабораторі, Колд Спрінг Харбор, нти охоплюють селективний маркер, сигнали по- Нью-Йорк (19843, (Т.У бйпаму, М. Вегптап па силення, репліки тому подібне. І М.Епдиіві, Ехрегптепів мій Сепе Еивіоп5, Соїй

Додатково до штучних регуляційних послідо- Зрііпд Нарог І арогайюгу, Соїа бргіпд Наог, МУ вностей перед первинним структурним геном (1984)), і в Аусабель Ф.М. і ін., Карент Протоколз можуть бути ще природна регуляційна послідов- ін Молекула Байолоджі, Гріні Паблішінг Ассос. ність. Шляхом генетичної зміни це природне ре- енд Уайлі Інтерсайнс (1987) (А!,зибреї, Е.М. еї аї., гулювання може виключатися і підвищувати або Ситепі Ргоїосоії5 іп МоїІесціаг Віоіоду, Стгеепе знижувати експресію гена. Конструкт гена може Рибіїзпіпуд Ав5ос. апа УмМіеу Іпіегзсіепсе(1987))|. бути побудований простіше, що означає, що пе- Рекомбінантний конструкт нуклеїнової кисло- ред структурним геном не можуть бути вставлені ти, відповідно, генний конструкт уводиться для додаткові регуляційні сигнали, а природний про- розширення в придатний для цього організм ха- мотор зі своїм регулюванням не віддаляється. зяїна переважним чином у специфічному для

Замість цього природна регулювальна послідов- хазяїна векторі, що уможливлює оптимальну екс- ність мутує так, щоб більше не потрібно було пресію гена в хазяїні. Вектори відомі фахівцям і регулювання, а експресія гена підвищувалася можуть бути взяті з (книги "Вектори клонування" або знижувалася. Послідовності нуклеїнових кис- (Ред. Поувелс П.Х. і ін., Нг59., Ельсевьє, Амстер- лот можуть міститися в генному конструкті в од- дам - Нью-Йорк - Оксфорд, 1985) ("Сіопіпд ній або багатьох копіях. Месіогв", Роцмеів Р.Н. еї аї., Нігзд., ЕІвемів",

Прикладами вживаних промоторів є: со5-, їас- Атвіегдат-Мем/ Моїк- Охіога, 1985))). Під цими Пр-, теї-, тр-гвї-, Ірр-, Іас-, Ірр-Іас-, Іасід-, Т7-, Т5-, векторами крім плазмідів слід розуміти також всі тТ3-, да!-, іго-, ага-, 5РБб-, І-РЕК або І-РІ -промотори, інші відомі фахівцю вектори, як, наприклад, фаги, що знаходять застосування переважно в грамне- віруси, як 5М40, СММ (цитомегаловірус), бакуло- гативних бактеріях, а також грампозитивні промо- вірус і аденовірус, транспозонси, ІЗ-елементи тори ату і 5РО2, дріжджові промотори АОС, (транспосабельні елементи), плазміди, косміди і

МЕа, АС, Р-60, СУС1, САРОН або рослинні про- лінійні або циркулярні ДНК. Ці вектори можуть мотори Самм/355, 5510, ОС5, ІА, изр, 5ТІ 51, репліціюватися або автономно в організмі хазяї-

В33, пов або убіквітинові або фазеолінові промо- на, або хромосомно. тори. Особливо краще застосування промоторів, За допомогою описаних у винаході векторів що індукують, як, наприклад, світло- і, особливо, виробляються рекомбінантні мікроорганізми, що термоіндукованих промоторів, як РРі. Принципо- трансформуються, наприклад, як мінімум, одним во, всі природні промотори можуть застосовува- описаним у винаході вектором і можуть застосо- тися з їх регулюючими послідовностями. Виходя- вуватися для виробництва мутантів. Переважно чи з цього, можуть також з вигодою описані заявлені рекомбінантні конструкти вво- застосовуватися синтетичні промотори. дяться в придатну для цього систему хазяїна,

Вказані регуляторні послідовності повинні за- потім експресуються. При цьому фахівцями за- безпечувати цілеспрямовану експресію послідов- стосовуються переважно відомі методи клону- ностей нуклеїнових кислот і експресію протеїнів. вання і трансфекції, щоб вставити названі нукле-

Це може, наприклад, у залежності від організму Тнові кислоти в відповідну експресійну систему хазяїна означати, що ген експресується або зве- для експресії. Придатні системи описуються, на- рхекспресується тільки після індукції, або він не- приклад, у (|"Карент протоколз ін молекьюла гайно експресується або зверхекспресується. байолоджі", фФ. Аусабель і ін., Нг5д., Вайлі Інтер-

Регуляторні послідовності, відповідно, фак- сайнс, Нью-Йорк 1997 (Сагтепі Ргоюсої5 іп тори можуть при цьому переважно позитивно МоїІесшаг Віоіоду, Р. А!йвибеї еї аї., Нгіза., УМієу впливати на експресію і тим самим підвищувати Іп(егесієпсе, МУ 1997)|. або знижувати її. Таким чином, посилення регу- Як організми хазяїна принципово придатні всі ляторних елементів може здійснюватися перева- організми, що уможливлюють експресію заявле- жно в площині транскрипції, причому застосову- них нуклеїнових кислот, варіантів їх апелів, їх ються сильні транкскрипційні сигнали, як функціональних або еквівалентів похідних. Під промотори і/або "підсилювачі". Поряд з цим мож- організмами хазяїна слід розуміти, наприклад, ливо також посилення трансляції, причому, на- бактерії, гриби, дріжджі, рослинні або тварини приклад, поліпшується стабільність мР НК. клітини. Переважними організмами хазяїна є бак-

Виготовлення експресійної касети здійсню- терії, як бактерії з роду ЕвзсПегіспіа (наприклад, ється шляхом злиття придатного промотору з Езспепспіа соїї), стрептоміцети, бацили або псе- придатною послідовністю нуклеотидів моноокси- вдомонади, еукаріотичні мікроорганізми, як

Засспагітусез сегемізіає, АгзрегоїПив5, еукаріотичні розкладаються, а монооксигеназа добувається з клітини більш високого порядку тваринного або лізату способом ізоляції білка. Клітини можуть рослинного походження, наприклад, 519 або розкладатися на вибір: високочастотним ультра- сно. звуком, високим тиском, як, наприклад, в комірці

При бажанні генний продукт можна вносити тиску Френча, шляхом осмолізу, шляхом впливу для експресії також у трансгенні організми, як детергентів, літичних ензимів або органічних роз- трансгенні тварини, зокрема, в мишей, овець або чинників, за допомогою гомогенізаторів або шля- в трансгенні рослини. В разі трансгенних організ- хом комбінації декількох наведених способів. мів мова може йти також про так звані "нокаутні" Очищення монооксигенази може бути досягнуте тварини або рослини, в яких був виключений ко- такими відомими хроматографічними способами, респондуючий ендогенний ген, наприклад, шля- як хроматографією з молекулярним ситом (геле- хом мутації або часткового або повного вида- ва фільтрація), як хроматографія О-Зерпагове, лення. іонообмінна хроматографія і гідрофобна хрома-

Селекція успішно трансформованих організ- тографія, а також іншими звичайними способами, мів здійснюється маркерним геном, що також як ультрафільтрування, кристалізація, висалю- міститься в векторі або експресійній касеті. Прик- вання, діаліз і нативний гелевий електрофорез. ладом таких маркерних генів є гени стійкості до Придатні способи описані, наприклад, у (Коопер антибіотиків і до ензимів, що каталізують кольо- Ф..Ж., "Біохемічні методи роботи", вид. Вальтер рову реакцію, що викликає фарбування трансфо- де Грайтер, Берлін, Нью-Йорк (Соорег, Б.б., рмованих клітин. Останні можуть тоді відбирати- Віоспетізспе Агреїйвтеїподеп, Мепад Умакег ає ся автоматично. Мікроорганізми, успішно Сгиугег, Вегіїп, Мем/ Могк ) або в Скоупс, Р., "Очи- трансформовані вектором, що несуть ген стійкос- щення білків", вид. Спрінгер, Нью-Йорк, Хайде- ті до антибіотиків (наприклад, 5418 або гідромі- льберг, Берлін (Зсоре5, Е., Ргоївеіп Ригітісайноп, цин) можна селектувати шляхом середовищ, що Зргіпдег Мепад, Мем хогк, Неїєїрего, Вепіп)|. містять антибіотики, або живильних грунтів. Мар- Особливо вигідно застосовувати для ізоляції керні білки, що представлені на поверхні клітин, рекомбінантного білка векторну систему або олі- можуть використовуватися для селекції за допо- гонуклеотиди, що продовжують кДНК на визначе- могою афінної хроматографії. ну послідовність нуклеотидів і тим самим кодують

Комбінація організмів хазяїнів з векторами, подовжені поліпептиди або змішані білки, що що підходять для організмів, як то плазміди, віру- служать для більш простого очищення. Відповідні си або фаги, наприклад, плазміди з системою модифікації такого роду є, наприклад такі, що полімераза/промотор РНК, фаги 7, ц, або інші діють як іммобілізатор так звані "мітки", як, напри- помірні фаги або транспозонси і/або інші регуля- клад, відома як гексагістидиновий іммобілізатор торні послідовності, що мають перевагу, утворює модифікація або епітоп, що може розпізнаватися експресійну систему. Наприклад, під поняттям як антиген антитіл (описаний, наприклад, у Хар- "експресійна система" слід розуміти комбінацію з лоу Е. енд Лейн Д., 1988, Антитіла: Е Лабораторі клітин ссавців, як СНО-клітини, і векторів, як век- Меньюал, Колд Спрінг Харбор (Нью-Йорк) Преб.) тор реоМАЗпео. (Напож Е. апа ІГапе 0., 1988, Апііродієв: А

Як уже згадувалося, генний продукт може пе- Іарогаюгу Мапиа). Соїй Збргіпд Наїбог (М.У.) реважно вводитися для експресії в трансгенні Ргез5))|. Ці іммобілізатори можуть служити для тварини, наприклад, у мишей, в овець або в тра- зв'язування білка на твердих носіях, наприклад, нсгенні рослини. Також можливо програмувати полімерних матрицях, що, наприклад, можуть вільні від клітин трансляційні системи з отриманої бути засипані в хроматографічну колонку, або з нуклеїнової кислоти РНК. можуть застосовуватися на мікротитровальній

Подальшим об'єктом винаходу є спосіб виго- пластині, або на інших носіях. товлення заявленої монооксигенази, коли куль- Одночасно ці іммобілізатори можуть застосо- тивують мікроорганізм, що робить монооксигена- вуватися для розпізнавання білків. Для розпізна- зу, в разі необхідності індукують експресію вання білків можуть застосовуватися, крім того, монооксигенази і виділяють монооксигеназу з такі звичайні маркери, як флуоресцентні барвни- культури. Заявлена монооксигеназа при необхід- ки, ензимні маркери, що після реакції з субстра- ності може вироблятися в промислових масшта- том утворюють продукт реакції, що детектується бах. або радіоактивні маркери самостійно, або в ком-

Мікроорганізми можуть культивуватися і фе- бінації з іммобілізаторами для дериватизації рментуватися відомими способами. Бактерії мо- білків. жуть розмножуватися, наприклад, у ТВ- або І В- Винахід стосується, крім того, способу мікро- середовищі і при температурі від 207С до 40"С і біологічного оксидування органічних сполук, як, значенні рН від 6 до 9. Докладно придатні умови наприклад, М-гетероциклічних одно-, дво- або культивації описуються в |(Т. Маньятіс, Е.Ф. Фрітш багатоланкових вищевизначених ароматичних і Дж. Самбрук, Молекьюла Клонінг, Е Лабораторі сполук, що відрізняються тим, що

Меньюал, Колд Спрінг Харбор Лабораторі, Колд а!) культивують вишеозначений рекомбінан-

Спрінг Харбор, Нью-Йорк (1989) (Т. Мапіаїйв5, Е.Е. тний мікроорганізм у культурі в присутності екзо-

Епівсп апа У. бЗатбгоок, МоіІесшаг Сіопіпд: А генного (внесеного ззовні) або утвореного промі-

І арагаюгу Мапиаї, Соїа 5рііпд Нагбог І арогаюгу, жного оксидуючого субстрату, заявленої

Соа 5рііпу Наїботг, МУ (1989))). монооксигенази, переважно в присутності кисню

У тому випадку, коли монооксигеназа не ви- (тобто аеробно); або діляється в культуральне середовище, клітини аг) інкубують утримуюче субстрат реакційне середовище з заявленим ензимом, переважно в мів здійснюється переважно в присутності кисню присутності кисню і донора електронів; і в комплексному середовищі, як, наприклад, ТВ- р) виділяють продукт оксидування, що утво- або І В-середовище при температурі культивації рився, або послідовний продукт цього з середо- приблизно 20-40"7С і значенні рН від 6 до 9, поки вища. не буде досягнута достатня щільність клітин. До-

Потрібний для перетворення кисень надхо- бавка екзогенного індолу звичайно не потрібна, дить в реакційне середовище з навколишнього оскільки він утворюються мікроорганізмом як повітря або може вводитися, якщо потрібно, ві- проміжний продукт. При перетворенні інших суб- домим способом. стратів може однак вимагатися добавка екзоген-

Субстрат, що оксидується, переважно виби- ного субстрату. Щоб можна було краще керувати рається серед реакцією оксидування, кращим є використання а) у разі необхідності заміщених /-М- промотору, що індукують, особливо, що індуку- гетероциклічних одно-, дво- або багатоланкових ють температурою. При цьому температуру під- вищевизначених ароматичних сполук; вищують до точки індукції, наприклад, 42"С при р) у разі необхідності заміщених одно-, або промоторі Р'РіІ, підтримують її протягом достат- багатоланкових ароматичних вуглеводнів; нього часу, наприклад, від 1 до 10, або від 5 до 6 с) нерозгалужених або розгалужених алканів годин, для експресії активної монооксигенази, а і алкенів; потім зменшують температуру до 30-407С. При а) у разі необхідності заміщених циклоалканів цьому культивація продовжується в присутності і циклоалкенів. кисню від 12 годин до З днів. Зокрема, при окси-

Кращий варіант способу спрямований на дуванні індолу значення рН за рахунок добавки утворення індиго/індирубіну і відрізняється тим, Маон може підвищуватися, наприклад, до 9-10, що субстрат є проміжним індолом, що утворений завдяки чому додатково сприяє утворенню інди- в культурі, і з культурального середовища виді- го, відповідно, індирубіну шляхом оксидування на ляють індиго і/або індирубін, що утворюється, що повітрі ензиматично утворених продуктів оксиду- був отриманий шляхом оксидування проміжних вання 2- і З-гідроксиіндолу. гідроксиіндолів, що утворюються. Утворення |індиго/індирубіну відповідно до

Якщо оксидування відповідно до даного ви- даного винаходу пояснюється наступною схемою находу проводиться за допомогою рекомбінант- реакції: ного мікроорганізму, то культивація мікроорганіз- пута ря Індол н

Мутант РЯБО вМ-З

Окисидування на

Є повітрі нн в ж Димеризациня 5 й й (ЗАС -ов я т песееттстоє етилового фо Ї Й н ч і: й х їх Індиго ра у нн ій , Оксидування на повітрі

Димеризация / з

АВ

Індирубін І е-підроксиїндол (оКендоп)

Н: З-гідроксиїндолі «індокСил)

Якщо оксидування відповідно до винаходу, або збагачених мутантів ензиму, то заявлений навпроти, проводиться за допомогою очищених ензим розчиняють в утримуючому екзогенний субстрат, наприклад, індол, середовищі (прибли- попередня інкубація (приблизно 20-407С). Перет- зно 0,01-10мММ, або 0,05-5мМ) і проводять перет- ворення здійснюється аеробно, в разі необхідно- ворення, переважно в присутності кисню, при сті при додатковому введенні кисню. температурі приблизно від 107С до 50"С, напри- При заявленому способі оксидування кисень, клад, від 30"С до 40"С, і значенні рН приблизно що одержується в реакційному середовищі або від 6 до 9 (яке, наприклад, установлюється при доданий, розщеплюється ензиматично і редукти- 100-200мМ фосфатного або ТРІС-буфера), а та- вно. Потрібний відновний еквівалент поставля- кож у присутності відновника, причому утримуюче ється відновним засобом, що додається, (доно- субстрат середовище містить, крім того, відносно ром електронів). Продукт оксидування, що субстрату, що окислюється, приблизно 1-100 кра- утворюється, далі відокремлюється від середо- тний, або 10-100 кратний молярний надлишок вища й очищається звичайним способом, як, на- відновних еквівалентів. Кращим відновником є приклад, шляхом екстракції або хроматографії.

НАДФН. Добавка відновника може, в разі необ- Подальшими об'єктами винаходу є біореак- хідності, здійснюватися порціями. тори, що включають заявлений ензим або заяв-

Аналогічним способом як субстрати є кращі: лений рекомбінантний організм у іммобілізованій н-гексан, н-октан, н-декан, н-додекан, кумол, І- формі. метиліндол, 5-СІ або Вг-індол, інден, бензотри- Останній об'єкт винаходу стосується застосу- офен, с, Д і у -іонон, акридин, нафталін, б-метил вання заявлених цитохром Р450-монооксигеназ або 8-метилхінолін, хінолін і хінальдин. або заявленого вектора або мікроорганізму для

Наприклад, заявлена ензиматична реакція біологічного оксидування субстрату з груп а)-а), оксидування може проводитися за наступних зокрема, М-гетероциклічних одно, дво або бага- умов: толанкових ароматичних сполук і, переважно,

Концентрація субст- для утворення індиго і/або індирубіну. рату: від 0,01 до 20мММ Запропонований винахід більш докладно

Концентрація ензиму: від 0,1 до 10мг/мл описується з урахуванням наступних прикладів.

Температура реакції: від 107С до 507С Приклад 1

РН: відбдо 8 Рандомізація спеціальних кодонів РАБО ВМ-3

Буфер: від 0,05 до 0,2М фосфа- Дослідження в суттєвому ступені були прове- та калію або ТРІС/НСІ дені так, як описано в (19). Три позиції (Рпев87,

Донор електронів: переважно додається Г ей188 і АІа74) були рандомізовані за допомогою порціями (початкова місцевоспецифічного мутагенезу з застосуванням концентрація приблизно набору бЗігаїадепе ОцікСпапде Кії, Ла Джолла, від 0,1 до 2мг/мл). Каліфорнія, США (Га доПа, СА, ОА). В окремих

Перед початком реакції, наприклад, шляхом позиціях були використані наступні ПЦР- добавки донора електронів (наприклад, НАДФН) приклади: може проводитися короткострокова (1-5 хвилин)

Рпе87: 5 -дсаддадасддуайдпппасаадсіддаса-3 (5ЕО ІЮ МО:3) -сдіссадсидіпппсаасссдісіссідс-3 (ЗЕО ІЮ МО:4)

Ї еи188: 5 -даадсааїдаасаадпппсадсдадсаааїссад-3" (БЕО ІЮ МО:5) 5 -сюдашосісдсідпппсйойНсанодснео-3 (5ЕО ІО МО:6)

АІа74: 5' -дсшдагаааааснааадісаапппскааашотаса-3" (ЗЕО І МО:7) 5 -сдтасааашаадпппідаснаадищаїсааадсо-3' (5ЕО ІЮ МО:8)

Умови для ПЦР були для всіх трьох позицій в Е.соїї ОНБо;, як вже описано (20). Колонії були ідентичні. Зокрема, застосовувалося по 50мкл взяті стерильним зубчатим відбірником і перене- реакційного об'єму, 17,5пмоль кожного прикладу, сені на мікротитровальні пластини з 96 комірка- 20пмоль шаблона плазміду ДНК, Зод. Рій полі- ми, що містять 200мкл середовища ТВ і мерази і 3,25нмоль для кожного аМТР (дезокси- 100мкг/мл ампіциліну на комірку. Після цього всю нуклеозид-5'-трифосфат). Реакція ПЦР була по- ніч при 37"С здійснювалася інкубація. 40мкл клі- чата при 94"С/Іхв, а потім був 20 разів тинної культури кожної комірки були потім пере- повторений наступний цикл: 94"С, їхв; 46"С, ведені в культуральну пробірку, що містила 2мл 2,5хв; 72"С, 17хв. Після 20 циклів реакція була ТВ-середовища з 10Омкг/мл ампіциліну. Після продовжена 15хв. при 72"С. Після ПЦР шаблон цього протягом 2 годин проводилася культивація

ДНК реагував з 20од. Орпі при 37"С протягом З при 37"С. Потім для індукції температура підви- годин. Далі трансформувалися клітини Е.сої щувалася до 42"С на 6 годин. Після цього куль-

ОН5бо. Трансформовані клітини Е.соїї ОН5о; роз- тивація продовжувалася всю ніч при 37"С, при- міщалися на агарових І В-платах, що містили чому був отриманий блакитний пігмент. 150мг/мл ампіциліну. Після цього 18 годин при Препаративне виготовлення ензиму або бла- 37"С здійснювалася інкубація. китного пігменту проводилося, виходячи з ЗО0мл

Приклад 2 клітинної культури (ОО57внм-0,8-1,0). Для ізоляції

Експресія й очищення РА50 ВМ-3 і її мутантів ензиму клітини піддавалися центрифугуванню і виробництво синього пігменту 10хв. при 4000об/хв, потім ресуспендувалися в

Ген Р450 ВМ-3 і його мутанти були експресо- 0,1М КРО»-буфері, рн 7 4. Охолоджені до льоду вані під контролем сильного температурно- клітини обережно розкладалися за допомогою індукованого промотору РаяРі плазміду РСУТЕХРІ приладу Вгапзоп Зопійег5 УМ25 (Дайтцебах, Німе-

ччина) при вихідній потужності З80Вт шляхом три- ним центрифугуванням при 5009 блакитний за- кратного опромінення по 2хв. Суспензії були лишок, що утворився, екстрагувався тетрагідро- центрифуговані 20хв. при 327509. Сирий екстракт фураном (ТГФ). Екстракт випарювався майже до був використаний для визначення активності, сухого стану, і червоний пігмент багатократно відповідно, для очищення ензиму. Очищення екстрагувався абсолютним етанолом. Блакитна ензиму здійснювалася, як описано в (21), на що тверда речовина, що залишилася, була розчине- тут здійснюється настійне посилання. Концентра- на в ТГФф і аналізувалася методом тонкошарової ція очищеного ензиму визначалася з урахуван- хроматографії (ТІ С). Розчин етанолу був випару- ням різниці в екстинкції при 450 і 490нм, як вже ваний і очищений за допомогою силікагелевої описано в (11) із застосуванням коефіцієнта екс- хроматографії (ОС 60, Мерк, Дармштадт, Німеч- тинкції єх91мММ'" см". чина; 2смх3ЗОсм), перш ніж вона була промита

Приклад З ТГФф і петролейним ефіром у співвідношенні 1:2.

Виділення мутантів, що виробляють великі Отриманий червоний розчин був випарений і кількості блакитного пігменту аналізувався методом ТІ С. Абсорбційні спектри

З кожної позиції були виділені відповідно 100 блакитного і червоного пігменту були отримані за колоній мутантів, що були отримані шляхом ран- допомогою спектрофотометра ШКгазрес 3000 домізації кодону відповідної позиції. Ці колонії (Фармасія, Уппсала, Швеція) в області від 400 до були культивовані в культуральних пробірках для 80Оонм. Крім того, блакитний і червоний барвник виробництва блакитного пігменту. Після проми- аналізувався за допомогою мас-спектроскопії і вання клітин водою і багатьох уповільнених опе- ІН-ЯМР-спектроскопії. рацій центрифугування (500об/хв) блакитний піг- Результати експериментів мент був екстрагований диметилсульфоксидом 1. Підвищення виробництва блакитного піг- (ДМСО). Розчинність блакитного пігменту в менту шляхом мутагенезу Р.А5О ВМ-3

ДМСО була найбільшою. Абсорбція екстракту Природний Р4А450 ВМ-3 не має здатності до була визначена в області 677нм. Ті мутанти, що виробництва блакитного пігменту, що містить виробляли найбільшу кількість пігменту відносно індиго, відповідно, проміжні продукти - 2-, відпо- всіх мутантів визначеної позиції, були використа- відно, З-гідроксиїндол. Щоб одержати достатню ні для секвенування ДНК (набір АВІ ОМА кількість блакитного пігменту, РА50О0 ВМ-3 був під-

Зедиепгіегипдв-Кі; АВІ Ріїзтім 377 ОМА даний цілеспрямованому перетворенню. Всі му- бедцепсег) і, крім того, застосовувалися як шаб- танти, що виробляють блакитний пігмент, були лон для місцевоспецифічного рандомізованого секвеновані. Було встановлено, що мутувала, як мутагенезу. мінімум, одна з трьох наступних позицій: Рпев87,

Приклад 4 Гемш188 і АІа74. Тому приймалося, що ці три пози-

Тестування на активність для гідроксилюван- ції відіграють вирішальну роль для активності ня індолу Р4.50 ВМ-3 при виробництві блакитного пігменту.

Активність гідроксилювання індолу перевіря- Зі структури гем-домену цитохрома Р4.50 ВМ-3, лася в розчині, що містив Змкл розчину індолу комплексованого пальмітолеїновою кислотою, 10-500мМ у ДМСО, 850мкл буфера ТРІС/НСІ видно, що Рпе87 охороняє субстрат від ближньо- (0,1М, рН 8,2) і Обнмоль Р450 ВМ-3 природного го зсуву гем-групи (14). Мутант Рпе87Маї! виявляє типу або мутантів у кінцевому об'ємі їІмл. Суміш високу регіо- і стереоселективність при епоксиду- була попередньо інкубована протягом Ухв, перш ванні (145,15К)-арахідонової кислоти (13), а му- ніж запускалася реакція шляхом добавки 50мкл тант Рпе87Аїа переміщає позицію гідроксилю- водяного ТММ розчину НАДФН. Реакція припиня- вання о -1, Ф -2 і ю -3 (22). Позиція 87 була тому лася через 20сек шляхом додавання бомкл 1,2М обрана першою для місцевоспецифічного рандо-

КОН. Протягом 5-30сек (за аеробних умов) ензи- мізованого мутагенезу за допомогою ПЦР. У про- мні продукти були цілком переведені в індиго бірочних культурах було отримано 7 колоній, що (22 -бііндолін|-3,3'і-діон) і індирубін | (А28- після індукції виробляли незначну кількість бла- бііндолін|-2,3"-діон). Продукти індиго були визна- китного пігменту. Колонія, що виробляла найбі- чені шляхом їх абсорбції в області 670нм. Граду- льшу кількість блакитного пігменту, була обрана ювальний графік для чистого індиго на цій дов- для секвенування ДНК. Дані секвенації давали жині хвилі дає коефіцієнт екстинкції З; 9МмМ' см". заміщення Рпе87 на Маї. Мутант Рпе87Маї! був у

Лінійний хід градуювального графіка отриманий підсумку застосований як шаблон на другому колі для виробництва індиго через час реакції в 40сек місцевоспецифічного рандомізованого мутагене- при застосуванні 0,бнмоль природного типу, від- зу в позиції Геш188. Структура гем-домену, ком- повідно, мутанта РА4А50 ВМ-3 і від 0,05 до 5,0ММ плексованого пальмітолеїновою кислотою пока- індолу. Індирубін має дуже слабку абсорбцію при зує, що репозиціонування б- і / о-спіралі 6б7Онм, а кількості індирубіну, що утворилися, приводить залишок Геи188 у прямий контакт із значно менше, ніж кількість індиго. При визна- субстратом (14). Тому ця позиція може відіграва- ченні кінетичних параметрів утворення індирубіну ти важливу роль у зв'язуванні або орієнтуванні не враховувалося. Споживання НАДФН визнача- субстрату. Після проведення другого скринінгу лося шляхом виміру в області 34Онм і розрахунку спостерігалася 31 колонія, що виробляла блакит- з використанням коефіцієнта екстинкції 6,2мММ' ний пігмент. Мутант, що виробляв найбільшу кі- 1см', як описано в (17). лькість пігменту, містив заміщення Рпев87маї і

Приклад 5 Геи188сіІп. Цей мутант був у підсумку мутований

Очищення індиго і індирубіну в позиції АіІа74 у третьому проході місцевоспе-

Після промивання клітин водою і повторюва- цифічного рандомізованого мутагенезу. При цьо-

му одержували трикратні мутанти Е871І188А74 не містить монооксигенази Р.450. Відповідно до (Рпе87Маї, Геш1880іп і АІа74с1у), що робили ба- винаходу, насамперед, повинна бути визначена гато мг блакитного пігменту в дволітровій колбі, каталітична активність чистого ензиму відносно що містить ЗОбмл ТВ-середовища. Цієї кількості індолу. Мутант Е87І 1888А74 був змішаний з ін- було досить для виділення і визначення блакит- долом. Не спостерігалося ніякої кольорової реак- ного пігменту. ції. Тільки після добавки НАДФН у реакційну су- 2. Виділення і визначення блакитного пігме- міш приблизно через 20хв. утворився блакитний нту пігмент. Шляхом доведення значення рН реак-

Після промивання клітин блакитний залишок ційної суміші до значення 11, через Збосек після був екстрагований ТГФф і проаналізований мето- додавання НАДФН, протягом декількох секунд дом тонкошарової хроматографії. Блакитний піг- стало видно синє фарбування. Контрольні дослі- мент був розділений на блакитні компоненти, що дження з застосуванням природного РА5О ВМ-3 швидко просуваються і червоні компоненти, що були завжди негативні, навіть при застосуванні повільно просуваються. Обидва компоненти ма- підвищених концентрацій ензиму, індолу і НАД- ють такі ж параметри рухливості, як компоненти ФН. Блакитний пігмент був екстрагований етила- проби комерційного індиго. цетатом і проаналізований методом тонкошаро-

Після очищення були зареєстровані абсорб- вої хроматографії. Блакитний пігмент знову ційні спектри обох компонентів у ДМСО. Блакит- розділився на блакитний, що швидко просуваєть- ний компонент має такий же спектр, як проба ся і червоний компонент, що повільно просува- комерційного індиго. Очищені блакитні і червоні ється. Рентгенофлуоресцентні значення й абсор- компоненти, відповідно, були проаналізовані за бційні спектри були ідентичні тим же значенням, допомогою мас-спектрометрії. Мас-спектри обох що й в екстракті ферментаційного бульйону. Му- пігментів мають сильний іонномолекулярний пік танти Е8е7!/188А74 Р450 ВМ-3 являють собою при т/2-262 і 2 фрагментарних піки при т/2-234 і гідроксилазу індолу. 205 (відносна інтенсивність, відповідно, 10905). Дотепер було описано тільки два шляхи ен-

Цей зразок є типовим для індигоїдних сполук. зиматичної трансформації індолу в індиго. Один

Елементарний склад цих іонів був визначений за шлях каталізує за допомогою діоксигенази, дру- допомогою мас-спектроскопії високого розділен- гий - стирол-монооксигенази (24, 25). Стехіомет- ня як Сів6НіоМ2гО», Сі5НіоїМ2О, відповідно, С14НоеМе»2. рія НАДФН в обох випадках складає 2. Тому було

Це також характерно для структур індигоїдних прийнято, що на противагу діоксигеназі заявлені типів. Тим самим блакитний пігмент був визначе- мутанти Е871188А74 індолу гідроксилюються ний як індиго, а червоний - як індирубін. Для підт- тільки в одній позиції, щоб утворити оксіндол (2 вердження структури був перевірений "Н-ЯМР гідроксиіндол) або індоксил (3-гідроксиіндол). обох пігментів у розчині ДМСО-О6. Результати 4. Кінетичні параметри гідроксилювання ін- співпадають з літературними даними (23). долу 3. Виробництво індиго з ізольованими ензи- Для визначення кінетичних параметрів гідро- мами ксилювання індолу використовувалися чисті про-

Відомо, що індиго може бути отриманий з ін- би природного ензиму Р4-50 ВМ-3 і мутантів долу шляхом мікробіологічної трансформації (24- Геи18801Іп, Рпе87Маї, Е871І 188 і Е87І 188А74. Ре- 26). Однак жодна з цих мікробіологічних систем зультати представлені в нижченаведеній Табл.

Таблиця

Кінетичні параметри гідроксилювання індолу мутантів РА5О ВМ-3 м

ПИСТИК ЕЕ ТТе ПО ПОС ПОП КОН Ж ТОНН НО ТО а) активності не спостерігалося

Б) не визначено (активність була занадто незначною щоб її можна було вимірити)

Навіть при надлишку очищеного ензиму і ви- 3595, в той час, як значення Кт зменшуються сокій концентрації індолу природний ензим не в приблизно в 7 разів. Це вказує на те, що АіІа74с1у змозі оксидувати індол. Мутант Геи1880іп вияв- і еи188СбіІп беруть участь в зв'язуванні субст- ляє незначну активність. Мутант Рпе87Ма! має рату. каталітичну активність 119М"с" для гідроксилю- Частка оборотності індолу (Кса-2,73с7) для вання індолу. Каталітична ефективність подвій- трикратних мутантів Е87І 188А74 більш ніж у 10 них мутантів Е871188 (Рпе87Маї, ІГей18851п) під- разів вище, ніж для більшості ензимів РА5О (18). вищується до 543М'с! і була підвищена за Приклад 6: рахунок введення інших заміщень АІа74с1Іу до гідроксилювання н-октану модифікованої ци- 1365М'с!. Значення Кса підвищуються від тохром Р450-монооксигенази

Рпе87Маї до трикратних мутантів на, приблизно, Перетворення було проведено за допомогою мутанта монооксигенази РА5О ВМ-3, що містить Продукт видобутку не був знайдений. наступні мутації: Рпе87Маї, Геи18851Іп, АІа74 Су. Приклад 7

Як субстрат був обраний н-октан. Для гідрок- Гідроксилювання ароматичних вуглеводнів, силювання н-октану застосовувався наступний гетероароматичних вуглеводнів, сполук триме- реакційний набір: тилциклогексенілу мутанти Р4А5О ВМ-3: 17,5мг(ліофілізат); а) Приклад 6 був повторений, однак при цьо- буфер: 9,мл (буфер з фосфату му замість н-октану як субстрат був узятий наф- калію, 5ОмММ, рН 7,5); талін. Продуктами виявилися 1-нафтанол і цис- субстрат: 5Омкл розчину бОмММ (в 1,2-дигідрокси-1,2-дигідронафталін. Уведений ацетоні); нафталін перетворювався на 885905. температура: 256 Аналіз реакцій нафталіну

Ліофілізат ензиму був розчинений в 500мкл ас: буфера і відразу з субстратом і буфером був ін- Апаратура: Карло Ерба (Сапо Етба кубований 5хв. при кімнатній температурі. Потім зігитепіагіоп) тип НКОС 4160 на колоночном було здійснене додавання З0О0мкл розчину НАД- інжекторі; колонка: ОВ5 З0м х 0,2мм; матеріал:

ФН (5мг/мл). Додавання НАДФН повторювалося 595 дифеніл - 9595 диметилполісилоксан; газ но- двічі. Хід реакції контролювався шляхом виміру сій: О,5бар Не; температурна програма: 40"С хв. абсорбції на 340нм, завдяки чому можна було ізотерм/10"С/хв. до 300"С; І (1-нафтанол) - спостерігати зменшення НАДФН. НАДФН при 16,68 цьому додавали по Зб0Омкл, оскільки висока кон- 1ТІН-ЯМР: центрація НАДФН веде до дезактивації ензиму. Були ідентифіковані 1-нафтанол і цис-1,2-

Потім для виділення продукту реакційний розчин дигідрокси-1,2-дигідронафталін. був екстрагований З рази по 5мл діетилефіру. Б) Приклад 6 був повторений, однак при цьо-

Об'єднані органічні фази висушувалися за допо- му замість н-октану як субстрат був узятий 8- могою Ма5о»х і збиралися. Потім продукти були метилхінолін. Як головний продукт був ідентифі- проаналізовані методами тонкошарової хромато- кований 5-гідрокси-8-метилхінолін, крім інших графії (ОС), газової хроматографії з мас- похідних (співвідношення продукту 5:1). Уведений спектроскопічним закінченням (С/М5) і ЯМР. продукт перетворювався на 3595. (С/М5 - аналіз реакційної суміші дав наступ- с) Приклад 6 був повторений, однак при цьо- ні результати: му замість н-октану як субстрат був узятий с-

Сполука РІ (хв) У Конверсія (95 іонон. Як головний продукт був ідентифікований 4-октанол 19,51 37 З-гідрокси-о-іонон, крім інших похідних (співвід-

З-октанол 14,08 47 ношення продукту 76:24). Введений продукт пе- г-октанол 14,26 16 ретворювався на 6095. а) Приклад 6 був повторений, однак при цьо-

Температурна програма: 40"С 1хв. ізотерм/ му замість н-октану як субстрат був узятий кумол

З'С/хв. 95"С/ЛОб/хв. 2757С; Апаратура (ізо-пропілбензол). Були ідентифіковані 5 продук-

Ріппідап МАТ 95; С: НР 5890 серія ІЇ щілин- тів моногідрооксиду й один продукт дигідроокси- ний інжектор; колонка: НР-5М5 (метилсилок- ду. Введений продукт перетворювався на 7095. сан) ЗОм х 0,25мм; газ носій: 0,065мл/хв. Не.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«ТО» БАСФ Акціангезвильшадт «1205 Нові цитохром РаБО-монооксигенази і спосіб оксидування ними органічних сполук «1305 МАОЗЯ «140» «14» «16059 «1705 Рвівптінв Мег. 21 «ВО 1 «Ті З150 «212» ДНК «213» Вастив птедаєели «ВоО» «риї» СІВ «вро» (8).АЗ150) «0 ве вса вс ава два ас есе сву сса зав ася Ух ча ву сб вана 48

ТВх оЇїв Буз біз Має Рто бій Рго цу Твх жЖБе сту біб Пец був ї 5 10 15 взає са сечу ба Сса авс зса дає ава сся че сав ост КБУ бу вав 96 дво тез Рко Пес во Ана ТЕ йзв бух Рко Уа1ї бів для баз Мет уж 29. 253 30 аж че чає чаа та зча аа айс БЕЄ ваа с Ччау чо сет Зеє сує 144

Ії дів Дар біз пач сіу біб ї1є ре Був Ве бій Аїа Бхо 5БіУу Ак 35 40 й св всч бус ас ба са вує сву сує ста в ява Чан дса суб зак 192

Чаї Так аку Тут їо бек Бах бів гу ей І1іє Буз сій Ала Суя Ав 50 55 о чва си соус 5Еб чає зай вас ба ау сза че ст йза 5 ба су 249 сіб Зах Аху ББе Азв пу деп обей Бех пів Аза пез пуб Бе унії Асе 70 75 чає шБЄ пса уча час з94 са СЕ дса вус УЗ ясу сяє двя вай ває 285

Авр ЕВе Аіа сіу Взроб3іу Без вве тт бБет ТЕр Тв Нія сти ув Ав во 85 90 95 ба вав дна ЧеФ ва ват абс тва ств шев вус ко веб сад сгач дса 335

Тер Був Буз Кіа Ніз дяц ті1і6 їй Ше) Рго Бех РНе Бех бів бій Аза 100 1035 це ату пап дес бас сає су аб ато Фо да ас цес чЧкч свя ск зх 384

Каб Був сіу Тук Нія зла Меб Мас Уаї дар хів Аїх Уді сія їву уві 115 128 125 сва «ад уч Час сук са ав са Час чад свє веж дя Чка сс дана 432 сій Бу Трр бій Ах бас Аза дія дар сій Ні Іїе бій Улі хо дій 139 135 їі40

Час вт вса суб та зе сб дає аса ак суб сб бус бус СЕ вас 0 «80 вар Мет Твх Аху пемз Те беп Ажр Тв Її Сіу ГПа Сув біу бе вв 145 150 155 І тв сус ж аво здо ес Бас суа дає сву сс сабо сса Кб аб вса 528 тух акч Жнве Акп бек Ре Тут вх Мав сів вхо Бів Рго Ра ї3За тТвЕ ї6о 165 їто 175 вче ве Ес соує удса су Чай аа Чев аку дає за сту са сча са 576 йек Має Уаї АтУу Але пев вар лм Аїн Мес Аяв Буз Пес сій Ах Аїв 150 185 188 авт сса ас ас сеса чсї баб зас Зав авс вва сус свау СЕ свя дай 584 дар ржо вар Алр рхо лів Тужх Вер ща Ана зує дхч с Фів Ве бів Біш ї3з5 200 205 чес вс вва з асо вас бас ста дев дах дав ас ве са чає сус 677 зр Ії пу Уві Має Авп Аяр пе Уві дир Буя Її Хїе діа Ажр АК 210 215 226 ваа часа вує ччЕ зано саа аує ца ца ва ба васу саб «ку ств вас 729 пуз Вів Бех біу Мі бід Бек Ар дар Бей їеа Ти Ніз Меб ем дай 225 230 235 ча вка дав сса дна вс усге да ссу себ сеї Час дасд вас в сує 788: сбіу Був Авр Ро із Тк бі біз РКО їни Ввр о Авнробіц Ана ї1в АгФ 240 245 259 235 бає сай ввЕ ах вси бос ба вес деч зда свс ва аса йса аце я нів ту сій Хі Іїє ТВж РВа пе сіє Ада піу НУ Фіз ТВе ТВ беж біу з5о 255 2795 се Ба Єса ББЕ дсу сб БА бЕс бба Фа ава ває сса саї дта ба 864 ей бе бек Ве діа пез Тух Ве Сеа уві Муз дав туо Віз Узі цео 275 280 285 сза зай си ев чва чав пса дев сова чек сса Чек за соб дев сса 512 сій уз Аза дія біс біз дів Аза Ах Уаії Пе Маї др кто уаї го 290 235 300 аде Бас аха сва чес ява са се аза таб че зас вбу дес сен авс 560

Бех ТЖжк уз сів Маї Цув бій йес був Тут Чаї біу Мес ні їш дай 305 зії 315 чав дсу зу сЧе та бо сса аст ас се до ЕЕ бе ста гак чев 19588 бій Аза без Ах Таб Тхр'яхо ТвВх Аіа во Аза Бра Бех Гви Тух дів 320 325 335 335 ааа аа аб асо тку СБ ча чеа даа КаЄ сеє Ба сад вай дос дає 1055

Туз 10 Авр ТЬж Уві аз сіу бі бі) тує БЕ йве бій Буз біу ар 340 345 ЗБ

Чен ста аб ЧЕ су веж себ Са стЄ шас суб баб ави вса вет буд 1104 січ Таб Має Чаї паз ї1а ро йію їв Ніж Аку Авр о буз Тех їі8 Ттр : 355 380 ЗБ5 ца ус ца усу чва За бе ес сса дао сої ВЕБ даа лав сов ауг 1152 сіу Азб Ачзр чаї січ 013 РВж ЗКУ ко сіб Ву Бе біз дав Во баг за 375 Зо

Че аск ссу сад сає 909 СЕ ава сс У дов вас ус сад сце дея 1200 він її хо сій Ні діз Ра Пуа ро Бнзе сСіу лаб Сі; Сів Аку Вів за5 330 385 тує абс ук сву сад с дсе сб са аа дова дсу соя яса сіб дує 4246

Сує Ії біу пів біз РБе діа гай вів біз Аза Тнг пес Уаї рей СІу 490 485 418 415 ак вч сб айва бас оно час СЕ два дав са аса аяс бас чав сбд 19956

Ме нес їв» бує Віз тбе азр вно бі Авр Ніз ТЕ взй Тух йів Тез 420. 425 430 чав: ат ана Яма аст та ася ся аза сс дав зус СЕ де дея вав 1384 кар тів Бу Сіш тТвс їв тТВх Бай Був вхо сім сі ве Уаї уаї Був : 435 445 445

Чеа ава со адя чав вк ссу сб оце да аж сс їса соб ваде асї 1392 вів туз Бах Муз цуа її РжО їТи Сі бі Іїа РЕ ба вко Бек ТВЕ «450 зай во чав свау ше УСЕ заз ава ців сус дай аву два уав авс оче саж ва 1448 сі біп бек Аїв Був Муя Уаї йху Був Був діа бій Ап Аза Нів Аях 885 419 та ася сс сбо бЕЖ де ста бас чує са авас аа Я яса з. дав два 1488 їнег: ко Бей іїва чаї цем Тух пйіу бек Аяп о Ме біу Тнж А1а БМ б1У 480 а5 499 455 всч вс с За -жЕа дев аб вас дсз аку вас вав Зуа ж ува бод 1536 тв Аза Ак Ар ам А1а Ар їла Вів МНеє дек цу Чіу РБе Ала Ехо 5Заб 508 18 сич ес дев всу сте Чи са сес дес дув вас сб сс сс два зує 1584 біп Мах Аза ТВ бви Авробек Нів Кіа сіу дев пец вхо Аку віча бід

Зі зей 525 дет яса шта ас дів асо дсу ст баЄ вас уує саї ссо сс уваб ас 1632 дів Тай Бей Іі Таї ТВх Аїв Нех Тут аз сіу нія Рго Рхо лавр дяк 539 835 з40 са гад о сай ЖЕ Ес бас 59у та сас сва че сб с дає ка та 1680 зів йув біз РБе Узі Авр Тхр То дер сій А) Бех Аза дяр С1ю вх 545 550 555 і ваза ус це сус тас пе да ж бува вдо дос дв вай ває бод де 1728

Пує сіу Чаї Ахку Тук Бех Чиї Рва сіу Стує сі Авр Буя дав Ткр о дів , 5во 5855 зт 575 аст аса таб сва зах з сс де ве ав дає дай су СЕ дес зоб 1776 твг о ТвВк Тук сів Буш Чаї Бжо Аза бе їз Авр обі) ТУ Без Аїв дій

Ей 585 5ай вав шчч чса зма вас ака че час сус уч: два деа чає чеса ас дає 1824

Був бі1у Аія Чі Аз (16 Аїз дер Атху ху Сіц Аза йхр Аїа бех дир 5УЗ 800 05 час ЕЕ Чан ас аса Сак Чаз дав со сує чай о саб асо ку ат зас 1873 ар вів біз піу Тв Тут біз бій ТЕр АкУ біз ія Меб Тер о бек Ар 610 5і5 520 чів ува дсас Бас бе айс сес дає ас Зах вас ауб ка аб зас ваа 1929

Узі вів діва Тук ВБе деп їец Авр о Їїз біч йап бег сім яр бжа Був в25 830 535 жест асе сб са сб са БЕ чес Час адс цес о дса чаї аб сед ств 1968

Бех Тнх Без бек Пай бів вве уві Хар Бех Аза діа дар Меж вка їй 646 55 550 6555 че вав вк сас Зк уся ЕЕ Бсв зба вас Чо ка дса вус зва аз 2016 віз мує Мах Ні біу Аін Бе Бак ТВг о ляв Уаї У«ї Афа бет Був бї5

ГУ 565 ато скї сав сад сса ус зуб са са водс зсу суа саж сеї Чад зе дав 2064 та сів сів Рко біу Бех Аїа Ах бег ТЕ Ака Ніз пе бію Біє бій 875 во вх сек бса вва дав дит же жав саа дав 5уа вх бай їв чув ве аве 2112 їви гРко уз Сій ліз бек Тук бів бій біу дар Віз пез біу Уві Іїе 550 655 то сеї счи вас вах чЧаз чча аа чув авс сус са аск са ад тс ус 7169

Рхо йху Аз Тут біз бйіу їі чаї лаяв Аця Чаї Твх яхта Аху опе іу 705 710 715 ста чаб вфса беса сву свї абс сує су ей дса Чаї да Чай вав кв 3208 печ Азр Ала Бек бів сій її дк їви бів дія біз Січ бій уз ех

Че сає єб4 оса стес ст вав вса ев сс са за дао сек ск ска 3256

Аза ін реа Рхо ен діа Брує Тнт чаї бе уаї сій Сі їво їеб сій : 740 745 750 їас чу чад СЕ саа дат себ ук ас сос асу сад св бує са аст 2304

Тук Уаї січ Бас бів Ашур Бхо Уаї Твг Жгя ТВ бів їі Ага Аз Ме т755 780 65 чех Чеї зва асу Кс Сус ссу ссу сах ава уби дад се дав пос ж. 7355

Аїів Аїа пуж ХВ Маї Суз РкЕо Вко Вії пу Чаї Пій Печ бів діа їв сн 779 715 78а ст чаа аву сва сс бас вад аа сава З су дса вва са скв'яаспа 0 2400 їв біз пуз бій Аїя Тух Пуг піз бів Уаї Пез Аїз Був Ах їжу ве 785 735 735 аку ст даа сту ст дала вав Бас бе дод їує ува збу зва сс вус 3448

Мат їні сію їлжнх бах біо Бує Тух Бко Ліз Сує сіа Мей Ббуз Ре бах оо 505 810 815 чав ЕЕ аїс дес сх сту сса вус вба сус сод сус Жах ас сш аж 2496 сік ре її для цей їй РКО Зег їіїв Аку Рхо аку Тут Тух Яак тів 820 825 838 жа жЖса тва сс сої 9їс чає аа айва сав чЧесеа вус ас ася дес вад 8544 бетг Бех бех Вго Ахч Уаї дяр ія бує бів Аза беж Тіе ТОК У«і Ве 835 840 845 че Ядкс єса доз дав до БУ адс ча хат ЯЧа дна жаб ава ув зх 2583

Чаї Чаї бех бі сій Аїа Ткр бек Сіу Тух ФУ біз Тух уз бі тіє 850 55 Бо чеЯ су вас вав сеї чес Чво су свя дав дова ди асу абт вс бас 540

Аїа бек АвпоТук Брі із біз пей бів» бій бі Азр тВвжх їі ТВж Суз 585 а 875 жк аж босу оаса соч свя са ува СЕ асч су поса нава дво сс чав 2588 вне І16 Бех Тих Кхо бів бек бій фФБе Тс Бе рго уз Аяр Кко піч

Ів на» вай 55 ас сс сів збс ву дуссо ов ссч Ява аса зас Ба Чеч оса ЕЕ вав аї36

ТВ Втхо Пей Їзіє Неї Чаї піУу Рко піу ТвЕ Пі. У«1і Аїа Рго РБа АхкФ за 505 зів че с У сво чо сус ава сау сса вва дав саа заа сад бсв ск гі -1у РБе уаії сФіп Аза вВху Був бів без Пув бів бів бЗу бів беж Бей з15 928. 925 зда дай дея саї ка кас Єсо дос де суб бса ссео сяє дав час ве 28537

Су сій Аіївн Ніз Пе Тух Ре б1іу Сух Аху Бег Рга Нія б3у зар тує 930 935 940 сб бак ска аа Чад ст чаа вас дос сва вус два Ччус або Ех аез 7980 ії-иа Тут бід біб бів ву СІ Яза Аїва бід бек б Сіу ї1ів її ТЕ 945 950 555 се сає асо усе СЕ ЕСЕ сус аб сса вааб сад ссу пла йаса ас ЕЕ 2978 цес Віз ТВх Аіва РБа Бак Аг Меб рРго Аля бів Рко Бу ТІ Тукг увї зво 965 870 з75 сад сас дта во дав сва дас Зс вад ана тку абс дав себ сс ве 2976 сів нія Чаї Меб сій Сів дер сіу уз Пуз Бец Хі бі бей Пвх дар 980 985 т80 саа дав се сас же баб аб бус ода час дов вус саа ад дев се 0 3024 сіп с21іу Аза ів Рце Хук Ії Суз піу дз сіу Бех Сів Мей дій рРго 995 1000 1005 чес ЧК аз Чсва асу сх аку ава вдос жає де чар уєє сес свв ча 3075

Аї« Маї б) аіїа ТЕХ Паз Мах буа Бех Тук Аїз дер чаї із сів угї 1010 хв 1020 ації чаа щеа Час ус бус та 59 сс сад сад ста два два ана дае 0 3120 ех Сі; Аза Азо Аів Ах їм Ткв Свв бів біб Без бій С1із Був біу 1025 5030 135 сца та деа аа» час ба баз 9дс5 чу ва зі5а вхч Тук Аів уз Авр; Уві ТжЕр аів ФУ 1840 1045 «1052 «2112 1048 «2125 РНАТ «213» Васійше гпедаіечт «МО» тв іє Був бів Має Рко сіб РБко буз ТВ: Ве біт Біс їео муз Аяв ї з ке. 15 ач рхо ппей ва азо ТВ Азр о Пуз Рхо Уаї біп азїа їжи Мас Буз її й 5 за діа вав сій пеп піу сій ї1е Ре бух Бе сі; дів Вго біу Акч Ув1 35 «й 45 тТвх Ак Тух пец Бек Зех бій Аг4 цез їіє Ббуз бій а1в Суз Азр сів

БО 5 60

Бех Агу КВе Авропув йо Хац ех с1в Аза їй Був Ре уві Агу дер 63 70 75 во вве Аїа сіу Авр сіу без Ріє Твх Зег Тур Тк Ніз сій Був дян тер 85 ща 85

Шцуз уз Аіїз Ні Аза Ії їеч за Рго Бек Ра Бек бій бід дів Мет 106 05 110

Буз сїіу тут нії зіва Ме Меє уаї Ажр тіє дія чаї йій ївй тлі бів 115 120 125

Буз Тгр біз аку Ії; Аа Аза Айр обі; Ні її бій чаї вхо ії дер 130 1235 149

Мас тах Аху пес Твх ем АВР ТВ Ті біу цез Суз Ф1іу Ріє Аєп отут 145 150 155 ' 160 вахта Ре аво Бех Бе Тух Аху зр бів Рко Нів Бо Ка їі ТТ бек 185 170 і7т5

Меє уаї джу Аіз ши Авр біс Ві Меб дав Був пез біз Аку йзїа зав 189 185 130

Рхо Ар ар Еко ді Тук зр бі Аз бує Вку Сію ба пів Січ днр 155 200 295

Ії муз Уві Неє дяп Ав їеп маії дер муз Ії Іі дій ляр Яку Куз 210 215 2 дів Бех піу сів бій бак Авр о аз еп їм: Твх Ніз Ме во Азв о б1у 225 230 235 240 уз йвр Рго біз Твж пХу сій Рто тей АЛюр Азр біп дно ї1і8 Аху Тух 245 250 255 біп ї1е Іїв тТвх Ре тез Їїв Аза Сіу Ніз Сів ТбгоТну Баг біу їжи 260 2655 279 їваа Баг Ве діз Та Ту ВБе Пей Узі Був дав о вхо Нів Уукі Бех сій 275 280 зв пує діа діа бій бій А1їа Аїа Ату Уа) Бей Уаї Азр о Рхоа Уві рРхо Баг 2359 295 зо :

Тут муз біп Уві Буз бід їви бух Тук Уаї сі Меб5 Чаї беа вза бід за5 310 315 320

Аїа рез Ак цей Тур Рго ТІ Аіа хо Аза Ре бех рей Тук Аза пуз " З25 330 з35 бі Ав ТВх Уві їз С1у бСіу бів Тук РЕ Бей бій буз біу двр сій 340 - 345 350 во Мес ай ей Хі Рто біп рез Ніз Аку Азр Був ТВх І1е Тер ву 355 зво 345

Авр хр Уаї бій 010 Ве Ак РКО сів Аку Ра бів дяп орто Баг діа 370 3175 зб 16 го бій Лів Аіїа РБе Буш РКО Ра С1й Хан біу 015 Ася дів бук 385 399 з» 200

Їїз біу сів бів РБе Аза ав ніз бій Аза Тву Бе Чаї во біу Меб 405 410 415

Меї пес пув Ні Рбе дяр Бе сій дар йіз ТЬх Аза Тук Сів пе Ав «20 425 430 хіе був біс ТВ ва ТВ ба Був Бо пма сіу рве Узі Уві бтя діа 435 440 «45

Буз беж Пуз пух ї1ію рго Бе сьу зіу їіє Рко беж Ржхо Бех ТВЕ 015 450 455 4660 дів бек діа пув Буя Маі Ахч Бу Був ві ін йяв Аїа Віз йяв ТЕ яв 470 475 ї 480

Рто їй їв ЧУ) їва Тух Сіу Бех айва Ма біу Твх Аза біз б1у ТВх 485 199 495

Аіїв Ат Ав бо Аза Авр її Аза Меї Бех Пуз сту вне Аїа тхо бів

БО за вій уні дів ТВх Гео дер Заг Нів ія Сіу лев Га Рко аку сій бі АТ 515 Ба 525 чуаї їжа І16 Уві ТВж Аза вах Тух АвпобСіу Нів Ро Бко Авр ява Аза за 5135 5ай вуз бій ЕВе Уаі Аве Ткр Тех др біп АтТа Чек Аза Ар осі Уаії Буз 545 зо 555 569 біт маї Ах Тух Зетг уві впе сі1у Суз б1іу Авр Був Аз о тТхр Аза ТвЕ 70 ІВ . тТвх: Тук біб Був уаії РІ Ата РВЕ Ї12 Ар біц ТВвЕ Бей Аза Аїа Був

З8О 585 З сіу діа 415 Аза їі Аіа дар Ака біу сі Аза лвр Аїз Бек Авр дер 595 5а0 05

Рне біп біу Твх Тук б1п біш Тер Аг біз Ніз мас Тр бек дяр Ууаї - Що ві | 620

Аїа Аїв Тук Рве Ав пез дер Її ій бяп бак бії дер дав Бпуз зЗаї зе 35 54аб

ТВжх цей бек їйвч бів Ра Маз Аяр бек АЇв Аза дяр Має Рто їв вів 645 850 35

Муз Меї Ніз Стіу Аїа Ра Бек Тах дез Уаії Уаі Аїа бек Буж сід Гей бей 555 670 сій сій Рто бі Вак Аїа дку бек ТВЖ Аку Нія Бей біз Її бів бе 675 80 вн: вхо буз сіб Аза Вех Тут бій 23 Зіу дар Ні пео Сіу Уві хів рЕо 580 595 760 й хх йап о тТух сії біу її Чаї Айвп йха Уві Тьж Аза ага Ре бі їх 75 715 71ї15 78 дар Аїа бек сів бів ї1їв Аху їев біб Аза сій зій біз був ец віа 7 745 за 735

Кі пай то Бе) АМ1в Був ївк уа)ї бек Уаі січ сів ей їжи бів тує 740 745 758

Уві са ва пів зр ро Уві ТВх Аг ТйБ сів їви Аху лін має Аз 755 тво 788

Аїа шуй Тих Чаї Сув Ржхо Рхо Нів цузв уаї с)а пев біз А1їа цей тео то зв 769 сій пуз біл дів Тухк Бу бію сів Угі Пец Аів уз Агуу Без Тв Меб 785 й 790 193 яп ївч біз реа пео біз пуя Тух Рхо іа Суз піз Меб Був Рів Бех сів во 510 вів те їі дів їжи Бай ро Баш ІЗ Акч рРхОо вх тТуХ Тук Бек хів БЕЖ вгй т 825 830

Беж бет Ржо аку кі зр сь був сій вів Зех їі ТБжх чаї бек св 835 вай 845

Чаї бек сіу біз дїа Ттр Бех Сту Тук сіу біз Тух Буз біу Кіє Аїй

Зо 855 850 ;

Бек Аяп о Тух меч дів бій Бей сів Січ біу Ар ТБ Іїіє Твх Суз рве 855 ато 75 во

18 Бек Тіх Рго бій Зех бій Рна Тк Ту рго Був Ар о рко бій Тк вя5 : 890 855

Рхо пе І1їе Ме Уві сіу Кхо С1іу ТВ Сіу чаї Аза рто бе Ах сіу запо 505 910

РНа уаі сій Аїз АкЧ Буя біо їв пуз сіз Сів Су бій бек їви сіт 515 924 чав біш вза ія їси Тух Бе біу Сух ху Зах рхо нів січ бар Тук їв 930 335 зай тухкх бів січ біб Без біп Ав яз бій бех б) с1у їз3е їі бвх їв 545 350 955 980

Ніз тТвт діа Рвє бек Аху Майї БКОо Аяв бів Рго Був Такт Туб Уаї бів 65 978 . 875

Нія Уві неї бій біб вер шьу уз буз Без Хі бі їі Пай р 016 зва з85 з90 сіу Аіїва нів Ре Тух її Суп біУу йяр Сіу Ба бї1п Меб Аїн Рко дів 595 ії000 1005 чаї ази діа Твх Гац Небо уз Беж Тут Аїа йвр уві Бівз Сів уві Бек 1010 1515 ща2о сій Аїа йлр віа Акту їни ТхвВ о без бів біо Пе біз сіа Був Сіу АкФ 025 1035 1035 1940

Тук Азїн пуз Авр Чаї Тхр аіїв с1У 1045 «ех 3 «115 30 «125 ДНК к2153» Финтетична послідовність «ех «аг» Опис синтатичної послідовності: ПДР приклад «00» З чсязувцасяа Учесуліпас авсстччасаЯ Й «05 4 й «21ї2 30 «тих ДНК «о13» Синтетична послідовність ках «ад Уу» Опис синтетичної послідовності; ПЦР-приклад

«4005 4 ! сасссаусте деовисвасо соссвсесьве зо «1055 ео11ж «1 ДНК «213» Синтетична послідовність «ох «823» Опис синтетичної поспідовность ПІД; приквад «400» 5 чЧчаавусваєди всазоппвся дечасеааває ссаф за «216 «211» ЗО «7122 ДНК «13» Синтетична послідовність «вод» «ей» пис синтетичної поспідовності; ПЦР:приютад «Ода В сеусаєтеде гсостопаве Ккусссахта Й зо «207 «Вії жа хе12» ДНК «іа» Синтетична поспідовність «оо «223» Опис синтетичної лослідовності: ПуР приклад ках 7 честссасаа вазсекавач ссвавзппес: вавсскотас 4 І 41 «2105 В «ох «Фіг» ДНК «13» Синтетична послідовність «ве «223» Опис синтетичної послідовності: ПЦР-приклад «008 сасвсваавес Сазоповббу ассгавесЕ стаєсаавує 40 «10» 8 «24115 1049 «2125 АТ «213» вастив теданви

«0 8

Ма ТВх Іїв Пух пі Меб бко пі Ву Пуз ТВх ре б1іу Січ рец бух і 5 18 15

Аза Бви Бхо печ пез Азо ТВЕ яр мує Рко чаї Сів аїй тез Ме Був то 25 зо

Ії Аа Азр бій пеп біу сіМа І18 бе буз Вбе Сі) Аза рхо сі веч 35 40 45 тзі Тнк Ахе Тук їви Бек бек Сіп Агу Бей Тіє Пуз бій Аза Суя йвр 50 5. во січ ет Аку РБе Ав уз Азп ор бетг бій А)зм Пес пух РБе чаї хе 55 70 75 з вав Ріе Ала сіу Алр б3у їмиі РБа Три бек Тер ТВгЕ Міз Сів був яп 85 за 95

Тк Був бує Лів Ніз Аяп ІзА6 Ппей Гей РКО бак бе Бех біз сів Аза 109 195 її

Мах пуб сіу тТух нів Аза Має МНеб Ук) дяр їі лід уві піп їжа чаї 126 ї25 сів Буз Тр сіз Аху їва Ахв Аз бар сіє ія їіж біз Уаі Бо бій 135 135 140

Азр Меї ТЬх Ак бе ТВжх їви АвБо ТВж ІЗ сіу пей Суб бІіу Бе Ав 145 їі . 155 ї6о тух АкЧ рМо дя Бех Бе Тух аку Авр біл ржо Віз Ро Ре ї1є ТЕ 365 170 175 бах нах аз вка А1а їз Азр ай АТа Ме Авоп о буз без бів вху дів ї85 ї85 ї950 вАло вто Азр Азр Рко Аза Тух лжрв бім Азпобув Ага бів ге бів 63 195 290 205 дар тіє Був чаї Неї Ляв Авр їні ча) АБр обу їїв хів Аза Авр АхФ 210 215 їй

Гуз дів бек піу біч бів Бех зр Аяр бе Без Твх Нівв Меб Тез Азо 228 230 235 258 бі вуз Аяр Вго біз Твї біу біз ртб пев Ар о Аазр см ляд тів Акч - 245 250 255

Тух бі ї1і6 іє Твк Ре цез І16 Аза Ту Вів бів Те ТвжЖ бек сту 26 2855 70

Беп реп бе ріж Аїа їз Тух Ре без узі Шуз Аяв Рхо ній Уаї тва 275 280 «аа біз Буг Кіз Аіа бій Сі Аза азів йго Уаї ей Улі Яярорто удї хо 290 г38 збо

Бех Тук Пуз сію Уві Пув біп Бей уж Тут Маї біу Мет Уві Бев вай 305 зій зі5 320

Сіц віз Без Аг їеа Тхровко ТВ Аа Рхо Аїа Ре бог баз бух аз 325 330 335 пуа біз Азр ТВтІ Уаі пев сіу біу бів Тук Ро їз біб пув СТУ др 34 345 35а сів пес Меє чаї тей Ії рРхо Сів еп ній Агу Ажр був Твх Х1в Тв за5 368 зе5 сіу Авр Авр Уві бі сій РвВе аку Рто січ аку Бе біс Аза вхо бех 370 375 в ) зіа її хо біз Ні дів Ре уз Рго Ре біт дя п0їу бів лкха дів 385 390 395 400

Суз їі С1іу бій бів Бе Аїа Ге нів сів Аї« Твх Без укі пез сід: 405 410 415

Має нас рез Був Ні Ре йяр РбБе біо Азо Нія ТБ деп Тук Сі еш 420 425 440 авор ї1з уз пі ТНжх Іа ТВЕ пеп Бужх рго біз бі Ба Уві Уві Був «35 440 445

Віва пуз бек цує цув Хі рхо їх с1у біу Ііє Рхо бех рко Бех Таж 450 425 460 біз сіп бех діва пуз муч Маї Аху ув буз Аза бій дав Аїа із деп 465 470 415 480 тв вхо тез бен уві вм Тух сіу Бех Ав» Має сі ТтТвнЕ Аїа бів 615 485 490 485, твх ліз Ак Авр рей Аза Азр Ііє йіз Меєб Бех ув сій бе Аїя рт 505 510 сів уаї дія ТвІ їз АвробБек Вів А1з біу Ап ойва рРхо ах біз б1у 52й 5285 "

Аїа Чаї ев хз уаї тих діа бБеї Тук Аза сіу Ніз вхо РКО Ар Аз 535 535 545 та цуз сів Ре Уаі Азр Тур Шен Азр бів діва бек аа Азр сій Чаї 545 55 " з55 5бО пу сіу уаї Ако бук бек Чаї РБе С1У Сув сіу Азр о їув дви тгр ка 555 78 575

Твжх тах Тух бій уз Чаї Рхо вАіїа Бе їїє Айр сій Твг без дів лів 880 зЗе5 5980

Був сіу Аїа сс Ап їі Аза дар Аг сіу біз Аза Авр Аія бах ажр 38 «оо 605 лар ве біз біу ТВх Тук бів біз Тгр Ах біш Нія Неб Тхр Бах Агро 610 вІ5 620 узі Аїа йіа Тук Ре Авп Пец Авр о Ї16 сій Авп о бех сіш яр Ап Був 525 30 5135 . вій

Вес Тйх Бас бах їм сів ве Хаї Авр бек Аза Аза дар Ме Рко Беав 245 50 55 аїз уз Меаї Ніж Сіу Аіїа Ріє бек ТБ Ак Маї Чаї Аіїя« бВех Буя Піп

Е бо вах о7о пез бід сій ко біу Зеж Ала вт бетотТвж Аку Вів Пеє сій Х1Зє 030 75 вй 685 ї-ц Вго пу п)й Аїа бак Тух Сід біс с1у Авр о Ніз ви СТу чаї її 550. 535 709

Рко аку Аяв Тух Бій сіу тів уві лав Ату Чаї ївЕ лів Ату Ра с1у 705 710 тів. 720

Пец Авр о Аїва Бех сій сій І1є гу Бей сіз Аза сій са біз бу» Бей 730 235 лів ніз пе Рго тей Аза Буя ТвкК уві Бех Уа1ї біз бій без баз бів 740 745 ТВ

Туш Уа січ їх бів вро Рхо Узі ТВх Ах Тс оза беє Ах Аї18 Мах 785 - 765 . 7Е5 діа діла їуз Твх Уаї Суз руо ко Нія Буа Уаї бій Би бів Віа пев т7а 775 7ва й й еп сів бує сів діа Тух Буя бів бів Маї пе Аза Був вка Бе Твх 785 : ; 795 . 735 508

Неб йец біз їз тва бій Буз Тут РКО діа Сув бі Меї Був Ре Зех 805 810 віБ

Сі РБе Ще Азії пез рес рРгО бек Із хх Рко Ако Тух ТУЖ бек їїв 820 825 .в3а

Бех Бек ех РКхо Ах Угі Азр са пуяє Фі Аїа бБет Ії Ту Уві вк 835 840 845

Уві Уві Бех ПІУ Сів Аїа Тхр бек С1іу Тух сіу п10 бут бух біт їіїв во 855 вЕ0

Віз Бех Мей Туг Пе; дів 010 Бей сів бів О1у Взр Твт Ії Так Сук 865 т 875 ща тХБе Тіз Зах Твк Рко біп Бек сій ре ТВх без Бко бує Ажер вто сій 885 550 з 595 тТвх Рко їз Їїе Меє Уві Біу вхо біу Твх біу уаї Аїа рто Бе АхФ зай зо5 518 сіу бе Узі біз Аза аку Буя бів за був біс біз Сіх бів баг с 915 з28 з25 сі віч Аза Ніз їшо Тух Ре сіу Суз йку бек хо із Сі лер Тк 936 з35 й 940

Без Тук сіп бій сій рей сі Аза діа Сів Бек біз Сіж Ті їїв Те 950 355 550 тТас нів Те аіа фе Бех Аку Меб рхо Анп бій то бує Тк Тук уві

Й 965 970 975

Сів нія Уві Ммеї сів біз дар сіу ув Шев без Її бій пе) Без Азр за 985 93939 сів біу діє Ні» Рйє Тух ї16 Сув Сіу Авр сіу Бах Сію Меб дія Кго 995 1000 їа95 дів уві біз жів ТВ Сез Меб руб Бех Тух Аба Авр кі ів 03 чах 3016 1515 1020

Бех Фі: Ала дер Аза йо їей Тхр лев Сів бів Без бів стіз Був біу 3025 1030 й 1035 10409 джч Тухк йіа пух Азр о Меї Тхр ат с1у 1045

Література Зсієпсе 255, 1249-1253. 1. Мапо, Т., Оце, 5. і Кадатіуата, Н. (1998) Ргос. 7. ТисКег, С... Нипієу, 9.Н., МіПег, Т.В.ї Нипієу, І В.

Маї!. Асай. сі. ОБА 95, 5511-5515. (1998) Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 95, 5993-5997. 2. йпапд, 9У.-Н., Оамжевз, б. і 5іепппег, МУ. Р. б. 8. Ойцетепеицг, Е., Мошієл, 9У.-В.С. і Мепе?, А. (1997) Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 94, 4504-4509. (1998) Майте (І опаоп) 391, 301-303. 3. Мап, І., Тміспей, М.В., ЕКі5, І.0., Машк, А... 9. Магздеп, А- БА, УМіКіпзоп, В., Сопев, »5.,

Зтійй, М. (1998) Ргос. Май. Асай. сі О5А Оипвіег, М.9У., Зіацпіоп, І Іеадіау, Р.Р. (1998) 95,12825-12831. Зсієпсе 279, 199-201. 4. Сгопіп, С.М. (1998) 9. Віої. Спет. 273, 24465- 10. Спеп, Е., Огеег, А., і Оєап, А. М. (1998) Ргос. 24469. Маї!. Асад. 5сі. 054 95, 11666-11670. 5. М/ЛІК5, Н.М., Най, К- МУ., Реєпеу, В., Юипп, С.В., 11. Водаираїййї, 5.5., ЕвіаргооК, К.МУ. і Реїегзоп,

Миїпеаа, Н., Спіа, М/.М., Вагеїом, О.А., АїКіпзоп, У.А. (1990) У Вісі. Спет. 265, 4233-4239.

Т., Сіагке, А.В., Ноїргоок, І 9. (1988) б5сіепсе 242, 12. Сардеміїа, 9.Н., У/іє, 5., Немід, С, Раїск, .В., 1541-1544. Веїпозіцаївзем, У.,Гшап, С, Сгапат-/ огепсе, 5.Е. і б. Неайзігот, І., З2Іадуі, Ї, Ашшег, УУ.9. (1992) Реїеггоп, 9.А. (1996) У. Віої. Спет. 271, 22663-

22671. Маїиге Віоїесппоіоду 17, 379-384. 13. Станат-і! огепсе, 5., Типшап, ах., Реїегзоп, у.А., 20. 5спмаперего, 0., Зсптідй-Оаппепй, С, Зсптій,

Ріаск, 9У.А., Ме! 5., Немід, С, СараеміМна, 9.Н. У, ї Зсптій, К.О. (1999) Апа! Віоспет. 269,359- (1997) 9. Вісі. Спет. 272, 1127-1135. 366. 14. 1, Н., Рошоз, Т.І. (1997) Маї. Біписішгаї! Віо!., 4, 21. Зопмаперега, Ш, Зргацег, А.Ї, Зесптіаї- 140-146. баппетп, С. і Зсптіа, К.О. У ої Спготаїйодг. А, іп 15. Ваміспапагап, К.С, ЗеКнаг, 5., Воаадирагї!ї, 5., ргезв.

Назетапп, С.А., Реїегзоп, 9.А., ЮОвєізеппоїег, 1 22. Оїїмег, С.Р., Мода, 5., Зцісійе, М.9., Ріітгове, (1993) 5сієпсе 261,731-736. ММ.О., Шап, С.М. і Корегі5, с.С.К (1997) 16. Моаді 5., Зцісійе, М.О., Ріїтгозе, М.0., Пап, Г.- Віоспетівігу 36, 25 1567-1572.

У., Ворегів, (3.0.К (1996) Маї. бігписішга Віої. З, 23. Най, 5., Косп, К.МК. і УМоса5, О.К. (1992) У Сеп. 414-417. Місгобіо!. 138, 211-216. 17. Оїїмег, С.Р., Моаді 5., Ргітгозе, МУ.О., Сап, М. і 24. Мигдоск, О., ЕпеІеу, В.О., зегааг, С і Тпаїеп,

Вобетгів, (.С.К (1997) Віоспет. у 327, 537-544. М. (1993) Віо/Тесппоїоду 11, 381-385. 18. Сйепдепси, Б.С. (1991) У. Віої. Спет. 266, 25. О'соппог, ІСЕ., борзоп, А-ЛМ. і Наптап», 5. 10019-10022. (1997) Аррі. Епмігоп. Місгобіо!. 63, 4287-4291. 19. Спегту, 9.В., І атвга, М.Н., Зсппеїдег, Р., Міпа, 26. Еаюп, КМУ. і Спартап, Р... (1995) У Васіегіо!. у., змепазеп, А., допев, А. і Редегзеп, А.Н. (1999) 177, 6983-6988.

Комп'ютерна верстка 0. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601