MX2014010074A - Moduladores de ligando de tipo delta 3 (dll3) y metodos de uso. - Google Patents

Moduladores de ligando de tipo delta 3 (dll3) y metodos de uso.

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MX2014010074A
MX2014010074A MX2014010074A MX2014010074A MX2014010074A MX 2014010074 A MX2014010074 A MX 2014010074A MX 2014010074 A MX2014010074 A MX 2014010074A MX 2014010074 A MX2014010074 A MX 2014010074A MX 2014010074 A MX2014010074 A MX 2014010074A
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MX
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tumors
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David Liu
Robert A Stull
Laura Saunders
Scott J Dylla
Orit Foord
Michael Torgov
Hui Shao
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Stem Centrx Inc
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
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    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/16—Peri-condensed systems
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
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    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
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Abstract

Se proporcionan moduladores novedosos, que incluyen anticuerpos y derivados de estos, y métodos de empleo de tales moduladores para tratar trastornos proliferativos.

Description

MODULADORES DE LIGANDO DE TIPO DELTA 3 (DLL3) Y METODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCION Esta solicitud se refiere en general a compuestos, composiciones y métodos novedosos que se pueden utilizar en el diagnóstico, la prevención, el tratamiento o la mejora de trastornos proliferativos y cualquier expansión, recidiva, recaída o metástasis de estos. En un sentido amplio, la presente invención se refiere al uso de moduladores del ligando de tipo delta 3 (DLL3), incluidos los anticuerpos anti-DLL3 y constructos de fusión, para el tratamiento, el diagnóstico o la profilaxis de trastornos neoplásicos. Ciertas modalidades seleccionadas de la presente invención contemplan el uso de tales moduladores de DLL3 , incluidos los conjugados de anticuerpo-fármaco, para el tratamiento inmunoterapéutico de enfermedades malignas que comprende preferentemente una reducción en la frecuencia de las células iniciadoras de tumores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La diferenciación de las células madre y progenitoras y la proliferación celular son procesos continuos normales que actúan de forma concertada para estimular el crecimiento tisular durante la organogénesis y el reemplazo celular, y para reparar la mayoría de los tejidos durante la vida de REF. : 250536 todos los organismos vivos. En circunstancias normales, la diferenciación y la proliferación celular son controladas por numerosos factores y señales que generalmente se equilibran para mantener decisiones sobre el destino celular y la arquitectura tisular. Por ende, este microentorno controlado es el que regula en gran medida la división celular y la maduración tisular en las que se generan señales de forma adecuada en función de las necesidades del organismo. A este respecto, la proliferación y la diferenciación celular normalmente se producen solamente según sea necesario para el reemplazo de células dañadas o moribundas, o para el crecimiento. Desafortunadamente, la disrupción de la proliferación y/o la diferenciación celular puede ser consecuencia de multitud de factores que incluyen, por ejemplo, la carencia o abundancia de diversos compuestos químicos de señalización, la presencia de microentornos alterados, mutaciones genéticas o alguna combinación de estos . Cuando se interrumpe o altera de algún modo la proliferación y/o la diferenciación celular normal, esto puede originar varias enfermedades o trastornos incluidos trastornos proliferativos como el cáncer.
Los tratamientos convencionales para el cáncer incluyen la quimioterapia, radioterapia, cirugía, inmunoterapia (p. ej . , modificadores de la respuesta biológica, vacunas o agentes terapéuticos dirigidos) o combinaciones de estos.
Desafortunadamente, ciertos cánceres presentan una respuesta mínima o no responden a tales tratamientos. Por ejemplo, en algunos pacientes los tumores exhiben mutaciones genéticas que hacen que no respondan a pesar de la efectividad general de las terapias seleccionadas. Además, dependiendo del tipo de cáncer y de la forma que adquiera, puede que algunos tratamientos disponibles, tales como la cirugía, no sean alternativas viables. Las limitaciones inherentes de los agentes terapéuticos de uso habitual actuales se ponen de manifiesto particularmente cuando se intenta tratar pacientes que han sido sometidos a tratamientos previos y que posteriormente han sufrido una recaída. En tales casos, los regímenes terapéuticos fallidos y el resultante deterioro de los pacientes pueden contribuir a la aparición de tumores refractarios que se manifiestan a menudo como una enfermedad relativamente agresiva que, en última instancia, resulta ser incurable. Aunque han conseguido grandes mejoras en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer en los últimos años, las tasas de supervivencia globales para muchos tumores sólidos han permanecido prácticamente invariables debido al fracaso de las terapias existentes en la prevención de la recaída, la recidiva y las metástasis tumorales. Por lo tanto, el desarrollo de terapias más potentes y dirigidas sigue constituyendo un desafío para los trastornos proliferativos .
SUMARIO DE LA INVENCION Estos y otros objetivos son contemplados por la presente invención, la cual, en su sentido más amplio, se refiere a métodos, compuestos, composiciones y artículos manufacturados que se pueden utilizar en el tratamiento de trastornos asociados con DLL3 (p. ej . , trastornos proliferativos o trastornos neoplásicos) . Con este fin, la presente invención proporciona moduladores del ligando de tipo delta 3 (o DLL3) novedosos que atacan de forma eficaz a células tumorales y/o células madre cancerosas, y se pueden utilizar para tratar pacientes que padecen una gran variedad de enfermedades malignas. Como se describirá más detalladamente en la presente, hay al menos dos isoformas o variantes de DDL3 naturales y los moduladores descritos pueden comprender o asociarse selectivamente con una isoforma o la otra o con ambas. Es más, en ciertas modalidades, los moduladores de DDL3 descritos pueden reaccionar además con uno o más miembros de la familia DLL (p. ej . , DLL1 o DLL4) o, en otras modalidades, se pueden generar y seleccionar de modo que se asocien o reaccionen exclusivamente con una o más isoformas de DLL3. En cualquier caso, los moduladores pueden comprender cualquier compuesto que reconozca, compita, agonice, antagonice, interaccione , se una o se asocie con un determinante fenotípico o genotípico de DLL3 (o uno de sus fragmentos) y module, ajuste, altere, regule, cambie o modifique el impacto de la proteína DLL3 sobre una o más vías fisiológicas y/o elimine las células asociadas con DLL3. Por lo tanto, en un sentido más amplio, la presente invención se refiere en general a moduladores de DLL3 aislados y sus usos. En modalidades preferidas, la invención se refiere más en particular a moduladores de DLL3 aislados que comprenden anticuerpos (es decir, anticuerpos que se unen, reaccionan o se asocian inmunopreferencialmente con al menos una isoforma de DLL3) que, en modalidades particularmente preferidas, se asocian o conjugan con uno o más agentes citotóxicos. Además, tal como se describe detalladamente más adelante, estos moduladores se pueden utilizar para proporcionar composiciones farmacéuticas útiles para la profilaxis, el diagnóstico o el tratamiento de trastornos proliferativos incluido el cáncer.
En modalidades seleccionadas de la invención, los moduladores de DLL3 pueden comprender un polipéptido DLL3 o fragmentos de este, ya sea en una forma aislada o fusionados o asociados con otros restos (p . ej . , Fc-DLL3, PEG-DLL3 o DLL3 asociado con un resto de direccionamiento) . En otras modalidades seleccionadas, los moduladores de DLL3 pueden comprender antagonistas de DLL3 que, a los efectos de la presente invención, se debe sobreentender que se refieren a cualquier constructo o compuesto que reconoce, compite, interacciona, se une o se asocia con DLL3 y neutraliza, elimina, reduce, sensibiliza, reprograma, inhibe o controla el crecimiento de células neoplásicas incluidas las células iniciadoras de tumores. En modalidades preferidas, los moduladores de DLL3 de la presente invención comprenden anticuerpos anti-DLL3, o fragmentos o derivados de estos, que inesperadamente se ha descubierto que silencian, neutralizan, reducen, disminuyen, agotan, moderan, merman, reprograman, eliminan o inhiben de otro modo la capacidad de las células iniciadoras de tumores para propagar, mantener, expandir, proliferar o facilitar de otro modo la supervivencia, recidiva, regeneración y/o metástasis de las células neoplásicas. En modalidades particularmente preferidas, los anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos se pueden asociar o conjugar con uno o más agentes anticancerosos (p. ej . , un agente citotóxico) .
En lo que respecta a tales moduladores, se podrá apreciar que los anticuerpos compatibles pueden presentar cualquiera de numerosas formas incluidas, por ejemplo, anticuerpos mono- y policlonales , quiméricos, con injertos de CDR, humanizados y humanos, y fragmentos inmunorreactivos y/o variantes de cada uno de los anteriores. Las modalidades preferidas comprenderán anticuerpos que son relativamente no inmunogénicos tales como constructos humanizados o completamente humanos. Por supuesto, en vista de la presente exposición, los expertos en la técnica podrían identificar fácilmente una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) asociadas con regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los moduladores de DLL3 de tipo anticuerpo, y emplear tales CDR para modificar o fabricar anticuerpos quiméricos, humanizados o con injertos de CDR sin necesidad de realizar demasiados experimentos. Por consiguiente, en ciertas modalidades preferidas, el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo que incorpora una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) como las que se definen en las FIGS. 11A y 11B, y derivadas de las regiones variables murinas de las cadenas ligera (FIG. 11A) o pesada (FIG. 11B) contiguas (SEQ ID NOS: 20-203) expuestas en las figuras. Las regiones variables con injertos de CDR de este tipo también se muestran en la FIG. 11 que comprende las SEQ ID NOS: 204-213. En modalidades preferidas, tales anticuerpos comprenderán anticuerpos monoclonales y, en modalidades incluso más preferidas, comprenderán anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanizados.
Las secuencias de ácido nucleico representativas que codifican cada una de las secuencias de aminoácidos expuestas en las FIGS. 11A y 11B se adjuntan a la presente en el listado de secuencias y comprenden las SEQ ID NOS: 220-413. A este respecto, se apreciará que la invención comprende además moléculas de ácido nucleico (y constructos, vectores y células hospederas asociados) que codifican las secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo descrito que incluyen aquellas expuestas en el listado de secuencias que se adjunta.
Más particularmente, en modalidades seleccionadas, los moduladores de DLL3 compatibles pueden comprender un anticuerpo que tenga una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO : 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO : 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NC ): 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 202 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 103, SEQ ID NO: 1 05, SEQ ! ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203. En otras modalidades preferidas, los moduladores seleccionados comprenderán regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden una identidad de un 65, 70, 75 o 80% respecto a las secuencias murinas mencionadas anteriormente. En otras modalidades adicionales, los moduladores comprenderán regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden una identidad de un 85, 90 o incluso un 95% respecto a las secuencias murinas descritas.
En otras modalidades preferidas, los moduladores seleccionados comprenderán una o más CDR obtenidas a partir de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera anteriores. Por consiguiente, las modalidades seleccionadas de la invención incluyen un modulador de DLL3 que comprende una o más CDR de cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-203. En otras modalidades adicionales, los moduladores de la presente invención comprenderán cualquier anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este que compita por la unión con cualquiera de los moduladores anteriores .
Otro aspecto de la invención comprende moduladore enidos o derivados a partir de SC16.3, SC16.4, SC16.5 SC16 .7, SC16.8, SC16 .10, SC16. .11, SC16.: L3, SC16.15, SC16.18, SC16 • 19, SC16 .20, SC16 .21, SC16.22, SC16 .23, SC16.25, SC16 .26, SC16 .29, SC16 .30, SC16.31, SC16 .34, SC16.35, SC16 .36, SC16 .38, SC16 -39, SC16.41, SC16 .42, SC16.45, SC16 • 47, SC16 • 49, SC16 .50, SC16.52, SC16 •55, SC16.56, SC16 • 57, SC16 .58, SC16 .61, SC16.62, SC16 -63, SC16.65, SC16 .67, SC16 .68, SC16 .72, SC16.73, SC16 .78, SC16.79, SC16 .80, SC16. 81, SC16. 84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16 .104, SC16. 105, SC16. 106, SC16.107, SC16. 108, SC16.109, SC16 .110, SC16. 111, SC16. 113, SC16.114, SC16. 115, SC16.116, SC16 .117, SC16. 118, SC16. 120, SC16.121, SC16. 122, SC16.123, SC16 .124, SC16. 125, SC16. 126, SC16.129, SC16. 130, SC16.131, SC16 .132, SC16. 133, SC16. 134, SC16.135, SC16. 136, SC16.137, SC16 .138, SC16. 139, SC16. 140, SC16.141, SC16. 142, SC16.143, SC16 .144, SC16. 147, SC16. 148, SC16.149 y SC16 .150. En otras modalidades, la invención comprenderá un modulador de DLL3 que tiene una o más CDR de cualquiera de los moduladores mencionados anteriormente.
En otras modalidades compatibles más, la presente invención comprenderá los moduladores de DLL3 humanizados o con injertos de CDR: hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16.56. Otras modalidades adicionales se refieren a un modulador de DLL3 que comprende un anticuerpo humanizado, donde el anticuerpo humanizado comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210 y SEQ ID NO: 212 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO : 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211 y SEQ ID NO: 213. Además, como se ha descrito justo antes, las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera humanizadas se exponen en el listado de secuencias adjunto como las SEQ ID NOS : 404-413.
Aparte de los aspectos mencionados anteriormente, otras modalidades preferidas de la presente invención comprenderán moduladores de DLL3 asociados o conjugados con uno o más fármacos para proporcionar conjugados de moduladores que puede que sean particularmente efectivos en el tratamiento de trastornos proliferativos (solos o combinados con otros agentes farmacéuticamente activos) . Más generalmente, una vez que se hayan fabricado los moduladores de la invención y se hayan seleccionado, se pueden asociar, fusionar o conjugar (p. ej . , de forma covalente o no covalente) o asociar de otro modo con restos para el diagnóstico o farmacéuticamente activos, o modificadores biocompatibles . Las expresiones "conjugado" o "conjugado de modulador" o "conjugado de anticuerpo", tal como se utilizan en la presente, se utilizarán en un sentido amplio y se sobreentenderá que se refieren a cualquier molécula biológicamente activa o detectable, o fármaco asociado con los moduladores descritos independientemente del método de asociación. A este respecto, se sobreentenderá que tales conjugados pueden comprender, además de los moduladores descritos, péptidos, polipéptidos , proteínas, profármacos que son metabolizados para obtener un agente activo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes aglutinantes, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos.
Además, como se ha indicado anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar asociado de forma covalente o no covalente con el modulador o ligado a este y exhibir diversas proporciones molares estequiométricas dependiendo, al menos en parte, del método empleado para conseguir la conjugación.
Los aspectos particularmente preferidos de la presente invención, comprenderán conjugados de modulador-anticuerpo o conjugados de anticuerpo-fármaco que se pueden utilizar para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos proliferativos . Tales conjugados pueden estar representados por la fórmula M-[L-D]n, donde M representa un modulador descrito o un resto de unión a la diana, L es un conector opcional o unidad conectora, D es un fármaco o profármaco compatible, y n es un número entero comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20. Se apreciará que, a menos que el contexto dicte lo contrario, se sobreentenderá que las expresiones "conjugado de anticuerpo-fármaco" o "ADC" (por sus siglas en inglés) o la fórmula M-[L-D]n abarcan los conjugados que comprenden tanto restos terapéuticos como de diagnóstico. En tales modalidades, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco comprenderán normalmente anti-DLL3 como la unidad moduladora (M) , un resto terapéutico o de diagnóstico (D) , y opcionalmente un conector (L) que une el fármaco al agente de unión al antígeno. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un mAb de DLL3 que comprende al menos una CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera como las descritas anteriormente.
Como se ha indicado previamente, un aspecto de la invención puede comprender la asociación terapéutica inesperada de los polipéptidos DLL3 con células madre cancerosas. Por lo tanto, en ciertas modalidades diferentes, la invención comprenderá un modulador de DLL3 que reduce la frecuencia de las células iniciadoras de tumores al administrarlo a un sujeto. Preferentemente, la reducción de la frecuencia se determinará utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo. En modalidades particularmente preferidas, el análisis se puede llevar a cabo utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprenda el trasplante de células tumorales humanas vivas en ratones inmunodeprimidos (p. ej . , remítase al Ejemplo 17 de más adelante) . Como alternativa, el análisis de dilución limitante se puede llevar a cabo utilizando un análisis de dilución limitante in vitro que comprenda la deposición por dilución limitante de células tumorales humanas vivas en condiciones que estimulen las colonias in vitro. En cualquier caso, el análisis, el cálculo o la cuantificación de la reducción de la frecuencia comprenderá preferentemente el uso del modelo estadístico de la distribución de Poisson para proporcionar un recuento preciso. Se apreciará que, a pesar de que se prefieran estos métodos de cuantificación, también se pueden utilizar otras metodologías menos laboriosas, tales como la citometría de flujo o la inmunohistoquímica para proporcionar los valores deseados y, por consiguiente, se contemplan expresamente como incluidos dentro del alcance de la presente invención. En estos casos, la reducción de la frecuencia se puede determinar utilizando un análisis por citometría de flujo o una detección inmunohistoquímica de los marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores.
Como tal, otra modalidad preferida de la presente invención comprende un método para tratar un trastorno asociado con DLL3 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de DLL3 a un sujeto que lo necesita, mediante el cual se reduce la frecuencia de las células iniciadoras de tumores. Preferentemente, el trastorno asociado con DLL3 comprende un trastorno neoplásico. De nuevo, la reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se determinará preferentemente utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.
A este respecto, se apreciará que la presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los inmunógenos de DLL3 se asocian terapéu icamente con las células perpetuantes de tumores (es decir, células madre cancerosas) que intervienen en la etiología de diversos trastornos proliterativos incluidas las neoplasias. Más específicamente, la presente solicitud demuestra inesperadamente que la administración de diversos moduladores de DLL3 ilustrativos puede mediar, reducir, agotar, inhibir o eliminar la señalización tumorigénica por parte de células iniciadoras de tumores (es decir, reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores) . Esta señalización reducida, ya sea por agotamiento, neutralización, reducción, eliminación, reprogramación o silenciamiento de las células iniciadoras de tumores o por modificación de la morfología de las células tumorales (p. ej . , diferenciación inducida, disrupción del nicho (microentorno) ) , a su vez permite el tratamiento más efectivo de trastornos asociados con DLL3 mediante la inhibición de la tumorigénesis , el mantenimiento, la expansión y/o la metástasis y la recidiva tumoral .
Aparte de la asociación mencionada anteriormente con células madre cancerosas, existen pruebas de que las isoformas de DLL3 pueden intervenir en el crecimiento, la recidiva o el potencial metastásico de tumores que comprenden o exhiben características o determinantes (genotípicos o fenotípicos) neuroendocrinos . A los efectos de la presente invención, este tipo de tumores comprenderán tumores neuroendocrinos y tumores pseudoneuroendocrinos . La intervención en la proliferación de tales células tumorigénicas utilizando los moduladores de DLL3 novedosos descritos en la presente puede mejorar o tratar de este modo un trastorno mediante más de un mecanismo (p. ej . , la reducción de las células iniciadoras de tumores y la disrupción de la señalización de la vía oncogénica) para proporcionar efectos aditivos o sinérgicos. Otras modalidades preferidas adicionales pueden aprovechar la internalización celular de la proteína DLL3 de la superficie celular para proporcionar un agente anticanceroso mediado por un modulador. A este respecto, se apreciará que la presente invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular sino que abarca el uso general de los moduladores descritos para tratar trastornos asociados con DLL3 (incluidas diversas neoplasias) .
Por tanto, en otras modalidades, la presente invención comprenderá el uso de los moduladores descritos para tratar tumores que comprenden características neuroendocrinas en un sujeto que lo necesite. Por supuesto, se pueden utilizar los mismos moduladores para la profilaxis, el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, la inhibición o la terapia de mantenimiento de estos mismos tumores.
Otras facetas de la presente invención explotan la capacidad de los moduladores descritos para interrumpir potencialmente las vías oncogénicas (p. ej . , Notch) a la vez que silencian simultáneamente las células iniciadoras de tumores. Tales moduladores de DLL3 multiactivos (p. ej . , antagonistas de DLL3 ) pueden resultar particularmente efectivos cuando se usan combinados con agentes anticancerosos o agentes citorreductores de uso habitual. Por consiguiente, las modalidades preferidas de la presente invención comprenden el uso de los moduladores descritos como agentes antimetastásicos para la terapia de mantenimiento después de tratamientos iniciales. Además, se pueden utilizar dos o más antagonistas de DLL3 (p. ej . , anticuerpos que se unen específicamente a dos epítopos discretos en DLL3) combinados de acuerdo con los principios de la presente. Asimismo, como se indica en cierto detalle más adelante, los moduladores de DLL3 de la presente invención se pueden utilizar en un estado conjugado o no conjugado y, opcionalmente, como un agente sensibilizante, combinados con diversos agentes anticancerosos químicos o biológicos.
Por consiguiente, otra modalidad preferida de la presente invención comprende un método de sensibilización de un tumor en un sujeto para tratarlo con un agente anticanceroso que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3 a el sujeto. Otras modalidades comprenden un método para reducir la metástasis o recidiva tumoral después de un tratamiento que comprende administrar un modulador de DLL3 a un sujeto que lo necesite. En un aspecto particularmente preferido de la invención, el modulador de DLL3 provocará específicamente una reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores tal como se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.
Las modalidades más generalmente preferidas de la invención comprenden un método para tratar un trastorno asociado con DLL3 en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3 al sujeto. En modalidades particularmente preferidas, el modulador de DLL3 se asociará (p. ej . , conjugará) con un agente anticanceroso. En otras modalidades más, el modulador de DLL3 se internalizará después de asociarse o unirse a DLL3 en o cerca de la superficie de la célula. Además, los aspectos beneficiosos de la presente invención, que incluyen cualquier alteración de las vías de señalización y beneficios colaterales, se pueden conseguir tanto si el tejido tumoral del sujeto exhibe unos niveles elevados de DLL3 , como unos niveles reducidos o bajos de DLL3 en comparación con el tejido adyacente normal. Las modalidades particularmente preferidas comprenderán el tratamiento de trastornos que exhiben unos niveles elevados de DLL3 en células tumorigénicas en comparación con el tejido normal o células no tumorigénicas .
En otro aspecto más, la presente invención comprenderá un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de DLL3 internalizante. Las modalidades preferidas comprenderán la administración de moduladores de tipo anticuerpo internalizantes, donde los moduladores se conjugan o asocian con un agente citotóxico.
Otras modalidades se refieren a un método para tratar un sujeto que padece un trastorno asociado con DLL3 que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de DLL3 supresor .
En otra modalidad más, la presente invención proporciona métodos de terapia de mantenimiento, donde los efectores o moduladores descritos se administran durante un período después de un procedimiento inicial (p. ej . , quimioterapia, radiación o cirugía) diseñado para eliminar al menos una porción de la masa tumoral . Tales regímenes de mantenimiento terapéutico se pueden administrar durante un período de semanas, un período de meses o incluso un período de años, durante el cual los moduladores de DLL3 pueden actuar profilácticamente para inhibir la metástasis y/o recidiva tumoral. En otras modalidades más, los moduladores descritos se pueden administrar de forma concertada con regímenes citorreductores conocidos para prevenir o retardar la metástasis, el mantenimiento o la recidiva tumoral.
Como se ha indicado anteriormente, los moduladores de DLL3 de la presente invención se pueden fabricar y/o seleccionar para que reaccionen con una o ambas isoformas de la proteína DLL3 o, por el contrario, pueden comprender un modulador de pan-DLL que reaccione o se asocie con al menos un miembro de la familia DLL adicional además de DLL3. Más específicamente, los moduladores preferidos, tales como anticuerpos, se pueden generar y seleccionar de modo que reaccionen con dominios (o epítopos de estos) que exhiben DLL3 únicamente o con dominios que están conservados al menos en cierto modo entre múltiples o todos los miembros de la familia DLL.
En otras modalidades preferidas más, los moduladores se asociarán o unirán a un epítopo, una porción, un motivo o un dominio específico de DLL3. Como se indicará en cierto detalle más adelante, ambas isoformas de DLL3 incorporan una región extracelular idéntica (remítase a la FIG. 1F) que comprende al menos un dominio aminoterminal , un dominio DSL (Delta/Serrate/lag-2) y seis dominios similares a EGF (es decir, EGF1-EGF6) . Por consiguiente, en ciertas modalidades, los moduladores se unirán o asociarán con el dominio aminoterminal de DLL3 (es decir, los aminoácidos 27-175 de la proteína madura) mientras que, en otras modalidades seleccionadas, los moduladores se asociarán con el dominio DSL (es decir, los aminoácidos 176-215) o un epítopo en este.
Otros aspectos de la presente invención comprenden moduladores que se asocian o se unen a un epítopo específico situado en un dominio similar a EGF particular de DLL3. A este respecto, el modulador particular se puede asociar o unir a un epítopo situado en EGF1 (los aminoácidos 216-249) , EGF2 (los aminoácidos 274-310) , EGF3 (los aminoácidos 312-351), EGF4 (los aminoácidos 353-389), EGF5 (los aminoácidos 391-427) o EGF6 (los aminoácidos 429-465) . Por supuesto, se apreciará que cada uno de los dominios mencionados anteriormente puede comprender más de un epítopo y/o más de una sección. En modalidades particularmente preferidas, la invención comprenderá un modulador que se une, reacciona o se asocia con el dominio DSL o un epítopo en este. En otras modalidades preferidas, la invención comprenderá moduladores que se unen, reaccionan o se asocian con un dominio similar a EGF particular o un epítopo en este. En otras modalidades preferidas más, los moduladores se unirán, reaccionarán o se asociarán con el dominio aminoterminal o un epítopo en este.
En lo que respecta a las "secciones" de modulador o anticuerpo, se apreciará que el antígeno de DLL3 se puede analizar o mapear mediante la unión competitiva al anticuerpo utilizando técnicas reconocidas en la materia para definir secciones específicas situadas en o a lo largo de la proteína. Como se describe más detalladamente en la presente y se muestra en los Ejemplo 9 y 10 más adelante, se puede considerar que dos anticuerpos (uno de los cuales se puede denominar "anticuerpo de referencia", "anticuerpo delineante de secciones" o "anticuerpo delineante") están en la misma sección si compiten entre sí por la unión al antígeno diana. En tales casos, los epítopos del anticuerpo en cuestión pueden ser idénticos, sustancialmente idénticos o lo suficientemente cercanos (ya sea en un sentido lineal en el que están separados por unos pocos aminoácidos o conformacionalmente) de modo que la unión de ambos anticuerpos al antígeno esté inhibida o impedida estérica o electrostáticamente. Tales secciones definidas se pueden asociar generalmente con ciertos dominios de DLL3 (p. ej . , el anticuerpo de referencia se unirá a un epítopo contenido en un dominio específico) aunque la correlación no es siempre precisa (p. ej . , puede haber más de una sección en un dominio o la sección puede estar definida conformacionalmente y comprender más de un dominio) . Se apreciará que los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente la relación entre los dominios DLL3 y las secciones determinadas empíricamente.
En lo que respecta a la presente invención, el análisis de la unión competitiva utilizando técnicas conocidas en el campo (p. ej . , ELISA, resonancia de plasmones superficiales o interferometría de biocapa) definió al menos nueve secciones diferentes, cada una de las cuales se comprobó que contenía múltiples moduladores de tipo anticuerpo. A los efectos de la presente exposición, las nueve secciones se denominaron de la sección A a la sección I. Por tanto, en modalidades seleccionadas, la presente invención comprenderá un modulador que reside en una sección seleccionada del grupo constituido por la sección A, sección B, sección C, sección D, sección E, sección F, sección G, sección H y sección I. En otras modalidades, la presente invención comprende un modulador que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado entre el grupo constituido por SC16 -3, SC16.4, SC16.5, SC16 .7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16 .13, SC16. .15, SC16 .18, SC16.19, SC16 .20, SC16.21, SC16 .22, SC16. ,23, SC16 .25, SC16.26, SC16 .29, SC16.30, SC16 .31, SC16. 34, SC16 •35, SC16.36, SC16 .38, SC16.39, SC16 .41, SC16. 42, SC16 .45, SC16.47, SC16 • 49, SC16.50, SC16 .52, SC16. 55, SC16 .56, SC16.57, SC16 .58, SC16.61, SC16 .62, SC16. 63, SC16 .65, SC16.67, SC16 .68, SC16.72, SC16 • 73, SC16. 78, SC16 • 79, SC16.80, SC16 .81, SC16.84, SC16 .88, SC16.101, SC16. 103, SC16.104 , SC16. 105, SC16.106, SC16 .107, SC16. 108, SC16. 109, SC16.110, SC16. ni, SC16.113, SC16 .114, SC16. 115, SC16. 116, SC16.117, SC16. 118, SC16.120, SC16 .121, SC16. 122 , SC16. 123, SC16.124, SC16. 125, SC16.126, SC16 .129, SC16. 130, SC16. 131, SC16.132, SC16. 133, SC16.134, SC16 .135, SC16. 136, SC16. 137, SC16.138, SC16. 139, SC16.140, SC16 .141, SC16. 142, SC16. 143 , SC16.144, SC16. 147, SC16.148, SC16 .149 y SC16.150 . En otras modalidades adicionales, la invención comprenderá moduladores de la sección A, moduladores de la sección B, moduladores de la sección C, moduladores de la sección D, moduladores de la sección E, moduladores de la sección F, moduladores de la sección G, moduladores de la sección H o moduladores de la sección I. Otras modalidades preferidas más comprenderán un modulador de tipo anticuerpo de referencia y cualquier anticuerpo que compita con el anticuerpo de referencia.
La expresión "competir" o "anticuerpo competitivo", cuando se utiliza en el contexto de los moduladores descritos, se refiere a la competición por la unión entre anticuerpos según se determina con un ensayo en el que un anticuerpo de referencia o un fragmento inmunológicamente funcional previene o inhibe sustancialmente (p. ej . , más de un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90%) la unión específica de un anticuerpo de ensayo a un antígeno común. Los métodos compatibles para determinar la competición comprenden técnicas conocidas en el campo tales como, por ejemplo, interferometría de biocapa, resonancia de plasmones superficiales, citometría de flujo, ELISA competitivo, etc.
Aparte de los moduladores mencionados anteriormente, en modalidades seleccionadas, la invención comprende un modulador de pan-DLL que se asocia con DLL3 y al menos otro miembro de la familia DLL. En otras modalidades seleccionadas, la invención comprende un modulador de DLL3 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de DLL3 pero no se asocia inmunoespecíficamente con ningún otro miembro de la familia DLL. En otras modalidades más, la presente invención comprende un método para tratar un sujeto que lo necesite que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de pan-DLL. Otras modalidades adicionales comprenden un método para tratar un sujeto que lo necesite que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de DLL3 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de DLL3 pero que no se asocia inmunoespecíficamente con ningún otro miembro de la familia DLL.
Además de los usos terapéuticos descritos anteriormente, también se apreciará que los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para detectar, diagnosticar o clasificar los trastornos relacionados con DLL3 y, en particular, trastornos proliferativos . También se pueden utilizar en el pronóstico y/o el teragnóstico de tales trastornos. En algunas modalidades, el modulador se puede administrar al sujeto y detectar o monitorizar in vivo. Los expertos en la técnica apreciarán que tales moduladores se pueden marcar o asociar con efectores, marcadores o indicadores como los que se describen más adelante, y se pueden detectar utilizando cualquiera de numerosas técnicas estándar (p. ej . , M I, escaneo CAT, escaneo PET, etc.) .
Por lo tanto, en algunas modalidades, la invención comprenderá un método para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con DLL3 in vivo en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3.
En otros casos, los moduladores se pueden utilizar en un contexto de diagnóstico in vitro utilizando procedimientos reconocidos en la técnica (p. ej . , inmunohistoquímica o IHC) . Como tal, una modalidad preferida comprende un método para diagnosticar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto que lo necesite que comprende los pasos de: a. obtener una muestra de tejido de el sujeto; b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de DLL3 ; y c. detectar o cuantificar el modulador de DLL3 asociado con la muestra.
Tales métodos se pueden apreciar fácilmente junto con la presente solicitud y se pueden poner en práctica fácilmente utilizando la tecnología comercial generalmente disponible tal como lectores de placas automáticos, sistemas indicadores específicos, etc. En modalidades seleccionadas, el modulador de DLL3 se asociará con las células perpetuantes de tumores (es decir, células madre cancerosas) presentes en la muestra. En otras modalidades preferidas, el paso de detección o cuantificación comprenderá una reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores la cual se puede monitorizar como se describe en la presente.
Del mismo modo, la presente invención también proporciona kits o dispositivos y métodos asociados que son útiles en el diagnóstico y la monitorización de trastornos asociados con DLL3 tales como el cáncer. Con este fin, la presente invención proporciona preferentemente un artículo manufacturado útil para detectar, diagnosticar o tratar trastornos asociados con DLL3 que comprende un receptáculo que contiene un modulador de DLL3 y materiales instructivos para utilizar el modulador DLL3 para tratar, monitorizar o diagnosticar el trastorno asociado con DLL3. En modalidades seleccionadas, los dispositivos y los métodos asociados comprenderán el paso de establecer contacto con al menos una célula tumoral circulante.
Otras modalidades preferidas de la invención también explotan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, caracterizar, aislar, seleccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores mediante métodos tales como la inmunohistoquimica, el análisis por citometría de flujo incluida la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o el seccionamiento mediado por láser.
Como tal, otra modalidad preferida de la presente invención se refiere a un método para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células iniciadoras de tumores que comprende el paso de poner en contacto las células iniciadoras de tumores con un modulador de DLL3.
Lo que antecede es un sumario y, por lo tanto, contiene necesariamente simplificaciones, generalizaciones y omisiones de detalles; por consiguiente, los expertos en la técnica apreciarán que el sumario es únicamente ilustrativo y no se pretende que sea limitante de ningún modo. Otros aspectos, características y ventajas de los métodos, las composiciones y/o los dispositivos y/o otros contenidos que se describen en la presente serán evidentes en vista de los principios que se exponen en la presente. El sumario se proporciona para introducir una selección de conceptos de una forma simplificada los cuales se describen más detalladamente a continuación en la Descripción detallada. No se pretende que este sumario identifique características clave ni características esenciales del contenido reivindicado, ni tampoco se pretende que se utilice como herramienta para determinar el alcance del contenido reivindicado.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las FIGS. 1A-1F son varias representaciones de DLL3 que incluyen secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, donde los ARNm completos que contienen los ORF (subrayados) que codifican las isoformas DLL3 están representados en las FIGS. 1A(SEQ ID:1) y IB (SEQ ID NO:2), las FIGS. 1C (SEQ ID NO:3) y ID (SEQ ID NO: 4) proporcionan la traducción de los ORF señalados en las FIGS. 1A y IB, respectivamente, donde los residuos subrayados indican el dominio de expansión transmembranal preel para cada isoforma de la proteina, la FIG. 1E representa la alineación de las dos isoformas de la proteina para ilustrar las diferencias secuenciales en los extremos citoplasmáticos de cada isoforma, donde nuevamente los residuos subrayados indican el dominio de expansión transmembranal predicho, y la FIG. 1F proporciona una representación esquemática de la reqión extracelular de la proteina DLL3 que ilustra las posiciones de los diferentes dominios ; las FIGS. 2A y 2B son representaciones tabulares del porcentaje de identidad a nivel proteico entre DLL3 y otros miembros de la familia de tipo delta en el genoma humano (FIG. 2A) o la isoforma humana más similar de DLL3 y las proteínas DLL3 de mono Rhesus, ratón y rata (FIG. 2B) ; la FIG. 3 ilustra esquemáticamente las interacciones genéticas entre varios genes "maestros" relevantes para las elecciones del destino celular que conducen a fenotipos neuroendocrinos o no neuroendocrinos (las flechas indican la promoción de la expresión génica y las flechas bloqueadas indican la inhibición de la expresión génica) , en donde la expresión del factor de transcripción ASCL1 inicia una cascada génica (flecha ancha) la cual conduce a un fenotipo neuroendocrino a la vez que activa simultáneamente DLL3 , que a su vez suprime N0TCH1 y su efector HES1, los cuales son ambos normalmente responsables de la supresión de ASCLl y la activación de cascadas génicas que conducen a un fenotipo no neuroendocrino; las FIGS . 4A y 4B son representaciones tabulares (FIG. 4A) y gráficas (FIG. 4B) de los niveles de expresión génica de DLL3 y, en la FIG. 4A, otros genes de las vías Notch o genes asociados con un fenotipo neuroendocrino según se midieron utilizando una secuenciación del transcriptoma completo (SOLiD) del ARN derivado de subpoblaciones de células tumorales o tejidos normales; la FIG. 5 es una representación gráfica de los niveles de expresión relativa de las variantes 1 y 2 del trascrito del AR m de DLL3 según se determinaron mediante la secuenciación del transcriptoma completo (SOLiD) en tumores de xenoinjerto no tradicionales (NTX, por sus siglas en inglés) derivados de cánceres de pulmón; las FIGS. 6A-6D muestran los datos de la expresión génica y la agrupación de tumores que exhiben características neuroendocrinas , donde la FIG. 6A representa la agrupación no supervisada de perfiles micromatriciales para 46 líneas tumorales y 2 tejidos normales que comprenden tumores seleccionados y tejidos de control normales, las FIGS. 6B y 6C son representaciones tabulares de los valores de la intensidad normalizada correspondientes a los niveles de expresión relativa de genes seleccionados relacionados con fenotipos neuroendocrinos (FIG. 6B) o la vía de señalización Notch (FIG. 6C) , donde las células sin sombreado y los números relativamente bajos indican poca o nada de expresión y las células más oscuras y los números relativamente mayores indican unos niveles de expresión más elevados, y la FIG. 6D es una representación gráfica que muestra los niveles de expresión relativa del ARNm de HES6 en diversos tumores y tejidos normales según se midieron utilizando qRT-PCR; la FIG. 7 es una representación gráfica que muestra los niveles de expresión relativa de los transcritos de DLL3 según se midieron por qRT-PCR en diversas muestras de ARN aisladas a partir de tejidos normales, principalmente, muestras de tumores de pacientes sin pases (denominados "pO") o tumores NTX enteros derivados de una neoplasia de pulmón, riñon y ovario, donde los tumores de pulmón NTX específicos se agrupan en cáncer de pulmón microcítico (SCLC) y cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (denominados l, p2 , p3 o p4 para reflejar el número de pases desde los ratones) , donde el tipo de tumor se señala utilizando las abreviaturas indicadas anteriormente ; las FIGS . 8A-8C son representaciones gráficas que muestran los niveles de expresión génica relativa (FIG. 8A) o absoluta (FIG. 8B) de la DLL3 humana según se midieron por qRT-PCR en muestras de tumores enteros (punto gris) o tejido adyacente normal de características similares (NAT, por sus siglas en inglés; punto blanco) de pacientes con uno de dieciocho tipos de tumores sólidos diferentes mientras que la FIG. 8C muestra la expresión proteica relativa de la DLL3 humana según se midió utilizando un ensayo ELISA sánd ich electroquimioluminiscente; la FIG. 9 proporciona representaciones gráficas de la determinación basada en citometria de flujo de la expresión proteica superficial de diversos receptores y ligandos Notch (p. ej . , DLL1, DLL4) en poblaciones de células tumorales humanas individuales derivadas de tumores NTX de riñon, ovario y pulmón microcítico, presentada como histogramas (línea negra) con referencia a la fluorescencia menos uno (FMO, siglas en inglés de fluorescence minus one) de una población teñida de control isotípico (gris sólido) con las intensidades de fluorescencia medias indicadas (MFI, por sus siglas en inglés) ; las FIGS. 10A-10D proporcionan, respectivamente la secuencia de ADNc (FIG. 10A; SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos (FIG. 10B; SEQ ID NO: 6) que codifica la proteína DLL3 murina madura clonada en un vector de expresión lentiviral, y la secuencia de ADNc (FIG. 10C; SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos (FIG. 10D; SEQ ID NO: 8) que codifica la proteína DLL3 cinomóloga madura clonada en un vector de expresión lentiviral, donde los vectores se utilizan para generar células que sobreexpresen la DLL3 murina y cinomóloga ; las FIGS . 11A y 11B proporcionan, en un formato tabular, secuencias de aminoácidos contiguas (SEQ ID NOS: 20-213) de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de varios moduladores de DLL3 ilustrativos humanizados y murinos aislados, clonados y modificados como se describe en los Ejemplos de la presente ,- la FIG. 12 expone las propiedades bioquímicas e inmunológicas de moduladores de DLL3 ilustrativos así como también su capacidad para aniquilar células de NTX KDY66 in vitro según se representa en un formato tabular; las FIGS. 13A-13C ilustran características de unión de moduladores seleccionados, donde las FIGS. 13A y 13B muestran características de unión comparativas de un modulador murino seleccionado y su equivalente humanizado utilizando resonancia de plasmones superficiales mientras que la FIG. 13C proporciona ciertas propiedades de los constructos humanizados en un formato tabular; las FIGS. 14A y 14B representan, en forma esquemática y gráfica respectivamente, los resultados del análisis por mapeo de nivel-dominio de los moduladores de DLL3 ilustrativos aislados, clonados y modificados como se describe en los Ejemplos de la presente (FIG. 14A) y una correlación entre el dominio de unión de moduladores seleccionados y la capacidad para aniquilar células de NTX KDY66 que expresan DLL3 in vitro (FIG. 14B) ; las FIGS . 15A-15C son histogramas de citometría de flujo que muestran la expresión de DLL3 utilizando el modulador anti-DLL3 ilustrativo SC16.56 en células 293 vírgenes (FIG. 15A) , células 293 modificadas genéticamente para sobreexpresar proteínas DLL3 humanas (h293-hDLL3; FIG. 15B) o células 293 modificadas genéticamente para sobreexpresar la proteína DLL3 murina (h293-mDLL3; FIG. 15C) ; las FIGS. 16A-16F comprenden histogramas de citometría de flujo (FIGS. 16A-16C) y resultados inmunohistoquímicos en un formato tabular (FIGS. 16D-16F) que ilustran, respectivamente, la expresión superficial relativamente alta de DLL3 utilizando el modulador anti-DLL3 ilustrativo SC16.56 en células humanas de tumores NTX de ovario (OV26; FIG. 16A) , riñon (KDY66; FIG. 16B) y un carcinoma de pulmón neuroendocrino de células grandes (LU37; FIG. 16C) , y la expresión de la proteína DLL3 en diversos tumores NTX (FIG. 16D) y células tumorales de carcinoma microcítico primario (FIG. 16F) a la vez que se demuestra que el tejido normal carece de la expresión de DLL3 (FIG. 16E) ; las FIGS. 17A-17C ilustran la capacidad de los moduladores descritos para dirigir de forma eficaz las cargas útiles citotóxicas a las células que expresan DLL3 donde la FIG. 17A documenta la capacidad de moduladores ilustrativos para aniquilar tumores NTX KDY66 o células 293 que sobreexpresan hDLL3, y las FIGS. 17B y 17C demuestran la capacidad de los moduladores descritos para suministrar cargas útiles citotóxicas a OV26 (FIG. 17B) y LU37 (FIG. 17C) , donde la curva con pendiente descendente indica la aniquilación de células a través de la citotoxina internalizada; las FIGS. 18A-18E ilustran diversas propiedades de los moduladores descritos, donde las FIGS. 18A y 18C demuestran por citometría de flujo que las DLL3 NSHP KDY66 y KDY66 vírgenes expresan DLL3 mientras que la expresión de DLL3 se redujo de forma eficiente en las células DLL3HP2 KDY66, la FIG. 18B muestra que el crecimiento de las células tumorales DLL3HP2 es inferior al de las células KDY66 vírgenes, y la FIGS. 18D y 18E demuestran que las modalidades conjugadas de la presente invención atacan y aniquilan inmunoespecíficamente células tumorales KDY66 que expresan DLL3 pero no KDY66 con DLL3 desactivado; las FIGS. 19A-19C muestran la capacidad de modalidades conjugadas seleccionadas de la presente invención para aniquilar y/o suprimir el crecimiento de células tumorigénicas de pulmón ilustrativas in vivo; las FIGS. 20A-20F representan la capacidad de moduladores conjugados de la presente invención para erradicar sustancialmente tumores y prevenir la recidiva tumoral in vivo — alcanzando remisiones duraderas en ratones inmunodeficientes sometidos a injertos de tumores de ovario (FIG. 20A) , pulmón (FIGS. 20B - 20D) y riñon (FIGS. 20E y 20F) ; y las FIGS. 21A-21F demuestran que los moduladores conjugados de la presente invención reducen la frecuencia de las células madre cancerosas según se determinó mediante un ensayo de dilución limitante (LDA, por sus siglas en inglés) para dos tumores de pulmón microcíticos ilustrativos LU95 (FIGS. 21A - 21C) y LU64 (FIGS. 21D - 21F) , donde las FIGS. 21A y 21D muestran el efecto de los conjugados sobre el crecimiento tumoral, las FIGS. 21B y 21E muestran los resultados del LDA y las FIGS. 21C y 21F presentan gráficamente la reducción en la frecuencia de las células madre cancerosas conseguida mediante el tratamiento con el conjugado de anticuerpo anti-DLL3 seleccionado.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I . Introducción A pesar de que la presente invención se pueda materializar de muchas formas diferentes, en la presente se describen modalidades ilustrativas específicas de esta que ejemplifican los principios de la invención. Cabe destacar que la presente invención no se limita a las modalidades específicas ilustradas. Además, todos los títulos de las secciones utilizados en la presente tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes del contenido descrito. Por último, a los efectos de la presente exposición, todos los números de acceso identificativos de secuencias se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de referencia (RefSeq) del NCBI y/o la base de datos de archivo de secuencias GenBank18 del NCBI a menos que se indique lo contrario.
Como se ha indicado anteriormente, se ha descubierto que sorprendentemente los determinantes genotípicos y/o fenotípicos de DLL3 están asociados con diversos trastornos proliferativos , incluidas las neoplasias que exhiben características neuroendocrinas, y que DLL3 y sus variantes o isoformas proporcionan marcadores tumorales útiles que se pueden explotar en el tratamiento de enfermedades relacionadas. Además, como se muestra en la presente solicitud, se ha descubierto inesperadamente que los marcadores o determinantes de DDL3 , tales como la proteína DLL3 de la superficie celular, están asociados terapéuticamente con las células madre cancerosas (conocidas también como células perpetuantes de tumores) y se pueden explotar de forma efectiva para su eliminación o silenciamiento . La capacidad para reducir o eliminar de forma selectiva las células madre cancerosas (p. ej . , mediante el uso de moduladores de DLL3 conjugados) es particularmente sorprendente ya que se sabe que estas células son generalmente resistentes a muchos tratamientos convencionales. Es decir, la efectividad de los métodos de tratamiento dirigidos tradicionales, así como también de los más recientes, normalmente está limitada por la existencia y/o la emergencia de células madre cancerosas resistentes que son capaces de perpetuar el crecimiento tumoral incluso ante estos diferentes métodos de tratamiento. Además, los determinantes asociados con las células madre cancerosas suelen ser malas dianas terapéuticas debido a que su expresión es baja o inestable, a que no se mantienen asociados con la célula tumorigénica o a que no están presentes en la superficie celular. En contraste drástico con los principios de la técnica anterior, los compuestos y métodos descritos en la presente superan de forma efectiva esta resistencia inherente y eliminan, agotan, silencian o promueven específicamente la diferenciación de estas células madre cancerosas, y de este modo anulan su capacidad para soportar o reinducir el crecimiento tumoral subyacente. Además, como la expresión de la proteína DLL3 se ha asociado en gran parte con posiciones intracelulares , tales como el Golgi, no estaba claro que los determinantes fenotípicos se pudieran explotar con éxito como diana terapéutica tal como se indica en la presente .
Por lo tanto, cabe destacar particularmente que los moduladores de DLL3 , tales como los que se describen en la presente, se pueden utilizar de forma conveniente en el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento y/o la prevención de trastornos proliferativos seleccionados (p. ej . , neoplásicos) en sujetos que lo necesiten. Se apreciará que, aunque a continuación se describan detalladamente las modalidades preferidas de la invención, particularmente en términos de dominios, regiones o epítopos particulares, o en el contexto de células madre cancerosas o tumores que comprenden características neuroendocrinas y sus interacciones con los moduladores descritos, los expertos en la técnica apreciarán que el alcance de la presente invención no se limita a tales modalidades ilustrativas. En cambio, las modalidades más expansivas de la presente invención y las reivindicaciones adjuntas se refieren de forma expresa y amplia a moduladores de DLL3 (incluidos los moduladores conjugados) y su uso en el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento y/o la prevención de diversos trastornos mediados por DLL3 o asociados con este, que incluyen trastornos proliferativos celulares o neoplásicos, independientemente de cualquier mecanismo particular de acción o del componente molecular o celular, o tumor al que se dirijan específicamente.
Con tal fin y tal como se demuestra en la presente solicitud, se ha descubierto inesperadamente que los moduladores de DLL3 descritos se pueden utilizar de forma efectiva para atacar y eliminar o incapacitar de algún otro modo células proliferativas o tumorigénicas y para tratar trastornos asociados con DLL3 (p. ej . , neoplasias) . La expresión "trastorno asociado con DLL3", tal como se utiliza en la presente, se sobreentenderá que se refiere a cualquier trastorno o enfermedad (incluidos los trastornos proliferativos) que se marque, diagnostique, detecte o identifique por una aberración fenotípica o genotípica de los componentes genéticos DLL3 o su expresión ("determinante de DLL3") durante el curso o la etiología de la enfermedad o trastorno. A este respecto, un determinante o aberración fenotípicos de DDL3 pueden comprender, por ejemplo, unos niveles elevados o reducidos de expresión de la proteína DLL3, una expresión anómala de la proteína DLL3 en ciertas poblaciones de células definibles o una expresión anómala de la proteína DLL3 en una fase o etapa inadecuada de un ciclo vital celular. Por supuesto, se apreciará que también se pueden utilizar patrones de expresión similares de determinantes genotípicos (p. ej . , niveles de transcripción de ARNm) de DLL3 para clasificar, detectar o tratar trastornos asociados con DLL3.
Las expresiones "determinante" o "determinante de DLL3 " , tal como se utilizan en la presente, se referirán a cualquier rasgo, propiedad, marcador o factor detectable que esté asociado identificablemente con una célula, una población de células o un tejido particular, o que se encuentre específicamente en o sobre estos, incluidos aquellos identificados en o sobre un tejido, una célula o una población de células afectados por una enfermedad o trastorno asociado con DLL3. En modalidades preferidas seleccionadas, los moduladores de DLL3 se pueden asociar, unir o reaccionar directamente con el determinante de DLL3 (p. ej . , la proteína DLL3 de la superficie celular o el ARNm de DLL3) y de este modo mejoran el trastorno. Más generalmente, los determinantes pueden ser de naturaleza morfológica, funcional o bioquímica y pueden ser genotípicos o fenotípicos. En otras modalidades preferidas, el determinante es un antígeno o un componente genético de la superficie celular que es expresado (o no) diferencial o preferencialmente por unos tipos de células específicas (p. ej . , células madre cancerosas) o por células en ciertas condiciones (p. ej . , durante puntos específicos del ciclo celular o células en un nicho particular) . En otras modalidades preferidas adicionales, el determinante puede comprender un gen o entidad genética que se regule (por aumento o disminución) de forma diferente en una célula o población de células discreta específica, un gen que se modifique diferencialmente respecto a su estructura física y composición química, o una proteína o colección de proteínas asociadas físicamente con un gen que presentan modificaciones químicas diferenciales. Los determinantes contemplados en la presente se consideran específicamente positivos o negativos, y pueden referirse a una célula, una subpoblación de células o un tejido (p. ej . , tumores), por su presencia (positivos) o ausencia (negativos) .
Del mismo modo, la expresión "moduladores de DLL3 " de la invención comprende en un sentido amplio cualquier compuesto que reconozca, reaccione, compita, antagonice, interaccione, se una, agonice o se asocie con una variante o isoforma de DLL3 (o dominios, regiones o epítopos específicos de estas) o su componente genético. Mediante estas interacciones, los moduladores de DLL3 pueden eliminar, reducir o moderar convenientemente la frecuencia, actividad, recidiva, metástasis o movilidad de células tumorigénicas (p. ej . , células perpetuantes de tumores o células madre cancerosas) . Los moduladores ilustrativos descritos en la presente comprenden nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos , péptidos o polipéptidos . En ciertas modalidades preferidas, los moduladores seleccionados comprenderán anticuerpos de una isoforma de la proteína DLL3 , o fragmentos inmunorreactivos o derivados de estos. Tales anticuerpos pueden ser de naturaleza antagonista o agonista, y pueden estar opcionalmente conjugados o asociados con un agente terapéutico o de diagnóstico. Además, tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden comprender anticuerpos supresores, neutralizantes o internalizantes. En otras modalidades, los moduladores de la presente invención constituirán un constructo de DLL3 que comprenderá una isoforma de DLL3 o un fragmento reactivo de esta. Se apreciará que tales constructos pueden comprender proteínas de fusión y pueden incluir dominios reactivos de otros polipéptidos tales como inmunoglobulinas o modificadores de la respuesta biológica. En otros aspectos adicionales, el modulador de DLL3 comprenderá un resto de ácido nucleico (p. ej . , miARN, ARNip, ARNhc, constructos complementarios, etc.) que ejerce los efectos deseados a nivel genómico. Otros moduladores adicionales compatibles con los principios de la presente se discutirán detalladamente más adelante.
Más generalmente, los moduladores de DLL3 de la presente invención comprenden en un sentido amplio cualquier compuesto que reconozca, reaccione, compita, antagonice, interaccione, se una, agonice o se asocie con un determinante (genotípico o fenotípico) de DLL3 , incluida la proteína DLL3 de la superficie celular. Independientemente de la forma del modulador que seleccione en última instancia, este se encontrará preferentemente en un estado aislado y purificado antes de introducirlo en un sujeto. A este respecto, se sobreentenderá que la expresión "modulador de DDL3 aislado" o "anticuerpo de DLL3 aislado", en un sentido amplio y de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar, se refiere a cualquier preparado o composición que comprende el modulador en un estado sustancialmente exento de contaminantes (biológicos o de otro tipo) no deseados. Además, estos preparados se pueden purificar y formular, según se desee, utilizando diversas técnicas reconocidas en la materia. Por supuesto, se apreciará que tales preparados "aislados" se pueden formular o combinar intencionalmente con ingredientes activos o inertes, según se desee, para mejorar los aspectos comerciales, terapéuticos o de fabricación del producto final y proporcionar composiciones farmacéuticas. En un sentido más amplio, las mismas consideraciones generales se pueden aplicar a una isoforma o variante "aislada" de DLL3, o a un ácido nucleico "aislado" que las codifique.
Además, se ha descubierto que sorprendentemente los moduladores que interaccionan, se asocian o se unen a dominios, motivos o epítopos de DLL3 particulares son especialmente eficaces para eliminar células tumorigénicas y/o silenciar o atenuar la influencia de las células madre cancerosas sobre el crecimiento o la propagación tumoral . Es decir, a pesar de que los moduladores que reaccionan o se asocian con dominios que están próximos a la superficie celular (p. ej . , uno de los dominios similares a EGF) son eficaces para agotar o neutralizar las células tumorigénicas, se ha descubierto inesperadamente que los moduladores que se asocian o se unen a dominios, motivos o regiones que están relativamente más distantes de la superficie celular también son eficaces para eliminar, neutralizar, agotar o silenciar células tumorigénicas . En particular y tal como se muestra en los Ejemplos adjuntos, se ha descubierto que los moduladores que reaccionan, se asocian o se unen a las regiones DSL o aminoterminal de la proteína DLL3 son sorprendentemente eficaces para eliminar o neutralizar células tumorigénicas, incluidas aquellas que exhiben características neuroendocrinas , y/o células madre cancerosas. Esto es especialmente cierto en el caso de los moduladores conjugados tales como, por ejemplo, conjugados de anticuerpo anti-DLL3-fármaco que comprenden un agente citotóxico. Como tales, se apreciará que ciertas modalidades preferidas de la presente invención se refieren a compuestos, composiciones y métodos que comprenden moduladores de DLL3 que se asocian, se unen o reaccionan con una porción relativamente distante de DLL3 que incluye el dominio DSL o la región aminoterminal .
Aunque la presente invención contempla expresamente el uso de cualquier modulador de DLL3 en el tratamiento de cualquier trastorno asociado con DLL3, incluido cualquier tipo de neoplasia, en modalidades particularmente preferidas, los moduladores descritos se pueden utilizar para prevenir, tratar o diagnosticar tumores que comprenden características (fenotípicas o genotípicas) neuroendocrinas, incluidos los tumores neuroendocrinos . Los "tumores neuroendocrinos canónicos" (NET, por sus siglas en inglés) o verdaderos se originan en el sistema endocrino difuso y normalmente son muy agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en el riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , tubo gastrointestinal (estómago, colon) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes) . Además, los moduladores descritos se pueden utilizar convenientemente para tratar, prevenir o diagnosticar tumores pseudoneuroendocrinos (pNET, por sus siglas en inglés) que genotípica o fenotípicamente imitan, comprenden, se asemejan o exhiben rasgos comunes respecto a los tumores neuroendocrinos canónicos. Los "tumores pseudoneuroendocrinos" son tumores que se originan a partir de células del sistema neuroendocrino difuso o a partir de células en las que se ha reactivado de forma aberrante una cascada de diferenciación neuroendocrina durante el proceso oncogénico. Tales pNET normalmente comparten ciertas características genotípicas, fenotípicas o bioquímicas con tumores neuroendocrinos definidos tradicionalmente , que incluyen la capacidad para producir subconjuntos de aminas, neurotransmisores y hormonas peptídicas biológicamente activos. Por consiguiente, a los efectos de la presente invención, se sobreentenderá que las frases "tumores que comprenden características neuroendocrinas " o "tumores que exhiben características neuroendocrinas" comprenden tanto tumores neuroendocrinos como tumores pseudoneuroendocrinos a menos que el contexto dicte lo contrario.
Aparte de la asociación con tumores indicada de forma general anteriormente, también hay indicios de la asociación fenotípica o genotípica entre células iniciadoras de tumores (TIC, por sus siglas en inglés) y determinantes de DLL3. A este respecto, ciertas TIC seleccionadas (p. ej . , células madre cancerosas) pueden expresar niveles elevados de la proteína DLL3 cuando se comparan con tejido normal y células no tumorigénicas (NTG) , que juntas constituyen normalmente la mayor parte de un tumor sólido. Por lo tanto, los determinantes de DLL3 pueden comprender un marcador (o antígeno o inmunógeno) asociado con un tumor, y los moduladores descritos pueden proporcionar agentes eficaces para detectar y suprimir TIC y neoplasias asociadas debido a unos niveles alterados de las proteínas en las superficies celulares o en el microentorno tumoral . Por consiguiente, los moduladores de DLL3 , incluidos los antagonistas o anticuerpos inmunorreactivos que se asocian, unen o reaccionan con las proteínas, pueden reducir de forma efectiva las frecuencia de las células iniciadoras de tumores, y podrían ser útiles para eliminar, agotar, incapacitar, reducir, promover la diferenciación de estas células iniciadoras de tumores o para impedir o limitar su capacidad de permanecer en estado latente y/o continuar fomentando el crecimiento, la metástasis o la recidiva tumoral en un paciente. A este respecto, los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención proporciona además moduladores de DLL3 y su uso para reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores .
II . Fisiología de DLL3 La vía de señalización Notch, identificada por primera vez en C. elegans y Drosophila y cuya conservación evolutiva de invertebrados a vertebrados se demostró posteriormente, participa en una serie de procesos biológicos fundamentales incluidos el desarrollo embrionario normal, la homeostasis tisular en adultos y el mantenimiento de células madre (D'Souza et al., 2010; Liu et al., 2010). La señalización Notch es fundamental para diversos tipos de células durante su especificación, moldeo y morfogénesis. Habitualmente, esta tiene lugar mediante el mecanismo de inhibición lateral, en el que las células que expresan uno o más ligandos Notch adoptan un destino celular predeterminado, pero suprimen este destino en células adyacentes a través de la estimulación de la señalización Notch (Sternberg, 1988, Cabrera 1990) . Esta elección binaria del destino celular mediada por la señalización Notch se comprueba que desempeña una función en numerosos tejidos, incluidos el sistema nervioso en fase de desarrollo (de la Pompa et al., 1997), los sistemas inmunitario y hematopoyético (Bigas y Espinosoa, 2012; Hoyne et al., 2011; Nagase et al., 2011), el intestino (Fre et al., 2005; Fre et al., 2009), el páncreas endocrino (Apelqvist et al., 1999; Jensen et al., 2000), la pituitaria (Raetzman et al., 2004) y el sistema neuroendocrino difuso (Ito et al., 2000; Schonhoff et al., 2004) . Un mecanismo generalizado para implementar este cambio binario parece conservarse a pesar de la amplia variedad de sistemas de desarrollo en los que Notch desempeña una función-- en células en las que la elección del destino celular predeterminado es determinada por reguladores transcripcionales conocidos como las proteínas hélice-bucle-hélice básicas (bHLH, por sus siglas en inglés) , la señalización Notch conduce a la activación de una clase de genes que responden a Notch, que a su vez suprimen la actividad de las proteínas bHLH (Ball, 2004) . Estas decisiones binarias tienen lugar en un contexto más amplio de señales de desarrollo y señalización que permiten la señalización Notch para que se produzca la proliferación o inhibirla y para estimular la autorrenovacion o inhibirla.
En Drosophila, la señalización Notch es mediada fundamentalmente por un gen receptor Notch y dos genes ligandos, conocidos como Serrate y Delta (Wharton et al., 1985; Rebay et al., 1991). En los seres humanos, hay cuatro receptores Notch conocidos y cinco ligandos DSL (Delta-Serrate LAG2) -- dos homólogos de Serrate, conocidos como Jagged 1 y Jagged 2, y tres homólogos de Delta, denominados ligandos de tipo delta o DLL1 , DLL3 y DLL4. En general, los receptores Notch en la superficie de la célula receptora de señales se activan al interaccionar con ligandos expresados en la superficie de una célula emisora de señales opuesta (esta interacción se denomina interacción trans) . Estas interacciones trans conducen a una secuencia de escisiones del receptor Notch mediadas por proteasas. En consecuencia, el dominio intracelular del receptor Notch puede translocarse libremente de la membrana al núcleo, donde se asocia con la familia CSL de factores de transcripción ( BPJ en los seres humanos) y los convierte de represores transcripcionales en activadores de los genes que responden a Notch.
Entre los ligandos Notch humanos, DLL3 es diferente ya que parece ser incapaz de activar el receptor Notch mediante interacciones trans (Ladi et al., 2005) . Los ligandos Notch también pueden interaccionar con receptores Notch en cis (en la misma célula) lo cual provoca la inhibición de la señal Notch, aunque no se conocen los mecanismos exactos de la inhibición en cis y pueden variar dependiendo del ligando (remítase, por ejemplo, a Klein et al., 1997; Ladi et al., 2005; Glittenberg et al., 2006) . Dos modos de inhibición hipotéticos incluyen la modulación de la señalización de Notch en la superficie de la célula mediante la prevención de interacciones trans, o la reducción de la cantidad del receptor Notch en la superficie de la célula mediante la alteración del procesamiento del receptor o provocando la retención física del receptor en el retículo endoplasmático o Golgi (Sakamoto et al., 2002; Dunwoodie, 2009). Sin embargo, está claro que las diferencias estocásticas en la expresión de los ligandos y los receptores Notch en las células adyacentes se pueden amplificar a través de procesos tanto transcripcionales como no transcripcionales, y unos equilibrios sutiles de las interacciones cis y trans pueden dar lugar al ajuste preciso de la delineación mediada por Notch de destinos celulares divergentes en tejidos adyacentes (Sprinzak et al., 2010).
El DLL3 (conocido también como ligando de tipo Delta 3 o SCDOl) es un miembro de la familia de tipo Delta de ligandos DSL Notch. Los ortólogos de la proteína DLL3 representativos incluyen, sin carácter limitante, los humanos (N.os de acceso NP_058637 y NP_982353), de chimpancé (N.° de acceso XP_003316395) , de ratón (N.° de acceso NP_031892) y de rata (N.° de acceso NP_446118) . En los seres humanos, el gen DLL3 está constituido por 8 exones con una extensión de 9.5 kBp situados en el cromosoma 19ql3. El corte y empalme alternativo dentro del último exón da origen a dos trascritos procesados, uno de 2389 bases (N.° de acceso NM_016941 ; FIG. 1A, SEQ ID NO: 1) y uno de 2052 bases (N.° de acceso NM_203486; FIG. IB, SEQ ID NO: 2) . El primer transcrito codifica una proteína de 618 aminoácidos (N.° de acceso NP_058637; FIG. 1C, SEQ ID NO: 3), mientras que el último codifica una proteína de 587 aminoácidos (N.° de acceso NP_982353; FIG. ID, SEQ ID NO: 4). Estas dos isoformas proteicas de DLL3 comparten una identidad total del 100% a lo largo de sus dominios extracelulares y sus dominios transmembranales, diferenciándose únicamente en que la isoforma más larga contiene una cola citoplasmática extendida que contiene 32 residuos adicionales en el extremo carboxi de la proteína (FIG. 1E) . La relevancia biológica de las isoformas se desconoce, aunque ambas isoformas se pueden detectar en células tumorales (FIG. 5) . Los porcentajes de identidad de todos los miembros de la familia de proteínas de tipo delta en los seres humanos se muestran en la FIG. 2A, así como también identidades entre especies en la in FIG. 2B.
En general, los ligandos DSL están compuestos por una serie de dominios estructurales : un dominio aminoterminal único, seguido de un dominio DSL conservado, múltiples repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) en tándem, un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático que no está muy conservado entre los ligandos pero que contiene múltiples residuos de lisina que son sitios potenciales para la ubiquitinación por ubiquitina- ligasas E3 específicas. El dominio DSL es un dominio similar a EGF degenerado que es necesario pero no suficiente para las interacciones con receptores Notch (Shimizu et al., 1999). Adicionalmente, las dos primeras repeticiones similares a EGF de la mayoría de los ligandos DSL contienen un motivo de la secuencia proteica más pequeño conocido como un dominio DOS que interacciona cooperativamente con el dominio DSL cuando se está activando la señalización Notch.
La FIG. 1F proporciona un diagrama esquemático de la región extracelular de la proteína DLL3, que ilustra la yuxtaposición general de los seis dominios similares a EGF, el único dominio DSL y el dominio aminoterminal . En general, los dominios EGF se reconocen como los que aparecen en aproximadamente residuos aminoácidos 216-249 (dominio 1) , 274-310 (dominio 2) , 312-351 (dominio 3) , 353-389 (dominio 4) , 391-427 (dominio 5) y 429-465 (dominio 6) , con el dominio DSL en aproximadamente los residuos aminoacídicos 176-215 y el dominio aminoterminal en aproximadamente los residuos aminoacídicos 27-175 de hDLL3 (SEQ ID NOS: 3 y 4) . Como se indica más detalladamente en la presente y se muestra más adelante en el Ejemplo 10, cada uno de los dominios similares a EGF, el dominio DSL y el dominio aminoterminal comprenden parte de la proteína DLL3 tal como son definidos por una secuencia de aminoácidos característica. Cabe destacar que, a los efectos de la presente exposición, los respectivos dominios similares a EGF se pueden denominar EGF1-EGF6 siendo EGF1 el más próximo a la porción aminoterminal de la proteína. En lo que respecta a la composición estructural de la proteína, un aspecto significativo de la presente invención es que los moduladores de DLL3 descritos se pueden generar, fabricar, modificar o seleccionar de modo que reaccionen con un dominio, motivo o epítopo seleccionado. En ciertos casos, tales moduladores específicos para un sitio pueden proporcionar una mejor reactividad y/o eficacia dependiendo de su modo de acción principal .
Cabe destacar que las expresiones "proteína madura" o "polipéptido maduro", tal como se utilizan en la presente, se refieren a la forma o las formas de la proteína producidas por expresión en una célula de mamífero. En general se plantea la hipótesis de que una vez que se ha comenzado a exportar una cadena proteica en crecimiento a través del grueso retículo endoplasmático, las proteínas secretadas por las células de mamífero tienen una secuencia de péptido señal (PS) que se escinde del polipéptido completo para producir una forma "madura" de la proteína. En ambas isoformas de DLL3 , la proteína madura comprende un péptido señal de 26 aminoácidos que se puede escindir antes de la expresión en la superficie de la célula. Por lo tanto, en proteínas maduras el dominio aminoterminal se extenderá desde la posición 27 en la proteína hasta el principio del dominio DSL. Por supuesto, si la proteína no se procesa de este modo, se sobreentenderá que el dominio aminoterminal se extiende hasta la posición 1 de las SEQ ID NOS: 3 y 4.
Entre los ligandos de tipo Delta, el DLL3 es el más diferente de los demás en la familia, ya que contiene un dominio DSL degenerado, ningún motivo DOS y un dominio intracelular que carece de residuos de lisina. El DSL degenerado y la carencia de motivos DOS concuerda con la incapacidad de DLL3 para inducir la señalización Notch en trans (entre células), lo cual sugiere que DLL3 , a diferencia de DLL1 o DLL4, actúa únicamente como inhibidor de la señalización Notch (Ladi et al., 2005) . Unos estudios han demostrado que DLL3 puede residir principalmente en el cis-Golgi (Geffers et al., 2007), lo cual concuerda con su hipotética capacidad para retener el receptor Notch intracelularmente o para interferir con el procesamiento de los receptores Notch, lo cual impide que se exporte a la superficie celular y en su lugar lo redirige al lisosoma (Chapman et al., 2011) . Sin embargo, parte de la proteína DLL3 puede aparecer en la superficie celular cuando la proteína se sobreexpresa de modo artificial en sistemas modelo (Ladi et al., 2005), pero no es evidente que esto ocurra en contextos biológicos normales ni en tumores en los que los niveles del transcrito de ARNm de DLL3 son elevados; en cierto modo resulta sorprendente que los niveles proteicos detectados en ciertos tipos de tumores descritos en la presente indiquen que una cantidad significativa de la proteína DLL3 se escapa hasta la superficie celular de varios tumores.
Se han asociado defectos en el gen DLL3 con la disostosis espondilocostal en los seres humanos, un defecto de nacimiento congénito grave que provoca malformaciones en las vértebras y anomalías en las costillas (Dunwoodie, 2009) . Esto se asocia con alteraciones en la señalización Notch, que se sabe que desempeña una función crucial en la determinación de la polaridad y el moldeo de los somitas, los precursores embriónicos de las vértebras que requieren una relación oscilante regulada de forma precisa entre las vías de señalización Notch, Wnt y FGF para un desarrollo adecuado (Kageyama et al., 2007; Goldbeter y Pourquie, 2008). Aunque DLL1 y DLL3 se expresan normalmente en posiciones similares dentro de los embriones de ratón en fase de desarrollo, los experimentos con ratones transgénicos han demostrado que DLL3 no compensa a DLL1 (Geffers et al., 2007) . Los ratones con DLL1 desactivado mueren en fase embrionaria, pero los ratones con una mutación en DLL3 sobreviven pero presentan un fenotipo similar al de los seres humanos que padecen disostosis espondilocostal (Kusumi et al., 1998; Shinkai et al., 2004). Estos resultados concuerdan con una relación sutil de interacciones Notch cis y trans cruciales para un desarrollo normal.
Además, tal como se ha indicado anteriormente, la señalización Notch desempeña una función en el desarrollo y el mantenimiento de las células neuroendocrinas y los tumores que exhiben características neuroendocrinas . A este respecto, la señalización Notch interviene en una amplia variedad de decisiones sobre el destino celular en órganos endocrinos normales y en el sistema neuroendocrino difuso. Por ejemplo, en el páncreas, la señalización Notch se necesita para suprimir el desarrollo de un fenotipo endocrino predeterminado mediado por el factor de transcripción NGN3 de bHLH (Habener et al., 2005). Una supresión mediada por Notch de los destinos de las células endocrinas similar tiene lugar en las células enteroendocrinas (Schonhoff et al., 2004), células parafoliculares de la tiroides (Cook et al., 2010), en la especificación de las proporciones relativas de tipos de células neuroendocrinas en la pituitaria (Dutta et al., 2011) , y es probable que intervenga en las decisiones de las células dentro de los pulmones para adoptar un fenotipo neuroendocrino o no neuroendocrino (Chen et al., 1997; Ito et al., 2000; Sriuranpong et al., 2002) . Por ende, no cabe duda de que en muchos tejidos, la supresión de la señalización Notch está relacionada con fenotipos neuroendocrinos.
Una reactivación inadecuada de las vías de señalización del desarrollo o la desregulación de las vías de señalización normales se observan habitualmente en tumores, y en el caso de la señalización Notch, se han asociado con numerosos tipos de tumores (Koch y Radtke, 2010; Harris et al., 2012). La vía Notch se ha estudiado como oncogén en linfornas, cáncer colorrectal, cáncer pancreático y algunos tipos de cáncer de pulmón no microcítico (remítase a Zarenczan y Chen, 2010 y sus referencias) . En cambio, se ha informado de que Notch actúa como supresor tumoral en tumores con características neuroendocrinas (remítase a Zarenczan y Chen, 2010, mencionado anteriormente) . Los tumores con características neuroendocrinas se originan con poca frecuencia en una amplia variedad de sitios primarios y, a pesar de que su clasificación exhaustiva sigue siendo problemática (Yao et al., 2008; Klimstra et al., 2010; Klóppel, 2011), se pueden clasificar en cuatro tipos principales: carcinoides benignos de bajo grado, tumores neuroendocrinos bien diferenciados de bajo grado con comportamiento maligno, tumores con características neuroendocrinas y epiteliales mixtas, y carcinomas neuroendocrinos poco diferenciados de alto grado. Entre estas clasificaciones, los carcinomas neuroendocrinos poco diferenciados, que incluyen el carcinoma de pulmón microcítico (SCLC) y subconjuntos de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) , son los tipos de cáncer con un pronóstico desalentador. Se ha sugerido que el SCLC es de origen broncogénico y se origina en parte a partir de células neuroendocrinas pulmonares (Galluzzo y Bocchetta, 2011) . Independientemente de la fuente celular específica de origen de cada uno de estos tumores que poseen un fenotipo neuroendocrino, cabe esperar que la supresión de la señalización Notch, ya sea por lesiones directas en los propios genes de la vía Notch o por activación de otros genes que suprimen la señalización Notch, pueda conducir a la adquisición del fenotipo neuroendocrino de estos tumores. Por extensión, los genes que conducen a la perturbación de la vía Notch pueden proveer dianas terapéuticas para el tratamiento de tumores con fenotipos neuroendocrinos, en particular para indicaciones que en la actualidad tienen resultados clínicos insatisfactorios .
ASCL1 es uno de estos genes que parecen interaccionan con la vía de señalización Notch a través de DLL3. Se sabe que muchos tumores neuroendocrinos presentan un fenotipo endocrino poco diferenciado (es decir, parcialmente completo) ; por ejemplo, la expresión o un aumento drástico de diversas proteínas y polipéptidos endocrinos (p. ej . , cromogranina A, CHGA; calcitonina, CALCA; propiomelanocorina, PO C; somatostatina, SST) , proteínas asociadas con vesículas secretoras (p. ej . , sinaptofisina, SYP) y genes que participan en las vías bioquímicas responsables de la síntesis de aminas bioactivas (p. ej . , dopa-descarboxilasa, DDC) . Quizás no sea sorprendente que estos tumores normalmente sobreexpresen ASCL1 (conocido también como mASHl en ratones o hASHl en los seres humanos) , un factor de transcripción que se sabe que desempeña una función en la organización de las cascadas génicas que conducen a fenotipos neurales y neuroendocrinos . Aunque los detalles moleculares específicos de la cascada siguen sin estar bien definidos, cada vez está más claro que para ciertos tipos de células, en particular células parafoliculares de la tiroides (Kameda et al., 2007), células cromafines de la médula suprarrenal (Huber et al., 2002) y células que se encuentran en el sistema neuroendocrino difuso del plumón (Chen et al., 1997; Ito et al., 2000; Sriuranpong et al., 2002), ASCL1 forma parte de un bucle regulador del desarrollo ajustado de forma precisa en el que las elecciones del destino celular están mediadas por el equilibrio de las cascadas de expresión génica mediada por ASCL1 y mediada por Notch (FIG. 3) . Por ejemplo, se detectó la expresión de ASCL1 en células pulmonares neuroendocrinas de ratón normales, mientras que el efector de la señalización Notch HESl se expresaba en células pulmonares no neuroendocrinas (Ito et al., 2000). Cada vez se valora más la teoría de que estas dos cascadas están en equilibrio preciso con una regulación cruzada potencial. Se ha demostrado que el efector de Notch HESl reduce la expresión de ASCL1 (Chen et al., 1997; Sriuranpong et al., 2002). Estos resultados demuestran claramente que la señalización Notch puede suprimir la diferenciación neuroendocrina . Sin embargo, la demostración de que la unión de ASCL1 al promotor de DLL3 activa la expresión de DLL3 (Henke et al., 2009) y la observación de que DLL3 atenúa la señalización Notch (Ladi et al., 2005) definen el circuito genético para las elecciones del destino celular entre fenotipos neuroendocrinos y no neuroendocrinos .
Dado que la señalización Notch parece haber evolucionado para amplificar diferencias sutiles entre células adyacentes para tolerar dominios tisulares unidos firmemente con pasos de diferenciación diferentes (p. ej . , "inhibición lateral", como se ha descrito anteriormente) , estos datos juntos sugieren que se ha reactivado y desregulado un bucle regulador del desarrollo ajustado de forma precisa (FIG. 3) en cánceres con fenotipos neuroendocrinos. Aunque no es obvio que DDL3 sea una diana adecuada en la superficie celular para el desarrollo de agentes terapéuticos basados en anticuerpos debido a su residencia normal dentro de los compartimentos membranosos interiores de la célula (Geffers et al., 2007) y sus supuestas interacciones con Notch en estos, es posible que el aumento resultante de la expresión de DLL3 en los tumores neuroendocrinos pueda ofrecer una diana terapéutica única para tumores con el fenotipo neuroendocrino (p. ej . , NET y pNET) . Se observa habitualmente que cuando se produce una gran sobreexpresión de proteínas en los sistemas de laboratorio esto puede hacer que la proteína sobreexpresada se sitúe en otras posiciones dentro de la célula. Por lo tanto, es una hipótesis razonable, pero no obvia sin verificación experimental, que la sobreexpresión de DLL3 en tumores pueda conducir a cierta expresión de la proteína en la superficie celular y, por lo tanto, ofrezca una diana para el desarrollo de agentes terapéuticos basados en anticuerpos.
III . Células madre cancerosas Como se ha indicado anteriormente, se ha descubierto que sorprendentemente la expresión de DLL3 aberrante (genotípica y/o fenotípica) está asociada con diversas subpoblaciones de células tumorigénicas . A este respecto, la presente invención proporciona moduladores de DLL3 que pueden ser particularmente útiles para atacar tales células y especialmente células perpetuantes de tumores, y de este modo se facilita el tratamiento, el control o la prevención de trastornos neoplásicos. Por lo tanto, en modalidades preferidas, los moduladores de determinantes (genotípicos o fenotípicos) de DLL3 se pueden utilizar convenientemente para reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores de acuerdo con los principios de la presente y de este modo se facilita el tratamiento o el control de trastornos proliferativos .
A los efectos de la presente solicitud, la expresión "célula iniciadora de tumores" (TIC) abarca tanto las "células perpetuantes de tumores" (TPC, por sus siglas en inglés; es decir, células madre cancerosas o CSC, por sus siglas en inglés) como las "células progenitoras tumorales" muy proliferativas (denominadas TProg) , que juntas constituyen generalmente una subpoblacion única (es decir, un 0.1-40%) de una masa o volumen tumoral . A los efectos de la presente exposición, las expresiones "células perpetuantes de tumores" y "células madre cancerosas" o "células madre neoplásicas" son equivalentes y se pueden utilizar indistintamente en la presente. Las TPC se diferencian de TProg en que en las TPC pueden recapitular por completo la composición de células tumorales existentes en un tumor y tiene una capacidad de autorrenovación ilimitada tal como demuestran el trasplante en serie (dos o más pases a través de ratones) de un número reducido de células aisladas, mientras que TProg no presentará una capacidad de autorrenovación ilimitada.
Los expertos en la técnica apreciarán que la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando marcadores de la superficie celular adecuados es un método fiable para aislar subpoblaciones de células madre cancerosas muy enriquecidas (p. ej . , > 99.5% de pureza) debido, al menos en parte, a su capacidad para diferenciar entre células individuales y grupos de células (es decir, dobletes, etc.). Utilizando estas técnicas se ha demostrado que cuando se trasplantan un número reducido de células TProg de alta pureza en ratones inmunodeprimidos , estas pueden estimular el crecimiento tumoral en el trasplante primario. Sin embargo, a diferencia de las subpoblaciones de TPC purificadas, los tumores generados por TProg no reflejan por completo el tumor parental en lo que respecta a su heterogeneidad celular fenotípica y se puede demostrar que no son eficaces para reiniciar la tumorigénesis en serie en trasplantes subsecuentes. En cambio, las subpoblaciones de TPC reconstituyen por completo la heterogeneidad celular de los tumores parentales y pueden iniciar tumores de forma eficaz cuando se aislan y trasplantan en serie. Por lo tanto, los expertos en la técnica reconocerán que una diferencia definitiva entre TPC y TProg, aunque ambos tipos de células puedan generar tumores en trasplantes primarios, es la capacidad única de TPC para estimular de forma perpetua un crecimiento tumoral heterogéneo tras el trasplante en serie de un número reducido de células. Otras estrategias habituales para caracterizar TPC incluyen la morfología y el examen de marcadores de la superficie celular, el perfil transcripcional y la respuesta a fármacos, a pesar de que la expresión de los marcadores puede variar dependiendo de las condiciones de cultivo y el pase de la línea celular in vi ro.
Por consiguiente, a los efectos de la presente invención, las células perpetuantes de tumores, al igual que las células madre normales que respaldan las jerarquías celulares en los tejidos normales, están definidas preferentemente por su capacidad para autorrenovarse indefinidamente a la vez que mantienen la capacidad para la diferenciación de múltiples linajes. Así pues, las células perpetuantes de tumores son capaces de generar tanto una progenie tumorigénica (es decir, células iniciadoras de tumores: TPC y TProg) como una progenie no tumorigénica (NTG) . La expresión "célula no tumorigénica" (NTG) , tal como se utiliza en la presente, se refiere a una célula tumoral que se origina a partir de células iniciadoras de tumores, pero que no es capaz de autorrenovarse o generar los linajes heterogéneos de células tumorales que constituyen un tumor. Experimentalmente, las células NTG son incapaces de formar tumores en ratones de forma reproducible, incluso cuando se trasplanta un número excesivo de células.
Como se ha indicado, TProg también se clasifican como células iniciadoras de tumores (o TIC) debido a su capacidad limitada para generar tumores en ratones. Las TProg son la progenie de TPC y normalmente son capaces de llevar a cabo un número finito de divisiones celulares que no son autorrenovadoras . Además, las células TProg se pueden dividir a su vez en células progenitoras tumorales tempranas (ETP, por sus siglas en inglés) y células progenitoras tumorales tardías (LTP, por sus siglas en inglés) , cada una de las cuales se puede distinguir por el fenotipo (p. ej . , marcadores de la superficie celular) y capacidades diferentes para recapitular la arquitectura celular tumoral. A pesar de estas diferencias técnicas, tanto ETP como LTP se diferencian funcionalmente de TPC en que por lo general tienen una menor capacidad para reconstituir en serie tumores cuando se trasplantan números reducidos de células y normalmente no reflejan la heterogeneidad del tumor parental. Pese a las diferencias anteriores, también se ha observado que diversas poblaciones de TProg pueden, en raras ocasiones, adquirir la capacidad de autorrenovación atribuida normalmente a las células madre y convertirse en TPC (o CSC) . En cualquier caso, es probable que ambos tipos de células iniciadoras de tumores estén representados en la masa tumoral típica de un único paciente y son susceptibles de ser tratadas con los moduladores como se ha descrito en la presente. Es decir, las composiciones descritas generalmente son eficaces para reducir la frecuencia o alterar la quimiosensibilidad de tales células iniciadoras de tumores positivas para DLL3 independientemente de la modalidad particular o mezcla representada en un tumor.
En el contexto de la presente invención, las TPC son más tumorigénicas, relativamente más quiescentes y a menudo más quimiorresistentes que las células TProg (tanto ETP como LPT) , NTG y las células no derivadas de TPC que se infiltran en los tumores (p. ej . , fibroblastos/estroma, células edoteliales y hematopoyéticas) que constituyen el grueso de un tumor. Dado que las terapias y los regímenes convencionales han sido diseñados, en gran parte, para reducir el volumen tumoral y atacar rápidamente a las células proliferantes, es probable que las TPC sean más resistentes a las terapias y los regímenes convencionales que las TProg que proliferan más rápido y otras poblaciones de células constitutivas del tumor. Además, las TPC suelen expresar otras características que las hacen relativamente más quimiorresistentes a las terapias convencionales, tales como una mayor expresión de transportadores multirresistentes, unos mecanismos de reparación de ADN mejorados y proteínas antiapoptóticas . Estas propiedades, cada una de las cuales contribuye a la tolerancia a fármacos de TPC, constituye una razón clave por la que los regímenes de tratamiento oncológico estándar fracasan a la hora de garantizar el beneficio a largo plazo para la mayoría de los pacientes con una neoplasia en estado avanzado; es decir, no consiguen atacar y erradicar de forma adecuada las células que estimulan el crecimiento tumoral continuo y la recidiva (es decir, TPC o CSC) .
A diferencia de muchos tratamientos de la técnica anterior, las composiciones novedosas de la presente invención reducen preferentemente la frecuencia de las células iniciadoras de tumores al administrarlas a un sujeto, independientemente de la forma o diana específica (p. ej . , material genético, anticuerpo de DLL3 o constructo de fusión del ligando) del modulador seleccionado. Como se ha indicado anteriormente, la reducción de la frecuencia de células iniciadoras de tumores puede ser el resultado de a) la eliminación, el agotamiento, la sensibilización, el silenciamiento o la inhibición de células iniciadoras de tumores; b) el control del crecimiento, la expansión o la recidiva de células iniciadoras de tumores; c) la interrupción de la iniciación, la propagación, el mantenimiento o la proliferación de células iniciadoras de tumores; o d) la alteración de cualquier otro modo de la supervivencia, la regeneración y/o la metástasis de las células tumorigénicas . En algunas modalidades, la reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se produce como resultado de un cambio en una o más vías fisiológicas. El cambio en la vía, ya sea por reducción o eliminación de las células iniciadoras de tumores o por modificación de su potencial (p. ej . , diferenciación inducida, disrupción del nicho) o por otro tipo de interferencia en su capacidad para afectar al entorno tumoral u otras células, a su vez permite un tratamiento más efectivo de trastornos asociados con DLL3 al inhibir la tumorigénesis , el mantenimiento y/o la metástasis y la recidiva tumoral.
Entre los métodos reconocidos en la técnica que se pueden utilizar para evaluar esta reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se encuentra el análisis de dilución limitante, ya sea in vitro o in vivo, preferentemente seguido de la enumeración utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson o evaluando la frecuencia de eventos definitivos predefinidos tales como la capacidad para generar o no tumores in vivo. Aunque el análisis de dilución limitante comprende métodos preferidos para calcular la reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, también se pueden utilizar otros métodos, menos complicados, para determinar de forma eficaz los valores deseados, aunque con una exactitud ligeramente menor, y son totalmente compatibles con los principios de la presente. Por lo tanto, como podrán apreciar los expertos en la técnica, también es posible determinar la reducción de los valores de frecuencia por métodos conocidos como la citometría de flujo o inmunohistoquímica . En lo que respecta a todos los métodos anteriores, remítase, por ejemplo, a Dylla et al., 2008, P ID: 18560594 y Hoey et al., 2009, PMID: 19664991; cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia y, en particular, para los métodos descritos.
En lo que respecta al análisis de dilución limitante, la enumeración in vitro de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se puede conseguir depositando células tumorales humanas fraccionadas o no fraccionadas (p. ej . , de tumores tratados y no tratados, respectivamente) en condiciones de cultivo in vitro que favorezcan la formación de colonias. De este modo, las células formadoras de colonias se pueden enumerar mediante un simple conteo y caracterización de las colonias o mediante un análisis que consiste en, por ejemplo, depositar células tumorales humanas en placas en diluciones en serie y otorgar a cada pocilio un puntaje positivo o negativo para la formación de colonias al menos 10 días después de la deposición en las placas. Los experimentos o análisis de dilución limitante in vivo, que por lo general son más exactos en lo que respecta a su capacidad para determinar la frecuencia de las células tumorales iniciadoras de tumores, incluyen trasplantar células tumorales humanas, ya sean de poblaciones de control sin tratar o tratadas, por ejemplo, en ratones inmunodeprimidos en diluciones en serie y posteriormente otorgar a cada ratón un puntaje positivo o negativo para la formación de tumores al menos 60 días después del trasplante. La derivación de los valores de la frecuencia celular mediante el análisis de dilución limitante in vitro o in vivo se realiza preferentemente aplicando el modelo estadístico de la distribución de Poisson a la frecuencia conocida de eventos positivos y negativos, para proporcionar de este modo una frecuencia para los eventos que se ajustan a la definición de un evento positivo; en este caso, la formación de colonias o tumores, respectivamente.
En lo que respecta a otros métodos compatibles con la presente invención que se pueden utilizar para calcular la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, los más comunes comprenden técnicas de citometría de flujo y procedimientos de tinción inmunohistoquímica cuantificables . Aunque no son tan precisos como las técnicas de análisis de dilución limitante descritas justo antes, estos procedimientos son muchos menos laboriosos y proporcionan valores razonables en un plazo relativamente corto. Por lo tanto, se apreciará que un experto podrá utilizar una determinación del perfil de marcadores de la superficie celular por citometría de flujo empleando uno o más anticuerpos o reactivos que se unen a proteínas de la superficie celular conocidas en la técnica en las cuales se sabe que las células iniciadoras de tumores se enriquecen (p. ej . , marcadores potencialmente compatibles como los que se exponen en la solicitud de PCT 2012/031280 que se incorpora a la presente en su totalidad) y de este modo se miden los niveles de TIC de varias muestras. En otro método compatible adicional, un experto en la técnica podrá enumerar la frecuencia de TIC in sifcu (p. ej . , en una sección de tejido) por inmunohistoquímica utilizando uno o más anticuerpos o reactivos que son capaces de unirse a proteínas de la superficie celular que se cree que demarcan estas células.
Los expertos en la técnica reconocerán que se han asociado numerosos marcadores (o su ausencia) con diversas poblaciones de células madre cancerosas y estos se han utilizado para aislar o caracterizar subpoblaciones de células tumorales . A este respecto, los marcadores de células madre cancerosas ilustrativos comprenden 0CT4, Nanog, STAT3 , EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2 , CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, el receptor de transferrina, JAM3 , carboxipeptidasa M, ADAM9, oncostatina M, Lgr5 , Lgr6, CD324, CD325, nestina, Soxl, Bmi-1, eed, easyhl, easyh2 , mf2, yyl, smarcA3, smarckA5, smarcD3 , smarcEl, mllt3, FZD1, FZD2 , FZD3 , FZD4 , FZD6, FZD7 , FZD8 , FZD9 , FZD10, WN 2 , W T2B, WNT3 , WNT5A, WNT10B, W T16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8 , IL1RAP, TEM8 , TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14 , SLC4A11, PPAP2C, CAVI, CAV2, PTPN3 , EPHA1 , EPHA2 , SLC1A1 , CX3CL1 , AD0RA2A, MPZL1 , FLJ10052, C4.4A, EDG3 , RARRES1, TMEPAI , PTS, CEACAM6 , NID2, STEAP, ABCA3 , CRIM1, IL1R1, 0PN3 , DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9 , GJA1 , SLC19A2 , ABCA1 , PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1 , LRP3 , C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3 , SEMA4B , PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, ß-catenina, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74 , CD90, CXCR4 , decorina, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b y CD49f. Remítase, por ejemplo, a Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, la patente de EE. UU. N.° 7.632.678, y las patentes de EE. UU. N.os 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 y 2011/0020221, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia. Se apreciará además que cada uno de los marcadores mencionados anteriormente también se puede utilizar como antígeno diana secundario en el contexto de los anticuerpos biespecíficos o multiespecífieos de la presente invención.
De forma análoga, los ejemplos no limitantes de fenotipos de la superficie celular asociados con células madre cancerosas de ciertos tipos de tumores incluyen CD44hiCD241ow, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19- , CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+a2 pihiCD133+, CD44+CD24+ESA+ , CD271+, ABCB5+, así como también otros fenotipos de la superficie celular de células madre cancerosas conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Schulenburg et al., 2010, mencionado anteriormente, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 y la patente de EE . UU. N.° 2008/0138313, cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar fenotipos marcadores, como los que se han mencionado como ejemplos justo antes, junto con un análisis por citometría de flujo y técnicas de clasificación de células estándard para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer células TIC y/o TPC o poblaciones de células para su análisis posterior. Tiene interés para la presente invención el hecho de que CD46, CD324 y opcionalmente CD66c se expresen en niveles altos o de forma heterogénea en la superficie de muchas células tumorales humanas de cáncer colorrectal ("CR"), de mama ( WBR" del inglés breast) , de pulmón no microcítico (NSCLC) , de pulmón microcítico (SCLC) , pancreático ("PA"), melanoma ("Mel") , de ovario ( "OV" ) , y de cabeza y cuello ("HN" del inglés head and neck) , independientemente de que las muestras tumorales que se analicen sean muestras del tumor primario del paciente o de tumores NTX derivados del paciente.
Utilizando cualquiera de los métodos a los que se hace referencia anteriormente y marcadores seleccionados como los que se conocen en la técnica (y que se muestran más adelante en el Ejemplo 17) , es posible entonces cuantificar la reducción de la frecuencia de TIC (o las TPC en la muestra) proporcionada por los moduladores de DLL3 descritos (incluidos aquellos conjugados con agentes citotóxicos) de acuerdo con los principios de la presente. En algunos casos, los compuestos de la presente invención pueden reducir la frecuencia de TIC o TPC (mediante diversos mecanismos indicados anteriormente, que incluyen la eliminación, la diferenciación inducida, la disrupción del nicho, el silenciamiento, etc.) un 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o incluso un 35%. En otras modalidades, la reducción de la frecuencia de TIC o TPC puede ser del orden de un 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65%. En ciertas modalidades, los compuestos descritos pueden reducir la frecuencia de TIC o TPC un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o incluso un 95%. Por supuesto, se apreciará que cualquier reducción de la frecuencia de TIC o TPC probablemente provocará una reducción correspondiente en la tumorigenicidad, persistencia, recidiva y agresividad de la neoplasia.
IV. Moduladores de DLL3 En cualquier caso, la presente invención se refiere al uso de moduladores de DLL3 , incluidos antagonistas de DLL3, para el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento y/o la profilaxis de diversos trastornos que incluyen cualquiera de diversas enfermedades malignas asociadas con DLL3. Los moduladores descritos se pueden utilizar solos o junto con una amplia variedad de compuestos anticancerosos tales como agentes quimioterapéuticos o inmunoterapéuticos (p. ej . , anticuerpos terapéuticos) o modificadores de la respuesta biológica. En otras modalidades seleccionadas, se pueden utilizar dos o más moduladores de DLL3 discretos combinados para proporcionar efectos antineoplásicos mejorados o se pueden utilizar para fabricar constructos multiespecíficos .
En ciertas modalidades, los moduladores de DLL3 de la presente invención comprenderán nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos , péptidos o polipéptidos . Más particularmente, los moduladores ilustrativos de la invención pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno o derivados de estos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos , ácidos nucleicos, constructos complementarios, AR ip, miARN, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y traduccional , y similares. En ciertas modalidades, los moduladores comprenderán DLL3 soluble (DLL3s) o una forma, variante, derivado o fragmento de este incluidos, por ejemplo, constructos de fusión de DLL3 (p. ej . , DLL3-FC, restos de direccionamiento a DLL3 , etc.) o conjugados de DLL3 (p. ej . , DLL3-PEG, DLL3-agente citotóxico, DLL3-BRM, etc.). En otras modalidades preferidas, los moduladores de DLL3 comprenden anticuerpos, o fragmentos inmunorreacti os o derivados de estos. En modalidades particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención comprenderán anticuerpos neutralizantes, supresores o internalizantes, o derivados o fragmentos de estos. Además, al igual que con los constructos de fusión mencionados anteriormente, tales moduladores de tipo anticuerpo pueden estar conjugados, unidos o asociados de otro modo con agentes citotóxicos, polímeros, modificadores de la respuesta biológica (BRM, por sus siglas en inglés) seleccionados o similares para proporcionar inmunoterapias dirigidas con diversos (y opcionalmente múltiples) mecanismos de acción. Tal como se ha indicado anteriormente, tales anticuerpos pueden ser anticuerpos de pan-DLL y pueden estar asociados con dos o más miembros de la familia DLL o, como alternativa, pueden comprender moléculas de unión al antígeno que reaccionen selectivamente con una o ambas isoformas de DLL3. En otras modalidades preferidas más, los moduladores pueden operar a nivel genético y pueden comprender compuestos como constructos complementarios, ARNip, miARN y similares que interaccionen o se asocien con el componente genotípico de un determinante de DLL3.
Se apreciará además que los moduladores de DLL3 descritos pueden agotar, silenciar, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, la propagación o la supervivencia de células tumorales, incluidas las TPC, y/o neoplasias asociadas a través de varios mecanismos, que incluyen la agonización o antagonización de vías seleccionadas o la eliminación de células específicas dependiendo, por ejemplo, de la forma del modulador DLL3 , cualquier carga útil o dosis asociada y el método de suministro. Por lo tanto, aunque las modalidades preferidas descritas en la presente se refieren al agotamiento, la inhibición o el silenciamiento de subpoblaciones de células tumorales específicas, tales como células perpetuantes de tumores, o a moduladores que interaccionan con un epítopo o dominio específico, se debe hacer hincapié en que tales modalidades son meramente ilustrativas y no son limitantes en ningún sentido. En cambio, tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas, la presente invención se refiere en un sentido amplio a moduladores de DLL3 y a su uso en el tratamiento, el control o la profilaxis de diversos trastornos asociados con DLL3, independientemente de que se trate de un mecanismo, región de unión o población de células tumorales particular.
Independientemente de la forma del modulador seleccionado, se apreciará que el compuesto elegido puede ser de naturaleza antagonista. El término "antagonista", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de una diana particular o específica (p. e . , DLL3), incluida la unión de receptores a ligandos o las interacciones de enzimas con sustratos. A este respecto, se apreciará que los antagonistas de DLL3 de la presente invención pueden comprender cualquier ligando, polipéptido, péptido, proteína de fusión, anticuerpo, o fragmento inmunológicamente activo o derivado de este que reconozca, reaccione, se una, se combine, compita, se asocie o interaccione de cualquier otro modo con la proteína DLL3 o un fragmento de esta, y elimine, silencie, reduzca, inhiba, impida, restrinja o controle el crecimiento de células iniciadoras de tumores u otras células neoplásicas incluidas las células constitutivas del tumor o NTG. Los antagonistas compatibles pueden incluir además inhibidores de bajo peso molecular, aptámeros, constructos complementarios, AR ip, miARN y similares, moléculas de ligando o receptor y sus derivados que reconozcan o se asocien con un determinante genotípico o fenotípico de DLL3 para alterar de este modo sus patrones de expresión o privarle de su unión o interacción con un sustrato, receptor o ligando.
Se sobreentenderá que las expresiones "reconoce" o "se asocia", tal como se utilizan en la presente y se aplican a dos o más moléculas o compuestos, se refieren a la reacción, enlace, unión específica, combinación, interacción, conexión, ligadura, unificación, coalescencia, fusión o unión, de forma covalente o no covalente, de las moléculas, de modo que una molécula ejerce un efecto sobre la otra molécula.
Además, tal como se demuestra en los ejemplos de la presente (p. ej . , remítase a la FIG. 2B) , algunos moduladores de DLL3 humano pueden, en ciertos casos, presentar reactividad cruzada con DLL3 de una especie que no sea humana (p. ej . , murina) . En otros casos, los moduladores ilustrativos pueden ser específicos para una o más isoformas de DDL3 humano y no presentarán reactividad cruzada con ortólogos de DLL3 de otras especies. Por supuesto, estas modalidades, junto con los principios de la presente, pueden comprender anticuerpos de pan-DLL que se asocien con dos o más miembros de la familia DLL de una única especie o anticuerpos que se asocien exclusivamente con DLL3.
En cualquier caso y como se discutirá más detalladamente más adelante, los expertos en la técnica apreciarán que los moduladores descritos se pueden utilizar en una forma conjugada o no conjugada. Es decir, el modulador puede estar asociado o conjugado (p. ej . , de forma covalente o no covalente) con compuestos farmacéuticamente activos, modificadores de la respuesta biológica, agentes anticancerosos, agentes citotóxicos o citostáticos, restos de diagnóstico o modif cadores biocompatibles . A este respecto, se sobreentenderá que tales conjugados pueden comprender péptidos, polipéptidos , proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado en la presente, el conjugado seleccionado puede estar unido de forma covalente o no covalente con el modulador de DLL3 en diversas proporciones molares dependiendo, al menos en parte, del método empleado para conseguir la conjugación.
V. Fabricación y suministro de moduladores A. Moduladores de tipo anticuerpo 1. Introducción Como se ha indicado anteriormente, las modalidades particularmente preferidas de la presente invención comprenden moduladores de DLL3 en forma de anticuerpos que se asocian preferentemente con uno o más dominios de una isoforma de la proteína DLL3 y, opcionalmente, otros miembros de la familia DLL. Los expertos en la técnica apreciarán la base de conocimientos debidamente desarrollada sobre anticuerpos tal como la expuesta, por ejemplo, en Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6.a ed. , W.B. Saunders Company (2010) o Murphey et al., Janeway's Immunobiology, 8.a ed., Garland Science (2011) , cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia.
Se pretende que el término "anticuerpo" abarque anticuerpos policlonales , anticuerpos multiclonales, anticuerpos monoclonales , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y primatizados , anticuerpos humanos, anticuerpos producidos recombinantemente, intracuerpos , anticuerpos multiespecíficos , anticuerpos biespecíficos , anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos antiidiotípicos , anticuerpos sintéticos, incluidas las muteinas y sus variantes; fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), FvFc monocatenarios, Fv monocatenarios; y derivados de estos incluidas las fusiones de Fe y otras modificaciones, y cualquier otra molécula inmunológicamente activa, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (es decir, asociación o unión al antígeno) . Asimismo, el término comprende además todas las clases de anticuerpos (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e Ig ) y todos los isótopos (es decir, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) , así como también sus variaciones a menos que el contexto dicte lo contrario. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se indican con la letra griega minúscula , d, e, ? y µ correspondiente, respectivamente. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, denominados kappa (?) y lambda (?) , en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Aunque los anticuerpos de este tipo estén contemplados por el alcance de la presente invención, en la presente se discutirán en cierto detalle modalidades preferidas que comprenden la clase de inmunoglobulina IgG únicamente a efectos ilustrativos. Se sobreentenderá que, sin embargo, la exposición tiene carácter meramente demostrativo de composiciones y métodos para llevar a la práctica la presente invención que son ilustrativos, y no limita de ningún modo el alcance de la invención o las reivindicaciones que se adjuntan a la presente.
Como se sabe con certeza, los dominios variables de ambas porciones de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad antigénicos, y los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren y regulan propiedades biológicas importantes tales como la secreción, la movilidad transplacentaria, la semivida en circulación y la unión al complemento, y propiedades similares.
La región "variable" incluye sitios hipervariables que se manifiestan en tres segmentos denominados habitualmente regiones determinantes de la complementariedad (CDR) , tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables que flanquean las CDR se denominan regiones de entramado (FR) . Por ejemplo, en los anticuerpos de tipo inmunoglobulina G (IgG) monoméricos naturales, las seis CDR presentes en cada brazo de "Y" son cortas, secuencias de aminoácidos no contiguas que están situadas específicamente para formar el sitio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Así pues, cada anticuerpo IgG natural comprende dos sitios de unión idénticos próximos al extremo amino de cada brazo de Y.
Se apreciará que un experto en la técnica podrá identificar fácilmente la posición de las CDR utilizando técnicas estándar. Los expertos en la técnica también estarán familiarizados con el sistema de numeración que se describe en Kabat et al. (1991, Publicación del NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va . ) . A este respecto, Kabat et al. definieron un sistema de numeración para secuencias de dominios variables que se puede aplicar a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin recurrir a ningún dato experimental aparte de la propia secuencia. A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en un anticuerpo se ajustan al sistema de numeración de Kabat.
Por consiguiente, según Kabat, en la VH, los residuos 31-35 constituyen CDR1, los residuos 50-65 constituyen CDR2 y 95-102 constituyen CDR3 , mientras que en VL, los residuos 24-34 son CDR1, 50-56 constituyen CDR2 y 89-97 constituyen CDR3. A modo de contexto, en una VH, FR1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; FR2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; FR3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94 y FR4 corresponde al dominio de la región variable desde el aminoácido 103 hasta el final de la región variable. Las FR para la cadena ligera están separadas de forma similar por cada una de las CDR de la región variable de la cadena ligera.
Cabe destacar que las CDR varían considerablemente de un anticuerpo a otro (y por definición, no exhiben homología con las secuencias consenso de Kabat) . Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número de sitio de Kabat dado puede variar de una cadena de anticuerpo a otra debido a la divergencia alélica o entre especies. En Chothia et al., J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987) y MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) se expone una numeración alternativa, aunque, al igual que en Kabat, los límites de las FR están separados por los extremos CDR respectivos tal como se ha descrito anteriormente. Remítase también a Chothia et al., Nature 342, págs . 877-883 (1989) y S. Dubel, ed. , Handbook of Therapeutic Antibodies, 3.a ed. , WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007) , donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí. Cada una de las referencias mencionadas anteriormente se incorpora a la presente en su totalidad por referencia, y los residuos aminoacídicos que constituyen las regiones de unión o CDR según se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente y se exponen a efectos comparativos a continuación.
Definiciones de CDR ¦"¦La numeración de los residuos se ajusta nomenclatura de Kabat et al., mencionada anteriormente 2La numeración de los residuos se ajusta a la nomenclatura de Chothia et al., mencionada anteriormente 3La numeración de los residuos se ajusta a la nomenclatura de MacCallum et al., mencionada anteriormente En el contexto de la presente invención, se apreciará que cualquiera de las CDR de las cadenas pesada y ligera descritas derivadas de las secuencias de aminoácidos de la región variable murina expuestas en la FIG. 11A o la FIG. 11B se puede combinar o reorganizar para proporcionar anticuerpos anti-DLL3 (p. ej . , anti-hDLL3 humanizados o quiméricos) optimizados de acuerdo con los principios de la presente. Es decir, una o más de las CDR derivadas de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera contiguas expuestas en la FIG. 11A (SEQ ID NOS: 20-202, números pares) o las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada contiguas expuestas en la FIG. 11B (SEQ ID NOS: 21-203, números impares) se pueden incorporar en un modulador de DLL3 y, en modalidades particularmente preferidas, en un anticuerpo con injertos de CDR o humanizado que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de DLL3. También se exponen ejemplos de secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas ligera (SEQ ID NOS: 204- 212, números pares) y pesada (SEQ ID NOS: 205-213, números impares) de tales moduladores humanizados en las FIGS . 11A y 11B. Estas secuencias de aminoácidos novedosas de forma conjunta representan noventa y dos moduladores murinos y cinco humanizados ilustrativos de acuerdo con la presente invención. Además, las secuencias de ácido nucleico correspondientes de cada uno de los noventa y dos moduladores murinos y los cinco moduladores humanizados ilustrativos expuestos en las FIGS. 11A y 11B se incluyen en el listado de secuencias que se adjunta a la presente solicitud (SEQ ID NOS: 220-413) .
En las FIGS. 11A y 11B, las CDR comentadas se definen utilizando la numeración de Chothia. Sin embargo, tal como se ha indicado en la presente y se demuestra más adelante en el Ejemplo 8, un experto en la técnica podría definir, identificar, derivar y/o enumerar fácilmente las CDR como se define en Kabat et al., Chothia et al . o MacCallum et al. para cada secuencia respectiva de las cadenas ligera y pesada expuesta en la FIG. 11A o FIG. 11B. Por consiguiente, cada una de las CDR en cuestión y los anticuerpos que comprenden las CDR definidas mediante todas estas nomenclaturas se incluyen expresamente dentro del alcance de la presente invención. En un sentido más amplio, las expresiones "residuo aminoacídico de CDR de la región variable" o simplemente "CDR" incluyen los aminoácidos de una CDR identificados utilizando cualquier método de base estructural o secuencial como los expuestos anteriormente. 2. Generación de moduladores de tipo anticuerpo a . Anticuerpos policlonales La producción de anticuerpos policlonales en diversos animales hospedero, incluidos conejos, ratones, ratas, etc., es muy conocida en la técnica. En algunas modalidades, se obtiene suero que contiene anticuerpos anti-DLL3 policlonales desangrando o sacrificando al animal. El suero se puede utilizar con fines de investigación en la forma obtenida del animal o, como alternativa, los anticuerpos anti-DLL3 se pueden purificar parcial o completamente para proporcionar fracciones de inmunoglobulina o preparados de anticuerpo homogéneos .
Resumiendo, el animal seleccionado se inmuniza con un inmunógeno de DLL3 (p. ej . , DLL3 soluble o DLL3s) que puede comprender, por ejemplo, isoformas, dominios y/o péptidos seleccionados, o células vivas o preparados celulares que expresan DLL3 o fragmentos inmunorreactivos de este. Los adyuvantes conocidos en la técnica que se pueden utilizar para incrementar la respuesta inmunitaria, dependiendo de la especie inoculada, incluyen, sin carácter limitante, Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guérin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes pueden proteger el antígeno contra la dispersión rápida al secuestrarlo en una reserva local, o pueden contener sustancias que estimulan el hospedero para que secrete factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, el programa de inmunización incluirá dos o más administraciones del inmunógeno seleccionado repartidas a lo largo de un periodo predeterminado.
La secuencia de aminoácidos de una proteína DLL3 como la que se muestra en las FIGS . 1C o ID se puede analizar con el fin de seleccionar regiones específicas de la proteína DLL3 para generar anticuerpos. Por ejemplo, se utilizan análisis de la hidrofobicidad e hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de DLL3 para identificar regiones hidrófilas en la estructura de DLL3. Se pueden identificar fácilmente regiones de una proteína de DLL3 que presenten una estructura inmunogénica, así como también otras regiones y dominios, utilizando otros métodos diferentes conocidos en la técnica, tales como el análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf . Se pueden generar perfiles de flexibilidad media utilizando el método de Bhaskaran R. , Ponnuswamy P. K. , 1988, Int. J. Pept . Protein Res. 32:242-255. Se pueden generar perfiles de giro beta utilizando el método de Deleage, G. , Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Así pues, cada región, dominio o motivo de DLL3 identificado por cualquiera de estos programas o métodos queda contemplado por el alance de la presente invención y se puede aislar o modificar para proporcionar inmunógenos que originen moduladores que comprendan las propiedades deseadas. Los métodos preferidos para generar anticuerpos de DLL3 se ilustran además mediante los Ejemplos que se proporcionan en la presente. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como un inmunógeno son muy conocidos en la técnica. También se conocen en la técnica métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un portador tal como BSA, KLH u otra proteína portadora. En algunas circunstancias, también se utiliza la conjugación directa en la que se emplean, por ejemplo, reactivos carbodiimídicos ; en otros casos, los reactivos conectores son efectivos. La administración de un inmunógeno de DLL3 normalmente se lleva a cabo por inyección durante un periodo adecuado y utilizando un adyuvante adecuado, como consta en la técnica. Durante el programa de inmunización, se pueden obtener titulaciones de anticuerpos, como se describe más adelante en los Ejemplos, para determinar la idoneidad de la formación de anticuerpos, b . Anticuerpos monoclonales Además, la invención contempla el uso de anticuerpos monoclonales. La expresión "anticuerpo monoclonal" (o mAb) , tal como se conoce en la técnica, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones (p. ej . , mutaciones naturales) que puedan estar presentes en cantidades minoritarias. En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal de este tipo incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une o asocia con un antígeno, donde la secuencia polipeptídica de unión al antígeno se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana entre una pluralidad de secuencias polipeptídicas .
De un modo más general y como se ejemplifica en el Ejemplo 6 de la presente, se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando una gran variedad de técnicas conocidas en la materia, que incluyen técnicas recombinantes , hibridomas, tecnologías de presentación en fago, animales transgénicos (p. ej . , un XenoMouse°) o alguna combinación de estas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales utilizando hibridomas, y técnicas bioquímicas y de ingeniería genética reconocidas en la técnica, como las que se describen más detalladamente en An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1.a ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1.a ed. 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988; Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia. Se sobreentenderá que una secuencia de unión seleccionada se puede alterar aún más, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprenda la secuencia de unión a la diana alterada también es un anticuerpo de la presente invención, c . Anticuerpos quiméricos En otra modalidad, el anticuerpo de la invención puede comprender anticuerpos quiméricos derivados de segmentos proteicos unidos covalentemente procedentes de al menos dos especies o tipos de anticuerpos diferentes. El término anticuerpos "quiméricos", tal como se conoce en la técnica, se refiere a constructos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera que es idéntica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es (son) idéntica (s) u homologa (s) a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de EE . UU. N.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) ) .
En una modalidad, un anticuerpo quimérico de acuerdo con los principios de la presente puede comprender secuencias de aminoácidos de VH y VL murinas, y regiones constantes derivadas de fuentes humanas. En otras modalidades compatibles, un anticuerpo quimérico de la presente invención puede comprender un anticuerpo humanizado como los que se describen a continuación. En otra modalidad, el anticuerpo denominado "anticuerpo con injertos de CDR" comprende una o más CDR de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es (son) idéntica (s) u homologa (s) a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos. Para el uso en seres humanos, se pueden injertar CDR de roedor seleccionadas en un anticuerpo humano, reemplazando una o más de las regiones variables o CDR naturales del anticuerpo humano. Estos constructos generalmente presentan las ventajas de proporcionar funciones moduladoras máximas (p. ej . , CDC (siglas en inglés de citotoxicidad dependiente del complemento) , ADCC (siglas en inglés de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) , etc.) a la vez que se reducen respuestas inmunitarias al anticuerpo no deseadas en el sujeto, d. Anticuerpos humanizados Un anticuerpo "humanizado" es similar al anticuerpo con injertos de CDR. Las formas "humanizadas", tal como se utiliza el término en la presente, de anticuerpos no humanos (p. ej . , murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una o más inmunoglobulinas humanas. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor o aceptor) en la que se reemplazan residuos de una CDR del receptor por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) , tal como un ratón, rata, conejo, o primate no humano, con la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada. En ciertas modalidades preferidas, se reemplazan residuos en una o más FR en el dominio variable de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes del anticuerpo donante para ayudar a mantener la configuración tridimensional adecuada de la o las CDR injertadas y de este modo mejorar la afinidad. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante para, por ejemplo, refinar aún más el comportamiento del anticuerpo.
El injerto de CDR y los anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en las patentes de EE . UU. N.os 6.180.370 y 5.693.762. El anticuerpo humanizado opcionalmente también puede comprender al menos una porción de un Fe de inmunoglobulina, normalmente el de una inmunoglobulina humana. Para consultar información más detallada, remítase, p. ej . , a Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); y las patentes de EE. UU. N.os 6.982.321 y 7.087.409. Otro método adicional se denomina "humaneering" el cual se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 2005/0008625. Además, un anticuerpo no humano también se puede modificar por deleción específica de epítopos de linfocitos T humanos o "desinmunización" mediante los métodos descritos en WO 98/52976 y WO 00/34317. Cada una de las referencias mencionadas anteriormente se incorpora a la presente en su totalidad.
Los anticuerpos humanizados también se pueden biomodificar utilizando técnicas comunes de biología molecular, tales como el aislamiento, la manipulación y la expresión de secuencias de ácido nucleico que decodifica todas o parte de las regiones variables de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Además de las fuentes de tal ácido nucleico indicadas anteriormente, se dispone de secuencias de la línea germinal humana como las descritas en, por ejemplo, Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol . 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Im unol . Today 16: 237-242; Chothia, D . et al . (1992) J". Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638. El directorio V-BASE (VBASE2 - Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005) proporciona un directorio exhaustivo de secuencias de la región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I. A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, GB) . También se pueden utilizar FR humanas consenso, p. ej . , como las descritas en la patente de EE. UU. N.° 6.300.064.
En modalidades seleccionadas y como se detalla más adelante en el Ejemplo 8, al menos un 60%, 65%, 70%, 75% u 80% de los residuos aminoacídicos de la región variable de las cadenas pesada o ligera de los anticuerpos con injertos de CDR o humanizados corresponderá a los residuos de las secuencias de CDR y FR humanas del receptor. En otras modalidades, al menos un 85% o 90% de los residuos de la región variable de los anticuerpos humanizados corresponderán a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor. En otra modalidad preferida, más de un 95% de los residuos de la región variable de los anticuerpos humanizados corresponderán a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor, e . Anticuerpos humanos En otra modalidad, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos completamente humanos. La expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado utilizando cualquiera de las técnicas de producción de anticuerpos humanos.
Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando diversas técnicas conocidas en la materia. Una técnica es la presentación en fago, en la cual se sintetiza una colección de anticuerpos (preferentemente humanos) en fagos, se criba la colección con el antígeno de interés o una porción de unión al anticuerpo de este y se aisla el fago que se une al antígeno, a partir del cual se pueden obtener los fragmentos inmunorreactivos . Los métodos para preparar y cribar tales colecciones son muy conocidos en la técnica y los kits para generar colecciones de presentación en fagos se pueden adquirir de proveedores comerciales (p. ej . , the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n.° de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación en fagos Stratagene SurfZAP™, n.° de catálogo 240612) . También existen otros métodos y reactivos que se pueden utilizar para generar y cribar colecciones de presentación de anticuerpos (remítase, p. ej . , a la patente de EE. UU. N.° 5.223.409; las publicaciones de PCT N.os WO 92/18619, O 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; y Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)).
En una modalidad, los anticuerpos humanos recombinantes se pueden aislar cribando una colección de anticuerpos combinatoria recombinante preparada como se ha indicado anteriormente. En una modalidad, la colección es una colección de presentación en fagos de scFv, generada utilizando ADNc de VL y VH humanas preparados a partir de ARNm aislado de linfocitos B.
Los anticuerpos producidos por colecciones vírgenes (ya sean naturales o sintéticas) pueden tener una afinidad moderada (Ka de entre aproximadamente 106 y 107 NT1) , pero la maduración de la afinidad también se puede simular in vitro por construcción y reselección a partir de colecciones secundarias como las descritas en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir una mutación al azar in vitro utilizando la polimerasa propensa a errores (descrita en Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) . Además, la maduración de la afinidad se puede llevar a cabo mutando al azar una o más CDR, p. ej . , utilizando PCR con cebadores portadores de una secuencia aleatoria que abarque la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y cribándolos para obtener los clones con mayor afinidad. WO 9607754 describe un método para inducir la mutagénesis en una CDR de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una colección de genes de la cadena ligera. Otra estrategia efectiva es recombinar los dominios VH o VL seleccionados mediante presentación en fagos con repertorios de variantes de dominios V naturales obtenidos a partir de donantes no inmunizados y para cribarlos para obtener los de mayor afinidad en varias rondas de retransposición de las cadenas tal como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con una constante de disociación KD (k0ff/kon) menor o igual a aproximadamente 10"9 M.
En otras modalidades, se pueden emplear procedimientos similares utilizando colecciones que comprenden células eucariotas (p. ej . , levaduras) que expresan pares de unión en su superficie. Remítase, por ejemplo, a la patente de EE . UU. N.° 7.700.302 y la patente de EE. UU. N.° 12/404.059. En una modalidad, el anticuerpo humano se selecciona entre una fagoteca, donde la fagoteca expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998). En otras modalidades, se pueden aislar pares de unión humanos a partir de colecciones de anticuerpos combinatorias generadas en células eucariotas tales como levaduras. Remítase, p. ej . , a la patente de EE . UU. 7.700.302. Tales técnicas permiten convenientemente cribar un número elevado de moduladores potenciales y proporcionar una manipulación relativamente sencilla de secuencias potenciales (p. ej . , por maduración de la afinidad o transposición recombinante) .
También se pueden producir anticuerpos humanos mediante la introducción de locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos , p. ej . , ratones en los que se han desactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos y se han introducido genes de inmunoglobulina humana. Al ser estimulados, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluidos la reordenación, el ensamblaje y el repertorio génicos de los anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N.os 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 y las patentes de EE. UU. N.os 6.075.181 y 6.150.584 referentes a la tecnología XenoMouse® ,- y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13:65-93 (1995) . Como alternativa, el anticuerpo humano se puede preparar mediante la inmortalización de linfocitos B humanos produciendo un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B se pueden recuperar a partir de un individuo que padece un trastorno neoplásico o que puede haber sido inmunizado in vitro) . Remítase, p. ej . , a Colé efc al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ; Boerner et al., J. Immunol, 147 (l) :86-95 (1991) ; y la patente de EE . UU. N.° 5.750.373. 3. Procesamiento posterior Independientemente de cómo se obtengan, las células productoras de moduladores (p. ej . , hibridomas, colonias de levaduras, etc.) se pueden seleccionar, clonar y después cribar para obtener unas características deseables que incluyen, por ejemplo, un crecimiento robusto, una alta producción de anticuerpos y, como se indica más detalladamente más adelante, unas características deseables para un anticuerpo. Los hibridomas se pueden expandir in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, p. ej . , ratones atímicos, o en un cultivo celular in vitro. Los expertos en la técnica estarán muy familiarizados con los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas y/o colonias, cada uno de los cuales produce una especie de anticuerpo discreta.
B . Producción de moduladores recombinantes 1. Introducción Una vez perfeccionada la fuente, se puede aislar y secuenciar fácilmente el ADN que codifica los moduladores de DLL3 deseados utilizando procedimientos convencionales (p. ej . , utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos) . Las células de hibridoma aisladas y subclonadas (o colonias derivadas de levaduras o fagos) pueden servir como fuente preferida de el ADN si el modulador es un anticuerpo. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular adicionalmente tal como se describe en la presente para crear agentes que incluyen proteínas de fusión, o anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Más particularmente, el ADN aislado (que puede estar modificado) se puede utilizar para clonar secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos .
Por consiguiente, en modalidades ilustrativas, se pueden producir anticuerpos recombinantemente, utilizando procedimientos convencionales (tales como los que se exponen en Al-Rubeai; An, y Shire et. al. todos ellos mencionados anteriormente, y Sambrook J. y Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, iley, John & Sons, Inc. (2002)) en los cuales las células de hibridoma aisladas y subclonadas (colonias derivadas de levaduras o fagos) sirven como fuente preferida de moléculas de ácido nucleico.
Se pretende que la expresión "molécula de ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente, incluya moléculas de ADN y moléculas de ARN y variantes artificiales de estas (p. ej . , ácidos nucleicos peptídicos) , ya sean mono-o bicatenarias . Los ácidos nucleicos pueden codificar una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados. Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen suficientes polinucleótidos para su uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación con el fin de identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido; ácidos nucleicos complementarios para inhibir la expresión de un polinucleótido, y así como también secuencias complementarias. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Por ejemplo, pueden tener una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000 o más nucleótidos, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o formar parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Se apreciará que tales secuencias de ácido nucleico se pueden manipular adicionalmente para crear moduladores que incluyen anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Más particularmente, las moléculas de ácido nucleico aisladas (que pueden estar modificadas) se pueden utilizar para clonar secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos tal como se describe en la patente de EE. UU. N.° 7.709.611.
La expresión "ácido nucleico aislado" quiere decir que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , (ii) se produjo de forma recombinante por clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, por escisión y fraccionamiento electroforático en gel o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante una síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que se puede manipular mediante técnicas de ADN recombinante .
Independientemente de que la fuente del ácido nucleico que codifica la porción inmunorreactiva deseada del anticuerpo se obtenga o derive de una tecnología de presentación en fagos, colecciones de levaduras, tecnología basada en hibridomas o sintéticamente, se debe sobreentender que la presente invención abarca las moléculas de ácido nucleico y las secuencias que codifican los anticuerpos, o los fragmentos de unión al antígeno o derivados de estos. Además, la presente invención se refiere a vectores y células hospederas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. 2. Hibridación e identidad secuencial Tal como se ha indicado, la invención proporciona además ácidos nucleicos que se hibridan con otros ácidos nucleicos en condiciones de hibridación particulares. Más específicamente, la invención abarca moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones de hibridación de rigurosidad moderada o alta (p. ej . , como se define más adelante) con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos son muy conocidos en la técnica. Como es de sobra conocido, unas condiciones de hibridación de rigurosidad moderada comprenden una solución de prelavado que contiene 5x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) , 0.5% de SDS, EDTA 1.0 mM (pH 8.0), tampón de hibridación de aproximadamente un 50% de formamida, 6xSSC y una temperatura de hibridación de 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una que contenga aproximadamente un 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de 42 °C) y condiciones de lavado de 60 °C, en 0.5xSSC, 0.1% de SDS. A efectos comparativos, la hibridación en condiciones de hibridación de rigurosidad alta comprenden el lavado con 6xSSC a 45 °C, seguido de uno o más lavados en O.lxSSC, 0.2% de SDS a 68 °C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o reducir la rigurosidad de la hibridación de modo que los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de nucleótidos que tienen una identidad de al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% normalmente entre sí sigan hibridándose entre sí.
La invención también incluye moléculas de ácido nucleico que son "sustancialmente idénticas" a las moléculas de ácido nucleico descritas. En una modalidad, la expresión "sustancialmente idéntica" con respecto a una secuencia de ácido nucleico quiere decir que se puede construir como una secuencia de moléculas de ácido nucleico que exhiben una identidad secuencial de al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90%. En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico exhiben una identidad secuencial de un 95% o 98% respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia.
Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y las pautas para diseñar condiciones adecuadas se exponen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y un experto en la técnica las podrá determinar fácilmente en función de, por ejemplo, la longitud y/o la composición de bases del ácido nucleico .
La similitud secuencial entre polipéptidos, que también se denomina identidad secuencial, normalmente se mide utilizando un software para el análisis de secuencias. El software para el análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando mediciones de la similitud asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas las sustituciones aminoacídicas conservadoras. Por ejemplo, la herramienta para el análisis de secuencias GCG (Accelrys Software Inc.) contiene programas, tales como "GAP" y "BEST-FIT" , que se pueden utilizar con parámetros preestablecidos para determinar la homología secuencial o identidad secuencial entre polipéptidos relacionados estrechamente, tales como polipéptidos homólogos de especies de organismos diferentes o entre una proteína natural y una de sus muteínas. (Remítase, p. ej . , a GOG Versión 6.1 o Durbin et. al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge Press (1998) ) .
También se pueden comparar secuencias polipeptídicas utilizando FASTA con parámetros preestablecidos o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (p. ej . , FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y el porcentaje de identidad secuencial de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de referencia y de examen (Pearson (2000) , mencionado anteriormente) . Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de organismos diferentes es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, utilizando parámetros preestablecidos. Remítase, p. ej . , a Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol . 215: 403 410 y Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia.
A este respecto, la invención también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos que son "sustancialmente idénticos" con respecto a una secuencia polipeptídica de la región variable de un anticuerpo (p. ej . , ya sea la región variable de la cadena ligera o la cadena pesada del donante, o la región variable de la cadena ligera o la cadena pesada del aceptor) . La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idénticos", tal como se aplica a estos polipéptidos, quiere decir que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por medio de los programas GAP o BEST-FIT utilizando penalizaciones por hueco preestablecidas, comparten al menos una identidad secuencial de un 60% o 65%, preferentemente al menos una identidad secuencial de un 70%, 75%, 80%, 85% o 90%, incluso más preferentemente una identidad secuencial de al menos un 93%, 95%, 98% o 99%. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticos difieren en sustituciones aminoacídicas conservadoras. Una "sustitución aminoacídica conservadora" es aquella en la que un residuo aminoacídico está sustituido por otro residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (p. ej . , carga o hidrofobicidad) . En general, una sustitución aminoacídica conservadora no modificará de forma sustancial las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad secuencial o el grado de similitud se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. 3. Expresión Los diferentes procesos de la expresión recombinante, es decir, la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido, están bien definidos tal como se expone, por ejemplo, en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook eü al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3.a Ed.), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (2000); y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds . , Current Protocols, una colaboración empresarial entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado en el 2006) .
Ciertas expresiones de interés incluyen "secuencia de control de la expresión" que comprende promotores, sitios de unión al ribosoma, promotores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de ARNm. Como bien se sabe, un "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está situada generalmente antes (en el extremo 5') de la secuencia de ácido nucleico que se está expresando y controla la expresión de la secuencia al proporcionar un sitio de reconocimiento y unión para la AR -polimerasa .
Los promotores ilustrativos que son compatibles de acuerdo con la invención incluyen promotores para la polimerasa SP6, T3 y T7, promotor de ARN U6 humano, promotor de CMV y promotores híbridos artificiales de estos (p. ej . , CMV) donde una o varias partes se fusionan con una o varias partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como, p. ej . , GAPDH humana (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa) , y que incluyen o no uno o más intrones adicionales.
En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico puede estar presente en un vector, cuando proceda con un promotor, que controle la expresión del ácido nucleico. El término conocido "vector" comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite, por ejemplo, introducir el ácido nucleico en células procariotas y/o eucariotas y, cuando proceda, integrarlo en un genoma. Los métodos de transformación de células de mamífero son muy conocidos en la técnica. Remítase, p. ej . , a las patentes de EE. UU. N.os 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. Los vectores pueden incluir una secuencia de nucleótidos que codifique un anticuerpo de la invención (p. ej . , un anticuerpo entero, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, una VH o VL de un anticuerpo, o una de sus porciones, o una CDR de la cadena pesada o ligera, un Fv monocatenario, o fragmentos o variantes de este) , ligada operablemente a un promotor (remítase, p. ej . , a la publicación de PCT WO 86/05807; la publicación de PCT WO 89/01036; y la patente de EE . UU. N.° 5.122.464).
Se comercializan diversos sistemas vectoriales de expresión en el hospedero, y muchos son compatibles con los principios de la presente y se pueden utilizar para expresar los moduladores de la invención. Tales sistemas incluyen, sin carácter limitante, microorganismos tales como bacterias (p. ej . , E. coli, B. subtilis, estreptomicetos) transformadas con ADN bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias que codifican moduladores; levadura (p. ej . , Saccharomyces, Pichia) transfectada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican moduladores; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (p. ej . , baculovirus) que contienen secuencias que codifican moduladores; sistemas de células vegetales (p. ej . , Nicotiana, Arabidopsis, lentejas de agua, maíz, trigo, papa, etc.) infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (p. ej . , virus del mosaico de la coliflor; virus del mosaico del tabaco) o transíectados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (p. ej . , plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican moduladores; o sistemas de células de mamífero (p. ej . , células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, etc.) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (p. ej . , promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (p. ej . , el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia) .
La expresión "célula hospedera", tal como se utiliza en la presente, abarca cualquier tipo de sistema celular que se puede modificar por ingeniería genética para que genere los polipéptidos y las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. En una modalidad, la célula hospedera se modifica por ingeniería genética para permitir la producción de una molécula de unión al antígeno con glicoformas modificadas. En una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno o la variante de la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o proteína de fusión. En ciertas modalidades, las células hospederas han sido manipuladas adicionalmente para que expresen niveles elevados de uno o más polipéptidos con actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) . Las células hospederas compatibles incluyen células cultivadas, p. ej . , células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también las células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica, o planta cultivada o tejido animal.
Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por consiguiente, se pueden modificar genéticamente líneas celulares que expresan de forma estable el modulador seleccionado utilizando técnicas estándar reconocidas en la materia. En vez de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células hospederas se pueden transformar con ADN controlado por elementos para el control de la expresión adecuados (p. ej . , promotor, potenciador, secuencias, terminados de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Se puede utilizar cualquiera de los sistemas de selección conocidos en la técnica, incluido el sistema de expresión del gen de la glutamina-sintetasa (el sistema GS) que proporciona una estrategia eficiente para incrementar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se describe entero o en parte en relación con las patentes EP 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 y 0 338 841, y las patentes de EE. UU. N.os 5.591.639 y 5.879.936, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia. Otro sistema de expresión preferido, el kit Freedom™ CHO-S comercializado por Life Technologies (número de catálogo A13696-01) , también facilita el desarrollo de líneas celulares estables que se pueden utilizar para producir moduladores.
Tales sistemas de expresión en el hospedero representan vehículos a través de los cuales se pueden producir las secuencias codificantes de interés y posteriormente purificarlas, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos adecuadas, pueden expresar una molécula de la invención in situ. La célula hospedera se puede cotransfectar con dos vectores de expresión de la invención, por ejemplo, donde el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera.
Por lo tanto, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona células hospederas recombinantes que permiten la expresión de anticuerpos o porciones de estos. Los anticuerpos producidos por expresión en tales células hospederas recombinantes se denominan en la presente anticuerpos recombinantes. La presente invención también proporciona células descendientes de tales células hospederas y anticuerpos producidos por estas.
C . Síntesis química Además, los moduladores se pueden sintetizar químicamente utilizando técnicas conocidas en la materia (p. ej . , remítase a Creighton, 1983, Proteins : Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co., N.Y. , y Hunkapiller, M. , et al . , 1984, Nature 310:105-111). Es más, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos (tales como isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico y similares) como una sustitución o una adición en una secuencia polipeptídica .
D . Sistemas transgénicos En otras modalidades, los moduladores se pueden producir transgénicamente mediante la generación de un mamífero o una planta que sea transgénica para moléculas recombinantes tales como las secuencias de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, y que produce los compuestos deseados en una forma recuperable. Esto incluye, por ejemplo, la producción de moduladores proteicos (p. ej . , anticuerpos) en la leche de cabras, vacas u otros mamíferos, y su recuperación a partir de la leche. Remítase, por ejemplo, a las patentes de EE . UU. N.os 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957. En algunas modalidades, los animales transgénicos no humanos que comprenden locus de inmunoglobulina humana se inmunizan para producir anticuerpos.
Otras técnicas transgénicas se exponen en Hogan et al . , Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed. , Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000) ; y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) y la patente de EE. UU. N.° 6.417.429. En algunas modalidades, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos, y el producto deseado se produce en su sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, mucosidad y otros fluidos corporales a partir de los cuales se puede obtener fácilmente utilizando técnicas de purificación reconocidas en la técnica.
Otros sistemas de producción compatibles incluyen métodos para crear anticuerpos en plantas tales como las descritas, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N.os 6.046.037 y 5.959.177, que se pueden incorporar a la presente en lo que respecta a tales técnicas.
E . Aislamiento/purificación Una vez se ha producido un modulador de la invención por expresión recombinante o cualquier otra de las técnicas descritas, se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de inmunoglobulinas o proteínas. A este respecto, el modulador se puede "aislar" lo cual significa que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Los moduladores aislados incluyen un modulador in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente.
Si la molécula deseada se produce intracelularmente, como primer paso, los desechos particulados, ya sean células hospederas o fragmentos lisados, se pueden eliminar, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el modulador se secreta al medio, el sobrenadante de tales sistemas de expresión generalmente se concentra primero utilizando un filtro para concentrar proteínas comercializado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Pellicon (Millipore Corp.) . Una vez que se eliminan los contaminantes insolubles, el preparado del modulador se purifica aún más utilizando técnicas estándar tales como, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad de interés particular. A este respecto, la proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas de IgGl, IgG2 o IgG4 humana (Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)), mientras que la proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la IgG3 humana (Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986)). También se dispone de otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía de heparina, cromatografía de sefarosa en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo que se desee recuperar. En modalidades particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención se purificarán, al menos en parte, utilizando cromatografía de afinidad con Proteína A o Proteína G.
VI . Fragmentos y derivados de los moduladores de DLL3 Independientemente de la metodología de generación y producción que se seleccione, los moduladores de la presente invención reaccionarán, se unirán, se combinarán, formarán complejos, se conectarán, se enlazarán, se adherirán, interaccionarán o se asociarán de otro modo con un determinante diana (p. ej . , antígeno) y de este modo proporcionarán los resultados deseados. Cuando el modulador comprende un anticuerpo o un fragmento, constructo o derivado de este, tales asociaciones pueden ser a través de uno o más "sitios de unión" o "componentes de unión" expresados en el anticuerpo, donde un sitio de unión comprende una región de un polipéptido que es responsable de la unión selectiva a una molécula o antígeno diana de interés. Los dominios de unión comprenden al menos un sitio de unión (p. ej . , un anticuerpo IgG intacto tendrá dos dominios de unión y dos sitios de unión) . Los dominios de unión ilustrativos incluyen un dominio variable de un anticuerpo, un dominio de unión al receptor de un ligando, un dominio de unión al ligando de un receptor o un dominio enzimático.
A. Anticuerpos Tal como se ha indicado anteriormente, se pretende que el término "anticuerpo" abarque, al menos, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiclonales , anticuerpos quiméricos, anticuerpos con injertos de CDR, anticuerpos humanizados y primatizados , anticuerpos humanos, anticuerpos producidos recombinantemente, intracuerpos, anticuerpos multiespecíficos , anticuerpos biespecíficos , anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos antiidiotípicos, así como también anticuerpos sintéticos.
B . Fragmentos Independientemente del modulador (p. ej . , quimérico, humanizado, etc.) que se seleccione para llevar a la práctica la invención, se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos de este se pueden utilizar de acuerdo con los principios de la presente. Un "fragmento de anticuerpo" comprende al menos una porción de un anticuerpo intacto. El término "fragmento" de una molécula de anticuerpo, tal como se utiliza en la presente, incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos y la expresión "fragmento de unión al antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une o reacciona inmunoespecíficamente con un antígeno o determinante inmunogénico seleccionado de este, o compite con el anticuerpo intacto del cual se derivan los fragmentos por la unión específica al antígeno.
Los fragmentos ilustrativos incluyen: VL, VH, scFv, fragmento F(ab')2, fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmentos de un anticuerpo con un dominio único, diacüerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de un anticuerpo. Además, un fragmento activo comprende una porción del anticuerpo que retiene su capacidad para interaccionar con el antígeno/sustratos o receptores y modificarlos de una forma similar a la de un anticuerpo intacto (aunque quizás de una forma menos eficiente) .
En otras modalidades, un fragmento de un anticuerpo es aquel que comprende la región Fe y aquel que retiene al menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función ADCC y la unión al complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de este tipo puede comprender un brazo de unión al antígeno enlazado a una secuencia de Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.
Como reconocerán los expertos en la técnica, se pueden obtener fragmentos por tratamiento químico o enzimático (tal como papaína o pepsina) de un anticuerpo intacto o entero o una cadena de anticuerpo, o por medios recombinantes . Remítase, p. ej . , a Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para consultar una descripción más detallada de los fragmentos de un anticuerpo.
C . Derivados La invención incluye además derivados de moduladores inmunorreactivos y moléculas de unión al antígeno que comprenden una o más modificaciones. 1. Anticuerpos multivalentes En una modalidad, los moduladores de la invención pueden ser monovalentes o multivalentes (p. ej . , bivalentes, trivalentes, etc.). El término "valencia", tal como se utiliza en la presente, se refiere al número de sitios de unión a la diana potenciales asociados con un anticuerpo. Cada sitio de unión a la diana se une específicamente a una molécula diana o posición o locus específico en una molécula diana. Cuando un anticuerpo es monovalente, cada sitio de unión de la molécula se unirá específicamente a una única posición o epítopo antigénico. Cuando un anticuerpo comprende más de un sitio de unión a la diana (multivalente) , cada sitio de unión a la diana se puede unir específicamente a moléculas idénticas o diferentes (p. ej . , se pueden unir a ligandos diferentes o antígenos diferentes, o epítopos o posiciones diferentes en el mismo antígeno) . Remítase, p. ej . , a la patente de EE . UU. N.° 2009/0130105. En cada caso, al menos uno de los sitios de unión comprenderá un epítopo, motivo o dominio asociado con una isoforma de DLL3.
En una modalidad, los moduladores son anticuerpos biespecíficos en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes, tal como se describe en Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539. Otras modalidades incluyen anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos . Otros constructos multiespecíficos compatibles más sofisticados y métodos para su fabricación se exponen en la patente de EE. UU. N.° 2009/0155255, así como también WO 94/04690; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210; y WO96/27011.
Tal como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos multivalentes se pueden unir inmunoespecíficamente a epítopos diferentes de la molécula diana deseada o se pueden unir inmunoespecíficamente tanto a la molécula diana como también a un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Aunque las modalidades preferidas de los anticuerpos anti-DLL3 se unan solamente a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos) , la presente invención también abarca anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos . Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o anticuerpos "heteroconjugados " . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE. UU. N.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar utilizando cualesquiera métodos de reticulación convenientes. Los agentes reticulantes adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen en la patente de EE. UU. N.° 4.676.980, junto con múltiples técnicas de reticulación.
En otras modalidades más, los dominios variables de un anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de un dominio constante de inmunoglobulina, tales como el dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y/o CH3 , utilizando métodos con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. 2. Modificaciones de la región Fe Además de las diferentes modificaciones, sustituciones, adiciones o deleciones de la región variable o de unión de los moduladores descritos (p. ej . , Fc-DLL3 o anticuerpos anti-DLL3) expuestas anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que modalidades seleccionadas de la presente invención también pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región constante (es decir, la región Fe) . Más particularmente, se contempla que los moduladores de DLL3 de la invención pueden contener, ínter alia, una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones de residuos aminoacídicos adicionales que den como resultado un compuesto con características preferidas que incluyen, sin carácter limitante: propiedades farmacocinéticas alteradas, una semivida sérica mayor, una afinidad de unión mayor, una inmunogenicidad reducida, una producción mayor, una unión alterada del ligando de Fe a un receptor Fe (FcR) , una actividad "ADCC" (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) o "CDC" (citotoxicidad dependiente del complemento) mayor o menor, una glicosilación alterada y/o enlaces disulfuro y una especificidad de unión modificada. A este respecto, se apreciará que estas variantes de Fe se puedan utilizar convenientemente para mejorar las propiedades antineoplásicas efectivas de los moduladores descritos.
Con este fin, ciertas modalidades de la invención pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región Fe, por ejemplo, la adición de uno o más residuos aminoacídicos, sustituciones, mutaciones y/o modificaciones para producir un compuesto con funciones efectoras de Fe mejoradas o preferidas. Por ejemplo, los cambios en los residuos aminoacídicos que participan en la interacción entre el dominio Fe y un receptor Fe (p. ej . , FcyRI, FcyRIIA y B, FCYRIII y FcRn) pueden conducir a una citotoxicidad mayor y/o propiedades farmacocinéticas alteradas, tales como una semivida sérica mayor (remítase, por ejemplo, a Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995), cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia) .
En modalidades seleccionadas, se pueden generar anticuerpos con semividas in vivo mayores mediante la modificación (p. ej . , sustitución, deleción o adición) de residuos aminoacídicos identificados como participantes en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (remítase, p. ej . , a las publicaciones internacionales N.os WO 97/34631; WO 04/029207; la patente de EE. UU. N.° 6.737.056 y la patente de EE. UU. N.° 2003/0190311. En lo que respecta a tales modalidades, las variantes de Fe pueden proporcionar semividas en un mamífero, preferentemente un ser humano, superiores a 5 días, superiores a 10 días, superiores a 15 días, preferentemente superiores a 20 días, superiores a 25 días, superiores a 30 días, superiores a 35 días, superiores a 40 días, superiores a 45 días, superiores a 2 meses, superiores a 3 meses, superiores a 4 meses o superiores a 5 meses. El aumento de la semivida da como resultado una titulación sérica mayor que reduce así la frecuencia de la administración de los anticuerpos y/o reduce la concentración de los anticuerpos que se ha de administrar. La unión a FcRn humano in vivo y la semivida sérica de los polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano se pueden ensayar, p. ej . , en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los cuales se les administran los polipéptidos con una variante de la región Fe. WO 2000/42072 describe variantes de anticuerpo con una unión mayor o menor a FcRn. Remítase también, p. ej . , a Shields et al., J. Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) .
En otras modalidades, las alteraciones de Fe pueden conducir a una actividad ADCC o CDC mayor o menor. Como consta en la técnica, CDC se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento, y ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida a FcR presente en ciertas células citotóxicas (p. ej . , linfocitos citolíticos espontáneos, neutrófilos y macrófagos) permite a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno y subsecuentemente aniquilar la célula diana con citotoxinas. En el contexto de la presente invención, las variantes de anticuerpo se proporcionan con una afinidad por la unión a FcR "alterada", la cual es una unión mayor o menor en comparación con un anticuerpo original o anticuerpo sin modificar o con un anticuerpo que comprende una secuencia de FcR nativa. Tales variantes que presentan una unión menor pueden poseer una unión baja o inapreciable, p. ej . , una unión de un 0-20% al FcR en comparación con una secuencia nativa, p. ej . , según se determina mediante técnicas muy conocidas en la materia. En otras modalidades, la variante exhibirá una mayor unión en comparación con el dominio Fe de inmunoglobulina nativa. Se apreciará que estos tipos de variantes de Fe se puedan utilizar convenientemente para mejorar las propiedades antineoplásicas efectivas de los anticuerpos descritos. En otras modalidades más, tales alteraciones conducen a una mayor afinidad de unión, una inmunogenicidad menor, una producción mayor, una glicosilación alterada y/o puentes disulfuro (p. ej . , para sitios de conjugación), una especificidad de unión modificada, una fagocitosis mayor; y/o la reducción de los receptores de la superficie celular (p. ej . , receptor de linfocitos B; BCR), etc. 3. Glicosilación alterada Otras modalidades adicionales comprenden una o más glicoformas modificadas, es decir, un modulador de DLL3 que comprende un patrón de glicosilación alterada o una composición de carbohidratos alterada que está enlazado covalentemente a la proteína (p. ej . , en el dominio Fe). Remítase, por ejemplo, a Shields, R. L. et al., (2002) J. Biol . Chem. 277:26733-26740. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para diversos propósitos que incluyen, sin carácter limitante, el aumento o la reducción de la función efectora, el aumento de la afinidad del modulador por una diana o el fomento de la producción del modulador. En ciertas modalidades en las que se desea reducir la función efectora, la molécula se puede modificar para que exprese una forma aglicosilada . Las sustituciones que pueden provocar la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del entramado de la región variable para suprimir de este modo la glicosilación en el sitio son muy conocidas (remítase, p. ej . , a las patentes de EE . UU. N.os 5.714.350 y 6.350.861). En cambio, se pueden conferir unas mejores funciones efectoras o una unión mejorada a la molécula que contiene Fe añadiendo por ingeniería genética uno o más sitios de glicosilación adicionales.
Otras modalidades incluyen una variante de Fe que tiene una composición de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que contiene cantidades reducidas de residuos fucosílicos o un anticuerpo que tiene unas estructuras GlcNAc bisectrices mayores. Se ha demostrado que los patrones de glicosilación alterada de este tipo incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Se pueden generar glicoformas modificadas mediante cualquier método con el que esté familiarizado un experto en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de variantes de expresión de cepas o cepas modificadas, mediante la coexpresión con una o más enzimas (por ejemplo, N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) ) , mediante la expresión de una molécula que comprende una región Fe en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o mediante la modificación de carbohidrato (s) después de que la molécula que comprende la región Fe se haya expresado (remítase, por ejemplo, a WO 2012/117002) .
. Procesamiento adicional Los moduladores se pueden modificar diferencialmente durante o después de la producción, p. ej . , por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, ligadura a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de entre numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, sin carácter limitante, la escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.
Diversas modificaciones postraduccionales que la invención también abarca incluyen, por ejemplo, cadenas carbohidratadas unidas a través de N o unidas a través de O, el procesamiento de extremos aminoterminales o carboxiterminales , el acoplamiento de restos químicos al esqueleto aminoacídico, modificaciones químicas de cadenas carbohidratadas unidas a través de N o unidas a través de O y la adición o deleción de un residuo de metionina aminoterminal como resultado de la expresión de células hospederas procariotas. Además, los moduladores también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, radioisotópico o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento del modulador .
VII. Caracterísiticas de los moduladores Independientemente del modo de obtención o de las formas mencionadas anteriormente que el modulador adquiera, varias modalidades de los moduladores descritos pueden exhibir ciertas características. En modalidades seleccionadas, se pueden seleccionar, clonar y cribar posteriormente células productoras de anticuerpos (p. ej . , hibridomas o colonias de levaduras) para obtener unas propiedades favorables que incluyen, por ejemplo, un crecimiento robusto, una alta producción de moduladores y, como se indica más detalladamente más adelante, unas características deseables para un modulador. En otros casos, se pueden conferir o modificar las características del modulador seleccionando un antígeno particular (p. ej . , una isoforma de DLL3 específica) o fragmento inmunorreactivo del antígeno diana para su inoculación en el animal. En otras modalidades adicionales, los moduladores seleccionados se pueden modificar como se ha descrito anteriormente para mejorar o refinar sus características inmunoquímicas tales como la afinidad o propiedades farmacocinéticas .
A. Moduladores neutralizantes En ciertas modalidades, los moduladores comprenderán anticuerpos "neutralizantes", o derivados o fragmentos de estos. Es decir, la presente invención puede comprender moléculas de anticuerpo que se unen a dominios, motivos o epítopos específicos, y que son capaces de bloquear, reducir o inhibir la actividad biológica de DLL3. Más generalmente, la expresión "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que se une o interacciona con una molécula o ligando diana, y evita que la molécula diana se una o asocie con una entidad de unión, tal como un receptor o sustrato, y de este modo se interrumpe una respuesta biológica que de lo contrario provocaría la interacción de las moléculas.
Se apreciará que se pueden utilizar ensayos de unión competitiva conocidos en la técnica para evaluar la unión y la especificidad de un anticuerpo o fragmento o derivado inmunológicamente funcional de este. Con respecto a la presente invención, se sobreentenderá que un anticuerpo o fragmento inhibe o reduce la unión de DLL3 a una entidad de unión o sustrato cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de entidad de unión unida a DLL3 al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más según se mide, por ejemplo, mediante la actividad del receptor Notch o en un ensayo de unión competitiva in vitro. En el caso de los anticuerpos de DLL3, por ejemplo, un anticuerpo neutralizante o antagonista preferentemente alterará la actividad del receptor Notch al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más. Se apreciará que esta actividad modificada se puede medir directamente utilizando técnicas reconocidas en la materia o se puede medir por el impacto que la actividad alterada ejerce posteriormente (p. ej . , oncogénesis, supervivencia celular, o activación o supresión de genes que responden a Notch) . Preferentemente, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad de DLL3 se evalúa por la inhibición de la unión de DLL3 a un receptor Notch o evaluando su capacidad para aliviar la represión mediada por DLL3 de la señalización Notch.
B . Moduladores internalizantes Hay indicios de que una porción sustancial de la proteína DLL3 expresada sigue asociada con la superficie celular tumorigénica, lo cual permite localizar e internalizar los moduladores descritos. En modalidades preferidas, tales moduladores se pueden conjugar o asociar con agentes anticancerosos tales como restos citotóxicos que aniquilan la célula al internalizarlos. En modalidades particularmente preferidas, el modulador comprenderá un conjugado de anticuerpo internalizante-fármaco .
Tal como se utiliza en la presente, un modulador que se "internaliza" es aquel que es captado (junto con cualquier carga útil) por la célula al unirse a un antígeno o receptor asociado. Como se apreciará, el modulador internalizante puede comprender, en modalidades preferidas, un anticuerpo que incluya fragmentos de anticuerpo y derivados de este, así como también conjugados de anticuerpo. La inte nalización puede tener lugar in vitro o in vivo. Para las aplicaciones terapéuticas, la internalización tendrá lugar preferentemente in vivo en un sujeto que lo necesite. El número de moléculas de anticuerpo internalizadas puede ser suficiente o adecuado para aniquilar una célula que expresa antígeno, especialmente una célula madre cancerosa que expresa antígeno. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o el conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la captación de una única molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para aniquilar la célula diana a la cual se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son tan sumamente potentes que la internalización de unas pocas moléculas de la toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para aniquilar la célula tumoral . El que un anticuerpo se internalice al unirse a una célula de mamífero se puede determinar mediante diversos ensayos, incluidos los que se describen más adelante en los Ejemplos (p. ej . , los Ejemplos 12 y 15-17). También se describen métodos para detectar si un anticuerpo se internaliza en una célula en la patente de EE. UU. N.° 7.619.068, la cual se incorpora a la presente en su totalidad por referencia.
C . Moduladores supresores En otras modalidades, los anticuerpos comprenderán anticuerpos supresores, o derivados o fragmentos de estos. El término anticuerpo "supresor" se refiere a un anticuerpo que se une o asocia preferentemente con un antígeno en o cerca de la superficie celular, e induce, fomenta o provoca la muerte o la eliminación de la célula (p. ej . , por CDC, ADCC o introducción de un agente citotóxico) . En algunas modalidades, los anticuerpos supresores seleccionados estarán asociados o conjugados a un agente citotóxico.
Preferentemente un anticuerpo supresor será capaz de destruir, incapacitar, eliminar o aniquilar al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de las células tumorigénicas DLL3 en una población de células definidas. En algunas modalidades, la población de células puede comprender células perpetuantes de tumores enriquecidas, seccionadas, purificadas o aisladas. En otras modalidades, la población de células puede comprender muestras tumorales enteras o extractos tumorales heterogéneos que comprenden células perpetuantes de tumores. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar técnicas bioquímicas estándar como las que se describen más adelante en los Ejemplos (p. ej . , los Ejemplos 13 y 14) para monitorizar y cuantificar el agotamiento de células tumorigénicas o células perpetuantes de tumores de acuerdo con los principios de la presente.
D . Clasificación en secciones y unión a epítopos Se podrá apreciar además que los moduladores de tipo anticuerpo anti-DLL3 descritos se asociarán o se unirán con epítopos discretos o determinantes inmunogénicos presentados por la diana seleccionada o un fragmento de esta. En ciertas modalidades, los epítopos o determinantes inmunogénicos incluyen agrupaciones químicamente tensioactivas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Por lo tanto, el término "epítopo", tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a un receptor de linfocitos T o inmunoglobulina, o que interacciona con una molécula. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente (o se une o reacciona inmunoespecíficamente) con un antígeno cuando reconoce preferencialmente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas .
En modalidades preferidas, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación en equilibrio (KD) es menor o igual a 10"6M, o menor o igual a ?G7?, más preferentemente cuando la constante de disociación en equilibrio es menor o igual a 10_8M e incluso más preferentemente cuando la constante de disociación es menor o igual a 10"9M.
Más directamente, el término "epítopo" se utiliza con su sentido bioquímico común y se refiere a una porción de un antígeno diana que puede ser reconocida por un modulador de tipo anticuerpo particular y a la que este se une específicamente. Cuando el antígeno es un polipéptido, tal como DLL3 , se pueden formar epítopos generalmente a partir de tanto aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína ("epítopos conformacionales" ) . En tales epítopos conformacionales , los puntos de interacción se encuentran entre residuos aminoacídicos en la proteína que están separados linealmente unos de otros. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (denominados a veces epítopos "lineales" o "contiguos") normalmente se retienen al desnaturalizarse la proteína, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden al desnaturalizarse la proteína. En cualquier caso, un epítopo de un anticuerpo normalmente incluye al menos 3 y más habitualmente al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial .
A este respecto, se apreciará que, en ciertas modalidades, un epítopo se puede asociar con una o más regiones, dominios o motivos de la proteína DLL3 o residir en estos (p. ej . , los aminoácidos 1-618 de la isoforma 1). Tal como se indica más detalladamente en la presente, la región extracelular de la proteína DLL3 comprende una serie de dominios generalmente reconocidos que incluyen seis dominios similares a EGF y un dominio DSL. A los efectos de la presente exposición, el término "dominio" se utilizará de acuerdo con su significado generalmente aceptado y se sobreentenderá que se refiere a una entidad estructural conservada definible o identificable dentro de una proteína que exhibe un contenido estructural secundario característico. En muchos casos, los dominios homólogos con funciones comunes presentarán normalmente similitudes secuenciales y se pueden encontrar en diversas proteínas dispares (p. ej . , hay constancia de la presencia de dominios similares a EGF en al menos 471 proteínas diferentes) . De forma análoga, el término "motivo" reconocido en la técnica se utilizará de acuerdo con su significado habitual y se referirá en general a una región conservada corta de una proteína constituida normalmente por de diez a veinte residuos aminoacídicos contiguos. Como se indica a lo largo del documento, las modalidades seleccionadas comprenden moduladores que se asocian o unen con un epítopo dentro de regiones, dominios o motivos específicos de DLL3.
En cualquier caso, una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, se pueden generar anticuerpos para el epítopo, p. ej . , por inmunización con un péptido que comprende el epítopo utilizando técnicas que se describen en la presente invención. Como alternativa, durante el proceso de descubrimiento, la generación y la caracterización de anticuerpos pueden dilucidar información sobre epítopos deseables situados en dominios o motivos específicos. A partir de esta información, se pueden entonces cribar anticuerpos competitivamente para la unión al mismo epítopo. Una estrategia para conseguir esto es realizar estudios de la conducta competitiva para encontrar anticuerpos que se unen competitivamente uno respecto al otro, es decir, los anticuerpos compiten por la unión al antígeno. En O 03/48731 se describe un proceso de alto rendimiento para la clasificación en secciones de los anticuerpos en función de su competición cruzada. Más adelante, en los Ejemplos 9 y 10, se exponen otros métodos para la clasificación en secciones o el mapeo de los epítopos o el nivel de dominios que comprenden la competición entre moduladores o la expresión de un fragmento antigénico en levaduras.
El término "clasificación en secciones", tal como se utiliza en la presente, se refiere a métodos utilizados para agrupar o clasificar anticuerpos en función de sus características de unión al antígeno y competición. Aunque las técnicas son útiles para definir y categorizar los moduladores de la presente invención, las secciones no siempre se correlacionan directamente con epítopos y tales determinaciones iniciales de la unión a epítopos se pueden refinar aún más y confirmar mediante otra metodología reconocida en la técnica como la que se describe en la presente. Sin embargo, tal como se indica y muestra más adelante en los Ejemplos, la asignación empírica de moduladores de tipo anticuerpo a secciones individuales proporciona información que puede ser indicativa del potencial terapéutico de los moduladores descritos.
Más específicamente, se puede determinar si un anticuerpo de referencia seleccionado (o fragmento de este) se une al mismo epítopo o presenta competición cruzada por la unión con un segundo anticuerpo de ensayo (es decir, pertenece a la misma sección) utilizando métodos conocidos en la técnica y que se exponen en los ejemplos de la presente. En una modalidad, un modulador de tipo anticuerpo de referencia se asocia con un antígeno de DLL3 en condiciones de saturación y después se determina la capacidad de un modulador de tipo anticuerpo de ensayo o secundario para unirse a DLL3 utilizando técnicas inmunoquímicas estándard.
Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse sustancialmente a DLL3 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-DLL3 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo o secundario se une a un epítopo diferente al anticuerpo de referencia o primario. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse sustancialmente a DLL3 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo, un epítopo superpuesto o un epítopo que está en estrecha proximidad (al menos estéricamente) al epítopo al que se une el anticuerpo primario. Es decir, el anticuerpo de ensayo compite por la unión al antígeno y pertenece a la misma sección que el anticuerpo de referencia.
La expresión "competir" o "anticuerpo competitivo", cuando se utilizan en el contexto de los moduladores descritos, se refieren a la competición entre anticuerpos según se determina con un ensayo en el que un anticuerpo de ensayo o un fragmento inmunológicamente funcional objeto de estudio previene o inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Normalmente, un ensayo de este tipo supone el uso de antígeno purificado (p. ej . , DLL3 o un dominio o fragmento de este) unido a una superficie sólida o células portadoras de cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Habitualmente , la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso y/o se deja que se una primero. Los anticuerpos identificados mediante un ensayo competitivo (anticuerpos competitivos) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo al que se une el anticuerpo de referencia para que haya impedimentos estéricos . En los Ejemplos de la presente se proporcionan detalles adicionales referentes a métodos para determinar la unión competitiva. Normalmente, cuando un anticuerpo competitivo esté presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común al menos un 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algunos casos, la unión se inhibe al menos un 80%, 85%, 90%, 95% o 97%, o más.
En cambio, cuando se una el anticuerpo de referencia, inhibirá preferentemente la unión de un anticuerpo de ensayo añadido posteriormente (es decir, un modulador de DLL3) al menos un 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algunos casos, la unión del anticuerpo de ensayo se inhibe al menos un 80%, 85%, 90%, 95% o 97%, o más.
En lo que respecta a la presente invención y tal como se expone más adelante en los Ejemplos 9 y 10, se ha determinado (mediante resonancia de plasmones superficiales o interferometría biocapa) que el dominio extracelular de DLL3 define al menos nueve secciones según la unión competitiva denominadas de la "sección A" a la "sección I" en la presente. Teniendo en cuenta la resolución proporcionada por las técnicas de clasificación en secciones de los moduladores, se cree que estas nueve secciones comprenden la mayoría de la secciones que están presentes en la región extracelular de la proteína DLL3.
A este respecto y como consta en la técnica y se detalla más adelante en los Ejemplos, los datos sobre la clasificación en secciones o unión competitiva deseados se pueden obtener utilizando metodología de radioinmunoensayo (RIA) indirecto o directo en fase sólida, enzimoinmunoensayo (EIA o ELISA) indirecto o directo en fase sólida, ensayo competitivo de tipo sándwich, un sistema Biacore™ 2000 (es decir, resonancia de plasmones superficiales - GE Healthcare) , un analizador ForteBio® (es decir, interferometría de biocapa - ForteBio, Inc.) o citometría de flujo. La expresión "resonancia de plasmones superficiales", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite analizar interacciones específicas a tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones proteicas dentro de una matriz biosensora. La expresión " interferometría de biocapa" se refiere a una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada de dos superficies: una capa de proteína inmovilizada en un cabezal biosensor y una capa de referencia interna. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas al cabezal biosensor provoca un desplazamiento en el patrón de interferencia que se puede medir a tiempo real. En modalidades particularmente preferidas, el análisis (ya sea resonancia de plasmones superficiales, interferometría de biocapa o citometría de flujo) se realizó utilizando un instrumento Biacore o ForteBio o un citómetro de flujo (p. ej . , FACSAria II) como se demuestra más adelante en los Ejemplos.
Para caracterizar aún más los epítopos con los que se asocian o unen los moduladores de tipo anticuerpo de DLL3 descritos, se realiza un mapeo de los epítopos a nivel de dominios utilizando una modificación del protocolo descrito por Cochran et al., {J Immunol Methods . 287 (1-2) : 147-158 (2004) el cual se incorpora a la presente por referencia) . Resumiendo, se expresaron dominios individuales de DLL3 que comprendían secuencias de aminoácidos específicas en la superficie de una levadura y se determinó la unión de cada anticuerpo de DLL3 por citometría de flujo. Los resultados se explican más adelante en el Ejemplo 10 y se muestran en las FIGS. 14A y 14B.
Otras técnicas de mapeo de los epítopos compatibles incluyen mutantes por barrido de alanina, inmunotransferencia peptídica (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) (incorporado específicamente a la presente en su totalidad por referencia) o análisis de escisión peptídica. Además, se pueden emplear métodos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496) (incorporado específicamente a la presente en su totalidad por referencia) . En otras modalidades, la creación de perfiles asistida por modificación (MAP) , conocida también como creación de perfiles de anticuerpos basada en la estructura de los antígenos (ASAP) , proporciona un método que categoriza números grandes de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies antigénicas modificadas química o enzimáticamente (la patente de EE . UU. N.° 2004/0101920, que se incorpora específicamente a la presente en su totalidad por referencia) . Cada categoría puede reflejar un epítopo único ya sea muy diferente a un epítopo representado por otra categoría o que se superpone parcialmente a este. Esta tecnología permite filtrar rápidamente anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización se puede centrar en anticuerpos genéticamente diferentes. Se apreciará que se puede utilizar MAP para clasificar los moduladores de tipo anticuerpo de hDDL3 de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a epítopos diferentes.
Los agentes útiles para alterar la estructura del antigeno inmovilizado incluyen enzimas tales como enzimas proteolíticas (p. ej . , tripsina, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Asp-N, quimotripsina, etc.). Los agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado también pueden ser agentes químicos, tales como ésteres de succinimidilo y sus derivados, compuestos que contienen aminas primarias, hidrazinas y carbohidrazinas, aminoácidos libres, etc.
La proteína antigénica se puede inmovilizar en las superficies de un chip biosensor o microesferas de poliestireno . Estas últimas se pueden procesar con, por ejemplo, un ensayo tal como un ensayo de detección LUMINEX™ múltiplex (Luminex Corp.). Debido a la capacidad de LUMINEX para gestionar un análisis múltiplex con hasta 100 tipos diferentes de microesferas, LUMINEX proporciona superficies antigénicas prácticamente ilimitadas con diversas modificaciones, lo cual proporciona una mejor resolución en la creación de perfiles de los epítopos de un anticuerpo en comparación con un ensayo con un biosensor.
E . Características de la unión de los moduladores Aparte de la especificidad epitópica, los anticuerpos descritos se pueden caracterizar utilizando características físicas tales como, por ejemplo, las afinidades de unión. A este respecto, la presente invención abarca también el uso de anticuerpos que tienen una afinidad de unión alta para una o más isoformas de DLL3 o, en el caso de pan-anticuerpos, más de un miembro de la familia DLL.
Se pretende que el término "KD" , tal como se utiliza en la presente, se refiera a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Se dice que un anticuerpo de la invención se une inmunoespecíficamente a su antígeno diana cuando la constante de disociación KD (koff/kon) es = 10"7M. El anticuerpo se une específicamente a un antígeno con una afinidad alta cuando la KD es = 5xlO"9M y con una afinidad muy alta cuando la KD es = 5xlO~10M. En una modalidad de la invención, el anticuerpo tiene una KD de = 10"9M y una velocidad de disociación de aproximadamente lxl0" /s. En una modalidad de la invención, la velocidad de disociación es < lxl0"5/s. En otras modalidades de la invención, los anticuerpos se unirán a DLL3 con una KD de entre aproximadamente 10"7M y 10~10M, y en otra modalidad más, se unirá con una KD= 2xl0"10M. Otras modalidades seleccionadas de la presente invención comprenden anticuerpos que tienen una constante de disociación o KD (k0ff/kon) inferior a 10"2M, inferior a 5xl0"2M, inferior a 10"3M, inferior a 5xlO"3M, inferior a 10"4M, inferior a 5xlO"4M, inferior a 10"5M, inferior a 5xlO"5M, inferior a 10"6M, inferior a 5xlO"6M, inferior a 10"7M, inferior a 5xlO"7M, inferior a 1(T8M, inferior a 5xlO~BM, inferior a 1(G9?, inferior a 5xl0~9M, inferior a 10~10M, inferior a 5xlO"10M, inferior a ÍO'^M, inferior a 5xlO_11M, inferior a 10"12M, inferior a 5xlO"12M, inferior a 10"13M, inferior a 5xlO"13M, inferior a 10"14M, inferior a 5xl0~1M, inferior a 10 "15M o inferior a 5xlO"15 .
En modalidades específicas, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a DLL3 tiene una constante de la velocidad de asociación o velocidad kon (o ka) (DLL3 (Ab) + antígeno (Ag) kon<-Ab-Ag) de al menos ÍC^M' 1, al menos 2xl05M~1s~1 , al menos B lC^M^s"1 , al menos lO^s"1, al menos 5xl06M"1s"1, al menos lC^M^s"1, al menos Bxlo'M^s"1 o al menos 108M"1s"1.
En otra modalidad, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a DLL3 tiene una constante de la velocidad de disociación o velocidad koff (o kd) (DLL3 (Ab) + antígeno (Ag) koff÷-Ab-Ag) inferior a 10~V ¦"", inferior a 5x10" V """, inferior a I0"2s"1, inferior a 5xl0~2s inferior a I0"3s -1 inferior a d???^e"1, inferior a ío-V1, inferior a 5xl0"4s -1 inferior a lO^s"1, inferior a 5xl0"5s"x , inferior a I0"6s -1 inferior a 5xl0"6s_1, inferior a ÍO'V1, inferior a 5xl0"7s -1 inferior a lO^s"1, inferior a 5xl0"8s_1 , inferior a I0~9s -1 inferior a 5?10"95_1 o inferior a I0"10s"1.
En otras modalidades seleccionadas de la presente invención, los anticuerpos anti-DLL3 tendrán una constante de afinidad o Ka (kon/k0ff) de al menos ÍO2!^"1, al menos 5xl02M-1, al menos 103?_1, al menos 5?103?_1, al menos 104M_1, al menos 5?104?_1, al menos 105?_1, al menos d???5^!"1, al menos 106M_1, al menos 5xl06 _1, al menos 107M_1, al menos 5x107M-1, al menos ÍO'M"1, al menos d ??^"1, al menos 109?_1, al menos 5xl09M_1, al menos 1010?_1, al menos ????^?"1, al menos ÍO^M"1, al menos d???^?"1, al menos 1012M~\ al menos 5xl012M_1, al menos 1013M"\ al menos 5?1013?_1, al menos 101?_1, al menos 5xl014 "1, al menos ÍO1^"1 o al menos 5xl015M_1.
Aparte de las características de los moduladores mencionadas anteriormente, los anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar además utilizando características físicas adicionales que incluyen, por ejemplo, estabilidad térmica (es decir, temperatura de fusión; Tm) y puntos isoeléctricos. (Remítase, p. ej . , a Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia) .
VIII. Moduladores conjugados A. Generalidades Una vez que se hayan generado y/o fabricado los moduladores de la invención y se hayan seleccionado de acuerdo con los principios de la presente, se pueden unir, fusionar, conjugar (p. ej . , de forma covalente o no covalente) o asociar de otro modo con restos de diagnóstico o farmacéuticamente activos, o modificadores biocompatibles . Las expresiones "conjugado", "conjugado de modulador" o "conjugado de anticuerpo", tal como se utilizan en la presente, se utilizarán en un sentido amplio y se sobreentenderá que se refieren a cualquier molécula biológicamente activa o detectable, o fármaco asociado con los moduladores descritos independientemente del método de asociación. A este respecto, se sobreentenderá que tales conjugados pueden comprender, además de los moduladores descritos, péptidos, polipéptidos , proteínas, profármacos que son metabolizados para obtener un agente activo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes de unión, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar asociado de forma covalente o no covalente con el modulador o ligado a este y exhibir diversas proporciones molares estequiométricas dependiendo, al menos en parte, del método empleado para conseguir la conjugación.
Los aspectos particularmente preferidos de la presente invención, comprenderán conjugados de modulador-anticuerpo o conjugados de anticuerpo-fármaco que se pueden utilizar para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos proliferativos . Se apreciará que, a menos que el contexto dicte lo contrario, se sobreentenderá que las expresiones "conjugado de anticuerpo-fármaco" o "ADC" o la fórmula M- [L-D]n abarcan los conjugados que comprenden restos tanto terapéuticos como de diagnóstico. En tales modalidades, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco comprenderán un modulador de DLL3 (normalmente un anticuerpo anti-DLL3) como la unidad moduladora o de unión celular (abreviada como CBA, M o Ab en la presente), un resto terapéutico (p. ej . , agente anticanceroso) o de diagnóstico (D) , y opcionalmente un conector (L) que une el fármaco al agente de unión al antígeno. A los efectos de la presente invención, se sobreentenderá que "n" se refiere a un número entero comprendido entre 1 y 20. En una modalidad preferida, el modulador es un mAb de DLL3 que comprende al menos una CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera como las descritas anteriormente.
Los expertos en la técnica apreciarán que también se dispone de varias reacciones diferentes para el enlace o la asociación de restos terapéuticos o de diagnóstico y/o conectores con agentes de unión. En modalidades seleccionadas, esto se puede conseguir haciendo reaccionar los residuos aminoacídicos del agente de unión, p. ej . , molécula de anticuerpo, que incluyen los grupos amino de la lisina, los grupos de tipo ácido carboxílico libres del ácido glutámico y aspár ico, los grupos sulfhidrilo de la cisteína y los diferentes restos de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos no específicos de enlace covalente utilizados más habitualmente es la reacción carbodi imídica para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto con grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Además, se han utilizado agentes bifuncionales , tales como dialdehídos o imidoésteres , para enlazar los grupos amino de un compuesto con grupos amino de una molécula de anticuerpo. Para el enlace de fármacos con agentes de unión, también se dispone de la reacción que produce una base de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, para formar así un aldehido que posteriormente se hace reaccionar con el agente de unión. El enlace tiene lugar mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. También se pueden utilizar isotiocianatos y azolactonas como agentes de acoplamiento para enlazar covalentemente fármacos con agentes de unión.
En otras modalidades, los moduladores descritos de la invención se pueden conjugar o asociar con proteínas, polipéptidos o péptidos que imparten características seleccionadas (p. ej . , biotoxinas, biomarcadores , marcadores de purificación, etc.). En ciertas modalidades preferidas, la presente invención abarca el uso de moduladores o fragmentos de estos fusionados recombinantemente o conjugados químicamente (incluidas tanto las conjugaciones covalentes como no covalentes) con una proteína o péptido heterólogo, donde la proteína o péptido comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos. El constructo no requiere necesariamente estar unido directamente, pero puede que esto ocurra a través de secuencias conectoras de aminoácidos. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares que expresan DLL3 , ya sea in vitro o in vivo, o fusionando o conjugando los moduladores de la presente invención con anticuerpos específicos para receptores de la superficie celular particulares con el fin de proporcionar constructos biespecífieos . Es más, también se pueden utilizar moduladores fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos en inmunoensayos in vitro y pueden ser particularmente compatibles con la metodología de purificación (p. ej . , marcadores His) conocida en la técnica. Remítase, p. ej . , a la publicación internacional N.° O 93/21232; la patente europea N.° EP 439.095; Naramura et al., 1994, I munol. Lett . 39:91-99; la patente de EE . UU. N.° 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.
B . Conectores Aparte de los conectores o espaciadores peptídicos mencionados anteriormente, se apreciará que se pueden utilizar otras variedades o tipos de conector diferente para asociar los moduladores descritos con restos de diagnóstico o farmacéuticamente activos o modificadores biocompatibles . En algunas modalidades, el conector se puede escindir en condiciones intracelulares, de modo que la escisión del conector libere la unidad correspondiente al fármaco del anticuerpo en el entorno intracelular . En otras modalidades adicionales, la unidad conectora no se puede escindir y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación del anticuerpo .
Los conectores del ADC son preferentemente estables extracelularmente, evitan la agregación de moléculas de ADC y mantienen el ADC soluble libremente en medios acuosos y en un estado monomérico. Antes de su transporte o suministro a la célula, el conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) es preferentemente estable y permanece intacto, es decir, el anticuerpo permanece unido al resto correspondiente al fármaco. Los conectores son estables fuera de la célula diana y se pueden escindir en cierta tasa eficaz dentro de la célula. Un conector efectivo: (i) mantendrá las propiedades de unión específicas del anticuerpo; (ii) permitirá el suministro intracelular del conjugado o el resto correspondiente al fármaco; (iii) permanecerá estable e intacto, es decir, sin escindirse, hasta que el conjugado se haya suministrado o transportado a su sitio seleccionado como diana; y (iv) mantener un efecto de aniquilación de células citotóxico o un efecto citostático del resto correspondiente al fármaco PBD. La estabilidad del ADC se puede medir mediante técnicas analíticas estándar tales como espectroscopia de masas, HPLC y la técnica de separación/análisis por LC/MS. La unión covalente del anticuerpo y el resto correspondiente al fármaco requiere que el conector tenga dos grupos funcionales reactivos, es decir, bivalencia en un sentido reactivo. Se conocen reactivos conectores bivalentes que son útiles para enlazar dos más restos activos funcional o biológicamente, tales como péptidos, ácidos nucleicos, fármacos, toxinas, anticuerpos, haptenos y grupos indicadores, y ciertos métodos han descrito sus conjugados resultantes (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nueva York, págs . 234-242) .
Con este fin, ciertas modalidades de la invención comprenden el uso de un conector que puede ser escindido por un agente de escisión que esté presente en el entorno intracelular (p. ej . , dentro de un lisosoma o endosoma o caveola) . El conector puede ser, por ejemplo, un conector peptidílico que sea escindido por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluidas, sin carácter limitante, una proteasa lisosomal o endosomal . En algunas modalidades, el conector peptidílico tiene una longitud de al menos dos aminoácidos o al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D, y plasmina, cada una de las cuales se sabe que hidroliza derivados de fármacos dipeptídicos lo cual provoca la liberación del fármaco activo dentro de las células diana. Algunos conectores peptidílicos ilustrativos que pueden ser escindidos por la proteasa catepsina B dependiente de tiol son péptidos que comprenden Phe-Leu, ya que se ha comprobado que la catepsina B se expresa en grandes cantidades en el tejido canceroso. Otros ejemplos de tales conectores se describen, por ejemplo, en la patente de EE . UU. N.° 6.214.345 y la patente de EE . UU. N.° 2012/0078028, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia. En una modalidad preferida específica, el conector peptidílico que puede ser escindido por una proteasa intracelular es un conector Val-Cit, un conector Ala-Val o un conector Phe-Lys tal como se describe en la patente de EE. UU. N.° 6.214.345. Una ventaja del uso de la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente normalmente se atenúa cuando se conjuga y las estabilidades séricas de los conjugados son normalmente altas.
En otras modalidades, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Normalmente, el conector sensible al pH se puede hidrolizar en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede utilizar un conector lábil en medio ácido que se puede hidrolizar en el lisosoma (p. ej . , una hidrazona, oxima, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similar) (remítase, p. ej . , a las patentes de EE . UU. N.os 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929) . Tales conectores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como aquellas en la sangre, pero son inestables a un pH inferior a 5.5 o 5.0, el pH aproximado del lisosoma .
En otras modalidades más, el conector se puede escindir en condiciones reductoras (p. ej . , un conector de tipo disulfuro) . En la técnica se conocen varios conectores de tipo disulfuro incluidos, por ejemplo, los que se pueden formar utilizando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato) , SPDP (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato) , SPDB (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridilditio) tolueno) . En otras modalidades específicas más, el conector es un conector de tipo malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93) , un conector de tipo maleimidobenzoílo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med- Chem . 3 (10) : 1299-1304) o un análogo de 3'-iV-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10) : 1305-12) . En otras modalidades adicionales, la unidad conectora no se puede escindir y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo. (Remítase a la publicación de EE . UU. N.° 2005/0238649 incorporada a la presente en su totalidad por referencia y a todos los efectos) .
Más particularmente, en modalidades preferidas (expuestas en la patente de EE. UU. N.° 2011/0256157 que se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) , los conectores compatibles comprenderán: donde el asterisco indica el punto de unión del agente citotóxico, CBA es el agente de unión celular/modulador, L1 es un conector, A es un grupo conector que conecta L1 con el agente de unión celular, L2 es un enlace covalente o junto con -OC(=0)- forma un conector autodestructivo, y L1 o L2 es un conector escindible.
L1 es preferentemente el conector escindible y se puede considerar el detonante de la activación del conector para su escisión.
La naturaleza de L1 y L2, cuando están presentes, puede variar mucho. Estos grupos se eligen dependiendo de sus características de escisión, que pueden venir dictadas por las condiciones en el sitio en el que se suministre el conjugado. Se prefieren aquellos conectores que son escindidos por acción de enzimas, aunque también se pueden utilizar conectores que pueden ser escindidos por cambios en el pH (p. ej . , lábiles en medio ácido o básico), la temperatura o por irradiación (p. ej . , fotolábiles) . Los conectores que se pueden escindir en condiciones reductoras u oxidantes también pueden ser útiles en la presente invención.
L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser el sustrato diana de la escisión enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
En una modalidad, L1 puede ser escindido por acción de una enzima. En una modalidad, la enzima es una esterasa o una peptidasa .
En una modalidad, L2 está presente y junto con -C(=0)0-forma un conector autodestructivo . En una modalidad, L2 es un sustrato de la actividad enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
En una modalidad, donde L1 puede ser escindido por acción de una enzima y L2 está presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.
L1 y L2, cuando están presentes, pueden estar conectados por un enlace seleccionado entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC(=0)0-, -OC(=0)NH- y -NHC(=0)NH-.
Un grupo amino de L1 que conecta con L2 puede ser el extremo N de un aminoácido o se puede derivar de un grupo amino de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido lisina.
Un grupo carboxilo de L1 que conecta con L2 puede ser el extremo C de un aminoácido o se puede derivar de un grupo carboxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido ácido glutámico.
Un grupo hidroxilo de L1 que conecta con L2 se puede derivar de un grupo hidroxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina .
La expresión "cadena lateral aminoacídica" incluye aquellos grupos que se encuentran en: (i) aminoácidos naturales tales como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina; (ii) aminoácidos poco comunes tales como ornitina y citrulina; (iii) aminoácidos no naturales, beta-aminoácidos, análogos sintéticos y derivados, beta-aminoácidos, análogos y de aminoácidos naturales sintéticos; y (iv) todos los enantiómeros , diastereómeros , formas protegidas, enriquecidas isoméricamente, marcadas isotópicamente (p. ej . , 2H, 3H, 14C, 15N) y mezclas racémicas de estos.
En una modalidad, -C(=0)0- y L2 forman juntos el grupo: donde el asterisco indica el punto de unión con la posición del fármaco o el agente citotóxico, la línea ondulada indicada el punto de unión con el conector L1, Y es -N (H) - , -0-, -C(=0)N(H)- o -C(=0)0-, y n es 0-3. El anillo fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en la presente. En una modalidad, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido con halo, N02, R u 0R.
En una modalidad, Y es NH.
En una modalidad, n es 0 o 1. Preferentemente, n es 0.
Cuando Y es NH y n es 0, el conector autodestructivo se puede denominar conector de tipo p-aminobencilcarbonilo (PABC) .
El conector autodestructivo permitirá liberar el compuesto protegido cuando se active un sitio distante, lo cual procederá de la forma que se muestra a continuación (para donde L* es la forma activada de la porción remanente del conector. Estos grupos presentan la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que está protegido. Tal como se ha descrito anteriormente, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido.
En una modalidad descrita en la presente, el grupo L* es un conector L1 como se ha descrito en la presente, que puede incluir un grupo dipeptídico.
En otra modalidad, -C(=0)0- y L2 forman juntos un grupo seleccionado entre: donde el asterisco, la línea ondulada, Y y n son como se han definido anteriormente. Cada anillo fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en la presente. En una modalidad, el anillo fenileno que tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido y el anillo fenileno que no tiene el sustituyente Y no está sustituido. En una modalidad, el anillo fenileno que tiene el sustituyente Y no está sustituido y el anillo fenileno que no tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido.
En otra modalidad, -C(=0)0- y L2 forman juntos un grupo seleccionado entre: donde el asterisco, la línea ondulada, Y y n son como se han definido anteriormente, E es 0, S o NR, D es N, CH o CR, y F es N, CH o CR.
En una modalidad, D es N.
En una modalidad, D es CH.
En una modalidad, E es O o S.
En una modalidad, F es CH.
En una modalidad preferida, el conector es un conector lábil a catepsina.
En una modalidad, L1 comprende un dipéptido. El dipéptido se puede representar como -NH-Xi-X2-CO- , donde - H- y -C0-representan los extremos N y C de los grupos aminoacídicos Xx y X2 respectivamente. Los aminoácidos del dipéptido pueden ser cualquier combinación de aminoácidos naturales. Donde el conector es un conector lábil a captepsina, el dipéptido puede ser el sitio de acción de la escisión mediada por catepsina .
Además, para aquellos grupos aminoacídicos que tengan una funcionalidad en la cadena lateral amino o carboxilo, por ejemplo, Glu y Lys respectivamente, CO y NH pueden representar esa funcionalidad en la cadena lateral.
En una modalidad, el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-C0-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg- y -Trp-Cit-, donde Cit es citrulina.
Preferentemente, el grupo -X!-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-CO-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys- y -Val-Cit-. Aún más preferentemente, el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-X1-X2-CO- , es -Phe-Lys- o -Val-Ala-.
Se pueden utilizar otras combinaciones dipeptídicas, incluidas las descritas por Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13.855-869, que se incorpora a la presente por referencia.
En una modalidad, la cadena lateral aminoacídica se derivatiza, cuando proceda. Por ejemplo, se puede derivatizar un grupo amino o un grupo carboxi de una cadena lateral aminoacídica .
En una modalidad, un grupo amino NH2 de un aminoácido de cadena lateral, tal como la lisina, es una forma derivatizada seleccionada entre el grupo constituido por NHR y NRR' .
En una modalidad, un grupo carboxi COOH de un aminoácido de cadena lateral, tal como el ácido aspártico, es una forma derivatizada seleccionada entre el grupo constituido por COOR, CONH2, CONHR y CONRR' .
En una modalidad, la cadena lateral aminoacídica está protegida químicamente, cuando proceda. El grupo protector de la cadena lateral puede ser un grupo como los que se indican a continuación en relación con el grupo RL. Las secuencias aminoacídicas protegidas pueden ser escindidas por enzimas. Por ejemplo, se ha establecido que una secuencia dipeptídica que comprende un residuo Lys, cuya cadena lateral está protegida con Boc, puede ser escindido por catepsina.
Los grupos protectores para las cadenas laterales de aminoácidos son muy conocidos en la técnica y se describen en el catálogo de Novabiochem. En Protective Groups in Organic Synthesis, Greene y Wuts, se describen estrategias de grupos protectores adicionales.
A continuación se muestran grupos protectores de cadenas laterales posibles para aquellos aminoácidos que tengan una funcionalidad en la cadena lateral reactiva: Arg: Z, Mtr, Tos; Asn: Trt, Xan; Asp : Bzl, t-Bu; Cys : Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt; Glu: Bzl, t-Bu; Gln: Trt, Xan; His : Boc , Dn , Tos , Trt ; Lys : Boc , Z-Cl, Fmoc, Z, Alloe; Ser : Bzl, TBDMS , TBDPS ; Thr : Bz; Trp : Boc ; Tyr : Bzl, Z, Z-Br.
En una modalidad, la protección de la cadena lateral se selecciona de modo que sea ortogonal respecto a un grupo proporcionado como grupo desactivante o que forme parte de este, cuando esté presente. Por lo tanto, la eliminación del grupo protector de la cadena lateral no elimina el grupo desactivante ni ninguna otra funcionalidad de grupo protector que forme parte del grupo desactivante.
En otras modalidades de la invención, los aminoácidos seleccionados son aquellos que no tienen ninguna funcionalidad reactiva en la cadena lateral. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden seleccionar entre: Ala, Gly, lie, Leu, 16 et, Phe, Pro y Val.
En una modalidad, el dipéptido se utiliza combinado con un conector autodestructi o. El conector autodestructivo puede estar conectado a -X2- · Cuando hay un conector autodestructivo presente, -X2-está conectado directamente al conector autodestructivo. Preferentemente, el grupo -X2-CO- está conectado a Y, donde Y es NH, para formar de este modo el grupo -X2-CO-NH- . -??-??- está conectado directamente a A. A puede comprender la funcionalidad -C0- para formar de este modo un enlace amídico con -Xi-.
En una modalidad, L1 y L2 junto con -0C(=0)- comprenden el grupo NH-Xi-X2-CO-PABC- . El grupo PABC está conectado directamente al agente citotóxico. Preferentemente, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC- , que se ilustra a continuación: donde el asterisco indica el punto de unión con el resto citotóxico seleccionado, y la línea ondulada indica el punto de unión con la porción remanente del conector L1 o el punto de unión con A. Preferentemente, la línea ondulada indica el punto de unión con A. La cadena lateral del aminoácido Lys puede estar protegida, por ejemplo, con Boc, Fmoc o Alloc, tal como se ha descrito anteriormente.
Como alternativa, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC- , que se ilustra a continuación: donde el asterisco y la línea ondulada son como se han definido anteriormente.
Como alternativa, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC- , que se ilustra a continuación: donde el asterisco y la línea ondulada son como se han definido anteriormente.
En algunas modalidades de la presente invención, puede que se prefiera que si el resto correspondiente al fármaco contiene un enlace imínico sin proteger, p. ej . , si el resto B está presente, entonces el conector no contenga un grupo amino libre (H2N-) . Por lo tanto, si el conector tiene la estructura -A-L1-^-, entonces esta preferentemente no contendrá un grupo amino libre. Esta preferencia es particularmente relevante cuando el conector contiene un dipéptido, por ejemplo, como L1; en esta modalidad, se preferiría que uno de los dos aminoácidos seleccionados no fuera lisina.
Sin que ello suponga ceñirse a ninguna teoría particular, la combinación de un enlace imínico sin proteger en el resto correspondiente al fármaco y el grupo amino libre en el conector puede provocar la dimerización del resto f rmaco-conector que puede interferir con la conjugación de el resto fármaco-conector con un anticuerpo. La reacción cruzada de estos grupos se puede ver acelerada en el caso en el que el grupo amino esté presente como un ión amonio (H3N+-), tal como cuando se utiliza un ácido fuerte (p. ej . , TFA) para desproteger el grupo amino libre.
En una modalidad, A es un enlace covalente. Así pues, L1 y el agente de unión celular están conectados directamente. Por ejemplo, cuando L1 comprende una secuencia de aminoácidos contigua, el extremo N de la secuencia puede estar directamente conectado al agente de unión celular.
Por lo tanto, cuando A sea un enlace covalente, la conexión entre el agente de unión celular y L1 se puede seleccionar entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC(=0)0-, -OC(=0)NH-, -NHC (=0) NH- , -C (=0) HC (=0) - , -S-, -S-S-, -CH2C(=0)- y =N-NH- .
Un grupo amino de L1 que conecta con el modulador de DLL3 puede ser el extremo N de un aminoácido o se puede derivar de un grupo amino de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido lisina.
Un grupo carboxilo de L1 que conecta con el modulador puede ser el extremo C de un aminoácido o se puede derivar de un grupo carboxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido ácido glutámico.
Un grupo hidroxilo de L1 que conecta con el agente de unión celular se puede derivar de un grupo hidroxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina.
Un grupo tiol de L1 que conecta con un agente modulador se puede derivar de un grupo tiol de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina .
Los comentarios anteriores referentes a los grupos amino, carboxilo, hidroxilo y tiol de L1 también se api al agente de unión celular.
En una modalidad, L2 junto con -0C(=0)- representa: donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, la línea ondulada indica el punto de unión con L1, n es 0-3, Y es un enlace covalente o un grupo funcional, y E es un grupo que se puede activar, por ejemplo, por acción de una enzima o con luz, para generar de este modo una unidad autodestructiva. El anillo fenileno además está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en la presente. En una modalidad, el grupo fenileno además está opcionalmente sustituido con halo, N02, R u OR. Preferentemente, n es 0 o 1, más preferentemente 0.
E se selecciona de modo que el grupo sea susceptible de activación, p. ej . , con luz o por acción de una enzima. E puede ser -N02 o ácido glucurónico. El primero puede ser sensible a la acción de una nitrorreductasa, el último a la acción de una ß-glucoronidasa.
En esta modalidad, el conector autodestructivo permitirá liberar el compuesto protegido cuando E se active, lo cual procederá de la forma que se muestra a continuación (para n=0) : donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, E* es la forma activada de E e Y es como se ha descrito anteriormente. Estos grupos presentan la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que se está protegiendo. Tal como se ha descrito anteriormente, el grupo fenileno además puede estar opcionalmente sustituido.
El grupo Y puede ser un enlace covalente con L1.
El grupo Y puede ser un grupo funcional seleccionado entre : -C(=0)-, -NH-, -0-, -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC (=0) O- , -0C(=0)NH-, -NHC(=0)NH-, -NHC(=0)NH, -C (=0)NHC (=0) - y -S-.
Cuando L1 es un dipéptido, se prefiere que Y sea -NH-o -C(=0)-, para formar de este modo un enlace amídico entre L1 e Y. En esta modalidad, la secuencia dipeptídica no necesita ser un sustrato para una actividad enzimática.
En otra modalidad, A es un grupo espaciador. Así pues, L1 y el agente de unión celular están conectados indi ectamente .
L1 y A pueden estar conectados por un enlace seleccionado entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, 0C(=0)0-, -NHC(=0)0-, -OC(=0)NH- y -NHC(=0)NH-.
Preferentemente, el conector contiene un grupo funcional electrófilo para que reaccione con un grupo funcional nucleófilo en el modulador. Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, sin carácter limitante: (i) grupos amino aminoterminales , (ii) grupos amino de cadena lateral, p. ej . , lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, p. ej . , cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares donde el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos conectores y reactivos conectores que incluyen: (i) grupos maleimida (ii) disulfuros activados, (iii) ésteres activos tales como ésteres NHS (N-hidroxisuccinimida) , ésteres HOBt (N-hidroxibenzotriazol ) , haloformiatos y haluros de acilo; (iv) haluros alquílicos y bencílicos tales como haloacetamidas; y (v) aldehidos, cetonas, carboxilo y algunos que se ejemplifican como se indica a continuación: Ciertos anticuerpos contienen disulfuros entre las cadenas que se pueden reducir, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden convertir en reactivos para conjugarlos con reactivos conectores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol ) . Cada puente de cisteína formará así, teóricamente, dos nucleófilos tiólicos reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en anticuerpos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) , lo cual provoca la conversión de una amina en un tiol. Se pueden introducir grupos tiol reactivos en el anticuerpo (o un fragmento de este) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (p. ej . , preparando anticuerpos mutantes que comprendan uno o más residuos aminoacídicos de cisteína no nativos) . US 7521541 describe la modificación genética de anticuerpos mediante la introducción de aminoácidos de cisteína reactivos.
En algunas modalidades, un conector tiene un grupo nucleófilo reactivo que reacciona con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, sin carácter limitante, grupos carbonilo de aldehidos y cetonas . El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un conector incluyen, sin carácter limitante, hidrazida, oxima, amino, hidroxilo, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión de un conector.
En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con la línea ondulada indica el punto de unión con el agente unión celular y n es 0-6. En una modalidad, n es 5.
En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular y n es 0-6. En una modalidad, n es 5.
En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, n es 0 o 1 y m es 0-30. En una modalidad preferida, n es 1 y m es 0-10, 1-8, preferentemente 4-8 y aún más preferentemente 4 u 8. En otra modalidad, m es 10-30 y preferentemente 20-30. Como alternativa, m es 0-50. En esta modalidad, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, n es 0 o 1 y m es 0-30. En una modalidad preferida, n es 1 y m es 0-10, 1-8, preferentemente 4-8 y aún más preferentemente 4 u 8. En otra modalidad, m es 10-30 y preferentemente 20-30. Como alternativa, m es 0-50. En esta modalidad, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
En una modalidad, la conexión entre el agente de unión celular y A es a través de un residuo tiólico del agente de unión celular y un grupo maleimida de A.
En una modalidad, la conexión entre el agente de unión celular y A es : donde el asterisco indica el punto de unión con la porción remanente de A y la línea ondulada indica el punto de unión con la porción remanente del agente de unión celular. En esta modalidad, el átomo S se deriva normalmente del modulador .
En cada una de las modalidades anteriores, se puede utilizar una funcionalidad alternativa en vez del grupo derivado de maleimida que se muestra a continuación: donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular como se ha indicado anteriormente y el asterisco indica el enlace con la porción remanente del grupo A.
En una modalidad, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con el grupo: donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular y el asterisco indica el enlace con la porción remanente del grupo A.
En una modalidad, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con un grupo, que opcionalmente junto con el agente de unión celular, se selecciona entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -OC(=0)O- -NHC(=0)0-, -OC(=0)NH-, -NHC(=0)NH-, -NHC(=0)NH, C(=0)NHC(=0) -, -S-, -S-S-, -CH2C(=0)-, -C(=0)CH2-, =N-NH- y -NH-N= .
En una modalidad, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con un grupo, que opcionalmente junto con el agente de unión celular, se selecciona entre: donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular o el enlace con la porción remanente del grupo A, y el asterisco indica el otro de entre el punto de unión con el agente de unión celular o el enlace con la porción remanente del grupo A.
Otros grupos adecuados para conectar L1 con el modulador seleccionado se describen en WO 2005/082023.
En una modalidad preferida, los moduladores de la presente invención se pueden asociar con polímeros biocompatibles que comprendan unidades de fármaco-conector . A este respecto, un polímero compatible de este tipo comprende polímeros Fleximer® (Mersana Therapeutics) . Estos polímeros son supuestamente biodegradables , se toleran bien y han sido validados clínicamente. Es más, tales polímeros son compatibles con numerosas tecnologías y técnicas químicas de conectores personalizables , lo cual permite controlar las propiedades farmacocinéticas , el lugar en el que se libere el fármaco y una mejor biodistribución.
Los moduladores seleccionados también pueden ser radioisótopos conjugados directamente o pueden comprender quelatos macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (como los que se han descrito en la presente) . En ciertas modalidades, el quelato macrocíclico es el ácido 1,4, 7, lO-tetraazaciclododecano-^N'/iV' ' ,?' ' -tetraacético (DOTA) que se puede unir al anticuerpo a través de una molécula conectora. Tales moléculas conectoras normalmente se conocen en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman et al., 1999, Nucí . Med. Biol . 26:943.
Más generalmente, las técnicas para conjugar restos terapéuticos o agentes citotóxicos con moduladores son muy conocidas. Como se ha indicado anteriormente, se pueden conjugar restos con moduladores mediante cualquier método reconocido en la técnica, incluidos, sin carácter limitante, enlace de aldehído/Schiff , enlace de sulfhidrilo, enlace lábil en medio ácido, enlace de cis-aconitilo, enlace de hidrazona, enlace degradable enzimáticamente (remítase, en general, a Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171). Remítase también, p. ej . , a Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2.a Ed. ) , Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119. En modalidades preferidas, un modulador de DLL3 que está conjugado con un resto terapéutico o agente citotóxico puede ser internalizado por una célula al unirse a una molécula de DLL3 asociada con la superficie celular y de este modo se libera la carga útil terapéutica.
C . Modificadores biocompatibles En modalidades seleccionadas, los moduladores de la invención se pueden conjugar o asociar de otro modo con modificadores biocompatibles que se pueden utilizar para ajustar, alterar, mejorar o moderar las características de los moduladores según se desee. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o constructos de fusión con semividas in vivo mayores mediante la adhesión de moléculas poliméricas de peso molecular relativamente alto tales como polietilenglicol (PEG) comercializado o polímeros biocompatibles similares. Los expertos en la técnica apreciarán que el PEG se puede obtener con muchos pesos moleculares y configuraciones moleculares diferentes que se pueden seleccionar para conferir propiedades específicas al anticuerpo (p. ej . , la semivida se puede adaptar a unas necesidades particulares) . El PEG se puede enlazar con moduladores, o fragmentos o derivados de anticuerpo con o sin un conector multifuncional , ya sea mediante la conjugación específica para el sitio del PEG con el extremo N o C de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o a través de grupos amino épsilon presentes en residuos de lisina. Se puede utilizar una derivatización con polímeros lineales o ramificados que produzca una pérdida de actividad biológica mínima. El grado de conjugación se puede monitorizar estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar que la conjugación entre las moléculas de PEG y la moléculas de anticuerpo sea óptima. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante, p. ej . , cromatografía de exclusión por tamaños o de intercambio iónico. De forma análoga, los moduladores descritos se pueden conjugar con albúmina para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o para que tenga una semivida más prolongada in vivo. Las técnicas son muy conocidas en la técnica, remítase, p. ej . , a las publicaciones internacionales N.os O 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la patente europea N.° 0.413.622. Otros conjugados biocompatibles serán evidentes para los expertos en la técnica y se podrán identificar fácilmente de acuerdo con los principios de la presente.
D . Agentes de diagnóstico y detección En otras modalidades preferidas, se pueden conjugar moduladores de la presente invención, o fragmentos o derivados de estos, con un agente, un marcador o indicador de diagnóstico o detectable que puede ser, por ejemplo, una molécula biológica (p. ej . , un péptido o nucleótido) , una molécula de bajo peso molecular, un fluoróforo o un radioisótopo. Los moduladores marcados pueden ser útiles para monitorizar el desarrollo o el avance de un trastorno hiperproliferativo o como parte de un procedimiento de un estudio clínico para determinar la eficacia de una terapia particular que incluya los moduladores descritos (es decir, el teragnóstico) o para determinar un curso de tratamiento futuro. Tales marcadores o indicadores también pueden ser útiles para purificar el modulador seleccionado, analizar el modulador (p. ej . , la unión al epítopo o la clasificación en secciones del anticuerpo) , separar o aislar TIC, o en procedimientos o estudios toxicológicos preclínicos.
El análisis de diagnóstico y/o detección se puede conseguir acoplando el modulador a sustancias detectables que incluyen, sin carácter limitante, diversas enzimas que comprenden, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos tales como, sin carácter limitante, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, sin carácter limitante, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes tales como, sin carácter limitante, luminol ; materiales bioluminiscentes tales como, sin carácter limitante, luciferasa, luciferina y aecuorina; materiales radioactivos tales como, sin carácter limitante, yodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (115In, 113In, 112In, llxIn, ) y tecnecio (99Tc) , talio (201Ti) , galio (68Ga, 67Ga) , paladio (103Pd) , molibdeno (99Mo) , xenón (133Xe) , flúor (18F) , 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 14 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Estaño; metales emisores de positrones utilizando diversas tomografias de emisión de positrones, iones metálicos paramagnéticos no radioactivos y moléculas que están radiomarcadas o conjugadas con radioisótopos específicos. En tales modalidades, la metodología de detección adecuada es muy conocida en la técnica y se puede acceder a ella fácilmente a través de numerosos proveedores comerciales.
Como se ha indicado anteriormente, en otras modalidades, los moduladores o fragmentos de estos se pueden fusionar o conjugar con secuencias o compuestos marcadores, tales como un péptido o fluoróforo, para facilitar su purificación o procedimientos de diagnóstico o analíticos tales como la inmunohistoquímica, interferometría de biocapa, resonancia de plasmones superficiales, citometría de flujo, ELISA competitivo, FACs, etc. En modalidades preferidas, el marcador comprende un marcador His tal como el proporcionado por el vector pQE (Qiagen) , entre otros, muchos de los cuales se comercializan. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, sin carácter limitante, el marcador hemaglutinínico "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza ( ilson et al., 1984, Cell 37:767) y el marcador "flag" (patente de EE . UU. N.° 4.703.004).
E . Restos terapéuticos Como se ha indicado previamente, los moduladores, o fragmentos o derivados de estos también se pueden conjugar, enlazar, fusionar o asociar de otro modo con un "resto terapéutico" o "fármaco" tal como un agente antiproliferativo o anticanceroso que incluye, sin carácter limitante, agentes citotóxicos, agentes citostáticos , agentes antiangiogénicos , agentes citorreductores , agentes quimioterapéuticos , radioterapia y agentes radioterapéuticos , agentes anticancerosos dirigidos, BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia de radiación, y agentes antimetastásicos y agentes inmunoterapéuticos .
Los agentes anticancerosos ilustrativos preferidos incluyen citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina , etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina , daunorrubicina, dihidroxiantracina , maitansinoides tales como DM-1 y DM-4 (Immunogen, Inc.), diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaina, propranolol, puromicina, epirrubicina y ciclofosfamida , y análogos y homólogos de estos. Las citotoxinas compatibles adicionales comprenden dolastatinas y auristatinas, incluidas monometilauristatina E (MMAE) y monometilauristatina F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitinas tales como alfa-amanitina, beta-amanitina , gamma-amanitina o épsilon-amanitina (Heidelberg Pharma AG) , agentes de unión al surco menor del ADN tales como derivados de duocarmicina (Syntarga, B.V.) y dímeros pirrolobenzodiazepínicos modificados (Spirogen, Ltd.), inhibidores del corte y empalme tales como análogos o derivados de meayamicina (p. ej . , FR901464 tal como se expone en la patente de EE . UU. N.° 7.825.267), agentes de unión tubulares tales como los análogos de epotilona y paclitaxel, y agentes que dañan el ADN tales como calicheamicinas y esperamicinas . Además, en ciertas modalidades, los moduladores de DLL3 de la presente invención se pueden asociar con moléculas de unión a anti-CD3 para reclutar linfocitos T citotóxicos y hacer que ataquen las células iniciadoras de tumores (tecnología BiTE; remítase, p. ej . , a Fuhrmann, S. et. al., Congreso anual de la AACR, Resumen N.° 5625 (2010) que se incorpora a la presente por referencia) .
Otros agentes anticancerosos compatibles adicionales incluyen, sin carácter limitante, antimetabolitos (p. ej . , metotrexato, 6 -mercaptopurina , 6-tioguanina, citarabina, 5 - fluorouracildecarbazina) , agentes alquilantes (p. ej . , mecloretamina , tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU) , busulfán, dibromomanitol , estreptozotocina y cisdiclorodiaminoplatino (II) (DDP, cisplatino) , antraciclinas (p. ej . , daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (p. ej . , dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina y antramicina (AMC) ) y agentes antimitóticos (p. ej . , vincristina y vinblastina) . Se puede encontrar una lista más exhaustiva de restos terapéuticos en la publicación de PCT WO 03/075957 y la patente de EE . UU. N.° 2009/0155255, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia.
Como se ha indicado anteriormente, ciertas modalidades seleccionadas de la presente invención se refieren a moduladores de DLL3 conjugados tales como conjugados de anticuerpo anti -DLL3 - fármaco que comprenden pirrolobenzodiazepina (PBD) como agente citotóxico. Se apreciará que las PBD son agentes alquilantes que ejercen actividad antitumoral al unirse covalentemente al ADN en el surco menor e inhibir la síntesis de ácido nucleico. A este respecto, se ha demostrado que las PBD poseen propiedades antitumorales potentes a la vez que exhiben una mielodepresión mínima. Las PBD compatibles con la presente invención se pueden unir al modulador de DLL3 utilizando cualquiera de los diversos tipos de conector (p. ej . , un conector peptidílico que comprende un resto maleimido con un sulfhidrilo libre) y, en ciertas modalidades, están en forma dimérica (es decir, dímeros de PBD) . Algunas PBD compatibles (y conectores opcionales) que se pueden conjugar con los moduladores expuestos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N.os 6.362.331, 7.049.311, 7.189.710, 7.429.658, 7.407.951, 7.741.319, 7.557.099, 8.034.808, 8.163.736, la patente de EE . UU. N.° 2011/0256157, y las solicitudes de PCT O2011/130613 , WO2011/128650 y WO2011/130616 , cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia. Por consiguiente, en modalidades particularmente preferidas, el modulador comprenderá un anticuerpo anti-DLL3 conjugado o asociado con uno o más dímeros de PBD (es decir, un ADC de DLL3-PBD) .
En modalidades particularmente preferidas, las PBD compatibles que se pueden conjugar con los moduladores descritos se describen en la patente de EE. UU. N.° 2011/0256157. En esta exposición, puede que se prefieran los dímeros de PBD, es decir, aquellos que comprenden dos restos de PBD. Por lo tanto, los conjugados preferidos de la presente invención son aquellos de fórmula (AB) o (AC) : donde : las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o entre C2 y C3 ,- R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y además se selecciona opcionalmente entre halo o dihalo; donde RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02 , Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, e3Sn y halo; R10 es un conector que está conectado a un modulador, o fragmento o derivado de este, tal como se ha descrito anteriormente; Q se selecciona independientemente entre O, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es 0, S03M, donde M es un catión metálico; R y R' se seleccionan cada uno independientemente entre grupos alquilo Ci-i2, heterociclilo C3-20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y, opcionalmente en lo que respecta al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están enlazados forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; y donde R2" , R6" , R7" , R9", X", Q" y R11" son como se han definido de acuerdo con R2, R6 , R7, R9, X, Q y R11 respectivamente, y Rc es un grupo desactivante.
Doble enlace En una modalidad, no hay ningún doble enlace presente entre Cl y C2, ni entre C2 y C3.
En una modalidad, las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre C2 y C3 , como se muestra a continuación: En una modalidad, hay un doble enlace presente entre C2 y C3 cuando R2 es arilo C5-2o o alquilo Ci-i2.
En una modalidad, las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 , como se muestra a continuación: En una modalidad, hay un doble enlace presente entre Cl y C2 cuando R2 es arilo C5-2o o alquilo Ci-i2.
R^ En una modalidad, R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y además se selecciona opcionalmente entre halo o dihalo.
En una modalidad, R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR.
En una modalidad, R2 se selecciona independientemente entre H, =0, =CH2, R, =CH-RD y =C(RD)2.
En una modalidad, R2 es independientemente H.
En una modalidad, R2 es independientemente =0.
En una modalidad, R2 es independientemente =CH2.
En una modalidad, R2 es independientemente =CH-RD. Dentro del compuesto PBD, el grupo =CH-RD puede tener cualquiera de las configuraciones que se muestran a continuación: O) (II) En una modalidad, la configuración es 1 configuración (I) .
En una modalidad, R2 es independientemente =C(RD)2- En una modalidad, R2 es independientemente =CF2.
En una modalidad, R2 es independientemente R.
En una modalidad, R2 es independientemente arilo C5- opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente alquilo Ci-opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente arilo C5- opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente arilo C5 opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente arilo C8- opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente fenil opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente naftil opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente piridilo opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 es independientemente quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R2 tiene de uno a tres grupos sustituyentes, con más preferencia por 1 y 2, y siendo los grupos con una única sustitución los más preferidos. Los sustituyentes pueden estar en cualquier posición.
Cuando R2 es un grupo arilo C5-7, un único sustituyente está preferentemente en un átomo anular que no es adyacente al enlace con la parte remanente del compuesto, es decir, está preferentemente en ß o ? respecto al enlace con la parte remanente del compuesto. Por lo tanto, cuando el grupo arilo C5-7 es fenilo, el sustituyente está preferentemente en las posiciones meta o para y más preferentemente está en la posición para.
En una modalidad, R2 se selecciona entre: donde el asterisco indica el punto de unión.
Cuando R2 es un grupo arilo C8-io/ por ejemplo, quinolinilo o isoquinolinilo, puede tener cualquier número de sustituyentes en cualquier posición de los anillos quinolínicos o isoquinolínicos . En algunas modalidades, tiene uno, dos o tres sus ituyentes, y estos pueden estar en el anillo próximo o distante o en ambos (si hay más de un sustituyente) .
En una modalidad, cuando R2 está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan entre los sustituyentes que se mencionan más adelante en la sección de los sustituyentes.
Cuando R está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan preferentemente entre: Halo, Hidroxilo, Éter, Formilo, Acilo, Carboxi, Ester, Aciloxi, Amino, Amido, Acilamido, Aminocarboniloxi , Ureido, Nitro, Ciano y Tioéter.
En una modalidad, cuando R o R2 está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan entre el grupo constituido por R, OR, SR, NRR' , N02, halo, C02R, COR, C0NH2, CONHR y CONRR' .
Cuando R2 es alquilo Ci-12, el sustituyente opcional puede incluir además grupos heterociclilo C3-2o y arilo C5-20.
Cuando R2 es heterociclilo C3_2o, el sustituyente opcional puede incluir además grupos alquilo i-12 y arilo C5-20.
Cuando R2 es un grupo arilo C5_2o el sustituyente opcional puede incluir además grupos heterociclilo C3-20 y alquilo ^_?2.
Se sobreentiende que el término "alquilo" abarca las subclases alquenilo y alquinilo así como también cicloalquilo. Por lo tanto, cuando R2 es alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, se sobreentiende que el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono que pueden formar parte de un sistema conjugado. En una modalidad, el grupo alquilo C1-12 opcionalmente sustituido contiene al menos un doble o triple enlace carbono-carbono, y este enlace está conjugado con un doble enlace presente entre Cl y C2 o entre C2 y C3. En una modalidad, el grupo alquilo Ci_12 es un grupo seleccionado entre alquilo Ci-i2, alquenilo C2-i2, alquinilo C2-i2 y cicloalquilo C3-i2 saturados.
Si un sustituyente de R2 es halo, es preferentemente F o Cl, más preferentemente Cl .
Si un sustituyente de R2 es éter, en algunas modalidades puede ser un grupo alcoxi, por ejemplo, un grupo alcoxi C1-7 (p. ej . , metoxi, etoxi) o, en algunas modalidades, puede ser un grupo ariloxi C5-7 (p. ej . , fenoxi, piridiloxi, furaniloxi) .
Si un sustituyente de R2 es alquilo Ci-7, puede ser preferentemente un grupo alquilo Ci-4 (p. ej . , metilo, etilo, propilo, butilo) .
Si un sustituyente de R2 es heterociclilo C3-7, en algunas modalidades puede ser un grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno, p. ej . , morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo . Estos grupos pueden estar enlazados a la parte remanente del resto de PBD a través del átomo de nitrógeno. Estos grupos además pueden estar sustituidos, por ejemplo, con grupos alquilo Ci_4.
Si un sustituyente de R2 es bis (oxialquileno C1-3) , este es preferentemente bis (oximetileno) o bis (oxietileno) .
Los sustituyentes particularmente preferidos para R2 incluyen metoxi, etcxi, fluoro, cloro, ciano, bis (oximetileno) , metilpiperazinilo, morfolino y metiltienilo.
Los grupos R2 sustituidos particularmente preferidos incluyen, sin carácter limitante, 4 -metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 4-etoxifenilo, 3-etoxifenilo, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 3 , 4 -bis (oximetilen) fenilo, 4-metiltienilo, 4-cianofenilo, 4 -fenoxifenilo, quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo, isoquinolin-3 - ilo e isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinaftilo y naftilo.
En una modalidad, R2 es halo o dihalo. En una modalidad, R2 es -F o -F2, tales sustituyentes se ilustran a continuación como (III) y (IV) respectivamente: (III) (IV) En una modalidad, RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo.
En una modalidad, RD es independientemente R.
En una modalidad, RD es independientemente halo.
En una modalidad, R6 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn- y Halo.
En una modalidad, R6 se selecciona independientemente entre H, OH, OR, SH, NH2, N02 y Halo.
En una modalidad, R6 se selecciona independientemente entre H y Halo.
En una modalidad, R6 es independientemente H.
En una modalidad, R6 y R7 forman juntos un grupo -0-(CH2)p-0-, donde p es 1 o 2.
R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02 , Me3Sn y halo.
En una modalidad, R7 es independientemente OR.
En una modalidad, R7 es independientemente 0R7A, donde R7A es independientemente alquilo Ci-6 opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R7A es independientemente alquilo Ci_6 saturado opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R7A es independientemente alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R7A es independientemente Me.
En una modalidad, R es independientemente CH2Ph.
En una modalidad, R7A es independientemente alilo.
En una modalidad, el compuesto es un dímero donde los grupos R7 de cada monómero forman juntos un puente dimérico de fórmula X-R"-X que conecta los monóme os .
En una modalidad, el compuesto es un dímero donde los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico de fórmula X-R"-X que conecta los monómeros.
En una modalidad, R8 es independientemente 0R8A, donde R8A es independientemente alquilo Ci-4 opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R8A es independientemente alquilo Ci-6 saturado opcionalmente sustituido o alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R8A es independientemente Me.
En una modalidad, R8A es independientemente CH2Ph.
En una modalidad, R8A es independientemente alilo.
En una modalidad, R8 y R7 forman juntos un grupo -0-(CH2)p-0-, donde p es 1 o 2.
En una modalidad, R8 y R9 forman juntos un grupo -0- (CH2)p-0-, donde p es 1 o 2.
En una modalidad, R9 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2 , NHR, NRR' , N02 , Me3Sn- y Halo.
En una modalidad, R9 es independientemente H.
En una modalidad, R9 es independientemente R u OR.
R y R' En una modalidad, R se selecciona independientemente entre grupos alquilo C1-12, heterociclilo C3-2o y arilo C5-2o opcionalmente sustituidos. Estos grupos se definen cada uno más adelante en la sección de los sustituyentes .
En una modalidad, R es independientemente alquilo C1-12 opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R es independientemente heterociclilo C3-20 opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R es independientemente arilo C5-2o opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R es independientemente alquilo C -12 opcionalmente sustituido.
Anteriormente en relación con R2 se han descrito diversas modalidades referentes a grupos alquilo y arilo preferidos, y la identidad y el número de sustituyentes opcionales. Las preferencias indicadas para R2 al aplicarse a R son aplicables, cuando proceda, a todos los demás grupos R, por ejemplo, cuando R6, R7, R8 o R9 es R.
Las preferencias para R también se aplican a R' .
En algunas modalidades de la invención, se proporciona un compuesto que tiene el grupo sustituyente -NRR' . En una modalidad, R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están enlazados forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido. El anillo puede contener otro heteroátomo, por ejemplo, N, 0 o S.
En una modalidad, el propio anillo heterocíclico está sustituido con un grupo R. Cuando hay otro heteroátomo N presente, el sustituyente puede estar en el heteroátomo N.
R" R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos , p. ej . , 0, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, p. ej . , benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.
En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, p. ej . , benceno o piridina.
En una modalidad, el grupo alquileno está interrumpido opcionalmente por uno o más heteroátomos seleccionados entre O, S y NMe y/o anillos aromáticos, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.
En una modalidad, el anillo aromático es un grupo arileno C5-2o/ donde el arileno se refiere a un resto divalente obtenido al eliminar dos átomos de hidrógeno de dos átomos anulares aromáticos de un compuesto aromático, donde el resto contiene de 5 a 20 átomos anulares.
En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3.12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, p. ej . , O, S, N(H) , NMe y/o anillos aromáticos, p. ej . , benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos con NH2.
En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3-i2.
En una modalidad, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3, C5, C7, C9 y Cu.
En una modalidad, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3, C5 y C7.
En una modalidad, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3 y C5.
En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3.
En una modalidad, R" es un grupo alquileno C5.
Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, p. ej . , benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.
Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, p. ej . , benceno o piridina.
Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden ser grupos alquileno alifáticos lineales no sustituidos.
X En una modalidad, X se selecciona entre 0, S o N(H) .
Preferentemente, X es 0.
R10 Preferentemente, los conectores compatibles tales como los que se han descrito anteriormente unen un modulador DLL3 (CBA/Ab/M) con un resto D correspondiente a un fármaco PBD a través de uno o más enlaces covalentes en la posición de R10 (es decir, N10) . El conector puede ser un resto bifuncional o multifuncional que se puede utilizar para unir uno o más restos correspondientes a un fármaco (D) y un modulador (preferentemente un anticuerpo) para formar conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) . El conector (L) puede ser estable fuera de una célula, es decir, extracelular, o puede ser escindido por acción de una enzima, hidrólisis u otras condiciones metabólicas. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) se pueden preparar convenientemente utilizando un conector que tenga una funcionalidad reactiva para unir el resto correspondiente al fármaco con el anticuerpo. Un tiol de una cisteína o una amina, p. ej . , extremo N o una cadena lateral de un aminoácido tal como lisina, del anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional de un conector o reactivo espaciador, el resto (D) correspondiente al fármaco PBD o fármaco-reactivo conector (D-L) .
Muchos grupos funcionales del conector enlazado en la posición N10 del resto de PBD pueden ser útiles para la reacción con el agente de unión celular. Por ejemplo, se pueden formar enlaces de tipo éster, tioéster, amida, tioamida, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, éter, tioéter o disulfuro por reacción de los intermedios de conector- fármaco PBD y el agente de unión celular.
En otra modalidad, el conector puede estar sustituido con grupos que modulen la agregación, solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente sulfonato puede incrementar la hidrosolubilidad del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo conector con el anticuerpo o el resto correspondiente al fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L con D o D-L con Ab, dependiendo de la ruta sintética empleada para preparar el ADC.
En una modalidad preferida, R10 es un grupo: donde el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, CBA es el agente de unión celular/modulador, L1 es un conector, A es un grupo conector que conecta L1 con el agente de unión celular, L2 es un enlace covalente o junto con -0C(=0)- forma un conector autodestructivo, y L1 o L2 es un conector escindible.
L1 es preferentemente el conector escindible y se puede considerar el detonante de la activación del conector para su escisión.
Como se ha indicado anteriormente en la sección de los conectores, la naturaleza de L1 y L2, cuando están presentes, puede variar mucho. Estos grupos se eligen dependiendo de sus características de escisión, que pueden venir dictadas por las condiciones en el sitio en el que se suministre el conjugado. Se prefieren aquellos conectores que son escindidos por acción de enzimas, aunque también se pueden utilizar conectores que pueden ser escindidos por cambios en el pH (p. ej . , lábiles en medio ácido o básico), la temperatura o por irradiación (p. ej . , fotolábiles) . Los conectores que se pueden escindir en condiciones reductoras u oxidantes también pueden ser útiles en la presente invención.
L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser el sustrato diana de la escisión enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
En una modalidad, L1 puede ser escindido por acción de una enzima. En una modalidad, la enzima es una esterasa o una peptidasa .
En una modalidad, L2 está presente y junto con -C(=0)O-forma un conector autodestructivo . En una modalidad, L2 es un sustrato de la actividad enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
En una modalidad, donde L1 puede ser escindido por acción de una enzima y L2 está presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.
En lo que respecta al enlace del conector elegido a una PBD seleccionada, el grupo Rc se puede eliminar de la posición N10 de ciertos restos de PBD para obtener un enlace imínico N10-C11, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, cuando QR11 es 0S03M, un aducto de bisulfito, una tiocarbinolamina, una tiocarbinolamina sustituida o una carbinalamina sustituida.
En una modalidad, Rc puede ser un grupo protector que se puede eliminar para obtener un enlace imínico N10-C11, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida o, cuando QR11 es OSO3M, un aducto de bisulfito. En una modalidad, Rc es un grupo protector que se puede eliminar para obtener un enlace imínico N10-C11.
Se pretende que el grupo Rc se pueda eliminar en las mismas condiciones que las requeridas para eliminar el grupo R10, por ejemplo, para obtener un enlace imínico N10-C11, una carbinolamina, etc. El grupo desactivante actúa como grupo protector para la funcionalidad deseada en la posición N10. Se pretende que el grupo desactivante no sea reactivo respecto a un agente de unión celular. Por ejemplo, Rc no es el mismo que RL.
Los compuestos que tienen un grupo desactivante se pueden utilizar como intermedios en la síntesis de dímeros que tengan un monómero imínico. Como alternativa, los compuestos que tienen un grupo desactivante se pueden utilizar como conjugados, donde el grupo desactivante se elimina en la posición diana para obtener una imina, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, etc. Por lo tanto, en esta modalidad, el grupo desactivante se puede denominar grupo protector de nitrógeno que se puede eliminar terapéuticamente, tal como se define en WO 00/12507.
En una modalidad, el grupo Rc se puede eliminar en las condiciones que escinden el conector RL del grupo R10. Así pues, en una modalidad, el grupo desactivante puede ser escindido por acción de una enzima.
En una modalidad alternativa, el grupo desactivante se puede eliminar antes de conectar el conector RL con el modulador. En esta modalidad, el grupo desactivante se puede eliminar en condiciones que no escinden el conector RL.
Cuando un compuesto incluye un grupo funcional G1 para formar una conexión con el agente de unión celular, el grupo desactivante se puede eliminar antes de añadir o desenmascarar G1.
El grupo desactivante se puede utilizar como parte de una estrategia de protección de grupos para garantizar que solamente una de las unidades monoméricas de un dímero se conecte a un agente de unión celular.
El grupo desactivante se puede utilizar como enmascarante para un enlace imínico N10-C11. El grupo desactivante se puede eliminar en el momento en el que se necesite la funcionalidad imina en el compuesto. El grupo desactivante también es un enmascarante para una carbinolamina, una carbinolamina sustituida y un aducto de bisulfito, tal como se ha descrito anteriormente.
En una modalidad, Rc es un grupo protector de tipo carbamato .
En una modalidad, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona entre: Alloe, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ .
Opcionalmente, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona además entre Moc .
En una modalidad, Rc es un grupo conector RL que carece del grupo funcional para la conexión con el agente de unión celular .
Esta solicitud se refiere en particular a los grupos Rc que son carbamatos .
En una modalidad, Rc es un grupo: donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, G2 es un grupo terminal, L3 es un enlace covalente o un conector escindible L1, L2 es un enlace covalente o junto con 0C(=0) forma un conector autodestructivo .
Cuando L3 y L2 son ambos enlaces covalentes, G2 y OC(=0) forman juntos un grupo protector de tipo carbamato como el que se ha definido anteriormente.
L1 es como se ha definido anteriormente en relación con R10.
L2 es como se ha definido anteriormente en relación con R10.
A continuación se describen varios grupos terminales, incluidos aquellos basados en grupos protectores conocidos.
En una modalidad, L3 es un conector escindible L1, y L2 junto con OC(=0) forma un conector autodestructivo . En esta modalidad, G2 es Ac (acetilo) o Moc, o un grupo protector de tipo carbamato seleccionado entre: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ. Opcionalmente, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona además entre Moc.
En otra modalidad, G2 es un grupo acilo -C(=0)G3, donde G3 se selecciona entre alquilo (incluidos cicloalquilo, alquenilo y alquinilo) , heteroalquilo, heterociclilo y arilo (incluidos heteroarilo y carboarilo) . Estos grupos pueden estar opcionalmente sustituidos. El grupo acilo junto con un grupo amino de L3 o L2, cuando proceda, puede formar un enlace amídico. El grupo acilo junto con un grupo hidroxi de L3 o L2, cuando proceda, puede formar un enlace de tipo éster.
En una modalidad, G3 es heteroalquilo. El grupo heteroalquilo puede comprender polietilenglicol . El grupo heteroalquilo puede tener un heteroátomo, tal como 0 o N, adyacente al grupo acilo, para formar así un grupo carbamato o carbonato, cuando proceda, con un heteroátomo presente en el grupo L3 o L2, cuando proceda.
En una modalidad, G3 se selecciona entre NH2, NHR y NRR' . Preferentemente, G3 es NRR' .
En una modalidad, G2 es el grupo: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, n es 0-6, y G4 se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' , NH2, NHR, NRR', N02 y halo. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una modalidad, n es 1-6 y preferentemente n es 5. En una modalidad, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR' . En una modalidad, G4 es OR, SR y NRR'. Preferentemente, G4 se selecciona entre OR y NRR', aún más preferentemente, G4 es OR. Aún más preferentemente, G4 es OMe .
En una modalidad, el grupo G2 es: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, y n y G4 son como se han definido anteriormente.
En una modalidad, el grupo G2 es: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, n es 0 o 1, m es 0-50, y G4 se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2í CONHR, CONRR' , NH2, NHR, NRR' , N02 y halo. En una modalidad preferida, n es 1 y m es 0-10, 1-2, preferentemente 4-8 y aún más preferentemente 4 u 8. En otra modalidad, n es 1, m es 10-50 y preferentemente 20-40. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una modalidad, G4 es OR, SR, COOR, CONH2 CONHR, CONRR' y NRR' . En una modalidad, G4 es OR, SR y NRR' . Preferentemente, G4 se selecciona entre OR y NRR' , aún más preferentemente, G4 es OR. Preferentemente, G4 es OMe .
En una modalidad, el grupo G2 es: donde el asterisco indica el punto de unión con L , y n, m y G4 son como se han definido anteriormente.
En una modalidad, el grupo G2 es: donde n es 1-20, m es 0-6, y G4 se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' , NH2 , NHR, NRR' , N02 y halo. En una modalidad, n es 1-10. En otra modalidad, n es 10-50 y preferentemente 20-40. En una modalidad, n es 1. En una modalidad, m es 1. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una modalidad, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR' . En una modalidad, G4 es OR, SR y NRR' . Preferentemente, G4 se selecciona entre OR y NRR' , aún más preferentemente, G4 es OR. Preferentemente, G4 es O e.
En una modalidad, el grupo G2 es: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, y n, m y G4 son como se han definido anteriormente.
En cada una de las modalidades anteriores, G4 puede ser OH, SH, NH2 y NHR. Estos grupos protectores están preferentemente protegidos .
En una modalidad, OH está protegido con Bzl, TBDMS o TBDPS .
En una modalidad, SH está protegido con Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl -Me o Trt .
En una modalidad, NH2 o NHR están protegidos con Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z o Alloc.
En una modalidad, el grupo G2 está presente combinado con un grupo L3, donde el grupo es un dipéptido.
El grupo desactivante no está destinado a la conexión con el modulador. Por lo tanto, el otro monómero presente en el dímero actúa como punto de conexión con el modulador a través de un conector. Por consiguiente, se prefiere que la funcionalidad presente en el grupo desactivante no esté disponible para reaccionar con un modulador. Por tanto, preferentemente se evitan grupos funcionales reactivos tales como OH, SH, NH2, COOH. Sin embargo, la funcionalidad puede estar presente en el grupo desactivante si está protegida, como se ha descrito anteriormente.
Así pues, de acuerdo con los principios de la presente, una modalidad de la presente invención comprende un conjugado que comprende un compuesto : donde CBA es un agente de unión celular/modulador y n es 0 o 1. L1 es como se ha definido previamente, y RE y RE" se seleccionan cada uno independientemente entre H o RD.
En otra modalidad, el conjugado comprende un compuesto: donde CBA es un agente de unión celular /modulador, L1 es como se ha definido previamente, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo (¾-20 opcionalmente sustituido, y n es 0 o 1.
Los expertos en la técnica apreciarán que otros di me ros de PBD simétricos y asimétricos y conectores son compatibles con la presente invención, y estos se podrían seleccionar sin necesidad de demasiada experimentación sobre la base de los principios de la presente y la técnica anterior.
Otro aspecto de la invención incluye ADC que comprenden radioisótopos. Los radioisótopos ilustrativos que pueden ser compatibles con tales modalidades incluyen, sin carácter limitante, yodo (131I, 1251 , 123I, 121I, ) , carbono (14C) , cobre (62Cu, 64Cu, 67Cu) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (115In, 113In, 112In, 11:1ln, ) , bismuto (212Bi, 213Bi) , tecnecio (99Tc) , talio (201Ti) , galio (68Ga, 67Ga) , paladio (103Pd) , molibdeno (99Mo) , xenón (133Xe) , flúor (18F) , 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186 e, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 117Sn, 225Ac, 76Br y 211At. También se dispone de otros radionucleidos como agentes terapéuticos y de diagnóstico, especialmente aquellos comprendidos en el rango de energía de 60 a 4000 keV. Dependiendo de la afección que se deba tratar y el perfil terapéutico deseado, los expertos en la técnica podrán seleccionar fácilmente el radioisótopo adecuado para utilizar con los moduladores descritos .
Los moduladores de DLL3 de la presente invención también se pueden conjugar con un resto terapéutico o fármaco que modifique una respuesta biológica dada (p. ej . , modificadores de la respuesta biológica o BRM) . Es decir, no se debe interpretar que los agentes o restos terapéuticos compatibles con la presente invención se limiten a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, en modalidades particularmente preferidas, el resto correspondiente al fármaco puede ser una proteína o polipéptido o fragmento de estos que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, Onconasa (u otra RNasa citotóxica) , exotoxina de Pseudomonas, toxina colérica o toxina diftérica; una proteína tal como el factor de la necrosis tumoral, o¡-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, p. ej . , TNF-OÍ, TNF-ß, AIM I (remítase a la publicación internacional N.° WO 97/33899) , AIM II (remítase a la publicación internacional N.° WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567) y VEGI (remítase a la publicación internacional N.° WO 99/23105) , un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej . , angiostatina o endostatina; o, un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (p. ej . , interleucina-1 ("IL-l" ), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), y factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF")), o un factor de crecimiento (p. ej . , hormona del crecimiento ("GH")). Como se expone anteriormente, en la técnica se conocen métodos para fusionar o conjugar moduladores con restos polipeptídicos . Además de las referencias al contenido descritas anteriormente remítase, p. ej . , a las patentes de EE. UU. N.os 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851 y 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; las publicaciones de PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al., 1995, J" Immunol 154:5590; y Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia. Es más, como se ha expuesto anteriormente, la asociación de un modulador con tales restos no necesita ser necesariamente directa, sino que puede tener lugar a través de secuencias conectoras . Como se ha indicado anteriormente, tales moléculas conectoras normalmente se conocen en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucí Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171, cada uno de los cuales se incorpora a la presente.
IX . Diagnósticos y cribado A. Diagnósticos En otras modalidades más, la invención proporciona métodos in vitro o in vivo para detectar, diagnosticar o monitorizar trastornos proliferativos y métodos para cribar células de un paciente con el fin de identificar células tumorigénicas , incluidas CSC. Tales métodos incluyen la identificación de un individuo que padece cáncer para tratar o monitorizar el avance de un cáncer que comprende poner en contacto el paciente o una muestra obtenida a partir del paciente (es decir, ya sea in vivo o in vitro) con un modulador como los descritos en la presente y detectar la presencia o ausencia, o el nivel de asociación del modulador respecto a moléculas diana ligadas o libres en la muestra. En modalidades particularmente preferidas, el modulador comprenderá un marcador detectable o molécula indicadora como los descritos en la presente.
En algunas modalidades, la asociación del modulador, tal como un anticuerpo, con células particulares en la muestra denota probablemente que la muestra puede contener CSC, lo cual indica que el individuo que padece cáncer puede tratarse de forma eficaz con un modulador como los que se describen en la presente . Los métodos comprenden además un paso de comparación del nivel de unión con un control . Por el contrario, cuando el modulador sea un constructo de Fe, las propiedades de unión se pueden aprovechar y monitorizar (directa o indirectamente, i vivo o in vitro) cuando esté en contacto con la muestra para proporcionar la información deseada .
Los métodos de ensayo compatibles ilustrativos incluyen radioinmunoensayos , enzimoinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, inmunoensayo de fluorescencia, ensayos de inmunotransferencia, análisis por inmunotransferencia de Western, ensayos por citometría de flujo y ensayos ELISA. Los diagnósticos o teragnósticos in vivo compatibles pueden comprender técnicas de tomografía o monitorización reconocidas en la materia tales como tomografía por resonancia magnética, tomografía computarizada (p. ej . , escaneo CAT) , tomografía de positrones (p. ej . , escaneo PET) radiografía, ultrasonidos, etc., como sabrán los expertos en la técnica.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para analizar el avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo. En otra modalidad, el análisis del avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo comprende determinar el alcance del avance del tumor. En otra modalidad, el análisis comprende identificar el tumor. En otra modalidad, el análisis del avance del tumor se lleva a cabo en el tumor primario. En otra modalidad, el análisis se lleva a cabo durante un periodo dependiendo del tipo de cáncer como sabrá un experto en la técnica. En otra modalidad, se realiza otro análisis in vivo de los tumores secundarios que se originan a partir de células metastásicas del tumor primario. En otra modalidad, se analizan el tamaño y la forma de los tumores secundarios. En algunas modalidades, se realiza otro análisis ex vivo.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para analizar el avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo que incluye la determinación de la metástasis celular o la detección y cuantificación del nivel de células tumorales circulantes. En otra modalidad, el análisis de la metástasis celular comprende la determinación del crecimiento progresivo de células en un sitio que es discontinuo respecto al tumor primario. En otra modalidad, el sitio de análisis de la metástasis celular comprende la ruta de la dispersión neoplásica. En alguna modalidad, las células se pueden dispersar a través de la vasculatura sanguínea, ganglios linfáticos, dentro de las cavidades corporales o combinaciones de estos. En otra modalidad, el análisis de la metástasis celular se lleva a cabo en vista de la migración, diseminación, extravasación, proliferación celular o combinaciones de estas.
Por consiguiente, en una modalidad particularmente preferida, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para detectar y cuantificar los niveles de DLL3 en una muestra de un paciente (p. ej . , plasma o sangre), que, a su vez, se puede utilizar para detectar, diagnosticar o monitorizar trastornos asociados con DLL3 incluidos trastornos proliferativos . En modalidades relacionadas, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para detectar, monitorizar y/o cuantificar células tumorales circulantes in vivo o in vitro (remítase, por ejemplo, a WO 2012/0128801 que se incorpora a la presente por referencia). En otras modalidades preferidas adicionales, las células tumorales circulantes pueden comprender células madre cancerosas .
En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas en un sujeto o una muestra de un sujeto se pueden evaluar o caracterizar utilizando los moduladores descritos antes de la terapia o régimen para establecer un punto de referencia. En otros ejemplos, la muestra se deriva de un sujeto que ha sido tratado. En algunos ejemplos, la muestra se extrae del sujeto al menos aproximadamente 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90 días, 6 meses, 9 meses, 12 meses o > 12 meses después de que el sujeto comience o finalice el tratamiento. En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas se evalúan o caracterizan después de un número determinado de dosis (p. ej . , después de 2, 5, 10, 20, 30 o más dosis de una terapia) . En otros ejemplos, las células tumorigénicas se caracterizan o evalúan después de 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o un periodo más prolongado después de haber recibido una o más terapias.
En otro aspecto y tal como se indica más detalladamente más adelante, la presente invención proporciona kits para detectar, monitorizar o diagnosticar un trastorno hiperproliferativo, identificar un individuo que padezca un trastorno de este tipo para su posible tratamiento o monitorizar el avance (o la regresión) del trastorno en un paciente, donde el kit comprende un modulador como los descritos en la presente y reactivos para detectar el impacto del modulador en una muestra.
Otro aspecto más de la presente invención comprende el uso de DLL3 marcado para la inmunohistoquímica (IHC) . A este respecto, se puede utilizar IHC de DLL3 como herramienta de diagnóstico para conseguir diagnosticar diversos trastornos proliferativos y monitorizar la respuesta potencial a tratamientos incluida la terapia con un modulador de DLL3. Se pueden realizar ensayos para el diagnóstico compatibles en tejidos que han sido fijados químicamente (que incluyen, sin carácter limitante: formaldehído, gluteraldehído, tetraóxido de osmio, dicromato de potasio, ácido acético, alcoholes, sales de zinc, cloruro mercúrico, tetraóxido de cromo y ácido pícrico) y embebidos (que incluyen, sin carácter limitante: metacrilato de glicol, parafina y resinas) o conservados por congelación. Tal como se indica más detalladamente más adelante, estos ensayos se pueden utilizar como guía para decisiones sobre el tratamiento o para determinar los periodos y los regímenes posologicos.
B . Cribado En ciertas modalidades, los moduladores también se pueden utilizar para cribar o identificar compuestos o agentes (p. ej . , fármacos) que alteran una función o actividad de células tumorigénicas o su progenie al interaccionar con un antígeno (p. ej . , sus componentes genotípicos o fenotípicos) . Tales compuestos y agentes pueden ser fármacos potenciales que se pueden cribar para el tratamiento de un trastorno proliferativo, por ejemplo. En una modalidad, un sistema o método incluye células tumorigénicas que comprenden DLL3 y un compuesto o agente (p. ej . , fármaco) , donde las células y el compuesto o agente están en contacto entre sí. En tales modalidades, las células en cuestión pueden haber sido identificadas, monitorizadas y/o enriquecidas utilizando los moduladores descritos.
En otra modalidad más, un método incluye poner en contacto, directa o indirectamente, células tumorigénicas o su progenie con un agente o compuesto de prueba y determinar si el agente o compuesto de prueba modula una actividad o función de las células tumorigénicas asociadas con el antígeno. Un ejemplo de una interacción directa es la interacción física, mientras que una interacción indirecta incluye la acción de una composición sobre una molécula intermedia que, a su vez, actúa sobre la entidad de referencia (p. ej . , célula o cultivo celular). Las actividades o funciones ilustrativas que se pueden modular incluyen cambios en la morfología o viabilidad de las células, expresión de un marcador, diferenciación o desdiferenciación, respiración celular, actividad mitocondrial , integridad de la membrana, maduración, proliferación, viabilidad, apoptosis o muerte celular.
Los métodos para cribar e identificar agentes y compuestos incluyen aquellos adecuados para un cribado de alto rendimiento, que incluyen matrices de células (p. ej . , micromatrices) situadas o colocadas, opcionalmente en posiciones o lugares predeterminados. Por ejemplo, las células se pueden colocar o situar (presiembra) en una cubeta, tubo, matraz, botella rotatoria o placa de cultivo (p. ej . , una única cubeta o placa de múltiples pocilios tal como una cubeta o placa de 8, 16, 32, 64, 96, 384 y 1536 pocilios) . Los métodos de manipulación manuales o robóticos de alto rendimiento pueden sondear interacciones químicas y determinar los niveles de expresión de muchos genes en un periodo corto. Se han desarrollado técnicas que emplean señales moleculares (p. ej . , a través de fluoróforos) y análisis automáticos que procesan información a una velocidad muy elevada (remítase, p. ej . , a Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. , 7:133 (2004)). Por ejemplo, la tecnología de micromatrices se ha utilizado comúnmente para sondear las interacciones de miles de genes a la vez, al tiempo que se proporciona información sobre genes específicos (remítase, p. ej . , a Mocellin y Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593 : 19 (2007) ) .
Las colecciones que se pueden cribar incluyen, por ejemplo, colecciones de moléculas de bajo peso molecular, colecciones de expresión en fagos, colecciones de expresión en levaduras de anticuerpos completamente humanos (Adimab, LLC) , colecciones de AR ip y vectores de transfección adenovíricos .
X . Preparados farmacéuticos y usos terapéuticos A. Formulaciones y vías de administración Dependiendo de la forma del modulador junto con cualquier conjugado opcional, el modo de administración deseado, la enfermedad que se esté tratando o monitorizando y otras muchas variables, las composiciones de la invención se pueden formular según se desee utilizando técnicas reconocidas en la materia. En algunas modalidades, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar puras o con una cantidad mínima de componentes adicionales mientras que otras se pueden formular opcionalmente para que contengan portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que son muy conocidos en la técnica (remítase, p. ej . , a Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons : Drugfacts Plus, 20.a ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7.a ed. , Lippencott Williams y Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipiente, 3.a ed. , Pharmaceutical Press (2000) ) . Muchos portadores farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos, adyuvantes y diluyentes, se pueden adquirir fácilmente de muchos proveedores comerciales. Es más, también se dispone de un surtido de sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes tamponantes y reguladores del pH, agentes reguladores de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares. Ciertos portadores ilustrativos no limitantes incluyen solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de estos.
Más particularmente, se apreciará que, en algunas modalidades, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar puras o con una cantidad mínima de componentes adicionales. En cambio, los moduladores de DLL3 de la presente invención se pueden formular opcionalmente para que contengan portadores farmacéuticamente aceptables adecuados, que comprenden excipientes y auxiliares que son muy conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración del modulador o que ayudan a procesar los compuestos activos para obtener preparados que están farmacéuticamente optimizados para el suministro al sitio de acción. Por ejemplo, un excipiente puede conferir forma o consistencia, o actuar como diluyente para mejorar las propiedades farmacocinéticas o la estabilidad del modulador. Los excipientes o aditivos adecuados incluyen, sin carácter limitante, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración cutánea. En ciertas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en una forma liofilizada y reconstituir en, por ejemplo, solución salina tamponada, antes de su administración .
Los moduladores descritos para la administración sistémica se pueden formular para la administración entérica, parenteral o tópica. De hecho, estos tres tipos de formulación se pueden utilizar simultáneamente para conseguir una administración sistémica del principio activo. En Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20.a Ed. Mack Publishing (2000) , se exponen tanto excipientes como formulaciones para la administración de fármacos parenteral y no parenteral . Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales hidrosolubles . Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos según proceda para suspensiones de inyección oleosas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, poli (láctido) sustituido con hexilo, aceite de sésamo, o ásteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos . Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente , la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden utilizar liposomas para encapsular el agente para su suministro a la célula.
Las formulaciones adecuadas para la administración entérica incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, pastillas, comprimidos, incluidos los comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de estos.
En general, los compuestos y las composiciones de la invención que comprenden moduladores de DLL3 se pueden administrar in vivo, a un sujeto que lo necesite, a través de diversas vías, que incluyen, sin carácter limitante, la vía oral, intravenosa, intraarterial , subcutánea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracraneal, intracardíaca, intraventricular, intratraqueal , bucal, rectal, intraperitoneal , intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, o bien por implantación o inhalación. Las composiciones en cuestión se pueden formular como preparados en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas; que incluyen, sin carácter limitante, comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, enemas, inyecciones, inhaladores y aerosoles. La formulación y la vía de administración adecuadas se pueden seleccionar según la aplicación y el régimen terapéutico deseados.
B . Dosis De forma análoga, el régimen posológico particular, es decir, la dosis, la duración y la repetición, dependerán del individuo particular y de los antecedentes médicos del individuo, así como también de consideraciones empíricas tales como las propiedades farmacocinéticas (p . ej . , semivida, tasa de depuración, etc.). La frecuencia de la administración se puede determinar y ajustar durante el curso de la terapia, y se basa en reducir el número de células tumorigénicas o proliferativas , mantener la reducción de tales células neoplásicas, reducir la proliferación de células neoplásicas o retardar el desarrollo de metástasis. En otras modalidades, la dosis administrada se puede ajustar o atenuar para controlar efectos secundarios y/o toxicidad potenciales. Como alternativa, pueden ser adecuadas las formulaciones de liberación continua prolongada de una composición terapéutica en cuestión.
En general, los moduladores de la invención se pueden administrar en diferentes rangos. Estos incluyen de aproximadamente 10 ug/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 50 g/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dosis. Otros rangos incluyen de aproximadamente 100 g/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis y de aproximadamente 0.5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertas modalidades, la dosis es de al menos aproximadamente 100 g/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 250 u / de peso corporal, al menos aproximadamente 750 g/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.
En modalidades seleccionadas, los moduladores se administrarán en aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 g/kg de peso corporal por dosis. Otras modalidades comprenderán la administración de moduladores en 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 g/kg de peso corporal por dosis. En otras modalidades preferidas, los moduladores descritos se administrarán en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. En otras modalidades adicionales, los moduladores se pueden administrar en aproximadamente 12, 14, 16, 18 o 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En otras modalidades más, los moduladores se pueden administrar en 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal por dosis. De acuerdo con los principios de la presente, se apreciará que las dosis mencionadas anteriormente se pueden aplicar tanto a los moduladores sin conjugar como a los moduladores conjugados con un agente citotóxico. Un experto en la técnica podrá determinar fácilmente las dosis adecuadas para diversos moduladores conjugados y sin conjugar sobre la base de estudios preclínicos en animales, observaciones clínicas, y técnicas y mediciones médicas y bioquímicas estándar.
En lo que respecta a los moduladores conjugados, las modalidades particularmente preferidas comprenderán dosis de entre aproximadamente 50 ug/kg y aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. A este respecto, los moduladores conjugados se pueden administrar en 50, 75 o 100 pg/kg, o en 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o 1 mg/kg de peso corporal por dosis. En otras modalidades preferidas, los moduladores conjugados de la presente invención se pueden administrar en 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75 o 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En modalidades particularmente preferidas, las dosis de moduladores conjugados se administrarán por vía intravenosa durante un periodo. Es más, tales dosis se pueden administrar varias veces durante el curso del tratamiento establecido.
Se pueden proponer otros regímenes posológicos basados en cálculos del área de la superficie corporal (BSA, por sus siglas en inglés) tal como se describe en la patente de EE. UU. N.° 7,744,877. El BSA, como bien se sabe, se calcula utilizando la altura y el peso del paciente, y proporciona una medición del tamaño de un sujeto representado por el área de la superficie de su cuerpo. En ciertas modalidades, los moduladores se pueden administrar en dosis de entre 10 mg/m2 y 800 mg/m2, entre 50 mg/m2 y 500 mg/m2, y en dosis de 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2 o 450 mg/m2.
También se apreciará que se pueden utilizar técnicas empíricas y reconocidas en la técnica para determinar la dosis adecuada para los moduladores conjugados (es decir, ADC) .
En cualquier caso, los moduladores de DLL3 (tanto conjugados como sin conjugar) se administran preferentemente según sea necesario a sujetos que lo necesiten. Los expertos en la técnica, tales como un médico responsable del tratamiento, podrán determinar la frecuencia de administración en función de consideraciones sobre la afección que se esté tratando, la edad del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, el estado de salud general del sujeto que se esté tratando y similares. En general, se administra una dosis eficaz del modulador de DLL3 a un sujeto una o más veces. Más particularmente, se administra una dosis eficaz del modulador al sujeto una vez al mes, más de una vez al mes, o menos de una vez al mes. En ciertas modalidades, la dosis eficaz del modulador de DLL3 se puede administrar varias veces, que incluyen periodos de al menos un mes, al menos seis meses, al menos un año, al menos dos años o un periodo de varios años. En otras modalidades más, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) , varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o incluso un año o varios años entre las administraciones de los moduladores descritos.
En ciertas modalidades preferidas, el curso del tratamiento en el que intervienen moduladores conjugados comprenderá múltiples dosis del producto correspondiente al fármaco seleccionado (es decir, un ADC) durante un periodo de semanas o meses. Más específicamente, los moduladores conjugados de la presente invención se pueden administrar una vez al día, cada dos días, cada cuatro días, cada semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada mes, cada seis semanas, cada dos meses, cada diez semanas o cada tres meses. A este respecto, se apreciará que las dosis se pueden alterar o el intervalo se puede ajustar en función de la respuesta del paciente y las prácticas clínicas.
Las dosis y los regímenes también se pueden determinar empíricamente para las composiciones terapéuticas descritas en individuos que han recibido una o más administraciones. Por ejemplo, se pueden administrar a los individuos dosis crecientes de una composición terapéutica producida como se describe en la presente. En modalidades seleccionadas, la dosis se puede incrementar o reducir o atenuar gradualmente basándose respectivamente en efectos secundarios o toxicidad observados o determinados empíricamente. Para evaluar la eficacia de la composición seleccionada, se puede realizar un seguimiento de un marcador de la enfermedad, trastorno o afección específica tal como se ha descrito anteriormente. En modalidades en las que el individuo padece cáncer, estos marcadores incluyen mediciones directas del tamaño del tumor por observación visual o palpación, la medición indirecta del tamaño del tumor por rayos X u otras técnicas tomográficas ; una mejora según se evalúa mediante una biopsia tumoral directa o un examen por microscopía de la muestra tumoral; la medición de un marcador tumoral indirecto (p. ej . , PSA para el cáncer de próstata) o un antígeno identificado de acuerdo con los métodos descritos en la presente, una disminución del dolor o la parálisis; una mejora en el habla, la visión, la respiración u otra discapacidad asociada con el tumor; un mayor apetito; o un aumento de la calidad de vida según se mide mediante pruebas aceptadas o la prolongación de la supervivencia. Será evidente para un experto en la técnica que la dosis variará dependiendo del individuo, del tipo de afección neoplásica, el estadio de la afección neoplásica, si la afección neoplásica ha comenzado a metastatizarse en otras partes del cuerpo del individuo, y los tratamientos previos y concurrentes que se estén utilizando.
C . Terapias combinadas Las terapias combinadas pueden ser particularmente útiles para reducir o inhibir la proliferación de células neoplásicas no deseadas, reducir la aparición del cáncer, reducir o prevenir la recidiva del cáncer, o reducir o prevenir la dispersión o metástasis del cáncer. En tales casos, los moduladores de la presente invención pueden actuar como agentes sensibilizantes o quimiosensibilizantes mediante la eliminación de las CSC, que de lo contrario mantendrían y perpetuarían la masa tumoral, y de este modo se consigue utilizar de forma más eficaz los agentes anticancerosos o citorreductores de uso habitual actuales. Es decir, los moduladores descritos pueden proporcionar, en ciertas modalidades, un efecto mejorado (p. ej . , de naturaleza aditiva o sinérgica) que potencie el modo de acción de otro agente terapéutico administrado. En el contexto de la presente invención, la expresión "terapia combinada" se interpretará en un sentido amplio y se refiere simplemente a la administración de un modulador y uno o más agentes anticancerosos que incluyen, sin carácter limitante, agentes citotóxicos, agentes citostáticos , agentes antiangiogénicos, agentes citorreductores, agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos , agentes anticancerosos dirigidos (que incluyen tanto anticuerpos monoclonales como entidades de bajo peso molecular) , BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia con radiación y agentes antimetastásicos , y agentes inmunoterapéuticos , que incluyen tanto las estrategias específicas como no específicas .
No se necesita que los resultados combinados sean aditivos respecto a los efectos observados cuando se realiza cada tratamiento (p. ej . , anticuerpo y agente anticanceroso) por separado. Aunque por lo general sean deseables efectos al menos aditivos, cualquier incremento en el efecto antitumoral que sea superior al de las terapias individuales es beneficioso. Además, la invención no requiere que el tratamiento combinado exhiba efectos sinérgicos. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que con ciertas combinaciones seleccionadas que comprenden modalidades preferidas, se puede observar sinergia.
Al llevar a la práctica la terapia combinada, el modulador y el agente anticanceroso se pueden administrar al sujeto simultáneamente, ya sea en una única composición o como dos o más composiciones diferentes, utilizando las mismas vías de administración o vías diferentes. Como alternativa, el modulador puede preceder o seguir al tratamiento con un agente anticanceroso, p. ej . , en intervalos que varían entre minutos y semanas . El periodo entre cada administración es tal que al agente anticanceroso y el modulador son capaces de ejercer un efecto combinado sobre el tumor. En al menos una modalidad, tanto el agente anticanceroso como el modulador se administran en un intervalo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente dos semanas el uno respecto al otro. En otras modalidades más, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre la administración del modulador y el agente anticanceroso.
La terapia combinada se puede administrar una vez, dos veces o al menos durante un período hasta que la afección se trate, palie o cure. En algunas modalidades, la terapia combinada se administra varias veces, por ejemplo, de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración se puede ajustar a un programa tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o se puede administrar de forma continua a través de una minibomba . La terapia combinada se puede administrar por cualquier vía, como las indicadas anteriormente. La terapia combinada se puede administrar en un sitio distante del sitio del tumor.
En una modalidad, se administra un modulador combinado con uno o más agentes anticancerosos durante un ciclo de tratamiento corto a un sujeto que lo necesite. La invención también contempla la administración discontinua o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. El modulador y el agente anticanceroso se pueden administrar indistintamente, en días alternos o semanas alternas; o se puede administrar una secuencia de tratamientos con el anticuerpo, seguida de uno o más tratamientos de terapia con el agente anticanceroso. En cualquier caso, como sobreentenderán los expertos en la técnica, las dosis adecuadas de agentes quimioterapéuticos generalmente serán aproximadamente equivalentes a aquellas empleadas en terapias clínicas en las que se administran los agentes quimioterapéuticos solos o combinados con otros agentes quimioterapéuticos .
En otra modalidad preferida, los moduladores del DLL3 de la presente invención se pueden utilizar en la terapia de mantenimiento para reducir o eliminar la posibilidad de recidiva tumoral después de la presentación inicial de la enfermedad. Preferentemente, el trastorno habrá sido tratado y la masa tumoral inicial habrá sido eliminada, reducida o mejorada de alguna otra forma de modo que el paciente sea asintomático o esté en remisión. En tal momento, se pueden administrar al sujeto cantidades farmacéuticamente eficaces de los moduladores descritos una o más veces, aunque no haya prácticamente indicios o no haya ningún indicio de la enfermedad utilizando procedimientos de diagnóstico estándar. En algunas modalidades, los moduladores se administrarán conforme a un programa regular durante un período tal como semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, cada seis semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada seis meses o anualmente. Teniendo en cuenta los principios de la presente, un experto en la técnica podrá determinar fácilmente las dosis y los regímenes posológicos favorables para reducir el potencial de recidiva de la enfermedad. Es más, tales tratamientos se podrían prolongar durante un periodo de semanas, meses, años o incluso indefinidamente dependiendo de la respuesta del paciente y los parámetros clínicos y de diagnóstico .
En otra modalidad preferida más, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para prevenir o reducir, profilácticamente o como una terapia adyuvante, la posibilidad de que se produzca metástasis tumoral después de un procedimiento citorreducto . La expresión "procedimiento citorreductor" , tal como se utiliza en la presente exposición, se define en un sentido amplio y se referirá a cualquier procedimiento, técnica o método que elimine, reduzca, trate o mejore un tumor o la proliferación de un tumor. Los procedimientos citorreductores ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, cirugía, tratamientos con radiación (es decir, haz de radiación) , quimioterapia, inmunoterapia o ablación. En los momentos adecuados determinados fácilmente por un experto en la técnica en vista de la presente exposición, los moduladores descritos se pueden administrar según se sugiera por procedimientos clínicos, teragnósticos o de diagnóstico para reducir la metástasis tumoral. Los moduladores se pueden administrar una o más veces en dosis farmacéuticamente eficaces según se determine utilizando técnicas estándar. Preferentemente, el régimen posológico irá acompañado por técnicas de monitorización o diagnóstico adecuadas que permitan su modificación .
Otras modalidades más de la invención comprenden administrar los moduladores descritos a sujetos que son asintomáticos pero que corren el riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo. Es decir, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar en un sentido realmente preventivo y se pueden administrar a pacientes que hayan sido examinados o se hayan sometido a pruebas y que presenten uno o más factores de riesgo establecidos (p. ej . , indicios genómicos, antecedentes familiares, resultados de pruebas in vivo o in vitro, etc.) pero que no hayan desarrollado ninguna neoplasia. En tales casos, los expertos en la técnica serán capaces de determinar un régimen posológico efectivo mediante la observación empírica o mediante prácticas clínicas aceptadas .
D . Agentes anticancerosos La expresión "agente anticanceroso" o "agente antiproliferativo" se refiere a cualquier agente que se pueda utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular tal como el cáncer e incluye, sin carácter limitante, agentes citotóxicos, agentes citostáticos , agentes antiangiogénicos , agentes citorreductores , agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos, agentes anticancerosos dirigidos, BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia de radiación, y agentes antimetastásicos y agentes inmunoterapéuticos . Se apreciará que, en modalidades seleccionadas como las indicadas anteriormente, tales agentes anticancerosos pueden comprender conjugados y se pueden asociar con moduladores antes de su administración. En ciertas modalidades, el agente anticanceroso descrito estará unido a un modulador de DLL3 para proporcionar un ADC tal como se ha expuesto en la presente .
La expresión "agente citotóxico" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que es tóxica para las células, y reduce o inhibe la función de células y/o provoca la destrucción de células. Normalmente, la sustancia es una molécula natural derivada de un organismo vivo. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, sin carácter limitante, toxinas de bajo peso molecular o toxinas enzimáticamente activas de bacterias (p. ej . , la toxina diftérica, endotoxina y exotoxina de Pseudomonas, y enterotoxina A de Staphylococcus) , hongos (e.g., a-sarcina, restrictocina) , plantas (p. ej . , abrina, ricina, modecina, viscumina, proteína antivírica de Phytolacca americana, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina de la cebada, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diatínicas, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos) o animales, (p. ej . , RNasas citotóxicas, tales como las RNasas pancreáticas extracelulares ; DNasa I, incluidos sus fragmentos y/o variantes) .
A los efectos de la presente invención, la expresión "agente quimioterapéutico" comprende un compuesto químico que reduce o inhibe de forma no específica el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de células cancerosas (p. ej . , agentes citotóxicos o citostáticos) . Tales agentes químicos normalmente se dirigen a procesos intracelulares necesarios para el crecimiento o la división celular y, por lo tanto, son particularmente efectivos contra células cancerosas, que generalmente crecen y se dividen rápidamente. Por ejemplo, la vincristina despolimeriza microtúbulos y de este modo inhibe la entrada de las células en la fase de mitosis . En general, los agentes quimioterapéuticos pueden incluir cualquier agente químico que inhiba o que esté diseñado para inhibir una célula cancerosa o una célula que es probable que se vuelva cancerosa o genere una progenie tumorigénica (p. ej . , TIC). Tales agentes normalmente se administran y normalmente son más eficaces combinados, p. ej . , en regímenes tales como CHOP o FOLFIRI . Nuevamente, en modalidades seleccionadas, tales agentes quimioterapéuticos se pueden conjugar con los moduladores descritos.
Los ejemplos de agentes anticancerosos que se pueden utilizar combinados (o conjugados) con los moduladores de la presente invención incluyen, sin carácter limitante, agentes alquilantes, sulfonatos de alquilo, aziridinas, etileniminas y metilamilaminas, acetogeninas , una camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065, criptoficinas, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, una sarcodictina, espongistatina, mostazas nitrogenadas, antibióticos, antibióticos enodiínicos, dinemicina, bisfosfonatos , esperamicina, cromóforos de antibióticos enodiínicos cromoproteicos , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIA YCIN*, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina ; antimetabolitos , erlotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamida, análogos del ácido fólico, análogos de la purina, andrógenos, antiadrenales , regenerador del ácido fólico tal como el ácido frolínico, aceglatona, glicósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, una epotilona, etoglúcido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinán, lonidainina, maitansinoides , mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, complejo polisacárido PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR) , razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); c clofosfamida; tiotepa; taxoides, cloranbucilo; gemcitabina GEMZAR8; 6 -1ioguanina ; mercaptopurina; metotrexato ; análogos de platino, vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina ; vinorelbina NAVELBINE8; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina ; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11) , inhibidor de topoisomerasas RFS 2000; difluorometilornitina; retinoides; capecitabina; combretastatina; leucovorina; oxaliplatino; inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR y VEGF-A que reducen la proliferación celular, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores de los receptores de estrógeno selectivos, inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas suprarrenales y antiandrógenos ; así como también troxacitabina (un análogo citosínico del nucleósido de 1,3-dioxolano) ; oligonucleótidos com lementarios, ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF y un inhibidor de la expresión de HER2 ; vacunas, rIL-2 PROLEUKIN*; el inhibidor de la tipoisomerasa 1 LURTOTECAN*; rmRH ABARELIX®; Vinorelbina y Esperamicinas, y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
En otras modalidades, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar combinados con cualquiera de diversos anticuerpos (o agentes inmunoterapéuticos) que en la actualidad están en fase de ensayos clínicos o se comercializan. Con este fin, los moduladores descritos se pueden utilizar combinados con un anticuerpo seleccionado entre el grupo constituido por abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumoma , brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzuraab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minre umomab, mitumomab, moxetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomabn, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49, 3F8 y combinaciones de estos.
Otras modalidades particularmente preferidas adicionales comprenderán el uso de anticuerpos autorizados para la terapia contra el cáncer que incluyen, sin carácter limitante, rituximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, tositumomab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab y brentuximab vedotin. Los expertos en la técnica serán capaces de identificar fácilmente agentes anticancerosos adicionales que son compatibles con los principios de la presente.
E . Radioterapia La presente invención también proporciona la combinación de moduladores con radioterapia (es decir, cualquier mecanismo para inducir daño en el ADN localmente en las células tumorales tal como irradiación de rayos gamma, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares) . También se contempla la terapia combinada en la que se emplea el suministro dirigido de radioisótopos a células tumorales y se puede utilizar en conexión con un agente anticanceroso dirigido u otro medio de direccionamiento . Normalmente, la radioterapia se administra en pulsos durante un período de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 semanas . La radioterapia se puede administrar a sujetos que padecen cáncer de cabeza y cuello durante aproximadamente 6-7 semanas. Opcionalmente, la radioterapia se puede administrar como una única dosis o como múltiples dosis secuenciales .
XI . Indicaciones Se apreciará que los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para diagnosticar, tratar o inhibir la aparición o la recidiva de cualquier trastorno asociado con DLL3. Por consiguiente, los moduladores de la invención, ya sean administrados solos o combinados con un agente anticanceroso o radioterapia, son particularmente útiles para tratar en general afecciones neoplásicas en pacientes o sujetos que pueden incluir tumores benignos o malignos (p. ej . , carcinomas de las glándulas suprarrenales, hígado, riñon, vejiga, mama, gástricos, ováricos, colorrectales , de próstata, pancreático, de pulmón, tiroides, hepáticos, del cuello uterino, de endometrio, esofágicos y uterinos; sarcomas; glioblastomas ; y diversos tumores de cabeza y cuello) ; leucemias y enfermedades malignas linfoides,- otros trastornos tales como neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos , epiteliales, estromales y blastocélicos ; y trastornos inflamatorios, angiogénicos , inmunológicos y trastornos provocados por patógenos. En particular, las dianas principales del tratamiento son afecciones neoplásicas que comprenden tumores sólidos, aunque las enfermedades malignas hematológicas quedan contempladas por el alcance de la invención. Preferentemente, el "sujeto" o "paciente" que se ha de tratar será un ser humano aunque se sobreentenderá que estos términos, tal como se utilizan en la presente, comprenden cualquier especie de mamífero.
Más específicamente, las afecciones neoplásicas sensibles al tratamiento de acuerdo con la presente invención se pueden seleccionar entre un grupo que incluye, sin carácter limitante, tumores de las glándulas suprarrenales, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma escamocelular y carcinoma de células transicionales) , cáncer de huesos (adamantinoma, quiste óseo aneurismático, osteocondroma, osteosarcoma) , cánceres de cerebro y de la médula espinal, tumores de cerebro metastásicos , cáncer de mama, tumores del cuerpo carotídeo, cáncer del cuello uterino, condrosarcoma, cordoma, carcinoma de células renales cromófobas, carcinoma de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores desmoplásicos de células pequeñas y redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ósea, displasia fibrosa ósea, cánceres de las vías biliares y la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumores de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores insulares, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renales) , leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, 1iposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular) , linfornas, cánceres de pulmón (carcinoma microcítico, adenocarcinoma, carcinoma escamocelular, carcinoma de células grandes, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cáncer ovárico, cánceres pancreáticos, carcinomas papilares de la tiroides, tumores de paratiroides , cánceres pediátricos, tumores de la vaina de los nervios periféricos, feocromocitoma, tumores de la pituitaria, cáncer de próstata, melanoma uveal posterior, trastornos hematológicos poco frecuentes, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas de los tejidos blandos, cáncer escamocelular, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastásico de la tiroides y cánceres uterinos (carcinoma del cuello uterino, carcinoma de endometrio y leiomioma) .
En ciertas modalidades preferidas, el trastorno proliferativo comprenderá un tumor sólido que incluye, sin carácter limitante, carcinomas de las glándulas suprarrenales, hígado, riñon, vejiga, mama, gástricos, ováricos, del cuello uterino, uterinos, esofágicos, colorrectales , de próstata, pancreáticos, de pulmón (tanto microcíticos como no microcíticos) , de la tiroides, carcinomas sarcomas, glioblastomas y diversos tumores de cabeza y cuello. En otras modalidades preferidas y tal como se muestra más adelante en los Ejemplos, los moduladores descritos son especialmente efectivos en el tratamiento del carcinoma de pulmón microcítico (SCLC) y el carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) (p. ej . , el cáncer de pulmón no microcítico escamocelular o el cáncer de pulmón microcítico escamocelular) . En una modalidad, el cáncer de pulmón es refractario, recividante o resistente a un agente basado en platino (p. ej . , carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, topotecán) y/o un taxano (p. ej . , docetaxel, paclitaxel, larotaxel o cabazitaxel) . Además, en modalidades particularmente preferidas, los moduladores descritos se pueden utilizar en una forma conjugada para tratar el cáncer de pulmón microcítico.
En lo que respecta al cáncer de pulmón microcítico, las modalidades particularmente preferidas comprenderán la administración de moduladores conjugados (ADC) . En modalidades seleccionadas, los moduladores conjugados se administrarán a pacientes que exhiben una enfermedad en estadio limitado. En otras modalidades, los moduladores descritos se administrarán a pacientes que exhiben una enfermedad en estadio extensivo. En otras modalidades preferidas, los moduladores conjugados descritos se administrarán a pacientes refractarios (es decir, aquellos que experimentan una recidiva durante o poco después de finalizar un curso de terapia inicial) . Otras modalidades adicionales comprenden la administración de los moduladores descritos a pacientes sensibles (es decir, aquellos cuya recaída tiene lugar más de 2-3 meses después de la terapia primaria) . En cada caso, se apreciará que los moduladores compatibles pueden estar en un estadio conjugado o sin conjugar dependiendo del régimen posológico seleccionado y el diagnóstico clínico.
Tal como se ha indicado anteriormente, los moduladores descritos se pueden utilizar además para prevenir, tratar o diagnosticar tumores con características o fenotipos neuroendocrinos que incluyen tumores neuroendocrinos . Los tumores neuroendocrinos (NET) verdaderos o canónicos que se originan en el sistema endocrino difuso son relativamente poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 cada 100 000 personas, pero son sumamente agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en el riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , tubo gastrointestinal (colon, estómago) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes) . Estos tumores pueden secretar varias hormonas, incluidas la serotonina y/o cromogranina A, que pueden provocar síntomas debilitantes conocidos como el síndrome carcinoide. Estos tumores se pueden detectar mediante marcadores inmunohistoquímicos positivos tales como la enolasa neuroespecífica (NSE, conocida también como enolasa gamma, símbolo génico = EN02) , CD56 (o NCAM1) , cromogranina A (CHGA) y sinaptofisina (SYP) o mediante genes que se sabe que exhiben una expresión elevada tales como ASCL1. Desafortunadamente, las quimioterapias tradicionales no han sido particularmente efectivas en el tratamiento de NET y la metástasis hepática es un resultado habitual .
Aunque los moduladores descritos se pueden utilizar convenientemente para tratar tumores neuroendocrinos , también se pueden utilizar para tratar, prevenir o diagnosticar tumores pseudoneuroendocrinos (pNET) que genotípica o fenotípicamente imitan, se asemejan o exhiben rasgos comunes respecto a los tumores neuroendocrinos canónicos . Los tumores pseudoneuroendocrinos o tumores con características neuroendocrinas son tumores que se originan a partir de células del sistema neuroendocrino difuso o a partir de células en las que se ha reactivado de forma aberrante una cascada de diferenciación neuroendocrina durante el proceso oncogénico. Tales pNET normalmente comparten ciertas características fenotípicas o bioquímicas con tumores neuroendocrinos definidos tradicionalmente , que incluyen la capacidad para producir subconjuntos de aminas, neurotransmisores y hormonas peptídicas biológicamente activos. Histológicamente, tales tumores (NET y pNET) comparten una apariencia común que normalmente presenta células pequeñas conectadas densamente con citoplasma mínimo de citopatología blanda y núcleos punteados de redondos a ovales. A los efectos de la presente invención, los marcadores histológicos o marcadores genéticos expresados comúnmente que se pueden utilizar para definir tumores neuroendocrinos y pseudoneuroendocrinos incluyen, sin carácter limitante, la cromogranina A, CD56, sinaptofisina, PGP9.5, ASCLl y enolasa neuroespecífica (NSE) .
Por consiguiente, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar beneficiosamente para tratar tanto tumores pseudoneuroendocrinos como tumores neuroendocrinos canónicos. A este respecto, los moduladores se pueden utilizar como se describe en la presente para tratar tumores neuroendocrinos (tanto NET como pNET) que se originan en el riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , tubo gastrointestinal (colon, estómago) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes) . Es más, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para tratar tumores que expresan uno o más marcadores seleccionados entre el grupo constituido por NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A, ASCLl y PGP9.5 (UCHL1) . Es decir, la presente invención se puede utilizar para tratar un sujeto que padece un tumor que es NSE+ o CD56+ o PGP9.5+ o ASCL1+ o SYP+ o CHGA+ o alguna combinación de estos.
En lo que respecta a enfermedades malignas hematológicas , se apreciará además que los compuestos y métodos de la presente invención pueden ser particularmente efectivos en el tratamiento de diversos linfornas de linfocitos B que incluyen el linfoma de células foliculares de bajo grado/NHL (FCC, por sus siglas en inglés) , linfoma de células del manto ( CL, por sus siglas en inglés) , linfoma difuso de células grandes (DLCL, por sus siglas en inglés) , NHL linfocítico pequeño (LP) , NHL folicular/de grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL no escindido pequeño de alto grado, NHL de gran masa tumoral, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma linfoplasmacitoide (LPL, por sus siglas en inglés) , linfoma de células del manto (MCL) , linfoma folicular (FL, por sus siglas en inglés) , linfoma difuso de células grandes (DLCL) , linfoma de Burkitt (BL, por sus siglas en inglés) , linfomas relacionados con el SIDA, linfoma monocítico de linfocitos B, linfoadenopatía angioinmunoblástica, linfocitíco pequeño, folicular, difuso de células grandes, difuso de células pequeñas escindidas, linfoblastoma inmunoblástico de células grandes, pequeño, no escindido, de Burkitt y de no Burkitt, folicular, predominantemente de células grandes; folicular, predominantemente de células pequeñas escindidas; y linfomas mixtos foliculares, de células grandes y de células pequeñas escindidas. Remítase a Gaidono et al., "Lymphomas" , IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol . 2: 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5.a ed. 1997). Debería ser obvio para los expertos en la técnica que estos linfomas a menudo tendrán nombres diferentes debido a sistemas de clasificación sujetos a cambios, y que los pacientes que padecen linfomas clasificados con nombres diferentes también se pueden beneficiar de los regímenes terapéuticos combinados de la presente invención.
La presente invención también proporciona un tratamiento preventivo o profiláctico de sujetos que presentan tumores benignos o precancerosos . Aparte de tratarse de un trastorno asociado con DLL3 , no se cree que se deba excluir ningún tipo particular de tumor o trastorno proliferativo del tratamiento utilizando la presente invención. Sin embargo, el tipo de células tumorales puede ser relevante para el uso de la invención en combinación con agentes terapéuticos secundarios, en particular agentes quimioterapéuticos y agentes anticancerosos dirigidos.
XII . Artículos manufacturados También se proporcionan presentaciones y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes, que comprenden una o más dosis de un modulador de DLL3. En ciertas modalidades, se proporciona una dosis unitaria donde la dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende, por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL3 con o sin uno o más agentes adicionales. Para otras modalidades, la dosis unitaria se suministra en una jeringa desechable prellenada para su inyección. En otras modalidades, la composición contenida en la dosis unitaria puede comprender solución salina, sacarosa o similar; un tampón, tal como fosfato o similar; y/o se puede formular dentro de un rango de pH estable y efectivo. Como alternativa, en ciertas modalidades, la composición se puede proporcionar como un polvo liofilizado que se puede reconstituir al añadir un líquido adecuado, por ejemplo, agua estéril. En ciertas modalidades preferidas, la composición comprende una o más sustancias que inhiben la agregación proteica, incluidas, sin carácter limitante, sacarosa y arginina. Cualquier etiqueta sobre el o los recipientes o que esté asociada con estos indica que la composición contenida se utiliza para el diagnóstico o el tratamiento de la afección patológica seleccionada.
La presente invención también proporciona kits para producir unidades de administración mono- o multidosis de un modulador de DLL3 y, opcionalmente , uno o más agentes anticancerosos. El kit comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de diversos materiales tales como vidrio o plástico y contener una cantidad farmacéuticamente eficaz de los moduladores descritos en una forma conjugada o sin conjugar. En otras modalidades preferidas, el o los recipientes comprenden un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica) . Tales kits generalmente contendrán en un recipiente adecuado una formulación farmacéuticamente aceptable del modulador de DLL3 y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerosos en el mismo recipiente o en recipientes diferentes. Los kits también pueden contener otras formulaciones farmacéuticamente aceptables, ya sea para el diagnóstico o la terapia combinada. Por ejemplo, además del modulador de DLL3 de la invención, tales kits pueden contener uno o más cualesquiera de un rango de agentes anticancerosos tales como fármacos quimioterapéuticos o radioterapéuticos ,· agentes antiangiogénicos ; agentes antimetastásicos ; agentes anticancerosos dirigidos; agentes citotóxicos ; y/u otros agentes anticancerosos. Tales kits también pueden proporcionar reactivos adecuados para conjugar el modulador de DLL3 con un agente anticanceroso o agente de diagnóstico (p. ej . , remítase a la patente de EE . UU. N.° 7.422.739, que se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) .
Más preferentemente, los kits pueden contener un único recipiente que contenga el modulador de DLL3, con o sin componentes adicionales, o pueden contener recipientes diferentes para cada agente deseado. Cuando se proporcionan agentes terapéuticos combinados para su conjugación, se puede premezclar una única solución, ya sea en una combinación de un equivalente molar o con un componente en exceso respecto al otro. Como alternativa, el modulador de DLL3 y cualquier agente anticanceroso opcional del kit se pueden mantener separados dentro de recipientes diferentes antes de administrarlos a un paciente. Los kits también pueden comprender un segundo/tercer recipiente que contenga un tampón u otro diluyente farmacéuticamente aceptable y estéril, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés) , solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) , solución de Ringer y solución de dextrosa.
Cuando se proporcionan los componentes del kit en una o más soluciones líquidas, la solución líquida es preferentemente una solución acuosa, con preferencia en particular por una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit se pueden proporcionar como polvo (s) seco(s) . Cuando se proporcionan reactivos o componentes como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado. Se contempla que el disolvente también se pueda proporcionar en otro recipiente.
Como se ha indicado anteriormente de forma breve, los kits también pueden contener un medio mediante el cual se administre el anticuerpo y cualesquiera componentes opcionales a un animal o paciente, p. ej . , una o más agujas o jeringas, o incluso un cuentagotas, una pipeta u otro aparato similar, a partir del cual se puede inyectar o introducir la formulación en el animal o aplicarla a una parte del cuerpo afectada por una enfermedad. Los kits de la presente invención también incluirán normalmente un medio que contenga los viales o recipientes similares, y otro componente aislado para su uso comercial, tal como, p. ej . , recipientes de plástico moldeados por soplado o de inyección en los que se colocan y retienen los viales y otros aparatos deseados. Cualquier etiqueta o prospecto indica que la composición del modulador de DLL3 se utiliza para tratar un cáncer, por ejemplo, el cáncer de pulmón microcítico.
En otras modalidades preferidas, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar junto con o pueden comprender dispositivos terapéuticos o de diagnóstico útiles en el diagnóstico o el tratamiento de trastornos proliferativos . Por ejemplo, en una modalidad preferida, los compuestos y las composiciones de la presente invención se pueden combinar con ciertos dispositivos o instrumentos de diagnóstico que se pueden utilizar para detectar, monitorizar, cuantificar u obtener el perfil de células o compuestos marcadores que participan en la etiología o la manifestación de trastornos proliferativos . Para modalidades seleccionadas, los compuestos marcadores pueden comprender NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A y PGP9.5.
En modalidades particularmente preferidas, los dispositivos se pueden utilizar para detectar, monitorizar y/o cuantificar células tumorales circulantes in vivo o in vitro (remítase, por ejemplo, a WO 2012/0128801 que se incorpora a la presente por referencia) . En otras modalidades preferidas adicionales y tal como se ha indicado anteriormente, las células tumorales circulantes pueden comprender células madre cancerosas.
XIII. Reactivos para la investigación Otras modalidades preferidas de la invención también explotan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, monitorizar, aislar, seleccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores mediante métodos tales como el análisis por citometría de flujo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) o el seccionamiento mediado por láser. Los expertos en la técnica apreciarán que los moduladores se pueden utilizar en diversas técnicas compatibles para caracterizar y manipular TIC incluidas las células madre cancerosas (p. ej . , remítase a las patentes de EE. UU. N.os 12/686.359, 12/669.136 y 12/757.649, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) .
XIV. Disposiciones varias A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente invención tendrán los significados habituales con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Más específicamente, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células y similares. Además, los rangos proporcionados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas incluyen ambos límites de los rangos y todos los puntos entre los límites. Por lo tanto, un rango de 2.0-3.0 incluye 2.0, 3.0, y todos los puntos entre 2.0 y 3.0.
En general, las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y la química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente, y la nomenclatura empleada en conexión con estas son las conocidas y de uso común en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales muy conocidos en la técnica, y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y describen a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Remítase, p. ej . , a Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6.a ed. , W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocole in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lañe Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998) ; y Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, según se realizan habitualmente en la técnica o como se describe en la presente. Los procedimientos y las técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritos en la presente, y la nomenclatura empleada en conexión con estos son los conocidos y de uso común en la técnica. Además, todos los títulos de las secciones utilizados en la presente tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes del contenido descrito.
XV. Referencias de DLL3 Todas las referencias o documentos descritos o citados en esta memoria descriptiva, incluidos los que se exponen justo a continuación, se incorporan, sin limitación, a la presente en su totalidad por referencia.
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El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 1, donde el modulador de DLL3 comprende un antagonista de DLL3. 3. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 1, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 4. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 3, donde el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 5. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal se selecciona entre el grupo constituido por anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. 6. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante. 7. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo supresor. 8. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo internalizante. 9. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 8, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico. 10. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena ligera que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una región variable de la cadena pesada que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad, donde las regiones determinantes de la complementariedad de las cadenas ligera y pesada comprenden al menos una región determinante de la complementariedad expuesta en la FIG. 11A y la FIG. 11B. 11. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 4 donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 20, ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO : 84, ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID : NO: 100, ID NO: 102 , SEQ ! ID NO : 104, SEQ ID NO: 106, l SEQ ID NO: SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 202 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID : NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203. 12. Un modulador de DLL3 aislado que comprende una CDR de cualquiera de las regiones variables de la cadena pesada o ligera expuestas en la reivindicación 11. 13. Un modulador de DLL3 aislado que comprende un anticuerpo competitivo, donde el anticuerpo competitivo inhibe la unión de un modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 10 u 11 a DLL3 al menos aproximadamente un 40%. 14. Un ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena pesada de aminoácidos o una región variable de la cadena ligera de aminoácidos de conformidad con la reivindicación 11. 15. Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14. 16. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de esta. 17. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 16, donde el modulador de DLL3 comprende además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina . 18. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 1, donde el modulador reduce la frecuencia de células iniciadoras de tumores al administrarlo a un sujeto que lo necesite. 19. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 18, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores . 20. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 18, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores. 21. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 18, donde las células iniciadoras de tumores comprenden células perpetuantes de tumores . 22. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 1 que comprende además un agente citotóxico. 23. Una composición farmacéutica que comprende el modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 1. 24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, donde el modulador de DLL3 aislado comprende un anticuerpo monoclonal. 25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado. 26. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, donde el anticuerpo humanizado comprende un agente citotóxico. 27. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina . 28. Un método para tratar un trastorno asociado con DLL3 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de DLL3 a un sujeto que lo necesite. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, donde el modulador de DLL3 comprende un antagonista de DLL3. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, donde el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, donde el anticuerpo monoclonal se selecciona entre el grupo constituido por anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32 donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO : 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 202 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado. 35. El método de conformidad con la reivindicación 31, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante. 36. El método de conformidad con la reivindicación 31, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo internalizante . 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, donde el anticuerpo internalizante comprende un agente citotóxico . 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina . 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, donde el trastorno asociado con DLL3 comprende un trastorno neoplásico . 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, donde el tumor que exhibe características neuroendocrinas comprende un tumor neuroendocrino . 42. El método de conformidad con la reivindicación 39, donde el trastorno neoplásico comprende una enfermedad maligna hematológica . 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, donde la enfermedad maligna hematológica comprende leucemia o linforna . 44. El método de conformidad con la reivindicación 39, donde el sujeto que padece el trastorno neoplásico exhibe tumores que comprenden células iniciadoras de tumores. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44 que comprende además el paso de reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores en el sujeto. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores o una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores. 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprende el trasplante de células tumorales humanas vivas en ratones inmunodeprimidos . 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, donde la reducción de la frecuencia determinada utilizando un análisis de dilución limitante in vivo comprende la cuantificación de la frecuencia de células iniciadoras de tumores utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson. 50. El método de conformidad con la reivindicación 47, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vitro que comprende la deposición por dilución limitante de células tumorales humanas vivas en condiciones que estimulen las colonias in vitro. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, donde la reducción de la frecuencia determinada utilizando un análisis de dilución limitante in vitro comprende la cuantificación de la frecuencia de células iniciadoras de tumores utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson. 52. El método de conformidad con la reivindicación 28 que comprende además el paso de administrar un agente anticanceroso . 53. El método de conformidad con la reivindicación 28, donde el modulador de DLL3 comprende una o más CDR de cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-203. 54. El método de conformidad con la reivindicación 28, donde el modulador de DLL3 comprende un modulador de pan-DLL . 55. Un método para reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3 a el sujeto . 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, donde las células iniciadoras de tumores comprenden células perpetuantes de tumores . 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, donde las células perpetuantes de tumores son células CD324+ o CD46+. 58. El método de conformidad con la reivindicación 55, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico . 61. El método de conformidad con la reivindicación 55, donde el sujeto padece un trastorno neoplásico seleccionado entre el grupo constituido por cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer del cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de mama. 62. El método de conformidad con la reivindicación 55, donde la frecuencia de células iniciadoras tumorales se reduce al menos un 10%. 63. El método de conformidad con la reivindicación 55, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores o una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores. 64. Un método para tratar un sujeto que padece una enfermedad maligna hematológica que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3 a el sujeto. 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo monoclonal . 66. Un método de sensibilización de un tumor en un sujeto para tratarlo con un agente anticanceroso que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3 a el suj eto . 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo. 68. El método de conformidad con la reivindicación 66, donde el tumor es un tumor sólido. 69. El método de conformidad con la reivindicación 66, donde el agente anticanceroso comprende un agente quimioterapéutico . 70. El método de conformidad con la reivindicación 66, donde el agente anticanceroso comprende un agente inmunoterapéu ico . 71. Un método para diagnosticar un trastorno proliferativo en un sujeto que lo necesite que comprende los pasos de : a. obtener una muestra de tejido de el sujeto; b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de DLL3; y c. detectar o cuantificar el modulador de DLL3 asociado con la muestra. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo monoclonal . 73. El método de conformidad con la reivindicación 72, donde el anticuerpo está asociado operablemente con un indicador . 74. Un artículo manufacturado útil para diagnosticar o tratar trastornos asociados con DLL3 que comprende un receptáculo que comprende un modulador de DLL3 y materiales instructivos para utilizar con el modulador DLL3 para tratar o diagnosticar el trastorno asociado con DLL3. 75. El artículo manufacturado de conformidad con la reivindicación 74, donde el modulador de DLL3 es un anticuerpo monoclonal. 76. El artículo manufacturado de conformidad con la reivindicación 74, donde el receptáculo comprende una placa legible . 77. Un método para tratar un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de DLL3 internalizante. 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo. 79. El método de conformidad con la reivindicación 78, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. 80. El método de conformidad con la reivindicación 79, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico . 81. El método de conformidad con la reivindicación 80 que comprende además el paso de administrar un agente anticanceroso . 82. Un método para tratar un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de DLL3 neutralizante. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo. 84. El método de conformidad con la reivindicación 83, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado . 86. El método de conformidad con la reivindicación 85, donde el anticuerpo humanizado comprende además un agente citotóxico. 87. El método de conformidad con la reivindicación 82, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas . 88. Un método para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células iniciadoras de tumores que comprende el paso de poner en contacto las células iniciadoras de tumores con un modulador de DLL3. 89. El método de conformidad con la reivindicación 88, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo. 90. Un modulador de DLL3 que comprende un anticuerpo humanizado, donde el anticuerpo humanizado comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210 y SEQ ID NO: 212 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211 y SEQ ID NO: 213. 91. Un método para inhibir o prevenir la metástasis en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un modulador de DLL3. 92. El método de conformidad con la reivindicación 91, donde el sujeto se somete a un procedimiento citorreductor antes o después de la administración del modulador de DLL3. 93. El método de conformidad con la reivindicación 92, donde el procedimiento citorreductor comprende la administración de al menos un agente anticanceroso. 94. Un método para llevar a cabo una terapia de mantenimiento en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un modulador de DLL3. 95. El método de conformidad con la reivindicación 94, donde el sujeto ha sido sometido a tratamiento de un trastorno neoplásico antes de administrar el modulador de DLL3. 96. Un método para agotar células iniciadoras de tumores en un sujeto que padece un trastorno proliferativo que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3. 97. Un método para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con DLL3 in vivo en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de DLL3. 98. Un método para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con DLL3 en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de poner en contacto células tumorales circulantes con un modulador de DLL3. 99. El método de conformidad con la reivindicación 98, donde el paso de puesta en contacto tiene lugar in vivo. 100. El método de conformidad con la reivindicación 98, donde el paso de puesta en contacto tiene lugar in vitro. 101. Un método para tratar un tumor que exhibe características neuroendocrinas en un paciente que lo necesite que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de DLL3. 102. El método de conformidad con la reivindicación 101, donde el tumor que exhibe características neuroendocrinas es un tumor neuroendocrino . 103. Un modulador de DLL3 derivado de un anticuerpo seleccionado entre el grupo constituido por SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16 ,• 45, SC16• 47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16• 55, SC16 , .56, SC16 • 57, SC16 .58, SC16 .61, SC16 .62, SC16 .63, SC16, .65, SC16 .67, SC16 .68, SC16 .72, SC16 .73, SC16 .78, SC16. .79, SC16 .80, SC16. 81, SC16. 84, SC16. 88, SC16. 101, SC16. .103, SC16 .104, SC16. 105, SC16. 106, SC16. 107, SC16. 108, SC16 , .109, SC16 .110, SC16. 111, SC16. 113, SC16. 114, SC16. 115, SC16. .116, SC16 .117, SC16. 118, SC16. 120, SC16. 121, SC16. 122, SC16 , .123, SC16 .124, SC16. 125, SC16. 126, SC16. 129, SC16. 130, SC16 , .131, SC16 .132, SC16. 133, SC16. 134, SC16. 135, SC16. 136, SC16 , .137, SC16 .138, SC16. 139, SC16. 140, SC16. 141, SC16. 142, SC16 , .143, SC16. 144 , SC16.147, SC16.148, SC16.149 y SC16.150. 104. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio EGF1 de DLL3. 105. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 104, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 106. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 105, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 107. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 106, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 108. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 107, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 109. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 108 que comprende además un conector. 110. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio EGF2 de DLL3. 111. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 110, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 112. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 111, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 113. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 112, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 114. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 113, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 115. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 114 que comprende además un conector. 116. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio EGF3 de DLL3. 117. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 116, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 118. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 117, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 119. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 118, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 120. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 119, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 121. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 120 que comprende además un conector. 122. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio EGF4 de DLL3. 123. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 122, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 124. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 123, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 125. El modulador de DLiL3 de conformidad con la reivindicación 124, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 126. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 125, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 127. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 126 que comprende además un conector. 128. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio EGF5 de DLL3. 129. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 128, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 130. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 129, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 131. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 130, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 132. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 131, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 133. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 132 que comprende además un conector. 134. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio EGF6 de DLL3. 135. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 134, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 136. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 135, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 137. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 136, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 138. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 137, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 139. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 138 que comprende además un conector. 140. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio DSL de DLL3. 141. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 140, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 142. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 141, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 143. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 142, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 144. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 143, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 145. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 144 que comprende además un conector. 146. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio aminoterminal de DLL3. 147. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 146, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 148. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 147, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 149. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 148, donde el modulador de DLL3 comprende un ADC. 150. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 149, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 151. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 150 que comprende además un conector. 152. Un modulador de DLL3 aislado que reside en una sección seleccionada del grupo constituido por la sección A, sección B, sección C, sección D, sección E, sección F, sección G, sección H y sección I. 153. Un modulador de DLL3 aislado que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado entre el grupo constituido por SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16 •7, SC16.8, SC16 .10, SC16 , .11, SC16.13 , SC16.15, SC16. .18, SC16 • 19, SC16. 20, SC16 .21, SC16 .22, SC16 .23, SC16. .25, SC16 .26, SC16. 29, SC16 .30, SC16 -31, SC16 -34, SC16. •35, SC16 .36, SC16. 38, SC16 • 39, SC16 •41, SC16 .42, SC16 .45, SC16 .47, SC16. 49, SC16 .50, SC16 .52, SC16 • 55, SC16. .56, SC16 .57, SC16. 58, SC16 .61, SC16 .62, SC16 .63, SC16 .65, SC16 .67, SC16. 68, SC16 .72, SC16 .73, SC16 -78, SC16 •79, SC16.80, SC16..81, SC16..84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16 .104, SC16 .105, SC16 .106, SC16 .107, SC16 .108, SC16 .109, SC16 .110, SC16 .111, SC16 .113, SC16 .114, SC16 .115, SC16 .116, SC16 .117, SC16 .118, SC16 .120, SC16 .121, SC16 .122, SC16 .123, SC16 .124, SC16 .125, SC16 .126, SC16 .129, SC16 .130, SC16 .131, SC16 .132, SC16 .133, SC16 .134, SC16 .135, SC16 .136, SC16 .137, SC16 .138, SC16 .139, SC16 .140, SC16 .141, SC16 .142, SC16 .143, SC16 .144, SC16. 147, SC16. 148, SC16.149 y SC16. 150. 154. Un conjugado de anticuerpo- fármaco de fórmula: M- [L-D] n o una sal farmacéuticamente aceptable de este, donde a) M comprende un modulador de DLL3 ; b) L comprende un conector opcional; c) D es un agente antiproliferativo; y d) n es un número entero comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20. 155. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 154, donde el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este . 156. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 155, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal . 157. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 156, donde el anticuerpo se deriva de un anticuerpo seleccionado entre el grupo constituido por SC16 • 3, SC16.4, SC16.5, SC16 .7, SC16.8 , SC16.10, SC16 • 11, SC16 • 13, SC16 .15, SC16 .18, SC16.19, SC16 .20, SC16 .21, SC16 .22, SC16 .23, SC16 .25, SC16.26, SC16 .29, SC16 .30, SC16 .31, SC16 • 34, SC16 • 35, SC16.36, SC16 .38, SC16 .39, SC16 • 41, SC16 .42, SC16 .45, SC16.47, SC16 • 49, SC16 .50, SC16 .52, SC16 .55, SC16 .56, SC16.57, SC16 .58, SC16 .61, SC16 .62, SC16 .63, SC16 .65, SC16.67, SC16 .68, SC16 .72, SC16 .73, SC16 .78, SC16 • 79, SC16.80, SC16 .81, SC16 .84, SC16 .88, SC16. 101, SC16. 103, SC16.104, SC16. 105, SC16. 106, SC16 .107, SC16 .108, SC16. ,109, SC16.110, SC16. 111, SC16. 113, SC16 .114, SC16 .115, SC16. ,116, SC16.117, SC16. 118, SC16. 120, SC16 .121, SC16 .122, SC16. 123, SC16.124, SC16. 125, SC16. 126, SC16 .129, SC16 .130, SC16. 131, SC16.132, SC16. 133, SC16. 134, SC16 .135, SC16 .136, SC16. 137, SC16.138, SC16. 139, SC16. 140, SC16 .141, SC16 .142, SC16. 143, SC16.144, SC16. 147, SC16. 148, SC16.149 y SC16.150. 158. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 157, donde el anticuerpo está humanizado. 159. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 154, donde el conector comprende un conector escindible. 160. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 159, donde el conector escindible comprende un conector peptidílico. 161. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 154, donde el agente antiproliterativo comprende un agente citotóxico. 162. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 161, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina . 163. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 162, donde la pirrolobenzodiazepina comprende un dímero de pirrolobenzodiazepina. 164. Un modulador de DLL3 que comprende una CDR de cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-203. 165. El modulador de DLL3 de conformidad con la reivindicación 164, donde el modulador comprende una pluralidad de CDR de cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-203. 166. Un modulador de DLL3 de tipo anticuerpo que compite por la unión a una proteína DLL3 con un anticuerpo de referencia seleccionado entre el grupo constituido por SC16 • 3, SC16.4 , SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16 ;.io, SC16. 11, SC16 • 13, SC16 • 15, SC16 .18, SC16. 19, SC16. 20, SC16. ,21, SC16 .22, SC16 .23, SC16 .25, SC16. 26, SC16. 29, SC16. .30, SC16 -31, SC16 .34, SC16 .35, SC16. 36, SC16. 38, SC16. 39, SC16 .41, SC16 .42, SC16 .45, SC16. 47, SC16. 49, SC16. .50, SC16 .52, SC16 • 55, SC16 .56, SC16. 57, SC16. 58, SC16. .61, SC16 .62, SC16 .63, SC16 .65, SC16. 67, SC16. 68, SC16. .72, SC16 • 73, SC16 .78, SC16 • 79, SC16. 80, SC16. 81, SC16. .84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16 .107, SC16. 108, SC16.109, SC16. , 110, SC16.111, SC16 .113, SC16 .114, SC16. 115, SC16.116, SC16. ,117, SC16.118, SC16 .120, SC16 .121, SC16. 122, SC16.123, SC16. 124, SC16.125, SC16 .126, SC16 .129, SC16. 130, SC16.131, SC16. 132, SC16.133, SC16 .134, SC16 .135, SC16. 136, SC16.137, SC16. 138, SC16.139, SC16 .140, SC16 .141, SC16. 142, SC16.143, SC16. 144, SC16.147, SC16 .148, SC16 .149 y SC16 .150, donde la unión del modulador de DLL3 de tipo anticuerpo a la proteína DLL3 se inhibe al menos un 30%. 167. Un modulador de DLL3 que se une a un epítopo de la proteína DLL3 que comprende los aminoácidos Q93, P94, G95, A96 y P97 (SEQ ID NO: 9) . 168. Un modulador de DLL3 que se une a un epítopo de la proteína DLL3 que comprende los aminoácidos G203, R205 y P206 (SEQ ID NO: 10) . Ejemplos La presente invención, tal como se ha descrito de forma general anteriormente en la presente, se sobreentenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo ilustrativo y no se pretende que limiten la presente invención. No se pretende que los ejemplos representen que los siguientes experimentos sean todos ni los únicos experimentos realizados. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión equivale o es próxima a la presión atmosférica. Ejemplo 1 Análisis de la expresión de marcadores en tumores seleccionados con características neuroendocrinas Los tumores neuroendocrinos (NET) que se originan en el sistema endocrino difuso son poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 cada 100 000 personas, pero son sumamente agresivos . Los tumores neuroendocrinos aparecen en las glándulas suprarrenales, riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , páncreas, tubo gastrointestinal (estómago y colon) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma neuroendocrino de células grandes y carcinoide) . Estos tumores pueden secretar varias hormonas, incluidas la serotonina y/o cromogranina A, que pueden provocar síntomas debilitantes conocidos como el síndrome carcinoide. Estos tumores se pueden detectar mediante marcadores inmunohistoquímicos positivos tales como la enolasa neuroespecífica (NSE, conocida también como enolasa gamma, símbolo génico = EN02), CD56/NCAM1 y sinaptofisina . Las quimioterapias tradicionales no han tenido éxito en el tratamiento de NET y la mortalidad debida a la dispersión metastásica es un resultado común. Desafortunadamente, en la mayoría de los casos, la cirugía es el único tratamiento curativo potencial, siempre que se lleve a cabo después de una detección temprana y antes de la metástasis tumoral . En este contexto, se han realizado estudios para identificar dianas terapéuticas novedosas asociadas con tumores que comprenden características neuroendocrinas. Con el fin de identificar y caracterizar los tumores como existen en pacientes que padecen cáncer, se desarrolló y mantuvo un gran banco de tumores de xenoinjerto no tradicionales (NTX) utilizando técnicas conocidas en la materia. El banco de tumores NTX, que comprende un número sustancial de líneas celulares de tumores discretas, se propagó en ratones inmunodeprimidos mediante múltiples pases de células tumorales heterogéneas obtenidas originalmente a partir de numerosos pacientes con cáncer que padecían diversas enfermedades malignas que generaban tumores sólidos. (Cabe destacar que en algunos de los Ejemplos y las FIGS. de la presente, el número de pases de la muestra evaluada se indica como p0-p# el cual se adjunta a la designación de la muestra, donde pO indica una muestra sin pases obtenida directamente a partir de un tumor del paciente y p# indica el número de veces que se ha realizado un pase del tumor por un ratón antes de la evaluación) . La disponibilidad continua de un gran número de líneas celulares de tumores NTX de los primeros pases discretas con linajes bien definidos facilita considerablemente la identificación y la caracterización de células purificadas a partir de las líneas celulares. En el estudio, el uso de líneas celulares NTX sometidas a un número mínimo de pases simplifica la experimentación in vivo y proporciona resultados fácilmente verificables . Es más, los tumores NTX de los primeros pases responden a agentes terapéuticos, tales como irinotecán (es decir, Camptosar®) y regímenes de cisplatino/etopósido, lo cual proporciona perspectivas relevantes desde un punto de vista clínico sobre los mecanismos subyacentes que estimulan el crecimiento tumoral, la resistencia a las terapias actuales y la recidiva tumoral. A medida que se fueron estableciendo las líneas celulares de tumores NTX, su fenotipo se caracterizó de diversas formas para examinar la expresión génica global. Para identificar qué líneas NTX en el banco pueden ser NET, se generaron perfiles de expresión génica mediante la secuenciación del transcriptoma completo y/o el análisis de micromatrices . Específicamente, los datos se examinaron para identificar tumores que expresaban niveles elevados de genes específicos que se sabe que son altos en NET o se utilizan como marcadores histoquímicos de la diferenciación neuroendocrina (p. ej . , ASCL1, NCAM1, CHGA) así como también tumores con cambios en los genes de la vía NOTCH indicativos de la supresión de la señalización de NOTCH (p. ej . , niveles reducidos de receptores NOTCH, y cambios en ligandos y moléculas efectoras) . Más particularmente, una vez que se establecieron diversas líneas celulares de tumores NTX tal como se realiza comúnmente para tumores humanos en ratones muy inmunodeprimidos , los tumores se extirparon cuando alcanzaron 800-2000 mm3, y las células se disociaron y dispersaron en suspensión utilizando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la materia (remítase, p. ej . , a la patente de EE . UU. N.° 2007/0292414 que se incorpora a la presente) . A continuación, se agotaron las células murinas de los preparados de células disociadas a partir de estas líneas NTX, y posteriormente se aislaron además subpoblaciones de células tumorales humanas por clasificación de células activadas por fluorescencia y se lisaron en tampón de lisis de ARN RLTplus (Qiagen) . Estos lisados se almacenaron posteriormente a -80 °C hasta su uso. Tras descongelar, se extrajo el ARN total utilizando un kit de aislamiento RNeasy (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific) y un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) de nuevo siguiendo los protocolos y los ajustes de los instrumentos recomendados por el fabricante. Los preparados del ARN total resultantes fueron adecuados para la secuenciación genética y el análisis de la expresión génica. Se realizó una secuenciación del transcriptoma entero utilizando el sistema de secuenciación de nueva generación SOLiD (secuenciación por ligamiento/detección de oligonucleótidos) 4.5 o SOLiD 5500x1 de la marca Applied Biosystems (ABI) (Life Technologies) en muestras de ARN de líneas TX. Se generó ADNc a partir de muestras de ARN total utilizando un protocolo de transcriptoma entero ( T, por sus siglas en inglés) modificado a partir de ABI diseñado para ARN total de bajo insumo o el sistema Ovation RNA-Seq V2™ (NuGEN Technologies Inc.). El protocolo WT de bajo insumo modificado utiliza 1.0 ng de ARN total para amplificar ARNm en el extremo 3' lo cual conduce a una fuerte distorsión en 3' de la expresión génica mapeada, mientras que el sistema de NuGen permite una amplificación más uniforme a lo largo de todo el transcrito, e incluye la amplificación de tanto ARNm como el ADNc trascrito no poliadenilado utilizando hexámeros aleatorios. La colección de ADNc se fragmentó y se añadieron adaptadores con códigos de barras para poder agrupar las colecciones de fragmentos de muestras diferentes. Las plataformas de secuenciación de nueva generación SOLiD 4.5 y SOLiD 5500x1 de ABI que permiten la secuenciación en paralelo de transcriptomas de múltiples líneas NTX y poblaciones clasificadas. Se construye una colección de ADNc a partir de cada muestra de ARN, la cual se fragmenta y se le asigna un código de barras. Los códigos de barras de cada colección de fragmentos permiten combinar múltiples muestras en concentraciones iguales y analizarlas garantizando la especificidad de cada muestra. Las muestras se extraen mediante emulsión de PCR utilizando el sistema robótico de microesferas SOLiD™ EZ Bead™ de ABI, que garantiza la consistencia de la muestra. La secuenciación de extremos apareados genera una lectura de 50 bases en la dirección de 5' a 3' y una lectura de 25 bases en la dirección de 3' a 5' para cada fragmento amplificado clonalmente en una única microesfera que existe en la combinación. En el caso de la plataforma 5500x1, para cada grupo de 8 muestras combinadas en el método mencionado anteriormente, se depositan microesferas uniformemente en 6 hileras de un único canal en un único chip. Esto generará, de media, más de 50 millones de lecturas de 50 bases y 50 millones de lecturas de 25 bases para cada una de las 8 muestras y genera una representación muy precisa del nivel de transcrito de AR m en las células tumorales . Los datos generados por la plataforma SOLiD mapearon 34 609 genes tal como anota la versión 47 de RefSeq utilizando la versión hgl9.2 de NCBI del genoma humano publicado y proporcionaron mediciones verificables de los niveles de ARN en la mayoría de las muestras. La plataforma SOLiD no solo es capaz de capturar la expresión, sino también los SNP, eventos de corte y empalme alternativos conocidos y no conocidos, ARN no codificantes pequeños y potencialmente descubrimientos de nuevos exones basándose únicamente en el alcance de la lectura (lecturas mapeadas especialmente para posiciones genómicas no anotadas previamente) . Por tanto, el uso de esta plataforma de secuenciación de nueva generación acompañada del análisis de datos registrados y el software de visualización permitió de este modo descubrir la expresión diferencial de transcritos así como también diferencias y/o preferencias por variantes de corte y empalme específicas de transcritos de ARNm expresados. Los datos de secuenciación de la plataforma SOLiD se representan nominalmente como un valor de la expresión de transcritos utilizando las cifras de RPM (siglas en inglés de lecturas por millón) y RPKM (siglas en ingles de lecturas por kilobase por millón) , lo cual permite el análisis básico de la expresión diferencial según la práctica estándar. La secuenciación del transcriptoma entero de cuatro tumores (LU73, LU64, LU86 y LU95) debidos al carcinoma de pulmón microcítico (SCLC) , un tumor ovárico (0V26) y un carcinoma neuroendocrino de células grandes (LCNEC; LU37) dio como resultado la determinación de los patrones de expresión génica que se encuentran normalmente en NET (FIG. 4A) . Más específicamente, estos tumores presentaron una alta expresión de varios marcadores de NET (ASCL1, NCAM1, CHGA) así como también unos niveles reducidos de receptores Notch y moléculas efectoras (p. ej . , HES1, HEY1) , y una alta expresión de marcadores de la supresión de Notch (p. ej . , DLL3 y HES6) . En cambio, 4 muestras de un pulmón normal, 3 tumores debido a un adenocarcinoma de pulmón (LU137, LU146 y LU153) y 3 carcinomas de pulmón escamocelulares (LU49, LU70 y LU76) presentan todos ellos la expresión de varios receptores Notch y moléculas efectoras, y no muestran una alta expresión de supresores de Notch tales como HES6 y DLL3. Tras identificar qué NTX en el banco de tumores son NET, se analizó cada uno utilizando datos de la secuenciación del transcriptoma entero para encontrar dianas terapéuticas potenciales cuya expresión en NET sea alta en comparación con no son NET (incluidos LU_SCC, LU_Ad y pulmón normal) . Se detectó una alta expresión de DLL3 en tumores NET NTX, incluidos SCLC, LCNEC y OV26, en comparación con una expresión de baja a inexistente en líneas de pulmón normal, ovario normal, otro OV NTX, LU_Ad y LU_SCC NTX (FIG 4B) . La alta expresión de DLL3 en NET relativa a diversos tipos de tejido normal fue muy interesante, ya que se sabe que DLL3 es un supresor conocido de la señalización Notch. Teniendo esto en cuenta y en vista de los datos generados, se seleccionó DLL3 para su análisis más en profundidad como diana inmunoterapéutica potencial. Con el descubrimiento de que DLL3 puede resultar ser una diana viable para la modulación y el tratamiento de ciertos trastornos proliferativos , se realizaron estudios para determinar el patrón de expresión y los niveles de variantes de DLL3. Tal como se ha indicado anteriormente, existen dos variantes de corte y empalme conocidas de DLL3 que codifican proteínas que difieren únicamente en que la isoforma 1 tiene un extremo C intracelular extendido (FIG. 1E) . Más específicamente, la isoforma 2 es una proteína de 587 aminoácidos (FIG. ID; SEQ ID NO: 4) codificada por una variante de A m 2 (FIG. IB; SEQ ID NO: 2), que contiene los exones 8a y 8c, mientras que la isoforma 1 es una proteína de 618 aminoácidos (FIG. 1C; SEQ ID NO: 3) codificada por una variante de ARNm 1 (FIG. 1A; SEQ ID NO: 1) , que contiene el exón 8b. En la FIG. 1F se presenta un diagrama esquemático que ilustra el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) idéntico de la isoforma 1 y la isoforma 2. Nuevamente, utilizando los datos del transcriptoma entero obtenidos como se ha descrito anteriormente, se examinaron tumores NET seleccionados para determinar los patrones de expresión de los exones mencionados anteriormente que, por extensión, proporcionan el cociente de expresión de las dos isoformas. Tal como se muestra en la FIG. 5, se comprobó que aunque el cociente de expresión particular entre las dos isoformas puede variar en cierto modo, la expresión de la isoforma 1 fue predominante en cada tumor. A este respecto, es importante destacar que, tal como se ha descrito anteriormente, la expresión acumulativa de DLL3 (ambas isoformas) aumentó en cada uno de los tumores estudiados respecto a la de los tejidos normales. Por consiguiente, aunque los cocientes de las isoformas puedan ser indicativos de ciertos tipos de tumores y relevantes para la selección del modulador genotípico, no es un factor tan crítico en lo que respecta a las estrategias con moduladores fenotípicos. Es decir, debido a que la región ECD de ambas isoformas es idéntica, cabe esperar que un modulador fenotípico de la presente invención dirigido a la región ECD (p. ej . , un anticuerpo anti-DLL3) reaccione con cualquiera de las isoformas. Por tanto, la expresión absoluta de los niveles de ECD de DLL3 (independientemente de la isoforma) es el factor determinante de la efectividad de tales estrategias. Ej emplo 2 Análisis de micromatrices y por RT-PCR de la expresión génica en tumores NTX seleccionados con características neuroendocrinas Para intentar identificar NET adicionales en el banco de NTX mencionado anteriormente, aparte de para los que se dispone de datos del transcriptoma completo obtenidos por SOLiD, se examinó un grupo mayor de líneas NTX utilizando un análisis de micromatrices. Específicamente, se analizaron 2-6 \ig de muestras de ARN total derivadas de tumores enteros en 46 líneas NTX o de 2 tejidos normales utilizando una plataforma de micromatrices OneArray18 (Phalanx Biotech Group) , que contiene 29 187 sondas designadas contra 19 380 genes en el genoma humano. Más específicamente, se obtuvieron muestras de ARN (como se ha descrito en el Ejemplo 1) a partir de 46 tumores NTX enteros derivados de pacientes que comprendían cánceres colorrectales (CR) , melanoma (SK) , de riñon (KD) , pulmón (LU) , ováricos (OV) , de endometrio (EM) , mama (BR) , hígado (LIV) o pancreáticos (PA) . Se utilizaron tejidos colorrectales normales (NormCR) y de páncreas normal (NormPA) como controles. Aún más específicamente, se subclasificaron además los tumores de pulmón como carcinomas de pulmón microcíticos (SCLC) , cánceres escamocelulares (SCC) o carcinomas neuroendocrinos de células grandes (LCNEC) . Las muestras de ARN se analizaron por triplicado utilizando los protocolos del fabricante y los datos resultantes se analizaron utilizando prácticas estándar en la industria para normalizar y transformar los valores de intensidad medidos obtenidos para el gen en cuestión en cada muestra. Se utilizó un algoritmo de agrupación jerárquica de Pearson Spearman imparcial en el conjunto de paquetes de R/BioConductor denominado hclust.2 para crear un dendrograma micromatricial estándar para estas 48 muestras. Como se sabe en la técnica, R/BioConductor es un lenguaje de programación estadístico de código abierto de uso extendido entre los círculos académicos, financieros y la industria farmacéutica para el análisis de datos. Por lo general, los tumores se dispusieron y agruparon en función de sus patrones de expresión génica, intensidad de expresión, etc. Tal como se muestra en la FIG. 6A, el dendograma derivado de las 48 muestras y para todos los 19 380 genes, agrupó líneas NTX juntas en función de su tipo de tumor o tejido de origen. Varios tumores normalmente asociados con fenotipos neuroendocrinos se agruparon juntos en la rama señalada como (1) ; estos incluían cánceres de piel, numerosos cánceres de pulmón y otros NET. Resulta interesante que una subrama, señalada como (2) , mostró que dos cánceres de pulmón de células grandes con características neuroendocrinas (LU50. LCNEC y LU37. LCNEC) y un carcinoma de pulmón microcítico (LU102.SCLC) se agruparon con un tumor ovárico (OV26) y un tumor de riñon (KD66) (grupo C) , lo cual sugiere que estos últimos tumores también poseían fenotipos neuroendocrinos. Es más, la FIG. 6A muestra el grupo D que consiste en 3 tumores SCLC adicionales, y a su derecha se encuentra un grupo pequeño que contiene un SCLC NTX (LU100) adicional y un tumor de endometrio neuroendocrino (E 6) , cabe esperar que todos ellos posean algunas características neuroendocrinas según consta generalmente en la bibliografía y la experiencia patológica en el centro sanitario. El hecho de que el grupo G, constituido por carcinomas escamocelulares de pulmón, se pueda encontrar en una rama completamente diferente del dendrograma de la FIG. 6A indica que la agrupación no depende exclusivamente del órgano de origen del tumor . Una inspección más exhaustiva de una colección de marcadores génicos asociados con NET (FIG. 6B) muestra que se expresan en niveles elevados en tumores que forman parte de los grupos C y D, mientras que se expresan en niveles mínimos en tumores del grupo G (carcinoma escamocelular de pulmón) , lo cual sugiere que los grupos C y D representan NET o tumores con un fenotipo neuroendocrino. Más específicamente, los NET del grupo C expresan niveles elevados de ASCLl, CALCA, CHGA, SST y NKX2-1, mientras que los NET del grupo D expresan niveles elevados de CHGA, EN02 y NCAM1, y la expresión de estos genes de fenotipo neuroendocrino es la que es responsable en parte de la agrupación de estos tumores. Una característica interesante es la fuerte expresión de KIT en el grupo D, un gen cuya asociación con tumores neuroendocrinos ha sido descrita ocasionalmente, pero que se relaciona claramente con la oncogénesis en otros contextos. Esto contrasta con los tumores SCC del grupo G que carecen de una fuerte expresión de cualquiera de estos genes (FIG. 6B) . En lo que respecta a la señalización de Notch, los tumores del grupo C muestran un fenotipo consonante con una reducción en la señalización Notch: una falta de expresión de cualquier receptor Notch, una falta relativa de expresión de JAG1 y HES1, y niveles elevados de expresión de ASCLl (FIG. 6C) . Resulta interesante que el grupo D muestre una alta expresión de HES6 , un factor de transcripción que puede estimular la actividad de ASCLl al antagonizar la actividad de HES1 mediante la formación de heterodímeros . Es más importante aún el hecho de que estos datos micromatriciales muestren niveles elevados de transcripción de DLL3 en tumores de los grupos C y D (relativos al grupo G) , lo cual sugiere que, en estos tipos de tumores, DLL3 proporciona una diana terapéutica atractiva para el tratamiento de NET. En vista de los resultados mencionados anteriormente, se examinó la expresión de ARNm de HES6 procedente de diversas líneas NTX y tejidos normales utilizando un equipo 7900HT de Applied Biosystems (Life Technologies) para realizar una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) a tiempo real Taqman de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se aisló ARN como se ha descrito anteriormente y se chequeó para comprobar que su calidad era adecuada para el análisis de la expresión génica. Se compró ARN de tejidos normales (Agilent Technologies y Life Technologies) . Se utilizaron 200 ng de ARN para sintetizar ADNc utilizando el kit de archivo de ADNc (Life Technologies) . El ADNc se utilizó para el análisis de qRT-PCR en matrices de baja densidad de Taqman (TLDA; Life Technologies) que contenían el ensayo Taqman de HES6 para medir los niveles de ARNm de HES6. Se muestran los niveles de ARNm de HES6 para cada muestra de las líneas NTX o tejidos normales (un punto en la gráfica) después de la normalización respecto a controles endógenos. Los valores normalizados se representan gráficamente en relación con la expresión media en los tejidos normales de interés para la toxicidad (NormTox) . Esta técnica permitió identificar y caracterizar rápidamente diversos tumores con características neuroendocrinas a partir del banco de tumores NTX mediante la medición de HES6 y otros marcadores relevantes. La FIG. 6D ilustra la sobreexpresión general de HES6 en los tumores con características neuroendocrinas a partir de los cuales se extrajeron muestras (p. ej . , LU-SCLC, LU-LCNEC) en comparación con tejidos normales, tumores de mama, colon, hígado y otros tumores seleccionados. Es significativo que estos datos micromatriciales y de qPCR muestren que al menos algunos tumores de endometrio, riñon y ováricos pueden exhibir características tumorales neuroendocrinas (FIGS. 6A y 6D) . Ejemplo 3 Análisis por RT-PCR de DLL3 en tumores con características neuroendocrinas Para confirmar los datos micromatriciales y de SOLiD generados, y para extender el análisis a muestras de NTX adicionales, se analizó la expresión de ARNm de DLL3 por qRT-PCR utilizando muestras de ARN de diversas líneas NTX, biopsias primarias y tejidos normales. El análisis se llevó a cabo de nuevo utilizando un equipo 7900HT de Applied Biosystems (Life Technologies) , sustancialmente como se describe justo antes, pero optimizado para la detección de DLL3. Se muestra la expresión de DLL3 relativa a la expresión media en tejidos normales y normalizada respecto a la expresión del gen de control endógeno ALASl. Como se observa en la FIG. 7, el análisis por qRT-PCR de la expresión génica mostró que el ARNm de DLL3 aumenta más de 10 000 000 veces en poblaciones NET en comparación con tejidos normales. En este Ejemplo, los tumores a partir de los cuales se extraen muestras incluyen líneas SCLC NTX adicionales aparte de las evaluadas previamente así como también varias muestras de ARN derivadas de biopsias primarias (pO) . De forma conjunta, estos datos demuestran que la expresión génica de DLL3 aumenta de forma drástica en tumores que exhiben características neuroendocrinas y, dado que se observa el mismo patrón en muestras de biopsias primarias, el aumento observado no es una consecuencia de los tumores humanos en fase de crecimiento en ratones. Además, también se representan tres subtipos de NSCLC como se define por la patología clínica en la FIG. 7: LU25 es un carcinoma de pulmón de células fusiformes, LU50 es un carcinoma neuroendocrino de células grandes (LCNEC) y LU85 es un carcinoma escamocelular (SCC) . La mayor expresión de DLL3 se observó en el tumor LCNEC LU50, aunque también se detectaron niveles elevados en los tumores de células fusiformes y SCC. KDY66 y OV26, un tumor de riñon y de ovario, respectivamente, se agruparon en la micromatriz con tumores SCLC y LCNEC (FIG. 6A) , lo cual sugiere que constituyen tumores con características neuroendocrinas (es decir, ET o pNET) . Esta conclusión se corroboró por los niveles elevados de ARNm de DLL3 observados en muestras de ambos tumores (FIG. 7) . A pesar de que todos los tumores presentan un aumento drástico de la expresión de ARNm de DLL3 en comparación con los tejidos normales (FIG. 7), la comparación de los tumores que se encuentran en las dos FIGS. 6A y 7 muestra que las sutiles diferencias en la expresión de ARNm de DLL3 medida en la FIG. 7 corresponden a la agrupación diferencial de la FIG. 6A; p. ej . , el grupo C contiene KD66, LU50, OV26 y LU102, que se encuentran entre los valores superiores de la expresión de DLL3 como se muestra en la FIG 7, mientras que LU85 y LU100, cada uno de los cuales se agrupa independientemente de los grupos C y D en la FIG. 6A, se encuentran entre los valores inferiores de la expresión de DLL3 para las muestras tumorales medidas. Los tumores debidos a un carcinoma de pulmón microcítico del grupo D de la FIG. 6A (p. ej . , LU86, LU64 y LU95) muestran niveles intermedios de expresión de ARNm de DLL3 , y es muy probable que sean sensibles al tratamiento con los moduladores de la presente invención. Ejemplo 4 Expresión de ARNm de DLL3 y proteína en varias muestras tumorales Para extender el análisis de la expresión de DLL3 a un rango más amplio de muestras tumorales, se realizó una qRT-PCR Taqman sustancialmente como se describe en los Ejemplos anteriores en una matriz de 384 pocilios TissueScan" qPCR (Origene Technologies) . Esta matriz permite comparar la expresión génica de 18 de tipos de tumores sólidos diferentes, con muestras derivadas de múltiples pacientes para cada tipo de tumor y de tejido adyacente normal. A este respecto, las FIGS . 8A y 8B muestran los niveles de expresión génica relativa y absoluta, respectivamente, de DLL3 en muestras de tumores enteros (puntos grises) o tejido adyacente normal (NAT; puntos blancos) de pacientes con uno de los 18 tipos de tumores sólidos diferentes. Los datos están normalizados en la FIG. 8A frente a la expresión génica media en NAT para cada tipo de tumor analizado. A las muestras en las que no se detectó DLL3 se les asignó un valor Ct de 50, el cual representa el último ciclo de amplificación en el protocolo experimental . Cada punto representa una única muestra de tejido, representándose el valor de la media geométrica como una línea negra. Utilizando esta matriz Origene TissueScan, se observó sobreexpresión de DLL3 en un subgrupo de cánceres suprarrenales, de mama, cuello uterino, endometrio, pulmón, ováricos, pancreáticos, de la tiroides y de vejiga, muchos de los cuales representan NET o tumores con fenotipos neuroendocrinos muy poco diferenciados. Un subgrupo de tumores de pulmón mostraron la mayor sobreexpresión de DLL3. La mayor expresión se observó en dos tumores LCNEC en la matriz. Tal como muestra la expresión génica absoluta en la FIG. 8B, el testículo normal es el único tejido normal con una alta expresión de DLL3. Esto sugiere que la expresión de DLL3 en NET y otras células tumorigénicas puede desempeñar una función en la tumorigénesis y/o el avance tumoral en una amplia variedad de tumores. Dados los elevados niveles de transcrito de DLL3 asociados con varios tumores, se realizaron estudios para demostrar el correspondiente aumento en la expresión de la proteina DLL3 en NET en comparación con otros tumores. Con este fin, se desarrolló un ELISA sándwich para DLL3 utilizando la plataforma de descubrimiento de MSD (Meso Scale Discovery, LLC) para detectar y cuantificar la expresión de DLL3 en muestras de tumores NTX seleccionadas. Resumiendo, se lisaron muestras de tumores NTX, y se midieron tanto la concentración proteica total como la concentración de la proteína DLL3 en los lisados utilizando una detección electroquimioluminiscente basada en el formato ELISA sándwich. Más específicamente, se interpolaron las concentraciones de DLL3 de las muestras a partir de los valores de electroquimioluminiscencia utilizando una curva estándar generada a partir de la proteína recombinante purificada y se expresan en la FIG. 8C como nanogramos de DLL3 por miligramo de proteína total. Más específicamente, se extirparon tumores NTX de ratones y se congelaron rápidamente en hielo seco/etanol. Se añadió tampón para la extracción de proteínas (Biochain Institute, Inc.) a los trozos del tumor descongelados y los tumores se pulverizaron utilizando un sistema lisador de tejidos (Qiagen) . Los lisados se separaron por centrifugación (20 000 g, 20 minutos, 4 °C) y se cuantificó la proteína utilizando ácido bicincóninico (BCA) . Los lisados proteicos se conservaron a -80 °C hasta su ensayo. Se recubrieron placas de MSD estándar (Meso Scale Discovery, LLC) durante la noche a 4 °C con 30 µL del anticuerpo SC16.34 (obtenido como se expone más adelante en el Ejemplo 7) con una concentración de 2 ug/mL en PBS . Las placas se lavaron con PBST y se bloquearon con 150 uL de solución de bloqueador A de MSD al 3% durante 1 hora. Las placas se lavaron de nuevo con PBST. Se conjugaron 25 µL del anticuerpo SC16.4 (obtenido como se expone más adelante en el Ejemplo 7) con el sulfomarcador de MSD y se añadieron a las placas lavadas en una concentración de 0.5 ug/mL en bloqueador A de MSD al 1%. También se añadieron 25 ]il¡ de lisado diluido lOx en bloqueador A de MSD al 1% o patrón de DLL3 recombinante diluido en serie en bloqueador A de MSD al 1% que contenía un 10% de tampón para la extracción de proteínas a los pocilios y se incubaron durante 2 horas. Las placas se lavaron con PBST. Se diluyó tampón de lectura T de MSD con surfactante hasta IX en agua y se añadieron 150 ih a cada pocilio. Las placas se leyeron en un lector Sector Imager 2400 de MSD que utiliza un programa de análisis informático integrado para derivar las concentraciones de DLL3 en las muestras NTX por interpolación. Posteriormente, los valores se dividieron por la concentración de proteína total para obtener los nanogramos de DLL3 por miligramo de proteína total en el lisado. Las concentraciones resultantes se exponen en la FIG. 8C en la que cada punto representa concentraciones derivadas de una única línea tumoral NTX. Aunque cada punto se derive de una única línea NTX, en la mayoría de los casos se evaluaron múltiples muestras biológicas de la misma línea NTX y se calculó la media de los valores para proporcionar el dato puntual. En cualquier caso, la FIG. 8C muestra que la mayor expresión de DLL3 se detectó en SCLC, LCNEC, así como también en otros tumores neuroendocrinos incluidas muestras renales seleccionadas y un único tumor ovárico. La FIG. 8C también demuestra que ciertas líneas NTX de melanoma exhibían una expresión de la proteína DLL3 elevada lo cual es particularmente interesante ya que estas líneas NTX también se agruparon cerca de las líneas NET NTX en el análisis micromatricial realizado en el Ejemplo 4 (FIG. 6A) . Estos datos, combinados con los datos de la transcripción para la expresión de DLL3 expuestos anteriormente, respaldan firmemente la teoría de que los determinantes de DLL3 proporcionan dianas atractivas para la intervención terapéutica. Ejemplo 5 Expresión de receptores NOTCH y ligandos de tipo Delta en la superficie celular de líneas tumorales NTX seleccionadas Para extender aún más las observaciones de los Ejemplos 1 y 2 anteriores, se analizaron células aisladas de diversos tumores NTX pertenecientes a los grupos C y D (KDY66, OV26, LU64; FIG 6A) así como también un tumor SCLC cuya expresión de DLL3 se determinó que era alta mediante secuenciación SOLiD o qRT-PCR (LU73, FIGS . 4 y 7) por citometría de flujo para determinar los niveles de expresión proteica para varios receptores Notch y otros miembros de la familia DLL. En general, los datos de expresión proteica basados en citometría de flujo se generaron utilizando un FACSCanto II (BD Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos de la FIG. 9 muestran células tumorales individuales representadas como histogramas, donde la tinción de fondo de anticuerpos de control isotípico se muestra en los histogramas de color gris uniforme y la expresión de la proteína de interés, según se determinó utilizando anticuerpos comercializados, es representada por la línea negra gruesa. Como se puede observar gráficamente en la FIG. 9, no se observó nada o prácticamente nada de expresión de ninguno de los receptores Notch (p. ej . , N0TCH1-4) en ninguno de estos tumores, como determinó en comparación con la fluorescencia menos uno (FMO) de las células teñidas de control isotípico. Esto lo indican gráficamente los histogramas, así como también numéricamente las intensidades de fluorescencia media (MFI) presentadas para cada medición. De forma análoga, los dos cánceres de pulmón derivados de células NTX no mostraron expresión de DLLl ni DLL4. Se podría observar una ligera expresión de DLL4 solo (OV26) o se podrían observar DLLl y DLL4 (KDY66) para dos de los tumores. En general, estas observaciones confirman los resultados obtenidos y presentados en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, de que estos tipos de tumores no presentan nada o prácticamente nada de expresión de los componentes de la vía de señalización Notch, lo cual concuerda con la pérdida de señalización Notch en NET o tumores poco diferenciados con fenotipos neuroendocrinos . Ejemplo 6 Generación de moduladores anti-DLL3 Se produjeron moduladores de DLL3 en forma de anticuerpos murinos de acuerdo con los principios de la presente mediante la inoculación con DLL3-Fc humana recombinante o con DLL3-His humana (donde cada una comprende el ECD maduro de DLL3 que se expone en la FIG. 1C; SEQ ID NO: 3) en dos campañas de inmunización independientes. A este respecto, se inocularon tres razas de ratones (Balb/c, CD-1 y FVB) con DLL3 recombinante humana para proporcionar hibridomas que secreten moduladores de tipo anticuerpo monoclonal murino de alta afinidad. El constructo de fusión hDLL3-Fc se adquirió en Adipogen International (N.° de catálogo AG-40A-0113) , donde había sido purificado a partir del sobrenadante de células HEK 293 que sobreexpresaban DLL3-Fc según se describe en la ficha técnica del producto del fabricante. La proteína hDLL3-His recombinante se purificó a partir del sobrenadante de células CHOKl modificadas genéticamente para que sobreexpresen hDLL3-His. Se emulsionaron 10 g de inmunógeno hDLL3-Fc o hDLL3-His con un volumen equivalente de TITERMAX8 Gold (CytRx Corporation) o adyuvante de tipo alumbre y se utilizaron para inmunizar cada ratón. Las emulsiones resultantes se inyectaron posteriormente en tres ratones hembra (1 de cada: Balb/c, CD-1 y FVB) a través de la almohadilla de una de las patas . Se utilizaron ensayos ELISA en fase sólida para cribar el suero de los ratones para detectar los anticuerpos IgG de ratón específicos para la DLL3 humana. Una señal positiva superior al fondo indicaba la presencia de anticuerpos específicos para DLL3. Resumiendo, se recubrieron placas de 96 pocilios (VWR International, Cat . # 610744) con DLL3 -His recombinante en una concentración de 0.5 g/mL en tampón de recubrimiento para ELISA durante la noche. Tras lavar con PBS que contenía un 0.02% (v/v) de Tween 20, los pocilios se bloquearon con un 3% (p/v) de BSA en PBS, 200 µ?/???????, durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) . Se tituló el suero de ratón (1:100, 1:200, 1:400 y 1:800) y se añadió a las placas recubiertas con DLL3 en una concentración de 50 µ??/pocillo, y se incubaron a TA durante 1 hora. Las placas se lavaron y después se incubaron con 50 µ??/??????? de anticuerpos anti-IgG de ratón producidos en cabra marcados con HRP diluidos 1:10 000 en un 3% de BSA-PBS o un 2% de FCS en PBS durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron nuevamente y se añadieron 40 µL/pocillo de una solución del sustrato TMB (Thermo Scientific 34028) durante 15 minutos a TA. Tras el revelado, se añadió un volumen equivalente de H2S0 2 N para detener el revelado del sustrato y las placas se analizaron con un espectrofotómetro para una DO de 450. Los ratones inmunizados cuyo suero era positivo se sacrificaron y se extirparon sus ganglios linfáticos drenantes (poplíteos e inguinales, e ilíacos mediales si están inflamados) y se utilizaron como fuente de células productoras de anticuerpos. Una suspensión de un único tipo de linfocitos B (228.9xl06 linfocitos) se fusionó con células de mxeloma P3x63Ag8.653 no secretoras (ATCC #CRL-1580) en una proporción de 1:1 por electrofusión . La electrofusión se llevó a cabo utilizando el sistema BTX Hybrimmune , (BTX Harvard Apparatus) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras el procedimiento de fusión, las células se resuspendieron en medio de selección de hibridomas suplementado con azaserina (Sigma #A9666) , medio DMEM de alto contenido de glucosa con piruvato sódico (Cellgro cat#15-017-CM) que contenía un 15% de suero fetal Clone I (Hyclone) , un 10% de BM Condimed (Roche Applied Sciences) , L-glutamina 4 mM, 100 IU de penicilina-estreptomicina y 2-mercaptoetanol 50 µ?, y después se colocaron en tres frascos T225 en 90 mL de medio de selección por frasco. A continuación, los frascos se introdujeron en una incubadora humidificada a 37 °C que contenía un 5% de C02 y un 95% de aire durante 6-7 días. Después de seis a siete días de cultivo, la colección constituida por las células cultivadas a granel en los T225 se colocó en una concentración de 1 célula por pocilio en placas de 96 pocilios Falcon con fondo en forma de U utilizando el clasificador de células Aria I. Los hibridomas seleccionados se cultivaron posteriormente en 200 ih de medio de cultivo que contenía un 15% de suero fetal Clone I (Hyclone) , un 10% de BM-Condimed (Roche Applied Sciences) , piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 100 IU de penicilina-estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 µ? e hipoxantina 100 µ?. Las posibles células de la colección de hibridomas no utilizadas remanentes se congelaron para pruebas futuras de la colección. Después de diez a once días de cultivo, se analizó el sobrenadante de cada pocilio de las células que se encontraban en las placas para detectar anticuerpos reactivos con DLL3 mediante ensayos ELISA y FACS. Para el cribado por ELISA, se recubrieron placas de 96 pocilios con DLL3 humana desnaturalizada o lisados celulares de células 293 que sobreexpresaban DLL3 humana (obtenidos como se ha indicado anteriormente) en tampón de carbonato de sodio durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y se bloquearon con un 3% de BSA en PBS/Tween durante una hora a 37 °C y se utilizaron inmediatamente o se mantuvieron a 4 °C. El sobrenadante de hibridomas sin diluir se incubó en las placas durante una hora a TA. Las placas se lavaron y se sondearon con el anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con HRP, diluido con un factor de 1:10 000 en un 3% de BSA-PBS durante una hora a TA. A continuación, las placas se incubaron con solución de sustrato tal como se ha descrito anteriormente y se realizó una lectura para una DO de 450. Los pocilios que contenían inmunoglobulina que se unía preferentemente a la DLL3 humana, según se determinó por una señal superior al fondo, se transfirieron y se expandiero . Los pocilios con hibridomas positivos del cultivo que secretaban inmunoglobulina murina también se cribaron para detectar la especificidad para DLL3 humana y la reactividad cruzada con DLL3 murina, de rata y cinomologa utilizando un ensayo basado en citometría de flujo con células 293 modificadas genéticamente para que sobreexpresen proteínas DLL3 humanas (h293-hDLL3) , cinomólogas (h293-cDLL3) , de rata (h293-rDLL3) o murinas (h293-mDLL3) . Las células h293-hDLL3 se crearon mediante la transducción de células 293T utilizando un lentivirus generado a partir de un vector lentiviral bicistrónico comercial (Open Biosystems) que expresaba tanto hDLL3 como un marcador GFP. Las células h293-mDLL3 se crearon mediante la transducción de células 293T utilizando un vector lentiviral bicistrónico que expresaba tanto mDLL3 como un marcador RFP, construido como se indica a continuación. Se obtuvo un fragmento de ADN (FIG. 10A; SEQ ID NO: 5) que codificaba la proteína DLL3 murina madura (FIG. 10B; SEQ ID NO: 6) mediante la amplificación por PCR a partir de un constructo de DLL3 murina comercial (Origene) y se subclonó en dirección 31 respecto a una secuencia de péptido señal de IgG K modificada previamente en dirección 5' respecto al sitio de clonación múltiple de pCDH-EFl-MCS-IRES-RFP (System Biosciences) utilizando técnicas de clonación molecular estándar. De forma análoga, se crearon células h293-rDLL3 mediante la transducción de células 293T utilizando un vector lentiviral bicistrónico que expresaba tanto DLL3 de rata como un marcador GFP, construido por clonación de un fragmento de ADN sintético (Gene iz) que comprendía una secuencia con codones optimizados que codificaba la proteína DLL3 de rata madura (acceso NP 446118.1, residuos 25-589) en dirección 3' respecto a una secuencia de péptido señal de IgK modificada previamente en dirección 5' respecto al sitio de clonación múltiple de pCDH-EF1-MCS-IRES-GFP (System Biosciences) utilizando técnicas de clonación molecular estándar. Por último, se dedujo la secuencia de DLL3 cinomóloga (p. ej . , Macaca fascicularis) (cDLL3) utilizando la secuencia de DLL3 humana en BLAST frente a cóntigos aleatorios del genoma completo de Macaca fascicularis de acceso público y ensamblando las secuencias exónicas del gen cinomólogo con la suposición de que la estructura exónica se mantiene en el gen entre especies. Se utilizaron la amplificación por PCR y la secuenciación directa de los exones individuales 2-7 del ADN genómico cinomólogo (Zyagen) para confirmar que la secuencia deducida era correcta a lo largo de la región ECD de la proteína. La secuencia de ADN de cDLL3 (FIG.10C; SEQ ID NO: 7), que codificaba la proteína cDLL3 (FIG.10D; SEQ ID NO: 8), se fabricó sintéticamente (GeneWiz) y se subclonó en dirección 31 respecto a una secuencia de péptido señal de IgG K modificada previamente en dirección 51 respecto al sitio de clonación múltiple de pCDH-EFl-MCS-IRES-GFP (System Biosciences) utilizando técnicas de clonación molecular estándar. La transducción de células 293T con este vector produjo las células h293-cDLL3. Para los ensayos de citometría de flujo, se incubaron 50xl04 células h293 transducidas respectivamente con DLL3 humana, cinomóloga, de rata o murina durante 30 minutos con 25-100 µ?? de sobrenadante de hibridomas. Las células se lavaron con PBS/2% de FCS dos veces y después se incubaron con 50 µ? de un fragmento Fe de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra específico secundario conjugado con DyLight 649 diluido con un factor de 1:200 en PBS/2% de FCS. Después de incubar 15 minutos, las células se lavaron dos veces con PBS/2% de FCS y se resuspendieron en PBS/2% de FCS con DAPI y se analizaron por citometría de flujo utilizando un FACSCanto II siguiendo las instrucciones del fabricante. Los pocilios que contenían inmunoglobulina que se unía preferentemente a las células DLL3+ GFP+ se transfirieron y se expandieron. Los hibridomas clónicos específicos para hDLL3 resultantes se crioconservaron en medio de congelación CS-10 (Biolife Solutions) y se almacenaron en nitrógeno líquido. Los anticuerpos que se unían a las células h293-hDLL3, h293-cDLL3, h293-rDLL3 y/o h293-mDLL3 se consideraron anticuerpos con reactividad cruzada (remítase a la FIG. 12) . Sobre la base de este ensayo, todos los moduladores seleccionados que presentaron reactividad cruzada con el antígeno murino también presentaron reactividad cruzada con el antígeno de rata . Los ensayos ELISA y de citometría de flujo confirmaron que el anticuerpo purificado a partir de todos o la mayoría de estos hibridomas se unía a DLL3 de un modo dependiente de la concentración. Se realizó una fusión de cada campaña de inmunización y se sembró en 64 placas (6144 pocilios con una eficiencia de clonación de aproximadamente un 60-70%) . La campaña de inmunización y el cribado de hDLL3-Fc produjeron aproximadamente 90 anticuerpos murinos específicos para DLL3 humana, varios de los cuales presentaron reactividad cruzada con DLL3 murina. La campaña de inmunización de hDLL3-His produjo 50 anticuerpos murinos adicionales más específicos para DLL3 humana, varios de los cuales presentaron reactividad cruzada con DLL3 murina. Ejemplo 7 Secuenciación de moduladores de DLL3 murina Basándose en lo anterior, se seleccionaron varios anticuerpos monoclonales diferentes ilustrativos que se unían a DLL3 humana o células h293-hDLL3 inmovilizadas con una afinidad aparentemente alta para su secuenciación y posterior análisis. Tal como se muestra en forma tabular en las FIGS. 11A y 11B, el análisis de las secuencias de las regiones variables de la cadena ligera (FIG. 11A) y las regiones variables de la cadena pesada (FIG. 11B) de anticuerpos monoclonales seleccionados generados en el Ejemplo 6 confirmó que muchas poseían regiones determinantes de la complementariedad novedosas y habitualmente presentaban disposiciones VDJ novedosas. Cabe destacar que las regiones determinantes de la complementariedad expuestas en las FIGS. 11A y 11B se definen como en Chothia et al., mencionado anteriormente . Como primer paso en la secuenciación de moduladores ilustrativos, las células hibridómicas seleccionadas se lisaron en reactivo Trizol"1 (Trizol Plus RNA Purification System, Life Technologies) para preparar el ARN. A este respecto, se resuspendieron entre 104 y 105 células en 1 mL de Trizol, y se agitaron vigorosamente después de añadir 200 µ?? de cloroformo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos y la fase acuosa se transfirió a otro tubo de microcentrifugación en el que se introdujo un volumen equivalente de isopropanol. Los tubos se agitaron vigorosamente de nuevo y se dejaron incubar a TA durante 10 minutos antes de centrifugarlos a 4 °C durante 10 minutos. Las pelotillas de ARN resultantes se lavaron una vez con 1 mL de etanol al 70% y se secaron brevemente a TA antes de resuspenderlos en 40 ]ih de agua tratada con DEPC. La calidad de los preparados de ARN se determinó fraccionando 3 pL en un gel de agarosa al 1% antes de almacenarlos a -80 °C hasta su uso. Se amplificó la región variable de la cadena pesada de Ig de cada hibridoma utilizando una mezcla de cebadores 5 ' que comprendía treinta y dos cebadores de la secuencia líder específicos de ratón, diseñados para atacar el repertorio VH completo de ratón, combinados con un cebador Cy de ratón 3 ' específico para todos los isotipos de Ig de ratón. Se secuenció un fragmento de PCR de 400 bp de la VH desde ambos extremos utilizando los mismos cebadores de PCR. De forma análoga, se utilizó una mezcla de treinta y dos cebadores de la secuencia lider de VK 5' diseñados para amplificar cada una de las familias VK de ratón combinados con un único cebador inverso específico para la región constante kappa de ratón para amplificar y secuenciar la cadena ligera kappa. Los transcritos de VH y VL se amplificaron a partir de 100 ng de ARN total utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) . Se realizaron ocho reacciones RT-PCR en total para cada hibridoma: cuatro para la cadena ligera VK y cuatro para la cadena pesada V gamma (??) . Se utilizó el kit de RT-PCR de un paso para la amplificación (Qiagen) . Este kit proporciona una combinación de transcriptasas inversas Sensiscript y Omniscript, ADN-polimerasa HotStarTaq, mezcla d TP, tampón y Q-Solution, un aditivo novedoso que permite la amplificación eficiente de patrones "difíciles" (p. ej . , ricos en GC) . Se prepararon mezclas de reacción que incluían 3 pL de ARN, 0.5 de 100 µ? de cebadores de la cadena pesada o ligera kappa (sintetizados por encargo en IDT) , 5 uL de 5x tampón de RT-PCR, 1 µ?. de d TPs, 1 \ih de mezcla de enzimas que contenía transcriptasa inversa y ADN-polimerasa, y 0.4 µ?.. del inhibidor de ribonucleasa RNasin (1 unidad) . La mezcla de reacción contiene todos los reactivos requeridos tanto para la transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés) como para la PCR. Se fijó el programa del ciclador térmico para un paso de RT a 50 °C durante 30 minutos, 95 °C durante 15 minutos, seguido de 30 ciclos de PCR (95 °C durante 30 segundos, 48 °C durante 30 segundos, 72 °C durante un minuto) . Posteriormente, se realizó una incubación final a 72 °C durante 10 minutos. Para preparar los productos de PCR para la secuenciación directa del ADN, se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se eluyó el ADN de la columna de centrifugación utilizando 50 \il¡ de agua estéril y después se secuenció directamente a partir de ambas hebras. Los productos de PCR extraídos se secuenciaron directamente utilizando cebadores de las regiones V específicos. Las secuencias nucleotídicas se analizaron utilizando IMGT para identificar los miembros de los genes V, D y J de la línea germinal con la mayor homología secuencial. Las secuencias derivadas se compararon con secuencias de ADN de la línea germinal conocidas de las regiones V y J de Ig utilizando V-BASE2 (Retter et al., mencionado anteriormente) y mediante la alineación de los genes de VH y VL respecto a la base de datos de la línea germinal de ratón para proporcionar las secuencias indicadas que se exponen en las FIGS. 11A y 11B. Más específicamente, la FIG. 11A representa las secuencias de aminoácidos contiguas de noventa y dos regiones variables de la cadena ligera murina novedosas de anticuerpos anti-DLL3 (SEQ ID NOS: 20-202, números pares) y cinco regiones variables de la cadena ligera humanizada (SEQ ID NOS: 204-212, números pares) derivadas de cadenas ligeras murinas representativas. De forma análoga, la FIG. 11B representa las secuencias de aminoácidos contiguas de noventa y dos regiones variables de la cadena pesada murina novedosas (SEQ ID NOS: 21-203, números impares) de los mismos anticuerpos anti-DLL3 y cinco regiones variables de la cadena pesada humanizada (SEQ ID NOS: 205-213, números impares) de los mismos anticuerpos murinos que proporcionan las cadenas ligeras humanizadas. Así pues, de forma conjunta las FIGS. 11A y 11B proporcionan las secuencias indicadas de noventa y dos anticuerpos anti-DLL3 murinos operables (denominados SC16 , • 3, SC16.4 , SC16.5, SC16. .7, SC16.8, SC16 .10, SC16. .11, SC16 , • 13, SC16 .15, SC16 .18, SC16. .19, SC16. 20, SC16 , .21, SC16 , .22, SC16 .23, SC16 .25, SC16. .26, SC16. 29, SC16 , .30, SC16. .31, SC16 .34, SC16 .35, SC16. .36, SC16. 38, SC16 , .41, SC16 , .42, SC16 .45, SC16 ¦47, SC16. ¦ 49, SC16. 50, SC16 , .52, SC16. ¦55, SC16 .56, SC16 ¦ 57, SC16. .58, SC16. 61, SC16 , .62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16. 78, SC16 ¦ 79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16. 101, SC16 .103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16. 108, SC16 .109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16. 115, SC16 .116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16. 122, SC16 .123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16. 130, SC16 .131, SC16.132 , SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16. 136, SC16 .137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16. 142, SC16. 143, SC16.144 , SC16.147, SC16.148, SC16.149 y SC16. 150) y cinco anticuerpos humanizados (denominados hSC16 • 13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16. .56) . Cabe destacar que estas mismas denominaciones se pueden referir al clon que produce el anticuerpo en cuestión y, como tal, el uso de cualquier denominación se debe interpretar en el contexto de la exposición relacionada. A los efectos de la presente solicitud, las SEQ ID NOS de cada anticuerpo particular son secuenciales . Así pues, el mAb SC16.3 comprende las SEQ ID NOS: 20 y 21 para las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, respectivamente. A este respecto, SC16.4 comprende las SEQ ID NOS: 22 y 23, SC16.5 comprende las SEQ ID NOS: 24 y 25, y así sucesivamente. Además, en el listado de secuencias que se presenta junto con la presente se adjuntan las secuencias de ácido nucleico correspondientes para cada secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de las FIGS. 11A y 11B. En el listado de secuencias en cuestión, las secuencias de ácido nucleico incluidas comprenden SEQ ID NOS que son doscientas veces mayores que la secuencia de aminoácidos correspondiente (cadena ligera o pesada) . Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del mAb SC16.3 (es decir, las SEQ ID NOS: 20 y 21) constituyen las SEQ ID NOS: 220 y 221 en el listado de secuencias. A este respecto, las secuencias de ácido nucleico que codifican todas las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada descritas, incluidas aquellas que codifican los constructos humanizados, se numeran de forma similar y comprenden las SEQ ID NOS: 220-413. Ejemplo 8 Humanización de los moduladores de DLL3 Tal como se ha indicado anteriormente, cinco de los anticuerpos murinos del Ejemplo 7 se humanizaron utilizando injertos de regiones determinantes de la complementar iedad (CDR) . Se seleccionaron entramados humanos para las cadenas pesada y ligera en función de la similitud secuencial y estructural con respecto a genes de la línea germinal humana funcionales. A este respecto, la similitud estructural se evaluó comparando la estructura de CDR canónica de ratón con candidatos humanos con las mismas estructuras canónicas tal como se describe en Chothia et al. (mencionado anteriormente) . Más particularmente, se humanizaron anticuerpos SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 y SC16.56 murinos utilizando un método de injerto de CDR asistido por computadora (Abysis Datábase, UCL Business Pie.) y técnicas de ingeniería molecular estándar para proporcionar los moduladores hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16.56. Las regiones de entramado humano de las regiones variables se seleccionaron en función de su mayor homología secuencial respecto a la secuencia de entramado de ratón en cuestión y su estructura canónica. A efectos del análisis de humanización, la asignación de aminoácidos a cada uno de los dominios CDR se ajusta a la numeración de Kabat et al. (mencionado anteriormente) . Los procedimientos de ingeniería molecular se llevaron a cabo utilizando técnicas reconocidas en la materia. Con tal fin, se extrajo ARNm total de los hibridomas y se amplificó como se ha expuesto en el Ejemplo 7 justo antes. A partir de la información sobre las secuencias de nucleótidos, se obtuvieron datos referentes a los segmentos de los genes V, D y J de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos en cuestión. Basándose en los datos sobre las secuencias, se designaron conjuntos de cebadores nuevos específicos para la secuencia líder de la cadena ligera VK y VH de Ig de los anticuerpos para clonar el anticuerpo monoclonal recombinante . Subsecuentemente, las secuencias V-(D) -J se alinearon con secuencias de la línea germinal de Ig de ratón. Las disposiciones genéticas resultantes para cada uno de los cinco constructos humanizados se muestran justo a continuación en la Tabla 1. TABLA 1 Las secuencias representadas en la TABLA 1 corresponden a las secuencias de las cadenas pesada y ligera indicadas que se exponen en las FIGS . 11A y 11B para los clones en cuestión. Más específicamente, las entradas en la Tabla 1 anterior corresponden a las secuencias de las regiones contiguas expuestas en las SEQ ID NOS: 204 y 205 (hSC16.13), SEQ ID NOS: 206 y 207 (hSC16.15), SEQ ID NOS: 208 y 209 (hSC16.25), SEQ ID NOS: 210 y 211 (hSC16.34) y SEQ ID NOS: 212 y 213 (hSC16.56). Además, la TABLA 1 muestra que eran necesarios muy pocos cambios en el entramado para mantener las propiedades favorables de los moduladores de unión. A este respecto, no se realizó ningún cambio en el entramado ni ninguna retromutación en las regiones variables de la cadena pesada y solamente se realizaron dos modificaciones en el entramado en las regiones variables de la cadena ligera (es decir, 87F en hSC16.15 y hSC16.34) . Tras la humanización de todos los anticuerpos seleccionados mediante la inserción de injertos de CDR, se analizaron las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada resultantes para determinar su homología con respecto a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada aceptoras humanas y donantes murinas. Los resultados que se muestran justo a continuación en la Tabla 2 indican que los constructores humanizados exhibieron uniformemente una homología mayor con respecto a las secuencias aceptoras humanas que con respecto a las secuencias donantes murinas. Más en particular, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera murinas muestran un porcentaje de homología global similar al caso más semejante de los genes de la línea germinal humana (85%-93%) en comparación con la homología de los anticuerpos humanizados y las secuencias proteicas de los hibridomas donantes (74%-83%) . TABLA 2 Al realizar una evaluación y tal como se indicará más detalladamente más adelante, cada uno de los constructos humanizados exhibió características de unión favorables más o menos comparables con las que mostraban los anticuerpos originales murinos . Independientemente de que sean humanizados o murinos, una vez que se determinan las secuencias de ácido nucleico de las regiones variables, los anticuerpos de la presente invención se pueden expresar y aislar utilizando técnicas reconocidas en la materia. Con este fin, se clonaron fragmentos de ADN sintéticos de la región variable de la cadena pesada elegida (humanizada o murina) en un vector de expresión de IgGl humana. De forma análoga, el fragmento de ADN de la región variable de la cadena ligera (nuevamente humanizada o murina) se clonó en un vector de expresión de la cadena ligera humana. El anticuerpo seleccionado se expresó a continuación por cotransfección de los constructos de ácido nucleico de las cadenas pesada y ligera derivados en células CHO. Más particularmente, un método compatible de producción de anticuerpos comprendió la clonación direccional de genes de las regiones variables murinas o humanizadas (amplificados por PCR) en vectores de expresión de inmunoglobulina humana seleccionados. Todos los cebadores utilizados en la PCR específica para genes de Ig incluían sitios de restricción que permitieron la clonación directa en vectores de expresión que contenían regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera de IgGl humana. Resumiendo, los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación para PCR Qiaquick (Qiagen) , y después se digirieron con Agel y Xhol (para la cadena pesada) y Xmal y DralII (para la cadena ligera), respectivamente. Los productos de PCR digeridos se purificaron antes de su ligamiento en vectores de expresión. Las reacciones de ligamiento se llevaron a cabo en un volumen total de 10 yL con 200 U de ADN-ligasa T4 (New England Biolabs) , 7.5 yL de producto de PCR con especificidad génica purificado y digerido, y 25 ng de ADN vectorial linealizado. Se transformaron bacterias DH10B de E. coli competentes (Life Technologies) mediante choque térmico a 42 °C con 3 de producto de ligamiento y se colocaron sobre placas de ampicilina (100 yg/mL) . El fragmento Agel-EcoRI de la región VH se insertó a continuación en los mismos sitios del vector de expresión pEE6.4HuIgGl mientras que el inserto de VK Xmal-DralII sintético se clonó en los sitios Xmal-DralII del vector de expresión pEE12.4Hu-Kappa respectivo. Se generaron células que producían el anticuerpo seleccionado por transfección de células HEK 293 con los plásmidos adecuados utilizando 293fectina. A este respecto, se purificó ADN plasmídico con columnas de centrifugación QIAprep (Qiagen) . Se cultivaron células renales embrionarias humanas (HEK) 293T (N.° de ATCC CRL-11268) en placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) en condiciones estándar en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de FCS desactivado térmicamente, 100 µg/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina G (todos ellos de Life Technologies) . Para las transíecciones transitorias, se cultivaron células con una confluencia de un 80%. Se añadieron cantidades equivalentes de IgH y ADN vectorial de una cadena de IgL correspondiente (12.5 ig de cada) a 1.5 mL de Opti-MEM mezclados con 50 µ]-? de reactivo de transfeccion de HEK 293 en 1.5 mL de opti-MEM. La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y se distribuyó uniformemente en la placa de cultivo. Se recogió el sobrenadante tres días después de la transfeccion, se reemplazó con 20 mL de DMEM fresco suplementado con un 10% de PBS y se recogió de nuevo 6 días después de la transfeccion. Se eliminaron los residuos celulares del sobrenadante de cultivo mediante centrifugación a 800xg durante 10 min y se conservó a 4 °C. Se purificaron los anticuerpos humanizados y quiméricos recombinantes con microesferas de proteína G (GE Healthcare) y se almacenaron en condiciones adecuadas. Ejemplo 9 Características de los moduladores de DLL3 Se utilizaron varios métodos para analizar las características inmunoquímicas y de unión de moduladores de DLL3 seleccionados generados como se ha expuesto anteriormente. Específicamente, se caracterizaron una serie de moduladores de tipo anticuerpo según su afinidad, propiedades cinéticas, clasificación en secciones, lugar de unión y reactividad cruzada respecto al reconocimiento de antígenos humanos, cinomólogos, de rata y de ratón (es decir, utilizando las células y constructos del Ejemplo 6) mediante métodos reconocidos en la técnica que incluyen la citometría de flujo. Las afinidades y las constantes cinéticas kon y koff de los moduladores seleccionados se midieron utilizando un análisis de interferometría de biocapa con un instrumento ForteBio RED (ForteBio, Inc.) o una resonancia de plasmones superficiales utilizando un instrumento Biacore 2000, en cada caso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados de la caracterización se exponen de forma tabular en la FIG. 12, donde se puede observar que los moduladores seleccionados exhibieron en general unas afinidades relativamente altas en el rango nanomolar y, en muchos casos, presentaron reactividad cruzada. La FIG. 12 además enumera la sección del modulador determinada empíricamente así como también el dominio DLL3 al que se une el modulador en cuestión según se determinó utilizando la expresión de un fragmento antigénico mediada por levaduras tal como se describe más detalladamente justo a continuación en el Ejemplo 10. Además, la FIG. 12 incluye también la capacidad de los moduladores para mediar la muerte celular inducida citotóxicamente de una línea de tumor de riñon NTX (% de células vivas) determinada como se expone más adelante en el Ejemplo 12. Considerados conjuntamente, estos datos demuestran las propiedades de unión variadas de los moduladores descritos, así como también su potencial de empleo en un contexto farmacéutico. En lo que respecta a la clasificación en secciones de los anticuerpos, se utilizó un instrumento ForteBio RED siguiendo las instrucciones del fabricante para identificar los anticuerpos competitivos que se unían a la misma sección o a secciones diferentes. Resumiendo, se capturó un anticuerpo de referencia (Abl) en un chip de captura de anticuerpos anti-ratón, a continuación se utilizó una concentración elevada de anticuerpo no enlazante para bloquear el chip y se registró una línea de referencia. Posteriormente, la DLL3-Flag humana recombinante monomérica (Adipogen International) fue capturada por el anticuerpo específico (Abl) y la punta se sumergió en un pocilio con el mismo anticuerpo (Abl) como control o en un pocilio con un anticuerpo de prueba diferente (Ab2) . Cuando se observó una unión adicional con un nuevo anticuerpo, entonces se determinó que Abl y Ab2 pertenecían a secciones diferentes. Si no se producía ninguna unión adicional, lo cual se determinó comparando los niveles de unión con el control Abl, entonces se determinó que Ab2 pertenecía a la misma sección. Como se sabe en la técnica, este proceso se puede expandir para cribar grandes colecciones de anticuerpos únicos, utilizando una hilera entera de anticuerpos que representen secciones únicas en una placa de 96 pocilios. En el presente caso, este proceso de clasificación en secciones mostró que los anticuerpos cribados se unían a al menos nueve secciones diferentes (denominadas secciones A-I en la FIG. 12) en la proteína DLL3. Sobre la base del tamaño aparente del antígeno DLL3 (donde el ECD es de aproximadamente 56kD) y la resolución de la metodología de clasificación en secciones empleada, se cree que las nueve secciones identificadas representan la mayoría de las secciones presentes en el antígeno extracelular DLL3. Además de la evaluación de los moduladores ilustrativos que se ha expuesto anteriormente, se realizó una citometría de flujo para confirmar que los moduladores de tipo anticuerpo SC16 seleccionados se pueden asociar inmunoespecíficamente con DLL3 humana y para determinar si los mismos moduladores presentan reactividad cruzada con DLL3 cinomóloga, de rata y/o murina. Más en particular, los moduladores murinos ilustrativos se analizaron por citometría de flujo utilizando un FACSCanto II y células 293 que sobreexpresaban DLL3 murina, de rata, cinomóloga o humana (es decir, h293-hDLL3, h293-cDLL3, h293-rDLL3 y h293-mDLL3 que expresaban GFP) sustancialmente como se ha descrito en el Ejemplo 6 anterior. En algunos casos, los moduladores murinos ilustrativos se analizaron por citometría de flujo utilizando un FACSCanto II y células de levadura que presentan DLL3 cinomóloga utilizando los métodos descritos por Cochran et al. (J Immunol Methods . 287 (1-2) : 147-158 (2004). Basándose en la citometría de flujo, se comprobó que todos los moduladores de tipo anticuerpo seleccionados se unían a DLL3 humana sobreexpresada en células 293 (no se muestran los datos) mientras que se comprobó que varios de los anticuerpos evaluados presentaban reactividad cruzada con DLL3 cinomóloga y/o murina (todos los anticuerpos que reaccionaron con la proteína de ratón también reaccionaron con la de rata) . A este respecto y tal como se enumera en la FIG. 12, se comprobó que ocho de los trece moduladores que reaccionan inmunoespecíficamente con DLL3 humana también reaccionan con DLL3 murina (o de rata) . Se descubrió que específicamente los mAb SC16.4, SC16.8, SC16.15, SC16.34, SC16.39, SC16.46, SC16.51 y SC16.56 presentaban reactividad cruzada con DLL3 murina en mayor o menor medida mientras que los mAb SC16.7, SC16.10, SC16.13, SC16.25 y SC16.65 no se asociaron de forma apreciable con DLL3 murina. No cabía esperar estos resultados ya que la DLL3 murina tiene una homología de aproximadamente un 83% con la isoforma 2 de la DLL3 humana (remítase a la FIG. 2B) . Se apreciará que esta reactividad cruzada se puede aprovechar convenientemente en el contexto de la presente invención mediante el uso de modelos animales en el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Aparte de los ensayos mencionados anteriormente, se analizaron constructos humanizados hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16.56 del Ejemplo 8 para determinar si el proceso de injerto de CDR había alterado de forma apreciable sus características de unión. A este respecto, los constructos humanizados (con injertos de COR) se compararon con anticuerpos quiméricos "tradicionales" que comprendían los dominios variables de las cadenas pesada y ligera originales murinos (o donantes) y una región constante humana sustancialmente equivalente a la utilizada en los constructos humanizados. Se llevó a cabo una resonancia de plasmones superficiales (SPR) con estos constructos utilizando un Biacore 2000 (GE Healthcare) con el fin de identificar cualesquiera cambios sutiles en las constantes de velocidad provocados por el proceso de humanización. En las FIGS. 13A-13C se muestran resultados ilustrativos para uno de los moduladores evaluados (SC16.15) y un resumen tabular de los resultados para cada uno de los constructos humanizados y quiméricos. Basándose en una serie de concentraciones comprendidas entre 25 y 12.5 nM de antígeno DLL3 humano (generando las curvas de arriba a abajo en las FIGS. 13A y 13B para SC16.15) y utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1, la KD del anticuerpo SC16.15 que se unía al antígeno DLL3 humano se estimó que era 0.2 nM. Posteriormente, se realizaron experimentos similares con los otros constructos humanizados y constructos quiméricos (no se muestran los datos) para proporcionar los valores de afinidad que se exponen en la FIG. 13C. Estos resultados indican que el proceso de humanización no ejerció ningún efecto material sobre la afinidad de los moduladores. Ejemplo 10 Dominio y mapeo de los epítopos de los moduladores de DLL3 Para caracterizar y posicionar los epítopos con los que se asocian o unen los moduladores de tipo anticuerpo de DLL3 descritos, se realizó un mapeo de los epítopos a nivel de dominios utilizando una modificación del protocolo descrito por Cochran et al., 2004 (mencionado anteriormente). Resumiendo, se expresaron dominios individuales de DLL3 que comprendían secuencias de aminoácidos específicas en la superficie de una levadura y se determinó la unión de cada anticuerpo de DLL3 por citometría de flujo. Más específicamente, se crearon constructos plasmídicos de presentación en levaduras para la expresión de los siguientes constructos : dominio extracelular de DLL3 (aminoácidos 27-466); quimera DLL1-DLL3, que consiste en la región aminoterminal y el dominio DSL de DLL1 (aminoácidos 22-225) fusionado con los dominios 1-6 similares a EGF de DLL3 (aminoácidos 220-466); quimera DLL3-DLL1, que consiste en la región aminoterminal y el dominio DSL de DLL3 (aminoácidos 27-214) fusionado con los dominios 1-8 similares a EGF de DLL1 (aminoácidos 222-518) ; dominio #1 similar a EGF (aminoácidos 215-249) ; dominio #2 similar a EGF (aminoácidos 274-310); dominios #1 y #2 similares a EGF (aminoácidos 215-310) ; dominio #3 similar a EGF (aminoácidos 312-351) ; dominio #4 similar a EGF (aminoácidos 353-389) ; dominio #5 similar a EGF (aminoácidos 391-427) ; y dominio #6 similar a EGF (aminoácidos 429-465) . (Para consultar información sobre los dominios remítase en general a la entrada Q9NYJ7 de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot , la cual se incorpora a la presente por referencia. Cabe destacar que la numeración de los aminoácidos hace referencia a una proteína DLL3 sin procesar con una secuencia líder tal como la que se expone en la SEQ ID NO: 3) . Para analizar la región aminoterminal o los dominios EGF en conjunto, se utilizaron quimeras con el miembro de la familia DLL1 (DLL1-DLL3 y DLL3-DLL1) en vez de fragmentos para minimizar posibles problemas debidos al plegamiento de la proteína. Se había demostrado previamente que los anticuerpos con dominios mapeados no presentaban reactividad cruzada con DLL1, lo cual indica que cualquier unión de estos constructos se produjo por asociación con la porción DLL3 del constructo. Estos plásmidos se transformaron en levadura, que se cultivó posteriormente y se indujo tal como se describe en Cochran et al . Para evaluar la unión a un constructo particular, 200 000 células de levadura inducidas que expresaban el constructo deseado se lavaron dos veces en PBS + 1 mg/mL de BSA (PBSA) y se incubaron en 50 ih de PBSA con 0.1 ig/mL de clon 3F10 anti-HA biotinilado (Roche Diagnostics) y o bien anticuerpo purificado 50 nM o sobrenadante no purificado diluido con un factor de 1:2 procedente de hibridomas cultivados durante 7 días. Las células se incubaron durante 90 minutos sobre hielo y a continuación se lavaron dos veces en PBSA. Posteriormente, las células se incubaron en 50 µ?? de PBSA con los anticuerpos secundarios adecuados: para los anticuerpos murinos, se añadieron estreptavidina conjugada con Alexa 488 y un anticuerpo anti-ratón producido en cabra conjugado con Alexa 647 (ambos de Life Technologies) , con una concentración de 1 xg/mL de cada uno, y para los anticuerpos humanizados o quiméricos, se añadieron estreptavidina conjugada con Alexa 647 (Life Technologies) y un anticuerpo anti-humano producido en cabra conjugado con R-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch) , con una concentración de 1 g/mL de cada uno. Después de veinte minutos de incubación sobre hielo, las células se lavaron dos veces con PBSA y se analizaron en un FACS Canto II. Los anticuerpos que se unieron a la quimera DLL3-DLL1 se denominaron enlazantes a la región aminoterminal + DSL. Los anticuerpos que se unieron específicamente a un epítopo presente en un dominio similar a EGF particular se denominaron enlazantes a su dominio respectivo (FIG. 14A) . Para clasificar un epítopo como conformacional (p. ej . , discontinuo) o lineal, se trató con calor una levadura que presentaba el dominio extracelular de DLL3 durante 30 minutos a 80 °C y después se lavó dos veces con PBSA helada. A continuación las levaduras que presentaban antígeno desnaturalizado (levadura desnaturalizada) se sometieron al mismo protocolo de tinción y análisis de citometría de flujo descritos anteriormente. Los anticuerpos que se unieron tanto a la levadura desnaturalizada como a la nativa se clasificaron como de unión a un epítopo lineal, mientras que los anticuerpos que se unieron a la levadura nativa pero no se unieron a la levadura desnaturalizada se clasificaron como conformacionalmente específicos. En la FIG. 14A se presenta un resumen esquemático de los datos del mapeo de los epítopos a nivel de dominios de los anticuerpos evaluados, estando los anticuerpos que se unen a un epítopo lineal subrayados y, cuando se determine, la sección correspondiente indicada entre paréntesis. Una revisión de la FIG. 14A muestra que la mayoría de los moduladores tienden a mapearse con epítopos que se encuentran en la región aminoterminal/DSL de DLL3 o con el segundo dominio similar a EGF. Como se ha indicado anteriormente, la FIG. 12 presenta datos similares referentes a la determinación de las secciones y el mapeo de dominios para una serie de moduladores seleccionados en una forma tabular. Para documentar la capacidad de los moduladores descritos para eliminar de forma efectiva células tumorigénicas a pesar de unirse a regiones de DLL3 diferentes, se correlacionaron los datos sobre la aniquilación con la unión a dominios. Más en particular, la FIG. 14B muestra la aniquilación in vitro mediada por los moduladores de la línea KDY66 PDX (derivada como se expone más adelante en el Ejemplo 12) representada frente al dominio de unión del modulador seleccionado. Estos datos muestran que la aniquilación debida a los moduladores específicos para un dominio es en cierto modo variable según se midió utilizando este ensayo de aniquilación in vitro. Sin embargo, para los moduladores que son eficaces, se observa una tendencia interesante en la que la aniquilación máxima en cada dominio aumenta a medida que el epítopo se desplaza hacia el extremo N en la secuencia primaria. En particular, la eficiencia de aniquilación máxima mejora de EGF6 a EGF2 , y se estabiliza en el dominio aminoterminal , EGF1 y EGF2. Además, entre los anticuerpos evaluados en este ensayo, el mayor porcentaje de anticuerpos eficaces se unen al dominio aminoterminal . Esto sugiere que los moduladores que se asocian o unen con el dominio DSL o la región aminoterminal de DLL3 pueden que resulten particularmente eficaces como fármacos o como restos de direccionamiento para agentes citotóxicos. Además se realizó un mapeo detallado de los epítopos en anticuerpos seleccionados utilizando uno de dos métodos. El primer método empleó el kit de colección de péptidos de presentación en fagos Ph.D.-12 (New England Biolabs E8110S) que se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumiendo, el anticuerpo para el mapeo de los epítopos se recubrió durante la noche en una concentración de 50 µ9/p^ en 3 mL de solución de bicarbonato de sodio 0.1 M, pH 8, en un tubo Nunc MaxiSorp (Nunc) . El tubo se bloqueó con una solución al 3% de BSA en una solución de bicarbonato. A continuación, se permitió que se unieran 1011 fagos de insumo en PBS + 0.1% de Tween-20 y después se realizaron diez lavados consecutivos con Tween-20 al 0.1% para eliminar los fagos que no se hubieran enlazado. Los fagos remanentes se eluyeron con 1 mL de glicina 0.2 M durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación se neutralizaron con 150 µL de Tris-HCl 1 M a pH 9. Los fagos eluidos se amplificaron y se mezclaron nuevamente con 1011 fagos de insumo, utilizando Tween-20 al 0.5% durante los pasos de lavado para incrementar la rigurosidad de la selección. Se aisló ADN de 24 placas de los fagos eluidos procedentes de la segunda ronda, utilizando el kit de centrifugación Qiaprep 13 (Qiagen) , y se secuenció. La unión del fago clónico se confirmó utilizando un ensayo ELISA, en el cual se utilizó el anticuerpo mapeado o un anticuerpo de control como recubrimiento sobre una placa de ELISA, se bloqueó y se expuso a cada fago clónico. La unión del fago se detectó utilizando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) y la solución 1-Step Turbo TMB ELISA (Pierce) . Las secuencias peptídicas de fagos correspondientes a fagos de unión específica se alinearon utilizando el vector NTI (Life Technologies) frente a la secuencia peptídica del ECD del antígeno para determinar el epítopo de unión. Como alternativa, se utilizó un método de presentación en levaduras (Chao et al., Nat Protoc. 1(2): 755-768, 2007) para mapear los epítopos de anticuerpos seleccionados. Resumiendo, se generaron colecciones de mutantes del ECD de DLL3 con PCR propensa a errores utilizando los análogos nucleotídicos 8-oxo-2 ' desoxiguanosina-5 ' -trifosfato y 2'-desoxi-p-nucleósido-5 ' trifosfato (ambos de TriLink Bio) para una tasa de mutagénesis deseada de una mutación aminoacídica por clon. Estos se transformaron en un formato de presentación en levaduras. Utilizando la técnica descrita anteriormente para el mapeo a nivel de dominios, la colección se tiñó con el fin de determinar la unión del anticuerpo y HA en una concentración de 50 nM. Utilizando un FACS Aria (BD) , se seleccionaron los clones que exhibieron una pérdida de la unión en comparación con el ECD de DLL3 natural. Estos clones se volvieron a cultivar y se sometieron a otra ronda de selección por FACS para determinar la pérdida de la unión al anticuerpo diana. Se aislaron y se secuenciaron clones de ECD individuales utilizando el kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (Zymo Research) . Cuando fue necesario, las mutaciones se reformatearon como clones de ECD de un solo mutante utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Agilent) . A continuación, los clones de ECD individuales se cribaron para determinar si la pérdida de la unión era debida a una mutación en el epítopo o a una mutación que provocaba un plegamiento inadecuado. Las mutaciones en las que intervenían cisteína, prolina y codones de parada se descartaron automáticamente debido a la elevada probabilidad de que se tratara de una mutación que provocaría un plegamiento inadecuado. A continuación, los clones de ECD restantes se cribaron para determinar su unión a un anticuerpo no competitivo conformacionalmente específico. Se concluyó que los clones de ECD que habían perdido capacidad de unión a los anticuerpos no competitivos conformacionalmente específicos contenían mutaciones que provocaban un plegamiento inadecuado, mientras que los clones de ECD que conservaban una unión equivalente a la del ECD de DLL3 natural se plegaban de forma adecuada. Se concluyó que las mutaciones en los clones de ECD del último grupo se encontraban en el epítopo. Los resultados se enumeran justo a continuación en la TABLA 3. TABLA 3 Más en particular, en la TABLA 3 se proporciona un resumen de anticuerpos seleccionados con sus epítopos derivados que comprenden residuos aminoacídicos que intervienen en la unión del anticuerpo. A este respecto, los anticuerpos SC16.34 y SC16.56 interaccionan aparentemente con residuos aminoacídicos comunes lo cual concuerda con la información sobre la clasificación en secciones y los resultados del mapeo por dominios que se muestran en la FIG. 14A. Es más, se descubrió que SC16.23 interaccionaba con un epítopo contiguo diferente y se comprobó que no pertenecía a la misma sección que SC16.34 ni SC16.56. Cabe destacar que a efectos del listado de secuencias adjunto, la SEQ ID NO: 10 comprenderá un aminoácido marcador de la posición en la posición 204. Ejemplo 11 Detección basada en citometría de flujo de DLL3 en la superficie de células y tinción inmunohistoquímica de DLL3 en tumores Para confirmar la naturaleza inmunoespecífica de los moduladores descritos, se evaluaron moduladores de tipo anticuerpo SC16 ilustrativos utilizando citometría de flujo para determinar su capacidad para reconocer selectivamente líneas de células 293 modificadas genéticamente para que expresaran la proteína DLL3 en su superficie. A este respecto, se produjeron células que expresaban DLL3 como se ha indicado detalladamente en el Ejemplo 6, se expusieron a moduladores seleccionados y se examinaron por citometría de flujo como se ha descrito en la presente. Se emplearon controles de tinción isotípicos y de fluorescencia menos uno (FMO) para confirmar la especificidad de la tinción. Tal como demuestran los datos representativos que se muestran en la FIG. 15 para el modulador SC16.56, algunos de los anticuerpos SC16 (p. e . , SC16.56) presentaron una tinción fuerte de células 293-hDLL3 (FIG. 15B) y células 293-mDLL3 (FIG. 15C), pero no de células 293 parentales que no expresaban DLL3 (FIG. 15A) . Estos datos demuestran, por citometría de flujo, que los moduladores descritos reconocen inmunoespecíficamente DLL3 humana y en el caso de SC16.56, también DLL3 murina. Para confirmar estos descubrimientos y para demostrar que se podía detectar la expresión de DLL3 en células tumorales humanas, se evaluó la expresión de la proteína DLL3 en la superficie de tumores NTX seleccionados por citometría de flujo utilizando varios anticuerpos SC16 ilustrativos. A este respecto, en la FIG. 16 se exponen los datos para uno de estos anticuerpos, SC16.56, y tres tumores particulares, OV26, KDY66 y LU37. Más específicamente, se recolectaron, disociaron y tiñeron tumores NTX conjuntamente con los anticuerpos comercializados anti-CD45 de ratón, anti-H-2Kd de ratón, anti-EpCAM humana y los anticuerpos anti-DLL3 humana/de ratón (SC16.56) descritos anteriormente. De forma análoga a los experimentos de tinción de 293 descritos anteriormente, se emplearon controles de tinción isotípicos y de fluorescencia menos uno (FMO) para confirmar la ausencia de tinción no específica. Tal como se observa en la FIG. 16, la tinción anti-DLL3 fue superior en una fracción de las células tumorales NTX humanas, como indican el desplazamiento del perfil de fluorescencia hacia la derecha y cambios en los valores de la intensidad de fluorescencia media (MFI) para las líneas de células de tumor ovárico OV26 NTX (FIG. 16A) , de riñon KDY66 NTX (FIG. 16B) y de pulmón LU37 NTX (FIG. 16C) . Los tumores SCLC NTX también se tiñeron de una forma idéntica y presentaron de forma análoga una expresión positiva de DLL3 (no se muestran los datos) . Estos datos sugieren que la proteína DLL3 se expresa en la superficie de varios tumores NTX y, por consiguiente, puede ser modulada utilizando moduladores de tipo anticuerpo anti-DLL3. Para corroborar además la presencia de la proteína DLL3 y localizarla en la arquitectura tumoral, se realizó un estudio inmunohistoquímico (IHC) en tumores NTX derivados de un paciente humano, tejidos humanos normales y tumores SCLC primarios. Más específicamente, se realizó IHC en secciones de tejido embebidas en parafina y fijadas en formalina (FFPE) , utilizando un método de detección indirecto, que incluía un anticuerpo primario monoclonal murino anti-DLL3 (SC16.65), anticuerpos secundarios conjugados con biotina específicos de ratón, complejo de avidina/biotina acoplado a peroxidasa de rábano picante, amplificación de la señal de tiramida y detección de DAB (Nakene PK 1968; 16:557-60). Cuando se tiñeron tumores NTX derivados de un tumor de un paciente humano, se utilizó un paso de bloqueo de IgG de ratón para reducir la señal de fondo debida a la unión no específica. Primero se validó SC16.65 y se confirmó que era adecuado para IHC ya que mostraba tinción específica en células 293 que sobreexpresaban DLL3 , pero no en células 293 parentales que no expresaban DLL3 , y la tinción disminuía en células tratadas con horquillas dirigidas a DLL3 diseñadas y validadas para silenciar la expresión de la proteína DLL3 y su ARN (remítase al siguiente Ejemplo 14, no se muestran los datos) . IHC en un panel de tumores de xenoinjerto NTX mostró que DLL3 se encontraba tanto en la membrana como en el citoplasma de muchos tumores SCLC NTX y NET que previamente habían presentado un resultado positivo para ARNm de DLL3 (FIG. 16D) . La intensidad de tinción se puntuó de tinción nula (-) a una expresión alta (+++) anotando además el porcentaje de células positivas. La tinción de tejidos humanos normales no mostró expresión detectable de DLL3 (FIG. 16E) . Significativamente, la tinción de muestras de tumores SCLC primarios confirmó que 36/43 tumores fueron positivos para DLL3 (FIG. 16F) . También se realizó una tinción de cromagranina A (CHGA) para confirmar que los tumores eran realmente tumores SCLC. La mayoría de los tumores que carecían de DLL3 también carecieron de tinción de CHGA, lo cual indica la posibilidad de que estas secciones no contengan te ido tumoral o de que el tejido se haya visto comprometido durante su procesamiento. Dos tumores evaluados como positivos para DLL3 pero que fueron negativos para CHGA, eran ambos tumores SCLC en estadio avanzado (Illa) . Estos datos sugieren que DLL3 proporciona una diana terapéutica eficaz ya que por lo general no se expresa en tejidos humanos normales, pero está presente en la mayoría de los tumores SCLC. Ejemplo 12 Los moduladores de DLL3 facilitan el suministro de agentes citotóxicos Para determinar si los moduladores de tipo anticuerpo de DLL3 de la presente invención son capaces de mediar el suministro de un agente citotóxico a células vivas, se llevó a cabo un ensayo de aniquilación celular in vitro utilizando moduladores de tipo anticuerpo de DLL3 seleccionados aleatoriamente . Específicamente, se disociaron 2500 células/pocilio de KDY66 humano, un NET NTX que expresaba DLL3 endógena, en una suspensión de un único tipo de células y se colocaron en placas BD Primaria™ (BD Biosciences) en un medio exento de suero suplementado con factor de crecimiento como los conocidos en la técnica, un día antes de añadir los anticuerpos y la toxina. Se añadieron diferentes concentraciones de moduladores de DLL3 purificados, tales como los que se han descrito en los Ejemplos 6 y 7, y una concentración fija de 4 nM de un fragmento Fab de anticuerpo anti-IgG de ratón unido covalentemente a la toxina saporínica (Advanced Targeting Systems, #IT-48) a los cultivos durante siete días. Para la aniquilación en 293-hDLL3, se disociaron 500 células/pocilio en una suspensión de un único tipo de células y se coloraron en placas de cultivo tisular BD en DMEM con un 10% de FBS un día antes de añadir los anticuerpos y la toxina. Se añadieron dos concentraciones de varios moduladores de DLL3 y una concentración fija de 2 nM de un fragmento Fab de anticuerpo anti-IgG de ratón unido covalentemente a saporina a los cultivos durante tres días. La capacidad de los complejos de saporina para internalizar y aniquilar células se determinó enumerando los números de células viables utilizando Cell Titer Glo® (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los conteos de luminiscencia sin procesar utilizando cultivos que contenían células con el fragmento Fab y saporina se fijaron como valores de referencia del 100% y todos los demás conteos se calcularon de acuerdo con esto (denominados "RLU normalizados"). Utilizando este ensayo se demostró que un subconjunto de anticuerpos DLL3 evaluados en concentraciones de 500 y 50 pM aniquilaron células KDY66, así como también un subconjunto de anticuerpos evaluados en concentraciones de 250 y 25pM en células que sobreexpresan 293-hDLL3 (FIG. 17A) . Los controles isotípicos no afectaron a los conteos celulares tal como muestran las barras de IgG2a, IgG2b y MOPC a la izquierda del gráfico (FIG. 17A) . Se evaluó un subgrupo de moduladores de DLL3 que presentaron una aniquilación eficiente en el primer ensayo descrito anteriormente en dilución para determinar los valores de CE50 para la actividad. Dos de estos anticuerpos representativos, SC16.34 y SC16.15, se muestran en la FIG. 17B, en la cual se determinó que SC16.15 mostró una aniquilación eficiente de OV26, un tumor ovárico NET NTX, con una EC50 subpicomolar (p. ej . , 0.14 pM) en comparación con el perfil de aniquilación mostrado por SC16.34 (p. ej . , 5.7 pM) . Debido a que la saporina solo aniquila células al ser absorbida en el citoplasma donde inactiva los ribosomas, este ensayo también demuestra que la internalización se puede producir al unir el anticuerpo específico para DLL3 a la superficie celular, sin necesidad de reticulación ni dimerización adicional. En último lugar, se trató LU37 con SC16.15 humanizado conjugado con ADC1 o con un ADC1 de IgGl humanizado de control (conjugado al igual que justo a continuación en el Ejemplo 13) . Específicamente, se colocaron 2500 células LU37 NTX en cada pocilio de placas BD PrimariaTM (BD Biosciences) en un medio exento de suero suplementado con factor de crecimiento como los conocidos en la técnica, un día antes de añadir los anticuerpos conjugados. Se añadieron diferentes concentraciones de huIgGl-ADCl o hSC16.15-ADC a los cultivos durante siete días y se determinó la capacidad para aniquilar de los agentes citotóxicos enumerando los números de células (como se ha descrito anteriormente) . Utilizando este ensayo se demostró que hSC16.15-ADC1 aniquiló eficientemente LU37. En contraste con una concentración >1000 ng/mL del ADC de control necesaria para aniquilar el 50% de LU37, una concentración < 10 ng/mL de hSC16.15-ADC1 aniquiló el 50% de LU37 (FIG. 17C) . Ejemplo 13 Preparación de conjugados de anticuerpo de DLL3- fármaco Basándose en los resultados anteriores con la saporina y para demostrar además la versatilidad de la presente invención, se prepararon conjugados de anticuerpo anti-DLL3 y fármaco (DLL3-ADC) utilizando agentes citotóxicos unidos covalentemente . Más específicamente, se prepararon DLL3-ADC que comprendían un conector como los descritos en la presente o en referencias que se mencionan justo a continuación y dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) seleccionados que se enlazaron covalentemente a los moduladores descritos (remítase, p. ej . , a las patentes de EE . UU. N.os 2011/0256157 y 2012/0078028, y la patente de EE . UU. N.° 6.214.345, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) . Se sintetizaron combinaciones de fármaco PBD-conector y se purificaron utilizando técnicas reconocidas en la materia teniendo en cuenta las referencias citadas. Aunque se emplearon varios dímeros de PBD y conectores para fabricar las combinaciones de fármaco-conector seleccionadas, cada unidad conectora comprendía un resto maleimido terminal con un sulfhidrilo libre. Utilizando estos conectores, se prepararon conjugaciones mediante la reducción parcial del mAb con tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) , seguida de la reacción de los residuos de Cys reducidos con la carga útil del maleimido del conector. Más en particular, el modulador de tipo anticuerpo de DLL3 se reduj o con 1.3 mol de TCEP por mol de mAb durante 2 h a 37 °C en Tris HCl 25 mM a pH 7.5 y tampón de EDTA 5 mM. La reacción se dejó enfriar hasta 15 °C y se añadió la carga útil del conector en DMSO con una tasa de 2.7 mol/mol de mAb seguida de una cantidad adicional de DMSO hasta una concentración final del 6% (v/v) . Se dejó que la reacción siguiera su curso durante 1 hora. El fármaco-conector sin reaccionar se desactivó mediante la adición de un exceso de N-acetilcisteína . A continuación, el DLL3-ADC (o SC16-ADC) se purificó en una columna de intercambio iónico utilizando un sistema FPLC AKTA Explorer (G.E. Healthcare) para eliminar el anticuerpo de alto peso molecular agregado, el codisolvente y moléculas de bajo peso molecular. Posteriormente, el ADC eluido se sometió a un cambio de tampón por filtración de flujo tangencial (TFF) en tampón de formulación, a continuación se ajustó su concentración y se añadió un detergente. El ADC final se analizó para determinar la concentración proteica (midiendo UV) , la agregación (SEC) , la proporción de fármaco respecto a anticuerpo (DAR) por HPLC en fase inversa (RP) , la presencia de anticuerpo sin conjugar por HPLC con cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) , materiales no proteínicos por RP HPLC y la citotoxicidad in vitro utilizando una línea celular que expresaba DLL3. Utilizando el procedimiento mencionado anteriormente o una metodología sustancialmente similar, se generó una serie de ADC (es decir, M-[L-D]n) que comprendían diversos moduladores de DLL3 y dímeros de PBD, y se evaluaron en diversos modelos in vivo e in vitro. A los efectos de estos Ejemplos y la presente exposición, tales ADC se pueden denominar en general DLL3-ADC o SC16-ADC. Los ADC independientes se nombrarán de acuerdo con la denominación del anticuerpo (p. ej . , SC16.13) y del conector-agente citotóxico específico ADCl, ADC2 , etc. Así pues, los moduladores ilustrativos compatibles con la presente invención pueden comprender SC16.13-ADC1 o SC16.67-ADC2 donde ADCl y ADC2 representan los agentes citotóxicos diméricos PBD individuales (y opcionalmente un conector) . Ejemplo 14 Especificidad de la toxicidad mediada por el conjugado de anticuerpo anti-DLL3- fármaco Para demostrar que la toxicidad de los conjugados de anticuerpo anti -DLL3 - fármaco es específica para células que expresan DLL3 endógena, se realizaron experimentos para mostrar que células tumorales que se sabe que expresan DLL3 endógena no siguen siendo aniquiladas por SC16-ADC in vitro cuando se suprime la expresión de DLL3 silenciando la expresión de la proteína DLL3 y su ARNm utilizando ARN horquillado corto (ARNhc) . KDY66 es un xenoinjerto derivado de un paciente procedente de un carcinoma papilar de células renales que exhibe características neuroendocrinas y expresa la proteína DLL3 y su ARNm (p. ej . , remítase a la FIG. 7 y la FIG. 16B) . La expresión de DLL3 se redujo en células KDY66 por transducción con ARNhc dirigido a DLL3 humana lentiviral GIPZ (Thermo Fisher Scientific Inc.) que contenía un ARNhc anti-DLL3. Más específicamente, el vector lentiviral se generó mediante la transfección de células 293T con un plásmido lentiviral bicistrónico que expresaba ARNhc anti-DLL3 (DLL3HP2) o un ARNhc no silenciador de control (DLL3NSHP) en presencia de plásmidos de empaquetamiento viral. Las partículas lentivirales resultantes contenidas en el sobrenadante se concentraron y se recogieron por ultracentrifugación . Estas partículas se utilizaron posteriormente para transducir los cultivos de células KDY66 e introducir el ARNhc (es decir, DLL3HP2 o NSHP) , donde el ARNhc anti-DLL3 se une al ARNm de DLL3 endógena y lo ataca para destruirlo con el fin de prevenir así su traducción en forma de la proteína DLL3. Ambos constructos vectoriales contenían un módulo de expresión GFP independiente para la verificación de una transducción exitosa y la selección de células transducidas . Tras la transducción, se evaluó la expresión de DLL3 por citometría de flujo. Resumiendo, se marcó una muestra de una suspensión de un único tipo de células disociadas correspondiente a células transducidas con DLL3HP2 con un modulador de DLL3 (SC16.34) conjugado con Alexa Fluor 647 (Life Technologies) y se analizó en un citómetro de flujo FACS Canto II en condiciones estándar. Para demostrar una reducción de la expresión de la proteína DLL3 en la superficie de células transducidas por DLL3HP2, se comparó su intensidad de fluorescencia con la de una muestra preparada de un modo similar de células KDY66 DLL3NSHP teñidas con un anticuerpo de control no reactivo (647-IgGl) y células KDY66 DLL3NSHP teñidas con 647-DLL3. Se comprobó que las células DLL3NSHP . KDY66 exhibían una expresión de la proteína DLL3 sustancialmente equivalente a células KDY66 vírgenes (no se muestran los datos) . Tal como se observa en la FIG. 18A, la expresión en la superficie de la proteína DLL3 se redujo en células transducidas con DLL3HP2 en comparación con células vírgenes teñidas con el mismo anticuerpo marcado con AlexaFluor-647. Para examinar las consecuencias de la expresión de DLL3 sobre el crecimiento de tumores, se trasplantaron células transducidas con DLL3HP2 (DLL3") y células KDY66 vírgenes (DLL3+) en ratones inmunodeprimidos . A partir de la muestra preparada como se ha descrito anteriormente, se seleccionaron células GFP+ humanas vivas para recoger células que contenían el ARNhc anti-DLL3. En cohortes de cinco ratones se inyectaron (140 células/ratón) células DLL3HP2 o KDY66 vírgenes, y se monitorizó el crecimiento tumoral semanalmente . En cada cohorte, dos de los cinco receptores desarrollaron tumores. La formación de tumores en los dos receptores de DLL3HP2. KDY66 se retrasó aproximadamente 22 días en comparación con la formación de tumores en los dos receptores de KDY66 vírgenes (FIG. 18B) . Este retraso observado en el crecimiento sugiere que la expresión de DLL3 puede estar relacionada con el aumento o la aceleración de la formación de tumores ya que el silenciamiento de DLL3 afectó al crecimiento tumoral. Cuando alcanzaron el volumen adecuado para la aleatorización (~ 160 mm3) , se extirparon tumores DLL3HP2 KDY66 y tumores KDY66 vírgenes de ratones receptores, y se dispersaron en suspensiones de un único tipo de células. Se confirmó la reducción continua de la expresión de DLL3 (es decir, que la expresión de DLL3 no se inducía durante el crecimiento in vivó) en células DLL3HP2 en suspensiones de un único tipo de células por citometría de flujo tal como se ha descrito anteriormente. A este respecto, la FIG. 18C muestra que las células transducidas con DLL3HP2 cultivadas in vitro muestran una expresión reducida de la proteína DLL3 en comparación con células vírgenes cultivadas en condiciones similares. Utilizando técnicas bioquímicas estándar, se colocaron células KDY66 vírgenes o células DLL3HP2 KDY66 en placas de 96 pocilios y se cultivaron en medio exento de suero. Se añadió una serie de diluciones de conjugados de anticuerpo-fármaco de tipo hSC16.56 humanizado-ADC1 (SC16-ADC1) o IgG anti-hapteno humanizada-ADC1 (como control) producidos como se ha expuesto anteriormente a las células por triplicado. Después de 7 días de exposición al conjugado de anticuerpo-fármaco, se midió la cantidad de células vivas con una detección basada en la luminiscencia de ATP en los lisados celulares de cada pocilio (Cell Titer Glo, Promega) sustancialmente como se ha expuesto en el Ejemplo 12. Aunque se aniquilaron un 50% de las células KDY66 vírgenes con una dosis relativamente baja de SC16-ADC 13.27 pM, ninguna dosis de SC16-ADC1 fue capaz de aniquilar ni un 20% de las células DLL3HP2. KDY66 (FIGS. 18D y 18E) . Cabe destacar que la pérdida de expresión de la proteína DLL3 endógena provocó una pérdida total de la aniquilación in vitro por parte de SC16-ADC1. Esto demuestra que la citotoxicidad de hSC16-ADCl está dirigida específicamente a células que expresan DLL3 con poca o ninguna toxicidad no específica . Ejemplo 15 Los moduladores de DLL3 conjugados suprimen el crecimiento tumoral Basándose en los resultados mencionados anteriormente, se realizaron estudios para demostrar que los moduladores de DLL3 conjugados de la presente invención reducen y suprimen el crecimiento de tumores humanos que expresan DLL3 in vivo. A este respecto, se asociaron varios moduladores de tipo anticuerpo murinos seleccionados covalentemente con un agente citotóxico PBD y se evaluaron los ADC resultantes para demostrar su capacidad para suprimir el crecimiento de tumores NTX humanos en ratones inmunodeprimidos . Con este fin, se indujo el crecimiento de tumores NTX derivados de un paciente subcutáneamente en los costados de ratones receptores NOD/SCID hembra utilizando técnicas reconocidas en la materia. Se monitorizaron los volúmenes tumorales y los pesos de los ratones dos veces por semana. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 150-250 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento y se les inyectaron dosis indicadas de SC16-ADC2 o un IgGl anti-hapteno-ADC2 de control (cada uno producido sustancialmente como se ha descrito en el Ejemplo 13 anterior utilizando el dímero de PBD ADC2) por inyección intraperitoneal . Se administraron tres inyecciones iguales a los ratones, separadas de forma equitativa a lo largo de siete días. Tras el tratamiento, se monitarizaron los volúmenes tumorales y los pesos de los ratones hasta que los tumores superaron 800 mm3 o los ratones enfermaron. En todas las pruebas, los ratones tratados no exhibieron ningún efecto adverso para la salud aparte de los que se observan habitualmente en ratones NOD/SCID portadores de tumores inmunodeprimidos . La FIG. 19 muestra el efecto de los ADC descritos sobre el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores de pulmón diferentes que exhibían características neuroendocrinas (dos carcinomas de pulmón microcíticos y un carcinoma de pulmón de células grandes con características neuroendocrinas). A este respecto, el tratamiento de LU37, un carcinoma de pulmón neuroendocrino de células grandes, con tres moduladores ilustrativos (SC16.13, SC16.46 y SC16.67) conjugados con ADC2 provocó una supresión del crecimiento tumoral que duró al menos 20 días más en el caso de SC16.13-ADC2 y SC16.67-ADC2 (FIG. 19A) ; en cambio, aunque SC16.46 redujo moderadamente el crecimiento tumoral, exhibió menos actividad que otros moduladores evaluados. De forma análoga, el tratamiento de LU73, un carcinoma de pulmón microcítico, con cuatro moduladores ilustrativos (SC16.4, SC16.13, SC16.15 y SC16.46) produjo remisiones durables que duraron, en algunos casos, más de 120 días después del tratamiento (FIG. 19B) . Sin embargo, al igual que con los anticuerpos evaluados frente a LU37, los anticuerpos evaluados frente a LU73 variaron en cierto modo en la duración de la represión del tumor. Por último, el tratamiento de LU86, otro carcinoma de pulmón microcítico, con dos moduladores conjugados (SC16.46-ADC2 y SC16.67-ADC2 ) produjo una reducción del tumor con un periodo hasta que se produjo un avance de 40 días en un caso (SC16.67-ADC2; FIG. 19C) . Cabe destacar que en la FIG. 19C dos de las curvas se superponen sustancialmente (mIgGl-ADC2 y SC16.46-ADC2) y es difícil distinguirlas. La sorprendente capacidad de varios moduladores conjugados para ralentizar o suprimir de forma drástica el crecimiento tumoral in vivo durante periodos prolongados valida además el uso de DLL3 como diana terapéutica para el tratamiento de trastornos proliferativos . Ejemplo 16 Los moduladores DLL3-ADC humanizados suprimen el crecimiento tumoral Teniendo en cuenta los impresionantes resultados proporcionados por DLL3-ADC2, se realizaron otros experimentos para demostrar la eficacia de moduladores ADC humanizados ilustrativos en el tratamiento de diversos tipos de tumores (incluidos el cáncer ovárico, de pulmón y de riñon) in vivo. Específicamente, se conjugaron (a través de una unidad conectora) anticuerpos anti-DLL3 humanizados seleccionados (hSC16.13, hSC16.15, hSC16.34 y hSC16.56 producidos como se ha expuesto en el Ejemplo 8 anterior) con dos agentes citotóxicos PBD independientes (ADC1 y ADC2) tal como se ha descrito anteriormente y se administraron, con controles, a ratones inmunodeprimidos en los que se habían implantado tumores NTX como se ha expuesto en el Ejemplo anterior. En cada estudio, se monitarizaron los volúmenes tumorales y los pesos de los animales de control hasta que los tumores superaron 800 mm3 o los ratones enfermaron. Los resultados de estos experimentos se presentan en las FIGS . 20A-20F. Una revisión de las FIGS. 20A-20F muestra que se consiguieron una reducción del volumen tumoral y una remisión duradera en diversos tipos de tumores, algunos de los cuales exhibían características neuroendocrinas , después del tratamiento con 1 mg/kg de hSC16-ADC. Por ejemplo, los regímenes de tratamiento, en los que la administración se define con líneas verticales en las FIGS. en cuestión, produjeron eliminaciones completas y duraderas de masa tumoral en un carcinoma ovárico con características neuroendocrinas (OV26, hSC16.15-ADC2 , FIG . 20A) , un carcinoma papilar de células renales con características neuroendocrinas (KDY66, hSC16.3 -ADC1 , FIG. 20E) y tres carcinomas de pulmón microcíticos (LU86, hSC16.13-ADC1, FIG. 20B) , (LU64, hSC16.13-ADC1, FIG. 20C LU64, hSC16.13 -ADC2 + hSC16.13-ADC1, FIG. 20D) . En todos estos casos se observó la ausencia de recidiva tumoral durante más de 100 días y, en algunos casos, más de 225 días después del tratamiento cuando se realizó un seguimiento de los ratones durante un periodo prolongado. Además, el tratamiento con los moduladores descritos produjo una reducción del volumen tumoral y la supresión del crecimiento en un xenoinjerto de carcinoma renal de células claras que exhibía niveles altos de DLL3 utilizando una dosis más baja de 0.5 mg/kg (KDY27 , hSC16.56-ADC1, FIG. 20F) . Por último, cabe destacar que ciertos tumores recurrentes siguieron siendo sensibles a la toxicidad de hSC16-ADC. Ochenta días después del tratamiento inicial con SC16.13-ADC2 , se observó recidiva en LU64 (FIG. 20D) . El tratamiento de tumores recurrentes con hSC16.13 -ADC1 provocó una eliminación de masa tumoral observable que duró más de 100 días después del segundo tratamiento. Nuevamente, estos resultados demuestran la sorprendente versatilidad y aplicabilidad de los moduladores de la presente invención en el tratamiento de diversos trastornos proliferativos . Ejemplo 17 Reducción de la frecuencia de células madre cancerosas con conjugados de anticuerpo de DLL3- fármaco Como se muestra en los Ejemplos anteriores, los moduladores descritos son sumamente eficaces en la supresión del crecimiento tumoral, en particular en forma de ADC. Además, como se ha demostrado anteriormente, la expresión de DLL3 se asocia con células madre cancerosas que se sabe que en general son resistentes a fármacos e inducen la recidiva y la metástasis tumorales. Por consiguiente, para demostrar que el tratamiento con DLL3-ADC reduce la potencial recidiva de líneas NTX, se realizaron ensayos de dilución limitante (LDA) in vivo para determinar la frecuencia de las células iniciadoras de tumores (TIC) en tumores debidos al carcinoma de pulmón microcítico después del tratamiento con SC16.13-ADC1 (denominado SC16-ADC en la FIG 21) . Se indujo el crecimiento de tumores de xenoinjerto de carcinoma de pulmón microcítico derivados de un paciente (LU95 y LU64) subcutáneamente en ratones hospedero inmunodeprimidos . Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron un valor medio de 150 mm3-250 mm3, los ratones se segregaron aleatoriamente en dos grupos de siete ratones. Mediante una inyección intraperitoneal , se inyectó en lo ratones los días 0, 4 y 7 (FIGS. 21A y 21D, líneas punteadas verticales) IgGl humana-ADCl (1 mg/kg; n=7 ratones) como control negativo o hSC16.13 -ADC1 (1 mg/kg; n=7 ratones). El día 8, se sacrificaron dos ratones representativos de cada grupo y sus tumores se extirparon y dispersaron en suspensiones de un único tipo de células. Tal como se muestra en las FIGS. 21A y 2ID, aunque los tumores tratados con hlgGl-ADCl (IgGl-ADC) siguieron creciendo en los cinco ratones remanentes, los volúmenes de los tumores tratados con hSC16.13-ADC1 (SC16-ADC) se redujeron hasta cero o casi cero en los cinco ratones remanentes . Utilizando técnicas estándar de citometría de flujo y un anticuerpo anti-DLL3 marcado, se confirmó que los dos tumores extirpados de cada uno de los dos grupos de tratamiento presentaban una expresión de DLL3 positiva similar. A continuación, se agruparon las células tumorales de cada grupo de tratamiento respectivo y se aislaron las células humanas vivas mediante FACS utilizando un FACSAria III (Becton Dickenson) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y técnicas reconocidas en la materia. Resumiendo, las células se marcaron con FITC conjugado con anticuerpos anti-H2Kd murina y anti-CD45 murina (ambos de BioLegend, Inc.) y después se resuspendieron en 1 µ9/p??? de DAPI . A continuación, se hizo una selección de la suspensión resultante en condiciones estándar recogiendo las células humanas DAPI", mH2Kd" y mCD45~, y eliminando las células murinas . A continuación, en cohortes de cinco ratones receptores se trasplantaron 2000, 500, 120 o 30 células humanas vivas seleccionadas procedentes de tumores tratados con hSC16.13-ADC1. A efectos comparativos, en cohortes de cinco ratones receptores se trasplantaron 1000, 250, 60 o 15 células humanas vivas seleccionadas procedentes de tumores tratados con el IgGl-ADCl de control. Se midieron los tumores en los ratones receptores semanalmente y se sacrificaron ratones individuales antes de que los tumores alcanzaran un volumen de 1500 mm3. Una vez que comenzaron a crecer los tumores, el estudio se concluyó después de cuatro semanas consecutivas sin que apareciera ningún tumor nuevo en ningún ratón adicional. En ese momento, los ratones receptores se clasificaron como positivos o negativos para el crecimiento tumoral, teniendo el crecimiento positivo volúmenes superiores a 100 mm3. En todas las dosis de células inyectadas, los receptores de células LU95 tratados con hSC16.13 -ADC1 produjeron únicamente un tumor, en comparación con doce en los receptores de células LU95 tratados con IgGl-ADCl (FIG. 21B) . De forma análoga, los receptores de células LU64 tratados con SC16.13-ADC1 produjeron tres tumores, en comparación con trece tumores en los receptores de células LU64 tratados con IgGl-ADCl (FIG. 21E) . Utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson (software L-Calc, Stemcell Technologies) , se utilizaron dosis de células inyectadas de receptores con y sin tumores 18 semanas después del trasplante para calcular las frecuencias de las células iniciadoras de tumores en cada población. El número de TIC cada 10 000 células humanas vivas en LU95 se redujo más de 100 veces, de 78.1 en tumores tratados con IgGl-ADC a 0.769 en tumores tratados con hSC16.13-ADCl (FIG. 21C, de 1:128 células en los tratados con el control a 1:12 998 en los tratados con el modulador). En LU64, el número de TIC se redujo 16.6 veces, de 47.4 TIC a 2.86 TIC cada 10 000 células humanas vivas en tumores tratados con IgGl-ADCl o hSC16.13-ADCl, respectivamente (FIG. 21F, de 1:211 células en los tratados con el control a 1:3500 células en los tratados con el modulador) . Esta reducción sustancial en la frecuencia de TIC (p. ej . , células madre cancerosas) demuestra que, además de reducir los volúmenes tumorales tal como se ha demostrado previamente, los moduladores de la presente invención reducen de forma significativa y específica las poblaciones de células madre cancerosas y, por extensión, el potencial de recidiva, metástasis y recrecimiento de los tumores. Esta reducción del potencial de recidiva y recrecimiento queda reflejada claramente en la significativa supervivencia sin tumor observada en los Ejemplos anteriores. La exposición completa de todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones, y el material disponible en formato electrónico (que incluye, por ejemplo, las presentaciones de secuencias de nucleótidos en, p. ej . , GenBank y RefSeq, y las presentaciones de secuencias de aminoácidos en, p. ej . , SwissProt, PIR, PRF, PBD y las traducciones a partir de regiones codificantes anotadas en GenBank y RefSeq) citados en la presente se incorporan por referencia. La descripción detallada anterior y los ejemplos se han proporcionado únicamente a efectos de claridad de compresión. No se debe sobreentender ninguna limitación innecesaria deducida a partir de estos. La invención no se limita a los detalles exactos que se muestran o describen, ya que las variaciones obvias para un experto en la técnica quedarán incluidas en la invención definida por las reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un modulador de DLL3 aislado.
2. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este.
3. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal .
4. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se selecciona entre el grupo constituido por anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos .
5. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal o fragmento inmunorreactivo de este se une a un dominio aminoterminal o un dominio DSL de la proteína DLL3.
6. El modulador de DLL3 de tipo anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende una región variable de la cadena ligera que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una región variable de la cadena pesada que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad, donde las regiones determinantes de la complementariedad de las cadenas ligera y pesada comprenden al menos una región determinante de la complementariedad expuesta en la FIG. 11A u 11B.
7. El modulador de DLL3 de tipo anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque compite por la unión a una proteína DLL3 con un anticuerpo de referencia seleccionado entre el grupo constituido por SC16.3, SC16.4, SC16 .5, SC16.7, SC16 .8, SC16. 10, SC16.11 , SC16.13, SC16 .15, SC16 .18, SC16. 19, SC16 .20, SC16 .21, SC16 .22, SC16 .23, SC16 .25, SC16. 26, SC16 .29, SC16 .30, SC16 -31, SC16 • 34, SC16 -35, SC16. 36, SC16 .38, SC16 • 39, SC16 .41, SC16 .42, SC16 -45, SC16. 47, SC16 • 49, SC16 .50, SC16 .52, SC16 • 55, SC16 .56, SC16. 57, SC16 .58, SC16 .61, SC16 .62, SC16 .63, SC16 .65, SC16. 67, SC16 .68, SC16 .72, SC16 .73, SC16 .78, SC16 • 79, SC16. 80, SC16. 81, SC16. 84, SC16. 88, SC16. 101, SC16 .103, SC16. 104, SC16. 105, SC16. 106, SC16. 107, SC16. 108, SC16 .109, SC16. 110, SC16. 111, SC16. 113, SC16. 114 , SC16. 115, SC16 .116, SC16. 117, SC16. 118, SC16. 120, SC16. 121, SC16. 122, SC16 .123 , SC16. 124 , SC16. 125, SC16. 126, SC16. 129, SC16. 130, SC16 .131, SC16. 132 , SC16. 133, SC16. 134, SC16. 135, SC16. 136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 y SC16.150, donde la unión del modulador de DLL3 de tipo anticuerpo a la proteína DLL3 se inhibe al menos un 30%.
8. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 2-7, caracterizado porque el anticuerpo comprende un anticuerpo internalizante .
9. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 2-8, caracterizado porque el anticuerpo comprende además un agente citotóxico .
10. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica una región variable de la cadena pesada de aminoácidos o una región variable de la cadena ligera de aminoácidos de un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este de conformidad con las reivindicaciones 1-8.
11. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10.
12. Un conjugado de anticuerpo- fármaco caracterizado porque es de la fórmula : M-[L-D]n o una sal farmacéuticamente aceptable de este, donde a) M comprende un modulador de DLL3 ,- b) L comprende un conector opcional; c) D es un agente antiproliferativo; y d) n es un número entero comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20.
13. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este y el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende una región variable de la cadena ligera que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una región variable de la cadena pesada que contiene tres regiones determinantes de la complementa iedad, donde las regiones determinantes de la complementa iedad de las cadenas ligera y pesada comprenden al menos una región determinante de la complementariedad expuesta en la FIG. 11A u 11B.
14. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado porque el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo internalizante.
15. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-9 o el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 12 o 14, para usarse en una medicina.
16. El modulador de DLL3 aislado de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-9 o el conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con las reivindicaciones 12 o 14, para usarse en el tratamiento de un cáncer en un paciente donde el cáncer se selecciona entre el grupo constituido por cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer del cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de mama.
17. El uso de un modulador de DLL3 para fabricar un medicamento para el tratamiento del carcinoma de pulmón microcítico en un sujeto que lo necesite.
18. El medicamento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo monoclonal.
19. El medicamento de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 17 o 18, caracterizado porque el modulador de DLL3 se une a un dominio aminoterminal o un dominio DSL de la proteína DLL3.
20. El medicamento de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 17-19, caracterizado porque el modulador de DLL3 comprende un agente citotóxico.
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