JPWO2004078988A1 - 芳香族ジオールの製造方法 - Google Patents

Abstract

下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：（式中、Ｈ１は複素環式基等であり、Ａ１は単結合等であり、Ｐ２はフェニル基等であり、Ａ２はアルキレン基等であり、Ｃ１はヘテロ原子置換環式炭化水素基である。ただし、Ｃ１における環式炭化水素基はフェニル基を含まない。）で表されるフェニル基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させて、芳香族ジオール化合物（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：（式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、Ａ２及びＣ１は前記定義のとおりである。）を得ることを含む芳香族ジオールの製造法。

Description

本発明の属する技術分野は、有機低分子化合物である脂質・脂質性化合物（即ち、水よりも有機溶媒（たとえばｎ−オクタノール）に溶けやすい物質）の生触媒工学（ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；又は、酵素工学（ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）とも言う）である。具体的には、組換え大腸菌等の組換え微生物を用いた生物工学的変換により、医薬品または医薬品様化合物等の産業上有用な有機低分子化合物、さらには、これらに繋げるための化学合成法のビルディングブロックを製造しようとするものである。さらに具体的には、本発明は、フェニル基等を含む芳香族化合物を原料として用い、そこから、フェニル基等の芳香族基内の隣合った位置に特異的に２つの水酸基が導入された芳香族化合物（芳香族ジオール）を製造する方法、および、この製造方法により得られた抗酸化活性を有する芳香族ジオールに関するものである。

現在までに多くの芳香族（芳香環）化合物ジオキシゲナーゼ［以後、芳香環ジオキシゲナーゼ（ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）と呼ぶ］に関する研究が行われてきた。芳香環ジオキシゲナーゼは、通常、フェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）及びフェレドキシンレダクターゼ（還元酵素）（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，別名：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を構成要素とし、さらにジオキシゲナーゼ本体酵素［大サブユニット（α−サブユニット）と小サブユニット（β−サブユニット）の２つからなる］からなる多成分酵素（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）である。
現在では、種々の芳香環ジオキシゲナーゼが知られており、それらをコードする遺伝子の構造や機能の解析も実施されている。現在までに単離され解析された代表的な芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子の例を挙げると、トルエン、ベンゼン等の有機溶媒資化細菌シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｆ１株由来のトルエンジオキシゲナーゼ（ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｚｙｌｓｔｒａ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ１：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｔｏｄ Ｃ１Ｃ２ＢＡＤＥ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４９４０−１４９４６，１９８９）、及び、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＣＩＢ９８１６−４株由来のナフタレンジオキシゲナーゼ（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｋ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｄｉｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＮＣＢＩ ９８１６．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７，４３８−４５７，１９９６）、及び、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）分解細菌シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ ｐｕｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ（ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓ ｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６，３９２−３９８，１９８６）、及び、多環式芳香族炭化水素分解細菌のノカルディオイデス属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．）ＫＰ７株由来のフェナントレン（フェナンスレン）ジオキシゲナーゼ（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｓａｉｔｏ，Ａ，Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＫＰ７：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，２１３４−２１４１，２０００）等が知られている。
本発明者らは、最近、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子として、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子を分子進化工学的手法により改変したものを作製し、これを導入・発現させた大腸菌を用いて、フェニル基等を含む複素環芳香族化合物からジヒドロジオール体を作製することに成功した（下記の非特許文献１又は特許文献１参照）。すなわち、我々は、ビフェニルやＰＣＢの分解細菌であるシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株から単離されたビフェニルジオキシゲナーゼにおける大サブユニットをコードするＤＮＡを、他のビフェニル分解細菌であるブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするＤＮＡとの間でＤＮＡシャフリング（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を行い基質特異性の幅を広げた遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子と呼ぶ］を作製した。このｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子と、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット以外の３つの構成要素をコードする遺伝子（ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子）からなる改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子（群）を作製した。本遺伝子を導入・発現させた大腸菌形質転換体を用いて、種々のフェニル基等を含む芳香族化合物を変換できるか（基質として認識できるか）どうかの検討を行ったところ、これまで広範に同種の変換実験が行われてきたにもかかわらず、報告が無かった複素環芳香族基を含む有機低分子化合物の生物変換が可能であることが見出された。すなわち、ＤＮＡシャフリングした改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）］を含む大腸菌が、種々のフェニル基等を含む複素環芳香族化合物を変換し、フェニル基または複素環芳香族基内の隣合った位置に位置特異的に２つの水酸基と２つの水素が導入された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体を立体選択的に生成できることがわかった。この改変ビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットのアミノ酸配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＢ０８５７４８に示されている。また、ＫＦ７０７株の小サブユニット（ＢｐｈＡ２）、フェレドキシン（ＢｐｈＡ３）、及び、フェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＡ４）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ８３６７３に示されている。また、本研究により生成された芳香族−シス−ジヒドロジオール体の例を下記に示す。

これから明らかなように、本研究による生物工学的変換法により、種々のフェニル基等を含む複素環芳香族化合物に水酸基を位置特異的に導入することが可能となったが、その中でも代表的な反応の例は、複素環芳香族基とフェニル基が単結合（ビフェニル結合）した有機低分子化合物を基質とし、産物として、複素環芳香族基−シス−２，３−ジヒドロベンゼンジオール（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ ｇｒｏｕｐ−ｃｉｓ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｅｚｅｎｅｄｉｏｌ，別名：複素環芳香族基−ｃｉｓ−２，３−ジヒドキシシクロヘキサ−４，６−ジエン，ｈｅｔｅｒｏａｒｏａｍｔｉｃ ｇｒｏｕｐ−ｃｉｓ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｃｙｃｌｏｈｅｘａ−４，６−ｄｉｅｎｅ）を合成する立体特異的反応（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。しかしながら、本シス−ジヒドロジオール体は、さらなる立体選択的化学合成のためのビルディングブロックとして主たる用途があり、この目的のために、シス−ジヒドロジオール体になったフェニル環は環開裂される運命にある（Ｈｕｄｌｉｃｋｙ，Ｔ．，Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｄ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，３２，３５−６２，１９９９）。
生理活性を有する有機低分子化合物は、フェニル基を始めとする芳香族基や種々の複素環式基を含むものが多い。これらのフェニル基等の芳香族基を含む有機低分子化合物において、フェニル基等の芳香族基内の二重結合をそのまま残しながら、芳香族基（フェニル基）に位置特異的に水酸基を導入する技術を開発することは有機化学者の長年の夢であるが、未だに技術開発されていないのが現状であった。
特開２００３−２６９号公報 Ｍｉｓａｗａ，Ｎ．，Ｓｈｉｎｄｏ，Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ｓｕｅｎａｇａ，Ｈ．，Ｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ．"Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ"，５８，９６０５−９６１２，２００２．

最近の医薬品研究開発においては、まず創薬のターゲットとするべき疾患関連分子（創薬標的分子）を明らかにした後、その創薬標的分子を用いて何らかの生物活性を指標に高速化スクリーニング（ハイスループット・スクリーニング，Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＨＴＳ）を行い、ヒットする化合物を探すという方法がよく取られる。この際に、経口用医薬品（合成医薬品、低分子性医薬品とも呼ばれる）に繋げるためのリード化合物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；通常分子量１００−７００位の脂質性化合物）のスクリーニングソース（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｏｕｒｃｅ）のライブラリーが必要となる。このライブラリーの質と量が医薬品研究開発の正否を決定づけると言っても過言ではない。現在、スクリーニングソースのライブラリーはコンビナトリアルケミストリー（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）等の有機化学技術によって化学合成されたものが主流を占めている（田中昭弘，創薬とコンビナトリアルケミストリー，蛋白質 核酸 酵素，４５，８８７−８９４，２０００）。微生物代謝産物等の天然物由来のライブラリーも経口用医薬品の研究開発に用いられているが、偽ヒット体（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）が多い、活性物質の特定に時間がかかる、新規化合物が見つかりにくい等の理由で、天然物由来のものが占める割合は少なくなりつつある。一方、化学合成されたスクリーニングソースのライブラリーはそれ特有の偏りを有している場合が多い。たとえば、化学合成法では、プラスとマイナスのものをくっつける反応（たとえば−ＮＨＣＯ−結合を介して２つの前躯体の化合物を導入する反応）は得意であるが、水酸基などの官能基をある化合物の特定の位置に導入したり、立体特異的に導入したりするのは困難である。
また、医薬品研究開発において、ＨＴＳにより創薬標的分子に作用するリード化合物が発見された後には、そのリード化合物の類縁体を作り、最適な開発候補化合物を見出す必要がある（リード最適化，ｌｅａｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）。このリード化合物の類縁体作製に際しても、現在は化学合成法が主流であり、有機化学反応特有の偏りを有していると見ることができる。
本発明は、上記の化学合成法の弱点を補い、スクリーニングソースのライブラリーやリード化合物類縁体等の産業上有用な有機低分子化合物の作製に際して、これらの質を高め多様性を増大させることを課題としている。
さらに具体的な本発明が解決しようとする課題としては、フェニル基等の芳香族基を含む有機低分子化合物、例えば、非置換フェニル基と置換基を有していてもよい複素環式基とを含む芳香族化合物において、前記フェニル基内の二重結合をそのまま残しながら、フェニル基に位置特異的に水酸基を導入する技術を開発することにあり、また、その技術により位置特異的に水酸基が導入された芳香族水酸化物を提供することである。なお、フェニル基と複素環式基を含む有機低分子化合物を本技術開発のための代表的基質として選んだ理由は、経口用医薬品を始めとする生理活性物質には、この２種類の官能基を持つ割合が高いと考えられたからである。
発明者は上記課題を達成するため、急速な進歩を遂げる分子生物学的手法を取り入れて、生物機能を応用した新しい有機低分子化合物の創製技術を構築することを目指した。すなわち、生物の持つ「生分解」或いは「生合成」経路の一群の酵素に注目し、必要なら、分子進化工学的手法等を用いてそれぞれの構成酵素の基質特異性を下げ、幅広い化合物に対して「生分解」或いは「生合成」反応を起こさせることにより、高効率で新規な化合物を創製する技術の確立を目指した。我々はこの技術を“ＢｉｏＣｏｍｂｉＣｈｅｍ”（Ｂｉｏｌｏｇｙ−ｂａｓｅｄＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）と呼称している。
本発明者は、ＢｉｏＣｏｍｂｉＣｈｅｍ技術の構築のための研究を通して、上記の具体的課題を解決するため鋭意検討を重ねた。その結果、前述の改変芳香環（改変ビフェニル）ジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４］と共に、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐ． ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＫＦ７０７株由来のｂｐｈＢ遺伝子［芳香環（ビフェニル）ジヒドロジオール デサチュラーゼ（デヒドロゲナーゼ）遺伝子］を同時に働かせて、フェニル基等の芳香族基を含む有機低分子化合物と反応させると、フェニル基等の芳香族基に２つの水酸基が隣り合って位置特異的に導入された芳香族ジオールが生成されることを発見した。なお、本発明で用いた基質であるフェニル基等の芳香族基を含む有機低分子化合物は、現在まで行われた種々の芳香環ジオキシゲナーゼと芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼによる反応では報告が無かったものばかりであり、このような基質を用いて芳香環ジオールが反応特異的に生成することは予想外のことであった。これは、本発明で用いた芳香環ジヒドロジオール（ジヒドロビフェニルジオール）デサチュラーゼ（デヒドロゲナーゼ）が、改変芳香環（改変ビフェニル）ジオキシゲナーゼにより生成された多様な反応産物（芳香族ジヒドロジオール体）を連続的に基質として認識し、更に変換反応を効率的に行うことができたことを意味している。
本発明は以上のような知見を基に完成されたものである。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：

（式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ａ２は置換基を有していてもよい炭素数２〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｃ１はヘテロ原子置換環式炭化水素基である。ただし、Ｃ１における環式炭化水素基はフェニル基を含まない。）
で表されるフェニル基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させて、芳香族ジオール化合物（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：

（式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、Ａ２及びＣ１は前記定義のとおりである。）
を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
（２）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである前記（１）記載の製造方法。
（３）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：

（式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ａ２は置換基を有していてもよい炭素数２〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｃ１はヘテロ原子置換環式炭化水素基である。ただし、Ｃ１における環式炭化水素基はフェニル基を含まない。）
で表されるフェニル基を含む芳香族化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、芳香族ジオール化合物（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：

（式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、Ａ２及びＣ１は前記定義のとおりである。）
を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
（４）組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである前記（３）記載の製造方法。
（５）組換え微生物が組換え大腸菌である前記（３）又は（４）記載の製造方法。
（６）下記式（ＩＶ）：

（式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ３は置換基を有するフェニル基であり、Ｈ２は非置換複素環芳香族基である。）
で表される複素環芳香族基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させ、複素環芳香族基Ｈ２内の隣合った位置に２つの水酸基が導入された芳香族化合物を得ることを含む複素環芳香族ジオールの製造方法。
（７）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである前記（６）記載の製造方法。
（８）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（ＩＶ）：

（式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ３は置換基を有するフェニル基であり、Ｈ２は非置換複素環芳香族基である。）
で表される複素環芳香族基を含む芳香族化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、複素環芳香族基Ｈ２内の隣合った位置に２つの水酸基が導入された芳香族化合物を得ることを含む複素環芳香族ジオールの製造方法。
（９）組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである前記（８）記載の製造方法。
（１０）組換え微生物が組換え大腸菌である前記（８）又は（９）記載の製造方法。
（１１）式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表されるフェニル基を含む芳香族化合物が、フラボン、フラバノン、６−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシイソフラボン、２−フェニルピリジン、２−フェニルインドール、２−フェニルベンゾキサゾール、２−フェニルベンゾチアゾール、２−フェニルキノリン、４−フェニルモルホリン、１−ベンジルイミダゾール、２−ベンジルピリジン、１−ベンジルピペリドン、（トランス−）カルコン及び３−フェニルインダノンからなる群より選択されるものである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（１２）式（ＩＶ）で表される複素環芳香族基を含む芳香族化合物が、２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾールであり、得られる複素環芳香族ジオールが２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾール−４，５−ジオールである前記（６）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１３）前記（１）〜（１２）のいずれかに記載の製造方法により得られる芳香族ジオールを含む抗酸化剤。
（１４）芳香族ジオールが、２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシクロメン−４−オン、３−インドール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール、３−ベンゾキサゾール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール、３−ベンゾチアゾール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール又は３−モルホリン−４−イルベンゼン−１，２−ジオールである前記（１３）記載の抗酸化剤。
（１５）２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシクロマン−４−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−７−ヒドロキシクロメン−４−オン、３−（２−ピリジル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（２−キノリル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（イミダゾリルメチル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（２−ピリジルメチル）ベンゼン−１，２−ジオール、１−［（２，３−ジヒドロキシフェニル）メチル］ピペリジン−４−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−１−フェニルプロパン−１−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）インダン−１−オン、２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾオキサゾール−４，５−ジオール又は３−（１−アミノエチル）ベンゼン−１，２−ジオール。
（１６）前記（１５）に記載のいずれかの化合物を含有する抗酸化剤。
（１７）下記式（Ｖ）：

（式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
で表される芳香族化合物のアミノ基をＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）保護基で保護した後、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼと反応させて、芳香族ジオール化合物（Ｖ’）：

（式中、ＢＯＣはＢＯＣ保護基を表し、Ａ１は前記定義のとおりである。）
を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
（１８）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである前記（１７）記載の製造方法。
（１９）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（Ｖ）：

（式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
で表される芳香族化合物のアミノ基をＢＯＣ保護基で保護した化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、芳香族ジオール化合物（Ｖ’）：

（式中、ＢＯＣはＢＯＣ保護基を表し、Ａ１は前記定義のとおりである。）
を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
（２０）組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである前記（１９）記載の製造方法。
（２１）組換え微生物が組換え大腸菌である前記（１９）又は（２０）に記載の製造方法。
（２２）式（Ｖ）で表される化合物が、アニリン、ベンジルアミン、１−フェニルエチルアミンである前記（１７）〜（２１）のいずれかに記載の製造方法。
（２３）下記式（ＶＩ）：

（式中、Ａ３は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
で表される芳香族化合物のカルボキシル基を炭素数１〜４のアルキル保護基Ｒで保護した後、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼと反応させて、芳香族ジオール化合物（ＶＩ’）：

（式中、Ｒは炭素数１〜４のアルキル保護基を表し、Ａ３は前記定義のとおりである。）
を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
（２４）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである前記（２３）記載の製造方法。
（２５）芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（ＶＩ）：

（式中、Ａ３は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
で表される芳香族化合物のカルボキシル基を炭素数１〜４のアルキル保護基Ｒで保護した化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、芳香族ジオール化合物（ＶＩ’）：

（式中、Ｒはアルキル保護基を表し、Ａ３は前記定義のとおりである。）
を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
（２６）組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである前記（２５）記載の製造方法。
（２７）組換え微生物が組換え大腸菌である前記（２５）又は（２６）記載の製造方法。
（２８）式（ＶＩ）で表される化合物が、ケイヒ酸である前記（２３）〜（２７）のいずれか１項に記載の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．芳香環ジオキシゲナーゼ（ビフェニルジオキシゲナーゼ）及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ（ジヒドロビフェニルジオール デサチュラーゼ）
本発明では、２種類の酵素、すなわち、改変芳香環（改変ビフェニル）ジオキシゲナーゼ（今後は単に「芳香環ジオキシゲナーゼ」と記載）及び芳香環（ビフェニル）ジヒドロジオール デサチュラーゼ（デヒドロゲナーゼ）（今後は単に「芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ」と記載）の活性を利用している。これらの酵素は上記酵素をコードする遺伝子を有する微生物から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ビフェニルやＰＣＢ等を分解するビフェニル分解細菌、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎ ａｓ）属、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎ ａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属等に属する細菌を挙げることができる。これらの属に属する細菌の例としては、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Ｓｐ ｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス・グロベルラス（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏ ｂｅｒｕｌｕｓ）、ラルストニア・オキサラティカ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｏｘａｌａｔｉｃａ）等を挙げることができる。これらの細菌は、ＡＴＣＣやＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。ただし、本発明で利用可能な微生物は上記のものに限定されず、芳香環ジオキシゲナーゼあるいは芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一方を有する微生物であればどのようなものでも利用することができる。なお、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子と芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ遺伝子は通常、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ内において、隣通しかごく近傍に存在しているので、どちらか一方の遺伝子の配列を含むクローン、たとえばコスミドクローン等をコロニーハイブリダイゼーション法等により単離すれば、簡単にもう一方の遺伝子も一緒に単離することができる。
芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子又は芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ遺伝子を有する微生物の一例として、本発明者らは、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕ ｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６，３９２−３９８．１９８６）及びブルクホルデリア・セパシアＬＢ４００株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に近い）（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｍｏｎｄｅｌｌｏ，Ｆ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｇｅｎａｓｅ，ａ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｉｎ ＬＢ４００．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，２９０３−２９１２，１９９２）の解析を行い、上記２種類の酵素遺伝子を単離している。シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＡ１Ａ２ Ａ３Ａ４）を組み込んだ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＦ６６２２）は、２０００年９月１３日付けで旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現特許生物寄託センター 〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３００）。また、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株とブルクホルデリア・セパシアＬＢ４００株由来のｂｐｈＡ１との間でＤＮＡシャフリングを行い分子進化させたｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子を含む芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４）を組み込んだ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＦ２０７２）は、２０００年９月１３日付けで旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現特許生物寄託センター 〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２９９）。また、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ遺伝子ｂｐｈＢの配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ８３６７３）を配列番号１に示した。
上記２種類の酵素、すなわち、芳香環ジオキシゲナーゼと芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼの元々報告されていた機能を下図に示す（Ｋｉｍｕｒａ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉ，Ａ．，Ｇｏｔｏ，Ｍ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，３９３６−３９４３，１９９７）。

芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子は、ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４からなり、芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼはｂｐｈＢ遺伝子からなっている。
本明細書でいう芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼには、上記の遺伝子を有する微生物から産生されるものだけでなく、例えば、それらの遺伝子間でＤＮＡシャフリング等の分子進化工学的手法を施して得られる改変遺伝子を導入した組換え微生物から産生される改変芳香環ジオキシゲナーゼ及び改変芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ等も含まれる。
本発明者らは、本発明において、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１とブルクホルデリア・セパシアＬＢ４００株のｂｐｈＡ１間でＤＮＡシャフリングを行い、コードされる酵素の基質特異性を広げたｂｐｈＡ１遺伝子（ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＢ０８５７４８）、及び、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４、ｂｐｈＢ遺伝子（ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ８３６７３）を用いた。しかしながら、同様の酵素活性を有する相当遺伝子は他にもあるので、本発明はこれらの遺伝子配列を有する組換え微生物から産生される酵素を利用するものに限定されるものではないことはいうまでもない。
なお、ＤＮＡシャフリング等の分子進化工学的手法は、現在では一般的な手法になりつつあるので、参考文献を参照されたい（たとえば、Ｋｕｒｔｚｍａｎ，Ａ．Ｌ．，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，Ｓ．，Ｖａｈｌｅ，Ｋ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ，Ｖ．，Ｐａｔｔｅｎ Ｐ．Ａ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２，３６１−３７０，２００１）。
２．微生物への導入・発現
本発明では、例えば、上記１で説明した改変芳香環（改変ビフェニル）ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ１（２０７２）：：ｂｐｈＡ２Ａ３ＡＡ４］（ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４）遺伝子、及び、芳香環（ビフェニル）ジヒドロジオールデサチュラーゼ（ｂｐｈＢ）遺伝子を導入・発現させた組換え大腸菌及びその組換え大腸菌が産生する酵素を用いることができる。外来遺伝子を大腸菌に導入・発現する方法は常法により行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）。例えば、大腸菌ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫを用いて、ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４遺伝子の発現にはｌａｃプロモータを利用することができる。
なお、宿主としての微生物は大腸菌に限定されるものではない。たとえば、放線菌であるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｐｍｙｃｅｓ）属細菌で、上記遺伝子を導入・発現させることも可能であり、そのような形質転換した組換え微生物も用いることができる（Ｃｈｕｎ，Ｈ．−Ｋ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，Ｓｈｉｎｄｏ，Ｋ．，Ｍｉｓａｗａ，Ｎ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｅ ａｎｄ ｆｌａｖａｎｏｎｅ ｂｙＳｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ｃｅｌｌｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｈｕｆｆｌｅｄ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２１，１１３−１２１，２００３）。
さらに、組換え大腸菌等の微生物から、必要な酵素を産生させて、それらを用いて物質変換を行うことも容易である。即ち、本発明は組換え微生物と変換したい基質との混合培養により芳香族ジオールを製造するだけでなく、該組み換え微生物または相当遺伝子を有する非組換え微生物が産生する酵素を抽出し、その抽出酵素を用いて芳香族ジオールを製造することもできる。
本発明では、上述のような、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び、芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ遺伝子、又はそれらの改変遺伝子を有する微生物が産生する芳香環ジオキシゲナーゼ、及び、芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼを用いて、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：

（式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ａ２は置換基を有していてもよい炭素数２〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｃ１はヘテロ原子置換環式炭化水素基である。ただし、Ｃ１における環式炭化水素基はフェニル基を含まない。）
で表されるフェニル基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させて、芳香族ジオール化合物（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：

（式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、Ａ２及びＣ１は前記定義のとおりである。）
を得ることを含む芳香族ジオールを製造する。
本明細書でいう「複素環式基」とは、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子からなる群から選択される１以上の異種原子を環原子として含んでなる単環式または二環式の環状基であって、置換基により置換されていてもよいものを意味する。「複素環式基」の例としては、Ｃ_１−４アルキル基により置換されていてもよい５〜７員の飽和または不飽和の単環性複素環式基、およびＣ_１−４アルキル基により置換されていてもよい９〜１１員の飽和または不飽和の二環性複素環式基が挙げられる。「複素環式基」を構成する複素環の具体的な例としては、キノリン、インドール、インダノン、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、ピリジン、３−メチルピリジン、ピリミジン、ピロール、ピラゾール、３−メチルピラゾール、イミダゾール、イソチアゾール、ベンゾフラン、チオフェン、クロモン（４Ｈ−クロメン−４−オン）、クロマン−４−オン、６−ヒドロキシ−クロマン−４−オン、およびフタルイミド等が挙げられる。
また、本明細書でいう「ヘテロ原子置換環式炭化水素基」とは、ヘテロ原子を含む置換基、例えば、−（Ｃ＝Ｏ）−、アミノ基、ヒドロキシル基等を有する環式炭化水素のことをいう。このようなヘテロ原子置換環式炭化水素としては、例えば、インダニル基等が挙げられる。
アルキレン基は−（ＣＨ_２）ｎ−（式中、ｎは１〜４の整数）であって、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、エチリデン基、イソプロピリデン基、プロピレン基等が挙げられる。
アルケニレン基としては、例えば、ビニレン基、１−プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基等が挙げられる。
上記複素環式基、アルキレン基及びアルケニレン基は、その基内に−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−等の構造を含んでいてもよい。さらに、上記複素環式基、アルキレン基及びアルケニレン基は置換基を有していてもよい。置換基としては、炭素数１〜４のアルキル基、アミノ基、ヒドロキシル基、シアノ基等が挙げられる。
本発明において好適に用いられる化合物としては、例えば、以下のような化合物が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物の具体例：

式（ＩＩ）の化合物の具体例：

式（ＩＩＩ）の化合物の具体例：

上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させるか、又はこれらの酵素を産生する微生物とともに培養することにより、下記式のように、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のフェニル基内の隣り合った位置に２つの水酸基を導入することができる。

（式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、Ａ２及びＣ１は前記定義のとおりである。）
即ち、本発明の方法により、例えば、上で示した式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の１６個の化合物からは以下の対応する芳香族ジオール化合物を得ることができる。

上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ（又は、これらの酵素を含む破砕微生物、微生物培養液、粗酵素、精製酵素等）との反応、あるいは上記２つの酵素を産生する微生物とともに培養する方法は、通常の酵素反応又は培養方法と同様にして常法により行なうことができる。
例えば、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される化合物とともに、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼを産生する微生物を培養する方法は以下のようにして行なうことができる。
微生物を培養する培地としては通常、該微生物が生育し得る培地であれば良く、具体的には、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＫＢ培地、ＹＭ培地、ＫＹ培地、Ｆ１０１培地、等が例示される。
炭素源としては菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
培養は、通常、温度２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃であり、ｐＨは５〜９が好ましい。また、適宜、振盪培養や回転培養としてもよい。
培養終了後、培養液を遠心分離機にかけ、上清を回収し、上清液を酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出する。次いで、抽出液をカラムクロマトグラフィー等で処理することにより目的とする芳香族ジオールを得ることができる。
さらに、本発明では芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼの基質として上記式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物の他に下記式（ＩＶ）：

（式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ３は置換基を有するフェニル基であり、Ｈ２は非置換複素環芳香族基である。）
で表される化合物も同様に用いることができる。本明細書でいう「複素環芳香族基」とは、先に述べた複素環式基のうち芳香族性を有する基、例えばベンゾキサゾリル基等のことをいう。
式（ＩＶ）の化合物と芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとの反応、あるいは前記２つの酵素を産生する微生物とともに培養する方法は先に述べたのと同様にして行なうことができる。
式（ＩＶ）の化合物を用いた場合、Ｈ２内の隣合った位置に２つの水酸基が導入される。例えば、式（ＩＶ）の化合物として、２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾール：

を用いた場合、複素環芳香族基が置換された下記式の化合物：

が得られる。
本発明の方法により得られる芳香族ジオール化合物は抗酸化作用を有するので、抗酸化剤として有用である。また、本発明の方法により得られる、２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシクロマン−４−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−７−ヒドロキシクロメン−４−オン、３−（２−ピリジル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（２−キノリル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（イミダゾリルメチル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（２−ピリジルメチル）ベンゼン−１，２−ジオール、１−［（２，３−ジヒドロキシフェニル）メチル］ピペリジン−４−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−１−フェニルプロパン−１−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）インダン−１−オン又は２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾオキサゾール−４，５−ジオールは新規な化合物である。
本発明ではまた、分子内にアミノ基とフェニル基を有する芳香族化合物（芳香族第一級アミン）から芳香族ジオールを製造する方法を提供している。このような芳香族第一級アミンの水酸化物は経口用医薬品や化学原料等の産業上有用な有機低分子化合物の化学合成のためのビルディングブロックとして有用である。一般に、アミノ基を有する有機低分子化合物（第一級アミン）は、分子双極子を有しており、窒素原子の方に電子密度がシフトしている。その結果として、アミノ基は求核性を有している。このような第一級アミンの性質のため、アミノ基をそのままにしたままで、任意の炭素原子部位に官能基を導入することは、生物変換反応によっても、有機化学反応によっても非常に困難であった。発明者らが検討したところによっても、分子内にアミノ基とフェニル基を有する芳香族化合物そのものを芳香環ジオキシゲナーゼの基質にすることは不可能であった。しかしながら、発明者らは以前、芳香族第一級アミンにおけるアミノ基をフタル酸イミド体に化学変換した化合物が、芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４］遺伝子を発現した放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎ ｓ）により、水酸化産物に変換されることを見出した（特許文献１参照）。たとえば、１−フェニルエチルアミンのフタル酸イミド誘導体を、上記の放線菌と混合培養することにより、分子内のフェニル基に水酸基を導入することができた。なお、芳香族第一級アミンのフタル酸イミド誘導体は、抱水ヒドラジン処理することにより、容易にフリー体に導くことができる。しかしながら、芳香族第一級アミンのフタル酸イミド誘導体の変換率は４〜５％と低く、また、同様の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を有する大腸菌では変換することができなかった（特許文献１参照）。
本発明者らは、上記の欠点を補うために検討を加えた結果、分子内にアミノ基とフェニル基を有する芳香族化合物（芳香族第一級アミン）のアミノ基にＢＯＣ（ｔ−ＢＯＣ）保護基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３）を付けた化合物が、芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈ Ａ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４］遺伝子と芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ（ｂｐｈＢ）遺伝子とを有する大腸菌により、高効率で芳香族ジオールに変換されることを見出した。
本発明では、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼの基質として、下記式（Ｖ）：

（式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
で表される芳香族化合物のアミノ基をＢＯＣ保護基で保護した後、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼと反応させることにより、芳香族ジオール化合物（Ｖ’）：

（式中、ＢＯＣはＢＯＣ保護基を表し、Ａ１は前記定義のとおりである。）
を製造する。アルキレン基、及びアルケニレン基の説明は先に述べたとおりである。また、アミノ基にＢＯＣ保護基を付けるのは常法に基づいて行うことができる。たとえば、芳香族第一級アミンを５０％ジオキサンに溶かし、アルカリ中で、ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｄｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）と反応させることにより、ＢＯＣ（ｔ−ＢＯＣ）保護物を得ることができる。
式（Ｖ）の化合物にＢＯＣ保護基を付けたものと、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとの反応、あるいは前記２つの酵素を産生する微生物とともに培養する方法は、先に述べたのと同様にして行うことができる。
たとえば、式（Ｖ）の化合物として、アニリン、ベンジルアミン、１−フェニルエチルアミン：

を用いた場合、フェニル基が置換された下記式の化合物：

が得られる。なお、本ＢＯＣ保護基は、１０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むジクロロメタン中で、室温、３時間撹拌することにより、容易に脱保護できる。その結果、下図のように、遊離アミノ基を有する芳香族ジオールに戻すことができる。

なお、２３の化合物は、新規の化合物である。
本発明ではさらに、分子内にカルボン酸とフェニル基を有する芳香族化合物（芳香族カルボン酸）から芳香族ジオールを製造する方法を提供している。このような芳香族カルボン酸の水酸化物は経口用医薬品や化学原料等の産業上有用な有機低分子化合物の化学合成のためのビルディングブロックとして有用である。前述のアミノ基を有する有機低分子化合物（第一級アミン）がプラスの電荷を有するビルディングブロックであるのに対して、芳香族カルボン酸はマイナスの電荷を有するビルディングブロックである。
発明者らは、分子内にカルボン酸とフェニル基を有する芳香族化合物（芳香族カルボン酸）そのものを、芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４］遺伝子と芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ（ｂｐｈＢ）遺伝子とを有する組換え大腸菌と共に混合培養を行っても変換することができないことを見出した。そこで、塩酸メタノールを用いてカルボン酸のメチルエステル化を行ったところ、その芳香族カルボン酸メチルエステル体は、上記の組換え大腸菌により、高効率で芳香族ジオールに変換されることを見出した。
本発明では、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼの基質として、下記式（ＶＩ）：

（式中、Ａ３は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
で表される芳香族化合物のカルボキシル基をメチル（アシル）エステル等の炭素数１〜４のアルキルエステルにした後、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼと反応させることにより、芳香族ジオール化合物（ＶＩ’）：

（式中、Ｒはメチル基等の炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ａ３は前記定義のとおりである。）
を製造する。アルキレン基、及びアルケニレン基の説明は先に述べたとおりである。Ｒは炭素数１〜４の直鎖又は分枝アルキル基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル基等が挙げられる。また、芳香族カルボン酸のカルボン酸のメチルエステル化による保護は常法、たとえば、以下のような方法により行うことができる。芳香族カルボン酸５００ｍｇを５ｍｌの５％ＨＣｌ−ＭｅＯＨ（塩酸メタノール）溶液に溶解し、室温で６時間反応させる。その後減圧下でＨＣｌ−ＭｅＯＨ溶液を留去し、残った反応物をシリカゲルカラム（直径１ｃｍ ｘ 長さ１５ｃｍ）で精製することにより、カルボン酸のメチルエステルを得ることができる。反応産物ＶＩ’のメチル基等のアルキル基は、アルカリで撹拌処理することにより容易に遊離の芳香族カルボン酸に戻すことができる。たとえば、芳香族カルボン酸メチルエステル体を、塩酸−炭酸カリウム水溶液（８０：２０）で６時間撹拌処理することにより、遊離の芳香族カルボン酸に戻すことができる。この芳香族カルボン酸は、反応液に５倍量位の水を加え塩酸でｐＨ３−４にした後、酢酸エチルで分液することに容易に回収することができる。
式（ＶＩ）の化合物のメチル（アシル）エステル体（ＶＩ’）と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとの反応、あるいは前記２つの酵素を産生する微生物とともに培養する方法は、先に述べたのと同様にして行うことができる。
たとえば、式（ＶＩ）の化合物として、ケイヒ酸：

を用いた場合、フェニル基が置換された下記式の化合物：

が得られる。なお、このメチルエステル体はアルカリ中で撹拌処理することにより、下図のように、遊離カルボン酸を有する芳香族ジオールに戻すことができる。

本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００３−０５７８６７号の明細書に記載される内容を包含する。

以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれにより限定されるものではない。
［実施例１］改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子発現用プラスミドｐＫＦ２０７２の作製
改変芳香環（改変ビフェニル）ジオキシゲナーゼ遺伝子発現用プラスミドｐＫＦ２０７２は、例えば、特許文献１（特開２００３−２６９号公報）等に記載の方法を参照することにより作製することができる。
ブルクホルデリア・セパシアＬＢ４００株由来の芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ大サブユニットをコードする遺伝子（ｂｐｈＡ１）（この塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ８６３４８に登録されている）とシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするＤＮＡ（ｂｐｈＡ１）（この塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ８３６７３に登録されている）を、共通のフランキング配列からなるｂｐｈＡ１プライマーを用いたＰＣＲにより単離した。ｂｐｈＡ１プライマーの塩基配列を示すと、

なお、フォワード側にはＳａｃＩ部位が、リバース側にはＢｇｌＩＩ部位があり、両側にさらにＥｃｏＲＩ部位が付与されている（いずれも、アンダーラインで示されている）。ＰＣＲの条件は、９４℃１分、５２℃１．５分、７２℃１分で、２５サイクル行った。
単離された上記の２種類のｂｐｈＡ１を混ぜ合わせ、０．１５ユニットのＤｎａｓｅ Ｉ（宝酒造）で１５℃６分間、分解処理した。１０−５０ｂｐ ＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収後、混合し、セルフプライミングＰＣＲ，ｂｐｈＡ１プライマーを加えたＰＣＲを行い、ランダムにアミノ酸配列が入れ替わった（ＤＮＡシャフリング）種々のキメラｂｐｈＡ１を含むＰＣＲ産物を得た。なお、ＰＣＲは上記と同じ条件で行い、種々のキメラｂｐｈＡ１を含むＰＣＲ産物は、ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化後、アガロースゲルから精製した。
Ｐ． ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群を含む発現プラスミドｐＪＨＦ１８（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｊ．，Ａｕｙａｍａ，Ａ．，Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｇｅｎｅ，１２８，２７−３３，１９９４）を有する大腸菌は、メタ開裂まで反応が進むので、ビフェニルを基質とした場合はメタ開裂産物として、２−ヒドロキシ−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｏｘｏ−６−ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａ−２，４−ｄｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を生成する。一般に、メタ開裂産物は黄色を呈するので、４３４ｎｍでモニターすることが可能である。プラスミドｐＪＨＦ１８において、１ヵ所のＭｌｕＩ部位がｂｐｈＡ１内にあるので、ＭｌｕＩで消化，ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ後、ｒｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎを行うことにより、ｂｐｈＡ １のみを破壊したプラスミドｐＪＨＦ１８ΔＭｌｕＩを作製した（Ｔ．Ｋｕｍａｍａｒｕ，Ｈ．Ｓｕｅｎａｇａ，Ｍ．Ｍｉｔｓｕｏｋａ，Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，６６３−６６６，１９９８）。
次に、ｐＪＨＦ１８ΔＭｌｕＩをＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化により、ΔｂｐｈＡ１遺伝子をのみを含む１．３９ｋｂ断片を除き、代わりに、上記で作製した種々のキメラｂｐｈＡ１を含むＰＣＲ産物（ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化後のもの）を挿入し、種々の改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｍｏｄｉｆｉｅｄｂｐｈＡ１：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子）とｂｐｈＢｂｐｈＣ遺伝子を含む種々のプラスミド（ｐＳＨＦ１０００シリーズ）を得た。
これら種々のプラスミドを有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅにビフェニル蒸気を充て、メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーを選抜し、以後の実験に用いた。メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーにおいては、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇにより得られたｍｏｄｉｆｉｅｄｂｐｈＡ１遺伝子が正常に機能できることを意味している。
ビフェニル蒸気により黄色を呈することができた、いくつかの大腸菌形質転換体のうちの１つ（この大腸菌に含まれるプラスミドをｐＳＨＦ１０７２と命名）は、ビフェニルに対するメタ開裂の分解効率が、それぞれの親（ＫＦ７０７及びＬＢ４００）のｂｐｈＡ １遺伝子を持つものより、２倍近く高かっただけでなく、それぞれの親（ＫＦ７０７及びＬＢ４００）のｂｐｈＡ１遺伝子を持つものが分解できないベンゼンやトルエンをもメタ開裂により分解することができた。ただし、この分解効率は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｆ１の相当遺伝子ｔｏｄＣ１遺伝子を持つものの１／３位であった。
次に、プラスミドｐＳＨＦ１０７２に含まれるｓｈｕｆｆｌｅｄｂｐｈＡ１：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子群が大腸菌ベクターｐＵＣ１１８のｌａｃプロモーターの転写のリードスルーを受ける方向に挿入された、改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子発現用プラスミドｐＫＦ２０７２を作製した。より具体的には、プラスミドｐＳＨＦ１０７２からｓｈｕｆｆｌｅｄｂｐｈＡ１−ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４−ｂ ｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群を含む６．７８ｋｂＸｈｏＩ断片を切りだし、ｐＵＣ１１８のＸｈｏＩ部位に挿入した。次に、ｂｐｈＢとｂｐｈＣ内にまたがって存在していた１．４３ｋｂＰｐｕＭＩ断片を、Ｐ ｐｕＭＩ消化、ｒｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎにより欠失させた。これにより、ｓｈｕｆｆｌｅｄｂｐｈＡ１（ｐＳＨＦ１０７２由来）：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子のみを含む５．３５ｋｂ断片がｐＵＣ１１８のｌａｃプロモーターの転写のリードスルーを受ける方向に挿入されたプラスミドｐＫＦ２０７２を得た。
このプラスミドｐＫＦ２０７２におけるｓｈｕｆｆｌｅｄｂｐｈＡ１（ｐＳＨＦ１０７２由来）遺伝子を以後、ｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子と呼ぶ。本遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＢ０８５７４８に登録されている。また、ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ８３６７３に登録されている。
なお、既に、本発明者らはこのｐＫＦ２０７２が導入された大腸菌ＪＭ１０９株［今後、大腸菌（ｐＫＦ２０７２）と記述する場合がある］を用いて種々の生変換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）実験を行なっており、その結果は、前述の非特許文献１（Ｍｉｓａｗａ，Ｎ．，Ｓｈｉｎｄｏ，Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ｓｕｅｎａｇａ，Ｈ．，Ｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５８，９６０５−９６１２，２００２））、及び、特許文献１（特開２００３−２６９号公報、三沢典彦、新藤一敏、岡崎寛、古川謙介、堀之内末治、水酸化された複素環化合物および芳香族カルボン酸の製造方法および改変された芳香環ジオキシゲナーゼ）に開示している。
大腸菌（ｐＫＦ２０７２）は、種々のフェニル基等を含む複素環芳香族化合物を変換し、フェニル基または複素環芳香族基内の隣合った位置に位置特異的に２つの水酸基と２つの水素が導入された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体を立体選択的に生成できることがわかっている。その中でも代表的な反応特異性の例は、複素環芳香族基とフェニル基が単結合（ビフェニル結合）した芳香環化合物を基質とし、産物として、複素環芳香族基−シス−２，３−ジヒドロベンゼンジオール（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ ｇｒｏｕｐ−ｃｉｓ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｅｚｅｎｅｄｉｏｌ）を合成する立体特異的反応（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。
なお、上記の改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＦ２０７２）は、２０００年９月１３日付で旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現特許生物寄託センター 〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７２９９である。
［実施例２］改変芳香環ジオキシゲナーゼ／芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ遺伝子同時発現用プラスミドｐＢＳ２０７２Ｂの作製
実施例１で作製したプラスミドｐＫＦ２０７２から、ｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子を含む１．９ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ断片を切り出した。また、実施例１で説明したプラスミドｐＪＨＦ１８から、ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４とｂｐｈＢ遺伝子（シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来）を含む３．７８ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ断片を切り出した。これら２つの断片をＢｇ ｌＩＩ部位を介して、大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫのＸｂａＩ−ＣｌａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＢＳ２０７２Ｂを作製した。
プラスミドｐＢＳ２０７２Ｂにおいて、ｂｐｈＡ１（２０７２）：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４ｂｐｈＢ遺伝子は、ベクターのｌａｃプロモータの転写のリードスルーを受ける方向に挿入されている。このｐＢＳ２０７２Ｂを大腸菌ＪＭ１０９株に導入することにより得られた形質転換体を以後の実験に用いた。ｂｐｈＢ遺伝子の塩基配列（配列番号１）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ８３６７３に登録されている。
［実施例３］大腸菌形質転換体と基質（式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の化合物、又は（Ｖ）の化合物のＢＯＣ保護物、又は（ＶＩ）の化合物のメチルエステル体）との共存培養の一般的手順
実施例２で作製した芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ遺伝子を有する組換え大腸菌ＪＭ１０９、すなわち、大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）を含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で対数期前半まで液体培養し、最終濃度が約３０％になるようにグリセロールに懸濁し、−７０〜−８０℃のディープフリーザーに入れることにより、グリセロール保存株とした。また、コントロールとして、ｐＵＣ１１８等のＡｐ耐性のベクターのみを有する大腸菌（ＪＭ１０９株）も同様に培養してグリセロール保存株を作製した。
大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）との共存培養による基質の芳香族ジオールへの変換反応を開始するにあたって、まず、上記のグリセロール保存株から、大腸菌形質転換体を白金耳で掻き取り、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）を含むＬＢ培地４ｍｌに懸濁し、１７５ｒｐｍ、３０℃で７〜８時間培養した（前培養）。次に、この前培養液を、１５０μｇ／ｍｌのＡｐ、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース、及び１０μｇ／ｍｌのチアミン（ｔｈｉａｍｉｎｅ）を含むＭ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ −Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）７０ｍｌに入れ、１７５ｒｐｍ、３０℃で１６〜１７時間（一晩）培養した（本培養）。これでＯＤ６００ｎｍが約１になる。これを８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体のみを集めた後、最終濃度１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と７ｍｇまたは１ｍＭ（最終濃度）の基質とを含む７０ｍｌのＭ９培地（１５０μｇ／ｍｌのＡｐ、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース、及び１０μｇ／ｍｌのチアミンを含む）に懸濁し、１７５ｒｐｍ、３０℃で２〜３日間さらに共存培養を行った。なお、基質は前もって、少量のＤＭＳＯ又は７０％エタノールに溶かしたものを培地に加えた。培養２〜３日目に７０ｍｌのメタノールを加え３０分間攪拌することにより生成した芳香族ジオールを含む脂質成分を抽出し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を集め、脂質粗抽出液とした。たいていの場合、この状態で４℃で数週間、保存可能であったが、脂質粗抽出液はすぐにＨＰＬＣ分析に供した。
［実施例４］脂質粗抽出液のＨＰＬＣ分析手順
実施例３で調製された脂質粗抽出液８０μｌを１回のインジェクションに供した。ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（５μｍ，４．６ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの速度でＨＰＬＣを行った。カラム温度は３０℃で行った。ＨＰＬＣの本体装置としてＷａｔｅｒｓ社のアライアンスシステム（２６９５型）を用い、フォトダイオードアレイ検出器としてＷａｔｅｒｓ２９９６型を用いた。展開溶媒の条件は、以下の通りである。
Ａ液：水／メタノール（５０／５０）
Ｂ液：メタノール／２−プロパノール（６０／４０）
０〜５分（Ａ液）、５〜２０分（Ａ液）→（Ｂ液）凸型グラジエント（Ｎｏ３，Ｗａｔｅｒｓ）、２０分〜（Ｂ液）
この条件では通常、３１分以内に全化合物が分離された。２１０〜３５０ｎｍの範囲で吸収極大値を示した波長（ｍａｘ ｐｌｏｔ）でモニターしたピークの面積比をもって変換率とした。
この分析で目的とする芳香族ジオールの生成が確認されたものについて次の精製・同定のステップを行なった。
［実施例５］共存培養により得られた産物の精製・同定
スケールを１０倍にして実施例３と同様にして大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）と実施例４で芳香族ジオールへの変換が確認された化合物（基質）との共存培養を行なった。
基質としては、具体的には、フラボン、フラバノン、６−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシイソフラボン、２−フェニルピリジン、２−フェニルインドール、２−フェニルベンゾキサゾール、２−フェニルベンゾチアゾール、２−フェニルキノリン、４−フェニルモルホリン、１−ベンジルイミダゾール、２−ベンジルピリジン、１−ベンジルピペリドン、ｔｒａｎｓ−カルコン、３−フェニル−１−インダノン及び２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾール、及び、アニリン、ベンジルアミン、１−フェニルエチルアミンのＢＯＣ保護物、及び、ケイヒ酸のメチルエステル体を用いた。
大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）と実施例４で芳香族ジオールへの変換が確認された基質との混合培養液７００ｍｌ〜１４００ｍｌに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを７，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下３００ｍｌ〜５００ｍｌまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮して芳香族ジオール含有粗抽出物を得た。この粗抽出物をシリカゲル［０．２５ｎｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０，（Ｍｅｒｃｋ）］を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム［２０ ｘ ２５０ｍｍ，Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いたカラムクロマトグラフィーに供して純品を得た。
なお、各基質におけるＴＬＣの展開溶媒は以下の通りである。
フラボン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；フラバノン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；６−ヒドロキシフラボン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；６−ヒドロキシフラバノン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（１５：１）；７−ヒドロキシイソフラボン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；２−フェニルピリジン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；２−フェニルインドール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）；２−フェニルベンゾキサゾール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８：１）；２−フェニルベンゾチアゾール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３０：１）；２−フェニルキノリン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；４−フェニルモルホリン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（３０：１）；１−ベンジルイミダゾール，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（１０：１）；２−ベンジルピリジン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；１−ベンジルピペリドン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｔｒａｎｓ−カルコン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）；３−フェニル−１−インダノン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２：１）；２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）；ＢＯＣ−アニリン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（５：１）；ＢＯＣ−ベンジルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（１０：１）；ＢＯＣ−１−フェニルエチルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＥｔＯＡｃ（３：１）、ケイヒ酸メチルエステル，ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ（４０：１）。
また、各基質におけるカラムクロマトグラフィフィーの展開溶媒は以下の通りである。
フラボン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；フラバノン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；６−ヒドロキシフラボン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；６−ヒドロキシフラバノン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（１５：１）；７−ヒドロキシイソフラボン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；２−フェニルピリジン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；２−フェニルインドール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）；２−フェニルベンゾキサゾール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８：１）；２−フェニルベンゾチアゾール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２０：１）；２−フェニルキノリン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；４−フェニルモルホリン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（３０：１）；１−ベンジルイミダゾール，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（１０：１）；２−ベンジルピリジン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１０：１）；１−ベンジルピペリドン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｔｒａｎｓ−カルコン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３０：１）→（４：１）（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）；３−フェニル−１−インダノン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２：１）；２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾール，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）；ＢＯＣ−アニリン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）；ＢＯＣ−ベンジルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；ＢＯＣ−１−フェニルエチルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２〜ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ（５：１）（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）、ケイヒ酸メチルエステル，ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ（４０：１）。
変換産物の同定を以下に記述していく。ただし、アニリン、ベンジルアミン、１−フェニルエチルアミンのＢＯＣ保護物の変換産物の同定は実施例８で、ケイヒ酸メチルエステル体の変換産物の同定は実施例９で記述する。
［実施例５−１］フラボンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）によりフラボン（ｆｌａｖｏｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１７６ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が１つのみ生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１（３０ｍｇ）の純品を得た。化合物１は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（特開２００３−２６９）により、２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）クロメン−４−オン（２−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ）であると同定した。

化合物１の２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）クロメン−４−オンは、改変芳香環ジオキシゲナーゼｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子のみを有するプラスミドｐＫＦ２０７２を含む大腸菌でも例外的に生成することが分かっている（特開２００３−２６９）。この理由としては、大腸菌内に内在的な芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼが存在していたためと思われる。しかしながら、この場合、他の生成産物として２−（３−ヒドロキシフェニル）クロメン−４−オン［２−（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ］を含んでおり、ジオール体の収率が悪くなり、また精製が煩雑になる。芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応によりジオール体である２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）クロメン−４−オンが効率的に製造できるという報告はこれが最初である。従って、本発明による方法は化合物１の製造方法としても有効である。
［実施例５−２］フラバノンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）によりフラバノン（ｆｌａｖａｎｏｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（２２５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が１つのみ生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物２（６８ｍｇ）の純品を得た。化合物２は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（特開２００３−２６９）により、２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン（２−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ−４−ｏｎｅ）であると同定した。

化合物２の２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）クロマン−４−オンは、改変芳香環ジオキシゲナーゼｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子のみを有するプラスミドｐＫＦ２０７２を含む大腸菌でも例外的に生成することが分かっている（特開２００３−２６９）。その理由としては、大腸菌内に内在的な芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼが存在していたためと思われる。しかしながら、この場合、他の生成産物として２−（３−ヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン［２−（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ−４−ｏｎｅ］及び２−（２−ヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン［２−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ−４−ｏｎｅ］が同時に生成し、目的とするジオール体の収率が悪くなり、また精製が煩雑になる。芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応によりジオール体の２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン［２−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ−４−ｏｎｅ］が効率的に製造できるという報告はこれが最初である。従って、本発明による方法は化合物２の製造方法としても有効である。
［実施例５−３］６−ヒドロキシフラボンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により６−ヒドロキシフラボン（６−ｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（３１０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が１つのみ生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物３（３１．５ｍｇ）の純品を得た。化合物３の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２７０．０５２２，計算値２７０．０５２８］よりＣ_１５Ｈ_１０Ｏ_５と決定された。化合物３のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物３は６−ヒドロキシフラボンの１’及び２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であると決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−４’（δ７．３０），からＣ−２（δ１６０．９），Ｃ−２’（δ１４５．５）へ、Ｈ−５’（δ６．７８）からＣ−１’（δ１４６．０），Ｃ−３’（δ１１８．４）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物３は２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシクロメン−４−オン［２−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ］と同定した。

（図中の数字は、^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲのスペクトルデータにおけるポジションの数字と対応している。以後、同様）
化合物３の２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシクロメン−４−オン［２−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ］はＣＡＳに構造登録のある既知物質である。しかしながら、化合物３を芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物３の製造方法として本発明による方法は有効である。

［実施例５−４］６−ヒドロキシフラバノンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により６−ヒドロキシフラバノン（６−ｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１２９ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が１つのみ生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（６４．２ｍｇ）の純品を得た。化合物４の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２７２．０６８３８，計算値２７２．０６８４６］よりＣ_{１ ５}Ｈ_１２Ｏ_５と決定された。化合物４のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物４は６−ヒドロキシフラバノンの１’、２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であると決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−４’（δ６．９１）からＣ−２（ｄ７４．４），Ｃ−２’（δ１４２．４）へ、Ｈ−５’（δ６．６８）からＣ−１’（δ１４５．２），Ｃ−３’（δ１２６．１）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物４は２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシクロマン−４−オン［２−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｒｏｍａｎ−４−ｏｎｅ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−５］７−ヒドロキシイソフラボンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＫＦ２０７２）により７−ヒドロキシイソフラボン（７−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１７４ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．１５の産物が１つのみ生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物５（５６．４ｍｇ）の純品を得た。化合物５の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２７０．０５２２，計算値２７０．０５２８］よりＣ_１５Ｈ_１０Ｏ_５と決定された。化合物５のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物５は７−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅの１’、２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−６’（δ６．７９）からＣ−２’（δ１４３．８），Ｃ−１’（δ１４５．６）へ、Ｈ−５’（δ６．６６）からＣ−１’，Ｃ−３’（δ１２０．１）へ遠隔スピン結合が観測されることからも確認された。以上の結果より、化合物５は３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−７−ヒドロキシクロメン−４−オン［３−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−７−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−６］２−フェニルピリジンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２−フェニルピリジン（２−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１３０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物６（２６．０ｍｇ）の純品を得た。化合物６の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値１８７．０６１４，計算値１８７．０６３３］よりＣ_１１Ｈ_９ＮＯ_２と決定された。化合物６のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物６は２−フェニルピリジンの１’、２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−４’（δ７．２７）からＣ−２（δ１５７．６），Ｃ−２’（δ１４７．４）へ、Ｈ−５’（δ６．７５）からＣ−１’（δ１４６．０），Ｃ−３’（δ１１８．１）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物６は３−（２−ピリジル）ベンゼン−１，２−ジオール［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−７］２−フェニルインドールの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２−フェニルインドール（２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１９１ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２及びＲｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物７’（６．８ｍｇ）及び化合物７（９．０ｍｇ）の純品を得た。
化合物７’は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較［Ｏｚａｋｉ，Ｙｕｔａｋａ：Ｏｋａｍｕｒａ，Ｋｙｏｕｋｏ；Ｈｏｓｏｙａ，Ａｙａｋｏ；Ｋｉｍ，ｓａｎｇ−Ｗｏｎ．Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ５−ｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌｅｓ ｆｒｏｍ １，４−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｄｉｏｎｅ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７），（７），６７９−６８０］により、２−フェニルインドール−５−オール（２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ−５−ｏｌ）であると同定した。
化合物７の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２２５．０７８６，計算値２２５．０７９０］よりＣ_１４Ｈ_{１ １}ＮＯ_２と決定された。化合物７のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物７は２−フェニルインドールの１’、２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であると決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−４’（δ７．２５），からＣ−２（δ１３４．９），Ｃ−２’（δ１４１．０）へ、Ｈ−５’（δ６．８０）からＣ−１’（δ１４３．４），Ｃ−３’（δ１１９．１）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物７は３−インドール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール（３−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）と同定した。

化合物７（３−インドール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール）はＣＡＳに構造登録のある既知物質である。しかしながら、化合物７を芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物７の製造方法として本発明による方法は有効である。化合物７のＮＭＲデータを以下に記す。

［実施例５−８］２−フェニルベンゾキサゾールの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２−フェニルベンゾオキサゾール（２−ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１５５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物８（７６．８ｍｇ）の純品を得た。化合物８は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較［Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｍ．，Ｊｒ．；Ｗｉｒｔｈ，Ｊ．Ｇ．；Ｈｅａｔｈ，Ｄ．Ｒ．Ｍｅｔｈｙｌ ａｒｙｌ ｅｔｈｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ｂｅｎｚａｚｏｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｉｎ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９７０），３５（９），３１４７−３１４９］により、３−ベンゾキサゾール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール（３−ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌ−２−ｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）であると同定した。

化合物８（３−ベンゾキサゾール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール）は新規化合物ではないが、芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物８の製造方法として本発明による方法は有効である。
［実施例５−９］２−フェニルベンゾチアゾールの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２−フェニルベンゾチアゾール（２−ｐｈｅｎｙｌｂｅｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１６５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物９（７３．５ｍｇ）の純品を得た。
化合物９は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較［Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｋｅｖｉｎ；Ｂｒｏｗｎ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｇ．；Ｈｅｐｗｏｒｔｈ，Ｊｏｈｎ Ｄ．；Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｗ．；Ｍａｙ Ｂｅｒｎａｄｅｔｔｅ；Ｗｅｓｔ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ２−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．２（１９８４），（１２），２１１１−２１１７］により、３−ベンゾチアゾール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール（３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）であると同定した。

化合物９（３−ベンゾチアゾール−２−イルベンゼン−１，２−ジオール）は新規化合物ではないが、芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物９の製造方法として本発明による方法は有効である。
［実施例５−１０］２−フェニルキノリンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２−フェニルキノリン（２−ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（２１０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１０（３１．３ｍｇ）の純品を得た。化合物１０の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２３７．０７８０，計算値２３０．０７９０］よりＣ_１５Ｈ_１１ＮＯ_２と決定された。化合物１０のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１０は２−フェニルキノリンの１’、２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−４’（δ７．６４）からＣ−２（δ１５８．２），Ｃ−２’（δ１４９．１）へ、Ｈ−５’（δ６．７８）からＣ−１’（δ１４６．６），Ｃ−３’（δ１１８．７）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１０は３−（２−キノリル）ベンゼン−１，２−ジオール（３−（２−ｑｕｉｎｏｌｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−１１］１−フェニルモルホリンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２−フェニルモルホリン（１−ｐｈｅｎｙｌｍｏｒｐｈｏｒｉｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（８６．５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１１（３０．０ｍｇ）の純品を得た。
化合物１１は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較［Ａｓｌｅｒ，Ｍａｎｆｒｅｄ；Ｓｃｈａｎｋ，Ｋｕｒｔ；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｖｏｌｋｅｒ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ α−ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ β−ｄｉｋｅｔｏｎｅ．２．Ｄｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ２−（ａｃｙｌｏｘｙ）−３−（ｓｅｃｏｎｄａｒｙａｍｉｎｏ）−２−ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎ−１−ｏｎｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．（１９７９），１１２（６），２３２４−２３３１］により、３−モルホリン−４−イルベンゼン−１，２−ジオール（３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ−４−ｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）であると同定した。

化合物１１（３−モルホリン−４−イルベンゼン−１，２−ジオール）は新規化合物ではないが、芳香環ジオキシゲナーゼ＋デサチュラーゼ反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物１１の製造方法としても本発明による方法は有効である。
［実施例５−１２］１−ベンジルイミダゾールの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により１−ベンジルイミダゾール（１−ｂｅｎｚｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１４０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１２（６７．７ｍｇ）の純品を得た。化合物１２の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値１９０．０７４８３，計算値１９０．０７４２１］よりＣ_１０Ｈ_１０Ｎ_２Ｏ_２と決定された。化合物１２のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１２は１−ベンジルイミダゾールの３’、４’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−７’（δ６．４７）からＣ−１’（δ４５．０），Ｃ−３’（δ１４３．４）へ、Ｈ−６’（δ６．５７）からＣ−４’（δ１４５．２），Ｃ−２’（δ１２４．６）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１２は３’，４’−ジヒドロキシ−１−ベンジルイミダゾール［３’，４’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｂｅｎｚｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−１３］２−ベンジルピリジンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２−ベンジルピリジン（２−ｂｅｎｚｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１０９ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．４の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１３（２０．０ｍｇ）の純品を得た。化合物１３の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２０１．０７６３６，計算値２０１．０７８９６］よりＣ_１２Ｈ_１１ＮＯ_２と決定された。化合物１３のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１３は２−ベンジルピリジンの３’，４’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−１’（δ４．００）からＣ−２’（δ１４３．４），Ｃ−４’（δ１２０．９），Ｃ−３’（δ１２６．６）へ、Ｈ−６’（δ６．５４）からＣ−１’（δ１４５．６）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１３は３−（２−ピリジルメチル）ベンゼン−１，２−ジオール［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−１４］１−ベンジルピペリドンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により１−ベンジルピペリドン（１−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒｉｄｏｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１０４ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１４（２２．５ｍｇ）の純品を得た。化合物１４の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２２１．１０５５，計算値２２１．１０５３］よりＣ_１２Ｈ_１５ＮＯ_３と決定された。化合物１４のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１４は１−ベンジルピペリドンの３’，４’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−７’（δ６．４７）からＣ−１’（δ６０．３），Ｃ−３’（δ１４４．２）へ、Ｈ−６’（δ６．６５）からＣ−４’（δ１４４．７），Ｃ−２’（δ１２０．８）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１４は１−［（２，３−ジヒドロキシフェニル）メチル］ピペリジン−４−オン［１−［（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−４−ｏｎｅ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−１５］ｔｒａｎｓ−カルコンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）によりトランスカルコン［（ｔｒａｎｓ−）ｃｈａｌｃｏｎｅ］の変換実験を行って得られた粗抽出物（１８７ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．７及びＲｆ値０．２の２つの産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１５’（１６．４ｍｇ）及び化合物１５（５８．５ｍｇ）の純品を得た。
化合物１５’は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較［Ｗｅｂｅｒ，Ｆ．Ｇ．；Ｒａｄｅｇｌｉａ，Ｒ．Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃａｒｂｏｎ−１３ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｃｈａｌｃｏｎｅ ｄｉｈａｌｉｄｅｓ．ＶＩＩＩ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ α− ａｎｄ β−ｈａｌｏｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅｓ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ−１３−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔｓ ｏｆ ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｃｈａｌｃｏｎｅ ｄｉｈａｌｉｄｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｃｏｎ ｈａｌｏｈｙｄｒｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｕｅｒ Ｐｒａｋｔｉｓｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｌｅｉｐｚｉｇ）（１９８９），３３１（２），２１２−２２２］により、１，３−ジフェニルプロパン−１−オン（１，３−ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ−１−ｏｎｅ）であると同定した。
化合物１５の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２４２．０９４３６，計算値２４２．０９４３２］よりＣ_１５Ｈ_１４Ｏ_３と決定された。化合物１５のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１５は（ｔｒａｎｓ−）カルコンのΔ_１，２の二重結合が還元され、かつ１’、２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であると決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−１（δ２．８５）からＣ−３（δ１９９．６），Ｃ−３’（δ１２８．０），Ｃ−２’（δ１４３．１），Ｃ−４’（δ１２０．２）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１５は３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−１−フェニルプロパン−１−オン［３−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ−１−ｏｎｅ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−１６］３−フェニルインダノンの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により３フェニルインダノン（３−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄａｎｏｎｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１４８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１６（７０．３ｍｇ）の純品を得た。化合物１６の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２４０．０７８６５，計算値２４０．０７８６３］よりＣ_１５Ｈ_１２Ｏ_３と決定された。化合物８のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１６は３−フェニルインダノンの１’、２’位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−３（δ４．８０），Ｈ−４’（δ６．３４）からＣ−２’（δ１４３．２）へ、Ｈ−５’（δ６．５２）からＣ−１’（δ１４５．２）、Ｃ−３’（δ１３０．１）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１６は３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）インダン−１−オン［３−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｉｎｄａｎ−１−ｏｎｅ］と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例５−１７］２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾールの変換産物の同定
実施例５にしたがって大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）により２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾオキサゾール（２’−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）の変換実験を行って得られた粗抽出物（１８５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２５の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１７（１９．５ｍｇ）の純品を得た。化合物１７の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２４３．０５３１１，計算値２４３．０５３１７］よりＣ_１３Ｈ_９ＮＯ_４と決定された。化合物１７のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１７は２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾオキサゾールの４，５位に２つのフェノール性水酸基が導入された物質であることが推定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−６（δ６．８８）からＣ−４（δ１３５．８．），Ｃ−７ａ（δ１４３．２）へ、Ｈ−７（δ７．０６）からＣ−３ａ（δ１２９．２），Ｃ−５（δ１４２．２）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１７は２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾオキサゾール−４，５−ジオール（２−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ−４，５−ｄｉｏｌ）と同定した。これは新規の化合物であった。

そのＮＭＲのデータを下表に示す。

［実施例６］抗酸化活性評価試験
６−１．ラット脳脂質過酸化抑制系（脳ホモ）
アッセイは基本的にＫｕｂｏらの方法に準拠して行った（Ｋｕｂｏ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ，Ｙ．，Ｋｕｍａｄａ，Ｋ．，Ｓｈｕｔｏ Ｋ．，Ｎａｋａｍｉｚｏ，Ｎ．Ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｎａｒｉｚｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．２７２，２８３−２９５，１９８４）。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．６ｍｌ中に、被検試料のメタノール溶液０．０５ｍｌ、１ｍＭアスコルビン酸０．１ｍｌ（終濃度１００μＭ）、及びＨ_２Ｏ ０．０５ｍｌを添加し、３７℃で５分間のプレインキュベーションを行った後、２．５％（ｗ／ｖ）ラット脳ホモジネートを０．２ｍｌ添加することで反応を開始させ、３７℃で１時間、振盪しながらインキュベートを行った。２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、０．５％（ｗ／ｖ）２−チオバルビツール酸、及び０．２Ｎ塩酸を含む混合液１ｍｌを上記反応液に添加することで反応を停止した。これを１００℃で３０分間煮沸処理して発色させ、冷却後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離上清の５３２ｎｍでの吸光度（Ａ_５３２）を測定した。被検試料添加群のＡ_５３２が、被検試料無添加群のＡ_５３２と比べ半分低下するのに必要な被検試料濃度をＩＣ_５０として算出し、これをラット脳脂質過酸化抑制作用とした。ポジティブコントロールとしたカテキンのＩＣ_５０は５．４μｇ／ｍｌであった。
６−２．ＤＰＰＨラジカル消去系（ＤＰＰＨ）
アッセイは基本的Ｋｕｂｏらの方法に準拠して行った（Ｋｕｂｏ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ，Ｙ．，Ｋｕｍａｄａ，Ｋ．，Ｓｈｕｔｏ Ｋ．，Ｎａｋａｍｉｚｏ，Ｎ．Ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｎａｒｉｚｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．２７２，２８３−２９５，１９８４）。１００μＭのＤＰＰＨのエタノール溶液に各種濃度の薬物を添加し、室温で３０分インキュベートした後、反応液の５１７ｎｍにおける吸光度（Ａ_５１７）を測定した。被検試料添加群のＡ_５１７が、被検試料無添加群のＡ_５１７と比べ半分低下するのに必要な被検試料濃度をＩＣ_５０として算出し、これをＤＰＰＨラジカル消去作用とした。ポジティブコントロールとしたカテキンのＩＣ_５０は２６μｇ／ｍｌであった。
両評価系試験の結果を以下に示す。

この結果から明らかなように、本発明により作製した芳香環ジオールはすべて優位な抗酸化活性を有していた。
［実施例７］芳香族第一級アミンへのＢＯＣ保護基の導入
芳香族第一級アミンのアミノ基へのＢＯＣ保護基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３）の導入は、常法、たとえば、以下のような方法により行うことができる。芳香族第一級アミン５００ｍｇを５０％のジオキサン４ｍｌに溶解し、これに２Ｎ ＮａＯＨを１．５当量、（ｔ−ＢＯＣ）_２Ｏ（ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｄｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）を１．５当量加え、室温で６時間反応させた。反応終了後、水５０ｍｌを加え、これを酢酸エチル５０ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層はその後、０．１Ｎ ＨＣｌ ５０ｍｌで１回洗浄したのち、濃縮した。これをシリカゲルカラム（直径１ｃｍ ｘ 長さ１５ｃｍ）で精製することによりアミノ基のＢＯＣ（ｔ−ＢＯＣ）保護物を得た。
以下にここで用いた芳香族第一級アミンと、得られるＢＯＣ誘導体についてのそれぞれのシリカゲルカラムでの展開溶媒、及び、収率を示す。試薬はＳｉｇｍａから購入した。
１）アニリン（ａｎｉｌｉｎｅ）
シリカゲルカラムは、ヘキサン：ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１０：１で展開・溶出した。収率は８５％であった。
２）ベンジルアミン（ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ）
シリカゲルカラムは、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５０：１で展開・溶出した。収率は７８％であった。
３）１−フェニルエチルアミン（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；α−メチルベンジルアミン）
シリカゲルカラムは、ヘキサン：ＣＨ_２Ｃｌ_２＝２：１で展開・溶出した。収率は７５％であった。
［実施例８］ＢＯＣ誘導体存在下での大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）の培養及び変換産物の精製・同定
大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）と、実施例７で作製したＢＯＣ誘導体の混合培養液７００ｍｌ〜１４００ｍｌに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを７，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下３００ｍｌ〜５００ｍｌまで濃縮し、等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し生成物含有エキスを得た。エキスをシリカゲル［０．２５ｎｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０，（Ｍｅｒｃｋ）］を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム［２０ ｘ ２５０ｍｍ，Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、純品を得た。
各基質におけるＴＬＣの展開溶媒は以下の通りである。
ｔ−ＢＯＣ−アニリン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（５：１）；ｔ−ＢＯＣ−ベンジルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（１０：１）；ｔ−ＢＯＣ−１−フェニルエチルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＥｔＯＡｃ（３：１）。
また、各基質におけるカラムクロマトグラフィフィーの展開溶媒は以下の通りである。
ｔ−ＢＯＣ−アニリン，ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）；ｔ−ＢＯＣ−ベンジルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２−ＭｅＯＨ（２０：１）；ｔ−ＢＯＣ−１−フェニルエチルアミン，ＣＨ_２Ｃｌ_２〜ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ（５：１）（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）。
８−１．ＢＯＣ−アニリンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）によりＢＯＣ−アニリン（ｔ−ＢＯＣ−ａｎｉｌｉｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（１３２．５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１８（６４．２ｍｇ）の純品を得た。化合物１８の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［実測値２２５．１００２，計算値２２５．１００２］よりＣ_１１Ｈ_１５ＮＯ_４と決定された。化合物１８のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−４（δ６．６８）−Ｈ−５（δ６．６６）−Ｈ−６（δ６．３３）のｖｉｃｉｎａｌｓｐ ^２ ｓｐｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋが観測されたことにより、化合物１８をｔ−ＢＯＣ−ａｎｉｌｉｎｅの１，２位に２つのフェノール性水酸基が導入されたＮ−（２，３−ジヒドロキシフェニル）（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボキサマイド（Ｎ−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙ）ｃａｒｏｂｏｘａｍｉｄｅ）と同定した。

これは新規の化合物であった。そのＮＭＲのデータを下表に示す。

化合物１８は、トリフルオロ酢酸０．２ｍｌ、ジクロロメタン１．８ｍｌを含む溶媒中で、室温で３時間、撹拌した後、エバポレータにかけることにより、ＢＯＣ基が外れたフリーのアミノ基を有する芳香族ジオール（下図）に変換された。

８−２．ＢＯＣ−ベンジルアミンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）によりＢＯＣ−ベンジルアミン（ｔ−ＢＯＣ−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（１３１．０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１９（４３．０ｍｇ）の純品を得た。化合物１９の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ ２３９．１１５５，ｃａｌｄ．２３９．１１５８］よりＣ_１２Ｈ_１７ＮＯ_４と決定された。化合物１９のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−５（δ６．８１）−Ｈ−６（δ６．６７）−Ｈ−７（δ６．５２）のｖｉｃｉｎａｌｓｐ ^２ ｓｐｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋが観測されたことにより、化合物１９をｔＢＯＣ−ベンジルアミンの３，４位に２つのフェノール性水酸基が導入されたＮ−［（２，３−ジヒドロキシフェニル）メチル］（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボキサマイド（Ｎ−［（２，３−ｄｉｈｙｄｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）と同定した。

これは新規の化合物であった。そのＮＭＲのデータを下表に示す。

化合物１９は、トリフルオロ酢酸０．２ｍｌ、ジクロロメタン１．８ｍｌを含む溶媒中で、室温で３時間、撹拌した後、エバポレータにかけることにより、ＢＯＣ基が外れたフリーのアミノ基を有する芳香族ジオール（下図）に変換された。

８−３．ＢＯＣ−フェニルエチルアミンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）によりＢＯＣ−１−フェニルエチルアミン（ｔ−ＢＯＣ−１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（１８３．０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．４の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物２０（５．７ｍｇ）の純品を得た。化合物２０の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ ２５３．１３１２，ｃａｌｄ．２５３．１３１５］よりＣ_１３Ｈ_１９ＮＯ_４と決定された。化合物２０のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ−６（δ６．７９）−Ｈ−７（δ６．７５）−Ｈ−８（δ６．６６）のｖｉｃｉｎａｌｓｐ ^２ ｓｐｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋが観測されたことにより、化合物２０をｔ−ＢＯＣ−フェニルエチルアミンの４，５位に２つのフェノール性水酸基が導入されたＮ−［（２，３−ジヒドロキシフェニル）エチル］（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボキサマイド（Ｎ−［（２，３−ｄｉｈｙｄｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）と同定した。

これは新規の化合物であった。そのＮＭＲのデータを下表に示す。

化合物２０は、トリフルオロ酢酸０．２ｍｌ、ジクロロメタン１．８ｍｌを含む溶媒中で、室温で３時間、撹拌した後、エバポレータにかけることにより、ＢＯＣ基が外れたフリーのアミノ基を有する芳香族ジオール（下図）に変換された。この化合物は３−（１−アミノエチル）ベンゼン−１，２−ジオールであり、新規の化合物である。

［実施例９］芳香族カルボン酸化合物のメチルエステル体の調製
芳香族カルボン酸化合物のカルボン酸のメチルエステル化は常法、たとえば、以下のような方法により行うことができる。芳香族カルボン酸５００ｍｇを５ｍｌの５％ＨＣｌ−ＭｅＯＨ（塩酸メタノール）溶液に溶解し、室温で６時間反応させた。その後減圧下でＨＣｌ−ＭｅＯＨ溶液を留去し、残った反応物をシリカゲルカラム（直径１ｃｍ ｘ 長さ１５ｃｍ）で精製することにより、カルボン酸のメチルエステルを得た。
今回用いたケイヒ酸（ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）のメチルエステル化物のシリカゲルカラムでの展開溶媒は ｈｅｘａｎｅ：ＣＨ_２Ｃｌ_２＝３：１、収率は９２％であった。試薬はＡｌｄｒｉｃｈから購入した。
［実施例１０］ケイヒ酸メチルエステル変換物の同定
大腸菌（ｐＢＳ２０７２Ｂ）を用いてケイヒ酸メチルエステル（ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）の変換実験を行った粗抽出物（１３０ｍｇ）をＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝４０：１）に供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝４０：１）により精製し、化合物２４（８６．０ｍｇ）の純品を得た。化合物２４の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ １９４．０５８１，ｃａｌｃｄ．１９４．０５７９］により、Ｃ_１０Ｈ_１０Ｏ_４と決定された。化合物２４のＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて、Ｈ−２（δ６．５５）−Ｈ−３（δ７．９０）及びＨ−７（δ６．８３）−Ｈ−８（δ６．６５）−Ｈ−９（δ７．０５）のｖｉｃｉｎａｌｓｐ ^２カップリングが観測されることから、化合物２４をケイヒ酸メチルエステルの５，６位に２つのフェノール性水酸基が導入された（Ｅ）−３−（２，３−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリリックアシッドメチルエステル（（Ｅ）−３−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）と同定した。本化合物は文献記載のある化合物であるが（Ｎａｍ，Ｎ．−Ｈ．；Ｙｏｕ，Ｙ．−Ｊ．；Ｋｉｍ，Ｙ．，Ｈｏｎｇ，Ｄ．−Ｈ．；Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｍ．；Ａｈｎ．Ｂ．Ｚ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ Ｃｅｒｔａｉｎ ３−Ａｒｙｌ−２−ｐｒｏｐｅｎｏａｔｅｓ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１（９），１１７３−１１７６，２００１）、微生物変換による製造は初めての報告である。

参考のため、ケイヒ酸メチルエステルのＮＭＲデータを下記に記す。

この芳香族カルボン酸メチルエステル体２４は、塩酸−炭酸カリウム水溶液（８０：２０）で６時間撹拌処理することにより、下図の遊離の芳香族カルボン酸に戻すことができる。この芳香族カルボン酸は、反応液に５倍量位の水を加え塩酸でｐＨ３−４にした後、酢酸エチルで分液することにより容易に回収することができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

産業上の利用の可能性

フェニル基を含む化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させることにより、又は、フェニル基を含む化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ遺伝子を同時に発現する微生物とを共存培養することにより、フェニル基を含む化合物のフェニル基内の隣合った位置に２つの水酸基を導入した化合物を容易に得ることができる。

【配列表】

Claims (34)

1. 下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
   

   

   （式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ａ２は置換基を有していてもよい炭素数２〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｃ１はヘテロ原子置換環式炭化水素基である。ただし、Ｃ１における環式炭化水素基はフェニル基を含まない。）
   で表されるフェニル基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させて、芳香族ジオール化合物（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：
   

   

   （式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、Ａ２及びＣ１は前記定義のとおりである。）
   を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
2. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである請求の範囲第１項記載の製造方法。
3. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
   

   

   （式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ａ２は置換基を有していてもよい炭素数２〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｃ１はヘテロ原子置換環式炭化水素基である。ただし、Ｃ１における環式炭化水素基はフェニル基を含まない。）
   で表されるフェニル基を含む芳香族化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、芳香族ジオール化合物（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：
   

   

   （式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、Ａ２及びＣ１は前記定義のとおりである。）
   を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
4. 組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである請求の範囲第３項記載の製造方法。
5. 組換え微生物が組換え大腸菌である請求の範囲第３項記載の製造方法。
6. 下記式（ＩＶ）：
   

   

   （式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ３は置換基を有するフェニル基であり、Ｈ２は非置換複素環芳香族基である。）
   で表される複素環芳香族基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼとを反応させ、複素環芳香族基Ｈ２内の隣合った位置に２つの水酸基が導入された芳香族化合物を得ることを含む複素環芳香族ジオールの製造方法。
7. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである請求の範囲第６項記載の製造方法。
8. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（ＩＶ）：
   

   

   （式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ３は置換基を有するフェニル基であり、Ｈ２は非置換複素環芳香族基である。）
   で表される複素環芳香族基を含む芳香族化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、複素環芳香族基Ｈ２内の隣合った位置に２つの水酸基が導入された芳香族化合物を得ることを含む複素環芳香族ジオールの製造方法。
9. 組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである請求の範囲第８項記載の製造方法。
10. 組換え微生物が組換え大腸菌である請求の範囲第８項記載の製造方法。
11. 式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表されるフェニル基を含む芳香族化合物が、フラボン、フラバノン、６−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシイソフラボン、２−フェニルピリジン、２−フェニルインドール、２−フェニルベンゾキサゾール、２−フェニルベンゾチアゾール、２−フェニルキノリン、４−フェニルモルホリン、１−ベンジルイミダゾール、２−ベンジルピリジン、１−ベンジルピペリドン、（トランス−）カルコン及び３−フェニルインダノンからなる群より選択されるものである請求の範囲第１項記載の製造方法。
12. 式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表されるフェニル基を含む芳香族化合物が、フラボン、フラバノン、６−ヒドロキシフラボン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシイソフラボン、２−フェニルピリジン、２−フェニルインドール、２−フェニルベンゾキサゾール、２−フェニルベンゾチアゾール、２−フェニルキノリン、４−フェニルモルホリン、１−ベンジルイミダゾール、２−ベンジルピリジン、１−ベンジルピペリドン、（トランス−）カルコン及び３−フェニルインダノンからなる群より選択されるものである請求の範囲第３項記載の製造方法。
13. 式（ＩＶ）で表される複素環芳香族基を含む芳香族化合物が、２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾールであり、得られる複素環芳香族ジオールが２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾール−４，５−ジオールである請求の範囲第６項記載の製造方法。
14. 式（ＩＶ）で表される複素環芳香族基を含む芳香族化合物が、２’−ヒドロキシ−２−フェニルベンゾキサゾールであり、得られる複素環芳香族ジオールが２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾキサゾール−４，５−ジオールである請求の範囲第８項記載の製造方法。
15. 請求の範囲第１項記載の製造方法により得られる芳香族ジオールを含む抗酸化剤。
16. 請求の範囲第３項記載の製造方法により得られる芳香族ジオールを含む抗酸化剤。
17. 請求の範囲第６項記載の製造方法により得られる芳香族ジオールを含む抗酸化剤。
18. 請求の範囲第８項記載の製造方法により得られる芳香族ジオールを含む抗酸化剤。
19. ２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシクロマン−４−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−７−ヒドロキシクロメン−４−オン、３−（２−ピリジル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（２−キノリル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（イミダゾリルメチル）ベンゼン−１，２−ジオール、３−（２−ピリジルメチル）ベンゼン−１，２−ジオール、１−［（２，３−ジヒドロキシフェニル）メチル］ピペリジン−４−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−１−フェニルプロパン−１−オン、３−（２，３−ジヒドロキシフェニル）インダン−１−オン又は２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾオキサゾール−４，５−ジオール、３−（１−アミノエチル）ベンゼン−１，２−ジオール。
20. 請求の範囲第１９項に記載のいずれかの化合物を含有する抗酸化剤。
21. 下記式（Ｖ）：
    

    

    （式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
    で表される芳香族化合物のアミノ基をＢＯＣ保護基で保護した後、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼと反応させて、芳香族ジオール化合物（Ｖ’）：
    

    

    （式中、ＢＯＣはＢＯＣ保護基を表し、Ａ１は前記定義のとおりである。）
    を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
22. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである請求の範囲第２１項記載の製造方法。
23. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（Ｖ）：
    

    

    （式中、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
    で表される芳香族化合物のアミノ基をＢＯＣ保護基で保護した化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、芳香族ジオール化合物（Ｖ’）：
    

    

    （式中、ＢＯＣはＢＯＣ保護基を表し、Ａ１は前記定義のとおりである。）
    を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
24. 組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである請求の範囲第２３項記載の製造方法。
25. 組換え微生物が組換え大腸菌である請求の範囲第２３項記載の製造方法。
26. 式（Ｖ）で表される化合物が、アニリン、ベンジルアミン、１−フェニルエチルアミンである請求の範囲第２１項記載の製造方法。
27. 式（Ｖ）で表される化合物が、アニリン、ベンジルアミン、１−フェニルエチルアミンである請求の範囲第２３項記載の製造方法。
28. 下記式（ＶＩ）：
    

    

    （式中、Ａ３は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
    で表される芳香族化合物のカルボキシル基を炭素数１〜４のアルキル保護基Ｒで保護した後、芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼと反応させて、芳香族ジオール化合物（ＶＩ’）：
    

    

    （式中、Ｒはアルキル保護基を表し、Ａ３は前記定義のとおりである。）
    を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
29. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼがビフェニル分解細菌由来のもの、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものである請求の範囲第２８項記載の製造方法。
30. 芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（ＶＩ）：
    

    

    （式中、Ａ３は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基である。）
    で表される芳香族化合物のカルボキシル基を炭素数１〜４のアルキル保護基Ｒで保護した化合物を含む培地で培養して、培養物又は菌体から、芳香族ジオール化合物（ＶＩ’）：
    

    

    （式中、Ｒはアルキル保護基を表し、Ａ３は前記定義のとおりである。）
    を得ることを含む芳香族ジオールの製造方法。
31. 組換え微生物が、ビフェニル分解細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ及び芳香環ジヒドロジオールデサチュラーゼ、又は、それらを分子進化工学的手法により改変したものをコードする遺伝子を導入したものである請求の範囲第３０項記載の製造方法。
32. 組換え微生物が組換え大腸菌である請求の範囲第３０項記載の製造方法。
33. 式（ＶＩ）で表される化合物が、ケイヒ酸である請求の範囲第２８項記載の製造方法。
34. 式（ＶＩ）で表される化合物が、ケイヒ酸である請求の範囲第３０項記載の製造方法。