JP3045540B2 - 酵素類および薬物検出におけるそれらの使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、微生物から単離された２種の新規酵素類、
これらの酵素類を産生する微生物類、ヘロイン分解を触
媒することにおける本酵素類の使用およびこれらの酵素
類を用いたヘロイン検出のための方法および装置に関す
る。

2.先行技術の説明 粒子形態および体液中におけるヘロインの検出方法に
対して緊急の必要がある。多くの異なる分析システムが
粒子ヘロインに関して提案されているが、質量分析のよ
うな大型機器にほとんどが依存している。体液に関して
イムノアッセイが使用されてきたが、これは、専門家の
熟練した操作が得られる研究室試験に一層適している。
ヘロインに特異的な酵素が入手できかつ酵素反応産物が
実質的に簡易な機器を用いて検出できれば、より廉価で
かつ簡易なヘロイン検出方法が原則的には提供できるで
あろう。残念ながら、現在入手可能な酵素活性の範囲は
どちらかと言えば限定されており、これらの酵素類は必
要な特異性を有していない。

発明の要約 我々は、ヘロイン（3,6−ジアセチルモルフィン）の
検出に使用できる２種の酵素類を現在見いだした。ひと
つは、ヘロインの加水分解を触媒するアセチルモルフィ
ンカルボキシエステラーゼ（以下、“AMCE"）であり、
ヘロインに対して高い特異性を有している。他は、モル
フィンに対して高い特異性を有するモルフィンデヒドロ
ゲナーゼ（“MDH"）であり、これは、ヘロインの加水分
解によって産生される。これらの酵素類のいずれかまた
は組み合わせた上記２者が、酵素をヘロインまたはその
加水分解によって得られたモルフィンと反応させ、そし
て、酵素触媒反応の出現を検出することによってヘロイ
ン検出に使用できる。本反応の検出の上記方法の１種
は、電気的である。１種の電気的方法において、ヘロイ
ンとAMCEとの反応によりアセテートイオン類が放出さ
れ、それらは、電気伝導度測定法で検出可能である。モ
ルフィンデヒドロゲナーゼ（MDH）とモルフィンとの反
応は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート（NADP＋）のような補因子を必要とし、本酵素によ
るモルフィンのモルフィノンへの酸化と同時にNADPHに
還元される。この酸化還元反応は、特に酸化還元メディ
エータの補助を得て電極表面において電流を発生させる
ために使用できる。したがって、本発明は、電気的セン
サー類、特にAMCEのみのための電気伝導型電気的センサ
ー類およびAMCEおよびMDH酵素類双方のための電流測定
型の電気的センサー類を含む。これらおよび他のセンサ
ー類は光学、電位差測定、熱または圧電型であることが
でき、密輸入者、麻薬買人およびヘロイン使用者の体
液、荷物、衣服等中のヘロイン粒子検出のための便利な
携帯用センサー類の基盤中のためにある。したがって、
本発明は、薬物使用に対する闘いおよびその使用制限に
重大な進歩をもたらす。

本明細書を通して使用する用語“ヘロイン”は、その
内容からしてさらに特殊な意味を必要とするのでなけれ
ば、その遊離塩基および塩類からなる。

第１の面において、本発明は、アセチルエステラーゼ
酵素を提供する。それはヘロイン（3,6−ジアセチルモ
ルフィン）、３−アセチルモルフィンおよび６−アセチ
ルモルフィンの加水分解を触媒するので、それはアセチ
ルモルフィンカルボキシラーゼ（AMCE）と命名するのが
便利である。したがって、ヘロインの６−アセチル基に
対してほとんどかまたは全く活性を示さない一般に入手
できるブタ肝カルボキシエステラーゼとは識別される。
本発明のAMCEの６−アセチル基に作用する能力は重要な
顕著な特性である。前記AMCEのもうひとつの顕著な特徴
は、それが（マーカータンパク質で校正したゲルろ過カ
ラムからの溶出によって決定されるように）約200,000
ダルトンの分子量を有することである。用語“約”によ
って、我々は、本方法による高分子量の決定で通常とな
っている変動を包含することを意味しており、10％まで
の変動を含むことを確かに意味している。200,000とい
うこのような天然のままの高分子量は、他のアセチルカ
ルボキシエステラーゼ類のそれとは異なっている；ノカ
ルジオホルム・アクチノマイセテスについて記載された
ものは、それぞれ分子量84,000および39,000であり（E.
F.Eubanksら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.Bacteriology）120,1133−1143,1974）、一方、バ
チラス・サチラス（Bacillus subtilis）に記載された
アセチルカルボキシエステラーゼ類は、それぞれ分子量
160,000および31,000を有している（J.B.Higerd＆J.Spi
zizen,ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacter
iology）114,1184−1192,1977）。ほ乳類カルボキシエ
ステラーゼ類は、165,000の領域に分子量を有している
（K.Kirsch、“カルボキシリックエステルヒドロラーゼ
（Carboxylic ester hydrolase）”、“エンザイムズ
（Enzymes）”、P.D.Boyer編著、第５巻、アカデミック
プレス社（Academic Press,Inc.）、ニューヨーク（New
York）、1971,43−69頁中）。

本発明のAMCEは、アルカリ性pHおよび広範囲のpH領域
において極めて活性であり、一方、他の微生物アセチル
カルボキシエステラーゼ類は、一般に低いpHで釣り鐘型
のpH活性プロフィールを示す。したがって、前記AMCE
は、８以上から10以下（８ or blow to 10 or abo
ve）のpHにおいて有意な活性を示す。

以下の実施例１は、前記AMCEの他の特徴を記載してい
るが、しかし、それを産生する微生物の増殖条件を変化
させることによってまたは本酵素の高度の精製によって
これらの一部を変化させることが可能であろうと予測さ
れる。したがって、最も一般的な本酵素の定義におい
て、６−アセチルモルフィンとよりも３−アセチルモル
フィンとの反応の速度が速いことまたは熱不活化の速度
というような特徴に依存しないことが望ましい。それら
のうちのいずれかひとつまたはそれ以上が（本文からわ
かるように）本酵素の定義の別の方法として考えられる
が、それらは上記で定義したものの１種以上よりも好適
で付加的な１種以上の特性と見るのが最善である。

前記AMCEは、天然から単離された菌株から得ることが
できる。この株は、属ロドコッカス（Rhodococcus）に
属し、本文で単に“ロドコッカス（Rhodococcus）H1"と
言われる。それは、特許手続き目的のための微生物寄託
物の国際承認に関するブダペスト協定（Budapest Trea
ty on the International Recognition of Depos
its of Microorganisms for the Purposes of P
atent Procedure）に基づき、特許寄託物として1989年
３月７日、ナショナルコレクションズ・オブ・インダス
トリアル・エンド・マリンバクテリア（National Coll
ections of Industrial and Marine Bacteria（NC
IMB））、23sT.Machar Drive,Aberdeen AB2 IRY,Scot
landに寄託番号NCIMB40120として寄託された。本菌は、
本発明のAMCEを産生するその突然変異体および変異株と
ともに、本発明の一部である。それは、炭素および窒素
源上でこのような細菌を培養することおよび破壊細胞か
ら本酵素を回収することによって産生でき、好適な炭素
源はヘロインからなる。本有機体は、唯一の炭素源とし
てのグルコース上で増殖するであろうが、細胞中ではよ
り低いAMCE活性をもたらす。

第２の面では、本発明は、モルフィンデヒドロゲナー
ゼ（MDH）酵素を提供する。本発明のMDHは数種の異なる
方法で定義できるが、請求の範囲の直前の明細書最終に
ある配列列挙の章のSEQUENCE（配列）ID1番として示さ
れるその部分的アミノ酸配列によっておそらく最もよく
定義される。タンパク質配列データベースPIRおよびDOO
LITTLEをFASTPプログラムによって検索し、いかなる有
意の配列相同性も明きらかとすることができなかった。

本発明のMDHは、これとは別にまたは付加的に、下記
の特性のいかなるものによっても特徴付けることが可能
である。補因子、特にNADP＋の補助によって、それは、
モルフィンをモルフィノンに酸化する。それは、コデイ
ンおよびエチルモルフィンを酸化する。それは、ヘロイ
ンまたは同様の環構造の多くの他のアルカロイド類で
は、いかなる有意の酵素活性も有していない。AMCEと同
様に測定したその分子量は、約32,000ダルトンである。
本酵素の至適活性はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
中で高pHで示され、当初は約10であると推定されたが、
現在はより正確に約9.5と決定されている。

以下の実施例２および４はMDHの他の特徴を記載して
いるが、それを産生する微生物の増殖条件を変化させる
ことによってまたは組換えDNA技術によってこれらの一
部を変化させることが可能であろうと予測される。した
がって、最も一般的な本酵素の定義において上記の特徴
に依存しないことが望ましい。それらのうちのいずれか
ひとつまたはそれ以上が、（本文からもわかるように）
本酵素の定義に使用される別のパラメータ、特に4.2の
等電点が考えられる（実施例４参照）が、それらは上記
で定義したものの１種以上よりも好適で付加的な１種以
上の特性と見るのが最善である。

MDHは、天然から単離され本文で“M10"と命名された
菌株シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）か
ら得ることができる。本細菌のブタペスト協定特許寄託
が、1989年３月７日、番号NCIMB40119として寄託され
た。本菌は、本発明のMDHを産生するその突然変異体お
よび変異株ともに、本発明に含まれる。シュードモナス
・プチダ（P.putida）M10はヘロインをモルフィンにモ
ルフィンをモルフィノンに変換し、第１段階を実行する
ためにアセチルカルボキシトランスフェラーゼを産生
し、かつ、第２段階を実行するためにMDHを産生する。
シュードモナス・プチダ（P.putida）M10は極めて低い
活性のアセチルカルボキシエステラーゼを産生するの
で、ヘロインセンサーに使用するためには大して関心事
ではない。むしろ、本発明の極めて重大でかつ貴重な特
徴によれば、前記AMCEは反応図： に従いヘロイン検出のためにMDHと結合される。

モルフィンまたはその低級アルキル基が１個乃至４個
の炭素原子を有するその３−（低級アルキル）エーテル
をMDHおよび上記に述べたような補因子の存在下におい
て酵素的に酸化することが初めて可能となる。この酸化
は、好適には、空気中でかつ25から35℃で行われる。反
応産物、特にモルフィノンおよびコデイノンは、鎮痛剤
として有用である。

図面の簡単な説明 第１図は、前記AMCEのクロマトグラフィ精製における
重要段階の過程をプロットしたものである（実施例１参
照）； 第２図は、前記AMCEのクロマトグラフィ精製における
その後の段階の過程をプロットしたものである（同様に
実施例１参照）； 第３図は、前記MDHのクロマトグラフィ精製における
重要段階の過程をプロットしたものである（実施例２参
照）； 第４図は、モルフィンからモルフィノンへの酸化反応
による電子類の電極への媒介移行を概略示したものであ
る（実施例７参照）； 第５図は、MDHを用いたモルフィン用電流測定センサ
ーにおいて、種々の濃度のモルフィンにおいて時間に対
する静止状態電流応答のグラフである（実施例７参
照）；および 第６図は、本発明の方法による検出用に試料を提供す
るために、ヘロインの試料採取装置の立面図略図であ
る。

好適な実施例の説明 本発明の両酵素類は、炭素および窒素源上でそれぞれ
の微生物類を培養することによって産生できる。いかな
る従来の栄養源も使用することができるが、ヘロインか
らなる炭素源上でロドコッカス（Rhodococcus）H1を増
殖させかつヘロインまたはモルフィンからなる炭素源上
でシュードモナス・プチダ（P.putida）M10を増殖させ
ることが望ましい。ロドコッカス（Rhodococcus）H1は
炭素源としてグルコース上で増殖するが、本細胞のAMCE
活性は、ヘロイン上で増殖させたときよりも低い。MDH
は本質的に産生され、したがって、シュードモナス・プ
チダ（P.putida）M10はグルコース上で培養でき高活性
のMDH調製物を産生する。両微生物にとって、培養は好
気的であるのが好ましい。20から40℃の範囲内の好適に
は25から35℃のいかなる温度も使用できる。本酵素を得
るために、前記細胞はいかなる従来の方法でも破壊でき
る。好適には、細胞を全く含まない抽出物が作製され
る。本酵素は、次に、細胞または抽出物から回収され
る。

寄託した通りの出発有機体の代わりに、例えばγ線照
射または化学的変異体の使用、別の培地における培養に
よる誘導等から由来する変異体または別の細菌とのトラ
ンス接合体または人工的に産生した変異株が使用でき
る。

本酵素またはその一時変異体の一部も、当該技術で十
分に認知された方法を用いて組換えDNA技術によって作
製可能である。これらは、別の宿主有機体中で本酵素を
産生させることを含むことができる。

本発明の酵素類は、ヘロインの検出において主に有用
である。好適な方法は、両酵素の同時使用、ヘロインも
モルフィンに分解するAMCEおよびこのモルフィンを酸化
するMDHの使用を含み、後者の反応は、補因子を必要と
する。これとは別に、AMCEは、それ自体の故に使用でき
る。また、MDH補因子系は、モルフィン検出のためにそ
れ自体で使用可能である。

本発明は、特に、粉末ヘロインまたはモルフィン（遊
離塩基またはそれらの塩類のいかなるもの）の粒子の検
出に適用可能である。本薬物を含有する試料類は荷物、
貨物からまたは人の回りから、影響を受けた周囲にエア
を吹き付け、この空気を採取し、そしてその中に含有さ
れる粒子類を濃縮することによって採取できる。適切な
装置は、第６図に概略図示してある。荷物２のプラスチ
ック表面に静電気的に捕捉されるようになった薬物粒子
類１を除去するために、最初に空気をニュートラライザ
ーユニット３中を通過させ、正および負に価電されたイ
オン類を産生させる。これは、例えば²¹⁰Po放射線源
（図示せず）などのいかなる従来方法によってでも発生
させることができる。イオン化された空気は、次に流路
４を通って荷物２中に加圧下に送られる。荷物内のプラ
スチック表面に捕捉された薬物粒子類は、それによって
電気的に中和される。空気は、流路５を介して荷物から
穏やかに吸引されることによって、薬物粒子類１を含有
しながら排気される。排気された空気中のこれらの薬物
粒子類は、集中されそして濃縮される。これは、空気イ
オン化装置６の補助によって粒子上に負の電荷を付与す
ることおよびそれらをバイオセンサーのアース付き電極
７上に集めることによって行うことができる。イオン化
装置６および電極７の代わりに、目的とする検出方法に
応じてこの粒子は超微細ふるい上にまたは例えば綿羊毛
の多孔性プラッグ内部に採取することができる。

本発明は、また、生物体液、特に尿および血液中でヘ
ロインまたはモルフィンを検出するために適用すること
が可能である。ヘロインは、インビボでモルフィンに加
水分解されそしてそれ故にMDHの使用は、このような検
出に適切である。

ヘロインのAMCEによる加水分解は、水性媒体中で行わ
れなければならない。本酵素または試料または両者が接
触の直前に水性媒体中にあるべきである。この水性媒体
は、（酸添加塩としての）前記ヘロインを可溶化するた
めにおよび酵素活性を与えるために使用される。固体粒
子類の検出のため、本酵素を湿潤組成物中に導入するこ
とがしばしば便利である。したがって、例えばバイオセ
ンサーを固体粒子類の検出のために使用する場合、この
バイオセンサーの試料採取表面を湿潤組成物中の本酵素
（類）で前被覆させる。試験片が使用される場合、同様
に、この試験片支持体を本酵素含有湿潤組成物で被覆す
る。試料装置からの空気フローによって起きる脱水から
本酵素を防御するために湿潤剤が望ましい。

検出方法は、例えばヘロインの加水分解によって放出
されたアセテートイオン類を検出するために伝導度に依
存することができる。この場合、湿潤剤は、試料採取時
におこるかもしれない周辺環境中における相対湿度の変
化によってそれほど悪影響を受けない安定な初期伝導度
レベル（ブランク読み取り値）を達成するようなもので
あるべきである。したがって、それは、当然、異なる諸
国で遭遇する種々の気象条件におけるこのバイオセンサ
ーの使用を可能とする。

電気伝導度測定法のために、適切に緩衝された塩化ナ
トリウム入りグリセロールのような単純で廉価な湿潤剤
が適切である。この緩衝液がイミダゾールであるのが好
適である。本組成物が（重量で）グリセロール70から90
％、塩化ナトリウム２から３％および例えばpH7.5など
の必要なpHに適した２ミリモルのような濃度の水性イミ
ダゾール17から７％を含有することが望まれる。特に、
（重量で）2mM水性イミダゾール約10％、約87.5％グリ
セロールおよび約2.5％塩化ナトリウム溶液からなる組
成物が好適である。

他の検出操作のため、他の湿潤剤類および緩衝液類も
使用できる。したがって、電流測定方法において、50mM
グリシン／水酸化ナトリウム、pH10がイミダゾールに置
換できる。これとは別に、ポリビニルピロリドン、緩衝
液および塩化ナトリウムが使用できる。

電気伝導度測定バイオセンサーの操作の原則は、電解
質中において１対の電極類を横断して電場をかけること
を含む。この電場は、望ましくないファラディープロセ
ス、二重層電荷および電極表面における濃縮分極を最小
とするかまたは消失させるために、電極を横断してサイ
ン電圧波形を適用することによって発生させることがで
きる。アセテートイオン類によって発生した小伝導を正
確に検出するために、比較回路を導入することが必要で
ある。好適には、実施例５に記載したようなオーウェン
（Owen）型のブリッジ回路が使用される。もちろん、こ
のアセテートイオン類は、電気伝導度測定法で検出され
る必要はない。

さらに好適には、前記加水分解によって放出されたモ
ルフィンが検出される。特に、両酵素類が使用され、そ
してヘロインは次に電流測定法によって検出される。電
流測定法による検出は、補因子の電気化学的な同時還
元、特にNADP＋のNADPHへの同時還元を介したモルフィ
ンのモルフィノンへの酸化を使用し、電子を電極に移動
しそしてその後外部電気回路に移動することに依存して
いる。移動のひとつの方法として、図面の第４図に例示
したようにメディエータを介するものがある。多くのメ
ディエータ類が、本酵素の補因子が再酸化されかつこれ
らのほとんどが本例で作用可能であるこの一般的な反応
型に付いて周知となっている。例として、ヘキサシアノ
フェレートイオン類、フェナジンメトサルフェートまた
はエトキシサルフェート、フェロセン／ジアフォラーゼ
または４−メチルキノンが挙げられる。電子類の化学反
応から電極への移動のための通常の電気化学的セル配置
のいかなるものも使用可能である。補因子は、NADP＋ま
たは３−アセチルピリジンADPのようなそのいかなる作
用可能アナログでも有り得る。NAD＋およびニコチンア
ミドヒポキサンチンジホスフェートは、現在まで試みら
れた条件下において作用可能であるとは判明していな
い。

したがってヘロイン検出における使用のための好適な
組成物は、（１）前記AMCE、（２）MDHおよび（３）前
記MDHのための補因子、特にNADP＋からなる。検出の方
法に応じて、本組成物は、また、湿潤剤またはメディエ
ータを含むことが適宜可能である。

この２酵素方法において、最適なヘロイン分解アセチ
ルカルボキシエステラーゼは本発明のそれであると確信
されているが、原則として他のこのようなアセチルカル
ボキシエステラーゼ類を使用することが可能である。こ
のようなアセチルカルボキシエステラーゼがシュードモ
ナス・プチダ（Pseudomonas putida）株“M10"に存在す
ることは明きらかであり、その理由としてこの菌がヘロ
インからモルフィンを産生できるからであるが、しか
し、その活性は低いようである。

本発明は、特に、MDH、そのための補因子および（通
常）メディエータを含有する電解質に接触する検出用電
極、標準電極および対向電極からなる電流測定バイオセ
ンサーを含む。電流が小さい時、この対向電極がまた標
準電極として作動する。また、AMCE含有電解質と接触し
ている１対の電極類からなる電気伝導度測定バイオセン
サーを含む。このバイオセンサーの電極類および外部回
路は、本例と同様に電流の電気伝導度測定または電流測
定検出に適するようなものである。

MDH反応は、また、種々の方法で分光法で検出可能で
ある。１つの面によれば、モルフィンの酸化は、色の変
化またはUV吸収の変化が起こるような酸化還元反応を起
こすために使用される。したがって、補因子自体は、特
に約340nmにおける吸光度の増加としてNADP＋NADPHへの
還元を観察することによって本反応を検出するために使
用できる。これとは別に、この補因子の酸化還元反応
は、色変化が起きるこのような反応１種以上からなる酸
化還元反応または“系”を誘発するために使用できる。
例えば、フェナジンメトサルフェートをメディエータと
して使用し、ニトロブルーテトラゾリウムをホルマザン
に還元し、青紫色を得る。ニトロブルーテトラゾリウム
の代わりに、トリフェニルテトラゾリウムクロリド、ヨ
ードニトロテトラゾリウムクロリド、ネオテトラゾリウ
ムクロリドまたは2,6−ジクロロフェノールインドフェ
ノールが使用できる。

本発明の他のセンサーの中で、光学的トランスジュー
サー（例えば、光学ファイバー）または熱トランスジュ
ーサ（例えば、サーミスター）、または電位差測定また
は圧電トランスジューサが本酵素と作用関係におかれ
る。

下記の実施例は、本発明を例示するものである。“セ
ファデックス（Sephadex）”、“セファセル（Sephace
l）”、または“ミメティック（Mimetic）”は、多くの
国の登録商標である。

実施例−１菌株“ロドコッカス（Rhodococcus）H1"から
のアセチルモルフィンカルボキシエステラーゼの調製 材料および方法 微生物類 微生物ロドコッカス（Rhodococcus）H1は、単一の炭
素源としてのヘロインを濃厚にすることによって、ケン
ブリッジ（Cambridge）の庭土壌から単離した。

J.A.Barnet＆M.Ingram、ジャーナル・オブ・アプライ
ドバクテリオロジー（Journal of Applied Bacterio
logy），18,131−148（1955）に記載のように、ロドコ
ッカス（Rhodococcus）H1の培養物を、微量元素含有１
リットル当たり（NH₄）₂SO₄（0.5g）、K₂PHO₄（2.0
g）、KH₂PHO₄（0.2g）およびMgSO₄（0.05g）からなる規
定の最小培地50mlに5mMグルコースおよび5mMヘロインを
添加したものを含有するエーレンマイヤー（Ehrlenmeye
r）フラスコ250ml中で増殖させた。（注意：本菌は、低
収率のバイオマスを付与するであろうが、10mMヘロイン
上で単独で増殖させると、高比活性のAMCEを付与するで
あろう）。振とう培養器中で30℃で増殖を48時間行った
後（180rev/分）、フラスコ内容物を同培地750mlを含有
する２リットルのエーレンマイヤーフラスコ中に無菌的
に注いだ。本培養物を48時間インキュベートした。菌の
大量調製のためには、２リットルフラスコの内容物を、
無菌培地9.25リットルを含む10リットルの培養容器用に
接種物として使用した。大量培養物は30℃でインキュベ
ートし、強制通気下に48時間または炭素源の80−85％が
利用されるまで行った。

0.5g/ml濃度のセルペーストを緩衝液Ａ（50mMリン酸
カリウム緩衝液混合液、pH7.0,1mMジチオスレイトー
ル）中に再懸濁することによって、細胞を含まない抽出
物を調製した。この細胞懸濁物を破砕氷浴中で冷却し、
15秒の数期間、総計３分の超音波破砕時間にわたりピー
ク対ピークで10μｍの強さのソニプレップ（Soniprep）
150MSE ウルトラソニックディスインテグレータ（Ultr
asonic Disintegrator）中で超音波破砕した。菌抽出物
を、ソーバル（Sorval）RC−5C遠心分離器中で15分間、
30,000g、４℃で８×50ローターを用いて遠心分離し、
非破壊細胞および残渣を除去した。

化学試薬 ３−アセチル−および６−アセチルモルフィンは、モ
ルフィンおよびヘロインから、それぞれ、L.E.Welsh,ジ
ャーナル・オブ・オーガニックケミストリ（J.Org.Che
m.）19,1409−1415（1954）およびC.I.Wright,ジャーナ
ル・オブ・ファーマコロジー・エンド・エクスペリメン
タルセラピューテックス（J.Pharmacol.Exp.Therap.）7
1,164−168（1941）の方法にそれぞれ従い、調製した。
他の化学試薬類は、市販されているかまたは公知の方法
によって容易に調製可能である。

酵素アッセイ エステラーゼ活性は、２種の分光法によってアッセイ
した。第１のアッセイでは、フェニルアセテートを基質
として使用した。本反応は30℃に維持し、フェノールの
形成を275nmのUV吸光度によってモニターした。この反
応混合物は、全量2ml中にpH7.5の50mMトリス塩酸緩衝液
混合物、4mMフェニルアセテートおよび酵素を含有して
いた。第２のエステラーゼ活性モニターのための分光法
はpH指示薬色素ブロモクレゾールパープルを使用し、そ
の理由として、ジアセチルモルフィンの酵素加水分解に
よって緩衝性に劣るアッセイ混合物のpHは急速に低下す
ることが挙げられる。ブロモクレゾールパープル（0.1
g）は、0.01N NaOH溶液16ml中に溶解させ、精製水で全
量250mlとした。588nmにおける吸光度の変化を、反応速
度として測定した。全量1mlの反応混合物は、2mMイミダ
ゾール緩衝液pH7.0、2mMジアセチルモルフィン、10μ
ブロモクレゾールパープル溶液および酵素を含有してい
た。第３の酵素アッセイは、ジアセチルモルフィン、６
−アセチルモルフィンおよびモルフィンのHPLCによる分
離であった。溶媒系は、J.G.Umans,ジャーナル・オブ・
クロマトグラフィ（Journal of Chromatography）23
3,213−225（1982）によって記載されたものである。本
反応混合物は、pH7.5の50mMトリス塩酸緩衝液混合物2ml
中に1mMヘロインおよび酵素を含有していた。30℃で振
とう水浴中でインキュベートしたアッセイ混合物から、
アリコット200μを時間間隔で除去し、本反応を濃酢
酸５μ添加によって停止させ、タンパク質沈澱物をミ
クロフュージ（Microfuge）中で遠心分離によって除去
し、その後、上清の試料（50μ）をHPLCによって分析
した。

酵素活性の単位は、１分間にフェニルアセテート１μ
モルをフェノールに加水分解するために必要な酵素量と
して定義した。

酵素アッセイに使用した抽出物中のタンパク質は、M.
M.Bradford,アナリティカル・バイオケミストリ（Analy
tical Biochemistry）72,243−254（1976）の方法によ
って測定した。

AMCEの精製 粗抽出物を、抽出前に４℃で解凍したジアセチルモル
フィン増殖凍結細胞19g（湿潤重量）から調製した。細
胞を緩衝液Ａ中に再懸濁した。この細胞懸濁物を破砕氷
浴中で冷却し、15秒の数期間、総計３分の超音波破砕時
間にわたりピーク対ピークで10μｍの強さのソニプレッ
プ（Soniprep）150MSE ウルトラソニックディスインテ
グレータ（Ultrasonic Disintegrator）中で超音波破砕
した。菌抽出物を、ソーバル（Sorval）RC−5C遠心分離
器中で15分間、30,000g、４℃で８×50ローターを用い
て遠心分離し、非破壊細胞および残渣を除去した。

1.硫酸ストレプトマイシン 細胞抽出物1ml当たり硫酸ストレプトマイシン0.1mlが
添加されるまで、中和した10％（w/v）硫酸ストレプト
マイシン溶液を常に攪拌しながら粗抽出物33mlに滴下し
た。４℃で５分間攪拌した後、核酸沈澱物を遠心分離に
よって除去した。

2.DEAEセファセル（Sephacel）イオン交換クロマトグラ
フィ ストレプトマイシン処理調製物を、事前に緩衝液Ａで
平衡にしたDEAEセファセルカラム（2.5×30cm）にのせ
た。カラム上へ吸着させた後、280nmにおける吸光度が
溶出液中にもはや検出されなくなるまで本試料を0.1M
NaCl含有緩衝液で十分に洗浄し、多量の夾雑するタンパ
ク質からそれを精製した。AMCEは、0.1M−1.0M NaClで
流出する直線勾配で緩衝液A400mlで溶出した。分画8ml
を、流速18ml/hで採取した。本酵素は、約0.25MのNaCl
で溶出した。クロマトグラフィの経過を、エステラーゼ
活性は白丸で、タンパク質含量は黒丸で第１図に示し
た。エステラーゼ活性のピークは、実質的に少量のタン
パク質含量ピーク内の分画50−56に出現した。

3.セファデックス（Sephadex）Ｇ−150ゲルろ過 最大エステラーゼ活性を含有するイオン交換カラムか
らの分画をひとまとめにし限外ろ過によって5mlまで濃
縮した。濃縮物を次に、事前に緩衝液Ｂ（50mM MOPS,p
H7.5）で平衡にしたセファデックスＧ−150カラム（1.5
×75cm）にのせた。流速は10ml/hに保持し、そして、6m
lの分画を採取した。クロマトグラフィの経過を第２図
に示し、その中でエステラーゼ活性は白丸で、タンパク
質含量は黒丸で示してある。エステラーゼ活性のピーク
は、２番目の広いタンパク質含量ピークの内部の分画14
−19に出現した。

4.FPLCモノＱクロマトグラフィ 最大エステラーゼ活性を含有するセファデックスＧ−
150カラムからの分画をモノQHR5/5カラム（ファルマシ
ア（Pharmacia））上にのせた。このカラムは事前に緩
衝液Ｂで平衡としておいた。カラムを280nmにおける吸
光度が溶出液中にもはや検出されなくなるまで緩衝液Ｂ
で洗浄し、次に本酵素を０−1M NaClで流出する直線勾
配の緩衝液Ｂ 20mlで溶出した。分画1mlを、流速1ml/h
で採取した。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE） PAGEは、U.K.Laemmli、ネーチャー（Nature）227,680
−682（1970）の方法に従って分解ゲル中に11％（w/w）
アクリルアミドを含有する1mm厚の垂直スラブゲル（バ
イオラド（Bio−Rad））上で行った。タンパク質は、こ
のゲルを３時間、メタノール−水−酢酸（容量で4:5:
1）からなる溶媒系に溶解したクーマシーブリリアント
ブルー（Coomassie Brilliant Blue）R250で染色するこ
とによって、検出した。ゲルは、上記の溶媒混合物中で
繰り返し洗浄することによって拡散脱色し、この染色剤
を溶媒中に溶液として拡散させた。

結果 ヘロインを単一炭素限とする単離物ロドコッカス（Rh
odococcus）H1の増殖は、グルコース上での増殖で観察
されるものに比べて約15倍高い比活性（単位/mgタンパ
ク質で示した）のAMCEを産生した。

本酵素は、電気泳動上均質となるまで上記の操作によ
って（比活性の観点からして200倍以上）高度に精製し
た。段階１−３は、約15倍の精製を達成し、段階４（モ
ノＱクロマトグラフィ）は、さらに18倍を達成した。本
酵素は、PAGEに供したときに均質であった。

至適pH AMCEは、フェニルアセテート基質を用いて、トリス塩
酸緩衝液中で7.0から9.5の広い至適pH範囲を有してい
る。このプラトー状pH活性関連は、AMCEが例えば9.5か
ら10の高いpHで使用できることが確認され、このこと
は、AMCEおよびMDHの併用において特に有益である。リ
ン酸カリウム緩衝液は、エステラーゼ活性に阻害効果を
有するように見える。

温度の効果 本酵素（60μｇ）をpH7.0の50mMリン酸カリウム緩衝
液中で40℃でインキュベートし、その活性を時間に対し
てプロットした。グラフから、それが、40℃において14
分の半減期を有することが推定された。

AMCEの基質特異性 AMCE活性の３−アセチル−および６−アセチルモルフ
ィンとの比較を、pH7.5のリン酸カリウム緩衝液3mlおよ
び精製酵素（5U）含有反応混合物中において1.0mMの濃
度の各化合物で検討した。この反応混合物を30℃の振と
う水浴中でインキュベートし、試料200μを一定時間
間隔で除去し、本反応を濃酢酸５μ添加によって停止
させた。試料を次に遠心分離し、全てのタンパク質沈澱
物をし除去した。アリコット50μをHPLCによって分析
した。アセチルエステラーゼは、３−アセチルモルフィ
ンを迅速にモルフィンに加水分解した。６−アセチルモ
ルフィンはまたAMCEの基質でもあるが、加水分解の速度
は、その３−アセチルアナゴルのそれに比べて極めて遅
かった。したがって、基質濃度を20％低下するために必
要な時間は、３−アセチルモルフィンで２分、６−アセ
チルモルフィンで４時間であった。

分子量 天然の本酵素の分子量は、Andrews,バイオケミカルジ
ャーナル（Biochem.Journal）91,222−223（1964）の方
法によって、マーカータンパク質の校正によるセファク
リル（Sephacryl）Ｓ−200カラム（1.5×75cm）上にお
ける測定から決定した。カラムをpH7.5の20mMトリス塩
酸で平衡とした後、精製酵素含有溶液をベッド表面にの
せ、流速4ml/hで平衡緩衝液で溶出し、分画1.5mlを採取
した。AMCEの溶出容量は、分子量200,000に対応した。

実施例２−シュードモナス・プチダ（Pseudomonas puti
da）M10からのモルフィンデヒドロゼナーゼ（MDH）の単
離 材料および方法 微生物類 出発微生物M10は、ヘロインを濃厚にすることによっ
て、産業廃棄物酒精から単離した。参考目的のため、他
のシュードモナス（Pseudomonas）菌についても検討し
た。これらは、Judith Greenland、デパートメント・オ
ブ・バイオケミストリ（Department of Biochemistr
y），ユニバーシティー・オブ・ケンブリッジ（Univers
ity of Cambridge），英国（England）から供与を受
けたシュードモナス・プチダ（P.putida）ATCC17464、
シュードモナス・テストステロニ（P.testosteroni）AT
CC17454およびシュードモナス・フルオレセンス（P.flu
orescens）、NCIMB9815およびシュードモナス・アエル
ギノサ（P.aeruginosa）株Ｋ ATCC25102であった。

シュードモナス・プチダ（P.putida）M10の培養物を
増殖させ、細胞を含まない抽出物を実施例１のロドコッ
クス（Rhodococcus）H1として調製した。

化学試薬 ３−アセチル−および６−アセチルモルフィンは、モ
ルフィンおよびヘロインからそれぞれ、L.E.Welsh,ジャ
ーナル・オブ・オーガニックケミストリ（J.Org.Che
m.）19,1409−1415（1954）およびC.I.Wright,ジャーナ
ル・オブ・ファーマコロジー・エンド・エクスペリメン
タルセラピューティックス（J.Pharmacol.Exp.Thera
p.）71.164−168（1941）の方法にそれぞれ従い、調製
した。他の化学試薬類は、市販されている。

３−アセチル−、６−アセチルモルフィン、モルフィ
ン、ヘロイン、コデインおよびコデイノンの分解および
同定は、ウォーターズ（Waters）740データモジュール
（Data Module）に連結したウォーターズ（Waters）450
システム上で218nmにおけるHPLC分析によって決定し
た。25cm長さのカラムは、５μスフエリソルブ（Spheri
sorb）−ODS（Ｃ−18）逆相充填物を含有していた。溶
媒系は、J.G.Umans,ジャーナル・オブ・クロマトグラフ
ィ（Journal of Chromatography）233,213−225（198
2）によって記載されたものであった。

酵素アッセイ MDHは、2mMモルィンまたはコデイン、2mM NADP＋お
よび酵素を最終容量1ml中に含有するpH10の50mMグリシ
ン−NaOH緩衝液中で340nmにおけるNADP＋の還元を追跡
することによって、紫外線分光法によって測定した。酵
素活性の単位は、NADP＋１μmolを１分間に還元するた
めに必要な酵素量として定義した。

酵素アッセイに使用した抽出物中のタンパク質は、M.
M.Bradford,アナリティカルバイオケミストリ（Analyti
cal Biochemistry）72,243−254（1976）の方法によっ
て測定した。

MDHの精製 1.硫酸ストレプトマイシン：実施例１における通り。

2.DEAEセファセルイオン交換クトマトグラフィ：実施例
１における通り。クロマトグラフィの経過を図面の第３
図に示し、タンパク質を白丸で、単位/mlにおけるMDH活
性を黒丸で示した。酵素活性は、直線的塩勾配で0.37M
NaClで溶出した。

3.セファクリルＳ−300ゲルろ過：実施例１におけるセ
ファデックスＧ−150ろ過用と同じ。分画28−60はタン
パク質を含有しており、分画32および42周辺においてピ
ーク類が得られた。分画35−55はMDH活性を示し、ピー
クは分画44周辺にあった。

結果 スクリーニングした全てのシュードモナス類は、ヘロ
インを消費することによって増殖する能力を保有してい
た；しかし、それらが単一の炭素源として供給されたと
きにシュードモナス・プチダ（P.putida）M10のみがモ
ルフィンおよびコデインを分解した。さらに、これらの
化合物類の代謝時において、倍地は漸次黒くなってい
た。ヘロインを消費して増殖したシュードモナス・プチ
ダ（P.putida）M10の洗浄細胞によるヘロイン代謝は、
インキュベーション混合物からの基質類の消失をHPLCに
よって測定することによって直接試験した。ヘロイン上
で増殖した細胞類は、容易にモルフィン、コデインおよ
びエチルモルフィンを代謝した。しかし、テバインは、
全く代謝されなかった。シュードモナス・プチダ（P.pu
tida）M10がグルコースを消費し増殖したときに、モル
フィンアルカロイド類の分解は全く検出されなかった。

ジアセチルモルフィン代謝における初期段階 HPLC分析および認定標準化合物類を参考にすることに
よって、ヘロインの両アセチルエステル基類が、ヘロイ
ン消費で増殖したシュードモナス・プチダ（P.putida）
M10の洗浄全細胞によって加水分解されることがわかっ
た。細胞抽出物によるその後の実験で、エステラーゼ酵
素がヘロインを６−アセチルモルフィンに加水分解し、
その際にモルフィンへのその後の加水分解を触媒した。
いかなる微量の３−アセチルモルフィンも集積しないこ
とが判明した。細胞を全く含まない抽出物をこの反応混
合物中において沸騰細胞抽出物で置換すると、ヘロイン
の６−アセチルモルフィンへのゆっくりした加水分解の
みが起こった。シュードモナス（Pseudomonad）の各株
について、ヘロインによる増殖後、アセチルカルボキシ
エステラーゼ活性をスクリーニングした。各場合におい
て、アルカロイド基質による増殖が、グルコース増殖細
胞抽出物で見られたものに比較して増強されたエステラ
ーゼ活性を導入した。

モルフィンのそれ以上の代謝 増殖基質としてのジアセチルモルフィンで増殖したシ
ュードモナス・プチダ（p.putida）M10の細胞からの粗
抽出物は、高い濃度の粗抽出物タンパク質が使用された
時でさえもモルフィンまたはコデインのいずれに対して
もいかなる活性も示さなかった。この抽出物類は、NADP
＋の絶対的必要性を示した;NAD＋は、基質であるとは示
されなかった。活性は、粗抽出物がこの反応混合物中に
おいて沸騰抽出物と置換された時にも観察されなかっ
た。

MDHは、DEAEセファセル上における陰イオン交換クロ
マトグラフィとその後のセファセルＳ−300におけるゲ
ルろ過クロマトグラフィによって（単位/mlタンパク質
におけるその比活性の観点から）100倍に精製されるこ
とが判明した（第３図）。本酵素は電気泳動的に均質で
あるとは判明しなかったが、モルフィノンはそれ以上分
解せず、したがって、他のモルフィンが分解経路の酵素
類が除去されたことを示唆している。

至適pH pH範囲７から11までのpHが酵素活性に及ぼす効果か
ら、モルフィンに対する至適活性がグリシン−NaOH緩衝
液混合物中においてpH10で示された。比活性は、10.5以
上のpH値において低下した。より高度に精製された実施
例４で調製された材料は、pH9.5において至適活性を示
した。

シュードモナス類（Pseudomonads）における新規デヒド
ロゲナーゼ酵素の誘導 シュードモナス・プチダ（P.putida）M10および標準
シュードモナス（pseudomonads）について、NADP＋依存
性MDH活性をスクリーニングした。細胞を、グルコース
（5mM）添加（ａ）ヘロイン（10mM）、（ｂ）モルフィ
ン（5mM）または（ｃ）グルコース（10mM）上で増殖さ
せ、各“M10"は、それぞれ、0.65,0.02および0.39のMDH
活性を示した。一方、他のシュードモナス（Pseudomona
ds）の全ては、あらゆる場合において全くMDH活性を示
さなかった。

モルフィンおよびコデイン分解の一次反応産物の同定 シュードモナス・プチダ（P.putida）M10によるモル
フィンまたはコデイン代謝の分解産物を決定するため
に、pH10.0の25mMグリシン−NaOH緩衝液50ml中のアルカ
ロイド（100μmol）を、高度に精製した酵素（4U）とと
もに30℃で３時間インキュベートした。このインキュベ
ーションの間、アリコット300μを時間間隔で本反応
混合物から除去し、本反応を濃酢酸５μ添加によって
停止させた。試料を次に遠心分離し、全ての沈澱タンパ
ク質をペレットとし、上清50μをHPLCによって分析し
た。コデインの酵素分解産物を、認定標準化合物を参考
としてコデイノンとして同定した。本化合物のアイデン
ティティ（身元）を確認するために、濃NaOH添加によっ
てこの反応混合物をアルカリ性とし、次にエチルアセテ
ート３×100ml容量で抽出した。エチルアセテート抽出
物は、無水MgSO₄で乾燥し、溶媒をインバキュオで蒸発
させ、少量の油状残渣を残した。この油状物を次に少量
のクロロホルムに溶解し、そして、溶媒Ａ｛容量でクロ
ロホルム：メタノール、80:20｝および溶媒Ｂ｛容量で
エチルアセテート：メタノール：水：アンモニア、85:1
0:3:1｝でシリカプレート上で薄層クロマトグラフィで
分解した。コデインおよびコデイノンは標準物質として
使用し、反応産物類の同定を補助した。この反応産物は
容易に２成分に分解し、溶媒Ａにおいて0.41および0.48
および溶媒Ｂにおいて0.24および0.27のRf値であった。
Rf値0.48および0.27の本化合物は、認定されたコデイノ
ンのRf値と同一であった。Rf値0.41および0.24の第２の
化合物は、未変換コデインに対応する。

コデイノンに対応する化合物は、溶媒Ａ中におけるシ
リカプレート上（1000μm,ホワットマン（Whatman））
での調製薄層クロマトグラフィによって精製した。コデ
イノンバンドはプレートからかきおとし、メタノールで
溶出した。メタノールは、40℃以下の温度でロータリー
エバポレーションによって除去した。残渣を次にクロロ
ホルムに溶解しそして赤外スペクトルを検討した。クロ
ロホルム中で測定した反応産物の赤外スペクトルは、カ
ルボニル基により1685cm^-1で強い吸収バンドを示し、こ
れは、認定されたコデイノンのスペクトルに一致してい
る。

コデインを反応混合物中でモルフィンに置換したと
き、単離産物は、それぞれ溶媒ＡおよびＢ中においてRf
値0.32および0.12を有していた。CDCl₃中における本化
合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルは、またモルフィ
ノンの構造に一致していた。（トリメチルシランに対す
る）その主な特徴は、下記の通りであった。6.0δにお
ける１組の二重項は、Ｃ−１およびＣ−２における２個
のプロトン類の芳香AB系に帰せられた。4.7δにおける
１重項は、Ｃ−５におけるプロトンに帰せられた。Ｃ−
６におけるカルボニル基は、関連炭素原子（Ｃ−７およ
びＣ−８）に結合した水素原子類の化学シフトに顕著な
変化をもたらす。このことから、芳香AB系の１組の二重
項とＣ−８におけるプロトンにより6.6δにおける多重
項の重なりが説明される。6.12δにおけるシグナルは、
Ｃ−７上におけるプロトンに帰せられる。

モルフィンデヒドロゲナーゼによるステロイド類の非酸
化 ステロイドデヒドロゲナーゼ活性は、標準的アッセイ
においてモルフィンをテストステロンまたはアンドロス
テロンのいずれかと交換したときに全く検出されなかっ
た。ステロイドデヒドロゲナーゼ活性は、NAD＋が反応
混合物中においてNADP＋に交換したときに全く検出され
なかった。

シュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas test
osteroni）由来β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼは、モルフィンに対する活性を有する唯一のこれま
で記載されたオキシドレダクターゼ酵素である。Liras
ら、アプライドマイクロバイオロジー（Applied Microb
iology）30,262−266（1975）。残念ながら、この酵素
は、コデインをコデイノンに変換するために必要な大量
の酵素（80U/ml以上）によって示唆されたようにモルフ
ィンまたはそのアナログ類に対するその極めて低い活性
のために電流測定センサーに使用するためには不利であ
る。シュードモナス・プチダ（P.putida）M10のモルフ
ィンデヒドロゲナーゼがシュードモナス・テストステロ
ニ（P.testosteroni）のステロイドデヒドロゲナーゼと
異なることは明白である。

実施例３ 実施例２を繰り返したが、前記MDHはさらに精製し
（実施例２に示した段階１から３以上）そしてさらに試
験した。

材料および方法 モルフィンデヒドロゲナーゼのそれ以上の精製 4.FPLCモノＱクロマトグラフィ 実施例１の通り。

5.セファクリルＳ−300ゲルろ過 モノＱカラムからの最大MDH活性を含有する分画をひ
とまとめにし、限外ろ過によって5mlにまで濃縮した。
この濃縮物を、次に、事前に緩衝液Ｂ（50mM MOPS、pH
7.5）で平衡にしたセファクリルＳ−300カラム（1.5×7
5cm）にのせた。流速は10ml/hに維持し、1.5mlの分画を
集めた。

ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE） これは、実施例１のように行った。

活性染色 活性染色を、未変性ポリアクリルアミドゲル中で活性
MDHを検出するために展開した。電気泳動ゲルを室温で:
50mMグリシン−NaOH緩衝液、pH10、2mM NADP,0.5mMジ
チオスレイトール、9mgニトロブルーテトラゾリウム、
0.1mgフェナジンメトサルフェートおよび2mMモルフィン
またはコデインを含有する溶液20ml中で室温でインキュ
ベートした。

結果 単一の炭素源としてヘロインまたはグルコースのいず
れかで増殖させたシュードモナス・プチダ（P.putida）
M10の細胞からの粗抽出物中において、MDHは、0.018単
位（mgタンパク質）^-1の比活性で存在していた。それ
は、下記の第１表に示したように233倍に精製された。

モノＱクロマトグラフィ段階で４個の主タンパク質ピ
ークが得られ、第４番目のピークは、MDH活性の単一ピ
ークと一致した。しかし、このピーク周辺の活性分画類
をPAGEに供したとき、本酵素は、均質でないことが判明
した。したがって、活性分画類を2mlに濃縮し、そし
て、セファクリルＳ−300ゲルろ過カラムに再度のせ
た。この最終段階からのプール活性分画類は、90％以上
純粋であり、これは、PAGEによって分析したときに顕著
な主タンパク質バンドを産生し、これは、モルフィンま
たはコデインのいずれかが活性株の基質として使用され
た時の単一バンドと一致した。

相対的分子量 天然酵素の相対的分子量は、マーカータンパク質で校
正したセファクリルＳ−200（1.5×75cm）のカラム上に
おける測定から先に述べたAndrewsの方法によって決定
された。本カラムをpH7.0の50mMリン酸カリウム緩衝液
で平衡とした後、精製酵素を含有する溶液をベッド表面
にのせ、流速4ml/hで平衡緩衝液で溶出し、1.5ml分画を
採取した。MDHの溶出容量は、32,000の相対的分子量に
対応した。

MDHの基質アナログ類 基質として作用する種々のモルフィンアルカロイド類
の能力を、モルフィンを下記のアナログ類：コデイン、
フォルコデイン、モルフィングルクロナイド、エチルモ
ルフィン、６−アセチルモルフィン、ヘロイン、デバイ
シン、ジヒドロコデイン、オキシコドンおよびコデイノ
ンのそれぞれと順次交換することによって、研究した。
エタノールも基質として同様に試験した。それぞれを2m
M濃度で、pH10、50mMグリシン−NaOH混合物、精製MDH5
μｇおよび2mM NADPを最終容量1mlに含有する反応混合
物に30℃で添加した。コデインは、モルフィンのそれの
1.7倍およびエチルモルフィンは1.2倍の活性を有してい
た。他の全ての基質類は、完全に不活性であった。より
高度に精製された実施例４の酵素を使用して、わずかに
異なる結果が得られた。エタノールも同様に20倍高い濃
度のMDHを用いて再度試験し、再度マイナスの結果が得
られた。試験したアルカロイド基質類の式を下記に示し
た。

この精製酵素は、コデイノンがアルカロイド基質であ
るときにNADPHの酸化を逆方向に触媒した。

温度の効果 精製MDH（48μｇ）を、pH7.0の50mMのリン酸カリウム
緩衝液中で50℃でインキュベートした。実施例２のよう
にし決定した活性を時間に対してプロットし、MDHが50
℃において6.5分の半減期を有していることが以上より
決定された。

結果 MDHは、電気泳動的に均質なまでに精製された。モル
フィンとは異なり、広範囲のアナログ類のうち２種のみ
が、すなわちコデインおよびエチルモルフィンのみが基
質として作用した。この精製状態において、本酵素は、
シクロヘキシル環上に２重結合のないことによってコデ
インとは異なるジヒドロコデインに対して活性を全く示
さなかった。本酵素は、ヒドロキシ基が芳香族Ｃ−３炭
素上にある６−アセチルモルフィンに対して活性を全く
示さなかった。さらに、Ｃ−14上にヒドロキシル基を有
するオキシコドンについては、これも全く活性を示さな
かった。フォルコデインおよびモルフィングルクロナイ
ドに対しての不活性は、Ｃ−３のアルキル基による立体
阻害によるもので、本酵素の活性中心のアルカロイドへ
の結合が妨げられるからかもしれない。

さらに、本酵素は、エタノールを酸化しないという点
において極めて特異的であり、このことは、麻薬バイオ
センサーにおける用途において重大な特性である。（エ
タノールは、こわれた香水瓶、または飲料または体液中
にも存在しうる。） 実施例４−精製MDHの別の調製 シュードモナス・プチダ（P.putida）M10（400リット
ル）の大量培養物を、実施例１の規定の最小培地に10mM
グルコースを添加して増殖させた。細胞を採取し、−80
℃で保存した。下記の操作は４℃で行い、全ての遠心分
離は30,000gで20分行った。“ミメティック（Mimeti
c）”カラムは、アフィニティクロマトグラフィ社（Aff
inity Chromatography Ltd.）、Freeport,Ballasall
a、Isle of Man,British Islesによって供与され
た。

（１）細胞を含まない（cell−free）抽出物の調製。細
胞抽出物は、凍結したグルコース増殖細胞40g（湿潤重
量）から調製した。細胞を緩衝液Ａ（1mMジチオスレイ
トール含有pH7.0の50mMリン酸カリウム−NaOH）中に濃
度0.5g（湿潤重量）/mlで再懸濁し、強度10μｍのソニ
プレップ（Soniprep）150MSE ウルトラソニックディス
インテグレータ（Ultrasonic Disintegrator）中で３分
間超音波破砕した。超音波破砕した細胞懸濁物を遠心分
離し、細胞残渣を除去した。

（２）“ミメティック（Mimetic）”オレンジ３アフィ
ニティクロマトグラフィ。細胞を含有しない抽出物を、
先に緩衝液Ｃ（1mMジチオスレイトール含有pH7.0の20mM
リン酸カリウム）で平衡としたミメティック（Mimeti
c）オレンジ３ A6XLカラムにのせた。吸着後、このカ
ラムを、溶出液（約500ml）中に280nmの吸光度がこれ以
上明白とならないまで0.25M KCl含有緩衝液Ｃで十分に
洗浄し、次に、モルフィンデヒドロゲナーゼを0.8M KC
l含有緩衝液Ｃ 400mlでバッチワイズに溶出した。分画
（10.2ml）を流速108ml/hで集めた。この段階によっ
て、MDHを非特異的NADPHオキシダーゼ類から分離し、ほ
とんどの夾雑タンパク質類を除去した。

（３）“ミメティック（Mimetic）”レッド２アフィニ
ティクロマトグラフィ。ミメティック（Mimetic）オレ
ンジ３アフィニティクロマトグラフィ段階からのモルフ
ィンデヒドロゲナーゼ最大活性を含有するプール分画
（54−61）を２リットルの緩衝液Ｃに対して透析した。
透析した試料を、先に緩衝液Ｃで平衡としたミメティッ
ク（Mimetic）オレンジレッド２ A6XLカラム（1.0×3.
0cm）にのせた。アフィニティマトリックス上に吸着
後、このカラムを溶出液（約500ml）中に280nmの吸光度
がこれ以上明白とならないまで緩衝液Ｃで洗浄し、そこ
で、0.1M KClでバッチワイズに本酵素を流速72ml/hで
溶出した。280nmにおける単一のピークが、全MDH活性に
関連していた。溶出活性分画（20−25）をプールしかつ
YM10メンブレンを付けたアミコン限外ろ過セル中に濃縮
した。SDS PAGEは、0.1％w/vクーマシーブルー（Cooma
ssie Blue）Ｒ−250で染色後単一のタンパク質バンド
を得た。未変性PAGEは、また、クーマシーブルー（Coom
assie Blue）Ｒ−250で染色された単一のタンパク質バ
ンドを生じ、これは、実施例３のそれと類似の方法で染
色することによって決定されたようにMDH活性と一致し
た。

MDH活性の収率は、平衡および溶出緩衝液にジチオス
レイトールを添加することによって、向上した。

本実施例の精製方法は、実施例２および３のそれらよ
りもより満足できることが判明した。酵素不活性の観点
からみた精製係数は、粗抽出物のそれの1216倍であっ
た。したがって、MDH特性のいくつかの再決定およびさ
らに特性の再決定が行われた。

相対的分子量 本酵素の相対的分子量は、マーカータンパク質類によ
って校正したセファクリルＳ−300カラム上で先に述べ
たAndrewsの方法によって、再度決定した。カラムを緩
衝液Ａで平衡とした後、精製酵素（3U）含有溶液をカラ
ムのベッド表面にのせ、そして、流速8ml/hで平衡緩衝
液で溶出し、1ml分画を集めた。カタラーゼ（Mr 240,0
00）、アルコールデヒドロゲナーゼ（Mr 150,000）、
ヘキソキナーゼ（Mr 110,000）、牛血清アルブミン（M
r 66,000）およびミオグロビン（Mr 17,000）を標準
として使用した。それは、３つの独立した測定から計算
されたように、32,000±1000であると決定された。MDH
を標準タンパク質類で校正したSDS/PAGEに供したとき、
Mr 32,000±1000の単一の顕著なバンドが得られ、した
がって、MDHが単量体であることが示唆される。

等電点 MDHの平坦なベッド等電点泳動をpH3.5−9.5のアンホ
リン（Amopholine）PAGプレート類を用いてLKB マルチ
ホア（Multiphor）装置上で行った。定電圧（750V）を
５時間かけ、このゲルを４℃に保持した。タンパク質
は、エタノール／水／酢酸（容量で0.25:0.67:0.08）に
溶解したクーマシーブルー（Coomassie Blue）Ｒ−250
で60℃で10分間ゲルを染色することによって検出した。
ゲルは、上記溶媒混合物中で洗浄を繰り返すことによっ
て、拡散脱色した。4.2の単一の等電点が得られた。

至適pH MDH活性は、3mMモルフィン、3mM NADP＋および酵素
を最終容量1ml中に含有しpH範囲7.0−10.5のグリシン−
NaOH緩衝液中で340nmにおけるNADP＋の還元を追跡する
ことによって、測定した。総容量1ml中MOPS緩衝液、0.5
mM NADPH,1mMコデイノンおよび酵素中でpH範囲6.0−8.
5で測定した。酵素活性の単位は、１分当たり30℃で１
μモルのNADP＋を還元するかまたは１μモルのNADPHを
酸化するために必要な酵素の量として定義した。至適pH
はそれぞれ9.5および6.5であった。

Ｎ末端アミノ酸決定 自動化Ｎ末端配列解析をアプライドバイオシステムズ
（Applied Biosystems）470Aシークエンサーで行った。
結果を、請求の範囲の直前の本明細書の終わりにある配
列リスト（Seuqence Listing）にのせた。

安定性および熱不活性化 モルフィンデヒドロゼナーゼは、緩衝液Ｃ中で−80℃
で長期保存したときに活性はゆっくりとしか消失しなか
ったけれども（２カ月間で約10％消失）、４℃で保存し
たときに極めて不安定であった。実施例３の熱不活化結
果を確認した。

動態特性 モルフィンおよびコデインの酸化の初期速度は、モル
フィンに付いて0.15−2.0mM、コデインに付いて0.015−
0.5mMおよびジヒドロコデインについて0.5−10mMの範囲
で変化するアルカロイド基質類を除き、標準アッセイ濃
度（3.0mM NADP＋）において全成分を有する反応混合
物を用いて分光法で決定した。二重逆比例およびEadie
−Hofsteeプロットはこの範囲で直線的であり、そして
データの回帰分析は、モルフィン、コデインおよびジヒ
ドロコデインに付いてそれぞれ0.50mM,0.04mMおよび2.9
1mMの見かけのKm値を与えた。

モルフィンデヒドロゲナーゼの基質特異性 デヒドロゲナーゼ活性を、至適pHについて述べたよう
におよびpH9.5において、最終濃度3mMのアルカロイド基
質類とともに精製酵素0.35μｇを用いて試験した。アル
コール基質類は50mMの最終濃度であったが、一方、D,L
−マンデル酸、テストステロンおよびアンドロステロン
は、最終濃度10mMであった。活性は、3mMモルフィン
（0.0252μモル NADPH/分＝100％）で測定したものに
相対している。コデインは120％の活性を有しており、
デヒドロゲナーゼは7.1％および下記:6−アセチルモル
フィン、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、ブ
タン−２−オール、プロパン−２−オール、エタノー
ル、プロパノール、テストステロン、アンドロステロン
およびD.L.−マンデル酸のそれぞれは、活性ゼロであっ
た。

チオール阻害剤、キレート剤および重金属類によるMDH
の阻害 精製MDHは、（ａ）室温で10分間および（ｂ）４℃で1
6時間および次に30℃で10分間、示唆された反応試薬類
とインキュベート後、3mM NADP＋を反応混合物に添加
して酵素活性を測定した。酵素0.35μｇを用いた絶対活
性は、67U/タンパク質1mg（＝100％）であった。下記の
第２表は、結果を示している。

これらのデータは、金属キレート剤による阻害に感受
性ではないほとんどの細菌アルコールおよびアルデヒド
デヒドロゲナーゼ類からMDHをより一層明白に識別す
る。この結果は、金属イオンおよびチオール基類が活性
部位に存在するかもしれないことを示唆している。

実施例５−電気伝導度測定法による（塩酸塩としての）
ヘロインの検出材料および方法 薬剤等級のヘロイン塩酸塩は、マックファーレン・ス
ミス社（MacFarlan Smith、Ltd.）（Edinburgh,Scotlan
d）によって供与された。AMCEは、実施例１の通りに調
製した。

全ての溶液類は、スーパー（Super）Ｑシステム（ミ
リポア（Millipore）,UK）で精製した脱イオン水中に調
製した。

ミクロ電気伝導度測定電極類および機器 ミクロ電気伝導度測定装置類は、L.D.Watsonら、バイ
オセンサーズ（Biosensors）３,101−115（1987/1988）
によって記載のように組み立てた。

これらの電極類は、種々の組成および最終加工の金上
層シリコンウェファー支持体を有している。

使用したオーウェン（Owen）ブリッジ型回路は、同一
平面セラミックベース支持体上に配線で結合された２対
の十分に適合したミクロ電気伝導度装置を必要とし、一
般に、L.D.Watsonら、同上に開示のそれに類似してい
る；同様に英国特許明細書2204408A（Plessey社）を参
照。

酵素組成物類とミクロ電極類との接触 ヘロイン塩酸塩とのAMCEの反応をモニターするため、
イミダゾール緩衝液（2mM;pH7.5）中の酵素溶液のアリ
コット５μを２個、標準および試料電極対上に配置し
た。ヘロイン塩酸塩粉末（典型的に、粒子２−３個）を
試料対電極上に絵筆用のはけから払い落とし、ヘロイン
のピックアップを模擬した。AMCE不在における対照反応
は、標準および試料電極対のそれぞれの上で、イミダゾ
ール−HCl緩衝液（2mM;pH7.5）のアリコット５μによ
って行い、次に試料電極に粉末ヘロイン塩酸塩を添加し
た。

結果 本章に記載の電気伝導度測定ミクロ電極類は、粉末化
ヘロイン塩酸塩の検出において高度に感受性であった。
粉末化ヘロイン塩酸塩の試料細胞への添加は、HCl塩に
よる伝導度測定においてわずかの上昇をもたらしたが、
ヘロインのAMCE分解によるはるかに高い伝導度測定法上
昇が電導性のアセテートイオン類を産生した。

実際には、このAMCEは、実施例６に記載のように湿潤
組成物中に取り込まれるであろう。

実施例６−湿潤組成物の調製および使用 湿潤組成物の調製 アクリルアミド保存溶液（Ａ）は、バイオラッド（Bi
o−rad）（Richmond,California,USA）によって供され
た方法にしたがって、下記のように調製した。アクリル
アミド（87.6g）およびＮ′,N′−ビスメチレンアクリ
ルアミド（2.4g）は、全量300mlとなるように水に溶
解、ろ過し、暗所で４℃で保存した。（１）アクリルア
ミド保存溶液Ａ、（２）新鮮調製硫酸アンモニウム溶液
（10％w/v）、（３）電気泳動的に純粋なTEMEDおよび
（４）実施例１からの緩衝AMCE（pH7.0の50mMリン酸カ
リウム緩衝液中におけるDEAEセファセルクロマトグラフ
ィ後の1mg/ml総タンパク質の10U/ml）は、それぞれ容量
で200:10:5:1790の割合で混合した。本混合物10μを
ミクロ伝導度測定電極表面上にスピン塗布し、そしてゲ
ルに置いた（５−６分）。本湿潤組成物は、30℃におい
て（乾燥試料の不在の中で）極めて安定な伝導度を有
し、そして、その伝導度は、大気中湿度の変化によって
も実質的にほとんど変動しない。

湿潤組成物の試験 ミクロ電気伝導度測定装置を、AMCE/湿潤混合物でス
ピン塗布し、そして、それらを開放大気中に置くことに
よって安定化させた。調製装置にヘロイン塩酸塩を吹き
かけた後、伝導度は迅速に増加し、次に、一定の値まで
水平になった。ヘロイン塩酸塩は、したがって、湿潤剤
によって容易に可溶化され、そして記録された伝導度測
定の結果としての増加は、第１に−塩素アニオン類、プ
ロトン類および４重子アンモニウムカチオン類の価電種
の添加または第２にAMCE活性の結果としてのヘロインの
アセチルエステル基の迅速加水分解によった。

実施例７−モルフィンデヒドロゲナーゼを用いたヘロイ
ンの電流測定法による検出 材料類および方法 モルフィンデヒドロゲナーゼ（MDH）は、シュードモ
ナス・プチダ（Pseudomonas putida）M10から単離さ
れ、実施例２に記載のようにDEAEセファセル陰イオン交
換クロマトグラフィによって部分的に精製した。

B.F.Y.Yon−Hin ＆C.R.Lowe,アナリティカルケミスト
リ（Anal.Chem.）59,2111−2115（1987）の方法を用い
て、作用電極を、多孔性ニッケルシート（40％多孔度、
0.25mm厚、INCOヨーロッパ社）から切断されかつセラミ
ックベース支持体上にエポキシ粘着剤で糊ずけしたスト
リップ（0.5cm×6cm）として調製した。全てのニッケル
表面は、外部電気接触用および作用表面領域（0.5cm×
0.5cm）用に必要な２つの領域を除いて、エポキシレジ
ンで絶縁した。銀／塩化銀（Ag/AgCl）標準電極類は、
クラークエレクトロケミカルインスツルメンツ（Clark
Electromedial Instruments）（Reading,Berks,UK）
から入手した。多孔性ニッケル電極類に表面固定化され
たヘキサシアノフェレートメディエータは、下記のよう
にして調製した。

電極類は、超音波浴中にてアセトン中で最初に超音波
破砕し次に乾燥させることによって調製した。それら
は、15分間、固定電位−1.0V（Ag/AgCl対）に保たれ
た；電極類は、一定のバックグラウンドプロフィールが
観察されるまで−0.1Vおよび＋0.4Vの間で循環させた。
ヘキサシアノフェレートフィルム類は、約5mMのナトリ
ウムフェリシアナイドを含有する水性溶液から掃作速度
70mM/秒で−0.1Vおよび＋1.0Vの間でこれらの電極類上
で連続的に掃作することによって電気化学的に生長させ
た。改良電極類は、精製水中で徹底的に洗浄した。沈着
プロセスにおいてサイクリックボルタモグラムをこのよ
うにして得た。

全ての溶液は、スーパーＱシステム（Millipore,UK）
で精製した脱イオン水中で調製した。

静止状態電流測定は、（NADP＋（2mM）およびMDH含有
過塩素酸ナトリウム（0.1M）（3ml）含有リン酸ナトリ
ウム（0.01M;pH8）緩衝溶液中でヘキサシアノフェレー
ト調製多孔性ニッケル電極で行った。この電極は、＋0.
2V（対Ag/AgCl）に保たれた。いったんバックグラウン
ド電流を得た後、モルフィンHCl（2mM;300μ）のアリ
コットを添加した。本混合物を短時間攪拌した後、静止
溶液中における電流を記録した。

結果 ニッケル／ヘキサシアノフェレート作用電極によるモ
ルフィン/MDH反応のために記録した静止状態電流測定
を、第6.5図に示した。モルフィン（１または2mM）の緩
衝液を添加後ピークに達し、そして、静止状態値に低下
する急激電流増加が各薬剤濃度に付いて得られる。

２作用電極系を用いることによって、モルフィンのHC
l塩としての添加による全ての電流応答とデヒドロゲナ
ーゼ反応による全ての酸化電流応答との間を識別するこ
とが可能であることがわかる。

実施例８−ヘロイン検出のための結合アッセイ ヘロイン酸化の初期速度は、最終容量1ml中に50mMグ
リシン−NaOH緩衝混合物（pH10）、2mM NADP、0.6mgの
部分精製AMCE,2.8μｇの精製MDHおよび0.25から1.5mMの
範囲内で変動するヘロインを含有する反応混合物を用い
て、340nmにおいて吸収するNADPHの産生を測定すること
によって、分光測定法で検出した。結合酵素アッセイに
おけるヘロイン濃度の効果を下記の第３表に示した。

実施例９−ヘロイン検出のための結合アッセイ ヘロイン検出のための比色アッセイも同様に展開し、
実施例８の結合アッセイを取り入れた。本反応混合物
は、標準濃度（上記）の全成分および1.5mMのヘロイン
を含有していた。さらに、本混合物は、0.45mgのニトロ
ブルーテトラゾリウムおよび5ngのフェナジンメトサル
フェートを含有していた。NADPHからのトロブルーテト
ラゾリウム（NBT）へのフェナジンメルサルフェートに
よる電子類の移行は、NBTを不溶のホルマザンに還元
し、青紫色を呈した。このアッセイはヘロインに極めて
特異的であり、極めて迅速で、この色は30秒以内に発現
した。

配列リスト 配列ID番号 ： １ 配列型 ： アミノ酸 配列長さ ： アミノ酸25個 断片片 ： Ｎ末端 起源 ： NCIMB40119として特許寄託物として寄
託されたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a）“M10" 特性 ： モルフィンに対して高特異性のデヒド
ロゲナーゼ酵素

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/416 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｔ //(Ｃ１２Ｎ 9/04 27/46 ３０１Ｇ Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 グレイ・スティーブンス，ローレン・ダ イアナ イギリス国ハートフォードシャー，エス ジー８・６イーズィー，ロイストン，メ ルボルン，フォウルメア・ロード，フォ ックスフィールド・ハウス （番地な し) (72)発明者 ロウ，クリストファー・ロビン イギリス国エセックス，シービー10・２ ピーダブリュー，サフロン・ウォルデ ン，ヘンプステッド，ザ・ライムス （番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】モルフィンデヒドロゲナーゼ酵素であっ
   て、そのＮ末端からの最初の25個のアミノ酸が配列番号
   1: を有し、さらに （１）NADP⁺補因子とともにモルフィンをモルフィノン
   に酸化する： （２）同一補因子とともにコデインおよびエチルモルフ
   ィンを酸化するが、ヘロイン、６−アセチルモルフィ
   ン、テバイン、ジヒドロコデイン、オキシコドン、モル
   フィンクロクルナイドまたはフォルコデインには有意な
   酵素作用は有しない： （３）ゲル濾過によって決定されたように約32,000ダル
   トンの分子量を有する： （４）グリシン−NaOH緩衝液中において、pH約9.5にお
   けるモルフィン至適反応性を示す：および （５）ゲル内の平面ベッド等電点フォーカシングによっ
   て決定された等電点が4.2である という特徴を有する、前記モルフィンデヒドロゲナーゼ
   酵素。
2. 【請求項２】モルフィンまたはその３−（低級アルキ
   ル）エーテルから６−ケトンを調製するための方法であ
   って、モルフィンまたは前記エーテルを請求項１に記載
   のモルフィンデヒドロゲナーゼ酵素およびNADP⁺補因子
   の存在下において酸化することを含む、前記方法。
3. 【請求項３】前記酸化が25から30℃の温度において空気
   中で行われる、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】試料中のモルフィンを検出する方法であっ
   て、請求項１に記載のモルフィンデヒドロゲナーゼ酵素
   およびNADP⁺補因子の存在下において前記試料を酸化反
   応に供し、そして前記反応の出現を検出することを含
   む、前記方法。
5. 【請求項５】前記NADP⁺から酸化反応によって同時に生
   産されるNADPHが検出される、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】NADPHが、酸化されたかまたは還元された
   色素が生産される酸化還元反応または反応系によって比
   色的に検出される、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】NADPHが、電子類を前記NADPHから電極へ移
   行し、そしてその結果生じた電流を電流回路において検
   出する、ことによって検出される、請求項５に記載の方
   法。