JP4824887B2 - 修飾されたシトクロムp450モノオキシゲナーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、改変された基質プロフィールを有する修飾されたシトクロムP450モノオキシゲナーゼ、それをコードする核酸配列、発現構築物およびベクター、これらのベクターを含む組換え微生物、ならびに末端または末端付近(subterminally)でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の微生物学的製造方法に関する。
【0002】
P450 BM−3と称されるモノオキシゲナーゼは、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)由来のシトクロムP450酵素であり、哺乳動物P450酵素に対して顕著な配列相同性を有する(1)。これらの類似性のため、P450 BM−3は、このクラスのP450酵素の優れたモデル系を構成する。P450 BM−3は、主として、長鎖飽和脂肪酸をそれらのω−1、ω−2およびω−3炭素原子においてヒドロキシル化する。長鎖不飽和脂肪酸のアミドまたはアルコール類似体およびエポキシドも変換される(1−3)。飽和脂肪酸に対する触媒活性は鎖長に左右され、最適な鎖長は14〜16炭素原子である。該酵素は、12炭素原子未満の鎖長を有する脂肪酸に対しては触媒活性を示さない(1)。
【0003】
発明の概要
野生型酵素と比較して改変された基質プロフィールを示すシトクロムP450モノオキシゲナーゼ突然変異体を提供することが、本発明の1つの目的である。特に、飽和脂肪族カルボン酸を別の鎖位置でヒドロキシル化する及び/又は改変された基質特異性を有する新規の突然変異体を提供することが1つの目的であった。特に、中鎖長、特に8〜12、例えば8〜10炭素原子の鎖長の脂肪族カルボン酸に対する触媒活性を有し、これらのカルボン酸を末端付近で、特にω−1、ω−2および/またはω−3位でヒドロキシル化する突然変異体を提供することが1つの目的であった。
【0004】
本発明者らは、基質結合領域の部位特異的突然変異誘発と定方向性進化との組合せにより、野生型と比較して脂肪族カルボン酸の末端および/または末端付近の酵素的ヒドロキシル化における改変された反応パターンまたは基質プロフィールを示す修飾されたシトクロムP450モノオキシゲナーゼを提供することにより、この目的が達成されることを見出した。
【0005】
詳細な説明
本発明の突然変異体には野生型酵素と比較して「改変された基質プロフィール」が認められる。「改変された基質プロフィール」は、本発明の目的においては、a)少なくとも1つのヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸またはヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸誘導体に対する突然変異体の反応性の向上、例えば比活性(反応したカルボン酸のnmol/分/P450酵素のnmolとして表される)および/または例えばKcat、KmおよびKcat/Kmから選ばれる少なくとも1つの速度論的パラメーターの増加、例えば、少なくとも1%、例えば10〜1000%、10〜500%または10〜100%の向上、および/またはb)カルボン酸のヒドロキシル化における改変された、特に増加した、位置選択性を意味する。したがって、例えば、少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸またはヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸誘導体における好ましい末端または末端付近(ω−1、ω−2、ω−3、ω−4、特にω−1〜ω−3)のヒドロキシル化位置の移動が生じる。本発明における「改変された基質プロフィール」が認められるヒドロキシル化されうる脂肪族カルボン酸またはその誘導体は、8〜30炭素原子を有する分枝状または好ましくは直鎖状のカルボン酸である。基質プロフィールの本発明の改変は、全長(すなわち、C8−C30)にわたり又は部分的にのみ(例えば、C8−C12−、C10−C12−、C12−C30−、C12−C25−もしくはC12−C20カルボン酸またはこれらの部分からの個々のカルボン酸の場合に)現れうる。
【0006】
本発明においてヒドロキシル化されうるカルボン酸として挙げられうる非限定的な具体例としては、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸およびメリシン酸が挙げられる。適当なカルボン酸誘導体の具体例としては、好ましくは短鎖C1−C4−カルボン酸とのC1−C4−アルキルエステル、アミドまたは無水物が挙げられる。
【0007】
本発明のモノオキシゲナーゼは、好ましくは、酵素クラスE.C.1.14.−.−からのシトクロムP450モノオキシゲナーゼ、特にP450ファミリーCYP102に由来し、真核生物または原核生物、特に細菌に由来するものである。
【0008】
突然変異体の特に好ましい一群は、アミノ酸配列領域:24−28、45−51、70−72、73−82(ヘリックス5)、86−88(ヘリックス6)、172−224(F/Gループ)および352−356(βストランド8)の1つにおいて少なくとも1つの機能的突然変異を有する(ただし、該酵素が突然変異F87Aを保持する場合には、これらの領域の2以上が突然変異している)、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)シトクロムP450モノオキシゲナーゼBM−3に由来するもの、ならびにこれらの突然変異体の機能的等価物である。
【0009】
本明細書においては、突然変異はアミノ酸の1文字表記で示されている。突然変異の配列位置を示す番号の前には元のアミノ酸が示されており、該番号の後には修飾アミノ酸が示されている。
【0010】
本発明の目的における「機能的突然変異」は、前記定義による「改変された反応パターン」または「改変された基質プロフィール」を与える前記配列領域内のアミノ酸の置換を含む。
【0011】
本発明において特に好ましいのは、少なくとも各場合において、個々に又は組合せて、アミノ酸配列領域86−88、172−224、73−82、45−51および24−28(配列番号2による)における1つの機能的突然変異を含むP450BM−3モノオキシゲナーゼ突然変異体(グループ(A))である。
【0012】
したがって、例えば、Phe87は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばAla、Val、Leu、特にValまたはAlaにより置換されうる。Leu188は、アミンまたはアミド側鎖を有するアミノ酸、例えばAsn、Gln、Arg、または特にLys、またはAla、Gly、Ser、Trpなどのアミノ酸により置換されうる。Ala74は、脂肪族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばValおよび特にGlyにより置換されうる。Arg47は、環状側鎖基を有するアミノ酸、例えばHis、Tyrまたは特にPheにより置換されうる。Val126は、ヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えばSerまたは特にThrにより置換されうる。
【0013】
好ましいグループ(A)突然変異体は、以下のアミノ酸置換パターンの少なくとも1つを示す:
a)F87V;
b)F87A、L188K:
c)F87V、L188K;
d)F87A、L188K、A74G;
e)F87V、L188K、A74G;
f)F87A、L188K、A74G、R47F;
g)F87V、L188K、A74G、R47F;
h)F87A、L188K、A74G、R47F、V26T;または
i)F87V、L188K、A74G、R47F、V26T;
およびそれらの機能的等価物。
【0014】
適当な突然変異体のもう1つの群であるグループ(B)は、前記配列領域の1つにおける又は配列領域70−72および352−356の1つにおける単一アミノ酸置換を示す。その2つの最後に挙げた配列領域においては、例えば、Ser72が、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばAla、Val、Leu、Ileおよび特にGlyにより置換されることが可能であり、Met354が、ヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えばSerまたは特にThrにより置換されることが可能である。
【0015】
特に、グループBの突然変異体は、以下から選ばれるアミノ酸置換を示す:
a)V26T、
b)R47F、
c)S72G、
d)A74G、
e)F87V、
f)L188z(ここで、zは、K、R、W、Q、N、G、AまたはSである)、および
g)M354T;
およびそれらの機能的等価物。
【0016】
「機能的等価物」は、本発明においては、前記配列位置の少なくとも1つにおいて、特に挙げたもの以外のアミノ酸置換を示すが、特に挙げた突然変異体と同様に、野生型と比較して前記定義による「改変された基質プロフィール」を示す突然変異体を尚も与えるアミノ酸置換を示す突然変異体を意味すると理解されるべきである。機能的等価物は、特に、反応性パターンにおける改変が質的に一致する場合にも存在する。
【0017】
もちろん、「機能的等価物」は、特に挙げたP450 BM3突然変異体と同様に、他の生物由来のP450酵素を突然変異させることにより得られうるP450モノオキシゲナーゼ突然変異体をも含む。例えば、相同配列の領域を配列比較により同定することができる。本発明において特に記載している原則に従い、現代の分子モデリング方法は、反応性パターンに影響を及ぼす等価的突然変異が施されるのを可能にする。
【0018】
「機能的等価物」はまた、1以上の追加的なアミノ酸の付加、置換、欠失および/または逆位により得られうる突然変異体を含み、前記の追加的な改変は、それが前記の意味で「改変された基質プロフィール」を有する突然変異体を与える限り、配列のいかなる位置にも存在しうる。
【0019】
本発明は更に、突然変異モノオキシゲナーゼまたは前記定義による「機能的等価物」をコードする核酸配列に関する。これらの配列は、好ましくは、前記アミノ酸置換パターンに従うコドン交換により、配列番号1から得ることができる。
【0020】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含む又は特に挙げた配列と比較して特定の起源または宿主生物のコドン使用頻度に従い改変された核酸配列、およびそのような核酸配列の天然に存在する変異体を含む。また、本発明は、遺伝暗号の縮重により(すなわち、対応するアミノ酸配列を改変することなく)または保存的ヌクレオチド置換(すなわち、対応するアミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性および/または溶解度を有する別のアミノ酸により置換されること)により得られる核酸配列の誘導体、および「改変された基質プロフィール」を有する本発明のモノオキシゲナーゼをコードする、ヌクレオチドの付加、挿入、逆位または欠失により改変された配列、および対応する相補的配列を含む。
【0021】
本発明は更に、調節核酸配列の遺伝的制御下で本発明の突然変異体をコードする核酸配列を含む発現構築物、およびこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。
【0022】
好ましくは、本発明の構築物は、コード配列の5’上流のプロモーターおよび3’下流のターミネーター配列を、および必要に応じて、他の通常の調節要素を含み、各場合において、それらは該コード配列に機能的に連結されている。機能的な連結は、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび必要に応じて使用する他の調節要素が、該調節要素のそれぞれが該コード配列の発現に際してその意図される機能を果たしうるように、連続的に配置されていることを意味すると理解されるべきである。機能的に連結されうる配列の具体例としては、ターゲッティング配列、または翻訳エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられる。
【0023】
人工的調節配列に加えて、天然調節配列が実際の構造遺伝子の上流に尚も存在しうる。また、所望により、この天然調節は遺伝的改変により無効にされることが可能であり、該遺伝子の発現は増強または減弱されうる。しかし、遺伝子構築物は構造的に更に単純でありうる。すなわち、追加的な調節シグナルを構造遺伝子の上流に挿入せず、その調節を行う天然プロモーターを保存する。その代わりに、もはや調節が生じず、遺伝子発現が増強も減弱もされないように、天然調節配列を突然変異させる。核酸配列の1以上のコピーが遺伝子構築物内に存在しうる。
【0024】
プロモーターの具体例としては、cos、tac、trp、tet、trp−tet、lpp、lac、lpp−lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、l−PRまたはl−PLプロモーター(それらは全て、グラム陰性菌において有利に用いられる);およびグラム陽性プロモーターamyおよびSPO2、酵母プロモーターADC1、MFa、AC、P−60、CYC1、GAPDHまたは植物プロモーターCaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nosまたはユビキチンまたはファゼオリンプロモーターが挙げられる。
【0025】
原則として、調節配列を有する全ての天然プロモーターを使用することができる。また、合成プロモーターも有利に使用することができる。
【0026】
前記調節配列は、該核酸配列の指令的(directed)発現を可能にすると意図される。宿主生物に応じて、これは、例えば、誘導が生じた後に初めて該遺伝子が発現または過剰発現されること、またはそれが直ちに発現および/または過剰発現されることを意味する。
【0027】
調節配列または因子は、好ましくは、発現に正の効果を及ぼし、このようにして、発現を増加または減少させる。したがって、調節要素の増強は、強力な転写シグナル、例えばプロモーターおよび/または「エンハンサー」を使用することにより転写レベルで有利に生じうる。また、翻訳は、例えば、mRNAの安定性を向上させることによっても増強されうる。
【0028】
発現カセットは、適当なプロモーターを適当なモノオキシゲナーゼヌクレオチド配列とターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルとに融合させることにより得られる。この目的には、例えばT.Maniatis,E.F.FritschおよびJ.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)ならびにT.J.Silhavy,M.L.BermanおよびL.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)ならびにAusubel,F.M.ら,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)に記載されている通常の組換え及びクローニング技術を用いる。
【0029】
適当な宿主生物内での発現のためには、組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、宿主内での最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的ベクター内に挿入すると有利である。ベクターは当業者によく知られており、例えば、“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.ら編,Elsevier,Amsterdam−New York−Oxford,1985)に記載されている。ベクターは、プラスミドだけではなく、当業者に公知の他のすべてのベクター、例えばファージ、ウイルス(例えばSV40、CMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルス)、トランスポゾン、IS要素、ファスミド、コスミドおよび直鎖状または環状DNAをも意味すると理解されるべきである。これらのベクターは、宿主生物内で自律的に又は染色体内で複製されうる。
【0030】
本発明のベクターは、例えば本発明の少なくとも1つのベクターで形質転換されて突然変異体の製造に使用されうる組換え微生物の作製を可能にする。本発明の組換え構築物は、適当な宿主系内に有利に導入され発現されうる。対象とする発現系内で前記核酸の発現を引き起こすためには、当業者に公知の通常のクローニングおよびトランスフェクション方法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いることが好ましい。適当な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubelら編,Wiley Interscience,New York 1997に記載されている。
【0031】
適当な宿主生物は、原則として、本発明の核酸、それらの対立遺伝子変異体およびそれらの機能的に等価な置換体または誘導体の発現を可能にする全ての生物である。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母または植物もしくは動物細胞を意味すると理解されるべきである。好ましい生物は、細菌、例えばエシェリキア(Escherichia)属の細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、バシラス(Bacillus)またはシュードモナス(Pseudomonas)、真核微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、アスペルギルス(Aspergillus)、および動物または植物由来の高等真核細胞、例えばSf9またはCHO細胞である。
【0032】
所望により、遺伝子産物の発現はまた、トランスジェニック生物、例えばトランスジェニック動物(例えば、特にマウス、ヒツジ)またはトランスジェニック植物内で引き起こすこともできる。また、トランスジェニック生物は、例えば突然変異または部分的もしくは完全な欠失により対応の内因性遺伝子が除去されたノックアウト動物または植物でもありうる。
【0033】
うまく形質転換された生物は、同様にベクター内または発現カセット内に含有されるマーカー遺伝子により選択することができる。そのようなマーカー遺伝子の具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、および形質転換細胞の着色を引き起こす呈色反応を触媒する酵素の遺伝子が挙げられる。ついでそれらを自動細胞選別により選択することができる。ベクターでうまく形質転換され適当な抗生物質(例えばG418またはハイグロマイシン)耐性遺伝子を保持する微生物は、抗生物質を含有する適当な液体培地または固形培地により選択することができる。細胞表面上に提示されたマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによる選択に利用することができる。
【0034】
宿主生物と該生物に適合するベクター(例えばプラスミド、ウイルスまたはファージ、例えばRNAポリメラーゼ/プロモーター系を伴うプラスミド、ファージλ、μもしくは他のテンペレートファージまたはトランスポゾンおよび/または更に有利な調節配列)との組合せは、発現系を形成する。「発現系」なる語は、例えば、哺乳動物細胞(例えばCHO細胞)と哺乳動物細胞に適したベクター(例えばpcDNA3neoベクター)との組合せを意味すると理解されるべきである。
【0035】
前記のとおり、遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物(例えばマウス、ヒツジ)またはトランスジェニック植物内でも有利に発現されうる。同様に、該核酸由来のRNAで無細胞翻訳系を設計することが可能である。
【0036】
本発明は更に、モノオキシゲナーゼ産生微生物を培養し、必要に応じてモノオキシゲナーゼの発現を誘導し、モノオキシゲナーゼを培養物から単離する、本発明のモノオキシゲナーゼの製造方法に関する。このようにして、所望により工業的規模においても、本発明のモノオキシゲナーゼを製造することができる。
【0037】
該微生物は、公知方法により培養し発酵させることができる。例えば細菌は、TBまたはLB培地内で20〜40℃の温度および6〜9のpHで増殖させることができる。適当な培養条件は、例えば、T.Maniatis,E.F.FritschおよびJ.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)に詳細に記載されている。
【0038】
モノオキシゲナーゼが培地内に分泌されない場合は、ついで該細胞を溶解し、公知タンパク質単離方法により該ライセートからモノオキシゲナーゼを得る。該細胞は、必要に応じて、高周波超音波により、高圧により(例えばフレンチプレスセル内)、オスモリシス(osmolysis)により、界面活性剤、溶菌酵素または有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、または前記の複数の方法の組合せにより破壊することができる。
【0039】
モノオキシゲナーゼは、公知のクロマトグラフィー法、例えば分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、例えばQ−セファロース上でのクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーにより、および他の通常の方法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析および天然ゲル電気泳動により精製することができる。適当な方法は、例えば、Cooper,F.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[Methods in Biochemistry],Verlag Walter de Gruyter,Berlin New YorkまたはScopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlinに記載されている。
【0040】
組換えタンパク質を単離するためには、あるヌクレオチド配列によりcDNAを伸長させて、更に簡便な精製の目的で改変されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを用いることが特に有利である。そのような適当な修飾としては、例えば、アンカーとして作用するタグ、例えばヘキサ−ヒスチジンアンカーとして公知の修飾、または抗体の抗原として認識されうるエピトープが挙げられる(例えば、Harlow,E.およびLane,D.,1988,Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Pressに記載されている)。これらのアンカーは、例えば、クロマトグラフィーカラム内に充填されるか又はマイクロタイタープレート上もしくは他の任意の担体上で使用される固相支持体(例えば高分子マトリックス)に該タンパク質を結合させるように機能しうる。
【0041】
同時に、これらのアンカーは、タンパク質の認識にも利用されうる。タンパク質を認識するためには、更に、通常の標識、例えば蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応産物を形成する酵素標識、または放射能標識を、単独で又は該タンパク質を誘導体化するためのアンカーと組合せて使用することが可能である。
【0042】
本発明は更に、
a1)少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する培地の存在下、本発明の組換え微生物を好気的に培養するか又は、
a2)少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する反応媒体を本発明の突然変異体と共に好気的にインキュベートし、
b)得られたヒドロキシル化産物または産物混合物を該培地または媒体から単離することを含んでなる、末端または末端付近(ω−1〜ω−4)でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の酵素的製造のための生化学的製造方法に関する。
【0043】
カルボン酸は、本発明の方法において、それ自体で又はその誘導体(例えば、特に、C1−C4−アルキルエステルまたはカルボキサミド)として使用することができる。
【0044】
本発明の方法において好ましく使用されるヒドロキシル化されうるカルボン酸は、C8−C30−モノカルボン酸またはその誘導体である。
【0045】
本発明の方法において特に好ましく使用されるヒドロキシル化されうるカルボン酸は、C8−C12−モノカルボン酸またはその誘導体であり、本発明の方法において特に好ましく使用されるモノオキシゲナーゼは前記グループ(A)の突然変異体である。
【0046】
本発明のもう1つの方法では、使用するヒドロキシル化されうるカルボン酸がC12−C30−モノカルボン酸またはその誘導体であり、モノオキシゲナーゼが単一突然変異体F87A、F87V、V26T、S72G、A74GおよびM354Tならびに前記グループ(A)の多重突然変異体f)〜i)から選ばれる突然変異体である。
【0047】
本発明の酸化反応は、通常は、大気酸素の存在下および電子供与体(または還元当量)、例えば特にNADH、NADPHおよびZn/Co(III)セパルクレートの存在下で行う。Zn/Co(III)セパルクレートの使用は、例えば、本明細書において明示的に言及するDE−A−199 35 115に記載されている。
【0048】
本発明のヒドロキシル化を組換え微生物で行う場合には、まず、十分な細胞密度に達するまで、酸素の存在下および複合培地(例えばTBまたはLB培地)内で約20〜40℃の培養温度および約6〜9のpHで、該微生物を培養することが好ましい。必要に応じて外因性基質を加える。より良好に酸化反応を制御するためには、誘導性プロモーター、特に温度誘導性プロモーターを使用することが好ましい。この場合、温度を、要求される誘導温度、例えばPrP1プロモーターの場合には42℃まで上昇させ、モノオキシゲナーゼ活性を発現させるために十分な時間(例えば、1〜10、または5〜6時間)にわたり維持し、ついで温度を約30〜40℃まで低下させる。ついで培養を、酸素の存在下、12時間〜3日間継続する。
【0049】
一方、純化または濃縮された酵素で本発明の酸化を行う場合には、本発明の酵素突然変異体を、外因性基質(約0.01〜10mM、または0.05〜5mM)を含む媒体に溶解し、該反応を、好ましくは酸素の存在下、約10〜50℃(例えば30〜40℃)の温度および約6〜9のpH(例えば100〜200mMリン酸またはトリスバッファーで調節する)で、および還元剤の存在下で行い、その過程中に、該基質含有媒体は更に、酸化される基質に対して約1〜100倍モル過剰の還元当量を示しうる。必要に応じて、該還元剤は、分割して加えることができる。
【0050】
必要に応じて、自体公知の方法により、酸素を該反応媒体内に通すことができる。
【0051】
本発明の方法を、富化または精製された酵素で行う場合には、例えば、以下の反応条件を設定することができる:
基質濃度:0.1〜20mg/ml、
酵素濃度:0.1〜10mg/ml、
反応温度:20〜40℃、
pH:6〜8、
バッファー:0.05〜0.2M リン酸カリウム、Tris/HCl、
電子供与体:好ましくは分割して加える(初期濃度は約0.1〜2mg/ml)。
【0052】
電子供与体を加えることにより該反応を開始する前に、1〜5%(v/v)の濃度のアセトンを加えプレインキュベート(約20〜40℃で1〜5分間)することにより該活性を増加させることが可能である。
【0053】
当業者はこれらの条件を改変し、問題の反応条件を通常の実験により最適化することが可能である。
【0054】
改変された酵素特性を有する変異体を得るためのタンパク質工学における2つの異なる方法がある。第1の方法は「論理的設計」法(4)であり、第2の方法は「定方向性進化」法(5−7)である。論理的設計の成功のために極めて重要なのは、酵素メカニズムの詳細な知見および高分解三次元構造モデルである。論理的設計は、非天然基質に対して高い活性を有する酵素突然変異体を与えることが示されているが(4)、該突然変異体の安定性、活性および特異性に対する個々のアミノ酸の点置換の効果は予測できないことが多い。
【0055】
P450 BM−3のX線構造がタンパク質データベース(8)に登録されている場合であっても、決定的なヒドロキシル化段階の基質とP450とのコンホメーションは依然として不明である(9−11)。定方向性進化法に極めて重要なのは、ランダムな突然変異体の大きなライブラリーの迅速なスクリーニングのための効率的な検出方法である。ω−パラ−ニトロフェノキシカルボン酸(pNCA)を使用するP450 BM−3突然変異体F87Aに関する光学的試験は有用であることが判明している(12,13)。単一突然変異体F87Aは脂肪酸のヒドロキシル化位置をω−1、ω−2およびω−3からω−位に移動させ(13)、さらに12−pNCAの完全な変換をもたらすが、これに対して、野生型酵素では33%の変換しか認められない(12)。しかし、P450 BM−3のモノオキシゲナーゼドメインは400以上のアミノ酸を含むため、ランダム突然変異体ライブラリーのスクリーニングは、干し草の山の中から針を捜し出すようなものである。
【0056】
この探索法の効率を改善するために、改変された反応性を有する突然変異体が得られるよう、特に、中鎖長の脂肪酸に対する特異性を有する突然変異体が得られるよう、論理的設計法を定方向性進化法に従い組合せる。本発明の「論理的進化(rational evolution)」法は、仮想的ランダムライブラリーを与えるための及び所望の特性に影響を及ぼす可能性が高い残基を同定するためのコンピューター支援タンパク質モデリングに基づく。これらの残基をランダム化することによりサブライブラリーを作製し、陽性突然変異体に関してスクリーニングする。第1工程では、構造モデルから出発して、鎖長特異性に潜在的に重要な残基を決定する。改善された特性を有する突然変異体を得るために、該モデルにより提示された突然変異部位を飽和突然変異原により修飾する。ついで、論理的設計を考慮して、最良の特性を有する個々の突然変異体をお互いに組合せる。この組合せ法の適用は、特に、中鎖長の基質に対するP450 BM−3の活性の改善を可能にする。
【0057】
この方法の適用および種々の起源のP450酵素に対する配列相同性は、同様に本発明の主題である他の突然変異体を当業者が同様に作製するのを可能にする。
【0058】
つぎに、以下の実験の記載により及び添付図面を考慮することにより、本発明を例示することとする。
【0059】
方法1:基質/P450 BM−3複合体のモデリング
基質/酵素複合体のモデリングは、パルミトレイン酸と複合体形成した結晶学的に決定されたP450 BM−3の構造に基づくものであった(9)。この構造はタンパク質データベース(8)に登録されている。記載されている2.9Åの分解能の結晶構造は、非対称単位格子内に4個の分子を含有する。該モデル化複合体の基準として、鎖Aを選択した。SYBYL“Molecule Builder”(Tripos,Inc.,St.Louis,USA)を用いて、基質分子として8−pNCAのモデルを作製した。SYBYL Biopolymer Toolを用いて、F87A突然変異体を作製した。該基質の炭素原子1−4を、結合したパルミトレイン酸の炭素原子6−9に適合する結合部位内に配置した。脂肪酸鎖のねじれ角は、該立体配置転移(transconfiguration)工程に応じて選択した。P450 BM−3/ラウレート複合体およびP450 BM−3/12−ブロモラウレート複合体に関するNMR研究は、該ヒドロキシル化炭素原子(C10およびC11)のプロトンが、II酸化状態にある(10,13)ヘム鉄から約3.0Åの距離に位置していることを示した。この知見の結果として、8−pNCAの対応原子C7およびC8を、該ヘム鉄からそれぞれ4Åおよび3.6Åの距離に配置した。パラ−ニトロフェノキシ基は、該結合ポケット内に手動で配置した。また、固定されたバックボーン原子により該複合体のエネルギーを最小にした。
【0060】
方法2:飽和突然変異誘発
本発明で使用する突然変異体は、Stratagene QuikChange Kit(La Jolla,California,USA)を使用する飽和突然変異誘発により作製した。P450 BM−3モデリングを介した突然変異のために、基質結合チャンネルの近傍の9個の位置、すなわちP25、V26、R47、Y51、S72、A74、F87、L188およびM354を選択した。これらの位置のそれぞれのプライマーを表1に列挙する。
【0061】
【表1】
【0062】
反応条件は、すべての突然変異誘発PCR法に関して同一であった。ただし、アニーリング温度は以下のとおりに変化させた:25、26、188および354位には50℃;47および51位には52℃;ならびに72、74および87位には46℃。反応は50μlの反応容積中で行い、各バッチは、17.5pmolの各プライマー、20pmolの鋳型プラスミドDNA、3UのPfuポリメラーゼおよび3.25nmolの各dNTPを含有していた。反応は95℃、4分で開始し、ついでバッチを以下の加熱サイクルに付した:95℃、1分;46〜52℃、2.5分;72℃、17分の20サイクル。これらの20サイクルの後、該反応を72℃で15分間継続した。部位特異的突然変異誘発をPCRにより行うため、1つのアミノ酸を置換するために個々のコドンを改変した。特定のアミノ酸をランダム化するために、「nnn」がその特定のアミノ酸をコードするプライマーを使用した。すべてのPCR産物溶液を、20U DpnIで37℃で3時間処理して、元の未突然変異鋳型DNAを消化した。ついで大腸菌(E.coli)DH5α内への形質転換を行った。
【0063】
方法3:野生型酵素および突然変異体の発現および精製
P450 BM−3野生型遺伝子およびその突然変異体を、強力な温度誘導性PRPLプロモーターpCYTEXP1の制御下、大腸菌(E.coli)株DH5α(supE44,lacU169[80lacZ M15] hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi−1 relA1)内で発現させた。単点突然変異F87Aを先行技術(12)に従い導入した。該形質転換細胞を、100μg/ml アンピシリンを含有するLB寒天プレート上にプレーティングした。該コロニーを12〜24時間培養した後、それらを無菌爪楊枝で拾い上げ、100μg/ml アンピシリンと共に200μlのTB培地(12gのトリプトファン、24gの酵母エキス、4mlのグリセロール、1リットルまでの(蒸留)H2O)を各ウェルが含有する96ウェルマイクロタイタープレート内に入れた。該プレートを37℃で一晩インキュベートした。ついで40μlを各ウェルから取り出し、100μg/ml アンピシリンと共に2mlのTB培地を含有する培養チューブ内に移し、ついで該バッチを37℃で2時間、ついで42℃で6時間インキュベートした。該細胞を4000rpmで5分間の遠心分離により取り出し、ニワトリアルブミンリゾチーム(1U/ml)で処理し、ついで2回、凍結し除氷した。14,000rpmで10分間の遠心分離により粗細胞抽出物を得た。得られた上清中の該活性を測定した。大量の酵素を得るために、100μg/ml アンピシリンと共に300mlのTB培地を含む2−l振とうフラスコを使用し、37℃でインキュベートし、200rpmで2時間振とうし(OD578nm=0.8〜1.0)、ついで42℃で6時間インキュベートした。該細胞を4000rpmで10分間の遠心分離により集め、15mlの0.1M リン酸カリウムバッファー(pH7.4)に懸濁させた。該氷冷懸濁液をBranson超音波処理装置W25(Dietzenbach,Germany)(80W、2分間、3サイクル)により破砕した。該懸濁液を32570×gで20分間遠心分離した。酵素活性の測定または酵素精製のために、該粗抽出物を使用した。
【0064】
酵素精製は、BioPilotクロマトグラフィー(Pharmacia,Sweden)を使用する以外は(14)に記載のとおりに行った。全タンパク質および酵素の量を測定することにより、酵素純度を測定した。波長の組合せ450nmおよび490nmに関する91mM−1cm−1の分子吸光率を用いて、鉄(II)形態と鉄(II)形態のカルボニル複合体との吸光スペクトルの差から、精製された酵素の濃度を求めた。
【0065】
方法4:より短い鎖長の基質に対して、より高い活性を有する突然変異体の単離
上記野生型の代わりに、P450 BM−3突然変異体F87Aを鋳型DNAとして使用した。問題の位置の突然変異を前記のとおりに作製した。各事例において、各位置における該配列領域をスクリーニングするために約100個のコロニーを拾い、培養チューブ内で増殖させ、細胞をチューブから取り出し、細胞溶解した。選択した各コロニーからの粗細胞抽出物を活性試験に使用した。15−pNCAより短い鎖長を有する少なくとも1つの基質に対してF87Aより高い活性を示す全ての突然変異体を配列決定して、その突然変異を同定した。
【0066】
同じ位置の全ての突然変異体のうち、それぞれ12−pNCA、10−pNCAまたは8−pNCAに対して、最も高い活性を有する突然変異体を、続いて行う他の突然変異との組合せのために選択した。組合せた突然変異を、部位特異的突然変異誘発法により段階的に施した。その組合せ法を図1に示す。基質特異性を測定するために、各組合せ工程から6個のコロニーを単離した。典型的な基質特異性を有するコロニーを選択し、その純粋な酵素に対する基質特異性を測定した。選択したコロニーのプラスミドを、部位特異的突然変異誘発法の次工程で使用した。最終突然変異体内の突然変異をDNA配列決定(ABI PRISM(登録商標) BigDye(商標) Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction KitおよびABI Prism(商標) 377 DNA Sequencer)により同定した。
【0067】
方法5:酵素活性アッセイ
pNCA活性アッセイでは、使い捨てセル中のDMSO中10mM pNCA溶液8μl(最終容積1ml)を使用した。850μlのTris−HClバッファー(0.1M,pH8.2)および0.1〜0.4nmolのP450を問題のpNCA/DMSO溶液に加えた後、該サンプルを5分間プレインキュベートし、ついで50μlの1mN NADPH水溶液を加えることにより反応を開始させた。KcatおよびKmを求めるために、種々のpNCA基質について一連の濃度系列を確立した(検出方法の詳細に関しては、(12)を参照されたい)。
【0068】
96ウェルプレート(Greiner,Frickenhausen,Germany)を使用して、マイクロタイタープレート中でpNCA試験を行った。Tris/HClバッファー(0.1M,pH8.2)中の250μlの全反応容積中、反応バッチは60nmolの8−pNCA、15nmolの10−pNCA、15nmolの12−pNCAまたは15nmolの15−pNCA(各場合において2.5μlのDMSOに溶解されている)を含有していた。サンプルを40μlのP450 BM−3サンプルと共に5分間プレインキュベートした後、30μlの1mM NADPH溶液を各ウェル内に注入することにより反応を開始させた。NADPH溶液を加えた直後に、プレートを、プレートリーダーにおいて405nmで測定した。
【0069】
方法6:本発明の突然変異体を使用するカルボン酸の変換およびその産物の同定
a)化学反応
P450 BM−3またはその突然変異体の存在下で脂肪酸をヒドロキシル化するために、以下のバッチを選択した。
P450 BM−3突然変異体:20mg
反応バッファー: 20ml
(Tris/HCl 50mM、KCl 250mM、pH7.8)
脂肪酸: 10mg
アセトン: 400μl(2% v/v)
(反応を2倍加速する)。
【0070】
反応を行う前に、酵素凍結乾燥物を1mlの反応バッファーに溶解し、まず、36℃で30分間インキュベートした。2% v/v アセトンの添加と同様、インキュベーションによって、活性がそれぞれ60および75%増大する。
【0071】
5分間のインキュベーションの後、500μlの既に調製されたNADPH溶液(12.5mg/ml)を加えた。この反応の経過を340nmでの吸光度測定によりモニターし、NADPHの消費を観察することができる。理論的には、化学量論的変換には4mlのNADPH溶液が必要と考えられるが、該反応溶液中の過度に高いNADPH濃度によって、酵素の不活性化が引き起こされる。このため、補因子を500μlずつ加える。
【0072】
上記反応が終了した後、該溶液を5M 塩酸でpH2に酸性化した。脂肪酸またはヒドロキシル化脂肪酸はこの間に沈殿し、溶液の曇りが認められるようになる。ついでこの混合物を各事例で10mlのジクロロメタンで2回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。折り重ねたフィルターで濾過した後、該ジクロロメタンをロータリーエバポレーター上で又は窒素と共に蒸発させることにより除去した。残存した白色固体を2mlのジクロロメタン中に取り、GC分析で使用した。
【0073】
b)ガスクロマトグラフィーによる分析
FIDを備えたFisonsガスクロマトグラフ(Fisons Instruments Mega Series,Mainz,Germany)を分析に使用した(Optima 5−カラム、内径25m×0.25mm,Macherey & Nagel,Duren,Germany)。
【0074】
分析のために、出発物質および産物をMSHFBAでシリル化した。この間、すべてのヒドロキシル基および酸性基が、それぞれ対応するトリメチルシリルエーテルおよびエステルに変換される。このサンプルは無水であることに注意しなければならない。なぜなら、そうでなければシリル化剤との副反応が生じるからである。15μlのMSHFBAを10μlの該ヒドロキシ脂肪酸含有ジクロロメタン溶液中にピペッティングし、この混合物を室温で15分間インキュベートした。25μlのジクロロメタンを加えた後、GC分析を行った。
【0075】
このために、1μlの上記シリル化サンプルを上記ガスクロマトグラフ内に注入した。インジェクターおよび検出器の温度は350℃であった。以下の温度プログラムを用いた:
【0076】
実施例1:出発突然変異体の選択
P450 BM−3単一突然変異体F87Aを出発鋳型として使用した。前記のとおり、この突然変異は、飽和C12−およびC14−脂肪酸におけるω−1、ω−2およびω−3のヒドロキシル化位置をω−位に変化させる(13)。12−pNCAおよび15−pNCAの変換に関しては、野生型の場合と比べてω−ヒドロキシル化が有意に増大することも示された(12)。12−pNCAのω−ヒドロキシル化に関しては、該野生型の場合には33%の変換であるのに対して、完全な変換が得られた。位置選択性の増加に加えて、12−pNCAおよび15−pNCAに対する活性の増加も認められた(表2で比較されたい)。
【0077】
【表2】
種々の鎖長を有する種々のpNCA誘導体に対する選択されたP450 BM−3突然変異体の比活性1
【0078】
F87Aの位置選択性の増加は、構造モデルを参照して理解しうる。嵩高い残基F87をアラニンで置換すると、F87により並びにV78、A82、T260、I263およびA264により形成される、p−ニトロフェノキシ基に対する結合ポケットが拡大する。また、その大きなp−ニトロフェノキシ基が該結合ポケットに接近するのが容易になり、F87とpNCAの炭素原子ω−2およびω−1との間の立体相互作用が排除される。これは、ヘム鉄原子に対するω位の、より有利な配向を可能にする。
【0079】
実施例2:モデリングによる個々の突然変異位置の選択、選択した位置の部位特異的ランダム化突然変異誘発およびスクリーニング
1.突然変異位置の選択
結合C8−pNCA基質のモデルは、カルボキシレートが該カルボキシレート結合残基R47およびY51からそれぞれ9および11Åの距離に位置することを示している。C8基質に対する活性を誘導するには、該基質のカルボキシレート基から適当な距離に位置する新たな結合部位を生成させる必要がある。8−pNCAの結合を促進するには、追加する残基は該結合部位内に配置すべきである。元のカルボキシレート結合部位を形成する残基R47およびY51を選択した。R47に関しては、そのグアニジニウム基と該基質のカルボキシレート残基との間でイオン対を形成することが提示されている。Y51は、基質のカルボキシレート基と水素結合を形成する(9)。パルミトレイン酸/P450 BM−3複合体においては、R47のCα原子と該脂肪酸カルボキシレート基のC原子との間の距離は12Åである。8−pNCAモデルのカルボキシレート基の周囲の半径12Åの半球内の全ての残基を同定し、脂肪酸のカルボキシレート基の方向に向いている側鎖を有するものだけを該結合ポケット内で選択した。このようにして、P25、V26、S72、A74、L188およびM354を選択した。これらは、おそらく、短鎖pNCA化合物に対する新たなカルボキシレート結合部位を形成しうるであろう。選択したこれらの6個の残基は、柔軟なコンホメーションで二次構造要素上に位置する(11)。
【0080】
2.突然変異およびスクリーニング
選択した8個の残基のそれぞれの突然変異体を、問題の位置における野生型コドンの部位特異的ランダム化により作製した。19の可能なアミノ酸種のほとんどが試験されることを保証するために、各位置の100個のコロニーを単離し、培養し、活性に関して試験した(したがって、各アミノ酸が試験される確率は、トリプトファンおよびメチオニンの場合に79%の確率になることを除き、95%を超える)。15−pNCAより短い鎖長を有する少なくとも1つの基質に対してより高い活性値を有する突然変異体を、該突然変異の同定のために選択して配列決定した。
【0081】
188位は比較的に可変性であることが明らかになった。上記100個のコロニーのほとんどはpNCAに対する活性を示した。これらから、8−pNCAに対するそれらの活性に基づき37個のコロニーを選択した。野生型を含めて16の異なるアミノ酸型が検出された。この結果は更に、可能性のある20のアミノ酸のほとんどが試験されることを保証するためには100個のコロニーの選択で十分であることを証明した。15の置換のうち、置換K、R、W、Q、N、G、AおよびSは、より短い鎖長の基質に対する触媒活性を有意に増大させた。負に荷電したアミノ酸によるLの置換によって、10−pNCA、12−pNCAおよび15−pNCAに対する活性が3〜7倍減少した。
【0082】
残りの7個の位置を、188位と同様にランダム化した。突然変異を検出するためのDNA配列決定のために、各位置から7〜19個のコロニーを選択した。これらの遺伝子のほとんどは突然変異していないか、または該遺伝子産物は、より短い鎖長の基質に対する活性の減少を示した(この試験は純粋な酵素で行った)。各場合において、15−pNCAと比較して、より短い鎖長の基質に対して、より高い活性を示したのは、26、47、74および354位の突然変異体では僅か1個、72位の突然変異体では2個、そしてP25およびY51位の突然変異体では0個であった。8−pNCAに対して最大活性を有する188位および72位における突然変異体、ならびに26、47、74および354位の単一突然変異体を、組合せのために選択した。前記表2に列挙されているこれらの突然変異は、以下の置換を含有する:V26T、R47F、S72G、A74G、L188KおよびM354T。F87Aと比較して、8−pNCAに対する比活性は、0.5〜33.5倍増大した。これらの突然変異のそれぞれを、元の突然変異F87Aと段階的に組合せた。
【0083】
実施例3:突然変異体の段階的組合せにより作製された多重突然変異体およびそれらのスクリーニング
1.突然変異体L(F87A、L188K)
単一突然変異体の組合せは個々の効果の累積を必ずしも与えないため、最初の突然変異体の選択は決定的に重要である。最初の突然変異の誤った選択は、最適な多重突然変異をもたらさない進化経路につながりうる。単一突然変異体の大きな出発プールの場合、莫大な組合せ多様性が考えられ、その結果、所望の多重突然変異体が見出されることはありそうもない。
【0084】
以下の2つの基準が出発物質としての突然変異体Lの選択を促進する。すなわち、他の全ての突然変異体と比較した場合の8−pNCAに対するその活性の増加(表2)、および、酵素/基質相互作用および該結合部位の特性における変化である。これらの変化を確認するために、SYBYL法により該突然変異位置の側鎖を置換することにより、選択した突然変異体の構造モデルを作製した。L188は、αヘリックスFのC末端上に位置する。このヘリックスおよび近傍のGヘリックスは、基質結合により最大のシフトを受ける(9)。このモデルは、ロイシンからリシンへの置換が新たな推定カルボキシレート結合部位の形成を招くことを示している。K188のアミノ基と8−pNCAのカルボキシレート残基との間の距離は6Åであり、したがって実験的に値が測定されているパルミトレイン酸のカルボキシレート基とR47のグアニジニウム基(元の結合残基)との距離に匹敵する。R47のグアニジニウム基と8−pNCAのカルボキシレート基との間の距離は11.4Åである。したがって、該ヒドロキシル化C8原子ならびにK188および該基質のカルボキシレート基の間のイオン対反応はヘム鉄原子への反応し易い距離において起こると提示されうる。
【0085】
残りの5つの突然変異体を、部位特異的突然変異誘発による突然変異体Lと段階的に組合せた(図1で比較されたい)。選択した突然変異体の構造モデルを各突然変異誘発工程について作製した。基質結合に対する作製した突然変異体の効果をこのモデルに関して調べ、これに基づき、該突然変異体およびそれらの組合せの最適化された特性に対する論理的説明を提示した。
【0086】
2.突然変異体LA(F87A、L188K、A74G)
8−pNCAに対する触媒効率は、突然変異A74Gを突然変異体L内に導入することにより増加した。A74はα−ヘリックスB’のN末端に位置する。A74の側鎖はK188のアミノ基と立体的に相互作用するため、この相互作用は、A74をグリシンで置換することにより排除される。したがって、該基質のカルボキシレート基に対する、該側鎖のより有利な配向を可能にする。
【0087】
3.突然変異体LAR(F87A、L188K、A74G、R47F)
8−pNCAに対する触媒効率は、追加的な突然変異R47Fを導入することにより成功裏のうちに改善された。突然変異R47Fは、考えられうる2つの効果を有していた。フェニルアラニンは元のカルボキシレートの結合を妨げる。そして、残基F11、L14、L17、P18、P45およびA191により形成される結合チャンネルの入り口にある疎水性部分(これは溶媒にさらされる)を拡大する。この疎水性部分は、該基質に対する結合に特に重要である(11)。
【0088】
4.突然変異体LARV(F87A、L188K、A74G、R47F、V26T)
突然変異M354Tを突然変異体LARに加えると、8−pNCAに対するKcat値が減少する。したがって、更なる組合せ実験にはM354Tを加えなかった。しかし、突然変異V26Tを突然変異体LARに加えると、得られる突然変異体LARVはLARより若干高いKcat値および若干低いKm値を示す。8−pNCAに対する触媒効率は増加した。代わりに突然変異S72Gを突然変異体LARに施すと、8−pNCAのKcat値は減少した。このため、突然変異体LARVを更なる突然変異のために選択した。
【0089】
V26はαヘリックスAのN末端に位置する。モデルは、T26が結合部位の元の残基Y51の役割を果たしうること、および水素結合の形成により該基質のカルボキシレート基を安定化しうることを示唆している。T26のヒドロキシル基とK188のアミノ基との間の距離は6.9Åである。元の結合部位と比較して、この距離は約2Å長い(Y51のヒドロキシル基とR47のグアニジニウム基との間の距離は4.8Å)。したがって、K188含有Fヘリックスを更なるコンホメーション改変に付し、それにより、8−pNCAは、より深い結合領域内位置に保持され、T26とK188との間の距離は減少する。
【0090】
5.突然変異体LARVF(F87V、L188K、A74G、R47F、V26T)
87位は該酵素の触媒活性および基質特異性に特に重要である可能性があった(3,13)。このため、部位特異的ランダム化突然変異誘発により87位において突然変異体LARVを最適化した。100個のコロニーのうち、8−pNCAに対して3.5*104s−1M−1の触媒効率を示す1個の突然変異体を得た。そのDNA配列データは、87位のアラニンがバリンにより置換されていることを示した。
【0091】
ヘム鉄への基質の接近にはR87が重要であることが、結晶構造(11)およびより初期の実験(3,13)から公知である。この物質の嵩高いパラ−ニトロフェニル基は、フェニルアラニンをアラニンで置換することにより該結合部位のサイズを増加させることを必要にする。A87をバリンで置換することにより、エーテル酸素とV87側鎖との間の立体的相互作用により、Cωとヘム鉄原子との接触が改善される。
【0092】
これらのデータは、2つの鍵となる工程(F87AからL、およびLARVからLARVF)が8−pNCAに対する触媒効率を増加させることを示している。これは、突然変異体LARVFにおけるその他の突然変異が、8−pNCAに対する活性を喪失することなく復元しうるか否かに関する問題を提起した。そこで、突然変異F87Aの代わりに突然変異F87Vを含有する突然変異体を作製した。これらの突然変異体は以下の名称を有する:
1.)突然変異F87V L188Kを有するL7V、
2.)突然変異F87V L188K A74Gを有するAL7V、
3.)突然変異F87V L188K A74G R47Fを有するARL7V。
【0093】
活性アッセイにおいては以下の結果が得られた。
【0094】
【表3】
pH8.0および25℃で測定された種々の鎖長を有するpNCA誘導体に対するP450 BM−3突然変異体の速度論的パラメーター
【0095】
これらの結果は、突然変異体F87VおよびL7Vが基質8−pNCAに対しては測定可能な変換を示さないことを示している。この結果は更に、4重突然変異体ARL7Vが、5重突然変異体ARVLFより一層良好な触媒効率を示すことを示している。
【0096】
さらに、突然変異体ARL7VおよびARVLFは、野生型酵素の最も短い天然脂肪酸基質より2炭素原子短いカプリン酸(C10)に対して高い活性を示す。さらに、ラウリン酸(C12)を基質として使用した場合には、ω−4−モノヒドロキシル化産物が認められ、一方、P450 BM−3の野生型酵素はω−1、ω−2およびω−3位においてのみ活性である。
【0097】
実施例4:種々の鎖長を有するカルボン酸および種々の突然変異体に関する好ましいヒドロキシル化位置の決定、および野生型酵素との比較
反応バッチを、前記方法(6)に従い後処理し分析した。
【0098】
その結果を以下の表4に列挙する。
【表4】
【0099】
ラウリン酸のヒドロキシル化において認められるのは、位置選択性の変化が、まず、野生型からP450 BM−3 F87Vへの変化中に生じ、それがω−3ヒドロキシル化を優先的に触媒する(これはP450 BM−3 L7Vの場合と同様である)ということである。3重突然変異体への変化中に、その位置選択性が再び変化し、P450 BM−3 AL7V、P450 BM−3 ARL7VおよびP450 BM−3 ARVLFはヒドロキシル化をω−2位に優先的に導く。
【0100】
すべてのGC分析は、カプリン酸がP450 BM−3 ARVLFおよびP450 BM3 ARL7Vによってのみ変換され、一方、その他の突然変異体においては1%未満の変換しか見出せないことを示している。両方の酵素は実質的に同じ位置選択性を示し、ω−1位が好ましい。
【0101】
反応収率を測定するために、基準物質のガスクロマトグラムを記録した。用いた出発物質の基準物質は、溶媒としてジクロロメタンを使用するカプリン酸またはラウリン酸溶液(濃度0.5mg/ml)であった。FID検出法により、出発物質および生成物のピーク面積を互いに単純に比較することは可能ではなかった。なぜなら、異なる構造式および実験式を有する分子は、燃焼に際して異なるイオンフラックスを生成するからである。これらのイオンフラックスは、出発物質と生成物との量比に比例しない。そこで、用いた生成物の基準物質は、商業的に入手可能な10−ヒドロキシカプリン酸または12−ラウリン酸であった。該基準物質および該生成物の実験式は同一であり、その構造はヒドロキシル基の位置に関して異なるにすぎず、このため、同一量に関してほぼ同一の検出可能なイオンフラックスが推定されうる。
【0102】
P450 BM−3 ARVLFおよびP450 BM−3ARL7V触媒でのカプリン酸のヒドロキシル化においては、累積生成物収率はそれぞれ57%および38%であった。ラウリン酸のヒドロキシル化においては、収率はP450 BM−3 ARVLF触媒では51%、他の全ての突然変異体および野生型では38%〜40%であった。
【0103】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【図1】 新規基質8−pNCAに対するP450 BM−3の段階的最適化。各突然変異体について、8−pNCAに対する触媒効率が示される(単位はS−1M−1)。
【図2】 P450 BM−3−突然変異体LARVFと基質8−pNCAとの複合体のモデル。突然変異のための5つの最良の位置を示し、突然変異体LARVFを与えるように組合された側鎖が示されている(V26T、R47F、A74G、F87V、L188K)。
【配列表】
Claims (11)
- 修飾されたシトクロムP450モノオキシゲナーゼであって、野生型酵素と比較して、その基質結合領域の部位特異的突然変異誘発により、脂肪族カルボン酸の末端および/または末端付近の酵素的ヒドロキシル化において改変された基質プロフィールを示し、
少なくとも各場合において、アミノ酸配列位置:87位および188位において1つの機能的突然変異、および、アミノ酸配列位置:26位、47位、72位、74位、および354位の1つにおいて任意に少なくとも1つの機能的変異を含む、配列番号2のアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)シトクロムP450モノオキシゲナーゼBM−3に由来し、
ここで、上記変異は、
Phe87のVal、Ala、またはLeuによる置換;
Leu188のAsn、Gln、Arg、Lys、Ala、Gly、Ser、またはTrpによる置換;
Ala74のValまたはGlyによる置換;
Arg47のHis、TyrまたはPheによる置換;
Val26のSerまたはThrによる置換;
Ser72のAla、Val、Leu、Ile、またはGlyによる置換;または
Met354のSerまたはThrによる置換、
である、上記モノオキシゲナーゼ。 - 下記のアミノ酸置換パターン:
b)F87A L188K:
c)F87V L188K;
d)F87A L188K A74G;
e)F87V L188K A74G;
f)F87A L188K A74G R47F;
g)F87V L188K A74G R47F;
h)F87A L188K A74G R47F V26T;
i)F87V L188K A74G R47F V26T;
の少なくとも1つを含む、請求項1記載のモノオキシゲナーゼ。 - 請求項1または2に記載のモノオキシゲナーゼをコードする核酸またはその相補的核酸。
- 調節核酸配列の遺伝的制御下に、請求項3記載の核酸を含むコード配列を含んでなる発現構築物。
- 少なくとも1つの請求項4記載の発現構築物を含んでなるベクター。
- 請求項5記載の少なくとも1つのベクターで形質転換された組換え微生物。
- エシェリキア(Escherichia)属の細菌から選ばれる、請求項6記載の微生物。
- 末端または末端付近でヒドロキシル化された脂肪族カルボン酸の酵素的製造方法であって、
a1)少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する培地の存在下に、請求項6または7記載の組換え微生物を培養するか、又は
a2)少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸または少なくとも1つのヒドロキシル化されうるカルボン酸誘導体を含有する反応媒体を請求項1または2記載の酵素と共にインキュベートし、
b)得られたヒドロキシル化産物を該培地又は媒体から単離する、ことを含んでなる上記方法。 - ヒドロキシル化されうるカルボン酸がC8−C12−モノカルボン酸またはその誘導体である、請求項8記載の製造方法。
- 電子供与体または還元当量の存在下で該反応を行う、請求項8または9記載の製造方法。
- 電子供与体または還元当量がNADH、NADPHおよびZn/Co(III)セパルクレートから選ばれる、請求項10記載の製造方法。
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