KR20020016924A - 신규 시토크롬 ｐ450 모노옥시게나제 및 유기 화합물의산화를 위한 그의 용도 - Google Patents

신규 시토크롬 ｐ450 모노옥시게나제 및 유기 화합물의산화를 위한 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형 기질 특이성을 갖는 신규 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 서열을 포함하는 발현 구조체 및 벡터, 및 이를 사용하여 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상이한 유기 기질을 미생물에 의해 산화시키는 방법, 예를 들어 인디고 및 인디루빈의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규 시토크롬 Ｐ450 모노옥시게나제 및 유기 화합물의 산화를 위한 그의 용도 {Novel Cytochrome P450 Monooxygenases and Their Use for Oxidizing Organic Compounds}
신규한 기능과 특성을 갖는 효소는 천연 시료의 스크리닝에 의해, 또는 공지 효소의 단백질 공학에 의해 제조할 수 있다. 특정 환경 하에서, 상기한 공지 효소의 단백질 공학에 의한 방법은 자연 선택 경로에 의해서는 발생할 것 같지 않은 특성들을 유도하기 위해 보다 적합할 수 있다. 효소 공학에서 수많은 시도가 있었음에도 불구하고, 현재까지 특정 기질에 대한 효소 변이체의 촉매 활성을 촉진시키는 연구는 단지 몇가지만 성공하였다 (참고문헌 1-10 참조). 이들 공지된 경우에서, 기질은 각 효소의 천연 기질과 구조적으로 밀접하게 관련되어 있다. 아직까지, 변형 후에 효소의 천연 기질과 구조적으로 완전히 상이한 화합물의 반응을 촉매화하는 효소의 성공적인 공학에 관한 보고는 없다.
세균 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)으로부터 단리가능한 시토크롬 P450 모노옥시게나제는 일반적으로 장쇄 포화산과 그의 대응하는 아미드 및 알콜의 하위말단 히드록실화, 또는 장쇄 불포화 지방산 또는 중쇄 포화 지방산의 에폭시드화를 촉매화한다 (참고문헌 11-13 참조). 포화 지방산의 최적 사슬 길이는 탄소원자수 14 내지 16이다. 사슬 길이가 12 미만인 지방산은 히드록실화되지 않는다 (참고문헌 11 참조).
P450 BM-3의 헴 (heme) 도메인의 구조는 X-선 구조 분석에 의해 결정되었다 (참고문헌 14-16 참조). 기질 결합 부위는 분자의 표면으로부터 헴 분자만큼 멀리 뻗어있고 소수성 아미노산 잔기에 의해 거의 독점적으로 둘러싸인 긴 터널형 구멍 형태로 존재한다. 헴 도메인 표면 상의 하전된 잔기는 잔기 Arg47과 Tyr51 뿐이다. 이들 잔기가 수소 결합의 형성에 의해 기질의 카르복실레이트기의 결합에 관여하는 것으로 추정된다 (참고문헌 14 참조). Arg47을 Glu로 돌연변이시키면 아라키돈산에 대해 효소가 불활성화되지만 (참고문헌 13 참조), C12-C14-알킬트리메틸암모늄 화합물에 비해서는 그 활성이 증가한다 (참고문헌 17 참조). 상기 효소에 대해 방향족 화합물, 특히 1핵, 2핵 또는 다핵 (필요한 경우 헤테로시클릭) 방향족 화합물, 알칸, 알켄, 시클론알칸 및 시클로알켄에 대한 기질 이용성은 설명되지 않았다. 따라서, 지금까지 전문가 집단에서는 지금까지 설명된 유기 기질 이외의 기질, 예를 들어 인돌은 P450 BM-3의 천연 기질과 구조가 명백하게 상이하며 특히 기질 포켓 내의 상기 언급한 잔기에 결합할 수 있는 관능기가 존재하기 않기 때문에 기질이 아닌 것으로 추정되었다.
본 발명은 유기 기질, 예를 들어 N-헤테로시클릭 방향족 화합물을 산화시킬 수 있는 변형 기질 특이성을 갖는 신규 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 서열을 포함하는 발현 구조체 및 벡터, 이를 사용하여 형질전환된 미생물, 상이한 유기 기질, 예를 들어 N-헤테로시클릭 방향족 화합물을 미생물에 의해 산화시키는 방법 및 특히 인디고 및 인디루빈의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 변형 기질 특이성 또는 변형 기질 프로파일을 갖는 신규 시토크롬 P450 모노옥시게나제를 제공하는 것이다. 특히, 비변이 야생형 효소에 비교하여, 구조적으로 명백히 상이한 기질에 대해 효소 활성을 갖는 모노옥시게나제 변이체를 제공한다.
야생형 효소에 비교하여, "변형 기질 프로파일"은 본 발명에 따른 변이체에서 관찰할 수 있다. 특히, 논의된 변이체에서, 군 a) 내지 d)에 정의된 1종 이상의 산화가능한 화합물의 전환에서, 반응성의 개선, 예를 들어 비활성도 (전환된 기질의 nmol/분/P450 효소의 nmol로 표현됨)의 증가, 및(또는) Kcat, Km 및 Kcat/Km으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 동력학적 파라미터의 증가 (예를 들어 1% 이상, 예를 들어 10 내지 1000%, 10 내지 500%, 또는 10 내지 100%)가 관찰된다. 본 발명에 따른 산화 반응은 1종 이상의 외생성 (즉, 반응 매질에 첨가됨) 또는 내생성 (즉, 반응 매질 내에 이미 존재함) 유기 기질의 효소 촉매화된 산화를 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 산화 반응은 지방족 또는 방향족 C-H기에서의 모노- 및(또는) 폴리히드록실화, 예를 들어 모노- 및(또는) 디히드록실화, 또는 바람직하게는 비방향족인 C=C기에서의 에폭시드화를 포함한다. 상기 반응들의 조합도 또한 가능하다. 또한 즉각의 반응 생성물은 효소에 의하지 않은 후속 반응 또는부반응에서 추가로 전환시킬 수 있다. 효소에 의한 공정과 효소에 의하지 않은 공정의 그러한 조합도 마찬가지로 본 발명의 주제의 일부를 형성한다.
본 발명자들은 놀랍게도 예를 들어 N-헤테로시클릭 2핵 또는 다핵 방향족 화합물을 산화시킬 수 있는 신규 시토크롬 P450 모노옥시게나제에 의해 상기 목적을 달성할 수 있음을 발견하기에 이르렀다.
특히, 본 발명은 그 기질 결합 영역이 부위 특이적 돌연변이에 의해 신규의, 예를 들어 N-헤테로시클릭 기질을 기능적으로 흡입할 수 있는, 상기한 모노옥시게나제에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 신규 모노옥시게나제는 가용성이며, 즉 막에 결합하지 않은 형태로 존재하며 이 형태로 효소 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 모노옥시게나제는 바람직하게는 아미노산 서열 영역 172-224 (F/G 루프 영역), 39-43 (β-스트랜드 1), 48-52 (β-스트랜드 2), 67-70 (β-스트랜드 3), 330-335 (β-스트랜드 5), 352-356 (β-스트랜드 8), 73-82 (헬릭스 5) 및 86-88 (헬릭스 6) 중 하나에서 적어도 하나의 기능적 돌연변이를 갖는, 즉 신규 유기 기질 (특히 아래에 정의된 군 a) 내지 d)의 화합물 참조), 예를 들어 N-헤테로시클릭 1핵, 2핵 또는 다핵 방향족 화합물의 산화를 촉진하는, 특히 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 바실러스 메가테리움으로부터의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 BM-3로부터 유래하는 것과 같이, 세균 기원의 시토크롬 P450 모노옥시게나제로부터 유래한다.
본 발명에 따라 제공되는 시토크롬 P450 모노옥시게나제 변이체는 바람직하게는
a) 비치환 또는 치환된 N-, O- 또는 S-헤테로시클릭 1핵, 2핵 또는 다핵 방향족 화합물의 산화;
b) 비치환 또는 치환된 1핵 또는 다핵 방향족 화합물의 산화;
c) 직쇄 또는 분지쇄 알칸 및 알켄의 산화; 및
d) 비치환 또는 치환된 시클로알칸 및 시클로알켄의 산화
중 하나 이상의 반응을 수행할 수 있다.
바람직한 모노옥시게나제 변이체는 서열 영역 73-82, 86-88 및 172-224 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 기능적 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 갖는다. 따라서, 예를 들어 Phe87은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 Ala, Val, Leu, 특히 Val으로 치환될 수 있고; Leu188은 아미드 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 Asn 또는 특히 Gln으로 치환될 수 있으며; Ala74는 지방족 측쇄를 갖는 다른 아미노산, 예를 들어 Val 및 특히 Gly로 치환될 수 있다.
이러한 유형의 특히 바람직한 모노옥시게나제 변이체는
1) Phe87Val;
2) Phe87Val, Leu188Gln; 또는
3) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly의 단일 아미노산 또는 다중 아미노산 치환체 및 그의 기능적 등가물 중 적어도 하나를 갖는 것이다. 숫자는 돌연변이의 위치를 나타내며; 원래 아미노산은 숫자 앞에 표시되고 새로 도입된 아미노산은 숫자 다음에 표시된다.
본 명세서에서, 구체적으로 개시된 변이체의 "기능적 등가물" 또는 유사체는 변이체와는 상이하고 추가로 상기한 산화 반응 a) 내지 d) 중 적어도 하나에 대한, 예를 들어 헤테로시클릭 방향족 화합물에 대한 목적하는 기질 특이성을 가지며, 예를 들어 인돌을 히드록실화하거나, 또는 추가로 야생형 효소에 관해 목적하는 "변형 기질 프로파일"을 보이는 변이체이다.
또한, "기능적 등가물"은 본 발명에서 상기 언급한 서열 위치 중 적어도 하나에서 구체적으로 언급된 것 이외의 다른 아미노산 치환을 갖지만, 구체적으로 언급된 변이체처럼 야생형 효소에 관해 "변형 기질 프로파일"을 보이며 상기 언급한 산화 반응 중 적어도 하나를 촉매화하는 변이체를 여전히 이끄는 변이체를 의미하는 것으로 이해된다. 또한, 기능적 등가성은 특히 기질 프로파일에서의 변형이 질적으로 상응하는 경우에, 즉 예를 들어 동일한 기질이 상이한 속도로 전환되는 경우에 존재한다.
"기능적 등가물"은 또한 원래 구체적으로 언급한 P450 BM3 변이체처럼, 다른 유기체로부터의 P450 효소를 돌연변이시켜 얻을 수 있는 P450 모노옥시게나제 변이체를 포함하다. 예를 들어, 상동성 서열 영역들의 영역은 서열 비교에 의해 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 구체적으로 설명한 원칙에 따르면, 현대 분자 모델링 방법에 의해 반응 패턴에 영향을 미치는 등가 돌연변이를 수행할 수 있다.
"기능적 등가물"은 하나 이상의 부가적인 아미노산 부가, 치환, 결실 및(또는) 역위에 의해 얻을 수 있는 변이체를 또한 포함하고, 상기 부가적인 변형은 상기한 의미의 변형 기질 프로파일을 갖는 변이체를 생성시키는 한 어느 서열 위치에서도 일어날 수 있다.
본 발명에 따라 산화될 수 있는 군 a)의 기질은 비치환 또는 치환된 헤테로시클릭 1핵, 2핵 또는 다핵 방향족 화합물; 특히 산화가능한 또는 히드록실화가능한 N-, O- 또는 S-헤테로시클릭 1핵, 2핵 또는 다핵 방향족 화합물이다. 이들은 바람직하게는 2 또는 3개, 특히 2개의 4원 내지 7원, 특히 6원 또는 5원의 융합 고리 (여기서, 적어도 하나, 바람직하게는 모든 고리가 방향족 특성을 갖고, 적어도 하나의 방향족 고리는 고리 내에 1 내지 3개, 바람직하게는 1개의 N-, O- 또는 S-헤테로원자를 포함한다)를 포함한다. 전체 고리 구조는 1개 또는 2개의 동일하거나 상이한 헤테로원자를 추가로 포함할 수 있다. 방향족 화합물은 고리 탄소 또는 헤테로원자에서 1 내지 5개의 치환체를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 치환체의 예는 C1-C4-알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, n- 또는 이소프로필, n-, 이소- 또는 t-부틸, 또는 C2-C4-알케닐, 예를 들어 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐 또는 3-부테닐, 히드록실 및 할로겐, 예를 들어 F, Cl 및 Br이다. 상기 언급한 알킬 또는 알케닐 치환체는 또한 케토 또는 알데히드기를 가질 수 있으며; 그 예는 프로판-2-온-3-일, 부탄-2-온-4-일, 3-부텐-2-온-4-일이다. 적합한 헤테로시클릭 기질의 비제한적인 예는 특히 2핵 헤테로환, 예를 들어 인돌, N-메틸-인돌, 및 탄소 원자 상에 1 내지 3개의 상기 정의된 치환체를 갖는 그의 치환 유사체, 예를 들어 5-클로로- 또는 5-브로모인돌; 및 또한 퀴놀린 및 퀴놀린 유도체, 예를 들어 8-메틸퀴놀린, 6-메틸퀴놀린 및 퀴날딘; 및 벤조티오펜, 및 탄소 원자 상에 1내지 3개의 상기 정의된 치환체를 갖는 그의 치환 유사체이다. 또한, 3핵 헤테로 방향족 화합물, 예를 들어 아크리딘, 및 탄소 원자 상에 1 내지 3개의 상기 정의된 치환체를 갖는 그의 치환 유사체도 언급할 수 있다.
본 발명에 따라 산화가능한 군 b)의 기질은 비치환 또는 치환된 1핵 또는 다핵, 특히 1핵 또는 2핵 방향족 화합물, 예를 들어 벤젠 및 나프탈렌이다. 방향족 화합물은 비치환되거나 또는 1치환 또는 다치환될 수 있으며, 예를 들어 고리 탄소 원자 상에 1 내지 5개의 치환체를 가질 수 있다. 적합한 치환체의 예는 C1-C4-알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, n- 또는 이소프로필, 또는 n-, 이소- 또는 t-부틸, 또는 C2-C4-알케닐, 예를 들어 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐 또는 3-부테닐, 히드록실 및 할로겐, 예를 들어 F, Cl 및 Br이다. 상기 언급한 알킬 또는 알케닐 치환체는 또한 케토 또는 알데히드기를 가질 수 있고; 그 예는 프로판-2-온-3-일, 부탄-2-온-4-일, 3-부텐-2-온-4-일이다. 방향족 화합물은 4원 내지 7원의 비방향족 고리와 융합될 수 있다. 비방향족 고리는 1 또는 2개의 C=C 이중 결합을 가질 수 있고, 상기 언급한 치환체에 의해 1치환 또는 다치환될 수 있으며, 하나 또는 2개의 헤테로 고리 원자를 가질 수 있다. 특히 적합한 방향족 화합물의 예는 1핵 방향족 화합물, 예를 들어 쿠멘, 및 2핵 기질, 예를 들어 인덴 및 나프탈렌, 및 탄소 원자 상에 1 내지 3개의 상기 정의된 치환체를 갖는 그의 치환 유사체이다.
본 발명에 따라 산화될 수 있는 군 c)의 기질은 탄소원자수 4 내지 15, 바람직하게는 6 내지 12의 직쇄 또는 분지쇄 알칸 또는 알켄이다. 언급할 수 있는 예는 n-부탄, n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, n-옥탄, n-노난, n-데칸, n-운데칸 및 n-도데칸, 및 1회 이상 분지된 이들 화합물의 유사체, 예를 들어 1 내지 3개의 메틸 측쇄기를 갖는 유사체 화합물; 또는 상기 언급한 알칸의 1치환 또는 다치환, 예를 들어 1치환된 유사체이다.
본 발명에 따라 산화될 수 있는 군 d)의 기질은 고리 탄소 원자가 4 내지 8개인 비치환 또는 치환된 시클로알칸 및 시클로알켄이다. 그 예로는 시클로펜탄, 시클로펜텐, 시클로헥산, 시클로헥센, 시클로헵탄 및 시클로헵텐이 있다. 고리 구조는 군 a) 내지 b)의 화합물에 대한 상기 정의에 따른 하나 이상, 예를 들어 1 내지 5개의 치환체를 가질 수 있다. 그의 비제한적인 예는 이오논, 예를 들어 α-, β- 및 γ-이오논, 및 대응하는 메틸 이오논 및 이소메틸 이오논이다. α- 및 β-이오논이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 모노옥시게나제 중 하나를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 바람직한 핵산 서열은 서열 번호 1로부터 유도되며, 이는 상기한 기능적 아미노산 돌연변이 중 하나를 일으키는 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 갖는다. 본 발명은 또한 개별 또는 다수의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입 및(또는) 결실에 의해 얻어진 핵산의 기능적 유사체에 관한 것이며, 이는 목적하는 기질 특이성, 예를 들어 인돌 산화 활성을 갖는 모노옥시게나제를 더욱 코딩한다.
본 발명은 소위 침묵 돌연변이를 포함하거나 또는 특정 기원 또는 숙주 유기체의 코돈 사용에 따라 구체적으로 언급된 서열에 비해 변형된 핵산 서열, 및 상기 핵산 서열의 천연 변형체 (variants)를 또한 포함한다. 또한, 본 발명은 유전 암호의 퇴화 (즉, 대응하는 아미노산 서열에서 어떠한 변화도 없음) 또는 보존적 뉴클레오티드 치환 (즉, 대응하는 아미노산이 동일한 하전, 크기, 극성 및(또는) 용해도의 다른 아미노산으로 치환됨)에 의해 얻어진 핵산 서열의 변형, 및 "변형 기질 프로파일"을 갖는 본 발명에 따른 모노옥시게나제를 코딩하는 서열인 뉴클레오티드 부가, 삽입, 역위 또는 결실에 의해 변형된 서열과 대응하는 상보성 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에서 본 발명에 따른 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조체, 및 하나 이상의 상기 발현 구조체를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 구조체는 논의된 코딩 서열의 프로모터 5'-상류 및 종결 서열 3'-하류, 및 임의로 각각 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 추가의 통상의 조절 성분을 포함한다. 작동가능한 연결은 프로모터, 코딩 서열, 종결 서열 및 적합한 경우 다른 조절 성분이, 각 조절 성분이 코딩 서열의 발현에 대한 그의 의도된 기능을 이행할 수 있는 방식으로 순차적으로 배열되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 작동가능하게 연결될 수 있는 서열의 예는 표적화 (targeting) 서열, 또는 다른 번역 인핸서, 인핸서, 폴리아데닐화 시그날 등이다. 추가의 조절 성분은 선택가능한 마커, 증폭 시그날, 복제 기원 등을 포함한다.
인공 조절 서열 외에, 천연 조절 서열이 실제 구조 유전자의 상류에 계속 존재할 수 있다. 필요한 경우, 상기 천연 조절은 유전자 변형에 의해 스위치 오프될 (switched off) 수 있고, 유전자의 발현은 증강되거나 또는 저하될 수 있다. 그러나, 유전자 구조체는 또한 보다 단순한 구조일 수 있으며, 즉, 구조 유전자의 상류에 추가의 조절 시그날이 삽입되지 않고 그의 조절을 갖는 천연 프로모터가 제거되지 않는다. 대신에, 천연 조절 서열은 더이상 조절이 일어나지 않고 유전자 발현이 증가되거나 또는 감소되는 방식으로 돌연변이된다. 핵산 서열의 하나 이상의 카피가 유전자 구조체에 존재할 수 있다.
적합한 프로모터의 예는 그람 음성균에서 유리하게 사용되는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, 1-PR 또는 1-PL 프로모터; 및 그람 양성균 프로모터 amy 및 SPO2, 효모 프로모터 ADC1, MFa, Ac, P-60, CYC1, GAPDH, 또는 식물 프로모터 CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴 또는 파세올린 프로모터이다. 유도성 프로모터, 예를 들어 광- 및 특히 온도-유도성 프로모터, 예를 들어 PrP1프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
원칙적으로, 그의 조절 서열을 갖는 모든 천연 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 또한 유리한 방식으로 사용될 수 있다.
상기 언급한 조절 서열은 핵산 서열 및 단백질 발현의 표적화된 발현을 허용하도록 의도한 것이다. 이것은 숙주 유기체에 따라 예를 들어 유전자가 유도가 일어난 후에만 발현되거나 또는 과발현되는 것, 또는 유전자가 즉시 발현되고(되거나) 과발현되는 것을 의미할 수 있다.
조절 서열 또는 팩터는 바람직하게는 발현에 대한 긍정적인 효과를 갖고, 이러한 방식으로 발현을 증가시키거나 또는 저하시킨다. 따라서, 조절 성분의 증강은 강한 전사 시그날, 예를 들어 프로모터 및(또는) "인핸서"를 사용하여 전사 수준에서 유리하게 일어날 수 있다. 또한, 번역은 예를 들어 mRNA 안정성을 개선시킴으로써 증강될 수도 있다.
발현 카세트는 적합한 프로모터를 적합한 모노옥시게나제 뉴클레오티드 서열 및 종결 시그날 또는 폴리아데닐화 시그날과 융합시킴으로써 제조된다. 이를 위해, 통상의 재조합 및 클로닝 기술이 예를 들어 문헌[T. Maniatis, E.F. Fritsch 및 J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); 및 T.J. Silhavy, M.L. Berman 및 L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984); 및 Ausubel, F.M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기술되어 있는 바와 같이 사용된다.
적합한 숙주 유기체에서의 발현을 위해, 재조합 핵산 구조체 또는 유전자 구조체를 숙주에서의 최적 유전자 발현을 허용하는 숙주 특이적 벡터에 삽입하는 것이 유리하다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Cloning Vector", Pouwels P.H. 등, Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985]에서 찾을 수 있다. 벡터는 플라스미드 뿐만 아니라 당업자에게 알려진 모든 다른 벡터, 예를 들어 파지, 바이러스, 예를 들어 SV40, CMV, 바큘로바이러스 및 아데노바이러스, 프랜스포존, IS 성분, 파스미드, 코스미드 및 선형 또는 원형 DNA를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 이들 벡터는 숙주 유기체 내에서 자발적으로 복제가능하거나 또는 염색체에 통합된 상태로 복제될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 예를 들어 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환되며, 변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 재조합 미생물의 생성을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 상기한 재조합 구조체는 유리하게 적합한 숙주 시스템에 도입되어 발현된다. 논의된 발현 시스템에서 상기 언급한 핵산의 발현을 일으키기 위해 당업자에게 공지된 통상의 클로닝 및 형질감염 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 시스템은 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel 등, Ed., Wiley Interscience, New York, 1997]에 기재되어 있다.
적합한 숙주 유기체는 원칙적으로 본 발명에 따른 핵산, 그의 대립유전자 변형체 및 그들의 기능적 등가물 또는 유도체의 발현을 허용하는 모든 유기체이다. 숙주 유기체는 예를 들어 세균, 진균류, 효모 또는 식물 또는 동물 세포를 의미하는 것으로서 이해해야 한다. 바람직한 유기체는 세균, 예를 들어 에스케리치아속 (Escherichia), 예를 들어 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 스트렙토마이세스속 (Streptomyces), 바실러스속 (Bacillus) 또는 슈도모나스속 (Pseudomonas), 원핵 미생물, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 아스퍼길러스 (Aspergillus), 및 동물 또는 식물의 고등 진핵 세포, 예를 들어 Sf9또는 CHO 세포이다.
필요한 경우, 유전자 산물의 발현은 또한 트랜스제닉 유기체, 예를 들어 트랜스제닉 동물, 예를 들어 특히 마우스, 양 또는 트랜스제닉 식물에서 일어날 수도 있다. 또한, 트랜스제닉 유기체는 대응하는 내생성 유전자가 예를 들어 돌연변이 또는 부분 결실 또는 완전 결실에 의해 제거된 낙아웃 (knock-out) 동물 또는 식물일 수 있다.
성공적으로 형질전환된 유기체는 마찬가지로 벡터 또는 발현 카세트에 포함된 마커 유전자에 의해 선별될 수 있다. 상기 마커 유전자의 예는 항생제에 내성인 유전자, 및 형질전환된 세포의 염색을 유발하는 색깔 반응을 촉매화하는 효소에 대한 유전자이다. 이들 형질전환된 세포는 이어서 자동 세포 선별을 이용하여 선별할 수 있다. 벡터를 사용하여 성공적으로 형질전환되고 항생제에 대해 내성인 적합한 유전자 (예를 들어 G418 또는 하이그로마이신)를 갖는 미생물은 적합한 항생제 함유 배지 또는 기질을 사용하여 선별할 수 있다. 세포 표면 상에 제시될 수 있는 마커 단백질은 친화도 크로마토그래피에 의한 선별에 사용될 수 있다.
숙주 유기체와 이 유기체에 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 파지, 예를 들어 RNA 폴리머라제/프로모터 시스템을 갖는 플라스미드, 파지 λ, μ 또는 다른 용원성 (temperate) 파지 또는 트랜스포존 및(또는) 다른 유리한 조절 서열과의 조합은 발현 시스템을 형성한다. 용어 "발현 시스템"은 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포와 포유동물 세포에 적합한 벡터, 예를 들어 pcDNA3neo 벡터와의 조합을 의미한다.
상기한 바와 같이, 유전자 산물은 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스, 양 또는 트랜스제닉 식물에서 또한 유리하게 발현될 수 있다. 핵산에서 유래된 RNA를 갖는 세포 배제 (cell-free) 번역 시스템을 프로그램하는 것도 마찬가지로 가능하다.
또한, 본 발명은 모노옥시게나제 생산 미생물을 배양하고, 적합하게 모노옥시게나제의 발현을 유도하며, 배양물로부터 모노옥시게나제를 단리하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 모노옥시게나제의 제조 방법을 제공한다. 필요한 경우, 본 발명에 따른 모노옥시게나제는 공업 규모로 또한 생산할 수 있다.
미생물은 공지 방법에 의해 배양하여 발효시킬 수 있다. 예를 들어, 세균은 20 내지 40℃ 및 pH 6 내지 9에서 TB 또는 LB 배지에서 성장시킬 수 있다. 적합한 배양 조건은 예를 들어 문헌[T. Maniatis, E.F. Fritsch 및 J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 상세히 기재되어 있다.
모노옥시게나제가 배양 배지 내로 분비되지 않으면, 세포를 용해시키고 공지의 단백질 단리 방법을 사용하여 용해물로부터 모노옥시게나제를 얻는다. 별법으로 세포는 고주파 초음파에 의해, 예를 들어 French pressure cell에서의 고압에 의해, 삼투작용에 의해, 세제, 용해성 효소 또는 유기 용매의 작용에 의해, 균질화에 의해 또는 상기 언급된 다수의 방법들의 조합에 의해 용해시킬 수 있다. 모노옥시게나제의 정제는 공지의 크로마토그래피 방법, 예를 들어 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 예를 들어 Q-세파로스 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피및 소수성 크로마토그래피에 의해, 및 다른 통상의 방법, 예를 들어 한외여과, 결정화, 염석, 투석 및 천연 겔 전기영동에 의해 달성할 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어 문헌[Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden (Biochemical Procedures), Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York 또는 Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기재되어 있다.
재조합 단백질을 단리하기 위해서, 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 cDNA를 신장시켜 정제를 단순화하는 기능을 하는 변형 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 특이 유리하다. 이러한 유형의 적합한 변형은 예를 들어 앵커로서 작용하는 소위 "tag", 예를 들어 헥사-히스티딘 앵커로서 알려진 변형, 또는 항체에 의해 항원으로서 인식될 수 있는 에피토프이다 (예를 들어 문헌[Harlow, E. 및 Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press] 참조). 이들 앵커는 단백질을 고체 지지체, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼에 충전될 수 있는 중합체 매트릭스에, 또는 미세적정판 또는 다른 지지체에 부착시키기 위해 사용할 수 있다.
이들 앵커는 또한 동시에 단백질을 인식하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 단백질의 인식을 위해 통상의 마커, 예를 들어 형광 염료, 기질과 반응한 후 검출가능한 반응 생성물을 형성하는 효소 마커 또는 방사성 마커를 단독으로 또는 단백질을 유도체화하기 위한 앵커와 조합하여 사용하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은
a1) 상기 정의된 재조합 미생물을 배양 배지 내에서 본 발명에 따른 모노옥시게나제에 의해 산화가능한 기질인 외생성 (첨가된) 기질 또는 중간체로서 형성된 기질의 존재 하에 바람직하게는 산소의 존재 하에 (즉, 호기적 조건 하에) 배양하거나; 또는
a2) 기질 함유 반응 배지를 본 발명에 따른 효소와 함께 바람직하게는 산소 및 전자 공여체의 존재 하에 인큐베이션하고;
b) 형성된 산화 생성물 또는 그의 2차 생성물을 배지로부터 단리하는 것
을 포함하는, 유기 화합물, 예를 들어 상기 정의한 바와 같은 N-헤테로시클릭 1핵, 2핵 또는 다핵 방향족 화합물의 미생물에 의한 산화에 관한 것이다.
상기 반응에 필요한 산소는 대기로부터 반응 매질 내로 통과되거나 또는 필요한 경우 공지의 방식으로 첨가될 수 있다.
산화가능한 기질은 바람직하게는
a) 비치환 또는 치환된 N-헤테로시클릭 1핵, 2핵 또는 다핵 방향족 화합물;
b) 비치환 또는 치환된 1핵 또는 다핵 방향족 화합물;
c) 직쇄 또는 분지쇄 알칸 및 알켄; 및
d) 비치환 또는 치환된 시클로알칸 및 시클로알켄
중에서 선택된다.
바람직한 변법은 인디고/인디루빈의 형성으로서, 상기 기질이 배양액 중에 중간체로서 형성된 인돌이며, 배지 중에 형성된 인디고 및(또는) 인디루빈을 히드록시인돌 중간체의 산화에 의해 단리한다는 사실을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 산화를 재조합 미생물을 사용하여 수행하는 경우, 미생물의 배양은 바람직하게는 먼저 산소의 존재 하에 복합 배지, 예를 들어 TB 또는 LB 배지 중에서 약 20 내지 40℃의 배양 온도 및 약 6 내지 9의 pH에서, 적당한 세포 밀도에 도달할 때까지 수행한다. 인돌은 미생물에 의해 중간체로서 형성되기 때문에, 외생성 인돌을 첨가하는 것은 일반적으로 불필요하다. 그러나, 다른 기질을 사용하는 경우에는 외생성 기질의 첨가가 요구될 수 있다. 산화 반응을 보다 양호하게 조절할 수 있도록, 유도성, 특히 온도 유도성 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 온도를 필요한 유도 온도, 예를 들어 PrP1프로모터의 경우 42℃까지 증가시키고, 이 온도를 모노옥시게나제 활성의 발현에 충분한 시간, 예를 들어 1 내지 10시간 또는 5 내지 6시간 동안 유지한 후 약 30 내지 40℃로 다시 저하시킨다. 이어서, 산소의 존재 하에 12시간 내지 3일 동안 계속 배양한다. pH는 특히 인돌 산화의 경우 NaOH를 첨가하여 예를 들어 9 내지 10으로 증가시킬 수 있고, 이에 의해 효소 작용으로 형성된 산화 생성물인 2- 및 3-히드록시인돌의 대기중 산화에 의해 인디고 형성 또는 인디루빈 형성이 부가적으로 촉진된다.
본 발명에 따른 인디고/인디루빈 형성은 하기 반응식으로 예시된다.
그러나, 본 발명에 따른 산화를 정제된 또는 풍부한 효소 변이체를 사용하여 수행하는 경우, 본 발명에 따른 효소를 외생성 기질 함유, 예를 들어 인돌 함유 배지 (약 0.01 내지 10 mM, 또는 0.05 내지 5 mM)에 용해시키고, 반응은 바람직하게는 산소의 존재 하에 약 10 내지 50℃, 예를 들어 30 내지 40℃의 온도 및 약 6 내지 9의 pH (예를 들어 100 내지 200 mM의 인산염 또는 Tris 완충액을 사용하여 확립된 바와 같이)에서, 그리고 환원제의 존재 하에 수행하며, 상기 기질 함유 배지는 산화하고자 하는 기질에 비해 약 1 내지 100배, 또는 10배 내지 100배 몰 과량의 환원 등가물을 추가로 함유한다. 바람직한 환원제는 NADPH이다. 필요한 경우, 환원제는 몇회로 나누어 첨가할 수 있다.
유사한 방식으로, 바람직하게 사용되는 산화가능성 기질은 n-헥산, n-옥탄, n-데칸, n-도데칸, 쿠멘, 1-메틸인돌, 5-Cl- 또는 Br-인돌, 인덴, 벤조티오펜, α-, β- 및 γ-이오논, 아크리딘, 나프탈렌, 6-메틸- 또는 8-메틸퀴놀린, 퀴놀린 및 퀴날딘이다.
본 발명에 따른 효소적 산화 반응은 예를 들어 다음 조건 하에 수행할 수 있다.
기질 농도: 0.01 내지 20 mM
효소 농도: 0.1 내지 10 ㎎/㎖
반응 온도: 10 내지 50℃
pH: 6 내지 8
완충액: 0.05 내지 0.2M의 인산칼륨 또는 Tris/HCl
전자 공여체: 바람직하게는 소량씩 나누어 첨가한다
(초기 농도: 약 0.1 내지 2 ㎎/㎖)
혼합물은 예를 들어 전자 공여체 (예를 들어 NADPH)를 첨가함으로써 반응이 개시되기 전에 잠깐 동안 (1 내지 5분) 예비인큐베이션시킬 수 있다 (약 20 내지 40℃에서). 반응은 적절하게 산소를 추가로 도입하면서 호기적으로 수행한다.
본 발명에 따른 기질 산화 방법에서, 반응 배지 내에 존재하거나 또는 첨가되는 산소는 효소에 의해 환원적으로 제거된다. 필요한 환원 등가물은 첨가되는 환원제 (전자 공여체)에 의해 제공된다.
이어서 형성된 산화 생성물을 배지로부터 분리시키고 통상의 방식, 예를 들어 추출 또는 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
또한, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 효소 또는 본 발명에 따른 재조합 미생물을 고정된 형태로 포함하는 생물반응기 (bioreactor)에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 미생물의, 군 a) 내지 d) 중 어느 한 군의 기질, 특히 N-헤테로시클릭 1핵, 2핵 또는 다핵 방향족 화합물의 미생물에 의한 산화를 위한, 및 바람직하게는 인디고 및(또는) 인디루빈의 형성을 위한 용도에 관한 것이다.
하기 실시예를 참고하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
<실시예 1>
P450 BM-3의 특이적 코돈의 랜덤화
실험은 본질적으로 참고문헌 (19)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 3 위치 (Phe87, Leu188 및 Ala74)를 Stratagene QuikChange 키트 (La Jolla, CA, USA)를 사용하는 부위 특이적 돌연변이를 통해 랜덤화시켰다. 다음 PCR 프라이머를 개별 위치에 대해 사용하였다.
Phe87: 5'-gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3' (서열 번호 3)
5'-cgtccagcttgtnnncaacccgtctcctgc-3' (서열 번호 4)
Leu188: 5'-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3' (서열 번호 5)
5'-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3' (서열 번호 6)
Ala74: 5'-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3' (서열 번호 7)
5'-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3' (서열 번호 8)
PCR 조건은 3 위치 모두에 대해 동일하였다. 특히, 17.5 pmol의 각 프라이머 중의 하나, 20 pmol의 주형 플라스미드 DNA, 3U의 Pfu 폴리머라제, 및 3.25 nmol의 각 dNTP를 50 ㎕의 반응 부피당 사용하였다. PCR 반응은 94℃/분에서 시작한 다음 94℃, 1분; 46℃, 2.5분; 72℃, 17분의 온도 싸이클을 20회 수행하였다. 20 싸이클 후, 72℃에서 15분 동안 계속 반응시켰다. PCR 후, 20U의 DpnI를 사용하여 주형 DNA를 37℃에서 3시간 동안 분해시켰다. 이어서, 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환된 이. 콜라이 DH5α 세포를 150 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 한천 평판 상에 플레이팅하였다. 이어서, 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다.
<실시예 2>
P450 BM-3 및 그의 변이체의 발현 및 정제와 청색 색소의 생산
P450 BM-3 유전자 및 그의 변이체를 참고문헌 (20)에 기재된 바와 같이 플라스미드 pCYTEXP1의 강한 온도 유도성 PRPL프로모터의 제어 하에 이. 콜라이 DH5α에서 발현시켰다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 콜로니를 집어 웰 (hollow) 당 200㎕의 TB 배지와 100 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 96웰의 미세적정판에 옮겼다. 이어서, 37℃에서 철야 인큐베이션하였다. 이어서, 각 웰 중 하나의 세포 배양액 40 ㎕를 2 ㎖의 TB 배지를 100 ㎍/㎖의 암피실린과 함께 함유한 배양관에 옮겼다. 이어서, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 유도를 위해 온도를 6시간 동안 42℃로 상승시켰다. 이어서, 37℃에서 계속 철야 배양시켰으며, 청색 색소가 생산되었다.
효소 또는 청색 색소의 예비적 생산은 300 ㎖의 세포 배양액 (OD578㎚= 0.8 내지 1.0)으로부터 출발하여 수행하였다. 효소의 단리를 위해, 세포를 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.1M KxPO4완충액, pH 7.4에 재현탁시켰다. Branson sonifer W25 (Dietzenbach, Germany)를 사용하여 에너지 출력 80 W에서 2분간 초음파 처리를 3회 실시하여 빙냉시킨 세포를 조심스럽게 파괴시켰다. 현탁액을 32,570×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 조 추출물은 활성도 결정 또는 효소 정제를 위해 사용하였다. 효소 정제는 본원에 참고로 포함된 참고문헌 (21)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정제된 효소의 농도는 91 mM-1㎝-1의 흡광 계수를 사용하여 문헌 (11)에 기재된 바와 같이 450 및 490 ㎚에서의 흡광도 차이에 의해 결정하였다.
<실시예 3>
다량의 청색 색소를 생산하는 변이체의 단리
대응하는 위치의 코돈의 랜덤화 돌연변이에 의해 생산된 각 위치 중 하나의변이체들로부터 각 경우에 대해 100개의 콜로니를 단리하였다. 이들 콜로니를 청색 색소의 생산을 위해 배양관에서 배양하였다.
세포를 물로 세척하고 수회의 저속 원심분리 단계 (500 rpm)를 수행한 후, 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 사용하여 청색 색소를 추출하였다. 청색 색소의 용해도는 DMSO에서 최대였다. 추출물의 흡광도는 677 ㎚에서 측정하였다. 최대량의 청색 색소를 생산하는 변이체, 특히 특수 위치로부터의 변이체를 DNA 서열결정 (ABI DNA 서열결정 키트; ABI Prism™ 377 DNA 서열결정기)을 위해 사용하였고, 또한 부위 특이적 랜덤화 돌연변이를 위한 주형으로서 사용하였다.
<실시예 4>
인돌 히드록실화에 대한 활성 시험
인돌 히드록실화 활성은 DMSO 중 10 내지 500 mM 인돌 용액 8 ㎕, Tris/HCl 완충액 (0.1 M, pH 8.2) 850 ㎕, 및 P450 BM-3 야생형 또는 변이체 0.6 nmol을 최종 부피 1 ㎖로 포함하는 용액에서 시험하였다. 혼합물을 9분 동안 예비인큐베이션한 후, NADPH 1 mM 수용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 20초 후 1.2 M KOH 60 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 5 내지 30초 이내에 (호기적 조건 하에), 효소 생성물은 인디고 ([△2,2'-비인돌린]-3,3'-디온) 및 인디루빈 ([△2,3'-비인돌린]-2',3-디온)으로 완전히 전환되었다. 인디고 생산은 670 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 순수 인디고를 사용한 검정 곡선은 상기 파장에서 3.9 mM-1㎝-1의 흡광 계수를 보여주었다. 0.6 nmol의 야생형 또는 P450 BM-3 변이체, 및0.05 내지 5.0 mM의 인돌을 사용하여 40초의 반응 시간에서 인디고 생산에 대한 선형 커브를 얻었다. 인디루빈은 670 ㎚에서 매우 약한 흡광도를 보였고, 형성된 인디루빈의 양은 형성된 인디고의 양보다 훨씬 더 적었다. 인디루빈의 형성은 동력학적 파라미터의 결정에서 무시되었다. NADPH 소비는 340 ㎚에서 측정하여 6.2 mM-1㎝-1의 흡광 계수를 사용하여 참고문헌 (17)에 기재된 바와 같이 산출하였다.
<실시예 5>
인디고 및 인디루빈의 정제
세포를 물로 세척하고 500 g에서 반복하여 원심분리한 후, 형성된 청색 펠렛을 테트라히드로푸란 (THF)을 사용하여 추출하였다. 추출물을 증발시켜 거의 무수 상태로 하고, 적색 색소를 무수 에탄올 50 ㎖로 여러번 추출하였다. 잔류 청색 고형물을 THF에 용해시키고 박층 크로마토그래피 (TLC)로 분석하였다. 에탄올 용액을 증발시키고 실리카겔 크로마토그래피 (TLC 60, Merck, Darmstadt, Germany; 2 ㎝×30 ㎝)로 정제한 후, THF 및 석유 에테르 (비율 1:2)로 세척하였다. 수득한 적색 용액을 증발시키고 그 순도를 TLC에 의해 측정하였다. 청색 및 적색 색소의 흡광 스펙트럼은 Ultraspec 3000 분광광도계 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 사용하여 400 내지 800 ㎚ 범위에서 측정하였다. 청색 및 적색 색상을 또한 질량 분광분석법 및1H-NMR 분광계로 더욱 분석하였다.
실험 결과
1. P450 BM-3 돌연변이에 의한 청색 색소에 대한 생산성 증가
천연 P450 BM-3은 청색 인디고 함유 색소, 또는 전구체 물질인 2- 또는 3-히드록시인돌 생산능을 갖지 않는다. 충분한 양의 청색 색소를 제조할 수 있도록 하기 위해, P450 BM-3을 제어된 방식으로 진화시켰다. 청색 색소를 생산하는 모든 변이체를 서열결정하였다. 3 위치: Phe87, Leu188 및 Ala74 중 적어도 하나의 위치가 돌연변이된 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 3 위치가 청색 색소의 생산에서 P450 BM-3의 활성에 대해 결정적인 역할을 하는 것으로 추정되었다. 팔미톨레산과 착화된 시토크롬 P450 BM-3의 헴 도메인의 구조로부터, Phe87은 기질이 헴기에 더 가까이 근접하는 것을 방해한다는 것을 알 수 있다 (참고문헌 14). 변이체 Phe87Val은 (14S, 15R)-아라키돈산의 에폭시드화에서 높은 레지오- 및 입체-선택성을 보이며 (참고문헌 13), 변이체 Phe87Ala는 ω-1, ω-2 및 ω-3의 히드록실화 위치를 ω로 이동시킨다 (참고문헌 22). 따라서 위치 87은 PCR에 의한 부위 특이적 랜덤화 돌연변이를 위해 우선적인 위치로서 선택되었다. 배양관에서, 유도 후 소량의 청색 색소를 생산하는 7개의 콜로니를 얻었다. 최대량의 청색 색소를 생산하는 콜로니를 선택하여 DNA 서열결정하였다. 서열 데이타는 Phe87이 Val로 치환된 것을 보여주었다. 이어서 변이체 Phe87Val을 위치 Leu188에 대한 부위 특이적 랜덤화 돌연변이의 제2 실시를 위한 주형으로서 사용하였다. 팔미톨레산과 착화된 헴 도메인의 구조는 F 및 G 나선의 위치변경에 의해 잔기 Leu188이 기질과 직접 접촉한다는 것을 보여준다 (참고문헌 14). 따라서, 이 위치는 기질 결합 또는 배향에서 중요한 역할을 할 수 있다. 제2 스크리닝 통과 후, 청색 색소를 생산하는 31개의 콜로니를 관찰하였다. 최대량의 색소를 생산하는 변이체는 치환 Phe87Val 및Leu188Gln을 포함하였다. 이어서, 이 변이체를 제3 통과의 부위 특이적 랜덤화 돌연변이에서 위치 Ala74에서 돌연변이시켰다. 이 경우에 3중 변이체 F87L188A74 (Phe87Val, Leu188Gln 및 Ala74Gly)를 얻었고, 이는 300 ㎖의 TB 배지를 포함하는 2리터 플라스크 내에서 수 ㎎의 청색 색소를 생산하였다. 이 양은 청색 색소의 단리 및 특성화를 위해 충분한 양이었다.
2. 청색 색소의 단리 및 동정
세포를 세척한 후, 잔류 청색 펠렛을 THF로 추출하고 TLC로 분석하였다. 청색 색소를 빠르게 이동하는 청색 성분과 보다 느리게 이동하는 적색 성분으로 분리하였다. 두 성분은 모두 시판 인디고 시료의 성분들과 정확히 동일한 이동 파라미터를 보였다.
정제 후, 두 성분의 흡광 스펙트럼을 DMSO 내에서 측정하였다. 청색 성분은 시판 인디고 시료와 동일한 스펙트럼을 보였다. 정제된 청색 및 적색 성분을 각각 질량 분광분석법으로 분석하였다. 두 색소의 질량 스펙트럼은 m/e= 262에서 강한 분자 이온 피크와 m/e= 234 및 205에서 2개의 단편 피크 (각 경우 상대 강도 10%)를 보였다. 이 패턴은 인디고이드 화합물의 전형적인 것이다. 이들 이온의 원소 조성은 고해상 질량 분광분석법에 의해 C16H10N2O2, C15H10N2O 및 C14H9N2로 결정되었다. 이는 또한 인디고 종류의 구조의 특징이다. 따라서 청색 색소는 인디고로서, 적색 색소는 인디루빈으로서 확인되었다. 구조 확정을 위해, 두 색소의 500 ㎒1H-NMR 스펙트럼을 DMSO-D6용액에서 수행하였다. 그 결과는 참고문헌의 데이타 (참고문헌23)와 일치하였다.
3. 단리된 효소를 사용한 인디고의 생산
인디고는 미생물 형질전환에 의해 인돌로부터 입수가능한 것으로 알려져 있다 (참고문헌 24-26). 그러나, 이들 미생물 시스템은 어느 것도 P450 모노옥시게나제를 포함하지 않았다. 본 발명에 따라, 인돌에 대한 순수 효소의 촉매 활성을 최초로 결정하였다. 변이체 F87L188A74를 인돌과 혼합하였다. 어떠한 색상 반응도 관찰할 수 없었다. NADPH를 반응 혼합물에 첨가한 후에만 약 20분 후 청색 색소가 형성되었다. 반응 혼합물의 pH를 약 11로 조절함으로써, NADPH를 첨가한 지 30초 후 청색 발색이 수초 내에 가시화되었다. 천연 P450 BM-3을 사용한 대조 실험은 효소, 인돌 및 NADPH의 농도를 증가시킨 경우에도 항상 음성 결과를 보였다. 에틸 아세테이트를 사용하여 청색 색소를 추출하고 TLC로 분석하였다. 청색 색소를 다시 보다 빠르게 이동하는 청색 성분과 보다 느리게 이동하는 적색 성분으로 분리하였다. Rf값 및 흡광 스펙트럼은 발효 브로쓰로부터의 추출물의 값들과 동일하였다. 따라서, P450 BM-3의 F87L188A74 변이체는 인돌 히드록실라제이다.
인돌의 인디고로의 효소적 전환을 위한 2가지 경로가 이전에 개시되었다. 한 경로는 디옥시게나제에 의해 촉매화되고, 다른 경로는 스티렌 모노옥시게나제에 의해 촉매화된다 (참고문헌 24 및 25). NADPH 화학양론은 두 경우 모두 2이다. 따라서, 디옥시게나제와 대조적으로, 본 발명에 따른 변이체 F87L188A74는 단지 한 위치에서만 인돌을 히드록실화하여 옥스인돌 (2-히드록시인돌) 또는 인독실 (3-히드록시인돌)을 형성하는 것으로 추정되었다.
4. 인돌 히드록실화의 동력학적 파라미터
야생형 효소 P450 BM-3과 변이체 Leu188Gln, Phe87Val, F87L188 및 F87L188A74의 순수 시료를 인돌 히드록실화의 동력학적 파라미터의 결정을 위해 사용하였다. 그 결과를 하기 표 1에 요약하였다.
인돌 히드록실화를 위한 P450 BM-3 변이체의 동력학적 파라미터
변이체 Kcat(S-1) Km(mM) Kcat/Km(M-1s-1)
야생형 -a) - -
Leu188Gln n.d.b) n.d. n.d.
Phe87Val 2.03 (0.14) 17.0 (1.0) 119
F87L188 2.28 (0.16) 4.2 (0.4) 543
F87L188A74 2.73 (0.16) 2.0 (0.2) 1365
a) 활성이 관찰되지 않음.b) 측정되지 않음 (활성이 너무 낮아 측정되지 않음)
과량의 정제된 효소와 고농도의 인돌을 사용하는 경우에도, 야생형 효소는 인돌을 산화시킬 수 없었다. 변이체 Leu188Gln은 낮은 활성을 보였다. 변이체 Phe87Val은 인돌 히드록실화에 대해 119 M-1s-1의 촉매 활성을 보였다. 이중 변이체 F87L188 (Phe87Val, Leu188Gln)의 촉매 효율은 543 M-1s-1으로 증가하였고, 추가 치환 Ala74Gly의 도입으로 1365 M-1s-1으로 증가하였다. Kcat값은 Phe87Val에서 3중 변이체까지 총 35% 증가한 반면, Km값은 약 7배 감소하였다. 이는 Ala74Gly 및 Leu188Gln이 기질 결합에 주로 관여한다는 것을 나타낸다.
3중 변이체 F87L188A74의 경우, 인돌 전환율 (Kcat= 2.73 s-1)은 대부분의 P450 효소보다 10배 더 높았다 (참고문헌 18).
<실시예 6>
변형 시토크롬 P450 모노옥시게나제를 사용한 n-옥탄의 히드록실화
Phe87Val, Leu188Gln 및 Ala74Gly의 돌연변이를 포함하는 P450 BM-3 모노옥시게나제 변이체를 사용하여 반응을 수행하였다.
선택된 기질은 n-옥탄이었다. n-옥탄의 히드록실화를 위해 하기 호기적 반응 혼합물을 사용하였다.
P450 BM-3 변이체: 17.5 ㎎ (동결건조물)
반응 완충액: 9.1 ㎖ (인산칼륨 완충액 50 mM, pH 7.5)
기질: 50 ㎕의 60 mM 용액 (아세톤 중)
온도: 25℃
효소 동결건조물을 500 ㎕의 반응 완충액에 용해시키고, 처츰에 기질 및 반응 완충액과 함께 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 300 ㎕의 NADPH 용액 (5 ㎎/㎖)을 첨가하였다. NADPH를 2회 더 반복하여 첨가하였다. 반응의 진행은 NADPH 감소를 관찰할 수 있는 340 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 모니터하였다. 반응 용액 중 지나치게 고농도의 NADPH는 효소를 불활성화시키기 때문에, NADPH를 300 ㎕의 분취액으로 첨가하였다. 이어서 생성물을 단리하기 위해, 반응 용액을 디에틸 에테르 5 ㎖로 3회 추출하였다. 유기상을 합하여 MgSO4상에서 건조시키고농축하였다. 이어서, 생성물을 TLC, GC/MS 및 NMR로 특성화하였다.
반응 혼합물의 GC/MS 분석의 결과는 다음과 같았다.
화합물 Rt[분]1) 전환율 [%]
4-옥탄올 13.51 37
3-옥탄올 14.08 47
2-옥탄올 14.26 16
1)온도 프로그램: 40℃ 1분(등온)/ 3℃/분으로 95℃까지/ 10℃/분으로 275℃; 장치: Finnigan MAT 95; GC: HP 5890 Series II Split Injector; 칼럼: HP-5MS (메틸실록산) 30 m×0.25 ㎜; 캐리어 기체: He 0.065 ㎖/분.
출발 물질은 발견되지 않았다.
<실시예 7>
방향족 화합물, 헤테로방향족 화합물 및 트리메틸시클로헥세닐 화합물의 히드록실화
a) 실시예 6을 반복하되, n-옥탄 대신에 나프탈렌을 기질로 사용하였다. 확인된 생성물은 1-나프톨 및 시스-1,2-디히드록시-1,2-디히드로나프탈렌이었다. 나프탈렌 출발 물질의 88%가 전환되었다.
나프탈렌을 사용한 반응물에 대한 분석 방법
GC:
장치: Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 on Column Injector; 칼럼: DB5 30 m×0.2 ㎜; 물질: 5% 디페닐-95% 디메틸폴리실록산; 캐리어 기체: 0.5 바아 H2; 온도 프로그램: 40℃ 1분(등온) / 10℃/분으로 300℃.
Rt (1-나프톨)= 16.68
NMR:
1-나프톨 및 시스-1,2-디히드록시-1,2-디히드로-나프탈렌을1H NMR에서 확인하였다.
b) 실시예 6을 반복하되, n-옥탄 대신에 8-메틸퀴놀린을 기질로 사용하였다. 5-히드록시-8-메틸퀴놀린이 주요 생성물로서 다른 유도체와 함께 확인되었다 (생성물비 5:1). 사용된 출발 물질의 35%가 전환되었다.
c) 실시예 6을 반복하되, n-옥탄 대신에 α-이오논을 기질로 사용하였다. 3-히드록시-α-이오논이 주요 생성물로서 다른 유도체와 함께 확인되었다 (생성물비 76:24). 사용된 출발 물질의 60%가 전환되었다.
d) 실시예 6을 반복하되, n-옥탄 대신에 쿠멘 (이소프로필벤젠)을 기질로 사용하였다. 5개의 모노히드록시 생성물 및 1개의 디히드록시 생성물이 확인되었다. 사용된 출발 물질의 70%가 전환되었다.
<참고문헌>

Claims (19)

  1. a) 비치환 또는 치환된 N-, O- 또는 S-헤테로시클릭 1핵 또는 다핵 방향족 화합물의 산화;
    b) 비치환 또는 치환된 1핵 또는 다핵 방향족 화합물의 산화;
    c) 직쇄 또는 분지쇄 알칸 및 알켄의 산화; 및
    d) 비치환 또는 치환된 시클로알칸 및 시클로알켄의 산화
    중 적어도 하나의 반응을 수행할 수 있는 시토크롬 P450 모노옥시게나제.
  2. 제1항에 있어서, 세균 기원의 시토크롬 P450 모노옥시게나제로부터 유래한 것인 모노옥시게나제.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)으로부터의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 BM-3으로부터 유래한 것이고, 아미노산 서열 영역 172-224, 39-43, 48-52, 67-70, 330-335, 352-356, 73-82 및 86-88 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 기능적 돌연변이를 가진 모노옥시게나제.
  4. 제3항에 있어서, 아미노산 서열 영역 73-82, 86-88 및 172-224 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 기능적 돌연변이를 가진 모노옥시게나제.
  5. 제4항에 있어서,
    a) Phe87Val;
    b) Phe87Val, Leu188Gln; 또는
    c) Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly
    의 단일 아미노산 또는 다중 아미노산 치환 및 그의 기능적 등가물 중 적어도 하나를 가진 모노옥시게나제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 모노옥시게나제를 코딩하는 핵산 서열.
  7. 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에 제6항에 따른 핵산 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함하는 발현 구조체.
  8. 제7항에 따른 발현 구조체를 하나 이상 포함하는 벡터.
  9. 제8항 기재의 하나 이상의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 에스케리치아 (Escherichia) 속의 세균 중에서 선택된 것인 미생물.
  11. a1) 제9항 또는 제10항 기재의 재조합 미생물을 외생성 기질 또는 중간체로서 형성된 기질의 존재 하에 배양 배지에서 배양하거나; 또는
    a2) 기질 함유 반응 배지를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 기재의 효소와 함께 인큐베이션하고;
    b) 형성된 산화 생성물 또는 그의 2차 생성물을 배지로부터 단리하는 것
    을 포함하는, 제1항에 정의된 화합물의 미생물에 의한 산화 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 외생성 기질 또는 중간체로서 형성된 기질이
    a) 비치환 또는 치환된 N-, O- 또는 S-헤테로시클릭 1핵 또는 다핵 방향족 화합물;
    b) 비치환 또는 치환된 1핵 또는 다핵 방향족 화합물;
    c) 직쇄 또는 분지쇄 알칸 및 알켄; 및
    d) 비치환 또는 치환된 시클로알칸 및 시클로알켄
    으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 기질이 중간체로서 형성된 인돌이며, 중간체로서 형성된 인돌의 산화에 의해 생성된 인디고 및(또는) 인디루빈을 배지로부터 단리하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 인돌 산화는 상기 미생물을 산소의 존재 하에 약 20 내지 40℃의 배양 온도 및 약 6 내지 9의 pH에서 배양함으로써 수행하는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 외생성 기질로서, 상기 제1항에 정의된 화합물 군 a) 내지 d) 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 배지에 첨가하고, 상기 산화는 산소의 존재 하에 약 20 내지 40℃의 온도 및 약 6 내지 9의 pH에서 기질 함유 배지의 효소적 전환에 의해 수행하며, 상기 기질 함유 배지는 기질을 기준으로 약 10배 내지 100배 몰 과량의 환원 등가물을 부가적으로 함유하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 사용된 외생성 기질이 인돌, n-헥산, n-옥탄, n-데칸, n-도데칸, 쿠멘, 1-메틸인돌, 5-Cl- 또는 Br-인돌, 인덴, 벤조티오펜, α-, β- 및 γ-이오논, 아크리딘, 나프탈렌, 6-메틸- 또는 8-메틸퀴놀린, 퀴놀린 및 퀴날딘으로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물인 방법.
  17. 고정된 형태의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 효소 또는 제9항 또는 제10항에 따른 재조합 미생물을 포함하는 생물반응기 (bioreactor).
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 제8항에 따른 벡터, 또는 제9항 또는 제10항에 따른 미생물의,
    a) 비치환 또는 치환된 N-, O- 또는 S-헤테로시클릭 1핵 또는 다핵 방향족 화합물;
    b) 비치환 또는 치환된 1핵 또는 다핵 방향족 화합물;
    c) 직쇄 또는 분지쇄 알칸 및 알켄; 및(또는)
    d) 비치환 또는 치환된 시클로알칸 및 시클로알켄
    의 미생물에 의한 산화를 위한 용도.
  19. 제18항에 있어서, 인디고 및(또는) 인디루빈의 제조를 위한 것인 용도.
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