JP2003512078A

JP2003512078A - 芳香族アルデヒド及び／又はカルボン酸の微生物学的製造方法

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Publication number: JP2003512078A
Application number: JP2001533182A
Authority: JP
Inventors: シュミットアンドレアス; ヴィトールトベルナルト; ハウアーベルンハルト; ビューラーブルノ
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2003-04-02
Also published as: EP1224315B1; EP1224315A2; DK1224315T3; EP1645638A1; ATE396276T1; AU1388001A; CN100354427C; DE50012376D1; KR20020060217A; EP1645638B1; NO20021906L; PT1224315E; KR100807899B1; ES2258982T3; IL149204A0; DE19951768A1; CN1415018A; NO20021906D0; ES2304738T3; DE50015174D1

Abstract

(57)【要約】本発明はキシレンモノオキシゲナーゼ又はアルカンモノオキシゲナーゼを発現する遺伝子組み換え微生物を使用して芳香族化合物を相応のアルデヒド誘導体及び／又はカルボン酸誘導体の段階的な酸化のための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はキシレンモノオキシゲナーゼ又はアルカンモノオキシゲナーゼを発現
する組み換え微生物の使用下に芳香族アルデヒド誘導体及び／又はカルボン酸誘
導体を製造するための酸化的な微生物学的方法に関する。

【０００２】例えばシュードモナスプチダｍｔ−２のＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯによっ
てコードされるキシレンモノオキシゲナーゼ（ＸＭＯ）はトルエン及びキシレン
異化の際に重要な役割を果たす酵素系である。ＸＭＯはアルキル基ヒドロキシラ
ーゼのファミリーに属し、選択的に芳香環上のメチル基をヒドロキシル化する。
これはカルボン酸誘導体の形成に導く代謝経路の第１工程（図１の（Ａ）参照）
であり、これらの誘導体を所謂メタ異化経路を介してクレブス回路のための基質
に変換する。

【０００３】ＸＭＯは２つのポリペプチド−サブユニットＸｙｌＭ及びＸｙｌＡからなり、
これらは遺伝子ｘｙｌＭ及びｘｙｌＡによってコードされる（ｘｙｌＭＡＧＥ
ＮＢＡＮＫ−アクセッション番号Ｍ３７４８０）。ＸｙｌＡはＮＡＤＨ受容体レ
ダクターゼ、すなわち電子伝達タンパク質であり、これはＮＡＤＨからＸｙｌＭ
膜に局在するヒドロキシラーゼへと還元当量を伝達する。

【０００４】ＸｙｌＭの活性はリン脂質及び鉄（ＩＩ）イオンの存在に依存し、７のｐＨ最
適値を有する。ＸｙｌＭのアミノ酸配列はＰ．オレオボランス（P.oleovorans）
ＧＰｏ１からのアルカン−ヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ構成要素Ａｌｋ
Ｂのアミノ酸配列と２５％以下の相同性を有する。

【０００５】アルカンヒドロキシラーゼは中鎖長のアルカンのための異化経路の第１の酵素
であり、これにＯＣＴ異化プラスミド上で２つのａｌｋ−遺伝子クラスターによ
ってコードされる１組の酵素がそれに関連している。

【０００６】図１（Ａ）に示される代謝経路における第２の酵素はベンジルアルコールデヒ
ドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）、長鎖アルコールを基質とする亜鉛含有のデヒドロゲ
ナーゼファミリーのホモダイマーのメンバーである。この酵素はｘｙｌＢ−遺伝
子によってコードされる。図１（Ａ）に示される代謝経路における第３の酵素は
、同様にｘｙｌＣ−遺伝子によってコードされるモノダイマーであるベンズアル
デヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＺＤＨ）である。

【０００７】前記の遺伝子及び酵素の機能及び特性に対する更なる詳細は文献箇所（１）〜
（１８）にある。

【０００８】ＸＭＯを発現するように遺伝子組み換えされたエシェリキアコリがトルエン
及びキシレンだけでなく、ｍ−及びｐ−エチル−、メトキシ−、ニトロ−及びク
ロロ−置換されたトルエン並びにｍ−ブロム置換されたトルエンをも相応のベン
ジルアルコール誘導体に酸化できることを示すことができる（１９，２０）。ス
チレンはスチレンオキシド（ｅｅ９５％）に酸化される。更にＸＭＯは図１（Ａ
）に示される代謝経路における第２工程を触媒する、すなわちインビボで相応の
アルデヒドにベンジルアルコールを酸化することが推測された（すなわち完全な
生存細胞による試験において）（２，２１）。また図１（Ａ）に示される代謝経
路の第３工程の後にベンゾエートへのベンズアルデヒドの変換を既に観察するこ
とができるが、Ｅ．コリにおける非特異的なデヒドロゲナーゼとみなされる（２
）。それに対して更にインビトロで実施される部分的に精製されたＸｙｌＭＡに
よる調査（この記載においてはＸＭＯの別名が使用されている、すなわちそのた
めに２つのポリペプチド−サブユニット、すなわちＸｙｌＭ及びＸｙｌＡからな
る機能的酵素）はこれがベンジルアルコールに関して活性を有さないことを示し
ている。この矛盾に関する理由は依然として明らかでない。

【０００９】キシレンモノオキシゲナーゼ及びアルカンモノオキシゲナーゼ（ＡＭＯ、アル
カンヒドロキシラーゼとも呼称される；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：Ａ
Ｊ２４５４３６）の間に表れる相同性に基づいて、当業者は触媒反応の種類及び
規模に関する両者の系に関する類似の制限を見込んでいる。

【００１０】今まで先行技術から公知の生体触媒的な芳香族アルデヒドもしくはカルボン酸
の製造方法は、なおも要求が満たされない限りはその実施のために種々の酵素を
必要とするとみなされる。また化学合成は必要なレジオ選択性及び化学選択性に
基づいて困難なことが明らかにされた。

【００１１】従って本発明の課題は芳香族アルデヒド及び／又はカルボン酸の簡単な製造方
法を提供することである。

【００１２】本発明によれば、意想外にも簡単な微生物学的な製造方法を提供することがで
きた。本発明は、特にＸＭＯもしくはＡＭＯが図１（Ａ）もしくは図１（Ｂ）に
示される反応経路の各個々の工程を触媒することができる、すなわちアルキル置
換された芳香族化合物を相応のアルコール誘導体及び相応のアルデヒド誘導体を
中間体として介してカルボン酸誘導体に酸化するという意想外な知識に基づく。
意想外にも本発明によれば、ＸＭＯを発現する組み換えＥ．コリ（２０，２１）
による以前の調査と比較してＸＭＯ遺伝子、すなわちｘｙｌＭ及びｘｙｌＡに関
する特定の発現系を使用すると１０〜２０倍高い活性を達成できることも確認さ
れた。

【００１３】本発明の第１の対象は従って一般式Ｉ：Ａｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｒ^１（Ｉ）［式中、Ａｒは一置換又は多置換されていてよい一核性の芳香環を表し、Ｒ^１は酸素含有基−ＣＨＯ又は−ＣＯＯＨを表し、ｎは０〜１５、例えば０〜１２、１〜６又は６〜１２の整数値を表す］の芳香族
アルデヒド及び／又はカルボン酸を製造するにあたり、ａ）式ＩＩ：Ａｒ−Ｒ^２（ＩＩ）［式中、Ａｒは前記の意味を有し、かつＲ^２は−ＣＨ＝ＣＨ_２又は−（ＣＨ_２）_ｎ＋１Ｒ^３（式中、ｎは前記のように定
義されており、かつＲ^３はＨ又はＯＨを表す）を表し、又はＲ^１が−ＣＯＯＨを
表す場合には、Ｒ^２は−（ＣＨ_２）_ｎＲ^４を表してよく、その際、ｎは前記のよ
うに定義されており、かつＲ^４は−ＣＨＯを表す］の芳香族基質を含有する培養
培地中でキシレンモノオキシゲナーゼ（ＸＭＯ）及びアルカンモノオキシゲナー
ゼ（ＡＭＯ）から選択される酵素を発現する微生物を、特に好気的に培養し、か
つｂ）式Ｉの化合物を培養培地から単離することを特徴とする方法である。

【００１４】従って本発明による反応は同一の酵素を使用して１段階又は多段階で実施でき
る。基質としては、アルキル化された芳香族化合物、相応のアルコール又は相応
のアルデヒドを使用してよい。使用される基質の酸化の程度は以下に記載される
ように容易に調節できる。

【００１５】規定の理論に定められること無く、^１８Ｏ−導入実験は質量分光測定によって
得られる断片化パターンに関連して、次いで恐らく非立体特異的に脱水素してア
ルデヒドが得られる中間生成物としてのゲミナルなジオールの形成を介するＸＭ
Ｏによって触媒されるアルコール酸化の最も見込みのあるメカニズムが進行する
ことが示唆される（図６を参照）。

【００１６】本発明により製造されるもしくは基質として使用される一般式Ｉ及びＩＩの化
合物における芳香族環系Ａｒは一置換又は多置換されていてよい。環置換の位置
は任意に選択できる。しかしながら酸化されるべき側鎖に対してメタ位及び／又
はパラ位が有利である。

【００１７】本発明による方法によってＸＭＯにより酸化可能な一般式ＩＩの基質の具体的
な制限されない例は、トルエン、キシレン、スチレン、ｍ−及び／又はｐ−メチ
ル、エチル−、メトキシ−、ニトロ−及びクロロ−置換されたトルエン、並びに
ｍ−ブロム−置換されたトルエン及びシュードクメン（すなわちトリメチルベン
ゼン）並びに前記化合物の相応のアルコールもしくはアルデヒドである。本発明
による方法によりＡＭＯにより酸化可能な一般式ＩＩの基質の具体的な制限され
ない例は、トルエン、エチルベンゼン、ｎ−及びｉ−プロピルベンゼン、ｎ−ブ
チルベンゼン並びにｍ−及び／又はｐ−メチル、エチル−、メトキシ−、ニトロ
−及びクロロ−置換された前記化合物の類似体；及び該化合物の相応のアルコー
ル及びアルデヒドである。

【００１８】本発明による方法は有利には以下の酵素の使用下に実施する：ｘｙｌＭＡのＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号Ｍ３７４８０による遺伝子ｘｙ
ｌＡ及びｘｙｌＢによってコードされるＸＭＯ及び相応のイソ酵素。ＸＭＯは有
利には属シュードモナス、特に種シュードモナスプチダ、有利には株ｍｔ−２
（ＡＴＣＣ３３０１５）の細菌に由来する。

【００１９】ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＡＪ２４５４３６による遺伝子ａｌｋＢ、ａ
ｌｋＧ及びａｌｋＴによってコードされるＡＭＯ及び相応のイソ酵素（例えばａ
ｌｋＢに対するイソ酵素）。ＡＭＯは有利には属シュードモナス、特に種シュー
ドモナスオレオボランス、有利には株ＧＰｏ１（ＡＴＣＣ２９３４７）の細菌
に由来する。

【００２０】本発明により包含されるものは、同様に具体的に開示されているＸＭＯ及びＡ
ＭＯの“機能的等価物”の使用である。

【００２１】 “機能的等価物”又は具体的に開示されているモノオキシゲナーゼの類似体は
本発明の範囲におけるそれとは異なるものであり、これらは更に望ましい反応を
示し、かつ前記の一般式Ｉのアルデヒド及び／又はカルボン酸の製造のために使
用できる。

【００２２】 “機能的等価物”とは、少なくとも１つの配列位置で本来のアミノ酸とは別の
アミノ酸を有するが、それにもかかわらず前記の酸化反応を触媒するものを表す
。“機能的等価物”は従って１つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失及び／又は逆
位によって得られる突然変異体を含み、その際、前記の変更は、本発明による触
媒活性を有する突然変異体に導く限りそれぞれの配列位置に生じてよい。機能的
等価物は、特に突然変異体及び変更されていない酵素間の反応性型が質的に一致
する、すなわち例えば同じ基質を異なる速度で変換する場合に与えられる。

【００２３】 “機能的等価物”は本来、別の生物、例えば本願で具体的に挙げられた細菌と
は別の生物から得られるモノオキシゲナーゼ並びに天然に存在する変異体又はイ
ソ酵素を含む、例えば配列比較によって相同的な配列領域の範囲を確認して、本
発明の具体的な基準に関連して同等な酵素を突き止めることができる。

【００２４】本発明により包含されるものは、また前記のモノオキシゲナーゼ及びその機能
的等価物の１つをコードする具体的に挙げられる核酸配列（一本鎖及び二本鎖の
ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列）とは別の配列の使用である。他の本発明により使用
可能な核酸配列は従って１つ又は複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠
失による具体的に使用される配列とは異なるが、更に望ましい特性プロフィール
を有するモノオキシゲナーゼをコードしている。

【００２５】本発明により含まれるものは、また所謂サイレント突然変異を含むか又は特定
の起源又は宿主生物のコドン利用に相応して具体的に挙げられる配列と比較して
その天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体と同様にそれによって変更
されている核酸配列の使用である。同様に対象は保存的なヌクレオチド置換（す
なわち当該アミノ酸を電荷、サイズ、極性及び／又は溶解性が同じアミノ酸に取
り換える）によって得られる配列である。

【００２６】本発明の対象は更に調節核酸配列の遺伝的制御下に本発明により使用可能なモ
ノオキシゲナーゼ酵素をコードする核酸配列を有する発現構築物；並びにこれら
の発現構築物の少なくとも１つを有するベクターである。有利には本発明による
構築物はそれぞれのコーディング配列の５′上流にプロモーターを有し、３′下
流にターミネーター配列並びに場合により通常の調節エレメントを有し、特にそ
れぞれはコーディング配列と機能的に結合している。“機能的結合”とはプロモ
ーター、コーディング配列、ターミネーター及び場合により他の調節エレメント
の配置順序が、各調節エレメントがコーディング配列の発現において規定のよう
にその機能を満たすことができるような順序であることを意味する。機能的に結
合可能な配列のための例はターゲティング配列並びに翻訳強化因子、エンハンサ
ー、ポリアデニル化シグナルなどである。他の調節エレメントは選択可能なマー
カー、増幅シグナル、複製起点などを含む。

【００２７】人工的な調節配列の他に、実際の構造遺伝子の前に天然の調節配列が存在して
いてよい。遺伝的変化によって、この天然の調節は場合によりオフにでき、遺伝
子発現を高めるか、又は低めることができる。しかしながら該遺伝子構築物は容
易に合成できる、すなわち構造遺伝子の前に付加的な調節シグナルを挿入せず、
かつその調節を有するプロモーターは除去されない。その代わりに、天然の調節
配列を、調節がもはや行われず、かつ遺伝子発現を高めるか、又は低めるように
変異させる。核酸配列は１つ以上のコピーを遺伝子構築物中に有していてよい。

【００２８】使用可能なプロモーターの例は：グラム陰性細菌で使用されるｃｏｓ−プロモ
ーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｐ−プロモーター、ｔｅｔ−プロモーター
、ｔｒｐ−ｔｅｔ−プロモーター、ｌｐｐ−プロモーター、ｌａｃ−プロモータ
ー、ｌｐｐ−ｌａｃ−プロモーター、ｌａｃＩｑ−プロモーター、Ｔ７−プロモ
ーター、Ｔ５−プロモーター、Ｔ３−プロモーター、ｇａｌ−プロモーター、ｔ
ｒｃ−プロモーター、ａｒａ−プロモーター、ＳＰ６−プロモーター、ｌ−ＰＲ
−プロモーター又はｌ−ＰＬ−プロモーター並びにグラム陽性プロモーターａｍ
ｙ及びＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ
１、ＧＡＰＤＨ又は植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉ
ｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｔ又はユビキチンプロモーター又はフ
ァセオリンプロモーターである。誘導可能なプロモーター、例えば光又は温度で
誘導可能なプロモーター、例えばＰ_ｒＰ_ｌ−プロモーターが特に有利である。

【００２９】原則的に、その調節配列を有する全ての天然のプロモーターを使用できる。更
にまた合成プロモーターを有利に使用することができる。

【００３０】前記の調節配列は核酸配列の意図された発現及びタンパク質発現を可能にする
べきである。これは、例えば宿主生物に応じて、遺伝子が誘導後に初めて発現す
るか又は過剰発現するか、又は直ちに発現及び／又は過剰発現することを意味す
る。

【００３１】調節配列もしくは因子は更に有利には発現にポジティブに作用し、それによっ
て高められるか、又は低められる。このように調節エレメントの強化は転写レベ
ルで、強力な転写シグナル、例えばプロモーター及び／又は“エンハンサー”を
使用することによって実施できる。しかしながらその他にも翻訳の強化が、例え
ばｍＲＮＡの安定性の改善によって可能である。

【００３２】本発明による発現カセットの製造は適当なプロモーターと適当なモノオキシゲ
ナーゼ−ヌクレオチド配列並びにターミネーターシグナル又はポリアデニル化シ
グナルとの融合によって実施する。このために、例えばＴ．マニアティス（T.Ma
niatis）他（２４）並びにＴ．Ｊ．ジルハヴィ（T.J.Silhavy）他（３２）及び
アウスユーベル（Ausubel），Ｆ．Ｍ．他（３３）に記載のような慣用の組み換
え技術及びクローニング技術が使用される。

【００３３】組み換え核酸構築物もしくは遺伝子構築物は適当な宿主生物中での発現のため
に有利には、宿主において最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的なベクター
に挿入される。ベクターは当業者に公知であり、例えば“クローニングベクター
（Cloning Vectors）”（Pouwels P. H. et al.(34)）から引用できる。

【００３４】ベクターとは、プラスミドの他に全ての当業者に公知の別のベクター、例えば
ファージ、ウイルス、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュウロウイルス及びアデノ
ウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファズミド、コスミド及び線状又
は環状ＤＮＡを意味する。

【００３５】これらのベクターは宿主生物中で自律的に複製され、又は染色体により複製さ
れることがある。

【００３６】かかる本発明によるベクターを使用して、例えば少なくとも１種の本発明によ
るベクターで形質転換されており、かつ本発明による方法で使用できる組み換え
微生物を製造できる。有利には前記の本発明による組み換え構築物を適当な宿主
系に導入し、発現させる。このために、有利には当業者に公知の慣用のクローニ
ング法及びトランスフェクション法、例えば共沈殿法、プロトプラスト融合、エ
レクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを使用して、
前記の核酸をそれぞれの発現系に発現のために導入する。適当な系は、例えば分
子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、Ｆ
．アウスベル他（３５）に記載されている。

【００３７】宿主生物としては、原則的に本発明による核酸、そのアレル変異体、機能的等
価物又は誘導体の発現を可能にし、本発明による微生物学的酸化反応の実施のた
めに使用できる全ての生物である。宿主生物とは、例えば細菌、菌類、酵母、植
物細胞又は動物細胞を意味する。有利な生物は細菌である。

【００３８】しかしながら有利には、かかるＸＭＯを発現する、実質的にベンジルアルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）及び／又はベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（ＢＺＤＨ）の活性を有さない微生物が使用される。

【００３９】更に、実質的に遺伝子ａｌｋＪもしくはａｌｋＨによってコードされるアルカ
ノールデヒドロゲナーゼ（ＡＯＤＨ）及び／又はアルカナールデヒドロゲナーゼ
（ＡＡＤＨ）の活性を有さないＡＭＯを発現する微生物が使用される。例えば微
生物として、属エシェリキア、例えばＥ．コリ、例えば株Ｗ３１１０及びＫ１２
株、例えばＪＭ１０１及びＤＨ５α又はシュードモナスプチダ株、例えば株Ｋ
Ｔ２４４０の細菌を使用できる。幾つかの有利なＥ．コリ株の特性を第１表に挙
げている。

【００４０】微生物をベクターで形質転換することは、本発明によれば確立された標準技術
（２４）に従って実施し、かつ従って詳細な説明は省く。

【００４１】首尾よく形質転換された生物の選択は、同様にベクター又は発現カセット中に
含まれるマーカー遺伝子によって実施できる。かかるマーカー遺伝子のための例
は抗生物質耐性のための遺伝子及び形質転換された細胞の呈色をもたらす呈色反
応を触媒する酵素のための遺伝子である。これらは自動的なセルソーティングに
よって選択できる。ベクターで首尾よく形質転換された相応の抗生物質耐性遺伝
子（例えばＧ４１８又はハイグロマイシン）を有する微生物は相応の抗生物質を
含有する固体又は液体培地によって選択できる。細胞表面に提示されるマーカー
タンパク質はアフィニティクロマトグラフィーによる選択のために役立つ。

【００４２】宿主生物及び該生物に適当なベクター、プラスミド、ウイルス又はファージ、
例えばＲＮＡ−ポリメラーゼ／プロモーター系を有するプラスミド、ファージλ
又はμ又は別のテンペレートファージ又はトランスポゾン及び／又は他の有利な
調節配列の組合せが発現系を形成する。

【００４３】特に有利な実施形によれば、ＸＭＯをコードする遺伝子ｘｙｌＭ及びｘｙｌＡ
又はＡＭＯをコードする遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ及びａｌｋＴを機能的結合で
有するシュードモナスオレオボランスＧＰｏ１からのａｌｋ調節系の遺伝的制
御下にある発現ベクターで形質転換された組み換え微生物を使用する。

【００４４】特に有利には微生物をｘｙｌＭＡをコードする発現プラスミドｐＳＰＺ３で形
質転換する。

【００４５】シュードモナスオレオボランスＧＰｏ１からのａｌｋ調節系は自体公知であ
る。２つの前記のａｌｋ遺伝子クラスタの第１のクラスタの発現はａｌｋＢｐ、
ａｌｋプロモーターの制御下にあり、かつ第２のａｌｋ遺伝子クラスタによって
コードされる機能的調節タンパク質ａｌｋＳの存在下、インデューサー、例えば
アルカン例えば、ｎ−オクタン又はこれによって僅かに抑えられる化合物、例え
ばジシクロプロピルケトン（ＤＣＰＫ）（８，２２，２３）の存在下に開始する
。ａｌｋ調節系をＥ．コリ中で使用することは異化作用抑制を生じないという利
点を有する。

【００４６】本発明による方法において、有利にはｎ−オクタン及びＤＣＰＫをインデュー
サーとして使用し、特に有利にはｎ−オクタンの場合には０．００１〜０．５％
（Ｖ／Ｖ）の量で、かつＤＣＰＫの場合には０．００５〜０．５％（Ｖ／Ｖ）の
量で使用される。もちろん、ｎ−オクタン及びＤＣＰＫからなる混合物を使用し
てもよい。これらの濃度範囲で作業する場合に誘導が最大になる。

【００４７】更に本発明は、前記の組み換え微生物によって前記の型の有機化合物の酸化の
ための微生物学的方法に関する。本発明により使用される組み換え微生物は公知
の方法によって培養及び発酵できる。これらの細菌は、例えばＴＢ培地又はＬＢ
培地中で、かつ２０〜４０℃の温度及び６〜９のｐＨ値で培養できる。詳細に、
適当な培養条件は、例えばＴ．マニアティス他、上述の箇所に記載されている。

【００４８】前記の組み換え微生物を使用して本発明による微生物学的酸化を実施する場合
には、有利にはまず酸素及び天然培地、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地中で、約２
０〜４０℃より高い培養温度及び約６〜９のｐＨ値で十分な細胞密度が得られる
まで実施する。酸化反応をより良好に調節しうるために、有利には誘導可能なプ
ロモーターを使用してよい。培養は、モノオキシゲナーゼ生産の誘導の後に酸素
の存在下に、例えば１時間から３日間継続する。形成された酸化生成物又は酸化
生成物混合物を、次いで慣習的な方法で、例えば抽出又はクロマトグラフィーに
よって培地から単離かつ精製することができる。

【００４９】本発明による反応は、有利にはバイオリアクター中で実施でき、これらは本発
明による組み換え微生物を、例えば固定化された形で有する。

【００５０】本発明により使用される基質の酸化の程度は簡単に制御できる。例えば、定期
的な間隔で試料を培養培地から取り出し、ガスクロマトグラフィー又はガスクロ
マトグラフィーと質量分析器との連結（ＧＣ−ＭＳ）又は高圧液体クロマトグラ
フィーを使用して相応のアルコール誘導体、アルデヒド誘導体及び／又はカルボ
ン酸誘導体の含有率を調査する。どのような酸化された誘導体が望ましいか、又
は所望の混合比を調整しているかに応じて、インキュベーションを中断する。こ
れは、例えば微生物を培養培地から分離又はそれを分解することによって、例え
ば遠心分離及びデカンテーション及び／又は酸、トリクロロ酢酸での処理又は熱
による処理によって実施できる。また酸化されていない基質（例えばトルエン及
び／又ははシュードクメン）の供給によって酸形成を阻害できる。

【００５１】酸化された芳香族化合物を、次いで慣用の分離法によって、例えば簡単な蒸留
、分別蒸留、精留、場合により真空中で、又は適当なクロマトグラフィー法を使
用して、有利には蒸留によって単離できる。適切には、微生物細胞を生成物の精
製前に培養培地から除去する。

【００５２】本発明により有利な発現ベクターｐＳＰＺ３の構築は（３１）パンケ他（Pank
e）、Applied and Environmental Microbiology (1991) 2324-2332に記載され、
引用することにより記載されたものとする。

【００５３】本発明による調査の構成において、微生物の形質転換のために、ＸＭＯ遺伝子
ｘｙｌＭ及びｘｙｌＡの他に更にシュードモナスプチダｍｔ−２からのベンジ
ルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）遺伝子ｘｙｌＢを発現可能な形で有
するベクターを使用した。ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ｘｙｌＢ
をｘｙｌＡ遺伝子の下流に直接、前記のプラスミドｐＳＰＺ３に挿入するために
、ｘｙｌＢ遺伝子を有するプラスミドｐＣＫ０４（２５）の２．３ｋｂ長のＸｈ
ｏＩ／ＦｓｐＩ断片をまずＸｈｏＩ及びＳｍａＩで消化されたベクターｐＧＥＭ
−７ｚｆ（＋）（プロメガ、チューリッヒ、スイス）中に挿入してｐＧＥＭＡＢ
を得た。この構築物から、２．３ｋｂ長の断片をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで切断
し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＳＰＺ３中にライゲーシ
ョンした。生じるプラスミドをｐＲＭＡＢと呼称した（図２）。

【００５４】ｐＲＭＡＢによる調査はしかしながら、ＢＡＤＨの存在下にＸＭＯの他にベン
ジルアルコールを低い活性でのみベンズアルデヒドに酸化するだけでなく、ベン
ジルアルコールを逆形成することが示される。

【００５５】ネガティブコントロールとして、本発明による調査の構成においてｘｙｌ遺伝
子を有さないプラスミドｐＲＳを構築した。ｐＲＭＡＢをＢａｍＨＩ及びＳｍａ
Ｉで消化し、クレノウ酵素で処理した。大きい方の断片を単離した後でベクター
をリライゲーションした。

【００５６】以下に具体的な制限しない例に関する本発明による方法及び図面を説明する。

【００５７】図１は（Ａ）トルエンからのベンジルアルコール、ベンズアルデヒド及び安息
香酸への上位のＴＯＬ代謝経路の酵素による段階的な酸化及び上位のＴＯＬオペ
ロンのｘｙｌ遺伝子の編成を示している。ＢＡＤＨ及びＢＺＤＨはベンジルアル
コールデヒドロゲナーゼもしくはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを表す。Ｐ _ｕは上位のＴＯＬオペロン−プロモーター、ｘｙｌＷ未知の機能を有する遺伝子
、ｘｙｌＣというＢＺＤＨをコードする遺伝子、ｘｙｌＭというＸＭＯの末端ヒ
ドロキシラーゼ成分をコードする遺伝子、ｘｙｌＡというＸＭＯのＮＡＤＨ：受
容体レダクターゼ成分をコードする遺伝子、ｘｙｌＢというＢＡＤＨをコードす
る遺伝子並びにｘｙｌＮという未知の機能を有する遺伝子を表す；（Ｂ）相応の
アルカノール及びアルカナールを介してアリール置換されたアルカンをアルカン
カルボン酸に段階的に酸化することは、酵素のアルカンヒドロキシラーゼ（ＡＭ
Ｏ）、アルカノールデヒドロゲナーゼ（ＡＯＤＨ）及びアルカナールデヒドロゲ
ナーゼ（ＡＡＤＨ）によって触媒される。

【００５８】図２はａｌｋ調節系の制御下に遺伝子ｘｙｌＭＡ及びｘｙｌＭＡＢを有する発
現プラスミドｐＳＰＺ３及びｐＲＭＡＢの構築図を示している。ａｌｋＢｐはａ
ｌｋオペロンのプロモーターを意味し、ａｌｋＳは正のレギュレーターＡｌｋＳ
に関する遺伝子である。これらの遺伝子ｘｙｌＭ*及びｘｙｌＡはキシレンモノ
オキシゲナーゼ（*はｘｙｌＭ遺伝子中でＮｄｅＩ部位が除去されていることを
意味する）。ｘｙｌＢ遺伝子はＢＡＤＨをコードする。Ｋｍはカナマイシン耐性
のための遺伝子を示し、かつＴ４ｔはファージＴ４の転写ターミネーターである
。

【００５９】図３はＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）（Ａ）及びＥ．コリＪＭ１０１（
ｐＲＭＡＢ）（Ｂ）の酸化を示している。トルエン（１．３７ｍＭ）を静止Ｅ．
コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３／ｐＢＲＭＡＢ）細胞のリン酸カリウムバッファ
ー（５０ｍＭ）ｐＨ７．４、１％（ｗ／ｖ）グルコース中の懸濁液（２．０７〜
２．１４ｇ*ｌ^- ^１ＣＤＷ）に添加した。丸：トルエン、正方形：ベンジルアルコ
ール、三角形：ベンズアルデヒド、菱形：安息香酸、×印：４つの濃度の総計。

【００６０】図４はシュードクメン、相応のアルコール及び相応のアルデヒドのＥ．コリ
ＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）（Ａ，Ｃ，Ｅ）及びＥ．コリＪＭ１０１（ｐＲＭＡ
Ｂ）（Ｂ，Ｄ）による酸化を示している。これらの基質（０．４６ｍＭ）を静止
Ｅ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３／ｐＢＲＭＡＢ）細胞（０．８６〜０．９２
ｇ*ｌ^- ^１ＣＤＷ）のリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ）ｐＨ７．４、１％（
ｗ／ｖ）グルコース中の懸濁液に添加した。グラフ（Ａ）及び（Ｂ）はシュード
クメンの酸化を示し、グラフ（Ｃ）及び（Ｄ）は３，４−ジメチルベンジルアル
コールの酸化を示し、かつグラフ（Ｅ）は３，４−ジメチルベンズアルデヒドの
酸化を示す。丸：シュードクメン、正方形：３，４−ジメチルベンジルアルコー
ル、三角形：３，４−ジメチルベンズアルデヒド、菱形：３，４−ジメチル安息
香酸、×印：全ての濃度の総計。

【００６１】図５はＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）におけるＸＭＯの増殖キネティッ
ク及び誘導キネティックを示している。グラフ（Ａ）はｎ−オクタンによる誘導
の後の種々の時点に対するキシレンモノオキシゲナーゼ活性及び細胞乾燥質量（
ＣＤＷ）を示しており、一方でグラフ（Ｂ）及び（Ｃ）はｎ−オクタンあるいは
ジシクロプロピルケトン（ＤＣＰＫ）の種々の量による誘導の３．５時間後の同
じ値を示している。各活性測定は無関係な培養に由来する。シュードクメン（１
．３７ｍＭ）を静止Ｅ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）細胞（２．０４〜２．
４４ｇ*ｌ^- ^１ＣＤＷ）のリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ）ｐＨ７．４、１
％（ｗ／ｖ）グルコース中の懸濁液に添加した。比活性は反応の最初の５分間の
間の生成物形成に基づく。グラフ（Ａ）中の矢印は、ＸｙｌＭＡ合成を誘導する
ためにいつ０．１％（ｖ／ｖ）のｎ−オクタンを添加したかを示している。塗ら
れた丸：誘導されていない培養のＣＤＷ、開いた丸：誘導された培養のＣＤＷ、
×印：誘導された培養の比活性。

【００６２】図６はベンジルアルコールからのベンズアルデヒドのＸＭＯ触媒的形成のため
の可能な機械的な説明を示している。

【００６３】一般的方法及び使用される材料ａ）細菌及びプラスミド表Ｉ細菌株及びプラスミド

【００６４】

【表１】

【００６５】ｂ）化学物質及び酵素全ての使用される化学物質及び酵素は、例えばベーリンガーマンハイム（ロー
トクロイツ、スイス）、ＮＥＢ（シュバルバッハ、ドイツ）、Ｇｉｂｃｏ（バー
ゼル、スイス）、ＡＧＳ（ハイデルベルク、ドイツ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（チュー
リッヒ、スイス）、Ｆｌｕｋａ（ブッフス、スイス）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ブッフ
ス、スイス）及びＬａｎｃａｓｔｅｒ（ミュールハイム、ドイツ）で市販されて
いる。小規模でのプラスミドＤＮＡの調製のために、製造元の指示に従ってＱｕ
ｉａｇｅｎ（バーゼル、スイス）のＱＩＡｐｒｅｐ−Ｓｐｉｎ−ＭｉｎｉＰｒｅ
ｐキットを使用した。

【００６６】ｃ）遺伝子工学的方法使用されるベクター／プラスミドの構築及び細菌のトランスフェクションもし
くは形質転換のために遺伝子工学の標準的方法を使用した。これらは例えばサン
ブローク（Sambrook）、フリッチュ（Fritsch）及びマニアティス（Maniatis）
の書籍（２４）に詳細に記載されている。更に材料及び方法の章で文献リストに
挙げたオリジナル論文に示される。従って進んだ論議は省く。

【００６７】ｄ）細菌の培養細菌をルリア−ベルタニ（ＬＢ）ブロス（Difco, Detroit, Mich）又は３倍濃
度のリン酸塩（Ｍ９*）及び０．５％（Ｗ／Ｖ）の唯一の炭素源としてのグルコ
ースを含有するＭ９−最少培地のどちらか一方で増殖させた。培養に場合により
カナマイシン（最終濃度：５０ｍｇ／リットル）、アンピシリン（１００ｍｇ／
リットル）、クロラムフェニコール（３０ｍｇ／リットル）、チアミン（１０^-
^３％、Ｗ／Ｖ）、１ｍＭのインドール及び０．５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を補った。固体培地は１．５％（Ｗ／
Ｖ）のアガーを含有した。液体培養を通常のように３０又は３７℃で水平振盪器
において２００ｒｐｍで増殖させた。

【００６８】ｅ）酵素活性の測定酵素活性の測定を簡素化のために全細胞の使用下に実施した。

【００６９】ユニット（Ｕ）は１マイクロモルの全生成物が１分間で生じる活性として定義
する。比活性は本願では１ｇの細胞乾燥質量（ＣＤＷ）あたりの活性（Ｕｇ^- ^１
ＣＤＷ）として表現する（以下に単に活性とも呼ぶ）。１ｇのＣＤＷあたりの反
応の最初の５分間で形成される生成物の量に対する平均活性として計算する。調
査は少なくとも３回、互いに無関係に繰り返した。

【００７０】該アッセイは以下のように実施した。相応のベクターで形質転換されたＥ．コ
リＪＭ１０１を４０又は１００ｍｌの培地中でカナマイシンの存在下にインキ
ュベートした。４５０ｎｍでの光学密度が約０．３である場合に、細胞を０．０
５％（Ｖ／Ｖ）のＤＣＰＫ又は０．１％（Ｖ／Ｖ）のｎ−オクタンの添加によっ
て誘導し、３〜３．５時間、ＯＤ_４５０が典型的に０．８〜０．９になるまで更
にインキュベートした。次いで細胞を回収し、５０ｍＭのリン酸カリウムバッフ
ァー、ｐＨ７．４（１％（Ｗ／Ｖ）のグルコース含有）中に２．５ｇ／ｌの細胞
乾燥質量にまで再懸濁した。１又は２ｍｌのアリコートを閉栓されたパイレック
ス（登録商標）−試験管に添加し、水平に回転振盪器で３０℃及び２５０ｒｐｍ
においてインキュベートした。５分後に、それぞれの基質を１．５ｍＭの最終濃
度に２０倍に濃縮されたエタノール中の原液の形で添加した。３，４−ジメチル
安息香酸の形成を測定する調査において、細胞乾燥質量を１ｇ／ｌに低減させ、
それぞれの基質を０．５ｍＭの最終濃度にまで添加する。それというのもこれら
の化合物は僅かに水溶性であるからである。反応を振盪器において５分間実施し
、次いで試料を氷中に置き、直ちに４０又は８０μｌの過塩素酸原液（１０％Ｖ
／Ｖ）と混合することによって完了させるので、懸濁液のｐＨ値は２であった。

【００７１】ｆ）時間の関数としての生成物形成の測定時間の関数としての生成物形成の調査のために、細胞を前記のように培養し、
誘導し、回収して、再懸濁し、種々の長さ、すなわち５分、１０分、２０分、３
０分、４０分及び８０分の間、それぞれの基質とインキュベートした。次いで反
応を前記のように中断し、細胞を遠心分離（７８００ｇ、８分）によって除去し
、上清を分析した。

【００７２】ベンジルアルコール、ベンジルアルデヒド及び安息香酸の分離のために、高性
能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用した。カラムとしてＮｕｃｌｅｏ
ｓｉｌＣ１８（孔径１００Å、粒度５μｍ、長さ２５ｃｍ、内径４ｍｍ）（Mac
herey-Nagel, Oensingen, Schweiz）を使用し、かつ移動相として６９．９％の
Ｈ_２Ｏ−３０％アセトニトリル−０．１％Ｈ_３ＰＯ_４を流速０．７ｍｌ／分で使
用した。３，４−ジメチルベンジルアルコール、３，４−ジメチルベンズアルデ
ヒド及び３，４−ジメチル安息香酸の分離のために、同一のカラムを使用するが
、移動相として６４．９％のＨ_２Ｏ−３５％アセトニトリル−０．１％Ｈ_３ＰＯ _４を同一の流速で使用した。検出のために、２１０ｎｍでＵＶ吸収を測定した。
分離された化合物をそれらの滞留時間を市販のスタンダードの滞留時間と比較す
ることによって同定した。

【００７３】トルエン／シュードクメン及び相応のアルコール、アルデヒド及び酸の場合に
は、分離をガスクロマトグラフィーによって実施した。ガスクロマトグラフィー
（Fisons Instruments, England）はＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（Oensingen
, Schweiz）のＯＰＴＩＭＡ−５型の石英キャピラリーカラム（長さ２５ｍ、内
径０．３２ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を装備していた。キャリヤーガスとして水
素を使用し、かつ注入をスプリットなしに実施した。この場合に、以下の温度プ
ロフィールを使用した：４０℃から７０℃まで１５℃／分で、７０℃から１０５
℃まで５℃／分で、かつ１０５℃から２４０℃まで２０℃／分で。化合物の検出
は水素炎イオン化検出器で実施した。分離された化合物をその滞留時間と市販の
スタンダードの滞留時間との比較によって同定した。選択的に検出は質量分析器
を使用しても実施できる（ＧＣ−ＭＳ連結）。後者は、特異的なクロマトグラフ
ィーによる滞留時間の他にフラグメンテーション型及び個々のピークの強度分布
を反応生成物の定性的又は定量的な測定のために考慮するという利点を有する。

【００７４】Ｆｉｓｏｎ型の質量分析器及びＣＰ−Ｓｉｌ−５ＣＢカラム（Chrompak, Nied
erlande）を備えたガスクロマトグラフからなるＧＣ−ＭＳ連結。キャリヤーガ
スとしてヘリウムを使用した。注入はスプリット（２０：１）で実施した。温度
プログラムは前記のガスクロマトグラフィーによる分離と同じであった。

【００７５】ガスクロマトグラフもＧＣ−ＭＳ連結の両者とも、試料に同量の氷冷エーテル
（内部標準として０．１ｍＭのドデカンを含有する）を添加した。引き続き塩化
ナトリウムを飽和するまで添加し、水相を３０℃で５分間の激しい攪拌後に抽出
した。有機相を無水の硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで分析した。

【００７６】例１：トルエン及びその誘導体のキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化以下の調査において、細胞をそれぞれ０．０９ｇＣＤＷ／ｌの細胞密度にまで
増殖させ、通常のように０．１％（Ｖ／Ｖ）のｎ−オクタンで誘導した。次いで
培養を更に３〜３．５時間インキュベートし、０．２３〜０．２７ｇＣＤＷ／ｌ
の細胞密度まで増殖させた。

【００７７】表ＩＩは、ＸＭＯがトルエンをベンジルアルコールに酸化し、ベンジルアルコ
ールをベンズアルデヒドに酸化し、かつベンズアルデヒドを安息香酸に酸化する
ことを示している。最初の２つの酸化反応のために、活性は９５〜１００Ｕ／ｇ
ＣＤＷにまで確認され、他方ベンズアルデヒドの酸化は低い活性、すなわち１０
Ｕ／ｇＣＤＷのみで実施した。

【００７８】シュードクメンの場合には結果は類似していた。シュードクメンは３，４−ジ
メチルベンジルアルコールに酸化され、３，４−ジメチルベンジルアルコールは
３，４−ジメチルベンズアルデヒドに酸化され、３，４−ジメチルベンズアルデ
ヒドは３，４−ジメチル安息香酸に酸化される。シュードクメンの酸化のために
１００Ｕ／ｇＣＤＷが確認され、それに対して３，４−ジメチルベンズアルデヒ
ドは５０Ｕ／ｇＣＤＷの活性で形成され、かつベンズアルデヒドよりも明らかに
高い活性（５５Ｕ／ｇＣＤＷ）で３，４−ジメチル安息香酸に酸化された。

【００７９】酸を基質として添加した場合、反応生成物は確認されず、かつ酸の減少も確認
されなかった。

【００８０】コントロールとして、プラスミドｐＳＰＺ３を有する誘導されていないＥ．コ
リＪＭ１０１並びにプラスミドを有さない誘導されたＥ．コリＪＭ１０１を使
用した。ａｌｋ調節系のＥ．コリに対する各影響を排除するために、付加的なコ
ントロールとしてプラスミドｐＲＳを含有するＥ．コリＪＭ１０１を使用した
。プラスミドｐＲＳはなおもａｌｋ遺伝子を有するが、ｘｙｌ遺伝子を有さない
。表ＩＩは、トルエン、シュードクメン及び相応のアルコールを基質として使用
する場合にコントロール試験において変換生成物を検出できないことを示してい
る。

【００８１】以下の表ＩＩＩは、それにもかかわらず前記試験において基質として添加した
アルデヒドが一定の活性でアルコールに還元されることを示している。また３，
４−ジメチル安息香酸の形成が確認できるが、２〜２．５Ｕ／ｇＣＤＷの非常に
低い活性で確認される。これは誘導されたＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）
（この略記は本願では微生物が挙げられたプラスミドを有することを意味する）
によって形成される殆どの酸がＸＭＯの存在にあることを結論づける。

【００８２】ここで形成された生成物及び活性もしくは形成速度に関して通常のように使用
されるインデューサーである０．１％（Ｖ／Ｖ）ｎ−オクタン及び代替的に使用
されるインデューサーである０．０５％（Ｖ／Ｖ）ＤＣＰＫの間で大きな差異が
確認できないことを示している。

【００８３】表ＩＩＸＭＯによるトルエン及び誘導体の酸化

【００８４】

【表２】

【００８５】表ＩＩＩコントロール試験におけるアルデヒドの変換

【００８６】

【表３】

【００８７】誘導されていないＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）及び誘導されたＥ．コ
リＪＭ１０１（ｐＲＳ）の使用下にコントロール試験で確認されるアルデヒド
のアルコールへの還元は、熱力学的理由から平衡がアルコール側にある反応を触
媒するＥ．コリ−アルコールデヒドロゲナーゼの作用を明確にすることができる
。Ｅ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）（図５Ａ参照）によるトルエンの生体変
換の終わりにおけるベンジルアルコールの逆変換は同様に高い活性のＥ．コリ−
デヒドロゲナーゼに割り当てることができる。それというのもＸＭＯ活性は時間
とともに低下するからである。

【００８８】例２：種々の基質の酸化の時間経過の測定トルエン、シュードクメン、３，４−ジメチルベンジルアルコール及び３，４
−ジメチルベンズアルデヒドの酸化の時間経過を図３及び４で示している。これ
らのアッセイを前記のように実施した。それぞれの基質をそれぞれの静止細胞の
５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．４（１％（Ｗ／Ｖ）のグルコー
スを含有する）中の懸濁液に添加した。

【００８９】トルエン又はシュードクメンを基質として添加する場合には、相応のアルコー
ル、アルデヒド及び酸の連続的な形成が確認された（図３Ａ及び４Ａ）。活性ア
ッセイにおいて確認されるように、ベンジルアルコール、３，４−ジメチルベン
ジルアルコール及びベンズアルデヒドを形成する活性が高かった。３，４−ジメ
チルベンズアルデヒド及び３，４−ジエチル安息香酸を形成する活性は中程度の
高さであり、安息香酸は低い活性で形成された。最初の５分間で、両者の基質の
シュードクメン及びトルエンから１００Ｕ／ｇＣＤＷの比活性（表ＩＩを参照）
で生成物が形成された。５〜１０分の範囲内で、ベンズアルデヒドは８０Ｕ／ｇ
ＣＤＷの活性で形成されるが、一方３，４−ジメチルベンズアルデヒドはより緩
慢に形成された（３７Ｕ／ｇＣＤＷ）。酸の形成はトルエン又はシュードクメン
の完全な消費の後に開始され、特に３．２Ｕ／ｇＣＤＷもしくは２１Ｕ／ｇＣＤ
Ｗの活性で安息香酸もしくは３，４−ジメチル安息香酸の場合には１０〜３０分
の間で開始される。常にベンジルアルコールの低い濃度が残る。４０〜８０分の
間で、ベンジルアルコールの濃度は再び増大するが、一方でベンズアルデヒドの
濃度は低下する（図３Ａ）。シュードクメン、３，４−ジメチルベンジルアルコ
ール及び３，４−ジメチルベンズアルデヒドは完全に３，４−ジメチル安息香酸
の形成下に消費される（図４Ａ）。

【００９０】３，４−ジメチルベンジルアルコールを基質として添加した場合には、３，４
−ジメチルベンズアルデヒドを形成する活性は５０Ｕ／ｇＣＤＷであり（表ＩＩ
）、それに対して３，４−ジメチル安息香酸を形成する活性は２３Ｕ／ｇＣＤＷ
であり、特に１０〜３０分の時間である（図４Ｃ）。ベンジルアルコールを基質
として使用した場合にはベンズアルデヒドを形成する活性は９５Ｕ／ｇＣＤＷで
あり、安息香酸を形成する活性は一定に２．９Ｕ／ｇＣＤＷ（結果は示さず）で
ある。調査された時間において、３，４−ジメチルベンジルアルコールはベンジ
ルアルコールの存在下に完全に酸に変換された。

【００９１】３，４−ジメチルベンズアルデヒドを基質として添加した場合に（図４Ｅ）、
３，４−ジメチル安息香酸は５５Ｕ／ｇＣＤＷの活性で形成され、かつ２０分後
に既に優性種であった。ベンズアルデヒドを基質として使用した場合には、緩慢
かつ一定の安息香酸の形成（３Ｕ／ｇＣＤＷ）が確認された（結果は示さず）。
ここでは最初の５分間での初期活性は１０Ｕ／ｇＣＤＷの比活性であった（表Ｉ
Ｉ）。

【００９２】例３：Ｅ．コリＪＭ１０１（ｐＲＭＡＢ）によるトルエン及びシュードクメ
ンの変換この調査はＢＡＤＨ及びＸＭＯの同時の存在によって、アルデヒドをトルエン
及びシュードクメンから形成する活性が増加するか又は低下するかという問題を
明確にするために使用されるべきである。幾つかのアルコールデヒドロゲナーゼ
は生理学的ｐＨ値における平衡がアルコールの側にある反応を触媒するので、後
者の可能性は完全に存在し、従ってＢＡＤＨはアルデヒド形成速度を低下させる
。

【００９３】実際に、Ｅ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）と比較して生体変換活性の差異
は明らかに確認できた。トルエンは８７Ｕ／ｇＣＤＷの初期の比活性でその相応
の酸化生成物に変換された。ベンジルアルコール、シュードクメン及び３，４−
ジメチルベンジルアルコールのための相応の活性は６６、７３及び４２Ｕ／ｇＣ
ＤＷであった。ＢＡＤＨが存在する場合には、従ってこれは生体触媒よりも組み
換えＥ．コリＭＪ１０１の生体変換活性の低下を引き起こすと考えられる。

【００９４】トルエンを添加した場合には、順々にベンジルアルコール、ベンズアルデヒド
及び安息香酸が形成される（図３Ｂ）。５分〜１０分間の間の時間において、ベ
ンジルアルコールは３４Ｕ／ｇＣＤＷの活性で形成され、酸は１０〜４０分の時
間において１Ｕ／ｇＣＤＷの活性で形成される。約２０分後に、ベンジルアルコ
ールの濃度は再び低下し始める（恐らく逆反応の開始の故に）。８０分後に、ベ
ンズアルデヒドは最早ほとんど残留しておらず、非常に少量の安息香酸のみが形
成された。

【００９５】ベンジルアルコールを基質として添加した場合には、非常に類似の結果（示さ
ず）が得られる。これと反対に、約２０分後にアルコールの形成の間にアルデヒ
ドの濃度が低下した。従って遺伝子ｘｙｌＢの導入はアルデヒドをアルコールに
相当の還元を引き起こし、これはアルデヒドの形成はＢＡＤＨの添加によって低
下されないことを示している。

【００９６】シュードクメンを基質として添加する場合には、再び順々に行われる３，４−
ジメチルベンジルアルコール、３，４−ジメチルベンズアルデヒド及び３，４−
ジメチル安息香酸の形成が確認された（図４Ｂ）。５〜１０分の時間の間に、３
，４−ジメチルベンズアルデヒドが１５Ｕ／ｇＣＤＷの活性で形成された。酸は
３０〜４０分の時間において、ほぼ同じ活性（１３Ｕ／ｇＣＤＷ）で形成した。
アルコールの迅速な形成の後に、アルデヒド濃度は２０分間比較的高いままであ
った。それにもかかわらず、アルコール及びアルデヒドの反応の最後には完全に
酸に変換された。

【００９７】３，４−ジメチルベンジルアルコールを基質として添加した場合には、３，４
−ジメチルベンズアルデヒド及び３，４−ジメチル安息香酸が形成された（図５
Ｂ）。２０〜３０分の時間において、酸は８Ｕ／ｇＣＤＷの比活性で形成された
。アルデヒド濃度は決してアルコール濃度を超えない。３，４−ジメチルベンジ
ルアルコールのより長期の存在は、酸化の他に反対にアルデヒドのアルコールへ
の還元が行われていることを示しており、ＢＡＤＨがその原因とみなされる。

【００９８】例４：Ｅ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）の増殖−及び誘導キネティック各活性点のために、個々の培養を培養した。活性アッセイを前記のように実施
した。図５Ａの場合には、シュードクメン（１．３７ｍＭ）を静止Ｅ．コリＪ
Ｍ１０１（ｐＳＰＺ３）（２．０４〜２．２６ｇｌ^- ^１ＣＤＷ）の５０ｍＭのリ
ン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．４（１％（Ｗ／Ｖ）のグルコースを含有する
）中の懸濁液に添加した。比活性を、ガスクロマトグラフィーによって測定した
変換の最初の５分間に形成された生成物の量を使用して計算した。矢印は、その
時点に０．１％（Ｖ／Ｖ）のｎ−オクタンをｘｙｌＭＡ合成の誘導のために添加
したことを示している。塗られた丸は誘導されていない培養の細胞乾燥質量（Ｓ
ＤＷ）を示し、塗られていない丸は誘導された培養の細胞乾燥質量を示し、×印
は誘導された培養の比活性を示している。

【００９９】図５（Ｂ）及び（Ｃ）は図５（Ａ）のように得られたが、細胞密度は２．２６
〜２．４４ｇｌ^- ^１ＣＤＷであった。図５（Ｂ）は異なる量のｎ−オクタンの作
用を示し、図５（Ｃ）はＤＣＰＫによる作用を示している。丸は誘導の３．５時
間後の細胞乾燥質量を示し、×印は誘導された培養の比活性を示している。

【０１００】ＸＭＯ活性を０．１％（Ｖ／Ｖ）のｎ−オクタン（図５（Ａ））又は０．０５
％（Ｖ／Ｖ）のＤＣＰＫによる誘導の後に測定した。ＸＭＯ活性を両者の化合物
によって直ちに誘導して、３〜３．５時間の誘導時間後に約１１５もしくは１０
５Ｕ／ｇＣＤＷの一定の強度がｎ−オクタンもしくはＤＣＰＫの場合に達成され
た。誘導されていない細胞との比較において、誘導された細胞の増殖速度は明ら
かに低い。

【０１０１】ＸＭＯ活性の誘導濃度［０．００００１〜１％の範囲］による依存性を、Ｅ．
コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）を１リットルあたり０．０９ｇのＣＤＷの濃度
にまで増大させ、細胞を種々の量のｎ−オクタン及びＤＣＰＫによって誘導する
ことによって測定した。更に３．５時間の培養の後に、それぞれのインデューサ
ー濃度に関して細胞乾燥質量及びＸＭＯ活性を測定した（図５（Ｂ）及び（Ｃ）
）。０．０００１％（Ｖ／Ｖ）のｎ−オクタン又は０．０００１％（Ｖ／Ｖ）の
ＤＣＰＫを培養培地に添加した場合には非常に低いＸＭＯ活性が生じる。最大の
誘導は、０．００５％〜０．０１（Ｖ／Ｖ）のＤＣＰＫ濃度及び０．００１〜０
．００４％（Ｖ／Ｖ）のｎ−オクタン濃度において確認された。より高い誘導濃
度においては、ＸＭＯ活性は一定のままであった。ｎ−オクタンの高い蒸気圧に
基づいて、封止された振盪フラスコを使用するが、その時でさえもｎ−オクタン
の一部のみが水性媒体に溶解されるだけである。蒸留された水中のｎ−オクタン
の溶解度は非常に低く、０．７ｍｇ／ｌ又は０．０００１％（Ｖ／Ｖ）であった
。

【０１０２】酵素活性をその最大値にまで増大させるインデューサー濃度範囲において細胞
密度が低下する。より高いｎ−オクタンの濃度においては、酵素活性は一定のま
まであった。それに対してＤＣＰＫのより高い濃度は細胞密度の更なる低下を引
き起こす（図５（Ｂ）及び（Ｃ））。更に種々のインデューサー濃度がプラスミ
ドを有さないＥ．コリＪＭ１０１の増殖に直接影響することを調査した。高濃
度のｎ−オクタンは細胞増殖に影響を及ぼさなかった。それに対して、０．０１
％（Ｖ／Ｖ）より高い濃度は増殖速度の低下をもたらす。０．５％（Ｖ／Ｖ）の
ＤＣＰＫ濃度のにおいては、誘導の３．５時間後に０．０７３ｇ／ｌの細胞乾燥
質量が測定されたにすぎない。高いＤＣＰＫ濃度は明らかに細胞に毒性作用を有
することを示している。従ってｎ−オクタンはより良好なインデューサーである
。

【０１０３】まとめると、以下のことを確認できる。トルエン及びシュードクメンの段階的
な酸化において、２つの大きな差異がある。３，４−ジメチルベンジルアルコー
ルはベンジルアルコールよりも穏やかに酸化され、３，４−ジメチル安息香酸は
安息香酸よりも明らかに高い活性で形成される。これは置換基の変更が酸化され
た基質のためのＸＭＯの比活性に、未酸化の基質、例えばトルエン及びシュード
クメンのための比活性とは別の作用を示し、そのためにＸＭＯは非常に類似した
活性を有する。他の重要な結果は、トルエン又はシュードクメンは多かれ少なか
れ完全に消費されるまでは酸は形成されないことである。一般にそのようにすべ
き場合には、ＸＭＯは明らかに、トルエン及びシュードクメンに関しては相応の
アルデヒドに関してよりもより高い親和性を有する。ＢＡＤＨの存在は生成物形
成に関するより低い活性をもたらし、それどころかベンジルアルコールの逆形成
をもたらす。ＢＡＤＨを有する細胞はアルデヒドを明らかに穏やかに蓄積する。
ＢＡＤＨはＥ．コリ−デヒドロゲナーゼの作用を劇的に低下させると考えられ、
その際、このデヒドロゲナーゼ反応の平衡はアルコールの側にあると考えられる
。このことは、従来の技術において公知の方法によって熱力学的計算によって（
２６〜２９）かつ酵素的調査によって（１６〜１８）によって確認される。

【０１０４】

【外１】

【０１０５】

【外２】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａはトルエンからのベンジルアルコール、ベンズアルデヒド及び安息香酸
への上位のＴＯＬ代謝経路の酵素による段階的な酸化を示している。

【図１Ｂ】図１Ｂは上位のＴＯＬオペロンのｘｙｌ遺伝子の編成を示している。

【図２】図２はａｌｋ調節系の制御下に遺伝子ｘｙｌＭＡ及びｘｙｌＭＡＢを有する発
現プラスミドｐＳＰＺ３及びｐＲＭＡＢの構築図を示している。

【図３Ａ】図３ＡはＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）の酸化を示している。

【図３Ｂ】図３ＢはＥ．コリＪＭ１０１（ｐＲＭＡＢ）の酸化を示している。

【図４Ａ】図４ＡはシュードクメンのＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）による酸化を
示している。、相応のアルコール及び相応のアルデヒドのＥ．コリＪＭ１０１
（ｐＳＰＺ３）（Ａ，Ｃ，Ｅ）及びＥ．コリＪＭ１０１（ｐＲＭＡＢ）（Ｂ，
Ｄ）による酸化を示している。

【図４Ｂ】図４Ｂは図４Ａに相応のアルコールのＥ．コリＪＭ１０１（ｐＲＭＡＢ）に
よる酸化を示している。

【図４Ｃ】図４Ｃは図４Ａに相応のアルコールのＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）に
よる酸化を示している。

【図４Ｄ】図４Ｄは図４Ａに相応のアルデヒドのＥ．コリＪＭ１０１（ｐＲＭＡＢ）に
よる酸化を示している。

【図４Ｅ】図４Ｅは図４Ａに相応のアルデヒドのＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）に
よる酸化を示している。

【図５Ａ】図５ＡはＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）におけるＸＭＯの増殖キネティ
ック及び誘導キネティックを示している。

【図５Ｂ】図５ＢはＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）におけるＸＭＯの増殖キネティ
ック及び誘導キネティックを示している。

【図５Ｃ】図５ＣはＥ．コリＪＭ１０１（ｐＳＰＺ３）におけるＸＭＯの増殖キネティ
ック及び誘導キネティックを示している。

【図６】図６はベンジルアルコールからのベンズアルデヒドのＸＭＯの触媒による形成
を示している。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１２月１４日（２００１．１２．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ベルンハルトハウアードイツ連邦共和国フスゲーンハイムメロヴィンガーシュトラーセ１ (72)発明者ブルノビューラースイス国チューリッヒデンラーシュトラーセ８Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA02 DA05 DA06 EA04 FA01 GA11 4B064 AC26 AD25 CA02 CA19 CC24 CD04 CD05 CD06 DA16 4B065 AA26X AA41X AA41Y AA44Y AB01 AC14 BA02 BB04 BB06 BB07 CA08 CA10 CA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式Ｉ：Ａｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｒ^１（Ｉ）［式中、Ａｒは一置換又は多置換されていてよい一核性の芳香環を表し、Ｒ^１は酸素含有基−ＣＨＯ又は−ＣＯＯＨを表し、ｎは０〜１５の整数値を表す］の芳香族アルデヒド及び／又はカルボン酸の製造
方法において、ａ）一般式ＩＩ：Ａｒ−Ｒ^２（ＩＩ）［式中、Ａｒは前記の意味を有し、かつＲ^２は−ＣＨ＝ＣＨ_２又は−（ＣＨ_２）_ｎ＋１Ｒ^３（式中、ｎは前記のように定
義されており、かつＲ^３はＨ又はＯＨを表す）を表すか、又はＲ^１が−ＣＯＯＨ
を表す場合にはＲ^２は−（ＣＨ_２）_ｎＲ^４を表してもよく、その際、ｎは前記の
ように定義されており、Ｒ^４は−ＣＨＯを表す］の芳香族基質を含有する培養培
地中で、キシレンモノオキシゲナーゼ（ＸＭＯ）及びアルカンモノオキシゲナー
ゼ（ＡＭＯ）から選択される酵素を発現する微生物を培養し；かつｂ）式Ｉの化合物を培養培地から単離することを特徴とする芳香族アルデヒド及
び／又はカルボン酸の製造方法。
【請求項２】ＸＭＯを発現する微生物が実質的にベンジルアルコールデヒ
ドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）及び／又はベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＺ
ＤＨ）の活性を有さない、請求項１記載の方法。
【請求項３】ＡＭＯを発現する微生物が実質的にアルカノールデヒドロゲ
ナーゼ及び／又はアルカナールデヒドロゲナーゼ（ＡＡＤＨ）の活性を有さない
、請求項１記載の方法。
【請求項４】シュードモナスオレオボランスＧＰｏ１からのａｌｋ調節
系の遺伝子制御下にＸＭＯをコードする遺伝子ｘｙｌＭ及びｘｙｌＡ又はＡＭＯ
をコードする遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ及びａｌｋＴを機能的な結合で有する発
現ベクターで形質転換された組み換え微生物を使用する、請求項１から３までの
いずれか１項記載の方法。
【請求項５】微生物が発現プラスミドｐＳＰＺ３で形質転換されている、
請求項４記載の方法。
【請求項６】微生物が属エシェリキアの細菌である、請求項１から５まで
のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】酵素発現を培養培地へのインデューサーの添加によって開始
する、請求項４から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】Ｒ^２が−ＣＨ＝ＣＨ_２、−ＣＨ_３又は−ＣＨ_２ＯＨを表す式
ＩＩの化合物を、ＸＭＯ活性を発現する微生物によって変換させる、請求項１か
ら７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】Ｒ^２が−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ^３を表し、その際、Ｒ^３が前記の
ように定義されており、ｍが６〜１３の整数値を表す式ＩＩの化合物を、ＡＭＯ
活性を発現する微生物によって変換させる、請求項１から７までのいずれか１項
記載の方法。
【請求項１０】シュードモナスプチダｍｔ−２からのキシレンモノオキ
シゲナーゼが発現される、請求項４記載の方法。
【請求項１１】シュードモナスオレオボランスＧＰｏ１からのａｌｋ調
節系の遺伝子制御下にＸＭＯをコードする遺伝子ｘｙｌＭ及びｘｙｌＡ又はＡＭ
Ｏをコードする遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ及びａｌｋＴを機能的な結合で有する
発現ベクターを有する、組み換え微生物。
【請求項１２】属エシェリキア及びシュードモナスの細菌から選択される
、請求項１１記載の微生物。
【請求項１３】プラスミドｐＳＰＺ３で形質転換された、請求項１１又は
１２記載の微生物。
【請求項１４】シュードモナスオレオボランスＧＰｏ１からのａｌｋ調
節系の遺伝子制御下にＸＭＯをコードする遺伝子ｘｙｌＭ及びｘｙｌＡ又はＡＭ
Ｏをコードする遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ及びａｌｋＴを機能的な結合で有する
、発現構築物。
【請求項１５】請求項１１から１３までのいずれか１項記載の微生物又は
請求項１４記載の発現構築物の、一般式Ｉの芳香族化合物の微生物学的製造のた
めの使用。