KR20020060217A - 방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산의 미생물학적 제조방법 - Google Patents

방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산의 미생물학적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 크실렌 모노옥시게나제 또는 알칸 모노옥시게나제를 발현하도록 유전공학적으로 유전자 조작된 미생물을 사용하여 방향족 화합물들을 상응하는 알데히드 및(또는) 카르복실산 유도체로 단계별 산화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산의 미생물학적 제조 방법 {Microbiological Method for Producing Aromatic Aldehydes and/or Carboxylic Acids}
본 발명은 크실렌 모노옥시게나제 또는 알칸 모노옥시게나제를 발현하는 재조합 미생물을 사용한, 방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산 유도체의 산화성 미생물학적 제조 방법에 관한 것이다.
슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) mt-2의 TOL 플라스미드 pWWO 등에 의해 코딩되는 것과 같은 크실렌 모노옥시게나제 (XMO)는 톨루엔 및 크실렌의 분해에 핵심적인 역할을 하는 효소 시스템이다. XMO는 알킬 히드록실라제 족에 속하며, 방향족 고리의 메틸기를 선택적으로 가수분해한다. 이는 메타 (meta)-이화 경로를 통해 크렙스 회로의 기질로 변환될 카르복실산 유도체를 형성하는 대사 경로의 제1 단계이다 (도 1A 참조).
XMO는 유전자 xylM 및 xylA (xylMA 진뱅크 (GENBANK) 접근 번호 M37480)에 의해 코딩되는 2개의 폴리펩티드 서브유닛인 XylM 및 XylA로 구성된다. XylA는 NADH 수용자 리덕타제, 즉, NADH로부터의 환원 당량을 막에 위치한 히드록실라제인 XylM으로 수송하는 전자 수송 단백질이다.
XylM 활성은 인지질 및 철 (II) 이온의 존재에 의존하며, 최적 pH는 7이다. XylM의 아미노산 서열은 슈도모나스 올레오보란스 (Pseudomonas oleovorans) GPo1 알칸 히드록실라제의 히드록실라제 성분 AlkB의 아미노산 서열과 25% 상동성을 나타낸다.
알칸 히드록실라제는 이화성 OCT 플라스미드에 있는 2개의 alk 유전자 클러스터에 의해 코딩되는 한 세트의 효소가 참여하는 중간 길이의 알칸 쇄 이화 경로의 제1 효소이다.
도 1A에 나타낸 대사 경로의 제2 효소는 기질이 장쇄 알콜인 아연-함유 데히드로게나제 족의 동종이량체 구성원인 벤질 알콜 데히드로게나제 (BADH)이다. 이 효소는 xylB 유전자에 의해 코딩된다. 도 1A에 나타낸 대사 경로의 제3 효소는 역시 동종이량체인 벤즈알데히드 데히드로게나제 (BZDH)로, xylC 유전자에 의해 코딩되는 효소이다.
상기 언급된 유전자 및 효소의 기능 및 특성에 관한 더욱 상세한 정보는 참고문헌 1 내지 18에 기재되어 있다.
XMO를 발현하도록 유전공학적으로 유전자 조작된 대장균이 톨루엔 및 크실렌을 산화시킬 수 있을 뿐 아니라, m- 및 p-에틸-, 메톡시-, 니트로- 및 염소-치환된 톨루엔 및 m-브롬-치환된 톨루엔을 산화시켜 상응하는 벤질 알콜 유도체를 제공할 수 있음이 증명되었다 (19, 20). 스티렌은 산화되어 스티렌 옥시드를 제공한다 (약 95%). 또한, XMO는 도 1A에 나타낸 대사 경로의 제2 단계, 즉, 벤질 알콜의 상응하는 알데히드로의 생체내 (즉, 온전한 살아있는 세포 상에서의 실험에서) 산화도 촉매한다고 여겨진다 (2, 21). 또한, 도 1A에 나타낸 대사 경로의 제3 단계 이후 벤즈알데히드의 벤조에이트로의 변환은 이미 관찰된 바 있으나, 대장균 내의 비특이적 데히드로게나제에 기인하는 것이었다 (2). 반대로, 부분적으로 정제된 XylMA (이는 또한 본 명세서에서 XMO, 즉, 2개의 폴리펩티드 서브유닛인 XylM 및 XylA로 구성된 기능적 효소와 동일한 의미로 사용됨)를 사용하여 시험관 내 수행한 추가의 실험에서는 이 효소가 벤질 알콜에 대한 활성이 없는 것으로 나타났다 (9). 이러한 모순에 대한 이유는 아직 불명확하다.
당업자라면, 크실렌 모노옥시게나제와 알칸 모노옥시게나제 (AMO, 알칸 히드록실라제로 지칭되기도 함; 진뱅크 접근 번호: AJ245436) 사이의 상기한 상동성으로부터, 촉매하는 반응의 성질 및 정도와 관련하여 상기 2가지 시스템 모두에 유사한 제한이 있음을 예측할 것이다.
방향족 알데히드 또는 카르복실산 제조를 위한 기존의 생물촉매 방법은 이러한 방법 수행에 여러가지 효소들이 요구되는 것으로 여겨진다는 점에서 만족스럽지 못하다. 또한, 위치선택성 및 화학선택성 (chemoselectivity)이 요구되기 때문에 화학적 합성법은 어렵다는 것이 입증되었다.
본 발명의 목적은 방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산 제조를 위한 간략화된 방법을 제공하는 것이다.
놀랍게도, 이러한 목적은 본 발명에 따른 간략화된 미생물학적 제조 방법에 의해 달성된다는것이 밝혀졌다. 특히, 본 발명은 XMO 및 AMO가 도 1A 및 1B 각각에 나타낸 반응 경로, 즉, 알킬-치환된 방향족 화합물을 중간체로서의 상응하는 알콜 유도체 및 상응하는 알데히드 유도체를 통해 카르복실산 유도체로 산화시키는 개별 단계 각각을 촉매할 수 있다는 놀라운 발견을 바탕으로 한다. 놀랍게도, 본 발명에 따라 XMO 유전자, 즉, xylM 및 xylA에 대한 특이적 발현 시스템을 사용하면, XMO를 발현하는 재조합 대장균에 관한 기존의 연구 (20, 21)에 비해 10 내지 20배 높은 활성을 달성할 수 있다는 것도 밝혀졌다.
그러므로, 본 발명의 제1 측면은 a) 크실렌 모노옥시게나제 (XMO) 및 알칸 모노옥시게나제 (AMO) 중에서 선택된 효소를 발현하는 미생물을 하기 화학식 II의 방향족 기질을 포함하는 배양 배지 중에서 배양하는 단계, 특히 호기성 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 하기 화학식 I의 화합물(들)을 단리하는 단계를 포함하는, 화학식 I의 방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산의 제조 방법이다.
Ar-(CH2)n-R1
상기 식에서,
Ar은 치환되거나, 일치환 또는 다치환된 단핵 방향족 고리이고,
R1은 산소를 함유하는 -CHO기 또는 -COOH기이며,
n은 0 내지 15의 정수, 예를 들면, 0 내지 12, 1 내지 6, 또는 6 내지 12의 정수이다.
Ar-R2
상기 식에서,
Ar은 상기 정의한 바와 같고,
R2는 -CH=CH2또는 -(CH2)n+1R3(여기서, n은 상기 정의한 바와 같고, R3은 H 또는 OH임)이거나, 또는 R1이 -COOH인 경우, R2는 -(CH2)nR4(여기서, n은 상기 정의한 바와 같고, R4는 -CHO임)일 수도 있다.
그러므로, 본 발명에 따른 반응은 동일 효소를 사용하여 상기 공정을 1회 이상 반복하여 수행될 수 있다. 이용할 수 있는 기질은 알킬화된 방향족 화합물, 상응하는 알콜 또는 상응하는 알데히드이다. 이용된 기질의 산화 정도는 상기 기재한 바와 같은 간단한 방식으로 제어할 수 있다.
이론에 얽매이길 원하는 것은 아니지만,18O 혼입 실험 및 질량 분광분석법에 의해 얻어진 피크 분리 (fragmentation) 양상은 XMO에 의해 촉매되는 알콜 산화에 관한 가장 가능한 메카니즘이 아마도 비-입체특이적 방식으로 탈수소화되어 알데히드가 될 중간체로서의 임시 (germinal) 디올의 형성을 통해 진행되는 것임을 암시한다 (도 6 참조).
본 발명에 따라 제조되거나, 기질로서 이용되는 화학식 I 및 II의 화합물에 있는 방향족 고리 시스템 Ar은 일치환 또는 다치환된 것일 수 있다. 고리 치환체(들)의 위치는 원하는 대로 선택할 수 있다. 그러나, 산화될 측쇄에 대해 메타- 및(또는) 파라 (para)-위치인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따라 XMO에 의해 산화될 수 있는 화학식 II의 기질의 구체적인 예로는 톨루엔, 크실렌, 스티렌, m- 및(또는) p-메틸-, 에틸-, 메톡시-, 니트로- 및 염소-치환된 톨루엔, 및 m-브롬-치환된 톨루엔 및 슈도큐멘 (pseudocumene) (즉, 트리메틸벤젠); 및 상기 화합물들의 상응하는 알콜 및 알데히드 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에 따라 AMO에 의해 산화될 수 있는 화학식 II의 기질의 구체적인 예로는 톨루엔, 에틸벤젠, n- 및 i-프로필벤젠, n-부틸벤젠, 및 상기 화합물들의 m- 및(또는) p-메틸-, 에틸-, 메톡시-, 니트로- 및 염소-치환된 유사체; 및 상기 화합물들의 상응하는 알콜 및 알데히드 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 방법은 하기의 효소를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다:
XMO (유전자 xylM 및 xylA (xylMA 진뱅크 접근 번호 M37480)에 의해 코딩됨) 및 상응하는 동위효소. XMO는 슈도모나스 속의 박테리아, 특히, 슈도모나스 푸티다 종, 바람직하게는 균주 mt-2 (ATCC 33015)로부터 유래되는 것이 바람직하다.
AMO (유전자 alkB, alkG 및 alkT (진뱅크 접근 번호 AJ245436)에 의해 코딩됨) 및 상응하는 동위효소 (예를 들면, alkB에 대한 동위효소). AMO는 슈도모나스 속의 박테리아, 특히, 슈도모나스 올레오보란스, 바람직하게는 균주 GPo1 (ATCC 29347)로부터 유래되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에는 구체적으로 개시된 XMO 및 AMO의 "기능적 동등물"의 사용도 포함된다.
본 발명의 목적상, 구체적으로 개시되어 있는 모노옥시게나제의 "기능적 동등물" 또는 유사체는 상기 효소와는 상이하나, 상기의 원하는 반응을 계속 나타내고, 상기 화학식 I의 알데히드 및(또는) 카르복실산의 제조에 유용한 효소이다.
본 발명에 따라, "기능적 동등물"은 특히, 아미노산이 원래의 아미노산 서열과 1개 이상의 위치에서 다르지만, 상기 언급된 산화 반응 중 하나를 촉매하는 효소 돌연변이체를 의미하는 것으로 이해된다. 그러므로, 1개 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실 및(또는) 역위에 의해 얻을 수 있는 돌연변이체를 포함하며, 이러한 변형은 상기 돌연변이체가 본 발명에 따른 촉매 활성을 갖는 한 임의의 서열 위치에서 일어날 수 있다. 또한, 기능적 동등물은 특히 돌연변이체와 미변형 효소 사이의 반응성 경향이 질의 면에서 부합되는 경우, 즉, 예를 들어, 동일한 기질을 상이한 속도로 전환시키는 경우에도 존재한다.
물론, "기능적 동등물"에는 다른 유기체, 예를 들면, 본원에 구체적으로 언급한 박테리아가 아닌 다른 박테리아로부터 얻을 수 있는 모노옥시게나제, 및 천연 발생 변이체 또는 동위효소도 포함된다. 예를 들어, 상동성 서열 영역의 영역은 서열 정렬에 의해 수립될 수 있고, 동등한 효소는 본 발명의 구체적인 설명을 참조하여 결정할 수 있다.
상기 모노옥시게나제 및 이들의 기능적 동등물을 코딩하는, 구체적으로 언급한 핵산 서열이 아닌 다른 핵산 서열 (단일- 및 이중-가닥 DNA 또는 RNA 서열)의 사용도 본 발명에 포함된다. 그러므로, 본 발명에 유용한 추가의 핵산 서열은 구체적으로 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 이용된 서열과 상이하나, 원하는 특성 프로파일을 갖는 모노옥시게나제를 코딩한다.
구체적으로 언급한 서열과 비교할 때, 소위 침묵 돌연변이를 포함하거나 특정 기원의 유기체 또는 숙주 유기체의 코돈 사용에 맞게 변형된 이러한 핵산 서열, 예를 들면, 이의 스플라이싱 변이체 등과 같은 천연 발생 변이체의 사용도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 다른 측면은 보존적 뉴클레오티드 치환 (즉, 해당 아미노산을 전하, 크기, 극성 및(또는) 용해성이 동일한 아미노산으로 교체함)에 의해 얻을 수 있는 서열이다.
본 발명의 추가의 측면은 조절 핵산 서열의 유전적 제어하에, 본 발명에 유용한 모노옥시게나제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 및 이러한 발현 구조물을 1개 이상 포함하는 벡터이다. 본 발명에 따른 이러한 구조물은 해당 코딩 서열에 각각 작동가능하게 연결된, 코딩 서열의 5'-상류의 프로모터, 및 3'-하류의 종결자 서열, 및 경우에 따라 추가의 통상적인 조절 요소를 포함하는 것이 바람직하다. "작동성 연결"은 프로모터, 코딩 서열, 종결자, 및 경우에 따라 추가의 조절 요소 각각이 코딩 서열이 발현될 때 이들의 의도된 기능을 이행할 수 있는 방식으로 순차적으로 정렬되어 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 작동가능하게 연결될 수 있는 서열의 예로는 표적 서열 및 번역 인핸서, 다른 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등이 있다. 다른 조절 요소로는 선택가능한 마커, 증폭 신호, 복제 기점 등이 있다.
인공 조절 서열 뿐 아니라, 천연 조절 서열도 실제의 구조 유전자 앞에 존재할 수 있다. 이러한 천연 조절은, 경우에 따라, 유전적 변형에 의해 차단 (switch off)될 수 있어서 유전자 발현이 증가 또는 감소될 수 있다. 그러나, 상기 유전자 구조물은 또한 더욱 간단하여, 구조 유전자 앞에 추가의 조절 신호가 삽입되지 않고, 천연 프로모터 및 그의 조절 서열이 제거되지 않은 구조일 수 있다. 대신, 이러한 천연 조절 서열은 더이상의 조절을 받지 않으며 유전자 발현이 증가 또는 감소되는 방식으로 돌연변이된다. 유전자 구조물 중에 핵산 서열 1개 이상의 카피가 존재할 수 있다.
유용한 프로모터의 예로는 하기와 같은 것들이 있다: cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, l-PR 또는 l-PL 프로모터, 이들 모두 그램 음성 박테리아에 유리하게 사용됨; 및 그램 양성 프로모터 amy 및 SPO2, 효모 프로모터 ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH 또는 식물 프로모터 CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, not, 또는 유비퀴틴 또는 파세올린 프로모터. 유도가능한 프로모터, 예를 들면, 빛- 또는 온도-유도가능한 프로모터, 예를 들면, PrP1프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
원칙적으로, 모든 천연 프로모터가 그의 조절 서열과 함께 사용될 수 있다. 또한, 합성 프로모터가 유리하게 사용될 수도 있다.
상기 언급한 조절 서열은 핵산 서열 및 단백질 발현의 표적화된 발현을 가능하게 만드려는 의도이다. 예를 들어, 숙주 유기체에 따라, 이는 유전자가 유도 후에만 발현 또는 과다발현되거나, 유전자가 즉시 발현 및(또는) 과다발현되는 것을의미할 수 있다.
조절 서열 또는 조절 인자는 바람직하게는 발현에 긍정적인 영향을 주기 때문에, 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 그러므로, 조절 요소는 프로모터 및(또는) 인핸서 등과 같은 강한 전사 신호를 사용함으로써 전사 수준에서 유리하게 향상될 수 있다. 그러나, mRNA의 안정성 개선 등을 통해 번역을 향상시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 적당한 프로모터를 적당한 모노옥시게나제 뉴클레오티드 서열 및 종결자 신호 또는 폴리아데닐화 신호와 융합함으로써 생성된다. 이러한 목적을 위해, 문헌 [T. Maniatis et al.] (24), 및 또한 문헌 [T.J. Silhavy et al.] (32) 및 문헌 [Ausubel, F.M. et al.] (33) 등에 기재된 것과 같은 통상적인 재조합 및 클로닝 기술을 사용한다.
적당한 숙주 유기체에서 발현시키기 위해서, 재조합 핵산 구조물 또는 유전자 구조물을 숙주 내에서 유전자의 최적 발현을 가능하게 만드는 숙주-특이적 벡터에 유리하게 삽입한다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [Pouwels P.H. et al., "Cloning Vectors"] (34) 등에서 찾을 수 있다.
플라스미드 뿐 아니라, 벡터 역시 당업자에게 공지된 모든 벡터, 예를 들면, 파지, 바이러스, 예를 들면, SV40, CMV, 바쿨로바이러스, 및 아데노바이러스, 트랜스포손, IS 요소, 파스미드, 코스미드 및 선형 또는 원형 DNA를 의미하는 것으로 이해된다.
이러한 벡터들은 숙주 유기체 내에서 자율 복제되거나 염색체와 함께 복제된다.
본 발명에 따른 상기 벡터를 사용하여 예를 들면, 본 발명에 따른 벡터 1개 이상으로 형질전환되고 본 발명의 방법에 이용할 수 있는 재조합 미생물을 생성하는 것이 가능하다. 상기 기재한 본 발명에 따른 재조합 구조물은 적당한 숙주 시스템으로 유리하게 도입되어 발현된다. 이를 위해서, 당업자에게 공지된 통상의 클로닝 형질감염법, 예를 들면, 동시침전법, 원형질체 융합법, 전기천공법, 레트로바이러스 형질감염법 등을 사용하여 상기 언급한 핵산을 해당 발현 시스템 내에서 발현시키는 것이 바람직하다. 적당한 시스템은 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al.] (35) 등에 기재되어 있다.
원칙적으로, 적당한 숙주 유기체는 본 발명에 따른 핵산, 이들의 대립유전적 변이체, 이들의 기능적 동등물 또는 이들의 유도체의 발현을 가능하게 할 수 있고, 본 발명에 따른 미생물학적 산화 반응 수행에 이용할 수 있는 모든 유기체이다. 숙주 유기체는 박테리아, 진균, 효모, 식물 세포 또는 동물 세포 등을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 유기체는 박테리아이다.
그러나, 사용되는 바람직한 XMO-발현 미생물은 본질적으로 벤질 알콜 데히드로게나제 (BADH) 활성 및(또는) 벤즈알데히드 데히드로게나제 (BZDH) 활성이 없는 미생물이다.
본질적으로 알칸올 데히드로게나제 (AODH) (유전자 alkJ에 의해 코딩됨) 활성 및(또는) 알칸알 데히드로게나제 (AADH) (유전자 alkH에 의해 코딩됨) 활성이 없는 AMO-발현 미생물을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 사용될 수 있는 미생물의 예로는 에쉐리히아 (Escherichia) 속, 예를 들어, 대장균, 예를 들어 균주 W3110, 및 K12 균주 중 하나, 예를 들어, JM101 및 DH5α, 또는 슈도모나스 푸티다 균주 중 하나, 예를 들면, 균주 KT 2440인 박테리아 등이 있다. 일부의 바람직한 대장균 균주의 특징을 표 1에 나타냈다.
본 발명에서, 벡터를 사용한 미생물의 형질전환은 수립된 표준 기술 (24)을 사용하여 수행되므로, 상세한 기재는 상기 문헌에서 찾을 수 있다.
성공적으로 형질전환된 유기체는 벡터 또는 발현 카세트에도 존재하는 마커 유전자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 마커 유전자의 예로는 항생제에 대한 내성 유전자 및 형질전환된 세포가 염색되도록 하는 착색 반응을 촉매하는 효소에 대한 유전자 등이 있다. 그 다음, 이러한 세포를 자동 세포 분류법 (automatic cell sorting)을 통해 선택할 수 있다. 벡터로 성공적으로 형질전환되고 적당한 항생제 (예를 들면, G418 또는 하이그로마이신) 내성 유전자를 보유하는 유기체는 그 항생제를 함유하는 적당한 고체 또는 액체 배지에 의해 선택될 수 있다. 세포 표면에 제시된 마커 단백질을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 선택할 수 있다.
숙주 유기체 및 그 유기체에 적합한 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 바이러스 또는 파지, 예를 들면, RNA 중합효소/프로모터 시스템을 갖춘 플라스미드, 파지 λ 또는 μ 또는 다른 용원성 (temperant) 파지의 조합, 또는 트랜스포손 및(또는) 추가의 유리한 조절 서열이 발현 시스템을 구성한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 작동가능하게 연결되고 예를 들어, 슈도모나스 올레오보란스 GPo1의 alk 조절 시스템의 유전적 제어를 받는 XMO-코딩 유전자 xylM및 xylA, 또는 AMO-코딩 유전자 alkB, alkG 및 alkT를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 사용한다.
미생물을 xylMA-코딩 발현 플라스미드 pSPZ3으로 형질전환시키는 것이 특히 바람직하다.
슈도모나스 올레오보란스 GPo1의 alk 조절 시스템은 그 자체가 공지되어 있다. 상기 언급한 2개의 alk 유전자 클러스터 중 제1 클러스터의 발현은 alkBp, alk 프로모터의 제어를 받으며, 제2의 alk 유전자 클러스터에 의해 코딩되는 기능적 조절 단백질 alkS, 및 유도자 (inductor), 예를 들면, n-옥탄 등의 알칸, 또는 디시클로프로필 케톤 (DCPK) (8,22,23) 등과 같이 이와 거의 관련이 없는 화합물 등의 존재하에 개시된다. 대장균 중의 alk 조절 시스템의 사용은 이화물질 억제가 일어나지 않는다는 점에서 유리하다.
본 발명의 방법에서는 유도자로서 n-옥탄 및 DCPK를 사용하는 것이 바람직하며, n-옥탄의 경우에는 0.001 내지 0.5% (v/v)의 양으로, DCPK의 경우에는 0.005 내지 0.05% (v/v)의 양으로 사용하는 것이 특히 바람직하다. 물론, n-옥탄 및 DCPK의 혼합물을 사용할 수도 있다. 상기 범위의 농도로 사용하는 경우, 최대 유도가 달성된다.
추가로, 본 발명은 상기 기재한 재조합 미생물을 사용하여 유기 화합물을 산화시키기 위한, 상기 언급한 유형의 미생물학적 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 재조합 미생물은 공지된 방법으로 발효 및 배양될 수 있다. 예를 들어, 박테리아를 pH가 6 내지 9이고, 온도가 20 내지 40℃인 TB 또는 LB 배지 중에서 증식시킬 수 있다. 구체적인 적당한 배양 조건은 문헌 [T. Maniatis et al., loc. cit] 등에 기재되어 있다.
상기 기재한 재조합 미생물을 사용한 본 발명에 따른 미생물학적 산화에서, 미생물을 산소의 존재 하에 온도가 대략 20 내지 40℃ 이상이고, pH가 대략 6 내지 9인 TB 또는 LB 배지 등의 복합 배지 중에서 충분한 세포 밀도에 도달할 때까지 제1 배양하는 것이 바람직하다. 산화 반응을 더욱 잘 제어하기 위해서, 유도가능한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 모노옥시게나제의 생성이 유도된 후, 상기 배양물을 산소의 존재하에 예를 들어 1시간 내지 3일 동안 계속 배양한다. 그 다음, 형성된 산화 생성물 또는 산소 생성물 혼합물을 배지로부터 분리하고, 추출 또는 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 방식으로 정제할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 반응은 유리하게는 본 발명에 따른 재조합 미생물을 함유하는, 고정된 형태 등의 생물반응기 중에서 수행될 수도 있다.
본 발명에 따라 사용되는 기질의 산화 정도는 유사한 방식으로 제어될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로부터 규칙적으로 샘플들을 취하고, 기체 크로마토그래피, 커플링된 기체 크로마토그래피 및 질량 분광분석기 시스템 (GC-MS) 또는 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 이들의 함유물 중의 상응하는 알콜 유도체, 알데히드 유도체 및(또는) 카르복실산 유도체에 관해 조사한다. 어떤 산화 유도체를 원하는 가에 따라, 또는 원하는 혼합 비율이 수립되었는지 여부에 따라, 배양을 중지한다. 이는 배양 배지로부터 상기 미생물을 제거하거나 이들을 파괴함으로써, 예를 들어, 원심분리하여 기울여 따라내거고(거나) 트리클로로아세트산 등의 산으로 처리하거나 열 처리하여 수행될 수 있다. 또한, 기질 (예를 들면, 톨루엔 또는 슈도큐멘 등)의 산화 정도를 계량하여 산 형성을 억제할 수도 있다.
그 다음, 간단한 증류법, 분별 증류법, 정류법 (rectification) 등과 같은 통상의 분리 방법을 적당하다면 진공 하에 사용하거나, 적당한 크로마토그래피 방법을 적용함으로써 산화된 방향족 화합물을 배양 배지로부터 단리할 수 있으며, 증류법을 사용하여 단리하는 것이 바람직하다. 편의상, 미생물 세포는 이 생성물을 단리하기 전에 배양 배지로부터 제거한다.
본 발명에 바람직한 발현 벡터 pSPZ3의 제작 방법은 문헌 [Panke, et al., Applied and Environmental Microbiology (1999) 2324-2332] (31)에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 명백히 본원에 참고문헌으로 도입된다.
본 발명의 연구 목적상, 상기 미생물을 형질전환하는데 사용되는 다른 벡터는 XMO 유전자 xylM 및 xylA 뿐 아니라, 슈도모나스 푸티다 mt-2의 벤질 알콜 데히드로게나제 (BADH) 유전자 xylB까지도 발현가능한 형태로 함유하는 벡터이다. 벤질 알콜 데히드로게나제 유전자 xylB를 상기 기재한 플라스미드 pSPZ3에서 xylA 유전자의 바로 하류에 도입하기 위해서, xylB 유전자를 함유하는 플라스미드 pCK04의 2.3 kb XhoI/FspI 단편 (25)을 XhoI 및 SmaI으로 소화시킨 벡터 pGEM-7Zf(+) (스위스 취리히에 소재하는 프로메가 (Promega) 제품)에 먼저 도입하여 pGEMAB를 생성했다. XhoI 및 BamHI을 사용하여 이 구조물로부터 2.3 kb 단편을 절단하고, 이를 XhoI 및 BamHI으로 소화시킨 플라스미드 pSPZ3에 라이게이션시켰다. 생성된 플라스미드를 pRMAB로 지칭했다 (도 2).
그러나, pRMAB에 대한 실험을 통해, XMO 뿐 아니라 BADH도 존재하는 경우, 벤질 알콜이 벤즈알데히드로 산화되는 활성이 더 낮을 뿐 아니라 실제로 역 반응이 일어나 벤질 알콜이 형성되는 것으로 나타났다.
본 발명의 연구 목적상, xyl 유전자를 함유하지 않는 플라스미드 pRS를 음성 대조군으로서 제작했다. pRMAB를 BamHI 및 SmaI으로 소화시키고, 클레나우 (Klenow) 효소로 처리했다. 더 커다란 단편을 단리한 다음, 벡터를 버렸다.
하기에서, 구체적인 예 및 도를 언급하면서 본 발명의 방법을 설명하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 1A는 상부의 TOL 대사 경로 효소 및 상부의 TOL 오페론의 xyl 유전자들의 조직화 (organization)에 의해 톨루엔에서 벤질 알콜, 벤즈알데히드 및 벤조산으로의 단계별 산화를 나타낸다. BADH는 벤질 알콜 데히드로게나제를 나타내고, BZDH는 벤즈알데히드 데히드로게나제를 나타낸다. Pu는 상부의 TOL 오페론 프로모터를 지시하고, xylW는 미지 기능의 유전자이며, xylC는 BZDH 코딩 유전자를 지시하고, xylM은 XMO의 말단 히드록실라제 성분을 코딩하는 유전자이며, xylA는 XMO의 NADH:수용자 리덕타제 성분을 코딩하고, xylB는 BADH-코딩 유전자이며, xylN은 미지 기능의 유전자이다. 도 1B는 아릴-치환된 알칸이 알칸 히드록실라제 (AMO), 알칸올 데히드로게나제 (AODH) 및 알칸알 데히드로게나제 (AADH) 효소에 의해 촉매되어 상응하는 알칸올 및 알칸알을 통해 알칸카르복실산으로 단계별 산화되는 것을 나타낸다.
도 2는 alk 조절 시스템의 제어를 받는 유전자 xylMA 및 xylMAB를 함유하는 발현 플라스미드 pSPZ3 및 pRMAB의 구조도를 나타낸다. alkBp는 alk 오페론의 프로모터를 지시하고, alkS는 양성 조절자 AlkS의 유전자이다. 유전자 xylM*및 xylA는 크실렌 모노옥시게나제를 코딩한다 (*는 xylM 유전자에서 NdEI 부위가 제거되었음을 의미함). xylB 유전자는 BADH를 코딩한다. Km은 카나마이신 내성 유전자를 지시하고, T4t는 T4-파지의 전사 종결자이다.
도 3은 대장균 JM101 (pSPZ3) (A), 및 대장균 JM101 (pRMAB) (B)에 의한 톨루엔의 산화를 나타낸다. 톨루엔 (1.37 mM)을 인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 7.4, 1% (w/v) 글루코스) 중의 휴지기 대장균 JM101 (pSPZ3/pBRMAB) 세포 현탁액에 첨가했다 (2.07 - 2.14 g/ℓ CDW). 원형 표시: 톨루엔, 사각형 표시: 벤질 알콜, 삼각형 표시: 벤즈알데히드, 다이아몬드 표시: 벤조산, 십자 표시: 4가지 농도의 총 합.
도 4는 대장균 JM101 (pSPZ3) (A, C, E) 및 대장균 JM101 (pRMAB) (B, D)에 의해 슈도큐멘이 상응하는 알콜 및 상응하는 알데히드로 산화되는 것을 나타낸다. 기질 (0.46 mM)을 인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 7.4, 1% (w/v) 글루코스) 중의 휴지기 대장균 JM101 (pSPZ3/pBRMAB) 세포 현탁액 (0.86 - 0.92 g/ℓ CDW)에 첨가했다. 그래프 (A) 및 (B)는 슈도큐멘의 산화를, 그래프 (C) 및 (D)는 3,4-디메틸벤질 알콜의 산화를 나타내고, 그래프 (E)는 3,4-디메틸벤즈알데히드의 산화를 나타낸다. 원형 표시: 슈도큐멘, 사각형 표시: 3,4-디메틸벤질 알콜, 삼각형 표시: 3,4-디메틸벤즈알데히드, 다이아몬드 표시: 3,4-디메틸벤조산, 십자 표시: 모든 농도의 총 합.
도 5는 대장균 JM101 (pSPZ3)의 성장 및 그 안에서의 XMO의 역학을 나타낸다. 그래프 (A)는 n-옥탄을 사용한 유도 이후 상이한 시점에서 세포 건조 질량 (CDW) 및 크실렌 모노옥시게나제의 활성을 나타내며, 그래프 (B) 및 (C)는 n-옥탄 및 디시클로프로필 케톤 (DCPK) 각각을 상이한 양으로 사용하여 유도한 후 3.5시간이 지난 후의 세포 건조 질량 및 크실렌 모노옥시게나제의 활성을 나타낸다. 각각의 활성 측정은 독립적인 배양물에 대해 수행되었다. 슈도큐멘 (1.37 mM)을 인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 7.4, 1% (w/v) 글루코스) 중의 휴지기 대장균 JM101 (pSPZ3) 세포 (2.04 - 2.44 g/ℓ CDW) 현탁액에 첨가했다. 비활성은 반응의 처음 5분 동안의 생성물 형성량에 기초한다. 그래프 (A)에서 화살표는 XylMA 합성을 유도하기 위한 0.1% (v/v) n-옥탄의 첨가 시간을 지시한다. 검정색 원형 표시: 비유도 배양물의 CDW, 백색 원형 표시: 유도된 배양물의 CDW, 십자 표시: 유도된 배양물의 비활성.
도 6은 XMO에 의해 촉매되어 벤질 알콜로부터 벤즈알데히드가 형성되는 메카니즘에 관한 가능한 설명을 나타낸다.
통상의 방법 및 사용된 물질
a) 박테리아 및 플라스미드:
A*: 상기 플라스미드는 오직 xylA 유전자의 일부만을 함유함
b) 화학물질 및 효소
사용된 모든 화학물질 및 효소는 시판하는 것들이며, 예를 들어, 베링거 만하임 (Boehringer Mannheim) (스위스 로트크로이쯔 소재), NEB (독일 슈발바하 소재), 깁코 (Gibco) (스위스 바즐 소재), AGS (독일 하이델베르크 소재), 프로메가 (스위스 취리히 소재), 플루카 (Fluka) (스위스 부후스 소재), 알드리치 (Aldrich) (스위스 부후스 소재) 및 란카스터 (Lancaster) (독일 뮐하임 소재)의 제품이다. 플라스미드 DNA의 소규모 프렙 (preparation)을 위해, 퀴아젠 (Qiagen) (스위스 바즐 소재)의 제품인 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (QIAprep Spin Miniprep Kit)를 제조업자의 지시에 따라 사용했다.
c) 재조합 방법
사용된 벡터/플라스미드를 제작하고, 박테리아를 형질감염 및 형질전환시키기 위해, 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis] (24) 등에 상세히 기재되어 있는 표준 재조합 방법을 사용했다. 또한, 참고문헌 부분에 나열된 원래의 문헌들에 있는 물질 및 방법란에 있는 것들이 바람직하다. 그러므로, 추가의 논의는 생략할 수 있다.
d) 박테리아 배양
박테리아는 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) (LB) 브로스 (미국 미시간주 디트로이트에 소재하는 디프코 (Difco) 제품), 또는 3배 농도의 인산염 (M9*) 및 유일한 탄소 공급원으로서의 0.5% (w/v) 글루코스를 함유하는 M9 최소 배지 (24) 중에 배양했다. 적당하다면, 상기 배양물에 카나마이신 (최종 농도: 50 mg/ℓ), 암피실린 (100 mg/ℓ), 클로르암페니콜 (30 mg/ℓ), 티아민 (10-3%, w/v), 1 mM 인돌 및 0.5 mM IPTG (이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드)를 보충한다. 고체 배지는 1.5% (w/v) 아가를 함유했다. 액체 배양물은 통상적으로 200 rpm의 수평 진탕기를 사용하여 30 또는 37℃의 온도에서 성장시켰다.
e) 효소 활성의 측정
간략하게 하기 위해, 무손상 세포를 사용하여 효소 활성을 측정했다.
1 유닛 (U)은 1분당 총 1 μmol을 생성하는 활성으로 정의된다. 여기서, 비활성은 세포 건조 질량 (CDW) 1 g 당 활성 (U/g CDW)으로 표현되며, 이후로는 간단하게 활성이라 지칭한다. 평균 활성의 계산은 CDW 1 g 당 전환의 처음 5분 동안 형성한 생성물의 양을 기초로 한다. 실험은 서로 독립적으로 3회 이상 반복 수행했다.
분석을 하기와 같이 수행했다. 해당 벡터로 재조합된 대장균 JM1O1을 카나마이신이 존재하는 배지 40 ml 또는 100 ml 중에서 인큐베이션시켰다. 450 nm에서의 광학 밀도가 대략 0.3일 때, 0.05% (v/v) DCPK 또는 0.1% (v/v) n-옥탄을 첨가하여 세포를 유도하고, OD450이 전형적으로 0.8 내지 0.9로 증가할 때까지 3 내지 3.5시간 동안 계속 인큐베이션했다. 그 다음, 세포를 수거하고 1% (w/v)의 글루코스를 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.4) 중에 세포 건조 질량을 2.5 g/ℓ 이하로 재현탁했다. 1 ml 또는 2 ml 분액들을 피렉스 (Pyrex) 튜브에 넣어 마개로 밀봉하고 250 rpm의 수평 궤도 진탕기를 사용하여 30℃에서 인큐베이션시켰다. 5분 후에, 에탄올 중 20배 농축된 스톡 용액 형태의 해당 기질을 최종 농도 1.5 mM로 첨가했다. 3,4-디메틸벤조산의 형성을 측정하는 실험에서, 세포 건조 질량은 1 g/ℓ로 감소했고, 해당 기질을 최종 농도 0.5 mM로 첨가했다 (이 화합물이 물에 거의 용해되지 않기 때문임). 진탕기 상에서 5분 동안 전환시킨 후에, 샘플들을 얼음에 넣고, 여기에 40 내지 80 ㎕의 과염소산 스톡 용액 (10% v/v)을 즉시 처리하여 현탁액의 pH가 2가 되도록 했다.
f) 시간의 함수에 따른 생성물 형성의 측정
시간의 함수에 따른 생성물 형성을 조사하기 위해서, 상기 기재한 바와 같이 세포를 성장시키고, 유도하고, 수집하고, 재현탁하고, 다른 시간, 즉, 5, 10, 20, 30, 40 및 80분 동안 해당 기질과 함께 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상기 기재한바와 같이 전환을 종료시키고, 원심분리 (7800 rpm, 8분)하여 세포를 제거하고 상층액을 분석했다.
고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 벤질 알콜, 벤질 알데히드 및 벤조산을 분리했다. 사용된 컬럼은 뉴클레오실 (Nucleosil) C18 (공극 크기 100 Å, 입자 크기 5 ㎛, 길이 25 cm, 내부 직경 4 mm) (스위스 오엔징겐에 소재하는 마체리-나겔 (Macherey-Nagel) 제품)이었고, 이동상은 69.9% H2O/30% 아세토니트릴/0.1% H3PO4(유속 0.7 ml/분)이었다. 이동상이 64.9% H2O/35% 아세토니트릴/0.1% H3PO4(동일 유속)라는 점만 제외하고는 동일한 컬럼을 사용하여 3,4-디메틸벤질 알콜, 3,4-디메틸벤즈알데히드, 및 3,4-디메틸벤조산을 분리했다. 210 nm에서의 UV 흡광도로 검출했다. 분리된 화합물들의 체류 시간을 시판 표준물질들의 체류 시간과 비교함으로써 상기 화합물들을 확인했다.
톨루엔/슈도큐멘 및 상응하는 알콜, 알데히드 및 산의 경우, 기체 크로마토그래피를 통해 분리했다. 상기 기체 크로마토그래피 (영국에 소재하는 피슨스 인스트루먼츠 (Fisons Instruments) 제품)에 마체리-나겔 (스위스 오엔징겐 소재) 제품인 OPTIMA 5-형 모세관 컬럼 (길이 25 m, 내부 직경 0.32 mm, 필름 두께 0.25 ㎛)을 장착했다. 사용된 운반 기체는 수소였으며, 주입은 끊임없이 수행되었다. 하기의 온도 프로파일을 사용했다: 40℃에서 70℃로 증가 (15℃/분), 70℃에서 105℃로 증가 (5℃/분), 및 105℃에서 240℃로 증가 (20℃/분). 상기 화합물들은 화염 (flame)-이온화 검출기로 검출했다. 분리된 화합물들의 체류 시간을 시판 표준물질들의 체류 시간과 비교함으로써 상기 화합물들을 확인했다. 별법으로, 질량 분광분석기 (커플링된 GC-MS 시스템)를 사용하여 검출할 수도 있다. 이렇게 질량 분광분석기를 사용하여 검출하는 경우, 특정 크로마토그래피성 체류 시간 뿐 아니라 개별 피크의 넓이 분포 및 피크 분리 양상까지 이용할 수 있어서 반응 생성물에 대한 정성 및 정량 측정을 할 수 있다는 이점이 있다.
커플링된 GC-MS 시스템은 피슨스 MD-800 형의 질량 분광분석기 및 CP-Sil-5CB 컬럼 (네덜란드에 소재하는 크롬팍 (Chrompack) 제품)이 장착된 기체 크로마토그래피 (영국에 소재하는 피슨스 인스트루먼츠 제품)로 구성된다. 사용된 운반 기체는 헬륨이었다. 분리하여 (20 : 1) 주입했다. 온도 프로그램은 상기 기재한 기체 크로마토그래피에 의한 분리에서와 동일했다.
기체 크로마토그래피 및 커플링된 GC-MS 시스템 모두의 경우에서, 0.1 mM 도데칸을 포함하는 동일 부피의 빙냉 에테르를 내부 표준물질로서 상기 샘플에 첨가했다. 그 다음, 염화 나트륨을 포화될 때까지 첨가하고, 수성 상을 30℃에서 5분 동안 격렬히 진탕시켜 추출했으며, 그 즉시 원심분리하여 상들을 분리했다. 유기 상을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시킨 다음, 분석했다.
실시예 1: 크실렌 모노옥시게나제를 사용한, 톨루엔 및 그의 유도체의 산화
하기의 실험에서, 모든 세포는 세포 밀도가 0.09 g CDW/ℓ이 될 때까지 성장시켰고 일반적으로 0.1% (v/v) n-옥탄을 사용하여 유도했다. 그 다음, 상기 배양물을 3 내지 3.5시간 더 인큐베이션시키면서, 세포 밀도가 0.23 내지 0.27 g CDW/ℓ가 될 때까지 성장시켰다.
표 2는 XMO가 톨루엔을 벤질 알콜로 산화시키고, 벤질 알콜을 벤즈알데히드로 산화시키며, 벤즈알데히드를 벤조산으로 산화시킨다는 것을 보여준다. 처음 2번의 산화 반응의 경우에서 활성은 95 내지 100 U/g CDW 이하인 것으로 확인되었으며, 벤즈알데히드가 산화되는 활성은 겨우 10 U/g CDW로 더 낮았다.
슈도큐멘의 경우에도 유사한 결과를 얻었다. 슈도큐멘은 3,4-디메틸벤질 알콜로 산화되고, 3,4-디메틸벤질 알콜은 3,4-디메틸벤즈알데히드로 산화되며, 3,4-디메틸벤즈알데히드는 3,4-디메틸벤조산으로 산화된다. 슈도큐멘 산화의 경우에서 활성은 100 U/g CDW인 것으로 확인되었으며, 3,4-디메틸벤즈알데히드가 형성되는 활성은 50 U/g CDW로 더욱 느렸고, 3,4-디메틸벤조산으로 산화되는 활성 (55 U/g CDW)은 벤즈알데히드의 경우보다 뚜렷하게 높았다.
기질로서 산을 첨가하는 경우, 반응 생성물 또는 산의 감소 어느 것도 검출되지 않았다.
비유도 대장균 JM101은 플라스미드 pSPZ3을 함유하였으며, 유도된 대장균 JM101은 임의의 플라스미드도 함유하지 않으며 대조구로 기능했다. 대장균에 미치는 alk 조절 시스템의 어떠한 영향도 피하기 위해, 플라스미드 pRS를 함유하는 대장균 JM101을 추가의 대조구로 사용했다. 플라스미드 pRS는 alkS 유전자를 함유하지만, xyl 유전자는 함유하지 않는다. 표 2는 톨루엔, 슈도큐멘 및 상응하는 알콜을 기질로 사용한 대조구 실험에서 변환 생성물이 검출되지 않았음을 증명한다.
하기의 표 3은 본 실험에 기질로서 첨가된 알데히드 역시 일정 활성으로 알콜로 환원된다는 것을 보여준다. 3,4-디메틸벤조산의 형성 또한 확인되었으나, 활성 범위가 2 내지 2.5 U/g CDW로 매우 낮았다. 이는 유도된 대장균 JM101 (pSPZ3) (이러한 문맥에서 이러한 약자는 상기 미생물이 언급한 플라스미드를 함유한다는 것을 의미함)에 의해 형성된 산 대부분이 XMO의 존재에 의한 것일 수 있다는 결론을 내릴 수 있게 한다.
일반적으로 사용된 유도자인 0.1% (v/v) n-옥탄 및 유도자 0.05% (v/v) DCPK (대체물로 사용됨) 사이에 형성된 생성물 및 활성, 또는 형성 속도와 관련한 유의한 차이가 발견되지 않았다는 점은 염두에 두어야 한다.
XMO에 의한 톨루엔 및 유도체의 산화
기질 비활성 (U/g CDW)
대장균 JM101 (pSPZ3) 유도됨b 대장균 JM101 (pSPZ3) 비유도됨b 대장균 JM101 (pRS) 유도됨b
톨루엔 100 0 0
벤질 알콜 95 0 0
벤즈알데히드 10 하기 참조c 하기 참조c
슈도큐멘 100 0 0
3,4-디메틸벤질알콜 50 0 0
3,4-디메틸벤즈알데히드 55 하기 참조c 하기 참조c
a활성을 측정하는 분석을 상기 기재한 바와 같이 수행했다. 유닛 (U)은 상기 정의한 바와 같고, 비활성은 상기 기재한 바와 같이 계산했다.
b0.1% (v/v) n-옥탄을 첨가하여 세포를 유도했다.
c하기 참조 (표 3)
대조 실험에서 알데히드의 변환
비활성a(U/g CDW)
기질로서의 벤즈알데히드 기질로서의 3,4-디메틸벤즈알데히드
형성된 생성물 유형 대장균 JM101 (pSPZ3) 비유도됨 대장균 JM101 (pRS) 유도됨b 대장균 JM101 (pSPZ3) 비유도됨 대장균 JM101 (pRS) 유도됨b
알콜 형성 19 15 9.4 8.3
산 형성 0.5 0 2.2 2.4
a, b표 2 참조
비유도 대장균 JM101 (pSPZ3) 및 유도된 대장균 JM101 (pRS)을 사용한 이러한 대조 실험에 나타난 알데히드의 알콜로의 환원은 열역학적 이유로 인해 평형이 알콜 쪽으로 치우친 반응을 촉매하는 대장균 알콜 데히드로게나제의 작용에 의한 것이라 설명될 수 있다. 대장균 JM101 (pSPZ3)에 의한 톨루엔의 생물변환 종료시 벤질 알콜이 재형성 (도 5A 참조)되는 것도 대장균 데히드로게나제의 활성이 현저해진다는 점 (XMO 활성은 시간에 따라 감소하기 때문임)에 기인하는 것일 수 있다.
실시예 2: 시간에 따른 여러가지 기질의 산화 진행 과정의 측정
톨루엔, 슈도큐멘, 3,4-디메틸벤질 알콜 및 3,4-디메틸벤즈알데히드가 시간에 따라 산화되는 경로를 도 3 및 도 4에 나타냈다. 이 분석은 상기 기재한 바와 같이 수행되었다. 각 경우마다 해당 기질을 1% (w/v) 글루코스를 포함하는 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.4) 중 각각의 휴지기 세포의 현탁액에 첨가했다.
톨루엔 또는 슈도큐멘을 기질로 첨가한 경우, 그 후의 상응하는 알콜, 알데히드 및 산의 형성은 수립되어 있다 (도 3A 및 4A). 또한, 활성 분석에서 수립된 바와 같이, 벤질 알콜, 3,4-디메틸벤질 알콜 및 벤즈알데히드가 형성되는 활성은 높았다. 3,4-디메틸벤즈알데히드 및 3,4-디메틸벤조산이 형성되는 활성은 중간이었며, 벤조산이 형성되는 활성은 낮았다. 처음 5분 동안, 2가지 기질 슈도큐멘 및 톨루엔의 생성물은 100 U/g CDW의 비활성으로 형성되었다 (또한, 표 2 참조). 제5분 내지 제10분 사이에, 벤즈알데히드는 80 U/g CDW로 형성되었지만, 3,4-디메틸벤즈알데히드는 더욱 서서히 (37 U/g CDW) 형성되었다. 톨루엔 또는 슈도큐멘의 소모가 완료되었을 때, 제10분 내지 제30분 동안 벤조산의 경우에는 3.2 U/g CDW의 활성으로, 3,4-디메틸벤조산의 경우에는 21 U/g CDW의 활성으로 산 형성이 시작되었다. 이때, 벤질 알콜은 계속 낮은 농도로 유지되었다. 제40분 내지 제80분 사이에, 벤질 알콜 농도는 다시 증가했으나, 벤즈알데히드 농도는 급감했다 (도 3A). 슈도큐멘, 3,4-디메틸벤질 알콜 및 3,4-디메틸벤즈알데히드를 완전히 소모하면서 3,4-디메틸벤조산이 형성되었다 (도 4A).
3,4-디메틸벤질 알콜을 기질로 첨가한 경우, 3,4-디메틸벤즈알데히드가 형성되는 활성은 50 U/g CDW (표 2)였고, 제10분 내지 제30분 사이의 시간 동안 3,4-디메틸벤조산이 형성되는 활성은 23 U/g CDW였다 (도 4C). 벤질 알콜을 기질로 사용한 경우, 벤즈알데히드가 형성되는 활성은 95 U/g CDW였고, 벤조산이 형성되는 활성은 일정하게 2.9 U/g CDW였다 (결과는 나타내지 않음). 시험 기간 동안, 벤질 알콜과는 달리, 3,4-디메틸벤질 알콜은 모두 산으로 완전히 전환되었다.
3,4-디메틸벤즈알데히드를 기질로 첨가한 경우 (도 4E), 3,4-디메틸벤조산이 형성되는 활성은 55 U/g CDW였고, 이는 불과 20분만에 우세한 종을 구성했다. 벤즈알데히드를 기질로 첨가한 경우, 벤조산의 형성은 느리고 일정 (3 U/g CDW)한 것으로 수립되었다 (결과는 나타내지 않음). 여기서, 처음 5분 동안의 초기 활성은10 U/g CDW였다 (표 2).
실시예 3: 대장균 JM101 (pRMAB)에 의한 톨루엔 및 슈도큐멘의 변환
본 실험은 BADH 및 XMO가 동시에 존재하는 경우에 톨루엔 및 슈도큐멘으로부터 알데히드가 형성되는 활성이 증가 또는 감소하는지 여부를 명백히 하고자 함이다. 일부의 알콜 데히드로게나제는 생리적 pH에서 평형이 알콜 쪽으로 치우친 반응을 촉매하기 때문에 실제로 알데히드 형성 활성이 감소할 가능성이 있어서, BADH가 알데히드 형성 속도를 감소시킬 것이다.
실제로, 대장균 JM101 (pSPZ3)과 비교하여 생물변환 활성과 관련한 명백한 차이점이 관찰되었다. 톨루엔은 초기 비활성 87 U/g CDW로 그의 상응하는 산화 생성물로 변환되었다. 벤질 알콜, 슈도큐멘 및 3,4-디메틸벤질 알콜에 대한 상응하는 활성은 66, 73, 및 42 U/g CDW였다. 또한, BADH의 존재가 대장균 JM101의 생물촉매로서의 생물변환 활성 감소를 초래한다고 여겨진다.
톨루엔을 첨가하면, 벤질 알콜, 벤즈알데히드 및 벤조산이 연속적으로 형성된다 (도 3B). 제5분 내지 제10분 동안, 벤질 알콜이 34 U/g CDW의 활성으로 형성되었고, 제10분 내지 제40분 동안, 산이 1 U/g CDW의 활성으로 형성되었다. 대략 20분 후에, 벤질 알콜 농도는 다시 증가하기 시작 (역반응이 시작되기 때문일 것임)했다. 실제로, 80분 후에는 벤즈알데히드가 남아있지 않았고, 단지 매우 소량의 벤조산만이 형성되었다.
벤질 알콜을 기질로 첨가한 경우의 결과는 매우 유사했다 (나타내지 않음). 다시, 대략 20분 후에 알데히드 농도는 알콜 형성 동안 급감했다. 이와 같이,xylB 유전자의 도입은 상당량의 알데히드를 알콜로 환원시켰으며, 이는 알데히드의 형성이 BADH의 첨가에 의해 증가하지 않음을 암시한다.
슈도큐멘을 기질로 첨가한 경우, 3,4-디메틸벤질 알콜, 3,4-디메틸 벤즈알데히드 및 3,4-디메틸벤조산의 연속 형성이 다시 수립되었다 (도 4B). 제5분 내지 제10분 동안, 3,4-디메틸 벤즈알데히드가 15 U/g CDW의 활성으로 형성되었다. 제30분 내지 제40분 동안, 산이 대략 동일한 활성 (13 U/g CDW)으로 형성되었다. 신속한 알콜 형성 후에, 알데히드 농도는 20분 동안 비교적 높게 유지되었다. 그러나, 반응 종료시에는 알콜 및 알데히드가 모두 산으로 변환되었다.
3,4-디메틸벤질 알콜을 기질로 첨가한 경우, 3,4-디메틸 벤즈알데히드 및 3,4-디메틸벤조산이 형성되었다 (도 5B). 제20분 내지 제30분 동안, 산이 8 U/g CDW의 비활성으로 형성되었다. 알데히드 농도는 절대로 알콜 농도를 초과하지 않았다. 3,4-디메틸벤질 알콜이 더 오랫동안 존재한다는 사실은 알데히드가 산화될 뿐 아니라 다시 알콜로 환원된다는 것을 지시하며, 이로부터 BADH가 관여한다고 짐작된다.
실시예 4: 대장균 JM1001 (pSPZ3)의 성장 및 유도 역학
각 활성 지점에 대해 단일 배양물을 성장시켰다. 활성 분석은 상기 기재한 바와 같이 수행되었다. 도 5A의 경우, 슈도큐멘 (1.37 mM)을 1% (w/v) 글루코스를 포함하는 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.4) 중 휴지기 대장균 JM101 (pSPZ3) (2.04 - 2.26 g/ℓ CDW)의 현탁액에 첨가했다. 전환의 처음 5분 동안 형성된 양을 기체 크로마토그래피로 측정하고, 이를 사용하여 비활성을 계산했다. 화살표는 xylMA합성을 유도하기 위해 0.1% (v/v) n-옥탄을 첨가한 시점을 지시한다. 검은 색 원형 표시는 비유도된 배양물의 세포 건조 질량 (CDW)을 지시하고, 백색 원형 표시는 유도된 배양물의 세포 건조 질량을 지시하며, 십자 표시는 유도된 배양물의 비활성을 지시한다.
도 5B 및 도 5C는 세포 밀도가 2.26 - 2.44 g/ℓ CDW라는 점을 제외하면, 도 5A에 기재한 바와 같이 얻어졌다. 도 5B는 상이한 양의 n-옥탄의 영향을 나타내며, 도 5C는 상이한 양의 DCPK의 영향을 나타낸다. 원형 표시는 유도한 지 3.5시간 후의 세포 건조 질량을 지시하며, 십자 표시는 유도된 배양물의 비활성을 지시한다.
0.1% (v/v) n-옥탄 (도 5A) 또는 0.05% (v/v) DCPK를 사용하여 유도한 후의 XMO 활성을 모니터링했다. XMO 활성은 상기 2가지 화합물 모두에 의해 신속하게 유도되었고, 3시간 내지 3.5시간 후에는 n-옥탄의 경우 대략 115 U/g CDW, DCPK의 경우에는 대략 105 U/g CDW의 일정한 값에 도달했다. 유도된 세포의 성장 속도는 비유도된 세포에 비해 뚜렷하게 낮았다.
대장균 JM101 (pSPZ3)을 1 ℓ당 0.09 g CDW의 농도 이하로 성장시키고 상이한 양의 n-옥탄 및 DCPK을 사용하여 세포를 유도함으로써 유도자 농도에 대한 XMO활성의 의존성 (O.0O001 - 1% (v/v))을 측정했다. 3.5시간 더 배양한 후에, 세포 건조 질량 및 XMO 활성을 각각의 유도자 농도에 대해 측정했다 (도 5B 및 도 5C). 0.0001% (v/v) 미만의 n-옥탄 또는 0.001% (v/v) 미만의 DCPK를 배양 배지에 첨가했을 때 얻어진 XMO 활성은 매우 낮았다. 최대 유도값은 DCPK 농도가 0.005 내지0.01% (v/v)일 때와 n-옥탄 농도가 0.001 내지 0.004% (v/v) 사이일 때인 것으로 밝혀졌다. 더 높은 유도자 농도에서의 XMO 활성은 일정했다. n-옥탄의 높은 증기압때문에 밀봉된 진탕 플라스크를 사용했으며, 오직 소량의 n-옥탄만을 수성 배지에 용해시켰다. 증류수 중의 n-옥탄의 용해도는 매우 낮아서 0.7 mg/ℓ, 또는 0.0001% (v/v)였다.
효소 활성이 최대값으로 증가하는 유도자 농도 범위 내에서 세포 밀도는 감소했다. 더 높은 n-옥탄 농도에서의 효소 활성은 일정했다. 반대로, 더 높은 DCPK 농도는 세포 밀도를 더 감소시켰다 (도 5B 및 도 5C). 또한, 여러가지 유도자 농도가 플라스미드 없는 대장균 JM1O1에 미치는 직접적인 영향을 조사했다. 높은 n-옥탄 농도는 세포 성장에 아무런 영향을 미치지 않았다. 반대로, 0.01% (v/v)를 초과하는 DCPK 농도는 성장 속도를 감소시켰다. DCPK 농도가 0.5% (v/v)일 때, 유도한 지 3.5시간 후의 세포 건조 질량은 겨우 0.073 g/ℓ인 것으로 측정되었다. 분명히, 높은 DCPK 농도는 세포에 해로운 영향을 미친다. 그러므로, n-옥탄이 더 양호한 유도자이다.
하기와 같이 요약할 수 있다. 톨루엔 및 슈도큐멘의 단계별 산화에는 2가지 유의한 차이가 있다. 3,4-디메틸벤질 알콜은 벤질 알콜보다 더 서서히 산화되고, 3,4-디메틸벤조산은 벤조산보다 뚜렷하게 높은 활성으로 형성된다. 이는 치환체의 변동이 XMO가 매우 유사한 활성을 나타내는 톨루엔 및 슈도큐멘 등의 비산화된 기질에 대한 XMO 비활성보다 산화된 기질 (알콜, 알데히드)에 대한 비활성에 상이한 영향을 미친다는 것을 암시한다. 다른 중요한 결과는 톨루엔 또는 슈도큐멘 모두가 더 많이 또는 더 적게 소모되는 한, 산은 형성되지 않는다는 것이다. 이것이 통상적인 사실인 경우, 톨루엔 및 슈도큐멘에 대한 XMO의 친화성은 상응하는 알데히드에 대한 친화성보다 명백히 더 높다. BADH의 존재는 생성물 형성에 대한 활성을 낮추고, 심지어는 벤질 알콜을 재형성시킨다. BADH를 함유하는 세포는 명백히 알데히드를 더욱 서서히 축적한다. BADH는 대장균 데히드로게나제에 대한 영향을 극적으로 증가시키는 것으로 여겨지며, 이러한 데히드로게나제 반응의 평형이 알콜 쪽으로 치우쳐져 있는 것으로 여겨진다. 이는 공지된 선행 방법 (26 내지 29) 및 효소 역학에 대한 연구 (16 내지 18)에 의한 열역학적 계산에 의해 확인된다.
참고문헌

Claims (15)

  1. a) 크실렌 모노옥시게나제 (XMO) 및 알칸 모노옥시게나제 (AMO) 중에서 선택된 효소를 발현하는 미생물을 하기 화학식 II의 방향족 기질을 포함하는 배양 배지 중에서 배양하는 단계, 및
    b) 배양 배지로부터 하기 화학식 I의 화합물(들)을 단리하는 단계
    를 포함하는, 화학식 I의 방향족 알데히드 및(또는) 카르복실산의 제조 방법.
    <화학식 I>
    Ar-(CH2)n-R1
    <화학식 II>
    Ar-R2
    상기 식에서,
    Ar은 치환되거나, 일치환 또는 다치환된 단핵 방향족 고리이고,
    R1은 산소를 함유하는 -CHO기 또는 -COOH기이며,
    n은 0 내지 15의 정수이며,
    R2는 -CH=CH2또는 -(CH2)n+1R3(여기서, n은 상기 정의한 바와 같고, R3은 H또는 OH임)이거나, 또는 R1이 -COOH인 경우, R2는 -(CH2)nR4(여기서, n은 상기 정의한 바와 같고, R4는 -CHO임)일 수도 있다.
  2. 제1항에 있어서, XMO-발현 미생물이 본질적으로 벤질 알콜 데히드로게나제 (BADH) 활성 및(또는) 벤즈알데히드 데히드로게나제 (BZDH) 활성이 없는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, AMO-발현 미생물이 본질적으로 알칸올 데히드로게나제 활성 및(또는) 알칸알 데히드로게나제 (AADH) 활성이 없는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 작동가능하게 연결되고 슈도모나스 올레오보란스 (Pseudomonas oleovorans) GPo1의 alk 조절 시스템의 유전적 제어를 받는 XMO-코딩 유전자 xylM 및 xylA, 또는 AMO-코딩 유전자 alkB, alkG 및 alkT를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 사용하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 미생물을 발현 플라스미드 pSPZ3으로 형질전환시키는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 에쉐리히아(Escherichia) 속의 박테리아인 것인 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 발현이 유도자 (inductor)를 배양 배지에 첨가함으로써 개시되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, XMO 활성을 발현하는 미생물을 사용하여 R2가 -CH=CH2, -CH3, 또는 -CH2OH인 화학식 II의 화합물을 전환시키는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, AMO 활성을 발현하는 미생물을 사용하여 R2가 -(CH2)m-R3(여기서, R3은 상기 정의한 바와 같고, m은 6 내지 13의 정수임)인 화학식 II의 화합물을 전환시키는 것인 방법.
  10. 제4항에 있어서, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) mt-2의 크실렌 모노옥시게나제가 발현되는 것인 방법.
  11. 작동가능하게 연결되고 슈도모나스 올레오보란스 GPo1의 alk 조절 시스템의 유전적 제어를 받는 XMO-코딩 유전자 xylM 및 xylA, 또는 AMO-코딩 유전자 alkB,alkG 및 alkT를 함유하는 발현 벡터를 보유하는 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 에쉐리히아 및 슈도모나스 속의 박테리아로부터 선택된 것인 미생물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 플라스미드 pSPZ3으로 형질전환된 것인 미생물.
  14. 작동가능하게 연결되고 슈도모나스 올레오보란스 GPo1의 alk 조절 시스템의 유전적 제어를 받는 XMO-코딩 유전자 xylM 및 xylA, 또는 AMO-코딩 유전자 alkB, alkG 및 alkT를 함유하는 발현 구조물.
  15. 화학식 I의 방향족 화합물을 미생물학적으로 제조하기 위한, 제11항 내지 제13항의 미생물 또는 제14항의 발현 구조물의 용도.
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