KR20210018311A - Dll3-cd3 이중 특이적 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 DLL3/CD3 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 결합 단백질을 코딩하는 핵산; 이러한 결합 단백질을 제조하는 방법; 이러한 결합 단백질을 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 결합 단백질을 포함하는 조성물, 및 특히 암 질환 분야에서 치료 목적을 위한 이러한 결합 단백질 또는 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 DLL3에 특이적인 제 1 항원 결합 단위 및 CD3에 특이적인 제 2 항원 결합 단위를 포함하는 다중 특이적 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 결합 단백질을 코딩하는 핵산; 이러한 결합 단백질을 제조하는 방법; 이러한 결합 단백질을 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 결합 단백질을 포함하는 조성물, 및 특히 암 질환 분야에서 치료 목적을 위한 이러한 결합 단백질 또는 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
DLL3은 노치 (Notch) 리간드 계열에 속하는 I 형 막관통 단백질이다. DLL3은 주로 골지체에 국한되어 있고 세포 표면에 국한된 다른 DLL 계열 구성원인 DLL1 및 DLL4와 달리 노치 신호 전달의 억제제로 작용하는 체절 형성에 주로 관여한다. DLL3이 과발현되는 암세포에서만 일부 DLL3 분자가 세포 표면으로 탈출한다 (Dylla, Molecular & Cellular Oncology 2016, Vol. 3, No. 2). DLL3은 몇 가지 방법 예를 들어, 종양 조직의 LC/MS 분석 (WO 2014/125273), RNA 시퀀싱 (WO 2017/021349) 및 면역 조직 화학 (Saunders et al., Sci Transl Med. 2015 Aug 26; 7 (302): 302ral36; Saunders et al, AACR 2017; WO 2013/126746) 분석을 사용하여 종양 특이적 표적으로 확인되었다.
DLL3 발현은 대세포 신경내분비 암종 (LCNEC), 소세포 폐암 (SCLC), 소세포 방광암, 신경내분비 전립선암, 신경내분비 췌장암 및 교모세포종과 같은 신경내분비 종양에서 서술되었다 (Saunders et al, Sci Transl Med. 2015 Aug 26;7(302):302ral36; Saunders et al, AACR 2017).
SCLC는 매우 높은 의학적 필요성의 조짐을 나타낸다. SCLC는 폐암 진단의 13%를 차지하며 NSCLC보다 예후가 더 나쁘다. 이러한 암에 대한 기존의 치료법에는 주로 화학요법, 방사선 요법, 수술 또는 이들의 조합이 포함되지만 아직 사용할 수 있는 표적 치료법은 없다. 화학요법에 대한 초기 반응률은 높지만 많은 환자들이 화학 내성 질환으로 빠르게 재발하는데 이에 대한 치료 옵션은 없다. 지난 몇 년에 걸쳐 이러한 암 치료가 개선되었지만 이들 종양 유형의 전체 생존율은 변하지 않았기 때문에 보다 표적화되고 강력한 치료에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 있다.
표적 요법에 대한 한 가지 접근법은 항체 약물 접합체 (ADC)에 의해 제공되지만, DLL3의 경우 이 전략은 DLL3의 낮은 세포 표면 발현과 화학요법에 대한 높은 저항률로 인해 바람직하지 않다. 대부분의 환자가 화학요법 치료 후 재발하고 세포 표면에서 DLL3의 낮은 발현으로 인해 ADC로 DLL3을 표적화하는 데 한계가 있을 수 있다. 또한 ADC 접근법은 링커 불안정 또는 분해 결과 유리 약물에 의해 유발되는 표적 외 독성을 빈번히 가진다.
DLL3 표적화와 다른 단백질의 표적화를 결합하려는 시도가 있었다. 예를 들어, WO2017/021349호는 표적 세포 표면상의 인간 DLL3에 대한 결합과 T 세포 표면상의 인간 CD3에 대한 결합을 조합한 이중 특이적 항체 작제물을 기재하고 있다. 그러나 그러한 접근법이 성공할 것인가에 대해서는 현재까지 입증되지 않았으며 SCLC 및 교모세포종뿐만 아니라 다른 DLL3 발현 종양에 대한 표적 요법도 이용 가능하지 않다.
그러한 암 환자에 대한 열악한 전망을 고려할 때, 보다 효과적인 치료법, 특히 내약성이 개선된 효과적인 치료법을 밝힐 필요가 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 현재 사용되고/되거나 당 업계에 공지된 활성제, 조성물 및/또는 방법과 비교하여 특정 이점을 제공하는 약리학적 활성제, 조성물 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이점에는 생체 내 효능, 개선된 치료 및 약리학적 특성, 증가된 특이성, 개선된 안전성 프로필, 부작용 감소, 면역원성 감소 및 기타 유리한 특성, 예컨대 개선된 제조 용이성 또는 제품 비용 감소, 높은 안정성/긴 반감기, 특히 당 업계에 이미 알려진 후보 약물에 비해 덜 빈번한 투여 요법에 대한 필요성이 포함된다.
발명의 요약
본 발명은 T 세포상의 CD3에 대한 결합 암 및 종양 세포의 세포 표면상의 DLL3에 대한 결합 암을 갖는 다중 특이적 결합 단백질을 사용하는 이중 특이적 T 세포 결합 접근법에 기초한다. T 세포와 종양 세포에 동시에 결합함으로써 T 세포는 두 세포 사이에 세포 용해 시냅스의 형성을 강제하므로 T 세포 활성을 표적 종양 세포로 선택적으로 지향한다.
한 측면에서, 본 발명은 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함하는 다중 특이적 결합 단백질을 제공하며, 상기 제 1 항원 결합 단위는 다음 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 DLL3에 특이적으로 결합한다:
i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
iii) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
iv) 서열 번호 19 (CDR1), 서열 번호 20 (CDR2) 및 서열 번호 21 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 22 (CDR1), 서열 번호 23 (CDR2) 및 서열 번호 24 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
v) 서열 번호 25 (CDR1), 서열 번호 26 (CDR2) 및 서열 번호 27 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 28 (CDR1), 서열 번호 29 (CDR2) 및 서열 번호 30 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
vi) 서열 번호 31 (CDR1), 서열 번호 32 (CDR2) 및 서열 번호 33 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 34 (CDR1), 서열 번호 35 (CDR2) 및 서열 번호 36 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
vii) 서열 번호 133 (CDR1), 서열 번호 134 (CDR2) 및 서열 번호 135 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 136 (CDR1), 서열 번호 137 (CDR2) 및 서열 번호 138 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
viii) 서열 번호 139 (CDR1), 서열 번호 140 (CDR2) 및 서열 번호 141 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 142 (CDR1), 서열 번호 143 (CDR2) 및 서열 번호 144 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
ix) 서열 번호 145 (CDR1), 서열 번호 146 (CDR2) 및 서열 번호 147 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 148 (CDR1), 서열 번호 149 (CDR2) 및 서열 번호 150 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
x) 서열 번호 151 (CDR1), 서열 번호 152 (CDR2) 및 서열 번호 153 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 154 (CDR1), 서열 번호 155 (CDR2) 및 서열 번호 156 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xi) 서열 번호 157 (CDR1), 서열 번호 158 (CDR2) 및 서열 번호 159 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 160 (CDR1), 서열 번호 161 (CDR2) 및 서열 번호 162 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xii) 서열 번호 163 (CDR1), 서열 번호 164 (CDR2) 및 서열 번호 165 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 166 (CDR1), 서열 번호 167 (CDR2) 및 서열 번호 168 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xiii) 서열 번호 169 (CDR1), 서열 번호 170 (CDR2) 및 서열 번호 171 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 172 (CDR1), 서열 번호 173 (CDR2) 및 서열 번호 174 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xiv) 서열 번호 175 (CDR1), 서열 번호 176 (CDR2) 및 서열 번호 177 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 178 (CDR1), 서열 번호 179 (CDR2) 및 서열 번호 180 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xv) 서열 번호 181 (CDR1), 서열 번호 182 (CDR2) 및 서열 번호 183 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 184 (CDR1), 서열 번호 185 (CDR2) 및 서열 번호 186 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xvi) 서열 번호 187 (CDR1), 서열 번호 188 (CDR2) 및 서열 번호 189 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 190 (CDR1), 서열 번호 191 (CDR2) 및 서열 번호 192 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xvii) 서열 번호 193 (CDR1), 서열 번호 194 (CDR2) 및 서열 번호 195 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 196 (CDR1), 서열 번호 197 (CDR2) 및 서열 번호 198 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위; 및
xviii) 서열 번호 199 (CDR1), 서열 번호 200 (CDR2) 및 서열 번호 201 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 202 (CDR1), 서열 번호 203 (CDR2) 및 서열 번호 204 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하고 하기 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
iii) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
iv) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
v) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
vi) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
vii) 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
viii) 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
ix) 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
x) 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xi) 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xii) 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xiii) 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xiv) 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xv) 서열 번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xvi) 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xvii) 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위; 및
xviii) 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위는 하기 i) 내지 iii)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 6l (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위; 및
iii) 서열 번호 96 (CDR1), 서열 번호 97 (CDR2) 및 서열 번호 98 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 99 (CDR1), 서열 번호 100 (CDR2) 및 서열 번호 101 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하고 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위; 및
iii) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위.
본 발명의 일부 실시양태에서, DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위는 그의 N-에서 C-말단으로 제 1 경쇄 가변 도메인, 제 1 경쇄 불변 도메인, 제 1 펩티드 링커, 제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 중쇄 불변 CH1 도메인을 포함하고; CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위는 그의 N-에서 C-말단으로 제 2 경쇄 가변 도메인, 제 2 경쇄 불변 도메인, 제 2 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 중쇄 불변 CH1 도메인을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 제 1 및/또는 제 2 펩티드 링커는 26 내지 42 개의 아미노산, 바람직하게는 30 내지 40 개의 아미노산, 34 내지 40 개의 아미노산, 또는 36 내지 39 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 38 개의 아미노산 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 제 1 링커 및/또는 제 2 링커는 바람직하게는 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 Gly-Ser 링커이고, 보다 바람직하게는 상기 제 1 및 제 2 펩티드 링커는 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 제 1 및 제 2 Fc 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제 1 Fc 도메인은 상기 제 1 항원 결합 단위에 공유 결합되고, 상기 제 2 Fc 도메인은 상기 제 2 항원 결합 단위에 공유 결합된다.
본 발명의 일부 실시양태에서,
i) 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하고, 제 2 Fc 도메인은 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하거나,
ii) 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고, 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함하거나,
iii) 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하고, 제 1 Fc 도메인은 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하거나,
iv) 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고, 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A], 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함하고,
바람직하게는 제 1 또는 제 2 Fc 도메인은 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에 페닐알라닌 [Y436F]을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제 1 및/또는 제 2 Fc 도메인은 위치 234 [L234A] 및 위치 235 [L235A]에 알라닌을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제 1 경쇄 불변 도메인 및 제 2 경쇄 불변 도메인은 인간 카파 또는 람다 도메인을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 24l, 서열 번호; 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251 및 서열 번호 252로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79, 서열 번호 80 또는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 i) 본 발명의 단백질의 제 1 항원 결합 단위 및/또는 제 2 항원 결합 단위를 코딩하고, 임의로 제 1 및/또는 제 2 Fc 도메인을 추가로 코딩하거나, 또는 ii) 본 발명의 단백질의 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 추가 측면에서 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 이러한 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포, 및 본 발명의 단백질 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중-특이적 결합 단백질이 제공되며, 여기서 제 1 폴리펩티드 쇄는 제 1 경쇄, 제 1 링커 및 제 1 중쇄를 포함하고, 제 2 폴리펩티드 쇄는 제 2 경쇄, 제 2 링커 및 제 2 중쇄를 포함하며, 바람직하게는 상기 제 1 경쇄의 C-말단은 상기 제 1 펩티드 링커를 통해 상기 제 1 중쇄의 N-말단에 공유 결합되며, 상기 제 2 경쇄의 C-말단은 상기 제 2 펩티드 링커를 통해 상기 제 2 중쇄의 N-말단에 공유 결합된다.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄는 본원에 설명된 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17, 또는 DLL3#18의 항원 결합 단위에 대해 정의된 바와 같은 CDR 서열 및/또는 VH/VL 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄는 본원에 설명된 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3의 항원 결합 단위에 대해 정의된 바와 같은 CDR 서열 및/또는 VH/VL 서열을 포함하는 경쇄 가변 및 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 결합 단백질을 포함하는 추가 측면, 실시양태, 용도 및 방법은 본 발명의 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구 범위로부터 명확해질 것이다.
본 발명은 SCLC, 교모세포종 또는 DLL3 발현 신경내분비 종양과 같은 DLL3 발현 암의 보다 효과적인 치료를 가능하게 하는 신규 결합 단백질을 제공한다.
도 1: 본 발명의 이중 특이적 결합 단백질의 개략도,
도 2: 에피토프 도메인 매핑을 위한 HEK293 세포에서 발현된 DLL3 전장 단백질 및 DLL3 도메인 구성의 개략도. DLL3 도메인 작제물의 경우 막관통 및 세포 내 도메인은 EpCAM에서 유래된다.
도 3A: 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 DLL3 에피토프 도메인 매핑. DLL3의 막 근위 펩티드, EGF4, EGF1 및 DSL 도메인을 인식하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질. y 축은 카운트를 나타내고, x 축은 PE-A (피코에리스린 신호 영역)를 나타낸다.
도 3B: 6 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 DLL3 에피토프 도메인 매핑. DLL3의 EGF1, EGF3, EGF4 또는 EGF6을 인식하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호)를 나타낸다.
도 3C: 6 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 DLL3 에피토프 도메인 매핑. DSL 도메인을 인식하거나 DLL3의 DSL, EGF 또는 막 근위 펩티드를 인식하지 않는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호)를 나타낸다.
도 4: 인간 및 cyno DLL3을 발현하는 세포주에 대한 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호 영역)를 나타낸다.
도 5: 인간 DLL1 및 DLL4를 발현하는 세포주에 대한 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합, 인간 DLL1 및 DLL4에 대한 결합 비검출. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호 영역)를 나타낸다.
도 6A: 유세포 계측 분석에 의한 SCLC 세포주 및 인간 T 세포에 대한 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합.
도 6B: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF 1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드에 대해 지향됨)의 결합.
도 6C: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6D: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6E: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6F: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6G: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6H: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6I: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드에 대해 지향됨)의 결합.
도 6J: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6K: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6L: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6M: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6N: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6O: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6P: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드에 대해 지향됨)의 결합.
도 6Q: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6R: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6S: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6T: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6U: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF6 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6V: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 7A: 비자극된 PBMC를 인간 SCLC 세포주로 지향하는 7 개의 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능.
도 7B: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드로 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7C: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7D: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7F: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7G: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF6 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7H: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7I: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드로 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7J: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7K: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7L: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7M: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7N: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF6 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7O: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 8: 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질을 사용한 시험관 내 내재화 분석. DLL3/CD3 결합 단백질은 인간 PBMC와 함께 48 시간 동안 공동-인큐베이션하기 전에 2 시간 및 4 시간 동안 DLL3-양성 SHP77 세포와 함께 예비-배양되었다.
도 9: 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 약동학. 단일 1 mg/kg 정맥 내 투여 후 수컷 C57BL/6 마우스에서 DLL3#3/CD3#1 (흰 사각형) 및 DLL3#3/CD3#2 (검은 사각형)의 평균 약동학 프로파일.
도 10: 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 항종양 활성. y 축은 중간 종양 부피를 나타내고 x 축은 시간을 나타낸다.
도 11: 비자극된 PBMC를 인간 SHP77 및 RKO-E6 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능.
도 12: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 T 세포의 활성화 효능
도 13: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 T 세포의 탈과립화의 효능
도 14A: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 PBMC에 의한 인터페론 감마의 분비 효능
도 14B: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 PBMC에 의한 MCP-1의 분비 효능
도 15: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포의 존재하에 T 세포 증식의 효능
도 16: 비자극된 팬 T 세포 및 나이브 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 17: 비자극 CD4+ 및 CD4+ 중앙 기억 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 18: 비자극 CD4+ 및 CD4+ 이펙터 기억 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 19: 비자극 CD8+ 및 CD8+CD45RA+ 이펙터 기억 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 20: 비자극 CD8+ 및 CD8+ 기억 T 세포를 인간 SHP77로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 21: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질로의 SHP77 이종이식 종양 조직에서의 T 세포 침윤
도 22: ELISA 분석에서 재조합 DLL3 단백질에 대한 3 개의 예시적인 항-DLL3 항체의 결합. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 DLL3 단백질의 농도를 나타낸다.
도 23: 유세포 분석에 의해 결정된 DLL3-양성 SCLC 세포주에 대한 6 개의 예시적인 항-DLL3 항체의 결합. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 항-DLL3 항체의 농도를 나타낸다.
도 24: 5 개의 예시적인 항-DLL3 항체를 사용한 SCLC 조직 샘플의 대표적인 염색. 항-DLL3 항체 DLL3#1 및 DLL3#5는 종양 세포가 점상 및/또는 확산 세포질 및/또는 막성 DLL3 염색을 나타내는 것으로 나타났다. 이미지는 LEICA SCN400 자동 스캐너에 의해 10 배 배율로 전자적으로 생성되었다.
도 25: 상이한 DLL3 발현 수준을 갖는 SCLC 세포주로부터의 세포 펠렛의 대표적인 염색. 항-DLL3 항체 DLL3#5
도 2: 에피토프 도메인 매핑을 위한 HEK293 세포에서 발현된 DLL3 전장 단백질 및 DLL3 도메인 구성의 개략도. DLL3 도메인 작제물의 경우 막관통 및 세포 내 도메인은 EpCAM에서 유래된다.
도 3A: 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 DLL3 에피토프 도메인 매핑. DLL3의 막 근위 펩티드, EGF4, EGF1 및 DSL 도메인을 인식하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질. y 축은 카운트를 나타내고, x 축은 PE-A (피코에리스린 신호 영역)를 나타낸다.
도 3B: 6 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 DLL3 에피토프 도메인 매핑. DLL3의 EGF1, EGF3, EGF4 또는 EGF6을 인식하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호)를 나타낸다.
도 3C: 6 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 DLL3 에피토프 도메인 매핑. DSL 도메인을 인식하거나 DLL3의 DSL, EGF 또는 막 근위 펩티드를 인식하지 않는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호)를 나타낸다.
도 4: 인간 및 cyno DLL3을 발현하는 세포주에 대한 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호 영역)를 나타낸다.
도 5: 인간 DLL1 및 DLL4를 발현하는 세포주에 대한 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합, 인간 DLL1 및 DLL4에 대한 결합 비검출. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 PE-A (피코에리스린 신호 영역)를 나타낸다.
도 6A: 유세포 계측 분석에 의한 SCLC 세포주 및 인간 T 세포에 대한 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합.
도 6B: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF 1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드에 대해 지향됨)의 결합.
도 6C: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6D: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6E: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6F: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6G: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6H: SHP77 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6I: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드에 대해 지향됨)의 결합.
도 6J: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6K: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6L: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6M: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6N: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6O: NCI-H82 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6P: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드에 대해 지향됨)의 결합.
도 6Q: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6R: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6S: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6T: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6U: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF6 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 6V: T 세포에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드 도메인에 대해 지향됨)의 결합.
도 7A: 비자극된 PBMC를 인간 SCLC 세포주로 지향하는 7 개의 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능.
도 7B: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드로 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7C: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7D: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7F: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7G: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF6 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7H: 비자극된 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7I: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL도 EGF1-6도 아니고 막 근위 펩티드도 아닌 펩티드로 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7J: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (DSL 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7K: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF1 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7L: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF3 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7M: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF4 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7N: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (EGF6 도메인에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 7O: 비자극된 T 세포를 인간 NCI-H82 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (막 근위 펩티드에 대해 지향됨)의 세포 용해에서의 효능.
도 8: 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질을 사용한 시험관 내 내재화 분석. DLL3/CD3 결합 단백질은 인간 PBMC와 함께 48 시간 동안 공동-인큐베이션하기 전에 2 시간 및 4 시간 동안 DLL3-양성 SHP77 세포와 함께 예비-배양되었다.
도 9: 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 약동학. 단일 1 mg/kg 정맥 내 투여 후 수컷 C57BL/6 마우스에서 DLL3#3/CD3#1 (흰 사각형) 및 DLL3#3/CD3#2 (검은 사각형)의 평균 약동학 프로파일.
도 10: 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 항종양 활성. y 축은 중간 종양 부피를 나타내고 x 축은 시간을 나타낸다.
도 11: 비자극된 PBMC를 인간 SHP77 및 RKO-E6 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능.
도 12: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 T 세포의 활성화 효능
도 13: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 T 세포의 탈과립화의 효능
도 14A: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 PBMC에 의한 인터페론 감마의 분비 효능
도 14B: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포 존재하에서의 PBMC에 의한 MCP-1의 분비 효능
도 15: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 SHP77 세포의 존재하에 T 세포 증식의 효능
도 16: 비자극된 팬 T 세포 및 나이브 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 17: 비자극 CD4+ 및 CD4+ 중앙 기억 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 18: 비자극 CD4+ 및 CD4+ 이펙터 기억 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 19: 비자극 CD8+ 및 CD8+CD45RA+ 이펙터 기억 T 세포를 인간 SHP77 세포로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 20: 비자극 CD8+ 및 CD8+ 기억 T 세포를 인간 SHP77로 지향하는 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 세포 용해에서의 효능
도 21: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질로의 SHP77 이종이식 종양 조직에서의 T 세포 침윤
도 22: ELISA 분석에서 재조합 DLL3 단백질에 대한 3 개의 예시적인 항-DLL3 항체의 결합. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 DLL3 단백질의 농도를 나타낸다.
도 23: 유세포 분석에 의해 결정된 DLL3-양성 SCLC 세포주에 대한 6 개의 예시적인 항-DLL3 항체의 결합. y 축은 카운트를 나타내고 x 축은 항-DLL3 항체의 농도를 나타낸다.
도 24: 5 개의 예시적인 항-DLL3 항체를 사용한 SCLC 조직 샘플의 대표적인 염색. 항-DLL3 항체 DLL3#1 및 DLL3#5는 종양 세포가 점상 및/또는 확산 세포질 및/또는 막성 DLL3 염색을 나타내는 것으로 나타났다. 이미지는 LEICA SCN400 자동 스캐너에 의해 10 배 배율로 전자적으로 생성되었다.
도 25: 상이한 DLL3 발현 수준을 갖는 SCLC 세포주로부터의 세포 펠렛의 대표적인 염색. 항-DLL3 항체 DLL3#5
발명의 상세한 설명
사용된 용어 및 정의
본 발명의 상기 및 다른 측면 및 실시양태들이 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
지시되지 않거나 달리 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어는 당해 기술 분야에서 당업자에게 명백한 통상의 의미를 가질 것이다. 표준 핸드북, 예컨대 [Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), 및 Roitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)], 뿐만 아니라 여기에 인용된 일반적인 배경기술을 참고할 수 있다. 또한, 달리 언급하지 않는 한, 상세하게 구체적으로 기술되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명백한 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 또한 수행되었다. 예를 들어, 표준 핸드북, 위에서 언급한 일반적인 배경기술 및 그 안에 인용된 다른 참고 문헌을 다시 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "포함하는" 및 "포함한다" 및 "포함하다"와 같은 그의 변형은 용어 "함유하는" 또는 "가지는" 또는 "갖는"으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열" (예를 들어 "중/경쇄 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "불변 도메인 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어)은 일반적으로 문맥 상 더 제한적인 해석을 요구하지 않는 한, 관련된 아미노산 서열뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
본원에 사용된 "항원 결합 단위"는 그의 특이적 표적 또는 항원에 결합할 수 있고 표적 결합을 허용하는 항체 (전형적으로 항체에 존재)로부터 유래된 최소 구조적 요건을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 항원 결합 단위는 적어도 3 개의 경쇄 및 3 개의 중쇄 CDR 서열, 바람직하게는 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 존재를 적어도 포함한다.
항체 또는 면역글로불린의 일반화된 구조는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 분자는 일반적으로 2 개의 동일한 경쇄 (L) 및 2 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이며, 일반적으로 전장 항체라고 한다. 각 경쇄는 하나의 이황화 결합에 의해 중쇄에 공유적으로 연결되어 이종이량체를 형성하고, 이종사량체 분자는 이종이량체의 2 개의 동일한 중쇄 사이의 공유 이황화 결합을 통해 형성된다. 경쇄와 중쇄가 하나의 이황화 결합에 의해 함께 연결되어 있지만, 두 중쇄 사이의 이황화 결합의 수는 면역글로불린 동형에 따라 다르다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄 내 이황화 다리를 가지고 있다. 각 중쇄는 N-말단에 가변 도메인 (VH), 이어서 3 개 또는 4 개 (IgE의 경우)의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)과 CH1과 CH2 사이에 힌지 영역을 가지고 있다. 각 경쇄에는 N-말단 가변 도메인 (VL) 및 C-말단 불변 도메인 (CL)의 두 도메인이 있다. VL 도메인은 VH 도메인과 비공유적으로 결합하는 반면, CL 도메인은 일반적으로 이황화 결합을 통해 CH1 도메인에 공유적으로 연결된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성하는 것으로 여겨진다 (Chothia et al, 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663). 가변 도메인은 또한 본원에서 가변 영역 또는 Fv로 지칭되며 항원 결합 부위를 보유함으로써 항원에 대한 항체에 특이성을 부여하는 부분을 나타낸다.
본원에 사용된 "경쇄 가변 도메인" (또는 "경쇄 가변 영역") 및 "중쇄 가변 도메인" (또는 "중쇄 가변 영역")은 동일한 일반 구조를 가지며 각 도메인은 본질적으로 그의 서열이 광범위하게 보존된 4 개의 프레임워크 (FR) 영역으로 이루어져 있으며, 이는 당 업계 및 이하에서 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 각각 지칭되며; 프레임워크 영역은 3 개의 초가변 영역, HVR (또는 CDR)에 의해 중단되며, 이는 당 업계 및 이하에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2" 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 각각 지칭된다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 프레임워크 영역은 베타 시트 형태를 채용하고, CDR은 베타 시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 쇄의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 3 차원 구조로 유지되고 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 내용에서, CDR에 대한 언급은 IMGT로도 칭해지는 CCG의 정의에 기초한다 (Lefranc MP, Pommie C, Ruiz M, Giudicelli V, Foulquier E, Truong L, Thouvenin-Contet V, Lefranc G. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains." Dev Comp Immunol. 2003 Jan;27(1):55-77; Giudicelli V, Brochet X, Lefranc MP. "IMGT/V-QUEST: IMGT standardized analysis of the immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) nucleotide sequences". Cold Spring Harb Protoc. 2011;2011(6):695-715). CDR의 다른 정의는 Kabat (E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)와 함께 Chothia에 기초한다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917).
본 출원에서 사용되는 용어 "불변 도메인" 또는 "불변 영역"은 가변 영역 이외의 항체 도메인의 총합을 의미한다. 이러한 불변 도메인 및 영역은 당 업계의 기술 수준에서 잘 알려져 있으며, Kabat 등에 의해 기술되었다 ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91).
항체의 "Fc 부분" 또는 "Fc 도메인"은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 부분"은 당업자에게 잘 알려져 있고 항체의 파파인 절단에 기초하여 정의된 용어이다. 그의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 클래스로 분류된다. 중쇄 불변 영역에 따라, 면역글로불린의 상이한 부류는 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 이들 중 몇 개는 하위 클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 기초하여 ADCC (항체 의존성 세포 매개 세포 독성) 및 CDC (보체 의존성 세포 독성)에 직접 관여한다. 보체 활성화 (CDC)는 대부분의 IgG 항체 하위 클래스의 Fc 부분에 보체 인자 C1q를 결합시킴으로써 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 의존적이지만, Clq에 대한 결합은 Fc 부분의 한정된 결합 부위에 의해 야기된다. 이러한 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat의 EU 지수에 따른 번호 매김, 아래 참조) (Edelman et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85)이다. IgG1에서 C1q 및 Fcγ 수용체 결합을 매개하는 이들 잔기 중에서 가장 중요한 것은 L234 및 L235이다 (Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161- 12168, Shields et al (2001) JBC, 276 (9): 6591-6604). 하위 클래스 IgG1 및 IgG3의 항체는 보체 활성화 및 C1q 및 C3 결합을 보인 반면, IgG2 및 IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않으며 C1q 및 C3에 결합하지 않는다.
용어 "항체" 또는 "항체 분자" (본원에서 동의어로 사용됨)는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중 특이적 항체 (예를 들어 이중 특이적 항체), 항체의 단편, 특히 Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편, 단쇄 항체, 특히 단쇄 가변 단편 (scFv), 단쇄 Fab 단편 (scFab), 소형 모듈 면역약제 (SMIP), 도메인 항체, 나노바디, 디아바디 (diabody)를 포함할 수 있다. 항체는 항체의 Fc 부분 (항체 불변 영역)에 의해 통상 매개되는 ADCC 또는 CDC와 같은 이펙터 기능을 가질 수 있거나 또는 예를 들어 Fc 부분을 갖지 않거나 차단, 마스킹된 Fc 부분, 본질적으로 면역 세포 또는 보체 시스템과 같은 면역계 성분에 의해 인식되지 않거나 불충분하게 인식되는 Fc 부분을 가짐으로써 이펙터 기능을 갖지 않을 수 있다.
모노클로날 항체 (mAb)는 아미노산 서열이 동일한 단일 특이성 항체이다. 그들은 특이적 항체 생성 B 세포와 골수종 (B 세포 암) 세포의 융합 클론을 나타내는 하이브리드 세포주 (하이브리도마 (hybridoma)라 칭함)로부터 하이브리도마 기술에 의해 생성될 수 있다 (Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7). 대안적으로, 모노클로날 항체는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다 (Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells." J Immunol Methods 204 (1): 77-87; 또한 하기 참조). "재조합 항체" 또는 "재조합 결합 분자"는 재조합적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성된 항체 또는 결합 분자이다. 이는 임의로 단리되거나 정제된다.
전장 항체는 유용한 항체 단편을 생성하기 위해 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리될 수 있다. 파파인 분해는 "Fab" 단편이라고 하는 2 개의 동일한 항원 결합 항체 단편을 생성하는 데 사용되며, 각각 단일 항원 결합 부위와 잔류 "Fc" 단편이 있다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 CH1 도메인을 포함한다. 펩신 처리는 2 개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 교차 결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
Fab' 단편은 CH1 도메인의 C-말단에서 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 추가 잔기의 존재가 Fab 단편과 다르다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 영역에서 시스테인 잔기에 의해 연결된 Fab' 단편 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 결합도 알려져 있다.
"Fv" 단편은 단단한 비공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함한다. 이 구성에서, 각 가변 도메인의 3 개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 정의한다. 종합적으로, 6 개의 CDR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단쇄 Fv 변이체이다. 단쇄 Fv는 항원을 인식하고 결합할 수 있다. scFv 폴리펩티드는 scFv에 의한 항원 결합을 위한 원하는 3 차원 구조의 형성을 촉진하기 위해 VH와 VL 도메인 사이에 위치하는 폴리펩티드 링커를 선택적으로 포함할 수 있다 (예를 들어, Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315).
"단쇄 Fab" 또는 "scFab" 항체 단편은 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 포함하는 단쇄 Fab 변이체이다. 단쇄 Fab는 항원을 인식하고 결합할 수 있다. scFab 폴리펩티드는 선택적으로 CL과 VH 도메인 사이에 위치하는 폴리펩티드 링커를 또한 포함할 수 있다 (Hust et al (2007) BMC Biotechnology).
인간에서의 적용을 위해, 기원적으로 마우스와 같은 다른 종에서 유래된 치려 분자, 예컨대 본원에 기술된 바와 같인 항원 결합 단위를 포함하는 항체 또는 결합 단백질의 면역원성을 감소시키는 것이 종종 바람직하다. 이것은 키메라 항체/결합 단백질의 작제 또는 "인간화"로 불리는 과정에 의해 이루어질 수 있다. 이 문맥에서, "키메라 항체"; 또는 "키메라 항원 결합 단위"는 상이한 종 (예를 들어 인간)으로부터 유래된 서열 부분 (예를 들어, 불변 도메인)에 융합된 하나의 종 (예를 들어 마우스)으로부터 유래된 서열 부분 (예를 들어 가변 도메인)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단위로 이해된다. 이 문맥에서, "인간화 항체", "인간화 결합 단백질" 또는 "인간화 항원 결합 단위"는 본래 비인간 종에서 유래된 가변 도메인을 포함하는 항체, 단백질 또는 항원 결합 단위이며, 여기서 특정 아미노산은 그 가변 도메인의 전체 서열을 인간 가변 도메인의 서열에 보다 가깝게 만들기 위해 돌연변이되어 있다. 항체의 인간화 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Billetta R, Lobuglio AF. "Chimeric antibodies". Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76; Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323).
"최적화된 항체" 또는 "최적화된 항원 결합 단위 또는 단백질"은 예정된 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 아미노산 서열 변이체 또는 그의 단편을 포함하고 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 하나 이상의 FR 및 비-인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 특정 유형의 인간화 항체 또는 인간화 항원 결합 단위/단백질이다. 종종 "수입"서열로 지칭되기도 하는 이 비인간 아미노산 서열은 전형적으로 "수입" 항체 도메인, 특히 가변 도메인으로부터 취해진다. 일반적으로, 최적화된 항체는 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입된 비-인간 항체 또는 비-인간 항체로부터 유래된 CDR (또는 HVL)을 적어도 포함한다. 특정 마우스 FR 잔기가 최적화된 항체의 기능에 중요할 수 있으므로 특정 인간 생식선 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 잔기가 상응하는 마우스 서열의 것과 동일하도록 변형된다는 것이 이해될 것이다. 이 과정 동안 바람직하지 않은 아미노산은 또한 제거되거나 변경될 수 있으며, 예를 들어 탈아미드화, 바람직하지 않은 전하 또는 친유성 또는 비특이적 결합을 방지할 수 있다. "최적화된 항체", "최적화된 항체 단편" 또는 "최적화된"은 때때로 "인간화 항체", "인간화 항체 단편" 또는 "인간화" 또는 "서열 최적화"로 지칭될 수도 있다.
또한, 인간 게놈으로부터 유도된 서열을 기초로 항체 또는 VH/VL 도메인을 생성하는 기술이 개발되었고, 예로는 파지 디스플레이 또는 유전자이식 동물의 사용을 들 수 있다 (WWW. Ablexis.com/technology-alivamab.php; WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) "By-passing immunisation. human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203; Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.; Brueggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.). 이러한 항체 또는 항원 결합 단위 또는 VH/VL 도메인은 본 발명의 맥락에서 "인간 항체", "인간 항원 결합 단위" 또는 "인간 VH/VL 도메인이다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체", "인간 항원 결합 단위" 또는 "인간 VH/VL 도메인"은 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에서 유래된 가변 (및 적용 가능한 경우 불변) 영역을 갖는 항체, 항원 결합 단위 또는 VH/VL 도메인을 포함하는 것으로 의도된다. 본 기술의 인간 항체, 항원 결합 단위, 단백질 또는 VH/VL 도메인은 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체", "인간 항원 결합 단위" 또는 "인간 VH/VL 도메인"은 다른 (포유동물 종), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 크래프트된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "인간 항체", "인간 항원 결합 단위" 또는 "인간 VH/VL 도메인"은 단백질의 실질적으로 모든 부분 (예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인 (예를 들어, CHI, CH2, CH3), 힌지, VL, VH)이 인간에서 실질적으로 비면역원이며, 단지 작은 서열 변화 또는 변이만 있는 항체, 항원 결합 단위 또는 VH/VL 도메인을 지칭한다. 이러한 변화 또는 변이는 비변형 항체 또는 항원 결합 단위에 비해 인간 또는 다른 종에서 선택적으로 그리고 바람직하게는 면역원성을 유지하거나 감소시킨다.
따라서, 인간 항체, 인간 항원 결합 단위 또는 인간 VH/VL 도메인은 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다. 인간 항체, 인간 항원 결합 단위 또는 인간 VH/VL 도메인은 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 생성될 수 있음이 언급된다.
용어 "단량체"는 본원에 기재된 항체 또는 다중 특이적 단백질의 균질한 형태를 지칭한다. 예를 들어, 전장 항체의 경우 단량체는 2 개의 동일한 중쇄와 2 개의 동일한 경쇄를 갖는 단량체 항체를 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 단량체는 본원에 기술된 바와 같이 DLL3에 특이적인 단일 항원 결합 단위 및 CD3에 특이적인 단일 항원 결합 단위를 갖는 본 발명의 단백질을 의미한다. 예를 들어, 본원에 기재된 결합 단백질의 단량체는 2 개의 쇄, 제 1 항원 결합 단위를 갖는 단쇄 Fab 및 선택적으로 제 1 Fc 도메인을 포함하는 제 1 쇄 및 제 2 항원 결합 단위를 갖는 단쇄 Fab 및 선택적으로 제 2 Fc 도메인을 포함하는 제 2 쇄를 가질 수 있다.
에피토프는 항체 또는 항원 결합 모이어티 (예를 들어, 본원에 기재된 단백질의 항원 결합 단위)에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 용어 "에피토프"는 항체 또는 항원 결합 모이어티에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 에피토프 결정자는 아미노산, 글리칸 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하고, 특정 실시양태에서 특정 3 차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 구조적 및 비구조적 에피토프는 전자와의 결합이 변성 용매의 존재하에 손실되지만 후자와의 결합에서는 그렇지 않다는 된다는 점에서 구별된다.
특정 에피토프, 항원 또는 단백질 (또는 그의 적어도 하나의 부분, 단편 또는 에피토프에 대해) "과 결합한다", "에 결합한다", "와 특이적으로 결합한다", "에 특이적으로 결합한다", "에 대해 친화성을 가진다, "에 대해 특이적이다" 및/또는 "에 대해 특이성을 가진다"고 할 수 있는 항원 결합 분자/단백질 (예를 들어, 면역글로불린, 항체, 항원 결합 단위 또는 이러한 항원 결합 분자/단백질의 단편)은 상기 에피토프, 항원 또는 단백질 "에 대한", "에 대해 지향된"이라고 하거나, 또는 이러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합 "분자/단백질이다.
본원에 사용된 용어 "결합" 및 "특이적 결합"은 정제된 야생형 항원에 의한 시험관 내 분석, 바람직하게는 플라즈몬 공명 분석 (Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.", Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.)에서 항원의 에피토프에 대한 항체 또는 항원 결합 모이어티 (예를 들어, 면역글로불린, 항체, 항원 결합 단위 또는 이러한 항원 결합 분자/단백질의 단편)의 결합을 지칭한다. 항체 친화성은 또한 키네틱 배제 분석 (kinetic exclusion assay (KinExA)) 기술을 사용하여 측정할 수 있다 (Darling, R.J., and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657).
일반적으로, 용어 "특이성"은 특정 항원 결합 분자/단백질 (예컨대 면역글로불린, 항체, 항원 결합 단위, 또는 항원 결합 분자/단백질의 단편)이 결합할 수 있는 상이한 타입의 항원 또는 에피토프의 수를 지칭한다. 항원-결합 분자/단백질의 특이성은 그의 친화력 및/또는 결합력에 기초하여 결정될 수 있다. 항원과 항원 결합 단백질의 해리에 대한 평형 상수 (KD)로 표시되는 친화력은 항원 결합 분자/단백질상의 항원 결합 부위와 에피토프 사이의 결합 강도를 측정하기 위한 척도이다; KD 값이 작을수록 에피토프와 항원-결합 분자/단백질 사이의 결합 강도가 강해진다 (대안적으로, 친화력은 또한 1/KD인 친화력 상수 (KA)로서 표시될 수 있다). 당업자에게 명백한 바와 같이 (예를 들어, 본원에서의 추가적인 개시에 기초하여), 친화도는 관심있는 특정 항원에 따라 그 자체로 공지된 방식으로 결정될 수 있다. 결합도는 항원-결합 분자/단백질 (면역글로불린, 항체, 항원 결합 단위 또는 이러한 항원 결합 분자/단백질의 단편과 같은)와 관련 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합도는 항원 결합 분자/단백질상의 에피토프와 그것의 항원 결합 부위 사이의 친화력 및 항원 결합 분자/단백질 상에 존재하는 관련 결합 부위의 수 모두와 관련된다.
본원에 사용된 용어 "단리된 (isolated)"은 원래 또는 자연 환경 (예를 들어, 자연 발생인 경우 천연 환경)으로부터 제거되는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 인간이 개입하여 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 벡터 또는 조성물은 자연계에서 발견되는 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것일 수 있다. 예를 들어, 그의 천연 생물학적 공급원 및/또는 그로부터 얻은 반응 배지 또는 배양 배지와 비교할 때 다른 핵산, 다른 단백질/폴리펩티드, 다른 생물학적 성분 또는 거대 분자 또는 적어도 하나의 오염물, 불순물 또는 미량 성분과 같이 일반적으로 상기 공급원 또는 배지에서 결합되는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 분리된 경우 이 핵산, 단백질/폴리펩티드 분자는 "본질적으로 단리된 (형태)"로 간주된다. 특히, 핵산 또는 단백질/폴리펩티드 분자는 적어도 2 배, 특히 적어도 10 배, 더욱 특히 적어도 100 배, 최대 1000 배까지 정제되었을 때 "본질적으로 단리된" 것으로 간주된다. "본질적으로 단리된 형태"인 핵산 또는 단백질/폴리펩티드 분자는 적합한 크로마토그래피 기술, 예를 들어 폴리아크릴 아미드-겔 전기 영동과 같은 적합한 기술을 사용하여 결정된 바, 바람직하게는 본질적으로 균질하다.
본원에서 사용된 것으로 2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 "동일" 또는 "퍼센트 동일성"이란 용어는 비교하였을 때 동일하고 최대한 대응되도록 정렬된, 동일하거나 특정 퍼센트의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 가지는 2 이상의 서열 또는 부분 서열들을 지칭한다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 제2 아미노 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산의 서열 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유된 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/전체 위치의 수 (예를 들어, 중첩 위치)×100). 일부 실시양태에서, 비교되는 2개의 서열은 적합하다면 갭이 서열 내에 도입된 후 동일한 길이이다 (예를 들어, 비교되는 서열을 넘어서 연장되는 추가 서열을 배제한다). 예를 들어, 가변 영역 서열이 비교될 때, 선도 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 두 서열 간의 서열 비교를 위해, "상응하는" CDR은 양 서열에서 동일한 위치에 있는 CDR을 의미한다 (예를 들어, 각 서열의 CDR-H1).
두 서열 간의 % 동일성 또는 % 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 두 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예는 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되어 있다. 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산에 상동인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, score = 100, wordlength = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행할 수 있다. 관심있는 단백질과 상동인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, score = 50, wordlength = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST를 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 분자 간의 거리 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다 (상동). BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 이용될 수 있다. 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비제한적 예는 Myers and Miller, CABIOS (1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위한 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4가 사용될 수 있다. 서열 분석을 위한 추가적인 알고리즘은 당 업계에 공지되었으며 [Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]에 기술된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기술된 바와 같은 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 검색의 민감도와 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup=2인 경우, 비교되는 두 서열의 유사한 영역은 정렬된 잔기의 쌍을 관찰함으로써 발견된다; ktup=1이면 단일 정렬된 아미노산을 조사한다. ktup은 단백질 서열의 경우 2 또는 1로, DNA 서열의 경우 1에서 6까지 설정할 수 있다. ktup을 지정하지 않으면 디폴트값은 단백질의 경우 2이고 DNA의 경우 6이다. 대안적으로, 단백질 서열 정렬은 [Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에 기술된 바와 같은 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "공유 결합"은 잔기 사이의 직접 공유 결합, 또는 2 개의 잔기가 직접 결합되지 않고 둘 다 중간 분자 또는 도메인, 예를 들어 면역글로불린의 중간 도메인에 공유 결합되는 간접 결합을 의미한다.
"경쟁" 또는 "교차 경쟁"이라는 용어는 항체 분자, 예를 들어, 본 발명의 항-DLL3 항체 분자의 표적, 예를 들어, 인간 DLL3에 대한 결합을 방해하는 항체 분자의 능력을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 결합에 대한 방해는 직접적 또는 간접적일 수 있다 (예를 들어, 항체 분자 또는 표적의 알로스테릭 조절을 통해). 항체 분자가 다른 항체 분자의 표적에 대한 결합을 방해할 수 있는 정도, 따라서 경쟁할 수 있는지의 여부는 경쟁 결합 분석, 예를 들어 FACS 분석, ELISA 또는 BIACORE 분석을 시용하여 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경쟁 결합 분석은 정량적 경쟁 분석이다. 일부 실시양태에서, 제 1 항-DLL3 항체 분자는 제1 항체 분자의 표적에 대한 결합이 경쟁 결합 분석 (예를 들어, 본원에 기재된 경쟁 분석)에서 10% 이상, 예를 들어 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 감소되는 경우 제 2 항-DLL3 항체 분자와 표적에 대한 결합에 대해 경쟁한다고 언급된다.
본 기술이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체에 관한 경우, 명백한 언급이 없고 달리 의도되지 않는 한, 그와 동등하거나 생물학적으로 동등한 것이 본 기술의 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "이의 생물학적 동등물"은 참조 단백질, 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 언급할 때 "이의 동등물"과 동의어인 것으로 의도되고, 원하는 구조 또는 기능성을 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다. 본원에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 언급된 임의의 핵산, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 항체는 또한 그의 동등물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 동등물은 적어도 약 80%의 상동성 또는 동일성을 의도하고, 대안적으로 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 98%의 상동성 또는 동일성을 의도하고 실질적으로 참조 단백질, 폴리펩티드, 항체 또는 핵산과 등가의 생물학적 활성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "검출 가능한 표지"는 검출 가능한 신호, 즉 비색법, 형광, 전기, 방사성 및 화학 발광 신호를 포함하는 물리적 또는 화학적 신호를 생성할 수 있는 분자, 화합물 또는 조성물을 의미하며, 이는 시각적 또는 도구적 방법으로 측정될 수 있고 샘플 내 표지의 존재 및/또는 양/농도를 나타낸다.
"검출 가능한 신호"는 광자의 흡수, 방출 및/또는 산란 (무선 주파수, 마이크로파 주파수, 적외선 주파수, 가시 주파수 및 자외선 주파수 광자 포함)을 포함한 다양한 메커니즘에 의해 생성될 수 있으며 비색법, 형광, 전기, 방사성 및 화학 발광 신호를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA에서 유래된 경우, 발현에는 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱이 포함될 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플에서 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하여 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 살아있는 세포로부터 유래되거나 이에 의해 접촉되는 샘플 물질을 의미한다. 이 용어는 대상자로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 체액을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "조직 샘플"은 샘플을 얻은 대상자 내에 존재하는 세포 사이의 단면적 공간 관계를 보존하는 세포 샘플을 의미한다. 생물학적 샘플은 내부 장기의 생검이나 암에서도 얻을 수 있다.
"조직 화학" 및 세포 화학"은 현미경으로 시각화할 수 있는 방식으로 분자에 특이적으로 결합하는 제제로 샘플을 표지링하여 손상되지 않은 세포의 맥락에서 분자를 식별하는 데 사용되는 기술이다. "면역 조직 화학" 및 "면역 세포 화학"은 분자를 표지하기 위해 항체를 사용하는 조직 화학 및 세포 화학의 유형이다.
본 발명의 다중-특이적 결합 단백질
본 발명은 DLL3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 단위 (제 1 항원 결합 단위) 및 CD3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 단위 (제 2 항원 결합 단위)를 포함하는 다중 특이적 결합 단백질을 제공한다. 이러한 (다중 특이적) 결합 단백질은 또한 본원에서 (다중 특이적) 결합 분자 또는 DLL3/CD3 결합 단백질 또는 DLL3/CD3 결합 분자로 지칭된다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질이 T 세포의 존재하에 DLL3-양성 SCLC 세포주의 선택적 용해를 유도하고 낮은 이펙터 대 표적 세포 비율에서 이미 활성임을 발견하였다. 중요한 것은, 본 발명의 결합 단백질이 DLL3-양성 세포의 부재 또는 DLL3-음성 세포의 용해에서 T 세포 활성화, T 세포 증식 및 사이토카인 분비를 유발하지 않는다는 것이다.
의심의 여지를 없애기 위해, 본원에 사용된 DLL3은 UniProt Q9NYJ7의 인간 DLL3 및 그 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용된 CD3은 인간 CD3epsilon (UniProt P07766) 및 CD3 감마 (Uniprot: P09693) 복합체 (인간 CD3 εγ 복합체)를 의미한다.
T 세포를 지향하는 것이 화학요법에 대한 내성에 영향을 받지 않고 세포 표면의 낮은 발현 수준이 이 작용 방식에 덜 중요하기 때문에, 이중 특이적 T 세포 참여 접근법으로 DLL3을 표적화하는 것이 ADC 접근법에 비해 이점을 제공할 것으로 예상된다. T 세포 참여자는 T 세포의 CD3에 대한 결합 암과 종양 세포의 세포 표면에 있는 항원에 대한 결합 암을 가진 다중 특이적 결합 단백질이다. T 세포와 종양 세포에 동시에 결합함으로써 T 세포는 두 세포 사이에 세포 용해 시냅스의 형성을 강제하므로 T 세포 활성을 표적 종양 세포로 선택적으로 지향한다.
한 측면에서, 본 발명의 다중 특이적 결합 단백질은 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함하며, 여기서 상기 제 1 결합 단위는 하기 i) 내지 xviii로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#1);
ii) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#2);
iii) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#3);
iv) 서열 번호 19 (CDR1), 서열 번호 20 (CDR2) 및 서열 번호 21 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 22 (CDR1), 서열 번호 23 (CDR2) 및 서열 번호 24 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#4);
v) 서열 번호 25 (CDR1), 서열 번호 26 (CDR2) 및 서열 번호 27 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 28 (CDR1), 서열 번호 29 (CDR2) 및 서열 번호 30 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#5);
Vi) 서열 번호 31 (CDR1), 서열 번호 32 (CDR2) 및 서열 번호 33 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 34 (CDR1), 서열 번호 35 (CDR2) 및 서열 번호 36 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#6);
vii) 서열 번호 133 (CDR1), 서열 번호 134 (CDR2) 및 서열 번호 135 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 136 (CDR1), 서열 번호 137 (CDR2) 및 서열 번호 138 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#7);
viii) 서열 번호 139 (CDR1), 서열 번호 140 (CDR2) 및 서열 번호 141 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 142 (CDR1), 서열 번호 143 (CDR2) 및 서열 번호 144 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#8);
ix) 서열 번호 145 (CDR1), 서열 번호 146 (CDR2) 및 서열 번호 147 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 148 (CDR1), 서열 번호 149 (CDR2) 및 서열 번호 150 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#9);
x) 서열 번호 15l (CDR1), 서열 번호 152 (CDR2) 및 서열 번호 153 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 154 (CDR1), 서열 번호 155 (CDR2) 및 서열 번호 156 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#10);
xi) 서열 번호 157 (CDR1), 서열 번호 158 (CDR2) 및 서열 번호 159 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 160 (CDR1), 서열 번호 161 (CDR2) 및 서열 번호 162 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#11);
xii) 서열 번호 163 (CDR1), 서열 번호 164 (CDR2) 및 서열 번호 165 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 166 (CDR1), 서열 번호 167 (CDR2) 및 서열 번호 168 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#12);
xiii) 서열 번호 169 (CDR1), 서열 번호 170 (CDR2) 및 서열 번호 171 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 172 (CDR1), 서열 번호 173 (CDR2) 및 서열 번호 174 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#13);
xiv) 서열 번호 175 (CDR1), 서열 번호 176 (CDR2) 및 서열 번호 177 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 178 (CDR1), 서열 번호 179 (CDR2) 및 서열 번호 180 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#14);
xv) 서열 번호 181 (CDR1), 서열 번호 182 (CDR2) 및 서열 번호 183 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 184 (CDR1), 서열 번호 185 (CDR2) 및 서열 번호 186 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#15);
xvi) 서열 번호 187 (CDR1), 서열 번호 188 (CDR2) 및 서열 번호 189 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 190 (CDR1), 서열 번호 191 (CDR2) 및 서열 번호 192 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#16);
xvii) 서열 번호 193 (CDR1), 서열 번호 194 (CDR2) 및 서열 번호 195 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 196 (CDR1), 서열 번호 197 (CDR2) 및 서열 번호 198 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#17); 및
xviii) 서열 번호 199 (CDR1), 서열 번호 200 (CDR2) 및 서열 번호 201 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 202 (CDR1), 서열 번호 203 (CDR2) 및 서열 번호 204 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 DLL3#18).
바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질의 제 1 항원 결합 단위는 상기 CDR 서열에 의해 정의된 i) 내지 iii) 중 어느 하나이다.
의심의 여지를 없애기 위해, 여기에 나열된 각각의 특정 실시양태는 본 발명의 독립적인 측면으로 간주될 수도 있다.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 항원 결합 단위는 하기 i) 내지 iii)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 CD3#1);
ii) 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 CD3#2); 및
iii) 서열 번호 96 (CDR1), 서열 번호 97 (CDR2) 및 서열 번호 98 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 99 (CDR1), 서열 번호 100 (CDR2) 및 서열 번호 101 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위 (항원 결합 단위 CD3#3).
위에 설명된 바와 같은 제 1 항원 결합 단위 i) 내지 xviii)은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 및 DLL3#18로 각각 지칭되고, 위에 설명된 바와 같은 제 2 항원 결합 단위 i) 내지 iii)은 CD3#1, CD3#2 및 CD3#3으로 각각 지칭된다. 본원에서는 본 발명의 특정 항원 결합 단위 및 전장 결합 단백질에 대한 개별 아미노산 서열의 식별 용이성을 위해 서열 표를 제공한다. 이것은 실시예 2의 표 1에 요약되었다.
일반적으로 본원에서 사용되는 항원 결합 단위에 관한 용어 "제 1" 및 "제 2"는 이들 단위가 (다른 표적 항원에 결합하기 때문에) 2 개의 상이한 단위임을 나타내기 위한 것이다. 따라서, 이들 용어는 본 발명의 결합 단백질 내의 단위의 정확한 순서 또는 서열을 나타내는 것으로 이해되지 않아야 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 및 DLL3#18로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 항원 결합 단위 및 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 CD3#1의 제 2 항원 결합 단위를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2 및 DLL3#3으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 항원 결합 단위 및 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 CD3#1의 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 및 DLL3#18로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 항원 결합 단위 및 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 CD3#2의 제 2 항원 결합 단위를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, 및 DLL3#3으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 항원 결합 단위 및 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 CD3#2의 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 및 DLL3#18로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 항원 결합 단위 및 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 CD3#3의 제 2 항원 결합 단위를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, 및 DLL3#3으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 항원 결합 단위 및 상기 기재된 각각의 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 CD3#3의 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1) 및 서열 번호 5 (CDR2), 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위와 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위와 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위와 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1) 및 서열 번호 5 (CDR2), 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위와 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위와 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위와 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
본원에 기재된 CDR 서열에 추가하여, 본 발명의 결합 단백질의 항원 결합 단위는 면역글로불린 프레임워크 영역 (FR) 서열을 포함한다. 이들 서열은 바람직하게는 인간에서 면역원성이 아니므로 바람직하게는 인간 또는 인간화된 FR 서열이다. 적합한 인간 또는 인간화 FR 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 특히 바람직한 FR 서열은 완전한 항원 결합 단위 및 이에 따른 CDR 서열 및 FR 서열을 개시하는 본원에 제시된 실시양태로부터 취해질 수 있다.
본 발명의 결합 단백질의 바람직한 실시양태에서, 제 1 및 제 2 결합 단위는 각각 항체 분자로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인, 제 1 항원 결합 단위에 대해 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나의 CDR 서열에 의해 정의된 상기 경쇄/중쇄 가변 도메인 및 제 2 항원 결합 단위에 대해 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나의 CDR 서열에 의해 정의된 상기 경쇄/중쇄 가변 도메인을 포함한다. 본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17, DLL3#18, CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나 이상의 항원 결합 단위의 VH 및/또는 VL 도메인은 인간 또는 인간화 VH 및/또는 VL 도메인이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 단위의 경쇄/중쇄 가변 도메인은 다음과 같이 추가로 정의된다.
i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#1); 또는
ii) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#2); 또는
iii) 서열 번호 4l의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#3); 또는
iv) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#4); 또는
v) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#5); 또는
vi) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#6); 또는
vii) 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#7); 또는
viii) 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#8); 또는
ix) 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#9); 또는
x) 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#10); 또는
xi) 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#11); 또는
xii) 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#12); 또는
xiii) 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#13); 또는
xiv) 서열 번호 2l9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#14); 또는
xv) 서열 번호 22l의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#15); 또는
xvi) 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#16); 또는
xvii) 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#17); 또는
xviii) 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 DLL3#18).
바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질의 제 1 항원 결합 단위는 상기 VL 및 VH 서열에 의해 정의된 바와 같은 i) 내지 iii) 중 어느 하나이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제 2 항원 결합 단위의 경쇄/중쇄 가변 도메인은 다음과 같이 추가로 정의된다.
i) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 CD3#1); 또는
ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 CD3#2); 또는
iii) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (항원 결합 단위 CD3#3).
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2,DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3, DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 및 제 2 항원 결합 단위의 조합을 포함하고, 제 1 및 제 2 항원 결합 단위는 상기 기재된 바와 같은 항원 결합 단위의 CDR 및/또는 VH 및 VL 서열에 의해 정의된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3 및 DLL3#3/CD3#3으로 이루어진 군으로부터 선택된 제 1 및 제 2 항원 결합 단위의 조합을 포함하고, 제 1 및 제 2 항원 결합 단위는 상기 기재된 바와 같은 항원 결합 단위의 CDR 및/또는 VH 및 VL 서열에 의해 정의된다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 (ii) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 (ii) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 (ii) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 (ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 (ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 (ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 i) 제 1 펩티드 링커와 제 1 중쇄 가변 도메인에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 제 1 경쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3 (예를 들어, 상기 각각의 CDR 또는 VH/VL 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나)에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및/또는 ii) 제 2 펩티드 링커와 제 2 중쇄 가변 도메인에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 제 2 경쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3 (예를 들어, 상기 각각의 CDR 또는 VH/VL 서열에 의해 정의된 바와 같은 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나)에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함한다.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 단위는 통상적인 항체 분자의 경/중 Fab 도메인에서와 같이 CL 및 CH1 도메인을 추가로 포함하고, 따라서 상기 제 1 결합 단위는 a) 제 1 CL 도메인에 공유 연결 (직접 또는 간접 결합)된 VL 도메인 (예를 들어, 경쇄 CDR (LCCDR) 또는 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나의 VL 서열에 의해 정의됨) 및 b) 제 1 CH 도메인에 공유 결합(직접 또는 간접 결합)된 VH 도메인 (예를 들어, 중쇄 CDR (HCCDR) 또는 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6 DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나의 VH 서열에 의해 정의됨)을 포함하고/거나, 상기 제 2 결합 단위는 a) 제 2 CL 도메인에 공유 결합(직접 또는 간접 결합)된 VL 도메인 (예를 들어, LCCDR 또는 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나의 VL 서열에 의해 정의됨) 및 b) 제 2 CH 도메인에 공유 결합(직접 또는 간접 결합)된 VH 도메인 (예를 들어, HCCDR 또는 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나의 VH 서열에 의해 정의됨)을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, CL 도메인은 항체 경쇄의 불변 도메인, 예를 들어 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄이다. 카파 경쇄의 불변 영역의 예는 서열 번호 87에 제시되어 있다. 람다 경쇄의 불변 영역의 예는 서열 번호 88에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 제 1 및 제 2 CL 도메인은 동일하고, 예를 들어, 제 1 및 제 2 CL 도메인은 모두 카파 경쇄 불변 도메인이거나 제 1 및 제 2 CL 도메인은 둘 다 람다 경쇄 불변 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제 1 및 제 2 CL 도메인은 상이하고, 예를 들어, 제 1 CL 도메인은 불변 카파 도메인이고 제 2 CL 도메인은 불변 람다 도메인이거나 그 반대이다.
본 발명의 맥락에서, CH1 도메인은 항체 중쇄의 제 1 불변 도메인이다. 불변 CH1 도메인의 예는 서열 번호 253에 제시되어 있다.
본 발명의 결합 단백질의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질의 제 1 항원 결합 단위 (예를 들어, 상술한 바와 같은 CDR 및/또는 VH/VL에 의해 정의된 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나)는 N-에서 C-말단으로 제 1 경쇄 가변 도메인, 제 1 CL 도메인, 제 1 링커 펩티드, 제 1 VH 도메인 및 제 1 CH1 도메인을 포함하고/거나, 본 발명의 결합 단백질의 제 2 결합 단위 (예를 들어, 상술한 바와 같은 CDR 및/또는 VH/VL에 의해 정의된 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나)는 N-에서 C-말단으로 제 2 경쇄 가변 도메인, 제 2 CL 도메인, 제 2 링커 펩티드, 제 2 VH 도메인 및 제 2 CH1 도메인을 포함한다. 이 실시양태에서, 제 1 및/또는 제 2 결합 단위는 단쇄 Fab의 구조를 갖는다. 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 단위 둘 다, 단쇄 Fab를 형성할 때, 항원 결합 단위가 VH-CH1-[링커 펩티드]-VL-CL을 포함하도록 N-에서 C-말단으로 순서가 역전될 수 있다. 본 발명의 단백질의 일부 실시양태에서, 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 단위가 Fab 또는 단쇄 Fab을 포함하는 경우, 불변 도메인은 동일한 유형이거나 (예를 들어, 두 CL 도메인은 모두 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인임), 상이한 유형 (제 1 CL 도메인은 카파이고 제 2 CL 도메인은 람다 경쇄 불변 도메인이거나, 또는 그 반대임)일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 결합 단백질에 사용되는 링커는 26 내지 42 개의 아미노산, 예를 들어 30 내지 40 개의 아미노산을 포함한다. 추가 측면에서, 본 발명의 단백질에 사용되는 링커는 34 내지 40 개의 아미노산, 예를 들어 36 내지 39 개의 아미노산, 예를 들어 38 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열 번호 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95, 바람직하게는 서열 번호 89 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
링커 서열은 자연 발생 서열 또는 비자연 발생 서열일 수 있다. 치료 목적으로 사용되는 경우, 링커는 바람직하게는 본 발명의 결합 단백질이 투여되는 대상체에서 비면역원성이다.
하나의 유용한 링커 서열 그룹은 WO1996/34103호 및 WO1994/04678호에 기재된 바와 같은 중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 링커이다. 다른 예는 Ala-Ala-Ala와 같은 폴리알라닌 링커 서열이다.
링커 서열의 추가의 바람직한 예는 예를 들어, (gly4ser)3, (gly4ser)5, (gly4ser)7, (gly3ser)3, (gly3ser)5, (gly3ser)7, (gly3ser2)3, (gly3ser2)5, 및 (gly3ser2)7을 포함한 (glyxsery)z 링커와 같은 상이한 길이의 Gly/Ser 링커 또는 서열 번호 89 내지 95 중 어느 하나의 링커이다.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 제 1 항원 결합 단위의 VL 도메인 (예를 들어, 경쇄 CDR (LCCDR) 또는 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18의 VL 서열에 의해 정의됨)은 제 1 Gly/Ser 링커 (예를 들어, 26 내지 42 아미노산, 30 내지 40 아미노산, 34 내지 40 아미노산, 또는 36 내지 39 아미노산, 바람직하게는 38 아미노산 중 어느 하나의 Gly/Ser 링커)를 통해 제 1 항원 결합 단위의 VH 도메인 (예를 들어, 중쇄 CDR (HCCDR) 또는 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18의 VH 서열에 의해 정의됨)에 공유 연결 (예를 들어, 직접 결합)되고; 제 2 항원 결합 단위의 VL 도메인 (예를 들어, 경쇄 CDR (LCCDR) 또는 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3의 VL 서열에 의해 정의됨)은 제 2 Gly/Ser 링커 (예를 들어, 26 내지 42 아미노산, 30 내지 40 아미노산, 34 내지 40 아미노산, 또는 36 내지 39 아미노산, 바람직하게는 38 아미노산 중 어느 하나의 Gly/Ser 링커)를 통해 제 2 항원 결합 단위의 VH 도메인 (예를 들어, 중쇄 CDR (HCCDR) 또는 CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3의 VH 서열에 의해 정의됨)에 공유 연결 (예를 들어, 직접 결합)된다. 보다 바람직하게는, 제 1 및 제 2 링커는 동일하다. 보다 더 바람직하게는, 제 1 및 제 2 링커는 각각 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3에 특이적인 제 1 항원 결합 단위를 형성하고 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 5l, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 229, 서열 번호 230, 서열 번호 231, 서열 번호 232, 서열 번호 233, 서열 번호 234, 서열 번호 235, 서열 번호 236, 서열 번호 237, 서열 번호 238, 서열 번호 239, 및 서열 번호 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 제 1 단쇄 Fab 및 CD3에 특이적인 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 서열 번호 71의 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 49의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 71의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 50의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 71의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 51의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 71의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3에 특이적인 제 1 항원 결합 단위를 형성하고 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54 서열 번호 229, 서열 번호 230, 서열 번호 231, 서열 번호 232, 서열 번호 233, 서열 번호 234, SEQ ID O:235, 서열 번호 236, 서열 번호 237, 서열 번호 238, 서열 번호 239, 및 서열 번호 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 제 1 단쇄 Fab 및 CD3에 특이적인 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 서열 번호 72의 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 49의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 50의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 51의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3에 특이적인 제 1 항원 결합 단위를 형성하고 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54 서열 번호 229, 서열 번호 230, 서열 번호 231, 서열 번호 232, 서열 번호 233, 서열 번호 234, 서열 번호 235, 서열 번호 236, 서열 번호 237, 서열 번호 238, 서열 번호 239, 및 서열 번호 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 제 1 단쇄 Fab 및 CD3에 특이적인 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 서열 번호 104의 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 49의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 104의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 50의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 104의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 51의 서열을 포함하는 제 1 항원 결합 단위를 형성하는 제 1 단쇄 Fab 및 서열 번호 104의 서열을 포함하는 제 2 항원 결합 단위를 형성하는 제 2 단쇄 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제 1 항원 결합 단위 (예를 들어, 상술된 CDR 및/또는 VH/VL 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18) 및/또는 제 2 항원 결합 단위 (예를 들어, CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3)는 공유적으로 CL 도메인에 연결된 (예를 들어 직접 결합된) VL 도메인 및 CH1 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함하고 (즉, 함께 항체로부터 유래된 Fab 단편을 형성), 상기 CH1 도메인은 Fc 도메인에 추가로 공유 결합 (예를 들어 직접 결합)되어 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는 통상적인 Y 형 항체 분자의 암을 형성한다. 일부 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 단위는 각각 Fab 단편, 즉, 제 1 및 제 2 Fc 도메인에 각각 공유 결합 (예를 들어 직접 결합)되어 있는 제 1 및 제 2 Fab 단편을 형성하여 기존의 이종사량체 이중 특이적 2 가 항체 분자를 형성한다.
바람직한 실시양태에서, 제 1 항원 결합 단위 (예를 들어, 상술된 CDR 및/또는 VH/VL 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나) 및/또는 제 2 항원 결합 단위 (예를 들어, CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나)는 펩티드 링커 (예를 들어, 26 내지 42 아미노산, 30 내지 40 아미노산, 34 내지 40 아미노산, 또는 36 내지 39 아미노산, 바람직하게는 38 아미노산 중 어느 하나의 Gly/Ser 링커, 보다 더 바람직하게는 서열 번호 89의 링커)를 통해 중쇄의 VH-CH1 도메인에 공유 연결된 단쇄 Fab, 즉 항체 경쇄 (VL-CL)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3 (예를 들어, 상기 각각의 CDR 또는 VH/VL 서열에 의해 정의된 바와 같은 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나, 바람직하게는 제 1 항원 결합 단위는 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3임)에 특이적으로 결합하는 제 1 단쇄 Fab 및 제 1 Fc 도메인 (본원에서 이 폴리펩티드 쇄는 "DLL3 쇄"라고도 함)을 포함하는 1 폴리펩티드 쇄와 CD3 (예를 들어, 상기 각각의 CDR 또는 VH/VF 서열에 의해 정의된 CD3#1 CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나)에 특이적으로 결합하는 제 2 단쇄 Fab 및 제 2 폴리펩티드 쇄 Fc 도메인 (본원에서 이 폴리펩티드 쇄는 "CD3 쇄"라고도 함)을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제 1 및 제 2 Fc 도메인은 동일하다. 바람직한 실시양태에서, 제 1 및 제 2 Fc 도메인은 상이하다. 본 발명의 생성된 결합 단백질은 완전한 Fc를 보유하고 2 개의 독립적인 결합 부위, 즉 DLL3에 대한 제 1 결합 단위 및 CD3에 대한 제 2 결합 단위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제 1 항원 결합 단위는 단일 폴리펩티드 쇄 (DLL3 쇄)로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제 2 항원 결합 단위는 단일 폴리펩티드 쇄 (CD3 쇄)로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원 결합 단위 둘다는 각각 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 제 1 항원 결합 단위는 제 1 폴리펩티드 쇄 (DLL3 쇄)에 의해 형성되고 제 2 항원 결합 단위는 제 2 폴리펩티드 쇄 (CD3 쇄)에 의해 형성된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 각각 상이한 특이성을 갖는 항원 결합 단위를 포함하는 2 개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 폴리펩티드 쇄는 이황화 결합을 통해 또는 잠재적으로 펩티드 링커를 통해 서로 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단위 (예를 들어, 각각의 CDR 및/또는 VH/VL 서열에 의해 정의된 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 중 어느 하나)를 포함하는 하나의 폴리펩티드 쇄 (제 1 폴리펩티드 쇄 또는 DLL3 쇄) 및 CD3 (예를 들어, CD3#1, CD3#2 또는 CD3#3 중 어느 하나)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단위를 포함하는 다른 폴리펩티드 쇄 (제 2 폴리펩티드 쇄 또는 CD3 쇄)를 포함하는 2 개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이중 특이적, 2가 이종이량체 단백질이다.
본 발명의 맥락에서, Fc 도메인은 예를 들어 IgG의 중쇄, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4 중쇄의 Fc 도메인이며 힌지 영역과 2 개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 포함한다. Fc 도메인 (힌지 영역 포함)의 예는 서열 번호 81 및 84에 제시되어 있다.
본 발명의 단백질의 아미노산 쇄에서 아미노산의 넘버링은 달리 명시되지 않는 한 EU 넘버링 시스템 (Edelman, Cunningham et al. 1969)에 따른다. 이는 본원에 표시된 아미노산 번호가 달리 명시되지 않는 한 EU 넘버링 시스템에 따라 해당 하위 유형의 중쇄 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4)의 위치에 해당함을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 제 1 Fc 도메인 및 제 2 Fc 도메인은 각각 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄의 이종이량체 대신에 제 1 또는 제 2 폴리펩티드 쇄의 동종이량체의 형성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 이러한 변화를 통해, 중쇄 중 하나의 인터페이스로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 Fc 도메인 중 하나에서 "돌출부"가 생성된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체하여 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"이 다른 Fc 도메인의 인터페이스에 생성된다. 이것은 동종이량체, 특히 "돌출부"를 갖는 Fc 도메인의 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다 (예를 들어 Ridgway et al. Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21 ; Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35 참조). 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 변화는 제 1 Fc 도메인의 위치 366에서의 티로신 (Y) [T366Y] 및 제 2 Fc 도메인의 위치 407에서의 트레오닌 (T) [Y407T]이다. 일부 실시양태에서, 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 세린 (S) [T366S]을 포함하고 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 트립토판 (W) [T366W], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 81의 인간 IgG1 Fc 서열에서 아미노산 위치 146에 해당하는 EU 넘버링에 따른 Fc 도메인의 위치 366은 서열 번호 81의 위치 146에서의 T에서 서열 번호 82의 위치 146에서의 W로 변경된다; 서열 번호 81의 아미노산 위치 146, 148 및 187에 각각 상응하는 EU 넘버링에 따른 위치 366, 368 및 407은 서열 번호 81의 이들 위치에서 T, L 및 Y로부터 서열 번호 83의 이들 위치에서 S, A 및 V로 변경된다. 이들 실시양태 중 어느 하나에서, 제 1 Fc 도메인에 대해 기재된 아미노산 변화는 제 2 Fc 도메인에 위치할 수 있고, 제 2 Fc 도메인에 대한 각각의 아미노산 변화는 제 1 Fc 도메인에 위치할 수 있다. 즉, 용어 "제 1" 및 "제 2"는 이들 실시양태예에서 교환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 중쇄로부터 유래된 Fc 도메인이다.
일부 실시양태에서, 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 트립토판 (W) [T366W] 외에 위치 354에 시스테인 (C) [S354C]을 포함하고, 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V] 외에, 위치 349에 시스테인 (C) [Y349C]을 포함한다. 한 측면에서, 이러한 Fc 도메인은 IgG4의 중쇄에서 유래된 Fc 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질에서 제 1 Fc 도메인 또는 제 2 Fc 도메인은 단백질 A에 대한 Fc 도메인의 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변화를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 변화는 Fc 도메인 중 하나의 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에 페닐알라닌 [Y436F]이다. 두 가지 변화 모두 인간 IgG3의 서열에서 유래된다 (IgG3 서열은 단백질 A에 결합하지 않음). 이들 2 개의 돌연변이는 CH3 도메인에 위치하고 Fc 도메인 중 하나에 통합되어 단백질 A에 대한 결합을 감소시킨다 (예를 들어 Jendeberg et al. J Immunol Methods, 1997. 201 (1): p. 25-34 참조). 이러한 두 가지 변화는 단백질 정제 동안 이러한 변화를 포함하는 중쇄의 동종이량체의 제거를 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질에서, 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하는 Fc 도메인은 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436 [Y436F]에 페닐알라닌을 추가로 포함한다. 이 경우, 다른 중쇄는 위치 366에 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하지만 위치 435 및 436에서 두 가지 변화를 포함하지 않는다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질에서 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함하는 Fc 도메인은 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에 페닐알라닌 [Y436F]을 추가로 포함한다. 이 경우, 다른 Fc 도메인은 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하지만 위치 435 및 436에 2 개의 변화를 포함하지 않는다. 따라서, 전술한 바와 같이 "공동"을 초래하는 아미노산 변화를 포함하는 Fc 도메인은 또한 단백질 A에 대한 결합을 감소시키는 아미노산 변화를 포함한다. 이 Fc 도메인을 포함하는 동종이량체는 단백질 A에 대한 결합 감소를 통해 제거된다. "돌출부"를 포함하는 다른 Fc 도메인의 동종이량체의 생성이 "돌출부"의 존재에 의해 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 Fc 도메인은 YTE 돌연변이 (M252Y/S254T/T256E, EU 넘버링 (Dall'Acqua, Kiener et al. 2006))를 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이들 돌연변이는 pH 6.0에서 신생아 FcRn 수용체에 대한 결합 친화성의 우선적 향상을 통해 Fc 도메인의 약동학적 특성을 개선하는 것으로 나타났다.
일부 실시양태에서, IgG1로부터 유래된 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 Fc 도메인은 또한 "KO" 돌연변이 (L234A, L235A)를 포함한다. 추가 측면에서, IgG4로부터 유래된 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 Fc 도메인은 또한 Pro 힌지 돌연변이 (S228P)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 결합 단백질은 i) 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#1/CD3#1), 또는 ii) 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#2/CD3#1), 또는 iii) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#3/CD3#1), 또는 iv) 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#4/CD3#1), 또는 v) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#5/CD3#1), 또는 vi) 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#6/CD3#1); 또는 vii) 서열 번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#7/CD3#1); 또는 viii) 서열 번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#8/CD3#1); 또는 ix) 서열 번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#9/CD3#1); 또는 x) 서열 번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#10/CD3#1); 또는 xi) 서열 번호 245의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#11/CD3#1); 또는 xii) 서열 번호 246의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#12/CD3#1); 또는 xiii) 서열 번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#13/CD3#1); 또는 xiv) 서열 번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#14/CD3#1); 또는 xv) 서열 번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#15/CD3#1), 또는 xvi) 서열 번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#16/CD3#1); 또는 xvii) 서열 번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#17/CD3#1); 또는 xviii) 서열 번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#18/CD3#1)를 포함한다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 이황화 결합을 통해 연결되고 통상적인 Y 형 항체 분자와 유사한 항체 유사 구조 (도 1)를 형성한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 73, 서열 번호 74 및 서열 번호 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 결합 단백질은 i) 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#1/CD3#2), 또는 ii) 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#2/CD3#2), 또는 iii) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#3/CD3#2), 또는 iv) 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#4/CD3#2), 또는 v) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#5/CD3#2), 또는 vi) 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#6/CD3#2); 또는 vii) 서열 번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#7/CD3#2); 또는 viii) 서열 번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#8/CD3#2); 또는 ix) 서열 번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#9/CD3#2); 또는 x) 서열 번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#10/CD3#2); 또는 xi) 서열 번호 245의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#11/CD3#2); 또는 xii) 서열 번호 246의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#12/CD3#2); 또는 xiii) 서열 번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#13/CD3#2); 또는 xiv) 서열 번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#14/CD3#2); 또는 xv) 서열 번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#15/CD3#2), 또는 xvi) 서열 번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#16/CD3#2); 또는 xvii) 서열 번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#17/CD3#2); 또는 xviii) 서열 번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#18/CD3#2)를 포함한다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 이황화 결합을 통해 연결되고 통상적인 Y 형 항체 분자와 유사한 항체 유사 구조 (도 1)를 형성한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 73, 서열 번호 74 및 서열 번호 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 80의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 80의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 80의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 결합 단백질은 i) 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#1/CD3#3), 또는 ii) 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#2/CD3#3), 또는 iii) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#3/CD3#3), 또는 iv) 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#4/CD3#3), 또는 v) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#5/CD3#3), 또는 vi) 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#6/CD3#3); 또는 vii) 서열 번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#7/CD3#3); 또는 viii) 서열 번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#8/CD3#3); 또는 ix) 서열 번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#9/CD3#3); 또는 x) 서열 번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#10/CD3#3); 또는 xi) 서열 번호 245의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#11/CD3#3); 또는 xii) 서열 번호 246의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#12/CD3#3); 또는 xiii) 서열 번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#13/CD3#3); 또는 xiv) 서열 번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#14/CD3#3); 또는 xv) 서열 번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#15/CD3#3), 또는 xvi) 서열 번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#16/CD3#3); 또는 xvii) 서열 번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#17/CD3#3); 또는 xviii) 서열 번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 (DLL3#18/CD3#3)를 포함한다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 이황화 결합을 통해 연결되고 통상적인 Y 형 항체 분자와 유사한 항체 유사 구조 (도 1)를 형성한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 73, 서열 번호 74 및 서열 번호 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
상기 모든 실시양태에 대해, "포함하는"이라는 용어를 사용함으로써, 각각의 도메인 또는 분자가 지시된 바와 같은 아미노산 서열로 "구성된" 실시양태를 또한 포함하고자 하는 것으로 이해되어야 한다.
추가 측면에서, 본 발명은 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단백질을 제공하며, 여기서 제 1 쇄는 자체가 제 1 중쇄에 공유 결합 (예를 들어 직접 결합)된 제 1 링커에 공유적으로 연결된 (예를 들어 직접 결합된) 제 1 경쇄를 포함하고, CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 쇄는 자체가 제 2 중쇄에 공유 결합 (예를 들어 직접 결합)된 제 2 링커에 공유 결합 (예를 들어 직접 결합)된 제 2 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제 1 폴리펩티드 쇄는 그의 N-말단에서 시작하여, DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 경쇄 가변 영역, 제 1 경쇄 불변 영역, 제 1 링커, DLL3에 특이적인 제 1 중쇄 가변 영역 및 제 1 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제 2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 시작하여, CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 경쇄 가변 영역, 제 2 경쇄 불변 영역, 제 2 링커, CD3에 특이적인 제 2 중쇄 가변 영역 및 제 2 중쇄 불변 영역을 포함한다.
생성된 단백질은 IgG보다 약간 더 크고 2 개의 독립적인 결합 부위 (예를 들어, 각 결합 부위는 각각의 항원에 대해 1 가임), DLL3에 대한 제 1 결합 부위 및 CD3에 대한 제 2 결합 부위를 갖는 완전한 Fc를 보유한다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 이황화 결합을 통해 연결된다. 따라서, 본 발명의 단백질은 통상적인 전장 항체의 Y 형 구조를 갖는 항체-유사 구조이다 (도 1 참조). 이러한 이중 특이적 형식은 원치 않는 면역원성 반응을 생성할 가능성이 적은 구조 내에서 결합 모이어티의 기능적 특성을 유지하면서 발현 및 정제 후 (예를 들면, 상이한 결합 특이성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 오쌍을 방지함으로써) 이질성을 크게 줄인다. 이로써 예를 들면 포유동물 세포에서 이종이량체 단백질의 우수한 발현이 또한 가능해진다.
본 발명의 단백질의 일부 실시양태에서, DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄는 하기 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열을 포함하는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함한다:
i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
ii) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
iii) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
iv) 서열 번호 19 (CDR1), 서열 번호 20 (CDR2) 및 서열 번호 21 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 22 (CDR1), 서열 번호 23 (CDR2) 및 서열 번호 24 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
v) 서열 번호 25 (CDR1), 서열 번호 26 (CDR2) 및 서열 번호 27 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 28 (CDR1), 서열 번호 29 (CDR2) 및 서열 번호 30 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
vi) 서열 번호 31 (CDR1), 서열 번호 32 (CDR2) 및 서열 번호 33 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 34 (CDR1), 서열 번호 35 (CDR2) 및 서열 번호 36 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
vii) 서열 번호 133 (CDR1), 서열 번호 134 (CDR2) 및 서열 번호 135 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 136 (CDR1), 서열 번호 137 (CDR2) 및 서열 번호 138 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
viii) 서열 번호 139 (CDR1), 서열 번호 140 (CDR2) 및 서열 번호 141 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 142 (CDR1), 서열 번호 143 (CDR2) 및 서열 번호 144 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
ix) 서열 번호 145 (CDR1), 서열 번호 146 (CDR2) 및 서열 번호 147 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 148 (CDR1), 서열 번호 149 (CDR2) 및 서열 번호 150 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
x) 서열 번호 151 (CDR1), 서열 번호 152 (CDR2) 및 서열 번호 153 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 154 (CDR1), 서열 번호 155 (CDR2) 및 서열 번호 156 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xi) 서열 번호 157 (CDR1), 서열 번호 158 (CDR2) 및 서열 번호 159 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 160 (CDR1), 서열 번호 161 (CDR2) 및 서열 번호 162 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xii) 서열 번호 163 (CDR1), 서열 번호 164 (CDR2) 및 서열 번호 165 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 166 (CDR1), 서열 번호 167 (CDR2) 및 서열 번호 168 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xiii) 서열 번호 169 (CDR1), 서열 번호 170 (CDR2) 및 서열 번호 171 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 172 (CDR1), 서열 번호 173 (CDR2) 및 서열 번호 174 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xiv) 서열 번호 175 (CDR1), 서열 번호 176 (CDR2) 및 서열 번호 177 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 178 (CDR1), 서열 번호 179 (CDR2) 및 서열 번호 180 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xv) 서열 번호 181 (CDR1), 서열 번호 182 (CDR2) 및 서열 번호 183 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 184 (CDR1), 서열 번호 185 (CDR2) 및 서열 번호 186 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xvi) 서열 번호 187 (CDR1), 서열 번호 188 (CDR2) 및 서열 번호 189 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 190 (CDR1), 서열 번호 191 (CDR2) 및 서열 번호 192 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xvii) 서열 번호 193 (CDR1), 서열 번호 194 (CDR2) 및 서열 번호 195 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 196 (CDR1), 서열 번호 197 (CDR2) 및 서열 번호 198 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 및
xviii) 서열 번호 199 (CDR1), 서열 번호 200 (CDR2) 및 서열 번호 201 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 202 (CDR1), 서열 번호 203 (CDR2) 및 서열 번호 204 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR.
이들 CDR 서열에 의해 정의된 각각의 경쇄/중쇄 가변 도메인은 각각 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#1O, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17, 및 DLL3#18로 칭해진다. 바람직하게는, CDR 서열은 상기 정의된 바와 같은 i) 내지 iii) (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 결합 단백질의 바람직한 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 폴리펩티드 쇄는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열을 포함하는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함한다:
i) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
ii) 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호: 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 및
iii) 서열 번호 96 (CDR1), 서열 번호 97 (CDR2) 및 서열 번호 98 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 99 (CDR1), 서열 번호 100 (CDR2) 및 서열 번호 101 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR.
이들 CDR 서열에 의해 정의된 각각의 경쇄/중쇄 가변 도메인은 각각 CD3#1, CD3#2 및 CD3#3으로 지칭된다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 2 중쇄 가변 도메인을 갖는 제 2 경쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 제 2 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 갖는 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
본 발명의 단백질의 바람직한 실시양태에서, DLL3에 특이적으로 결합하는 상기 제 1 폴리펩티드 쇄는 하기 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 (제 1 경쇄 가변 도메인) 및 중쇄 가변 도메인 (제 1 중쇄 가변 도메인)을 포함한다:
i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#1);
ii) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#2);
iii) 서열 번호 4l의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#3);
iv) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#4);
v) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#5);
vi) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#6);
vii) 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#7);
viii) 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#8);
ix) 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#9);
x) 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#10);
xi) 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#11);
xii) 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#12);
xiii) 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#13);
xiv) 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#14);
xv) 서열 번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#15);
xvi) 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#16);
xvii) 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#17); 및
xviii) 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#18).
바람직하게는, 경쇄 가변 및 중쇄 가변 도메인 서열은 상기 정의된 바와 같은 i) 내지 iii) (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 단백질의 바람직한 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 폴리펩티드 쇄는 하기 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 (제 2 경쇄 가변 도메인) 및 중쇄 가변 도메인 (제 2 중쇄 가변 도메인)을 포함한다:
i) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (CD3#1);
ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (CD3#2); 및
iii) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (CD3#3).
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 및 DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3으로 구성된 목록으로부터 선택된 경쇄/중쇄 가변 도메인의 CDR 및/또는 VH 및 VL 서열을 포함하는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, 및 DLL3#3/CD3#3으로 구성된 목록으로부터 선택된 경쇄/중쇄 가변 도메인의 CDR 및/또는 VH 및 VL 서열을 포함하는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 37의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 67의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 39의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 67의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 41의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 67의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 37의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 69의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 39의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 69의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 서열 번호 41의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) 서열 번호 69의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 제 1 및/또는 제 2 링커 펩티드는 상기 기재된 바와 같은 링커, 예를 들어 힌지 영역으로부터 유래된 링커, 폴리-알라닌 링커 또는 Gly/Ser 링커를 포함하며, 여기서 링커는 26 내지 42 개의 아미노산, 예를 들어 30 내지 40 개 아미노산, 34 내지 40 개 아미노산, 또는 36 내지 39 개 아미노산 중 어느 하나, 바람직하게는 38 개의 아미노산을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 229, 서열 번호 230, 서열 번호 231, 서열 번호 232, 서열 번호 233, 서열 번호 234, 서열 번호 235, 서열 번호 236, 서열 번호 237, 서열 번호 238, 서열 번호 239, 또는 서열 번호 240 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 5 l, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 229, 서열 번호 230, 서열 번호 231, 서열 번호 232, 서열 번호 233, 서열 번호 234, 서열 번호 235, 서열 번호 236, 서열 번호 237, 서열 번호 238, 서열 번호 239, 또는 서열 번호 240 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 229, 서열 번호 230, 서열 번호 231, 서열 번호 232, 서열 번호 233, 서열 번호 234, 서열 번호 235, 서열 번호 236, 서열 번호 237, 서열 번호 238, 서열 번호 239, 또는 서열 번호 240 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시양태에서, DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하고, CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 쇄는 IgG의 중쇄로부터 유래된 Fc 도메인, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4 중쇄의 Fc 도메인이며 힌지 영역과 2 개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 포함한다. 인간 IgG의 Fc 도메인의 예는 서열 번호 81 및 84에 제시되어 있다.
본 발명의 결합 단백질의 일부 실시양태에서, 중쇄는 하나 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 예를 들어, 이러한 아미노산 변화는 제 1 중쇄의 위치 366에서의 티로신 (Y) [T366Y] 및 제 2 중쇄의 위치 407에서의 트레오닌 (T) [Y407T]이다. 일부 실시양태에서, 제 1 중쇄는 위치 366에 세린 (S) [T366S]을 포함하고 제 2 중쇄는 위치 366에 트립토판 (W) [T366W], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제 1 중쇄는 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고 제 2 중쇄는 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 81의 인간 IgG1 Fc 서열에서 아미노산 위치 146에 상응하는 EU 넘버링에 따른 Fc 도메인의 위치 366은 서열 번호 81에 위치 146의 T로부터 서열 번호 82에 위치 146의 W로 변경되고; 서열 번호 81의 아미노산 위치 146, 148 및 187에 각각 상응하는 EU 넘버링에 따른 위치 366, 368 및 407은 서열 번호 81에 이들 위치에서의 T, L 및 Y로부터 서열 번호 83에 이들 위치에서의 S, A 및 V로 변경된다. 이들 실시양태 중 어느 하나에서, 제 1 중쇄에 대해 기재된 아미노산 변화는 제 2 중쇄에 위치할 수 있고 제 2 중쇄에 대한 각각의 아미노산 변화는 제 1 중쇄에 위치할 수 있다. 즉, 용어 "제 1" 및 "제 2"는 이러한 실시양태에서 교환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 IgG1 또는 IgG4의 중쇄로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 제 1 중쇄 또는 제 2 중쇄는 단백질 A에 대한 중쇄의 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변화를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 변화는 한 중쇄의 위치 435에서 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에서 페닐알라닌 [Y436F]이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질에서 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하는 중쇄는 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에 페닐알라닌 [Y436F]을 추가로 포함한다. 이 경우, 다른 중쇄는 위치 366에서 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하지만 위치 435 및 436에서 두 가지 변화를 포함하지 않는다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질에서, 중쇄는 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함하며, 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에 페닐알라닌 [Y436F]을 추가로 포함한다. 이 경우, 다른 중쇄는 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하지만, 위치 435 및 436에서의 두 가지 변화는 포함하지 않는다. 따라서, 아미노산을 포함하는 중쇄 위에서 설명한 "공동"을 초래하는 산 변화는 또한 단백질 A에 대한 결합을 감소시키는 아미노산 변화를 포함한다. 이들 중쇄를 포함하는 동종이량체는 단백질 A에 대한 결합 감소를 통해 제거된다. "돌출부"를 포함하는 다른 중쇄의 동종이량체의 생성은 "돌출부"의 존재에 의해 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 중쇄는 YTE 돌연변이 (M252Y/S254T/T256E, EU 넘버링 (Dall'Acqua, Kiener et al. 2006))를 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이러한 돌연변이는 pH 6.0에서 신생아 FcRn 수용체에 대한 결합 친화성의 우선적 향상을 통해 중쇄의 약동학적 특성을 개선하는 것으로 나타났다.
일부 실시양태에서, IgG1로부터 유래된 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 중쇄는 또한 "KO" 돌연변이 (L234A, L235A)를 포함한다. 추가 측면에서, IgG4로부터 유래된 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 중쇄는 또한 Pro 힌지 돌연변이 (S228P)를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명의 단백질은 인간 및 사이노몰구스 원숭이에 대해 바람직하게는 ≤10 nM, 보다 바람직하게는 ≤1 nM, 보다 더 바람직하게는 ≤0.1 nM, 보다 더욱 더 바람직하게는 ≤0.01 nM의 친화도를 갖는 DLL3에 특이적인 제 1 항원 결합 단위 또는 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 친화도는 예를 들어 실시예에 기술된 바와 같이 재조합 DLL3-단백질을 사용한 SPR (BIAcore) 분석, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 방법으로 측정할 수 있다. 단백질은 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3εγ 복합체에 대해 바람직하게는 ≤500 nM, 보다 바람직하게는 ≤100 nM, 더욱 더 바람직하게는 ≤10 nM의 친화도를 갖는 제 2 항원 결합 단위 또는 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질은 실시예 5에 나타낸 바와 같이 DLL3-음성 세포에 결합하지 않고 인간 및 DLL3 상동성 DLL1 및 DLL4와 교차 반응하지 않는다.
추가 측면에서, 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질은 DLL3 단백질의 막 근위 펩티드에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 또는 제 1 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 추가 측면에서, 본 발명의 단백질은 예를 들어, DLL3 단백질 발현 세포에 대해 약한 결합을 나타내며, 예를 들어 세포 표면에 결합하는 단백질의 포화는 100 nM의 농도까지 달성되지 않는다 (예를 들어 도 6 참조).
추가 측면에서, 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질은 T 세포를 표적 종양 세포에 선택적으로 활성화시켜 종양 세포 용해를 유도하도록 지향하기 위해 DLL3을 발현하는 종양 세포와 T 세포 사이의 세포 용해성 시냅스 형성을 위한 최적의 입체 조건을 제공함으로써 종양 세포에 대한 세포 독성을 매개할 수 있다.
본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질에 의해 매개되는 세포 독성을 측정하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 독성은 실시예 10에 기재된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 이펙터 세포는 예를 들어 자극되거나 자극되지 않은 (인간 또는 사이노몰구스 원숭이) T 세포 또는 이들의 서브세트 (예를 들어, CD4, CD8) 또는 자극되지 않은 (인간 또는 사이노몰구스 원숭이) 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)일 수 있다. 표적 세포는 적어도 (인간 또는 사이노몰구스 원숭이) DLL3의 세포 외 도메인을 발현해야 하며 인간 소세포 폐암종 세포주 SHP77, NCI-H82와 같은 내인성 (천연) DLL3 발현을 갖는 세포, 또는 전장 DLL3 또는 DLL3의 세포 외 도메인을 발현하는 재조합 세포일 수 있다. 이펙터 대 표적 세포 비율 (E:T)은 보통 약 10:1이지만 상이할 수 있다. DLL3/CD3 결합 분자의 세포 독성 활성은 예를 들어 48 또는 72 시간의 인큐베이션 후 LDH-방출 분석으로 결정될 수 있다. 배양 시간 및 세포 독성의 결정에 사용되는 판독의 변경이 가능하며 당업자에게 알려져 있다. 세포 독성에 대한 판독 시스템은 MTT/MTS 분석, ATP 기반 분석법, FACS 기반 분석법, 51-크롬 방출 분석, 설포로다민 B (SRB) 분석, 비색 (WST) 분석, 클론 생성 분석, ECIS 기술 및 생물 발광 분석을 포함할 수 있다.
본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질에 의해 매개되는 세포 독성 활성은 바람직하게는 세포 기반 세포 독성 분석에서 측정된다. 세포 독성은 세포 독성 분석에서 측정된 EC90 값으로 표시된다. 당업자는 정제된 T 세포가 이펙터 세포로 사용되는 경우 PBMC와 비교하여 EC90이 더 낮을 것으로 예상될 수 있음을 알고 있으며, 또한 당업자는 자극된 T 세포가 사용되는 경우 EC90이 훨씬 더 낮을 수 있음을 알고 있다. 또한 표적 세포가 세포 표면에서 적은 수의 DLL3 분자를 발현하는 세포에 비해 세포 표면에서 많은 수의 DLL3을 발현하는 경우 EC90 값이 더 낮을 것으로 예상할 수 있다. DLL3/CD3 결합 단백질의 EC90은 바람직하게는 ≤10 nM, 더 바람직하게는 ≤5 nM, 보다 더 바람직하게는 ≤1 nM이다.
바람직하게는, 본 발명의 다중 특이적 결합 단백질은 DLL3 음성 세포의 용해를 유도/매개하지 않는다. DLL3-음성 세포의 "용해를 유도/매개하지 않는다"라는 용어는 DLL3/CD3 결합 분자가 30% 이상으로 용해 또는 DLL3-음성 세포를 유도하거나 매개하지 않음, 바람직하게는 20% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 특히 5% 이하로 용해 또는 DLL3-음성 세포를 유도하거나 매개하는 것을 의미하며, 반면에, DLL3-양성 폐암 세포주의 용해는 100%로 설정된다. 이것은 보통 최대 1000 nM의 결합 단백질 농도에 적용된다.
바람직하게는, 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질은 표적화된 세포에 의해 내재화되지 않는다. 내재화 속도는 예를 들어 실시예 11에 기재된 바와 같이 분석할 수 있다. 바람직하게는, 내재화율 (예를 들어 세포 독성의 감소로 측정됨)은 DLL3/CD3 결합 단백질을 표적 세포와 4 시간 예비 인큐베이션한 후 ≤50%, 보다 바람직하게는 ≤40% 및 보다 더 바람직하게는 ≤30%이다.
또한, 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질은 95% 초과 단량체 함량 (예를 들어, 적어도 98%, 실시예 14 참조)에서 안정한 것으로 나타났고, 유리한 약동학적 특성 및 우수한 다운스트림 제조 가능성을 가지며, 또한 우수한 생체 분포를 가질 것으로 예상된다 (예를 들어, 실시예 12 참조). 본 발명의 단백질은 또한 유리한 면역원성 프로파일을 갖고 (실시예 16 참조), 시험관 내 및 생체 내에서 우수한 안정성을 갖는다 (예를 들어, 실시예 12 및 15 참조). 또한, 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질 (예를 들어, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2)은 인간화된 생체 내 이종이식 마우스 모델에서 유리한 효능을 나타낸다. DLL3/CD3 결합 단백질은 DLL3/CD3 결합 단백질의 제 1 용량 후 이미 시작된 강력한 종양 퇴행을 유도하였다. 또한, 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질은 매주 1 회 투여된 0.25 mg/kg의 매우 낮은 용량 (q7d)에서 종양 퇴행을 유도하여 치료적 적용 가능성을 더욱 뒷받침하였다. 특히 본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질은 DLL3-양성 표적 세포의 존재하에서만 선택적 T 세포 증식, T 세포 활성화, T 세포 탈과립화 및 사이토카인 분비를 유도하고 DLL3-음성 표적 세포의 존재하에서는 유도하지 않으며 (실시예 18 참조), 종양 조직으로의 T 세포 침윤을 더욱 현저하게 증가시킨다 (실시예 20 참조). 추가로 실시예 19는 DLL3/CD3 결합 단백질이 CD4+뿐만 아니라 CD8+ T 세포 지향 용해를 매개함을 입증한다. 특히, 나이브 T 세포뿐만 아니라 CD4+ 이펙터 기억, CD4+ 중앙 기억, CD8+CD45RA+ 이펙터 및 CD8+ 기억 세포는 DLL3-발현 종양 세포의 T 세포 지향 용해에 기여한다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 다중 특이적 결합 단백질의 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 단위를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 단위를 각각 코딩하는 핵산 분자의 3' 말단에 연결된 본원에 기재된 바와 같은 제 1 및/또는 제 2 Fc 도메인을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 i) DLL3에 특이적인 제 1 단쇄 Fab (예를 들어, DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 및 DLL3#18 중 어느 하나), 및 임의로 제 1 Fc 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및/또는 ii) CD3에 특이적인 제 2 단쇄 Fab (예를 들어, CD3#1, CD3#2 및 CD3#3 중 어느 하나) 및 임의로 제 2 Fc를 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄 도메인을 코딩한다.
바람직하게는 핵산 분자는 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 229, 서열 번호 230, 서열 번호 231, 서열 번호 232, 서열 번호 233, 서열 번호 234, 서열 번호 235, 서열 번호 236, 서열 번호 237, 서열 번호 238, 서열 번호 239, 또는 서열 번호 240 중 어느 하나의 제 1 단쇄 Fab 및/또는 서열 번호 7l, 서열 번호 72 또는 서열 번호 104의 제 2 단쇄 Fab를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 또는 서열 번호 252 중 어느 하나의 제 1 폴리펩티드 쇄 및/또는 서열 번호 79, 서열 번호 80 또는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다
본 발명의 추가 측면은 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 도메인 (예를 들어, 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 단쇄 Fab)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는 발현 벡터는 추가로 제 1 및/또는 제 2 항원 결합 도메인 (예를 들어, 각각 제 1 및/또는 제 2 단쇄 Fab)을 코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자에 연결된 제 1 및/또는 제 2 Fc 도메인을 코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다. 이와 같이, 발현 벡터는 제 1 Fc 도메인에 연결된 제 1 단쇄 Fab를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 Fc 도메인에 연결된 제 2 단쇄 Fab를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 또는 서열 번호 252 중 어느 하나의 제 1 폴리펩티드 쇄 및/또는 서열 번호 79를 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 또는 서열 번호 252 중 어느 하나의 제 1 폴리펩티드 쇄 및/또는 서열 번호 80을 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 또는 서열 번호 252 중 어느 하나의 제 1 폴리펩티드 쇄 및/또는 서열 번호 105를 포함하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 2 개의 발현 벡터가 사용될 수 있는데, 이 중 하나는 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄의 발현을 위해, 다른 하나는 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄의 발현을 위해 사용될 수 있고, 두 발현 벡터는 모두 재조합 단백질 발현을 위해 숙주 세포로 형질감염될 수 있다.
바람직하게는, 발현 벡터는 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 핵산 분자 또는 분자를 포함하는 벡터일 것이며, 여기서 이러한 조절 서열은 프로모터, 인핸서 또는 종결자 서열, 가장 바람직하게는 이종 프로모터, 인핸서, 또는 종결자 서열일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 DLL3에 특이적인 제 1 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 발현 벡터 및 본 발명의 CD3에 특이적인 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 발현 벡터를 갖는 숙주 세포에 관한 것이다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 다른 유용한 세포는 효모 세포 또는 기타 진균 세포이다.
적합한 포유동물 세포에는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등이 포함된다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 이종 단백질의 발현을 위해 당 업계에서 사용되는 다른 세포도 사용될 수 있다.
항-DLL3 항체
DLL3은 일반적으로 태아 뇌의 골지체의 것을 포함해 세포 내 막에서 발현되며 축주위 중배엽의 체절 형성에 중요한 역할을 한다 (Geffers et al, J Cell Biol. 2007;l78:465; Chapman et al, Hum. Mol. Genet. 20l l;20:905-916). SCLC, LCNEC 및 교모세포종을 포함한 일부 종양 유형에서 DLL3 발현의 현저한 유도는 세포 표면으로의 국소화로 이어진다; 이는 비악성 세포에서 검출 가능한 세포 표면 DLL3의 부재와 함께 종양 세포 특이적 치료와 진단 및 예후 도구로서 항-DLL3 항체의 사용을 위한 새로운 기회를 열어준다
여러 항-DLL3 항체 (예컨대 LS-c 167440, Lifespan; AP21739PU-N, Acris; LS-C 148700, LSBio)가 시판 중이다. 그러나 이러한 항체는 면역 조직 화학 (IHC), FACS 및 ELISA 분석에서 잘 수행되지 않으며 세포, 특히 종양 세포에서 발현되는 DLL3 단백질에 특이적으로 결합하지 못한다. 항-DLL3 항체도 예를 들어 W02007111733호에서 보고되었으며 신경교종 환자의 진단 용도로 제안되었지만 IHC 분석 데이터는 표시되지 않았다. 따라서 환자에서, 예를 들어 종양 세포/조직에서 DLL3 발현을 정확하게 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 진단 도구로 항-DLL3 항체를 사용하고/거나, DLL3 표적 치료의 효능을 평가하는 것은 여전히 어려운 일이다.
따라서 모든 종류의 생물학적 샘플에서 FACS, ELISA, 면역침전, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사면역분석, 유세포 분석, IHC 및 면역 측정 분석과 같은 다양한 분석에서 DLL3 단백질 발현의 정확하고 특이적인 검출에 사용할 수 있고 신뢰할 수 있는 진단 시약으로 사용할 수 있는 대체 항-DLL3 항체를 밝힐 필요가 있다.
따라서, 본 발명의 추가 측면은 다음을 포함하는 항-DLL3 항체 분자를 제공한다:
i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
ii) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
iii) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
iv) 서열 번호 19 (CDR1), 서열 번호 20 (CDR2) 및 서열 번호 2l (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 22 (CDR1), 서열 번호 23 (CDR2) 및 서열 번호 24 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
v) 서열 번호 25 (CDR1), 서열 번호 26 (CDR2) 및 서열 번호 27 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 28 (CDR1), 서열 번호 29 (CDR2) 및 서열 번호 30 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
vi) 서열 번호 3l (CDR1), 서열 번호 32 (CDR2) 및 서열 번호 33 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 34 (CDR1), 서열 번호 35 (CDR2) 및 서열 번호 36 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
vii) 서열 번호 133 (CDR1), 서열 번호 134 (CDR2) 및 서열 번호 135 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 136 (CDR1), 서열 번호 137 (CDR2) 및 서열 번호 138 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
viii) 서열 번호 139 (CDR1), 서열 번호 140 (CDR2) 및 서열 번호 141 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 142 (CDR1), 서열 번호 143 (CDR2) 및 서열 번호 144 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
ix) 서열 번호 145 (CDR1), 서열 번호 146 (CDR2) 및 서열 번호 147 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 148 (CDR1), 서열 번호 149 (CDR2) 및 서열 번호 150 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
x) 서열 번호 151 (CDR1), 서열 번호 152 (CDR2) 및 서열 번호 153 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 154 (CDR1), 서열 번호 155 (CDR2) 및 서열 번호 156 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xi) 서열 번호 157 (CDR1), 서열 번호 158 (CDR2) 및 서열 번호 159 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 160 (CDR1), 서열 번호 161 (CDR2) 및 서열 번호 162 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xii) 서열 번호 163 (CDR1), 서열 번호 164 (CDR2) 및 서열 번호 165 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 166 (CDR1), 서열 번호 167 (CDR2) 및 서열 번호 168 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xiii) 서열 번호 169 (CDR1), 서열 번호 170 (CDR2) 및 서열 번호 171 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 172 (CDR1), 서열 번호 173 (CDR2) 및 서열 번호 174 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xiv) 서열 번호 175 (CDR1), 서열 번호 176 (CDR2) 및 서열 번호 177 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 178 (CDR1), 서열 번호 179 (CDR2) 및 서열 번호 180 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xv) 서열 번호 181 (CDR1), 서열 번호 182 (CDR2) 및 서열 번호 183 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 184 (CDR1), 서열 번호 185 (CDR2) 및 서열 번호 186 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xvi) 서열 번호 187 (CDR1), 서열 번호 188 (CDR2) 및 서열 번호 189 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 190 (CDR1), 서열 번호 191 (CDR2) 및 서열 번호 192 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xvii) 서열 번호 193 (CDR1), 서열 번호 194 (CDR2) 및 서열 번호 195 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 196 (CDR1), 서열 번호 197 (CDR2) 및 서열 번호 198 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xviii) 서열 번호 199 (CDR1), 서열 번호 200 (CDR2) 및 서열 번호 201 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 202 (CDR1), 서열 번호 203 (CDR2) 및 서열 번호 204 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR.
위에 설명된 i) 내지 xviii)의 항체는 각각 DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18로 칭해진다. 본 발명의 특정 항체에 대한 개별 아미노산 서열의 확인을 용이하게 하기 위한 서열 표가 본원에 제공된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 분자는 DLL3#1 또는 DLL3#5에 상응하는 상기 i) 또는 v)에 정의된 CDR 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체 분자이다. 일부 실시양태에서, 항체 분자는 모노클로날 항체 Fab, F(ab)2, Fv 또는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체 분자의 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체는 서열 번호 38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 바람직하게는, 항체 분자는 서열 번호 38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 또는 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체 분자는 서열 번호 37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 및 227 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
바람직하게는, 항체 분자는 서열 번호 37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 또는 227.의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
아미노산 서열 동일성을 계산하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며 본 명세서의 정의 섹션에서 상세히 기재되었다.
일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체 분자는 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (DLL3#1), 또는 ii) 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (DLL3#2); 또는 iii) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (DLL3#3), 또는 iv) 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (DLL3#4); 또는 v) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (DLL3#5); 또는 vi) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (DLL3#6); 또는 vii) 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#7); 또는 viii) 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#8); 또는 ix) 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#9); 또는 x) 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#10); 또는 xi) 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#11); 또는 xii) 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#12); 또는 xiii) 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#13); 또는 xiv) 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#14); 또는 xv) 서열 번호 22l의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#15); 또는 xvi) 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#16); 또는 xvii) 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#17); 또는 xviii) 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (DLL3#18)을 가진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체는 마우스 모노클로날 항체이다. 본 발명의 맥락에서, 마우스 모노클로날 항체는 인간 DLL3 단백질로 마우스를 면역화하고, 인간 DLL3에 대한 특정 친화도로 결합하는 적합한 VH 및 VL 서열을 후속 선택한 후, 상기 VH 및 VL 서열을 재조합 기술에 의해 마우스 (예를 들어, 마우스 IgG2a로부터)로부터 유래되고 ; 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 생성된 불변 도메인에 추가 연결하여 VH 및 VL이 수득된 항체를 포함한다. 예를 들어 상이한 종으로부터의 가변 및 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 본 발명에 추가로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 상기 기재된 바와 같이 마우스로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하고 인간, 토끼, 래트, 염소, 당나귀와 같은 다른 종으로부터 유래된 불변 도메인을 추가로 포함하는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 마우스로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하고 추가로 인간화되거나 상기 정의된 바와 같이 최적화된 서열을 포함하고 다른 종으로부터 유래된 불변 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간 IgG 서열을 포함하는 유전자이식 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 따라서 인간 VH 및 VL 서열을 포함하고, 다른 종으로부터 유래된 불변 도메인을 추가로 포함한다. 상술된 키메라 항체의 임의의 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 마우스, 인간, 토끼, 래트, 염소 또는 당나귀 중쇄 영역이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 도메인을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 바람직하게는 서열 번호 254의 서열을 포함하는 IgG2a의 불변 도메인을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체 분자는 카파 또는 람다인 경쇄 불변 도메인을 갖고, 바람직하게 경쇄 불변 도메인은 바람직하게는 서열 번호 255의 서열을 포함하는 카파 경쇄 불변 도메인이다.
일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체 분자는 바람직하게는 ≤10 nM, 보다 바람직하게는 ≤1 nM, 보다 더 바람직하게는 ≤O.1 nM, 보다 더욱 더 바람직하게는 ≤0.01 nM의 해리 상수 (KD)로 인간 및 사이노몰구스 원숭이 DLL3에 결합할 수 있다. 친화도 (KD 값)는 예를 들어 실시예에 기술된 바와 같이 재조합 DLL3-단백질을 사용하는 SPR (BIAcore) 분석 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 방법으로 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체 분자는 마우스 DLL3에 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체 분자는 종양 조직 샘플 또는 배양된 세포주와 같은 조직 샘플 (예를 들어, 파라핀 포매/포르말린-고정 조직 샘플)에서 DLL3 발현 (예를 들어 세포질 및 표면 단백질 발현)을 검출할 수 있다. 임의로, 파라핀 포매/포르말린 고정 세포 배양 또는 조직 샘플은 Proteinase K와 같은 에피토프 리트리버로 추가 처리된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체 분자는 DLL3#1, DLL2#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 항체 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체 분자는 인간 DLL3에 대한 결합에 대해 DLL3#1, DLL2#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 또는 DLL3#18 항체 분자 중 어느 하나와 경쟁한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항-DLL3 항체 분자의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
바람직하게는 핵산 분자는 서열 번호 38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 또는 228 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는 핵산 분자는 서열 번호 37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 또는 227 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 항-DLL3 항체 분자의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.
바람직하게는 발현 벡터는 추가로 각각 중쇄 불변 도메인 및/또는 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자에 연결된 중쇄의 불변 도메인 및/또는 경쇄의 불변 도메인을 각각 코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 2 개의 발현 벡터가 사용될 수 있는데, 그 중 하나는 중쇄의 발현을 위한 것이고 다른 하나는 경쇄의 발현을 위한 것이며, 두 발현 벡터는 모두 재조합 단백질 발현을 위해 숙주 세포로 형질감염될 수 있다.
바람직하게는, 발현 벡터는 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터일 것이며, 여기서 이러한 조절 서열은 프로모터, 인핸서 또는 종결자 서열, 가장 바람직하게는 이종 프로모터, 인핸서, 또는 종결자 서열일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-DLL3 항체 분자의 중쇄를 코딩하는 발현 벡터 및 본 발명의 항-DLL3 항체 분자의 경쇄를 코딩하는 발현 벡터를 갖는 숙주 세포에 관한 것이다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 다른 유용한 세포는 효모 세포 또는 기타 진균 세포이다.
적합한 포유동물 세포는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeFa 세포, COS 세포 등을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 이종 단백질의 발현을 위해 당 업계에서 사용되는 다른 세포도 사용될 수 있다.
제조 및 정제 방법
본 발명은 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 일반적으로 다음 단계를 포함한다:
- 본 발명의 결합 단백질의 형성을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
- 배양물로부터 숙주 세포에 의해 발현된 결합 단백질을 회수하는 단계; 및
- 임의로 본 발명의 결합 단백질을 추가로 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계.
본 발명은 본 발명의 항-DLL3 항체를 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 일반적으로 다음 단계를 포함한다:
- 항체 분자의 형성을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
- 배양물로부터 숙주 세포에 의해 발현된 항체 분자를 회수하는 단계; 및
- 임의로 본 발명의 항체 분자를 추가로 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계.
본 발명의 핵산은 예를 들어 코딩 서열뿐만 아니라 조절 서열 및 임의로 천연 또는 인공 인트론을 포함하는 DNA 분자이거나 cDNA 분자일 수 있다. 그것은 원래의 코돈을 가질 수 있거나 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현을 위해 특이적으로 조정된 최적화된 코돈 사용을 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태이다.
본 발명의 핵산은 본원에 제공된 본 발명의 단백질에 대한 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여 그 자체로 공지된 방식 (예를 들어, 자동화된 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해)으로 제조되거나 수득될 수 있다.
본 발명의 핵산은 전형적으로 발현 벡터, 즉 적합한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템으로 형질감염되는 경우 단백질의 발현을 제공할 수 있는 벡터에 통합될 것이다.
본 발명의 결합 단백질 또는 항체를 제조하기 위해, 숙련된 기술자는 당 업계에 널리 공지된 매우 다양한 발현 시스템, 예를 들어 Kipriyanow and Le Gall, 2004에서 검토된 것에서 선택할 수 있다.
발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, EBV 유래 에피솜 등을 포함한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 숙주 세포와 양립할 수 있도록 선택된다. 제 1 항원 결합 단위 (예를 들어, 본 발명의 결합 단백질의 DLL3 특이적 단쇄 Fab 또는 전장 DLL3 쇄)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 DLL3/CD3 결합 단백질의 제 2 항원 결합 단위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 본 발명의 결합 단백질의 CD3 특이적 단쇄 Fab 또는 전장 CD3 쇄)은 별도의 벡터에 삽입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 양 DNA 서열은 동일한 발현 벡터에 삽입된다. DLL3 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 DLL3 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 별도의 벡터에 삽입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 양 DNA 서열은 동일한 발현 벡터에 삽입된다.
편리한 벡터는 상술된 바와 같이 단쇄 Fab 서열 또는 임의의 중쇄/경쇄 가변 도메인과 같은 임의의 항원 결합 단위가 쉽게 삽입 및 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위와 함께 기능적으로 완전한 인간 CH (불변 중쇄) 면역글로불린 서열을 코딩하는 벡터이다. 항체 중쇄의 경우, 이는 제한없이 임의의 IgG 이소형 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 또는 대립 유전자 변이체를 포함한 기타 면역글로불린일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 전장 CD3 또는 DLL3 쇄 또는 항-DLL3 항체의 경쇄/중쇄의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 단백질 쇄를 코딩하는 DNA는 신호 펩티드가 성숙한 전장 쇄 DNA의 아미노 말단에 프레임 내로 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 비면역글로불린 단백질로부터의 이종 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 단백질의 전장 쇄를 코딩하는 DNA 서열은 이미 신호 펩티드 서열을 포함하고 있을 수 있다.
DNA 서열을 코딩하는 DLL3/CD3 쇄 또는 DNA 서열을 코딩하는 DLL3 항체의 중쇄/경쇄에 추가하여, 재조합 발현 벡터는 전형적으로 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 신호 및 숙주 세포에서 항체 쇄의 발현을 조절하는 다른 발현 조절 요소를 포함하는 조절 서열, 임의로 이종 조절 서열을 가진다. (포유동물 세포에서의 발현을 위해 예시된) 프로모터 서열의 예로는 CMV 유래의 프로모터 및/또는 인핸서 (예컨대, CMV 유인원바이러스 40 (SV40) 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 폴리오마 및 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터와 같은 강력한 포유동물 프로모터가 있다. 폴리아데닐화 신호의 예로서 BGH polyA, SV40 후기 또는 초기 polyA; 또는, 면역글로불린 유전자의 3'UTR 등이 사용될 수 있다.
재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포에서 벡터의 복제 (예를 들어, 복제 기원) 및 선별 마커 유전자를 조절하는 서열을 보유할 수 있다. 제 1 항원 결합 단위 (단쇄 Fab 및 Fc 도메인) 또는 그의 항원 결합 부분을 갖는 전장 쇄 및/또는 제 2 항원 결합 단위 (단쇄 Fab 및 Fc 도메인) 또는 그의 항원 결합 부분을 갖는 전장 쇄를 코딩하는 핵산 분자 및 이들 DNA 분자를 포함하는 벡터는 리포좀-매개 형질감염, 폴리양이온-매개 형질감염, 원형질체 융합, 마이크로주입, 인산칼슘 침전법, 전기천공 또는 바이러스 벡터에 의한 전달을 비롯한 당 업계에 공지된 형질감염 방법에 따라 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 세포 또는 고등 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 단백질의 DLL3 및 CD3 쇄를 코딩하는 DNA 분자는 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포로 공동-형질감염되는 2 개의 발현 벡터에 존재한다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 특히 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0, SP2/0 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 암종 세포 (예를 들어, Hep G2 및 A-549 세포), 3T3 세포 또는 임의의 그러한 세포주의 유도체/자손을 포함한다. 인간, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주를 예로 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 다른 포유동물 세포, 또는 효모, 곤충 및 식물 세포를 예로 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 다른 진핵 세포 또는 박테리아와 같은 원핵 세포가 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질은 숙주 세포에서 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 단백질 분자는 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되거나, 예를 들어 분비 신호없이 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 단백질의 실질적으로 균질한 제제가 얻어지는 방식으로 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질에 사용되는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 단백질 분자를 정제하는 것이 필요하다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 분자를 얻는 데 유용한 최첨단 정제 방법은 제 1 단계로서 배양 배지 또는 용해물로부터 세포 및/또는 미립자 세포 파편을 제거하는 단계를 포함한다. 이어서 단백질이 예를 들어 면역 친화성 또는 이온 교환 컬럼, 에탄올 침전, 역상 HPLC, Sephadex 크로마토그래피, 실리카상의 크로마토그래피 또는 양이온 교환 수지상에서의 분획화에 의해 오염 가용성 단백질, 폴리펩티드 및 핵산으로부터 정제된다. 단백질 분자 제제를 수득하기 위한 공정의 최종 단계로서, 정제된 결합 분자 또는 항체는 치료적 적용을 위해 하기 기술된 바와 같이, 예를 들면, 건조, 예를 들면 동결 건조될 수 있다.
본 발명은 적어도 2개의 상이한 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여, 결합 분자는 항체로부터 유래된다. 결합 분자를 제조하는 기술에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동 발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 및 "노브-인-홀 (knob-in-hole)" 공학 (예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조; Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35)이 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 결합 분자는 또한 항체 Fc-헤테로이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 조종 효과 (electrostatic steering effect)의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 교차 연결시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) 참조); 이중 특이적 항체를 제조하기 위한 류신 지퍼 이용 (예를 들어, Kostelny et al., Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992) 참조); 이중 특이적 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술 이용 (예를 들어, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 및 단쇄 Fv (sFv) 이량체 사용 (예를 들어, Gruber et al., /. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. /. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재되어 있는 삼중 특이성 항체 제조에 의해 제조될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 (예를 들어, 다중-특이적 결합 단백질 및 항-DLL3 항체) 및 방법은 명시된 서열, 또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어, 명시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다. 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제 1 및 제 2 아미노산 서열이 공통 구조 도메인 및/또는 공통 기능 활성을 가질 수 있도록 제 2 아미노산 서열에서 정렬된 아미노산 잔기와 i) 동일하거나, ii) 보존적 치환인 충분한 또는 최소 수의 아미노산 잔기를 함유하는 제 1 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 공통 구조 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 참조 서열, 예를 들어 본원에 제공된 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는다. 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열이 공통 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하거나, 공통 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통 기능적 폴리펩티드 활성을 코딩하도록 제 2 핵산 서열에서 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 또는 최소 수의 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 핵산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 예를 들어 뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
본 발명의 핵산 분자는 서열 목록에 제시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 WO 2007/042309에 정의된 바와 같이 고 엄격성 결합 및 세척 조건하에 서열 목록에 제시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 분자에 하이브리드화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 분자 (mRNA 관점에서)는 본원에 기재된 DNA 분자 중 하나와 적어도 75% 또는 80% (바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%)의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 것이다. 예를 들어, 진핵 세포에서 항체를 발현한다는 관점에서, 서열 목록에 제시된 DNA 서열은 진핵 세포에서의 코돈 사용과 일치하도록 설계되었다. 대장균에서 항체를 발현하는 것이 바람직하다면, 이 서열을 대장균 코돈 사용법에 맞추기 위해 변경할 수 있다. 본 발명의 DNA 분자의 변이체는 다수의 상이한 방법으로, 예를 들어 WO 2007/042309에 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
본 발명의 단백질은 특정 발현 시스템 (예컨대 특정 벡터 또는 숙주 세포)을 사용하여 발현되거나, 봉입체 또는 가용성 형태로 발현되거나, 배지 또는 주변 세포질 공간으로 분비되거나, 세포 내에 포함되거나, 더 균질한 산물을 생성하도록 분자를 최적화하기 위해, 변형된 N-말단 서열, 예를 들어 하나 이상의 N-말단 아미노산의 결실, 또는 예를 들어 제 1 N-말단 아미노산의 교환 (예를 들어, 글루타메이트에서 알라닌으로)을 가질 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 이러한 폴리펩티드의 안정성을 더욱 향상시키거나 면역원성을 감소시키기 위해, 예를 들어 WO2012/175741호, WO2011/075861호 또는 W02013/024059호에서 설명된 바와 같이, 추가 알라닌과 같은 변형된 C-말단 서열, 및/또는 C-말단 부분 또는 임의의 프레임워크 영역 내의 다른 정의된 위치에 추가 아미노산 교환을 가질 수 있다.
의심의 여지를 없애기 위해, 단독으로 또는 추가 치료제와의 조합 (아래에 더 자세히 명시됨)으로 본원에 기재된 임의의 다중 특이적 결합 단백질에 대해 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물, 키트, 치료 방법, 의학적 용도, 조합, 투여 방법 및 투여량에 관한 모든 실시양태가 고려된다.
약학 조성물; 투여 방법; 복용량
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 다중 특이적 결합 단백질을 포함하는, 질환 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 적어도 하나의 다중-특이적 단백질 또는 하기 제시된 바와 같은 약학 조성물을 사용하여 질환을 치료하는 방법 (아래에 보다 상세히 명시됨)을 포함하고, 본 발명의 이러한 결합 단백질 또는 약학 조성물을 사용하여 이러한 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 추가로 포함한다.
본 발명의 결합 단백질 (예를 들어, DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 및 DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3 중 어느 하나, 바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나) 및/또는 이를 포함하는 조성물은 사용될 특정 약학 제형 또는 조성물에 따라 임의의 적절한 방식으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 따라서, 본 발명의 결합 단백질 및/또는 이를 포함하는 조성물은 유효량 또는 용량으로 예를 들어 정맥 내 (iv), 피하 (sc), 근육 내 (im), 복강 내 (ip), 경피, 경구, 설하 (예를 들어, 설하 정제의 형태, 혀 아래에 배치되고 점막을 통해 혀 아래의 모세관 네트워크로 흡수되는 스프레이 또는 드롭 형태), 비강 (내) (예를 들어, 비강 스프레이 및/또는 에어로졸 형태), 국소, 좌약, 흡입, 또는 임의의 다른 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 결합 단백질은 주입, 볼루스 또는 주사로 투여할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 투여는 정맥 내 주입 또는 피하 주사이다.
본 발명의 결합 단백질 및/또는 이를 포함하는 조성물은 치료 또는 완화될 질환, 장애 또는 상태를 치료 및/또는 완화시키는 데 적합한 치료 요법에 따라 투여된다. 임상의는 일반적으로 치료 또는 완화될 질환, 장애 또는 상태, 질환의 중증도, 증상의 중증도, 사용되는 본 발명의 특이적 결합 단백질, 사용되는 특정 투여 경로 및 사용되는 약학 제형 또는 조성물, 연령, 성별, 체중, 식이, 환자의 일반적인 상태 및 임상의에게 잘 알려진 유사 요인과 같은 인자에 따라 적합한 치료 요법을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 치료 요법은 본 발명의 하나 이상의 결합 단백질, 또는 이를 포함하는 하나 이상의 조성물을 치료적 유효량 또는 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다.
일반적으로, 본원에 언급된 질환, 장애 및 상태의 치료 및/또는 완화를 위해 그리고 치료할 특정 질환, 장애 또는 상태, 사용될 본 발명의 특이적 결합 단백질의 효능, 특정 투여 경로 및 사용된 특정 약학 제형 또는 조성물에 따라, 본 발명의 결합 단백질은 일반적으로 체중 및 용량 kg 당 0.005 내지 20.0 mg, 바람직하게는 0.05 내지 10.0 mg/kg/용량으로 연속적으로 (예를 들어 주입에 의해) 또는 더 바람직하게는 단일 용량 (예를 들어, 1 주일에 2 회, 주당 또는 월당 용량; 아래 참조)으로 투여될 것이나, 특히 상기 언급된 매개변수에 따라 상당히 다를 수 있다. 따라서 어떤 경우에는 위에 주어진 최소 용량보다 적게 사용하는 것으로 충분할 수 있지만 다른 경우에는 상한을 초과해야 할 수도 있다. 다량을 투여할 때는 하루에 여러 번 작은 용량으로 나누는 것이 권해질 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 단백질 및 그의 특이적 약동학 및 기타 특성에 따라, 매일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 6 일마다, 매주, 매월 등으로 투여될 수 있다. 투여 요법에는 장기, 주간 치료가 포함될 수 있다. "장기"는 적어도 2 주, 바람직하게는 수개월 또는 수년을 의미한다.
본 발명의 다중 특이적 단백질 및 이를 포함하는 조성물의 효능은 관련된 특정 질환에 따라 임의의 적합한 시험관 내 분석, 세포 기반 분석법, 생체 내 분석 및/또는 그 자체로 알려진 동물 모델, 또는 이들의 임의 조합을 사용하여 시험될 수 있다. 적합한 분석 및 동물 모델은 당업자에게 명확할 것이며, 예를 들어 아래 실시예에서 사용되는 분석 및 동물 모델을 포함한다.
제형
약학 용도를 위해, 본 발명의 결합 단백질은 (i) 적어도 하나의 본 발명의 결합 단백질 (예를 들어 DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 및 DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3 중 어느 하나, 바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나) 및 (ii) 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제, 및 (iii) 임의로 하나 이상의 추가 약리학적 활성 폴리펩티드 및/또는 또는 화합물을 포함하는 약학 제제로 제형될 수 있다. "약학적으로 허용되는"은 각각의 물질이 개인에게 투여될 때 어떠한 생물학적 또는 다르게는 바람직하지 않은 효과를 나타내지 않으며, 함유된 약학 조성물의 임의의 다른 성분 (예를 들어, 약학적 활성 성분)과 유해한 방식으로 상호작용하지 않음을 의미한다. 특정 예제는 표준 핸드북, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 단백질은 통상적인 항체 및 항체 단편 및 다른 약학 활성 단백질에 대해 그 자체로 알려진 임의의 방식으로 제형화되고 투여될 수 있다. 따라서, 추가 실시양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제, 및 임의로 하나 이상의 추가의 약리학적 활성 물질을 함유하는 동결 건조 또는 다르게 건조된 제형 또는 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액 형태의 약학 조성물 또는 제제에 관한 것이다.
정맥 내, 근육 내, 피하 주사 또는 정맥 내 주입과 같은 비경구 투여용 약학적 제제는 예를 들어, 활성 성분을 포함하며 임의로 추가의 용해 또는 희석 단계 후에 주입 또는 주사에 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액, 유제 또는 분말일 수 있다. 이러한 제제를 위한 적합한 담체 또는 희석제는 예를 들어 멸균수 및 생리 학적 인산염 완충 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 수성 완충액 및 용액; 물 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜뿐만 아니라 미네랄 오일, 동물성 오일 및 식물성 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유 및 이들의 적합한 혼합물을 제한없이 포함한다.
본 발명의 결합 단백질의 용액은 또한 항균 및 항진균제, 예를 들어, p-하이드록시벤조에이트, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티오메살, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (의 알칼리 금속 염) 등과 같은 미생물의 증식을 방지하기 위한 방부제를 함유할 수 있다. 많은 경우에, 당, 완충액 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 임의로, 유화제 및/또는 분산제가 사용될 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 리포솜의 형성, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 흡수를 지연시키는 다른 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴이 또한 첨가될 수 있다. 용액은 주사 바이알, 앰풀, 주입 병 등에 채울 수 있다.
모든 경우에 있어서 최종 투여 형태는 제조 및 저장 조건하에서 무균, 유동성 및 안정해야 한다. 멸균 주사 용액은 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거한 여러 가지 다른 성분과 적절한 용매에 도입한 다음 필터 멸균하여 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전 멸균 여과된 용액에 존재하는 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
보통, 수용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 결합 단백질과 같은 치료 단백질에 적합한 제형은 완충된 단백질 용액, 예컨대 적절한 농도 (예를 들어, 0.001 내지 400 mg/ml, 바람직하게는 0.005 내지 200 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/ml, 보다 바람직하게는 1.0 내지 100 mg/ml, 예컨대 1.0 mg/ml (iv 투여) 또는 100 mg/ml (sc 투여)의 단백질을 포함하는 용액 및 다음과 같은 수성 완충액:
- 포스페이트 완충 염수, pH 7.4,
- 다른 인산염 완충액, pH 6.2 내지 8.2,
- 아세트산염 완충액, pH 3.2 내지 7.5, 바람직하게는 pH 4.8 내지 5.5
- 히스티딘 완충액, pH 5.5 내지 7.0,
- 숙신산염 완충액, pH 3.2 내지 6.6,
- 시트르산염 완충액, pH 2.1 내지 6.2,
및 임의로 용액의 등장성을 제공하기 위한 염 (예, NaCl) 및/또는 당 (예컨대, 수크로스 및 트레할로스) 및/또는 다른 폴리알콜 (예를 들어, 만니톨 및 글리세롤)을 포함하는 용액이다.
또한, 다른 제제, 예를 들면, 세제, 예를 들어, 0.02% Tween-20 또는 Tween-80이 이러한 용액에 포함될 수 있다. 피하 적용을 위한 제형은 본 발명의 항체를 상당히 더 높은 농도로, 예컨대 최대 100 mg/ml 또는 심지어 100 mg/ml 초과로 포함할 수 있다. 그러나, 상기 주어진 성분 및 그 양은 오로지 하나의 바람직한 옵션을 나타내고자 한다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 이들의 대안 및 변형은 당업자에게 아주 분명할 것이거나, 상기 개시 내용으로부터 출발하여 용이하게 구상될 수 있다. 상기 기재된 제형은 용액, 예를 들어, 주사용수 (WFI)에서 재구성될 동결 건조된 제형으로서 선택적으로 제공될 수 있다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본 발명의 결합 단백질은 주사기, 주입기 펜, 마이크로펌프 또는 다른 장치와 같이 단백질의 투여에 유용한 장치와 조합하여 사용될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 결합 단백질의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 암 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 결합 단백질을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 암 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 결합 단백질의 용도이다.
의심의 여지를 없애기 위해, 본 발명의 의학적 사용 측면은 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 특이적 결합 단백질 중 임의의 것 (예를 들어, DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 및 DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3 중 어느 하나, 바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침범 단계와 무관하게 모든 유형의 암성 증식 또는 발암 과정, 전이 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 기재된 다중 특이적 결합 단백질을 사용하여 성장을 억제할 수 있는 예시적인 암은 임의의 DLL3 발현 종양, 바람직하게는 SCLC, LCNEC, 신경교종, 교모세포종, 흑색종, 또는 다른 DLL3 발현 신경내분비 종양 (예를 들어, 신경내분비 전립선암 또는 신경내분비 췌장암, 소세포 방광암)이다.
신경내분비 종양 (NET)은 분산된 내분비 시스템에서 발생하며 신체의 상이한 여러 영역에서 발생할 수 있다. 전통적으로, NET는 해부학적 기원 부위로 분류되어 왔으며 전형적으로 매우 공격적이다. 이들은 대부분 위장관, 췌장 또는 폐 (소세포 폐암종 및 대세포 신경내분비 암종), 신장 또는 비뇨생식기 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막)에 위치한다. NET에는 위장관 및 췌장 섬세포의 특정 종양, 특정 흉선 및 폐 종양, 및 갑상선 방여포 세포의 수질 암종이 포함된다.
본원에 기재된 다중-특이적 결합 단백질을 사용하여 성장을 억제할 수 있는 추가 암은 전통적으로 정의된 신경내분비 종양과 특정 유전형, 표현형 또는 생화학적 특성을 공유하는 가성 신경내분비 종양 (pNET)이다.
일부 실시양태에서, 다음의 암, 종양 및 기타 증식성 질환이 본 발명의 다중 특이적 결합 단백질로 치료될 수 있다: 폐암; 바람직하게는 SCLC, NSCLC 또는 LCNEC; 유방암; 자궁경부암; 결장암; 결장직장암; 자궁내막암; 두경부암; 간암 (간모세포종 또는 간세포 암종); 난소암; 췌장암; 전립선암; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 부신암; 신장암; 방광암; 자궁암; 식도암; 요로상피암; 뇌종양; 림프종; 유잉 육종; 및 기타 신경내분비 및 소원형 푸른 세포 종양.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 암은 소세포 폐암 (SCLC) 또는 교모세포종이다.
신체의 특정 위치/기원을 특징으로 하는 상기 언급된 모든 암, 종양, 신생물 등은 원발성 종양 및 그로부터 유래된 전이성 종양을 모두 포함하도록 의도된다.
환자가 DLL3의 높은 발현을 특징으로 하는 암을 앓고 있는 경우, 환자는 본 발명의 결합 단백질 (본원에 기술된 바와 같음)을 사용한 치료에 더 반응할 가능성이 높다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질로 치료될 암은 DLL3의 높은 발현을 갖는 암이고, 예를 들어 DLL3 발현은 동일한 유형의 DLL3 발현 암을 앓고 있는 환자 집단의 암세포에서의 평균 발현보다 더 높다.
본 발명의 결합 단백질은 제 1 선, 제 2 선, 또는 임의의 추가 선 치료 및 유지 치료와 관련하여 치료 요법에 사용될 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 임의로 또한 방사선 요법, 하나 이상의 추가 치료제 및/또는 수술과 결합하여 상기 언급된 질환의 예방, 단기 또는 장기 치료에 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체와 같은 PD-1 길항제와 조합하여 암 치료에 사용된다. 바람직하게는 상기 항-PD-1 항체는 본원 (하기 표 A에 서열에 의해 정의됨) 및 WO2017/198741 (본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 항-PDL-1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2 또는 DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-1과 조합하여 암 치료에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2 또는 DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-2와 조합하여 암 치료에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-3과 조합하여 암 치료에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-4와 조합하여 암 치료에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-5와 조합하여 암 치료에 사용된다.
이들 바람직한 실시양태 및 본 발명의 임의의 다른 측면에 따르면, 항체 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5는 WO2017/198741호에 개시된 항체 분자이고, 상기 표 A에 기재된 서열에 의해 정의된다.
따라서, PD1-1은 서열 번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 257의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖고;
PD1-2는 서열 번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖고;
PD1-3은 서열 번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 261의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖고;
PD1-4는 서열 번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 263의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖고;
PD1-5는 서열 번호 264의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 265의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다.
상기는 또한 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량을 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 다양한 방법에서 본 발명의 결합 단백질의 용도뿐만 아니라 상기 질환 치료용 약제 제조를 위한 이들 결합 단백질의 용도, 본 발명의 이러한 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물, 본 발명의 이러한 결합 단백질을 포함하는 약제의 제제 및/또는 제조 등을 포함한다.
다른 활성 물질 또는 치료제와의 조합
본 발명의 결합 단백질은 그 자체로 또는 하나 이상의 추가 치료제, 특히 DNA 손상제, 혈관 형성을 억제하는 치료 활성 화합물, 신호 전달 경로 억제제, EGFR 억제제, 면역 조절제, 면역 체크포인트 억제제, 유사 분열 체크포인트 억제제 또는 호르몬 치료제와 같은 화학요법제와 조합하여 사용될 수 있다.
추가 치료제는 임의로 동일한 약학 제제의 성분으로서 DLL3/CD3 결합 단백질의 투여와 동시, 전 또는 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 결합 분자와 조합하여 투여될 수 있는 세포 증식 억제 및/또는 세포 독성 활성 물질은, 호르몬, 호르몬 유사체 및 항호르몬, 아로마타제 억제제, LHRH 작용제 및 길항제, 성장 인자 (예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 인간 상피 성장 인자 (HER, 예를 들어, HER2, HER3, HER4) 및 간세포 성장 인자 (HGF)와 같은 성장 인자)의 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않으며, 억제제는, 예를 들어, (항-)성장 인자 항체, (항-)성장 인자 수용체 항체 및 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, 세툭시맙, 게피티닙, 아파티닙, 닌테다닙, 이마티닙, 라파티닙, 보수티닙 및 트라스투주맙; 항대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 랄티트렉세드와 같은 항폴린산제, 5-플루오로우라실 (5-FU), 겜시타빈, 이리노테칸, 독소루비신, TAS-102, 카페시타빈 및 겜시타빈과 같은 피리미딘 유사체, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 클라드리빈 및 펜토스타틴, 시타라빈 (ara C), 플루다라빈과 같은 퓨린 및 아데노신 유사체); 항종양 항생제 (예를 들어, 안트라사이클린); 백금 유도체 (예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴); 알킬화제 (예를 들어, 에스트라무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 부술판, 다카바진, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 테모졸로미드, 니트로소우레아, 예를 들어, 카르무스틴 및 로무스틴, 티오테파); 항유사분열제 (예를 들어, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈 및 빈크리스틴과 같은 빈카 알칼로이드; 및 파클리탁셀, 도세탁셀과 같은 탁산); 혈관형성 억제제 (베바시주맙, 라무시루맙 및 아플리베르셉 포함), 튜블린 억제제; DNA 합성 억제제, PARP 억제제, 토포아이소머라제 억제제 (예를 들어, 에피포도필로톡신, 예를 들어, 에토포시드 및 에토포포스, 테니포시드, 암사크린, 토포테칸, 이리노테칸, 미톡산트론), 세린/트레오닌 키나제 억제제 (예를 들어, PDK1 억제제, Raf 억제제, A-Raf 억제제, B-Raf 억제제, C-Raf 억제제, mTOR 억제제, mTORC1/2 억제제, PI3K 억제제, PI3Kα 억제제, 이중 mTOR/PI3K 억제제, STK33 억제제, AKT 억제제, PLK1 억제제 (예를 들어, 볼라세르팁), CDK 억제제 (CDK9 억제제 포함), 오로라 키나제 억제제), 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, PTK2/FAK 억제제), 단백질 단백질 상호작용 억제제, MEK 억제제, ERK 억제제, FLT3 억제제, BRD4 억제제, IGF-1R 억제제, Bcl-xL 억제제, Bcl-2 억제제, Bcl-2/Bcl-xL 억제제, ErbB 수용체 억제제, BCR-ABL 억제제, ABL 억제제, Src 억제제, 라파마이신 유사체 (예를 들어, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 시롤리무스), 안드로겐 합성 억제제, 안드로겐 수용체 억제제, DNMT 억제제, HDAC 억제제, ANG1/2 억제제, CYP17 억제제, 방사성 의약품, 면역치료제, 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, CTLA4, PD1, PD-L1, LAG3 및 TIM3 결합 분자/면역글로불린, 예를 들어, 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙) 및 각종 화학요법제, 예를 들어, 아미포스틴, 아나그렐리드, 클로드로나트, 필그라스틴, 인터페론, 인터페론 알파, 류코보린, 리툭시맙, 프로카바진, 레바미솔, 메스나, 미토탄, 파미드로네이트 및 포르피머; 프로테아좀 억제제 (예를 들어, 보르테조밉); Smac 및 BH3 모방체; mdm2-p53 길항제를 비롯한 p53 기능을 회복시키는 약제; Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로의 억제제; 및/또는 사이클린 의존성 키나제 9 억제제이다.
특히 바람직한 것은 항-PD-1 및 항-PD-L1 제제 및 항 LAG3 제제를 포함하는 하나 이상의 면역치료제와 조합하여 본 발명의 결합 분자를 사용한 치료이다: 예시적인 항-PD1 제제는 항-PD1 항체 PDR-001, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙 및 본원 (표 A) 및 WO2017/198741호에 기재된 바와 같은 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 항-PDL-1 제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 두르발루맙을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-1과 결합된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-2와 결합된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-3과 결합된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-4와 결합된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)은 PD1-5와 결합된다.
특정 실시양태에서, 추가 치료제는 TIM-l, TIM-3, TIM-4, PD-L2, LAG3, CTLA-4, 갈렉틴 9, 갈렉틴-1, CD69, CD113, GPR56, CD48, GARP, CAECAM-1, BTLA, TIGIT, CD 160, LAIR1, 2B4, CEACAM, CD39, TGF, IL-10, Fas 리간드, ICOS, B7 계열 (B7-1, B7-2, B7-H1 (PDL-l), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), 또는 B7-H6)의 조절제와 같은 추가 면역치료제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 추가 면역치료제는 CD40 및 CD40F, OX-40, OX-40F, CD70, CD27F, CD30, CD30F, 4-1BBF, CD137, GITR, TRAIF/Apo2-F, TRAIFR1/DR4, TRAIFR2/DR5, TRAIFR3, TRAIFR4, OPG, RANK, RANKE, TWEAKR/Fnl4, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGETL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, 림포톡신 a/TNEb, TNFR2, TNF a, LTpR, 림포톡신 a1b2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR을 포함하는 동족 TNF 수용체 패밀리 구성원에 결합하는 분자의 TNF 패밀리의 구성원이다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 SMAC 모방체이다. SMAC 모방체는 아폽토시스 단백질 억제제 (IAP)에 결합하고 면역 조절 기능을 가지며 동물 또는 인간에 투여된 경우 전신 사이토카인 (예를 들어, IL-6, TNFa 등) 및 케모카인 (예를 들어, MCP-1)의 유도를 매개하는 화합물이다. 일부 실시양태에서, SMAC 모방체는 (i) LCL161, 즉 WO 2008/016893호의 실시예 1 (28/29 페이지; [122])에서 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용되는 염; (ii) Debio-1143으로 알려진 SMAC 모방체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염; (iii) 비리나판트로 알려진 SMAC 모방체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염; (iv) ASTX-660으로 알려진 SMAC 모방체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염; 또는 (v) CUDC-427로 알려진 SMAC 모방체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다.
일부 실시양태에서, 추가 면역치료제는 (i) T 세포 활성화를 억제하는 사이토카인의 길항제 (예를 들어, IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF; "면역억제 사이토카인") 및/또는 (ii) 면역 반응을 자극하여 예를 들어 암과 같은 증식성 질환을 치료하기 위해 T 세포 활성화 및/또는 IL2와 같은 사이토카인을 자극하는 사이토카인의 작용제로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 추가 면역치료제는 CD28, GITRL, OX40L, CD27 및 CD28H와 같은 T 세포 활성화를 자극하는 단백질의 작용제이다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 박시니아바이러스, 아데노바이러스, (AdV), 단순 포진바이러스 (HSV1 또는 HSV2), 레오바이러스, 점액종 바이러스 (MYXV), 폴리오바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 마라바 바이러스, 수두바이러스, 홍역 바이러스 (MV) 또는 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)로부터 유래된 종양 용해성 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 용해성 바이러스이다.
진단 용도
본 발명의 항-DLL3 항체 분자는 진단 및 예후 방법에 유용하며, 염료, 약물 또는 다른 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 다른 분자를 부착하여 DLL3을 발현하는 세포 또는 조직을 표지, 국소화 또는 식별 (예를 들어, ELISA 분석, FACS 분석, 면역 조직학 등)하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 표지는 본 발명의 항-DLL3 항체 분자에 접합될 수 있거나 또는 본 발명의 항체 분자에 특이적으로 결합하고 검출 가능한 표지 (예를 들어, 2 차 항체)과 접합된 2 차 시약이 이러한 진단 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, DLL3 특이적 항체는 세포질 및/또는 세포 표면에서 세포에서 발현된 DLL3에 특이적으로 결합하고, 이러한 세포를 국소화 및/또는 식별하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DLL3 특이적 항체는 DLL3을 발현하는 세포 또는 조직 (예를 들어, 종양 세포)을 식별하기 위해 사용된다.
본 발명의 항체는 DLL3 폴리펩티드에 대한 높은 수준의 에피토프 결합 특이성 및 높은 결합 친화성을 갖도록 선택된다. 일반적으로 항체의 결합 친화도가 높을수록 면역 분석에서 보다 엄격한 세척 조건을 수행하여 표적 폴리펩티드를 제거하지 않고 비특이적으로 결합된 물질을 제거할 수 있다.
따라서, 생물학적 샘플에서 DLL3을 검출하는 방법이 추가로 제공된다.
구체적으로, 한 측면에서 본 발명은 다음을 포함하는 샘플 (예를 들어, 조직 샘플, 종양 조직 샘플)에서 DLL3을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; 및
(b) DLL3에 결합된 항-DLL3 항체를 검출하는 단계.
생물학적 샘플은 대상자의 모든 조직 (생검 포함), 세포 또는 체액에서 수득/단리할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플, 바람직하게는 종양 조직 샘플이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 고정 (종양) 조직 샘플, 바람직하게는 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직 샘플, 보다 바람직하게는 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 샘플이다.
샘플은 전형적으로 여러 부분으로 나뉘어 현미경 슬라이드와 같은 현미경 분석을 위해 매체에 부착된다. 샘플이 조직 샘플인 경우 여러 부분은 조직 절편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 절편이 FFPE 조직 샘플로부터 취해진다. 일부 실시양태에서, 일련의 절편은 FFPE 블록의 복수의 상이한 부위로부터 취해지며, 섹션 내 이질성 및 블록 내 이질성을 모두 포착하기 위해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 절편은 동일한 종양의 상이한 위치에서 취한 복수의 상이한 생검 샘플로부터 취해지며, 절편 내 이질성 및 종양 내 이질성을 모두 포착하기 위해 수행될 수 있다. 전형적으로 조직 샘플은 항원 검출 전에 먼저 탈파라핀화, 항원 검색 (예를 들어, Proteinase K 사용)을 거친다. 조직 샘플은 다양한 조직 (예를 들어, 생검), 특히 SCLC, LCNEC, 신경교종, 교모세포종, 흑색종 또는 기타 신경내분비 종양 (예를 들어, 신경내분비 전립선암 또는 신경내분비 췌장암, 소세포 방광암)을 포함하나 이에 제한되지 않는 종양으로부터 수득된 조직으로부터 수득/단리할 수 있다.
(조직) 샘플이 수득/단리될 수 있는 추가 예시적인 종양은 폐암; 바람직하게는 SCLC, NSCLC 또는 LCNEC; 유방암; 자궁경부암; 결장암; 결장직장암; 자궁내막암; 두경부암; 간암 (간모세포종 또는 간세포 암종); 난소암; 췌장암; 전립선암; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 부신암; 신장암; 방광암; 자궁암; 식도암; 요로상피암; 뇌종양; 림프종; 유잉 육종; 및 기타 신경내분비 및 소원형 푸른 세포 종양을 포함한다.
샘플에서 DLL3 검출의 예시적인 방법은 면역 세포 화학 (ICC), 면역 조직 화학 (IHC), 웨스턴 블롯팅, 유세포 분석 및/또는 ELISA이다.
바람직한 실시양태에서, DLL3은 IHC를 사용하여 검출된다.
본 발명의 특정 측면에서, 조직 샘플에서 DLL3을 검출하는 방법은
a) 조직 샘플 (예를 들어, SCLC, 교모세포종 또는 신경내분비 종양과 같은 종양 조직), 바람직하게는 상기 고정된 조직 샘플 (예를 들어, 포르말린 고정 및 파라핀 포매)을 본 발명의 항체 (예를 들어, DLL3#1 또는 DLL3#5)와 접촉시키는 단계,
b) 샘플에서 항체-항원 복합체의 형성을 허용하는 단계, 및
c) DLL3에 결합된 항-DLL3 항체를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 검출 가능한 신호에 의해 검출되고, 바람직하게 검출 가능한 신호는 검출 가능한 표지에 의해 생성된다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 IHC 분석에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 ELISA 검정, 유세포 분석 또는 웨스턴 블롯에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 예를 들어 유세포 분석을 사용하여 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 세포 표면에 존재하는 DLL3을 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 ELISA, 웨스턴 블롯 또는 IHC를 사용하여 조직 샘플 (예를 들어 종양 조직 샘플)에서 DLL3의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 항-DLL3 항체에 직접 접합되고 따라서 항-DLL3 항체가 DLL3에 결합할 때 샘플에 침착되며, 이는 일반적으로 직접 표지화 방법으로 지칭된다. 직접 표지화 방법은 종종 더 직접적으로 정량화할 수 있지만 민감도가 부족한 경우가 많다. 다른 실시양태에서, 검출 가능한 표지의 침착은 본 발명의 항체 분자에 특이적으로 결합하고 검출 가능한 표지 (예를 들어, 2 차 항체)과 접합되는 2 차 검출 시약의 사용에 의해 수행되며, 이것은 일반적으로 간접적인 표지화 방법으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 특이적 2 차 검출 시약은 종-종 특이적 2 차 항체, 합텐-접합된 항-DLL3 항체에 결합하는 항-합텐 항체, 또는 비오틴화된 항-DLL3 항체에 결합된 비오틴-결합 단백질일 수 있다.
본 발명의 항-DLL3 항체 또는 2 차 검출 시약에 접합될 수 있는 검출 가능한 표지의 특정 예에는 발색성, 형광성, 인광성, 발광성 및 방사성 분자 및 물질, 하나의 물질을 검출 가능한 차이를 제공하기 위해 다른 물질로 (예를 들어, 무색 물질을 유색 물질로 또는 그 반대로 전환시키거나, 침전물을 생성하거나 샘플 탁도를 증가시킴으로써) 전환시키는 촉매 (예를 들어, 효소), 추가 검출 가능하게 표지된 항체 접합체를 사용하여 항체-합텐 결합 상호작용을 통해 검출할 수 있는 합텐, 및 상자성 및 자기성 분자 또는 물질이 포함된다.
예를 들어, 검출 가능한 표지는 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 산성 포스파타제, 글루코스 산화효소, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제 및 β-락타마제와 같은 효소; 플루오레세인, 발광단, 쿠마린, BODIPY 염료, 레소루핀 및 로다민과 같은 형광단; 양자점과 같은 나노 입자 (미국 특허 제 6,815,064호, 6,682,596호 및 6,649,138호); Gd<3+> 등의 방사성 또는 상자성 금속 이온의 DOTA 및 DPTA 킬레이트와 같은 금속 킬레이트; 및 리포좀, 예를 들어 포획된 형광 분자를 함유하는 리포좀일 수 있다.
검출 가능한 표지가 효소를 포함하는 경우, 검출 가능한 신호를 생성하기 위해 발색체, 형광성 화합물 또는 발광성 화합물과 같은 검출 가능한 기질을 효소와 조합하여 사용할 수 있다. 발색성 화합물의 특정 예는 디아미노벤지딘 (DAB), 4-니트로페닐포스페이트 (pNPP), 패스트 레드 (fast red), 브로모클로로인돌릴 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸륨 (NBT), BCIP/NBT, 패스트 레드, AP 오렌지, AP 블루, 테트라메틸벤지딘 (TMB), 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린설포네이트] (ABTS), o-디아니시딘, 4-클로로나프톨 (4-CN), 니트로페닐-D-갈락토피라노시드 (ONPG), o-페닐렌디아민 (OPD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-갈락토피라노시드 (X-Gal), 메틸움벨리페릴-D-갈락토피라노시드 (MU-Gal), p-니트로페닐-a-D-갈락토피라노시드 (PNP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-D-글루쿠로니드 (X-Gluc), 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC), 푹신, 요오도니트로테트라졸륨 (INT), 테트라졸륨 블루 및 테트라졸륨 바이올렛을 포함한다.
일부 예에서, 검출 가능한 모이어티는 쿠마린, 플루오레세인 (또는 플루오레세인 유도체 및 유사체), 로다민, 레소루핀, 발광단 및 시아닌을 포함한 몇몇 일반적인 화학 부류에 속하는 형광단이다.
다른 실시양태에서, 검출 가능한 모이어티는 디아미노벤지딘 (DAB), 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-설폰아미드 (DABSYL), 테트라메틸로다민 (DISCOVERY Purple), N,N'-비스카복시펜틸-5,5'-디설포네이토-인도-디카보시아닌 (Cy5) 및 로다민 110 (로다민)을 포함한 염료이 같은 명시야 현미경을 통해 검출 가능한 분자이다.
합텐은 항체에 의해 특이적으로 결합되는 작은 분자이지만, 그 자체로는 동물에서 면역 반응을 유발하지 않으며 면역 반응을 생성하려면 먼저 단백질과 같은 더 큰 운반자 분자에 부착되어야 한다. 합텐의 예에는 디니트로페닐, 비오틴, 디곡시게닌 및 플루오레세인이 포함된다.
한 측면에서 본 발명의 항-DLL3 항체를 사용 (예를 들어, DLL3#1 또는 DLL3#5) (예를 들어, 종양 조직 샘플에서 IHC 사용)하여 대상체의 샘플 (예를 들어, 종양 조직 샘플)에서 DLL3을 검출하는 것을 포함하는, 종양을 DLL3 발현 종양 (세포질 및/또는 세포 표면에서 DLL3 발현)으로 진단하거나 식별하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 추가 측면에서, 본 발명의 항-DLL3 항체 (예를 들어, DLL3#1 또는 DLL3#5)를 사용 (예를 들어 종양 조직 샘플에서 IHC 사용)하여 대상체의 샘플 (예를 들어, 종양 조직 샘플)에서 DLL3을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에 대한 DLL3 표적 요법을 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 추가 측면에서, 본 발명의 항-DLL3 항체 (예를 들어, DLL3#1 또는 DLL3#5)를 사용 (예를 들어 종양 조직 샘플에서 IHC 사용)하여 대상체의 샘플 (예를 들어, 종양 조직 샘플)에서 DLL3을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 (예를 들어, DLL3-표적화 요법의) 치료 효과를 모니터링하는 방법이 본원에 제공된다.
본 발명의 항-DLL3 항체 분자는 또한 세포 표적화에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DLL3 특이적 항체는 약물 또는 세포 독성제를 상기 DLL3 항체에 부착함으로써 약물 또는 세포 독성제를 표적 세포 (예를 들어, DLL3을 발현하는 종양 세포)에 전달하여 예를 들어 상기 표적 세포를 사멸하는 데 사용된다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질 (예를 들어, DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#1O/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 및 DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3 중 어느 하나, 바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나) 및 임의로 상기 기재된 바와 같은 질환 및 장애의 치료에 사용되는 다른 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 키트를 포함한다.
일 실시양태에서, 키트는 단위 투여 형태의 유효량의 본 발명의 결합 단백질을 함유하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 적어도 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질, 및 상기 기재된 바와 같은 질환 및 장애의 치료에 사용되는 다른 약물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 키트를 포함한다.
일 실시양태에서, 키트는 단위 투여 형태의 유효량의 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)을 함유하는 조성물을 포함한다. 추가 실시양태에서 키트는 유효량의 단위 투여 형태의 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질 (바람직하게는 DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3 중 어느 하나)을 함유하는 조성물 및 단위 투여 형태의 유효량의 PD-1 길항제, 예컨대 항 PD-1 항체, 가장 바람직하게는 본원 (예를 들어 표 A) 및 WO2017/198741호에 기술된 바와 같은 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5을 함유하는 조성물을 모두 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 이러한 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함한다; 이러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터 팩, 또는 당 업계에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 상기 용기는 플라스틱, 유리, 적층지, 금속 호일 또는 의약품 보관에 적합한 기타 재료로 만들어질 수 있다. 추가로, 키트는 동결 건조된 형태의 본 발명의 결합 단백질이 들어 있는 제 1 용기 및 주사를 위한 약학적으로 허용되는 희석제 (예를 들어, 멸균수)가 있는 제 2 용기에 약학 조성물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제는 결합 단백질의 재구성 또는 희석에 사용될 수 있다.
필요한 경우, 본 발명의 다중-특이적 결합 단백질은 다중-특이적 결합 단백질을 암에 걸린 대상체에 투여하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 설명서에는 일반적으로 암 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 대한 정보가 포함된다. 다른 실시양태에서, 설명서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제에 대한 설명; 암 또는 그의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투약 일정 및 투여; 예방 조치; 경고; 징후; 대항 징후; 및 과복용 정보; 이상 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 문의. 설명서는 (있는 경우)에 용기 위에 직접 인쇄되거나, 용기에 부착된 표지로, 또는 용기에 또는 함께 제공된 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로 인쇄될 수 있다.
본원에 제시된 바와 같이, 본 개시 내용은 생물학적 샘플에서 DLL3의 발현을 결정하기 위한 진단 방법을 추가로 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 조직 수집 및/또는 검출 분석 수행 및/또는 결과 분석과 같은 본 개시 내용의 방법을 수행하기 위한 지침뿐만 아니라 이러한 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.
키트는 본 발명의 DLL3 항체 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체) 및 사용 설명서를 포함하거나, 대안적으로 필수적으로 이로 구성되거나 추가로 구성된다. 키트는 생물학적 샘플 (예를 들어, 임의의 체액 또는 신체 조직의 생검 샘플)에서 DLL3 폴리펩티드의 존재를 검출하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 키트는 샘플 내 DLL3 폴리펩티드에 결합할 수 있는 하나 이상의 DLL3 항체 (예를 들어, 항-DLL3 항체 DLL3#1 또는 DLL3#5); 샘플에서 DLL3 폴리펩티드를 검출하기 위한 수단; 및 임의로 샘플에서 DLL3 폴리펩티드의 신호/양을 대조군과 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 본 발명의 항-DLL3 항체 중 하나 이상은 표지될 수 있다. 키트 구성 요소 (예를 들어, 시약)는 적합한 용기에 포장될 수 있다. 키트는 키트를 사용하여 DLL3 폴리펩티드를 검출하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항-DLL3 항체 (제 1 항체) 및 DLL3 폴리펩티드 또는 제1항체에 결합하고 검출 가능한 표지에 접합되는 제 2의 상이한 항체를 포함한다.
키트는 또한, 예를 들어 완충제, 보존제 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출 가능한 표지를 검출하는데 필요한 성분, 예를 들어 효소 또는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 분석하여 시험 샘플과 비교할 수 있는 대조 샘플 또는 일련의 대조 샘플을 포함할 수 있다. 키트의 각 구성 요소는 개별 용기에 넣어질 수 있으며, 모든 다양한 용기는 키트를 사용하여 수행된 분석 결과를 해석하기 위한 설명서와 함께 단일 패키지 내에 있을 수 있다. 본 개시 내용의 키트는 키트 용기 상에 또는 내에 기록물을 함유할 수 있다. 기록물은 키트에 포함된 시약을 사용하는 방법을 설명한다.
허용할 수 있는 바와 같이, 이러한 제안된 키트 구성 요소는 당업자가 사용하기 위해 통상적인 방식으로 포장될 수 있다. 예를 들어, 이러한 제안된 키트 구성 요소는 용액 또는 액체 분산액 등으로 제공될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: CD3/DLL3 결합 단백질의 설계 및 작제
본 발명자들은 DLL3 및 CD3에 결합하고 T-세포 활성화를 유도하여 DLL3-발현 종양 세포의 용해를 유도하는 다중-특이적 결합 단백질을 개발하였다. 사용된 분자 설계는 IgG 항체 스캐폴드 및 IgG 유사 구조를 가지고 있다. 이는 노브 (항-DLL3) 및 홀 (항-CD3) 암의 이종-이량체화를 위해 Fc에서 노브-인-홀 (knod-in-hole) 기술을 특징으로 한다. 또한, 결합 단백질은 각 암에서 경쇄와 대응 중쇄 사이에 유연한 펩티드 서열을 가지고 있다. 따라서, 결합 단백질은 하나는 CD3에 결합하고 다른 하나는 DLL3에 결합하는 두 개의 암을 포함하고, 각 암은 단쇄 Fab 및 Fc 영역을 포함한다.
바람직하게는 결합 분자는 이중 특이적이고 2 가 (두 표적 각각에 대해 1 가)이다.
하이브리도마 및 배양된 단일 B 세포로부터 고 처리량 V 유전자 회수를 사용하여 DLL3 및 CD3를 인식하는 결합 도메인의 제조.
항-DLL3 결합제를 수득하기 위해, DLL3 면역화 야생형 및 AlivaMab 인간화 마우스 (Ablexis, San Francisco, CA, USA: AlivaMab transgenic mouse platform with human immunoglobulin loci)로부터 유래된 하이브리도마 또는 단일 B 세포를 시험관 내에서 배양하였다. 상등액을 AlphaLISA (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에 의해 재조합 인간 DLL3에 대한 반응성에 대해, 유세포 분석법에 의해 인간 DLL3을 발현하는 SHP77 세포 (ATCC®, CRL-2195TM)에 대해 스크리닝하였다.
이어 면역글로불린 (Ig) VH 및 VL 유전자를 식별된 양성 클론에서 증폭시켰다. 하이브리도마에서 RNA를 단리하기 위해, 모노클로날로부터 약 2×106 개의 세포를 펠렛화하여 원료 물질로 사용하였다. 단일 B 세포의 경우, 단일 단리된 B 세포에서 확장된 100 내지 500 개의 세포를 원료 물질로 사용하였다. RNeasy Plus (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 이어 Smarter cDNA 합성 키트 (Clontech, Mountain View, CA)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성을 촉진하기 위해, oligodT를 사용하여 모든 메신저 RNA의 역전사를 프라임하고 Smarter IIA 올리고뉴클레오티드로 "5' 캡핑"을 수행하였다. Smarter IIA 캡을 표적으로 하는 5' 프라이머 및 CH1에서 공통 영역을 표적으로 하는 3' 프라이머를 사용한 2 단계 PCR 증폭을 사용하여 VH 및 VL 단편의 후속 증폭을 수행하였다. 요약하면, 각 50 ㎕ PCR 반응은 20 μM의 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 25 ㎕의 PrimeStar Max DNA 중합효소 프리믹스 (Clontech), 2 ㎕의 비정제 cDNA 및 21 ㎕의 이중 증류 H20로 이루어졌다. 사이클링 프로그램을 94 ℃에서 3 분으로 시작하여 35 사이클 (94 ℃에서 30 초, 50 ℃에서 1 분, 68 ℃에서 1 분)을 진행한 후, 72 ℃에서 7 분으로 종료하였다. 각각의 pTT5 모 벡터 (VH 및 VL)에서 각각의 영역에 "겹치는" 15bp 상보성 확장을 포함하는 VL 및 VH 제 2 라운드 프라이머로 제 2 라운드 PCR을 수행하였다. 제 2 라운드 PCR은 다음 프로그램으로 수행되었다: 94 ℃에서 3 분; 35 사이클 (94 ℃에서 30 초, 50 ℃에서 1 분, 68 ℃에서 1 분), 72 ℃에서 7 분으로 종료.
In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech, U.S.A.)를 사용하여 VL 유전자를 pTT5 huIgK 벡터로, VH 유전자를 pTT5 huIgGlKO 벡터로 지향 클로닝하였다. In-Fusion® HD 클로닝을 용이하게 하기 위해 In-Fusion HD 클로닝 전에 PCR 산물을 정제하고 클로닝 인핸서 (Cloning Enhancer)로 처리하였다. 클로닝 및 변환을 제조업체의 프로토콜 (Clontech, U.S.A.)에 따라 수행하였다. Mini-prep DNA를 Sanger 시퀀싱에 적용하여 완전한 V-유전자 단편이 얻어졌는지 확인하였다.
이 방법론을 사용하여 DLL3에 대한 특이성을 갖는 결합 도메인을 코딩하는 Ig VH 및 VL 유전자 쌍을 준비하였다. 상응하는 중쇄 및 경쇄 코딩 플라스미드로 CHO-E37 세포를 일시 형질감염시켜 재조합 항체를 생성하였다.
재조합 항체의 확인 스크리닝
발현된 재조합 항체를 함유하는 유세포 분석법으로 상등액을 인간 또는 cyno DLL3을 발현하는 세포주에 대한 결합에 대해 분석하였다. 요약하면, 세포를 재조합 상등액과 함께 배양하고, 세척한 다음, 상등액으로부터 결합된 mAh를 항-인간-IgG-APC (Jackson ImmunoResearch 109-136-098)로 검출하였다. 샘플의 중간 형광 강도 (MFI)를 이소형 대조군 (비관련 단백질 및 다른 불변 영역 백본에 대한 가변 영역)의 것으로 나누어 신호 대 배경 비율 (S/B)을 계산하였다.
Biacore 400의 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 재조합 상등액에서 수행하였다. 요약하면, HTP 상등액 중에 최적화되지 않은 IgG를 단백질 A/G를 통해 센서 표면에 10 ㎕/분으로 60 초 동안 포획하였다. 포획된 IgG에 대한 100 nM 인간 DLL3의 결합을 30 ㎕/분으로 180 초 동안 회합에 대해 모니터링한 다음, HBS-EP 완충액에서 120 초 동안 해리시켰다. 각 결합 사이클 사이에 단백질 A/G 표면의 재생을 글리신 pH 2.1로 수행하였다. 이 분석에는 다음 물질이 사용되었다: 단백질 시약: 재조합적으로 발현된 인간 DLL3. 시스템 실행 완충액: HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% v/v 폴리소르베이트 P20). 포획 시약: 모든 인간 IgG 이소형에 대해 특이성을 갖는 단백질 A/G G (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).
다중 특이적 형식화를 위해 관심 클론 (Kd <300 pM)을 선택하였다. 다중 특이적 결합 단백질을 생성하고, 기계적 및 기능적 스크리닝 (예컨대, 하기에 기술된 바와 같은 세포 결합, 세포 독성 및 T 세포 활성화)으로 추가 평가하였다.
DLL3 및 CD3 결합제의 인간화
상술된 DLL3 결합제 및 문헌에 기술된 CD3 결합제의 서열 (Pessano et al., EMBO J. 1985 Feb; 4 (2): 337-44; Salmeron A et al, J Immunol. 1991 Nov l; l47) (9): 3047-52)을 인간화 및/또는 최적화하였다. 항체의 서열 최적화/인간화는 인간에서 생성된 항체와 유사한 치료제로 사용하기 위해 (특정 항원/에피토프에 대해) 비인간 종에서 생성된 항체를 조작하여 특이성을 유지하면서 면역원성과 같은 잠재적인 부작용을 제거하는 방법이다. 여기에 사용된 서열 최적화/인간화 접근 방식은 Singh et al, 2015 (Singh S et al., mAbs 2015: 7 (4): 778-9l)에 의해 설명되었다. 요약하면, 밀접하게 일치하는 인간 생식세포 계열을 인 실리코 (in silico)로 식별하고 파지 스크리닝 방법을 사용하여 최적화/인간화 변이체를 평가하였다. 결합, 인간 점수 퍼센트 및 Epivax (잠재적 면역원성에 대한 인 실리코 예측 도구) 점수를 기반으로 최종 선도 후보 서열을 선택하였다.
DLL3 및 CD3에 결합하는 이중 특이적 단백질의 작제
DLL3 및 CD3 결합제의 가변 영역을 일반적인 분자 생물학 기술을 사용하여 발현 벡터 pTT5 (캐나다 국립 연구 위원회)에 클로닝하여 Fc 영역 및 DLL3에 대한 단쇄 Fab 결합을 포함하는 하나의 DLL3 특이적 결합 단위 (이러한 결합 단위는 본원에서 "DLL3 암" 또는 "DLL3 쇄"라고도 함)와 Fc 영역 및 및 CD3에 결합하는 단쇄 Fab를 포함하는 CD3 특이적 결합 단위 (이러한 결합 단위는 본원에서 "CD3 암" 또는"CD3 쇄"라고도 함)를 가지는 이중 특이적 결합 단백질을 형성하였다. DLL3 및 CD3 암의 Fc 영역은 "놉 (Knob)" 또는 "홀 (Hole)" 돌연변이 (Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35)를 포함하고 각각의 쇄는 놉 또는 홀 쇄로 지칭된다. 다중 단편 DNA 어셈블리의 경우, Gibson 어셈블리 및 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 접근법을 제조업체의 프로토콜 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)에 따라 사용하였다. DNA 미니 프렙 (mini-prep)을 시퀀싱하였다.
각 발현 벡터는 쇄 코딩 유전자 (DLL3 또는 CD3 암/쇄), 즉 신호 서열과 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자에 대한 진핵 프로모터 요소, 암피실린과 같은 원핵 선별 마커 유전자에 대한 발현 카세트, 및 복제 기원을 함유한다. 이들 DNA 플라스미드를 암피실린 내성 대장균 콜로니 및 배양물에서 증식시키고 정제하였다.
실시예 2: DLL3 및 CD3에 결합하는 이중 특이적, 2 가 결합 단백질의 발현 및 정제
DLL3/CD3-쇄-코딩 유전자를 보유하는 pTT5 벡터로 CHO-E 세포를 일시적 형질감염시켜 DLL3 및 CD3에 결합하는 이중 특이적 분자를 생성하였다. 요약하면, 무혈청 배지 중 현탁액에서 성장하는 형질감염된 CHO-E 세포를 진탕 플라스크에서 140 rpm, 37 ℃ 및 5% CO2 하에 교반하면서 배양하고 지수 성장 조건에서 유지하였다. 형질감염 당일, 세포를 1:3 질량비로 Knob-chain 플라스미드와 Hole-chain 플라스미드로 화학적으로 형질감염시켰다. 그런 다음 1 L의 Gibco® FreeStyle™ CHO 발현 배지 (LifeTechnologies, NY, US)에 1 내지 2×106 세포/ml로 시딩하였다. 그 후 세포를 단백질 발현을 허용하도록 200 ml의 상업적 공급 용액을 1 회 공급하여 10 일 동안 궤도 진탕 하에 배양하였다. Octet® 기기 (Pall ForteBio, CA, US) 및 protA 바이오센서 팁을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 배양 상등액의 항체 역가를 측정하였다.
재조합 DLL3/CD3 결합 단백질을 다음 2 단계 공정으로 배양 상등액으로부터 정제하였다: 먼저 MabSelect™ 컬럼 (GE Healthcare)을 사용한 단백질 A 친화성 크로마토그래피; 이어, Poros 50 HS 컬럼 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피. 2 단계 정제 물질을 50 mM 아세트산나트륨 및 100 mM NaCl의 최종 완충액 (pH 5.0)에 저장하였다. 분석 크기 배제 크로마토그래피, 질량 분석법 및 분석 초원심분리로 샘플의 순도 및 이질성 정도를 평가하였다. 기능성 시험용으로 고도화된 샘플은 단량체 함량이 약 99%인 2 단계 정제 물질로 구성되었다.
실시예 3: 재조합 단백질의 생성
· 인간 DLL3-His
HEK-293 세포 (Thermo Fisher), Lenti-X 렌티바이러스 시스템 (Clontech) 및 인간 DLL3-His를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 인간 DLL3-His를 생성하는 세포주를 생성하였다 (인간 DLL3 수탁 번호 Q9NYJ7 huDLL3-His: 서열 번호 106). 발현을 위해, 세포를 37 ℃, 5% CO2 및 140 rpm에서 진탕 하에 배양하고 확장시켰다. 발현 0 일에, 세포를 펠렛화하고 Expi 293 배지에 재현탁시켰다. 발현 3 일째에 조정된 배양 상등액을 4700 rpm에서 40 분 동안 세포를 펠렛화하여 수확하였다. 정제 전에 프로테아제 억제제를 바이오매스에 첨가하였다. 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 조정된 배양 상등액을 0.5 mM TCEP, 0.02% CHAPS, 10 mM 이미다졸로 조절하였다. HisTrap Ni 엑셀 컬럼 및 완충액 A:50 mM MES, 50 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 0.02% CHAPS, pH 6.5에서 정제를 수행하였다. 관심 단백질을 20 mM 이미다졸에서 500 mM 이미다졸로의 용출 구배를 사용하여 0.5M 이미다졸이 보충된 완충액 A (pH 8.5)에서 용출시켰다. 풀링된 분획을 완충액: 50 mM MES, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.02% CHAPS, 0.2M 아르기닌, 3% 글리세롤, pH 6.5에서 투석시켰다. 정제된 물질을 질량 분석법 및 분석용 초원심분리에 의해 정성화하였다.
· Cyno DLL3-His
HEK-293 세포 (Thermo Fisher), Lenti-X 렌티바이러스 시스템 (Clontech) 및 Cyno DLL3-His를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 Cyno DLL3-His를 생성하는 세포주를 생성하였다 (Cyno DLL3 수탁 번호 XM_005589196.1 (RefSeq); Cyno DLL3-His: 서열 번호 107). 발현을 위해, 세포를 37 ℃, 5% CO2 및 140 rpm에서 진탕 하에 배양하고 확장시켰다. 발현 0 일에, 세포를 펠렛화하고 Expi 293 배지에 재현탁시켰다. 발현 3 일째에 조정된 배양 상등액을 4700 rpm에서 40 분 동안 세포를 펠렛화하여 수확하였다. 정제 전에 프로테아제 억제제를 바이오매스에 첨가하였다. 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 조정된 배양 상등액을 0.5 mM TCEP, 0.02% CHAPS, 10 mM 이미다졸로 조절하였다. HisTrap Ni 엑셀 컬럼 및 완충액 A:50 mM MES, 50 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 0.02% CHAPS, pH 6.5에서 정제를 수행하였다. 관심 단백질을 20 mM 이미다졸에서 500 mM 이미다졸로의 용출 구배를 사용하여 0.5M 이미다졸이 보충된 완충액 A (pH 8.5)에서 용출시켰다. 풀링된 분획을 완충액: 50 mM MES, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.02% CHAPS, 0.2M 아르기닌, 3% 글리세롤, pH 6.5에서 투석시켰다. 정제된 물질을 질량 분석법 및 분석용 초원심분리에 의해 정성화하였다.
· 인간 CD3 E+G HuFc-6xHis (E+G는 예를 들어 서브유닛을 나타냄)
HEK-293 세포 (Thermo Fisher), Lenti-X 렌티바이러스 시스템 (Clontech) 및 Human CD3 E+G HuFc-6xHis를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 인간 CD3 E+G HuFc-6xHis를 생성하는 세포주를 생성하였다 (인간 CD3E 수탁 번호 P07766; 인간 CD3E+G-HuFc-His: 서열 번호 108). 발현을 위해, 세포를 Freestyle 293 배지에서 37 ℃, 가습 8% CO2 환경 및 135 rpm에서 진탕 하에 배양하고 확장시켰다. 조정된 배양 상등액을 9300xg으로 30 분 동안 원심분리하여 6 일에 수확하였다. 발현을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 모니터링하였다. 조정된 배양 상등액을 0.2M 수크로스, 5% 글리세롤, 0.01% CHAPS 및 10 mM 이미다졸로 조절하였다. 그런 다음 pH를 7.2로 조정하였다. 정제를 2 단계 공정으로 수행하였다: Ni/NTA 수지를 사용한 친화성 정제 (4 ℃에서 밤새 배양하고 250 mM 이미다졸로 용출); 이어서 0.2M 수크로스, 5% 글리세롤, 0.01% CHAPS, 1 mM TCEP (pH 7.2)를 포함하는 목적 완충액 PBS로 Superdex 200 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피. 풀링된 물질을 최종 분석 및 저장 전에 10K MWCO PES 막 비바 셀 100 원심분리 장치를 사용하여 농축하였다. 정제된 물질을 질량 분석법 및 분석용 초원심분리에 의해 정성화하였다.
· Cyno CD3 E+G HuFc-6xHis (E+G는 εγ 서브유닛을 나타냄)
HEK-293 세포 (Thermo Fisher), Lenti-X 렌티바이러스 시스템 (Clontech) 및 Cyno CD3 E+G HuFc-6xHis를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 Cyno CD3 E+G HuFc-6xHis를 생성하는 세포주를 생성하였다 (사이노몰구스 CD3E 수탁 번호: Q95LI5 <, cyno CD3 E+G huFc-His: 서열 번호 109Accession). 발현을 위해, 세포를 Freestyle 293 배지에서 37 ℃, 가습 8% CO2 환경 및 135 rpm에서 진탕 하에 배양하고 확장시켰다. 조정된 배양 상등액을 9300xg으로 30 분 동안 원심분리하여 6 일에 수확하였다. 발현을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 모니터링하였다. 조정된 배양 상등액을 0.2M 수크로스, 5% 글리세롤, 0.01% CHAPS 및 10 mM 이미다졸로 조절하였다. 그런 다음 pH를 7.2로 조정하였다. 정제를 2 단계 공정으로 수행하였다: Ni/NTA 수지를 사용한 친화성 정제 (4 ℃에서 밤새 배양하고 250 mM 이미다졸로 용출); 이어서 0.2M 수크로스, 5% 글리세롤, 0.01% CHAPS, 1 mM TCEP (pH 7.2)를 포함하는 목적 완충액 PBS로 Superdex 200 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피. 풀링된 물질을 최종 분석 및 저장 전에 10K MWCO PES 막 비바 셀 100 원심분리 장치를 사용하여 농축하였다. 정제된 물질을 질량 분석법 및 분석용 초원심분리에 의해 정성화하였다.
실시예 4A: 재조합 DLL3 및 CD3 εγ 서브유닛에 대한 친화성 및 종간 교차 반응성의 SPR 기반 결정
재조합 인간 및 cyno DLL3-ECD 및 인간과 cyno CD3 εγ 서브유닛의 Fc-융합 단백질에 대한 정제된 DLL3/CD3 이중 특이적 작제물의 결합 친화성을 ProteOn XPR36 기기 (Bio-Rad)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정하였다. 전개 완충액 및 모든 희석 (제시된 경우 제외)은 PBS-T-EDTA에서 수행하였다. GLM 센서 칩 (Bio-Rad)을 제조업체의 권장사항에 따라 정규화하고 사전 조정하였다. 센서 칩을 EDC/s-NHS의 동일한 혼합물로 수평 방향으로 300 초 동안 30 ul/분의 유속에서 활성화하고 단백질 A/G (10 mM 아세테이트 (pH 4.5)에서 20 ug/ml)로, 30 ul/분의 유속에서 300 초 동안 수평 방향으로 고정하여 표면에 ~5000 RU의 단백질 A/G를 생성하였다. 센서 칩을 30 ul/분의 유속에서 300 초 동안 수평 방향으로 1M 에탄올 아민 HCl로 비활성화시켰다. 센서 칩을 수평으로 3 회, 수직으로 3 회 100 ul/분의 유속으로 18 초 0.85% 인산으로 안정화시켰다.
DLL3에 대한 결합 동역학적 결정을 위해, 25 ul/분의 유속으로 250 초 동안 수직으로 단백질 A/G 표면에 이중 특이적 분자를 개별적으로 포획하였다. 40 ul/분의 유속으로 60 초 동안 수평으로 PBS-T-EDTA를 주입하여 기준선을 안정화시켰다. 분석물 (hu DLL3 또는 cy DLL3)을 40 ul/분의 유속으로 600 초 동안 포획 및 2700 초 동안 해리된 항체 위에 수평으로 주입하였다. 분석물의 농도는 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM 및 1.25 nM이었다. 0.85% 인산 용액을 수평으로 1 회, 수직으로 1 회 100 ul/분의 유속으로 18 초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다.
CD3에 대한 결합 동역학적 결정을 위해, hu CD3 εγ-Fc 및 cy CD3 εγ-Fc (pH 4.5 아세테이트에 용해됨)를 30 ul/분의 유속으로 140 초 동안 수직으로 아민 커플링을 통해 센서 표면에 직접 고정하였다. 40 ul/분의 유속으로 60 초 동안 수평으로 PBS-T-EDTA를 주입하여 기준선을 안정화시켰다. 분석물 (이중 특이적 분자)을 40 ul/분의 유속로 600 초 동안 포획 및 600 초 동안 해리된 CD3 εγ-Fc 작제물 위에 수평으로 주입하였다. 분석물의 농도는 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, 31.3 nM 및 15.6 nM 또는 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.25 μM 및 0.125 μM이었다. 0.85% 인산 용액을 수평으로 1 회, 수직으로 1 회 100 ul/분의 유속으로 18 초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다.
인터 스팟 (센서 표면과의 상호작용) 및 블랭크 (PBS-T-EDTA)를 원시 데이터에서 제하였다. 그런 다음 센서 그램을 1:1 키네틱 모델에 적합화하여 hu DLL3 및 cy DLL3에 대한 친화성 (KD) 값뿐만 아니라 속도 상수 (ka, kd)를 제공하고, hu CD3εγ 및 cy CD3εγ에 대한 친화성 (KD) 값을 제공하기 위해 전체적으로 평형에 적합화시켰다.
본원에 기술된 DLL3/CD3 결합 단백질은 pM 범위에서 DLL3에 대한 친화성을 나타냈다. CD3 εγ 서브유닛에 대한 친화도는 낮은 nM 범위였다. 인간과 cyno 사이의 종간 갭은 균형을 이룬다. 3 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 친화도 (각각 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79, 서열 번호 80 또는 서열 번호 105의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질)가 표 2A에 제시되어 있다.
실시예 4B: 재조합 DLL3 및 CD3 εγ에 대한 친화성의 SPR 기반 결정
재조합 인간 DLL3-ECD 및 인간 CD3 εγ 서브유닛의 Fc-융합 단백질에 대한 정제된 DLL3/CD3 이중 특이적 작제물의 결합 친화도를 ProteOn XPR36 기기 (Bio-Rad)를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정하였다. 방법은 실시예 4A에서와 유사하지만, 아래에 설명된 바와 같이 몇 가지 차이점이 있다.
DLL3에 대한 결합 동역학적 결정을 위해, 30 ul/분의 유속으로 200 초 동안 수직으로 단백질 A/G 표면에 항-DLL3/CD3 분자를 개별적으로 포획하였다. 30 ul/분의 유속으로 60 초 동안 수평으로 PBS-T-EDTA를 주입하여 기준선을 안정화시켰다. 분석물 (hu DLL3)을 30 ul/분의 유속로 300 초 동안 포획 및 1800 초 동안 해리된 항체 위에 수평으로 주입하였다. 분석물의 농도는 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM 및 1.25 nM이었다. 0.85% 인산 용액을 수평으로 1 회, 수직으로 1 회 100 ul/분의 유속으로 18 초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다.
CD3에 대한 결합 동역학적 결정을 위해, HuCD3E_HuCD3G-Fc (pH 4.5 아세테이트에 용해됨)를 30 ul/분의 유속으로 360 초 동안 수직으로 아민 커플링을 통해 센서 표면에 직접 고정하였다. 30 ul/분의 유속으로 60 초 동안 수평으로 PBS-T-EDTA를 주입하여 기준선을 안정화시켰다. 분석물 (모든 항-DLL3/CD3 분자)을 30 ul/분의 유속로 600 초 동안 포획 및 1800 초 동안 해리된 항체 위에 수평으로 주입하였다. 분석물의 농도는 250 nM, 83.3 nM, 27.8 nM, 9.3 nM 및 3.1 nM이었다. 0.85% 인산 용액을 수평으로 1 회, 수직으로 1 회 100 ul/분의 유속으로 18 초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다.
예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질의 친화도 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 24l, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 또는 서열 번호 252의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질, 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 105의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)가 표 2B에 제시되어 있다.
실시예 5: 세포 표면에서 세포 외 도메인 및 그의 서브 도메인을 발현하는 HEK293 세포의 생성
전장 인간 DLL3 (Uniprot: Q9NYJ7), 사이노몰구스 DLL3 (UPI0003AB95BD), 인간 DLL1 (Q00548) 및 인간 DLL4 (Q9NR61)를 각각 발현하는 안정한 HEK293 세포의 생성을 위해, 각각의 코딩 서열을 pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific)에 클로닝하고, FLAG-태그를 신호 서열과 세포 외 도메인 사이에 삽입하였다. 세포 표면에서의 발현을 항-FLAG 항체 (클론 M2, Sigma)에 이어 모노클로날 항 마우스 IgG1 (Acris)을 사용하여 확인하였다. DLL3의 세포 외 도메인은 상이한 서브 도메인으로 구성된다:
· Hu DLL3 신호 펩티드: aa 1-26
· Hu DLL3 N-말단 ECD 도메인: aa 27-175
· Hu DLL3 DSL: aa 176-215
· Hu DLL3 EGF 1: aa 216-249
· Hu DLL3 EGF2: aa 274-310
· Hu DLL3 EGF3: aa 312-351
· Hu DLL3 EGF4: aa 353-389
· Hu DLL3 EGF5: aa 391-427
· Hu DLL3 EGF6: aa 429-465
· 막 근위 펩티드: AA 466-492
다음의 DLL3 서브 도메인이 HEK293 세포의 세포 표면에서 발현되었다:
· Hu DLL3 EGF 1+2: Uniprot: Q9NYJ7 aa 216-310
· Hu DLL3 EGF 2+3: Uniprot: Q9NYJ7 aa 274-351
· Hu DLL3 EGF3+4: Uniprot: Q9NYJ7 aa 312-389
· Hu DLL3 EGF4+5: Uniprot: Q9NYJ7 aa 353-427
· Hu DLL3 EGF5+6: Uniprot: Q9NYJ7 aa 391-465
· Hu DLL3 EGF6+막 근위 펩티드: Uniprot: Q9NYJ7 aa 429-492
인간 DLL3의 6-His-myc 태깅 서브 도메인을 발현하는 HEK293 세포의 생성을 위해, 각각의 코딩 서열을 pcDNA 3.1 (Thermo Fisher Scientific)에 클로닝하였다. 작제물은 N-말단 마우스 IgG Vk 선행 서열, 이어서 6-히스티딘-myc 태그 및 각각의 인간 DLL3 도메인을 포함한다. 인간 DLL3 도메인의 세포 표면 국재화를 보장하기 위해 모든 작제물에 Ser/Gly-링커, 막관통 도메인 (aa266-288) 및 인간 EpCAM (P 16422)의 세포 내 도메인 (aa 289-314)이 이어졌다. 서브 도메인의 발현을 WO 2013126746호에 기술된 바와 같은 다양한 도메인에 대한 마우스 모노클로날 IgG2a 항체를 사용하여 확인하였다. 결합된 모노클로날 항체는 염소 항-마우스 IgG (F(ab')2)-RPE (Jackson Immuno Research)로 검출되었다. 샘플을 유세포 분석법으로 측정하였다. 인간 DLL1 및 DLL4의 발현을 항-DLL1 (R&D Systems, MAB1818) 및 항-DLL4 (R&D Systems, MAB1506) 항체에 이어 PE 표지된 항-마우스 또는 항-래트 2 차 항체를 사용하여 FACS 분석으로 확인하였다 (도 5, 오른쪽 패널 참조).
실시예 6: DLL3/CD3 결합 단백질의 에피토프 도메인 매핑
DLL3의 서브 도메인을 발현하는 재조합 세포주에 대한 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합으로 에피토프 도메인을 결정하였다 (도 2 참조). 이들 세포주의 생성은 실시예 5에서 설명되었다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 쇄-코딩 유전자를 보유하는 pTT5 벡터로 CHO-E 세포를 일시적 형질감염시켜 DLL3/CD3 결합 단백질을 생성하였다.
DLL3의 서브 도메인을 발현하는 세포를 FACS 완충액 (PBS/0.5% BSA/0.05% 소듐 아지드)에서 1.6 nM의 2 단계 정제된 DLL3/CD3 결합 단백질로 염색하였다. 결합된 분자를 PE-접합된 항-인간 2 차 항체 (Sigma-Aldrich, #P8047)로 검출하였다. 음성 대조군으로서, 세포를 이차 항체만으로 배양하였다. 샘플을 유세포 분석법으로 측정하였다. 도 3A 내지 C는 DLL3의 상이한 영역에 결합하는 예시적인 결합제 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251 또는 서열 번호 252의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)를 나타낸다. 에피토프 도메인의 서열은 실시예 5의 표 3에 나열되어 있다.
실시예 7: 종간 교차 반응
NCI-H82 (HTB-175™) 및 SHP77 (ATCC®, CRL-2195™) 세포, 2 개의 SCLC 세포주 및 사이노몰구스 DLL3 발현 재조합 세포주에 대한 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합 (실시예 5에 기재된 세포주의 생성)으로 종간 교차 반응을 결정하였다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 쇄-코딩 유전자를 가지는 pTT5 벡터로 CHO-E 세포를 일시적 형질감염시켜 DLL3/CD3 결합 단백질을 생성하였다. 인간 또는 사이노몰구스 DLL3을 발현하는 세포를 FACS 완충액 (PBS/0.5% BSA/0.05% 소듐 아지드)에서 농도를 증가시키면서 1.6 nM의 2 단계 정제된 DLL3/CD3 결합 단백질로 염색하였다. 결합된 분자를 PE-접합된 항-인간 2 차 항체 (Sigma-Aldrich, #P8047)로 검출하였다. 음성 대조군으로의 세포는 2 차 항체로만 배양하였다. 샘플을 유세포 분석법으로 측정하였다. 도 4는 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 74의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄, 서열 번호 76의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 77의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄또는 서열 번호 78의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질)의 인간 및 cyno DLL3-발현 세포에 대한 결합을 나타낸다.
실시예 8: 인간 DLL1 및 DLL4에 대한 결합 부재 확인
인간 DLL1 또는 DLL4를 발현하는 재조합 세포에 대한 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합 (실시예 5에 기재된 세포주의 생성)으로 인간 DLL1 및 DLL4에 대한 교차-반응성의 부재를 결정하였다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 쇄-코딩 유전자를 가지는 pTT5 벡터로 CHO-E 세포를 일시적 형질감염시켜 DLL3/CD3 결합 단백질을 생성하였다.
DLL1 및 DLL4를 발현하는 세포를 FACS 완충액 (PBS/0.5% BSA/0.05% 소듐 아지드)에서 농도를 증가시키면서 1.6 nM의 2 단계 정제된 DLL3/CD3 결합 단백질로 염색하였다. 결합된 분자를 PE-접합된 항-인간 2 차 항체 (Sigma-Aldrich, #P8047)로 검출하였다. 음성 대조군으로의 세포는 2 차 항체로만 배양하였다. 샘플을 유세포 분석법으로 측정하였다. 항-DLL1 (R&D Systems, MAB1818) 및 항-DLL4 (R&D Systems, MAB1506) 항체에 이어 PE 표지된 항-마우스 또는 항-래트 이차 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 인간 DLL1 및 DLL4의 발현을 확인하였다. 도 5는 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 74의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄, 서열 번호 76의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄, 서열 번호 77의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄또는 서열 번호 78의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질)의 인간 DLL1 및 DLL4 발현 세포에 대한 결합을 나타낸다.
실시예 9: SCLC 세포주 및 T 세포에 대한 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합
NCI-H82 (HTB-175TM) 및 SHP77 (ATCC®, CRL-2195TM)의 유세포 분석법에 의해 인간 SCLC 세포주에 대한 DLL3/CD3 결합 단백질의 결합을 시험하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 DLL3/CD3 결합 단백질을 생성하였다.
수혈용 혈액을 수집하는 혈액 은행의 부산물인 농축 림프구 제제 (버피 코트)로부터 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 준비하였다. 모든 버피 코트는 헬싱키 선언에 따라 사전 동의 후 오스트리아의 주 윤리위원회의 승인을 받아 구하였으며 PBMC는 수집 당일에 준비하였다. 이에 따라, 단핵 세포를 Ficoll 밀도 구배 원심분리 (1400 rpm에서 중단없이 35 분)와 PBS로 광범위한 세척을 거쳐 단리하였다. 남은 적혈구를 ACK 용해 완충액 (Thermo Fisher Scientific, A1049201)에서 3 분 동안 인큐베이션한 다음, PBS에서 세척하여 제거하고, RPMI 1640 GlutaMAX (Gibco #61870-010), 5% 인간 AB 혈청 AB (Gemini, GemCell cat # 100-512 LOT # H56500I) + 1% MEM-NEAA (Gibco # 11140-035), 10 mM HEPES (Affymetrix #7365-49-9), 10 μM 베타-머캅토에탄올 (Gibco #21985-023) 및 피루브산나트륨 (Gibco #11360-039)를 함유하는 분석 배지에 현탁시켰다.
Pan T 세포 단리 키트 II (Miltenyi Biotec#130-091-156)를 사용하여 음성 선택으로 T-세포를 단리하였다. 요약하면, 세포를 10 Mio 세포 당 40 ㎕ 완충액 PBS/0.5% BSA (Gibco ref# 041-94553 M)/2 mM EDTA (Invitrogen ref# 15575-038)에 재현탁시키고, 4 ℃에서 5 분 동안 10 Mio 세포 당 10 ㎕의 비오틴-항체 칵테일과 인큐베이션하였다. 그 후 30 ㎕ 완충액 및 20 ㎕ 항-비오틴 마이크로비드/100 만 개의 세포를 첨가하고 4 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 혼합물을 적합한 MACS 분리기 (Miltenyi Biotec)의 자기장에서 미리 헹구어낸 25LS 컬럼 (Miltenyi Biotec#130-042-401)에 두었다. 통과 유동물을 수집하고 분석 배지에서 세척하였다.
세포 (T 세포 또는 인간 SCLC 세포)를 FACS 완충액 (PBS/0.5% BSA/0.05% 소듐 아지드)에서 농도를 증가시키면서 농도 증가의 2 단계 정제된 DLL3/CD3 결합 단백질로 염색하였다. 결합된 분자를 PE-접합된 항-인간 2 차 항체 (Sigma-Aldrich, #P8047)로 검출하였다. DSL (DLL3#6), EGF1 (DLL3#5) 또는 EGF4 (DLL#4) 도메인을 표적으로 하는 DLL3/CD3 결합 단백질은 막 근위 펩티드 (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3)를 표적으로 하는 DLL3/CD3 결합 단백질과 비교하여 DLL3을 발현하는 SCLC 세포주에 더 강한 결합을 나타낸다. 상이한 에피토프 도메인에 대한 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251 또는 서열 번호 252의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 및 DLL3 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 결합 단백질)의 SHP77, NCI-H82 세포 및 T 세포에의 결합은 도 6A 내지 V에 도시되었다.
실시예 10A: 인간 SCLC 세포주에 대한 비자극 PBMC의 지향 효능
세포 용해에 대한 판독값으로 락테이트-탈수소효소 (LDH) 방출을 사용하여 SCLC 세포주에 대한 비자극 PBMC의 효능을 결정하였다. 이 분석에서는, DLL3-양성 SCLC 세포주, SHP77 및 NCI-H82를 이펙터 세포로서 인간 PBMC와 10:1의 이펙터 대 표적 세포 비율로 72 시간 동안 DLL3/CD3 결합 단백질의 농도를 증가시켜 공동-배양하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 쇄-코딩 유전자를 보유한 pTT5 벡터로 CHO-E 세포를 일시적으로 형질감염시켜 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78의 DLL3 쇄, 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)을 생성하였다.
수혈용 혈액을 수집하는 혈액 은행의 부산물인 농축 림프구 제제 (버피 코트)로부터 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 준비하였다. 모든 버피 코트는 헬싱키 선언에 따라 사전 동의 후 오스트리아의 주 윤리위원회의 승인을 받아 구하였으며 PBMC는 수집 당일에 준비하였다. 이에 따라, 단핵 세포를 Ficoll 밀도 구배 원심분리 (1400 rpm에서 중단없이 35 분)와 PBS로 광범위한 세척을 거쳐 단리하였다. 남은 적혈구를 ACK 용해 완충액 (Thermo Fisher Scientific, A1049201)에서 3 분 동안 인큐베이션한 다음, PBS에서 세척하여 제거하고, RPMI 1640 GlutaMAX (Gibco #61870-010), 5% 인간 AB 혈청 AB (Gemini, GemCell cat # 100-512 LOT # H56500I) + 1% MEM-NEAA (Gibco # 11140-035), 10 mM HEPES (Affymetrix #7365-49-9), 10 μM 베타-머캅토에탄올 (Gibco #21985-023) 및 피루브산나트륨 (Gibco #11360-039)를 함유하는 분석 배지에 현탁시켰다.
이어서, 표적 세포, SHP77 및 NCI-H82 및 PBMC를 1:10 비율로 0.0001 nM 내지 100 nM 농도의 DLL3/CD3 결합 단백질과 함께 72 시간 동안 인큐베이션하였다.
Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 독성 활성을 측정하였다. 요약하면, 이 방법은 죽은 세포 또는 혈장 막 손상 세포로부터 LDH의 방출 용법을 기반으로 한다. 세포 배양 상등액을 키트의 반응 혼합물과 30 분 동안 인큐베이션하고 LDH의 활성 결과인 포마잔의 형성을 세포 용해 대용물로서 500 nm에서 분광 광도계로 측정하였다. 최대 용해 대조군에 대한 세포 독성의 백분율을 다음 공식에 따라 계산하였다:
세포 독성 (대조군 대비) = 측정값 - 배경 / 최대 용해 - 최소 용해
배경: 표적 세포 + 이펙터 세포
최대 용해: 표적 세포 + 5% Triton X-100
최소 용해: 표적 세포
GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 최대 용해 대조군에 대한 세포 독성 백분율을 해당 DLL3/CD3 결합 단백질 농도에 대해 플롯팅하였다. 시그모이드 용량 반응 곡선의 평가를 위해 4 매개변수 로지스틱 방정식 모델로 용량 반응 곡선을 분석하고 EC90 값을 계산하였다 (EC90 값은 표 4A에 제시됨).
도 7A는 상이한 에피토프 도메인에 결합하는 7 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 또는 서열 번호 78의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)의 세포 용해에서의 효능에 대한 예를 나타낸다.
실시예 10B: 인간 SCLC 세포주에 대한 비자극 T 세포의 지향 효능
T 세포를 실시예 9에 기술된 바와 같이 단리하였다. 이어 정제된 T 세포를 실시예 10A에 기술된 바와 같이 표적 세포로서 SHP77 및 NCI-H82 세포를 사용하는 세포 독성 분석에 이펙터 세포로서 사용하였다. 용량 반응 곡선은 도 7B 내지 H (SHP77 세포) 및 도 7I 내지 0 (NCI-H82 세포)에 도시되었다. 계산된 EC90 값은 표 4B에 제시되어 있다.
도 7B 내지 0는 19 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 서열 번호 252의 DLL3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질)의 세포 용해에서의 효능에 대한 예를 나타낸다.
실시예 11: 시험관 내 내재화 분석
표적 세포로서 DLL3-양성 SHP77 세포와 함께 예비 인큐베이션한 후 DLL3/CD3 결합 단백질의 효능 변화를 측정하였다. DLL3/CD3 결합 단백질이 내재화되면 유효 농도가 이에 따라 감소해야 하며 따라서 분명한 효능 감소가 있어야 한다.
DLL3/CD3 결합 단백질을 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 실시예 10에 기술된 바와 같이 준비하였다.
SHP77 표적 세포를 플레이팅하고, 비자극 PBMC를 48 시간 동안 첨가하기 전에 0.0001 내지 100 nM 농도의 DLL3/CD3 결합 단백질과 함께 2 시간 및 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 이펙터 대 표적 세포 비율은 10:1이었다. 실시예 10에 기술된 바와 같이 Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche)를 사용하여 세포 독성 활성을 결정하였다.
도 8은 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질)의 세포 용해의 효능 및 유효성에 차이가 없음을 보여준다. 비-예비 인큐베이션 샘플 (Oh)과 비교하여 효능과 유효성이 관찰되었다. 결과는 DLL3/CD3 결합 단백질로 유의한 내재화가 발생하지 않음을 시사한다.
실시예 12: 마우스 PK 연구
C57BL/6 마우스에서 단일 1 mg/kg i.v. 용량 후 DLL3/CD3 결합 단백질의 PK를 평가하였다. DLL3 포획/CD3 검출 분석을 사용하여 DLL3/CD3 결합 단백질의 혈청 농도를 결정하였다.
요약하면, 수컷 C57BL/6 마우스에 단일 1 mg/kg 정맥 내 (IV) 용량 (분자 당 n = 3)을 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 0.15, 2, 8, 24, 72, 96, 168, 240 및 336 시간에 혈액 샘플을 수집하였다. 비오티닐화된 DLL3을 포획 시약으로 사용하고 설포 태그된 CD3를 검출 시약으로 사용하여 MSD 기반 리간드 결합 분석으로 혈청 약물 수준을 측정하였다. 비구획 분석을 사용하여 혈청 농도 시간 프로파일로부터 약동학 (PK) 매개변수를 계산하였다. 다음 PK 매개변수가 평가되었다: AUCtlast (시간 0에서 마지막 정량화 가능한 시점까지 혈청 농도-시간 곡선 아래 면적), AUCinf (무한대로 외삽된 혈청 농도 시간 곡선 아래 면적), CL (전신 청소율), Vss (정상 상태 부피 분포) 및 tl/2 (종말 반감기).
예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질)에 대한 평균 (SD) 혈청 농도 시간 프로파일이 도 9에 요약되어 있다. 이들 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질에 대한 평균 (SD) PK 매개변수는 표 5에 요약되어 있다.
|
DLL3/CD3
결합 단백질 |
AUC
0-last
(μg*d/mL) |
AUC
0-inf
(μg*d/mL) |
CL
(mL/일/kg) |
V
ss
(mL/kg) |
t
1/2
(일) |
| DLL3#3/CD3#1 | 1180 (127) | 1760 (179) | 13.7 (1.48) | 178 (57.7) | 10.6 (4.67) |
| DLL3#3/CD3#2 | 1260 (170) | 1440 (154) | 16.8 (1.74) | 109 (19.5) | 4.97 (0.78) |
실시예 13: 생체 내 이종이식 효능 연구
인간 T 세포로 재구성된 인간 이종이식 마우스 모델을 사용하여 효능 연구를 수행하였다. 구체적으로, 인간 SHP77 소세포 폐암 세포 (2×107)를 아치사적으로 조사된 (2 Gy, -1 일) 암컷 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tmlSug /JicTac 마우스의 우측 등쪽 옆구리에 피하 (s.c.) 주사하였다 (1 일). 동시에, 인간 CD3 양성 T 세포 (건강한 인간 헌혈자로부터 단리)를 시험관 내에서 확장하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 실시예 10에 기재된 바와 같이 준비하였다.
Pan T 세포 단리 키트 II (Miltenyi Biotec #130-091-156)를 사용하여 음성 선택에 의해 T-세포를 단리하였다. 요약하면, 세포를 10 Mio 세포 당 40 ㎕ 완충액 PBS/0.5% BSA (Gibco ref# 041-94553 M)/2 mM EDTA (Invitrogen ref# 15575-038)에 재현탁시키고, 4 ℃에서 5 분 동안 10 Mio 세포 당 10 ㎕의 비오틴-항체 칵테일과 인큐베이션하였다. 그 후 30 ㎕ 완충액 및 20 ㎕ 항-비오틴 마이크로비드/100 만 개의 세포를 첨가하고 4 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 혼합물을 적합한 MACS 분리기 (Miltenyi Biotec)의 자기장에서 미리 헹구어낸 25LS 컬럼 (Miltenyi Biotec#130-042-401)에 두었다. 통과 유동물을 수집하고 분석 배지에서 세척하였다.
이어서, T 세포 활성화/확장 키트 인간 (Miltenyi Biotec Cat#130-091-441, Lot#5170720843)을 사용하여 20 일 동안 T 세포를 확장시켰다. 요약하면, 항-비오틴 MACSiBeadTM 입자에 CD2-, CD3-, CD28 비오틴을 적재하고 입자 당 2 개 세포의 비율로 정제된 T 세포로 전달한 후, 20 단위 재조합 IL-2 (R&D #202-IL-050/CF)의 존재하에 0.5-1×106 세포/ml의 밀도로 20 일 동안 인큐베이션하였다. 세포에 3 일마다 20 단위의 신선한 IL-2를 보충하였다. 동물에 주입하기 3 일 전에 T 세포를 CD2-, CD3-, CD28 비오틴을 4 개 세포 당 1 개의 비드 비율로 적재한 항-비오틴 MACSiBeadTM 입자로 추가 3 일 동안 재자극하였다. 마지막으로 MACSiMAG 분리기 (Miltenyi Biotec)로 비드를 제거하고 T 세포를 PBMC에서 세척하였다.
14 일째에, 동물을 종양 부피에 기초해 치료 그룹으로 무작위 배정하고 2×107 인간 T 세포를 복강 내로 (i.p.) 주사하였다. 17 일째에 치료를 시작하고, DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백) 또는 비히클 완충액 (50 mM NaOAc, 100 mM NaCl, pH 5.0)을 측면 꼬리 정맥에 정맥 내 (iv) 볼루스 주사에 의해 q7d 투여 요법으로 투여하였다. 종양 성장을 외부 캘리퍼 측정으로 모니터링하고 표준 반 타원체 공식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다. 연구 종료시 인간 CD3에 대한 면역 조직 화학 (IHC) 염색에 의해 비장에서 인간 T 세포 생착을 평가하였다. 연구 종료시 인간 T-세포 생착을 보이는 동물만 통계 분석에 포함시켰다. 희생 기준에 도달한 동물은 윤리적인 이유로 연구 중에 일찍 안락사시켰다. 종양 보유 마우스를 DLL3/CD3 결합 단백질로 매주 1 회 0.25 mg/kg으로 i.v. 처리하여 유의한 종양 퇴행이 유도되었다 (도 10).
실시예 14: DLL3/CD3 결합 단백질의 단량체 함량 백분율
예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 또는 서열 번호 252의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 105의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)의 단량체 백분율을 단백질 분석 크기 배제 크로마토그래피 (aSEC)에 의해 결정하였다 (표 6 참조). aSEC를 단백질 BEH SEC 컬럼 200Å, 1.7 ㎛, 4.6×150 mm (Cat# 186005225)를 사용하여 Waters (Milfrod, MA, USA) Acquity UPLC 시스템에서 실행하였다. 실행 조건은 다음과 같다: 이동상: 50 mM 인산나트륨, 200 mM 아르기닌 및 0.05% 소듐 아지드; 유속: 0.5 ml/분; 실행 시간: 5 분; 샘플 로딩량: 10 ㎍; 피크 검출: A280 nm; 크로마토그램의 자동화 처리 방법.
| DLL3/CD3 결합 단백질 |
1 차 정제 단계 후
단량체 퍼센트 |
2 차 정제 단계 후
단량체 퍼센트 |
| DLL3#1/CD3#1 | 76.4 | 99.4 |
| DLL3#2/CD3#1 | 54.4 | 98.0 |
| DLL3#3/CD3#1 | 69.5 | 99.8 |
| DLL3#3/CD3#2 | 77.6 | 99.5 |
| DLL3#3/CD3#3 | 70.8 | 98.3 |
| DLL3#4/CD3#1 | 72.2 | 99.1 |
| DLL3#5/CD3#1 | 70.5 | 99.1 |
| DLL3#6/CD3#1 | 55.2 | 99.9 |
| DLL3#7/CD3#1 | 78.1 | 99.0 |
| DLL3#8/CD3#1 | 54.8 | 99.5 |
| DLL3#9/CD3#1 | 72.0 | 99.0 |
| DLL3#10/CD3#1 | 70.2 | 98.3 |
| DLL3#11/CD3#1 | 68.2 | 94.7 |
| DLL3#12/CD3#1 | 66.2 | 98.7 |
| DLL3#13/CD3#1 | 52.8 | 99.9 |
| DLL3#14/CD3#1 | 52.6 | 87.0 |
| DLL3#15/CD3#1 | 61.5 | na |
| DLL3#16/CD3#1 | 71.8 | 99.5 |
| DLL3#17/CD3#1 | 60.2 | 94.7 |
| DLL3#18/CD3#1 | 61.5 | 98.2 |
실시예 15A: 열 안정성
시차 주사 열량계 (DSC)에 의해 열 안정성을 결정하고, DLL3/CD3 결합 단백질의 제 1 용융 전이 (Tm 1)의 결과를 표 7에 나타내었다. DSC 열 용융은 완충액 대조군에 대한 용액 내 단백질의 열 안정성에 관한 정보를 제공한다. 20 mM 시트 레이트, 115 mM NaCl, pH 6에서 단백질의 1 mg/ml 용액에 대한 열적 전개 및 응집을 자동화 모세관 DSC를 통해 60 ℃/hr의 스캔 속도로 20 ℃에서 110 ℃까지 모니터링하였다.
실시예 15B: 열 안정성
열 이동 분석 (TSA)에 의해 열 안정성을 측정하고, DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 24l, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251 또는 서열 번호 252의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 105의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)의 제 1 용융 전이 (Tm 1)) 결과를 표 7B에 나타내었다. 외인성 형광단으로서 SYPRO 오렌지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 함께 QuantStudio 6 Flex 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, MA, Waltham)을 사용하여 온도 함수로서의 형광 강도 프로파일을 획득하였다. 샘플을 40 mM 염화나트륨 및 0.02% 소듐 아지드를 사용하여 10 mM 히스티딘, pH 6.0에서 0.4 mg/ml로 희석하였다. 25 ℃에서 95 ℃까지 2 ℃/분의 속도로 열 램핌하여 용융 곡선을 생성하였고, 데이터는 'ROX' 필터 세트 (Ex: 580±10 nm, Em: 623±14 nm)를 통해 약 0.4 ℃마다 수집되었다. 데이터를 Protein Thermal Shift 소프트웨어 버전 1.3 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 분석하였다.
실시예 16: Epivax에 의한 인 실리코에서의 예측 면역원성 점수:
수학적 알고리즘을 사용하여 인 실리코로 서열의 면역원성을 평가하였다. 구체적으로, 면역원성 점수의 척도로서 EpiMatrix Treg-조정된 점수 (EpiVax Inc., Providence RI)를 DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251 또는 서열 번호 252의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 105의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)에 대해 결정하고, 다양한 Fc 서열의 점수와 비교하였다. 이 점수는 T-세포 에피토프와 Treg 에피토프를 고려하고 있다. 면역원성 점수가 낮을수록 서열이 면역원성이 될 가능성이 적다. 일반적으로 음의 점수는 면역원성 위험이 낮은 것으로 간주되고 높은 양의 점수는 잠재적인 면역원성 표시로 간주된다. 아래 표에 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 DLL3/CD3 결합 단백질은 매우 낮은 면역원성 점수를 가지며, 이는 이러한 결합 단백질에 대해 면역원성이 될 위험이 낮음을 제시한다.
| DLL3/CD3 결합 단백질 | VH | VL | 완전 폴리펩티드 쇄 (VL-CL-링커-VH-CH1-힌지-CH2-CH3) |
| DLL3#1 DLL3 쇄 | -36.88 | -59.85 | -43.31 |
| DLL3#2 DLL3 쇄 | -46.99 | 31.40 | -33.53 |
| DLL3#3 DLL3 쇄 | -34.44 | 2.84 | -35.50 |
| DLL3#4 DLL3 쇄 | 25.97 | 28.92 | -21.93 |
| DLL3#5 DLL3 쇄 | -59.87 | -46.45 | -44.95 |
| DLL3#6 DLL3 쇄 | 29.70 | -14.55 | -27.26 |
| CD3#1 CD3 쇄 | -9.68 | -50.52 | -35.25 |
| CD3#2 CD3 쇄 | -15.54 | -50.52 | -36.23 |
| CD3#3 CD3 쇄 | -13.49 | -50.52 | -35.88 |
| DLL3#7 DLL3 쇄 | -48.55 | -34.92 | -41.60 |
| DLL3#8 DLL3 쇄 | -54.39 | -37.79 | -42.89 |
| DLL3#9 DLL3 쇄 | 35.95 | -60.37 | -31.83 |
| DLL3#10 DLL3 쇄 | -33.82 | -34.60 | -40.73 |
| DLL3#11 DLL3 쇄 | -24.00 | 26.66 | -30.50 |
| DLL3#12 DLL3 쇄 | -30.43 | 25.68 | -31.67 |
| DLL3#13 DLL3 쇄 | 8.64 | 18.63 | -25.96 |
| DLL3#14 DLL3 쇄 | 1.58 | -10.63 | -31.72 |
| DLL3#15 DLL3 쇄 | 8.93 | -8.31 | -29.91 |
| DLL3#16 DLL3 쇄 | -55.14 | 13.98 | -35.59 |
| DLL3#17 DLL3 쇄 | 11.89 | 12.55 | -26.52 |
| DLL3#18 DLL3 쇄 | 5.82 | 15.85 | -27.01 |
| Fc 단백질 쇄 | 조정된 Epivax 점수 |
| Fc-IgG1-WT | -25.64 |
| Fc-IgG1-LALA | -29.83 |
| Fc-IgG1-LALA-KNOB | -31.76 |
| Fc-IgG1-LALA-HOLE | -18.01 |
실시예 17A: 표면에 대한 비특이적 결합
본 발명의 DLL3/CD3 결합 단백질의 특이성을 고 하전 단백질을 사용하여 SPR 기반 분석법으로 추가 시험하였다. 결합 단백질이 비관련 하전 단백질에 상당한 결합을 갖는지 결정하기 위해 바이오 센서 기술을 사용한 비특이적 결합 분석이 개발되었다. 이 분석에서는 DLL3/CD3 결합 단백질을 두 SPR 표면에 통과시켰는데, 하나는 음전하 단백질 (트립신 억제제)로 코팅되었고 다른 하나는 양전하 단백질 (리소자임)로 코팅되었다. 단백질이 이러한 표면에 상당한 비특이적 결합을 보이는 경우 결합의 원인은 후보에 양전하 또는 음전하를 띤 표면 패치의 존재일 가능성이 높다. 단백질의 비특이적 결합은 약동학 (PK) 및 생체 분포 불량으로 해석될 수 있으며 다운스트림 제조 가능성에 영향을 미칠 수도 있다.
실험은 Biacore T200에서 수행되었다. 희석, 표면 준비 및 결합 실험은 10X HBS-EP에서 제조된 1X HBS-EP 완충액에서 25 ℃에서 수행되었다. 고정화 프로토콜 및 결합 실험 모두에 대한 유속은 5 μL/분이었다.
비특이적 결합 실험을 위한 표면을 제조하기 위해, 달걀 흰자위 리소자임 및 글리신 맥스 대두 유래 트립신 억제제를 아민 커플링 키트를 제조업체 설명서에 따라 사용하여 3000-5000 RU의 표면 밀도로 시리즈 S CM5 칩에 수동으로 커플링하였다.
샘플은 1X HBS-EP 완충액에서 1 μM로 준비하였다. 샘플을 10 분 회합 및 10 분 해리로 활성화된 표면 위에 주입하였다. 데이터를 Biacore T200 제어 소프트웨어 버전 2.0.1을 사용하여 수집하고 Biacore T200 평가 소프트웨어 버전 3.0을 사용하여 분석하였다.
DLL3/CD3 결합 단백질은 이러한 고 하전 표면에 결합하지 않았다. 표 10A는 2 개의 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질과 함께 2 개의 고 하전 단백질, 트립신 억제제 및 리소자임에 대한 결합 부재를 나타낸다.
실시예 17B: 표면에 대한 비특이적 결합
DLL3/CD3 결합 단백질 (서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 24l, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251 또는 서열 번호 252의 DLL3 쇄 및 서열 번호 79의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3/CD3 결합 단백질, 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 80의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질 및 서열 번호 75의 DLL3 쇄 및 서열 번호 105의 CD3 쇄를 포함하는 DLL3 결합 단백질)의 특이성을 10 분 회합 및 15 분 해리로 실시예 17a에 기재된 바와 같은 고 하전 단백질을 사용하여 R 기반 분석법으로 추가 시험하였다. 결과를 표 10B에 나타내었다.
실시예 18: DLL3-양성 및 DLL3-음성 종양 세포의 존재하에 용해, T 세포 활성화, T 세포 탈과립, T 세포 증식 및 사이토카인 분비 유도
PBMC를 실시예 9에 기재된 바와 같이 정제하였다. T 세포 활성화, T 세포 탈과립화 및 사이토카인 분비를 결정하기 위해, 표적 세포로서 PBMC 및 DLL3-양성 SHP77 또는 DLL3-음성 RKO-E6 세포를 사용한 세포 독성 분석을 실시예 10B에 기재된 바와 같이 설정하였다. T 세포를 인간 SHP77 또는 RKO-E6 세포쪽으로 지향하는 것에 의한 세포 용해 효능을 실시예 10A에 기술된 바와 같이 결정하였다. T 세포 활성화를 결정하기 위해, T 세포 탈과립 세포를 원심분리하고 CD4 (BD #550630), CD8 (BD #557834), CD25 (BD #340907)에 대한 항체로 염색하고, 이어 세포를 고정/침투 용액 (BD #554714)을 사용하여 침투시킨 다음, 퍼포린 (BioLegend #308120) 및 그랜자임 B (BD#560221)에 대한 항체로 염색하고, 유세포 분석법으로 측정하였다. 상등액의 사이토카인 수준을 U-PLEX 바이오마커 그룹 1 (hu) 분석 (MSD, #Kl5067L-2, Kit)에 의해 결정하였다.
T 세포의 증식을 결정하기 위해, PBMC를 5 μM Cell Trace™ CFSE (Invitrogen, C34554)로 표지하고 T 세포를 항-CD3 항체 (BioLegend cat#: 317336)로 염색하였다. 이어서 표지된 PBMC를 DLL3/CD3 결합 단백질의 농도를 증가시키면서 SHP77 또는 RKO-E6 세포와 10:1의 비율로 6 일 동안 인큐베이션하였다.
도 11 내지 15는 SHP77 또는 RKO-E6 세포의 T 세포 지향 용해 유도 (도 11) 및 SHP77 또는 RO-E6 세포 및 DLL3/CD3 결합 단백질의 존재하에 용량 의존적 T 세포 활성화 (도 12), T 세포 탈과립 (도 13), 사이토카인 분비 (도 14A: 인터페론 감마; 14B: MCP-1), T 세포의 증식 (도 15)의 유도를 나타낸다.
실시예 19: T 세포 서브세트를 SHP77 세포로 지향
PBMC를 실시예 10a에 기재된 바와 같이 단리하였다. 이어 T 세포 서브세트를 다음 시약 및 프로토콜을 사용하여 단리하였다:
| T 세포 서브세트 | 사용한 시약 및 프로토콜 |
| 나이브 T 세포 | Miltenyi Biotech; #130-097-095 |
| CD4+ T 세포 | Miltenyi Biotech; #130-096-533 |
| CD4+ 이펙터 기억 T 세포 | Miltenyi Biotech; #130-094-125 |
| CD4+ 중앙 기억 T 세포 | Miltenyi Biotech; #130-094-302 |
| CD8+ T 세포 | Miltenyi Biotech; #130-096-495 |
| CD8+CD45RA+ 이펙터 T 세포 | Miltenyi Biotech; #130-094-485 |
| CD8+ 기억 T 세포 | Miltenyi Biotech; #130-094-412 |
도 16 내지 20은 DLL3/CD3 결합 단백질의 인간 SHP77 세포에 대한 Pan T 세포 (도 16), 나이브 T 세포 (도 16), CD4+ T 세포 (도 17, 18), CD4+ 이펙터 기억 T 세포 (도 18), CD4+ 중앙 기억 T 세포 (도 17), CD8+ T 세포 (도 19, 20), CD8+CD45RA+ 이펙터 T 세포 (도 19), CD8+ 기억 T 세포 (도 20)의 재지향 효능을 나타낸다.
실시예 20: 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질에 의한 SHP77 이종이식 종양 조직에서의 T 세포 침윤.
실시예 13에 기술된 연구에서 마우스로부터 남은 종양 조직을 준비하여 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매시켰다. 이후 조직 절편을 준비하고 T 세포 (2GV6 Ventana)에서의 CD3 발현을 위해 염색하였다. 예시적인 DLL3/CD3 결합 단백질에 의한 SHP77 이종이식 종양 조직에서 T 세포 침윤이 도 21에 나타나 있다. 표 12의 점수를 사용하여 이종이식 종양 조직에서의 CD3 발현을 정량화하였다.
| 점수 | 설명 |
| 0 | 절편 단면에 CD3+ 세포 없음 |
| 1 | 주로 간질에 드문 산란 세포 또는 작은 클러스터 |
| 2 | 간질 및 가장자리에서 드문 산란 세포 또는 작은 클러스터 |
| 3 | 기질, 상피 및 가장자리에 낮은 세포 수 또는 클러스터 |
| 4 | 기질 및 가장자리에 중간 세포 수 또는 클러스터; 적은 수의 상피내 세포 |
| 5 | 기질 및 가장자리에 높은 세포 수 또는 클러스터; 적은 수의 상피내 세포 |
실시예 21: 항-DLL3 항체의 생성
항-DLL3 결합제를 수득하기 위해, DLL3 면역화 야생형 및 AlivaMab 인간화 마우스 (Ablexis, San Francisco, CA, USA: 인간 면역글로불린 좌를 가지는 AlivaMab 유전자이식 마우스 플랫폼)로부터 유래된 하이브리도마 또는 단일 B 세포를 시험관 내에서 배양하였다. 상등액을 AlphaLISA (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에 의해 재조합 인간 DLL3에 대한 반응성에 대해, 유세포 분석법에 의해 인간 DLL3을 발현하는 SHP-77 세포 (ATCC®, CRL-2195TM)에 대한 반응성에 대해 스크리닝하였다.
이어 면역글로불린 (Ig) VH 및 VL 유전자를 식별된 양성 클론에서 증폭시켰다. 하이브리도마에서 RNA를 단리하기 위해, 모노클로날로부터 약 2×106 개의 세포를 펠렛화하여 원료 물질로 사용하였다. 단일 B 세포의 경우, 단일 단리된 B 세포에서 확장된 100 내지 500 개의 세포를 원료 물질로 사용하였다. RNeasy Plus (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 이어 Smarter cDNA 합성 키트 (Clontech, Mountain View, CA)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성을 촉진하기 위해, oligodT를 사용하여 모든 메신저 RNA의 역전사를 프라임하고 Smarter IIA 올리고뉴클레오티드로 "5' 캡핑"을 수행하였다. Smarter IIA 캡을 표적으로 하는 5' 프라이머 및 CH1에서 공통 영역을 표적으로 하는 3' 프라이머를 사용한 2 단계 PCR 증폭을 사용하여 VH 및 VL 단편의 후속 증폭을 수행하였다. 요약하면, 각 50 ㎕ PCR 반응은 20 μM의 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 25 ㎕의 PrimeStar Max DNA 중합효소 프리믹스 (Clontech), 2 ㎕의 비정제 cDNA 및 21 ㎕의 이중 증류 H20로 이루어졌다. 사이클링 프로그램을 94 ℃에서 3 분으로 시작하여 35 사이클 (94 ℃에서 30 초, 50 ℃에서 1 분, 68 ℃에서 1 분)을 진행한 후, 72 ℃에서 7 분으로 종료하였다. 각각의 pTT5 모 벡터 (VH 및 VL)에서 각각의 영역에 "겹치는" 15bp 상보성 확장을 포함하는 VL 및 VH 제 2 라운드 프라이머로 제 2 라운드 PCR을 수행하였다. 제 2 라운드 PCR은 다음 프로그램으로 수행되었다: 94 ℃에서 3 분; 35 사이클 (94 ℃에서 30 초, 50 ℃에서 1 분, 68 ℃에서 1 분), 72 ℃에서 7 분으로 종료.
In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech, U.S.A.)를 사용하여 VL 유전자를 pTT5 huIgK 벡터로, VH 유전자를 pTT5 huIgGlKO 벡터로 지향 클로닝하였다. In-Fusion® HD 클로닝을 용이하게 하기 위해 In-Fusion HD 클로닝 전에 PCR 산물을 정제하고 클로닝 인핸서 (Cloning Enhancer)로 처리하였다. 클로닝 및 변환을 제조업체의 프로토콜 (Clontech, U.S.A.)에 따라 수행하였다. Mini-prep DNA를 Sanger 시퀀싱에 적용하여 완전한 V-유전자 단편이 얻어졌는지 확인하였다.
이 방법론을 사용하여 DLL3에 대한 특이성을 갖는 결합 도메인을 코딩하는 Ig VH 및 VL 유전자 쌍을 준비하였다. 상응하는 중쇄 및 경쇄 코딩 플라스미드로 CHO-E37 세포를 일시 형질감염시켜 재조합 항체를 생성하였다.
재조합 항체의 확인 스크리닝
발현된 재조합 항체를 함유하는 상등액을 유세포 분석법으로 인간 DLL3을 발현하는 세포주에 대한 결합에 대해 분석하였다. 요약하면, 세포를 재조합 상등액과 함께 인큐베이션하고, 세척한 다음, 상등액으로부터 결합된 mAh를 항-인간-IgG-APC (Jackson ImmunoResearch 109-136-098)로 검출하였다. 샘플의 중간 형광 강도 (MFI)를 이소형 대조군의 것으로 나누어 신호 대 배경 비율 (S/B)을 계산하였다.
Biacore 400의 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 재조합 상등액에서 수행하였다. 요약하면, HTP 상등액 중에 최적화되지 않은 IgG를 단백질 A/G를 통해 센서 표면에 10 ㎕/분으로 60 초 동안 포획하였다. 포획된 IgG에 대한 100 nM 인간 DLL3의 결합을 30 ㎕/분으로 180 초 동안 회합에 대해 모니터링한 다음, HBS-EP 완충액에서 120 초 동안 해리시켰다. 각 결합 사이클 사이에 단백질 A/G 표면의 재생을 글리신 pH 2.1로 수행하였다. 이 분석에는 다음 물질이 사용되었다: 단백질 시약: 재조합적으로 발현된 인간 DLL3. 시스템 실행 완충액: HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% v/v 폴리소르베이트 P20). 포획 시약: 모든 인간 IgG 이소형에 대해 특이성을 갖는 단백질 A/G.
관심 클론 (Kd <300 pM의 것)을 선택하고 아래에 설명된 다양한 검출 분석법으로 추가 평가하였다.
실시예 22: 재조합 인간 DLL3 단백질에 대한 항-DLL3 항체의 결합
항체의 결합을 ELISA에서 수행하였다. 요약하면, 항-DLL3 항체를 밤새 4 ℃에서 2 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. 세척 후, 플레이트를 차단 완충액 (Gibco, Gibco#043-90309A)으로 실온에서 1 시간 동안 차단한 다음, 세척하고 증가된 농도에서 재조합 DLL3 단백질과 인큐베이션하였다. 검출을 위해 결합된 DLL3 단백질을 폴리클로날 항-DLL3 항체 (R & D Systems, AB4315)에 이어 SULFO-TAG 표지된 항-염소 항체 (R32AG-1)와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 Sector imager 6000 (MSD)에서 판독 완충액 (MSD)를 사용하여 정량화하였다. 도 22는 재조합 단백질에 대한 3 개의 예시적인 항-DLL3 항체에 대한 결합을 보여준다. 막 근위 펩티드 도메인 (DLL3#3)을 표적으로 하는 항-DLL3 항체는 EGF4 (DLL3#4) 또는 EGF1 도메인 (DLL3#5)을 표적으로 하는 항-DLL3 항체에 비해 재조합 DLL3 단백질에 더 강한 결합을 나타내었다.
실시예 23: SCLC 세포주에 대한 항-DLL3 항체의 결합
세포 (T 세포 또는 인간 SCLC 세포)를 FACS 완충액 (PBS/0.5% BSA/0.05% 소듐 아지드)에서 농도를 증가시키면서 농도 증가의 항-DLL3 항체로 염색하였다. 결합된 분자를 FACS 분석에 의해 PE-접합된 항-인간 2 차 항체 (Jackson Immuno Research, 115-116-072)를 사용해 검출하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, DSL (DLL3#6), EGF1 (DLL3#5) 또는 EGF4 (DLL3#4) 도메인을 표적으로 하는 항-DLL3 항체는 C-말단 펩티드 (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3)를 표적으로 하는 항-DLL3 항체와 비교하여 DLL3을 발현하는 SCLC 세포주에 더 강한 결합을 나타낸다.
실시예 24: (IHC)
항-DLL3 항체를 제조업체의 지침에 따라 Ventana Discovery ultra (Ventana Medical Systems, Inc, Arizona)를 사용하여 20 ㎍/ml 농도의 DLL3 mRNA 양성 SCLC 샘플에서 시험하였다. 요약하면, IHC를 항-DLL3 항체로 염색된 포르말린 고정된 파라핀 포매 조직 및 절편 (4 ㎛)에서 수행하였다. RUO Discovery Universal 프로토콜을 사용하여 Ventana Discovery Ultra 플랫폼에서 IHC 분석을 수행하였다. 에피토프 복구 (Epitope Retrieval)로 Proteinase K를 12 분 동안 사용하여 항-DLL3 항체 염색을 최적화하였다. 항-DLL3 항체를 60 분 동안 인큐베이션한 다음, 항-마우스 HQ 검출 시스템 및 항 HQ HRP 둘 다와 12 분 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군 (IgG 항체)을 각 조직 절편에 대해 수행하고 시험 슬라이드와 동일하게 처리하였다.
인간 SCLC 세포주 SHP77을 양성 대조군으로 사용하였다. 전체 조직 절편의 디지털 이미지를 Leica SCN400 조직학 스캐너 (Leica Microsystems, Milton Keynes, UK)를 사용하여 획득하였다.
예시적인 항-DLL3 항체를 갖는 인간 SCLC 샘플의 면역 조직 화학 분석이 도 24에 도시되었다.
실시예 25: SCLC 세포주에 대한 발현 수준의 결정
항-DLL3 항체의 세포 표면 발현을 QIFIKIT (K0078; Dako)를 사용하여 정량화하였다. 요약하면, SCLC 세포주 (SHP77, NCI-H82 및 NCI-H2286)를 항-DLL3 항체 (DL309, WO 2011/093097) 또는 비관련 항체 (이소형 대조군)로 별도의 바이알에서 5 ㎍/ml로 표지하였다. 이어서 키트에 제공된 세포 및 비드를 플루오레세인-접합 항-마우스 2 차 항체와 병행하여 표지하였다. 샘플을 BD CantoII Fluorocytometer에서 측정하였는데, 그 결과 형광은 세포와 비드에 결합된 항-DLL3 항체의 수와 상관 관계가 있었다. 표 12는 3 개의 SCLC 세포주의 세포 표면에 발현된 DLL3 분자를 나타낸다.
| SCLC 세포주 | 세포 표면 DLL3 분자/세포 |
| SHP77 (ATCC®, CRL-2195 TM | 2061 |
| NCI-H82 (HTB-175TM) | 824 |
| NCI-H2286 | 129 |
실시예 26: SCLC 세포주 블록에 대한 IHC 프로토콜의 민감도 결정
IHC 프로토콜의 민감도를 평가하기 위해 SCLC 세포주 (SHP77, NCI-H82 및 NCI-H2286)를 병원에서 조직과 같이 처리하고 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매하였다.
SCLC 세포주를 ATCC 지침에 따라 배양하였다. 세포를 플레이트에서 긁어내고 포르말린에 고정한 다음, 가용화 Histogel (Thermo Fisher Scientific, HG-4000-012)에 첨가하고 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한 뒤, 일반 병리학 실험실에서 수행되는 표준 파라핀 포매 절차를 수행하였다. 요약하면, 세포 블록를 파라핀 (roti-Plast, #6642.5)에 포매하기 전에 에탄올과 이소프로판올에서 인큐베이션하였다. 세포 펠렛 블록의 절편화를 수행하고 절편을 실시예 24에 설명된 바와 갗이 프로토콜로 염색하였다. 도 25에 도시된 결과는 항-DLL3 항체 DLL3#5에 의한 IHC 프로토콜이 매우 낮은 DLL3 발현을 갖는 세포를 검출할 수 있음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING
<110> Boehringer Ingelheim International GmbH
<120> Multi-specific binding proteins for cancer treatment
<130> 12-0431-WO-1
<160> 265
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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Gly
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<220>
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Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3#4 LCCDR1
<400> 19
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1 5 10 15
<210> 20
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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
325 330 335
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
530 535 540
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
565 570 575
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
580 585 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
610 615 620
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
625 630 635 640
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
660 665 670
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly
705
<210> 80
<211> 707
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3#2 chain
<400> 80
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1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
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195 200 205
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
325 330 335
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
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Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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690 695 700
Ser Pro Gly
705
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<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
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<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly
225
<210> 83
<211> 226
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<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 84
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fcdomain (IgG4Pro)
<400> 84
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 85
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fcknobdomain(IgG4Pro)
<400> 85
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 86
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fcholedomain(IgG4Pro,RF)
<400> 86
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constantregionofakappalightchain
<400> 87
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 88
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> constantregionofalambdalightchain
<400> 88
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
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<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 89
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser
1 5 10 15
Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
20 25 30
Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 90
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 90
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 91
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 91
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 92
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 92
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 93
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 93
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 94
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 94
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 95
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 95
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3#3 LCCDR1
<400> 96
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1 5 10
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<220>
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<400> 97
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<211> 9
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<220>
<223> CD3#3 LCCDR3
<400> 98
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<220>
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<400> 99
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1 5 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3#3 HCCDR2
<400> 100
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1 5 10 15
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<210> 101
<211> 14
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3#3 HCCDR3
<400> 101
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1 5 10
<210> 102
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3#3 VL
<400> 102
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 103
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> CD3#3 HL
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Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Ala Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
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Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
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275 280 285
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Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro
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Gly Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
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275 280 285
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG-tagged human DLL3 full length
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165 170 175
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195 200 205
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Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys
245 250 255
Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser
260 265 270
Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly
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Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser
530 535 540
Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly
545 550 555 560
Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp
565 570 575
Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala
580 585 590
Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala
595 600 605
Gly Gln Arg Gln His Leu Leu Phe Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser
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Ala Leu Ile Phe Ile Pro Gln Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
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Asp Lys Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly
35 40 45
Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Gly Pro Cys
50 55 60
Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala
65 70 75 80
Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro
85 90 95
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100 105 110
Asn Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe
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Ser Leu Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly
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Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Thr Arg Arg Arg Arg Leu
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Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp
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Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Leu Pro Ala Val Gly
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260 265 270
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Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val
325 330 335
Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly
340 345 350
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Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu
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Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg
420 425 430
Asn Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His
435 440 445
Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala
450 455 460
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580 585 590
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100 105 110
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Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg
165 170 175
Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr
180 185 190
Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly
195 200 205
His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp
210 215 220
Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu
225 230 235 240
Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly
245 250 255
Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu
260 265 270
His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp
275 280 285
Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys
290 295 300
Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly
325 330 335
Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr
340 345 350
Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly
355 360 365
Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe
370 375 380
Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg
385 390 395 400
Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr
405 410 415
Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly
420 425 430
Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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545 550 555 560
Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys
565 570 575
Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg
580 585 590
Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys
595 600 605
Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn
610 615 620
Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe
625 630 635 640
Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys
645 650 655
Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys
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Asp Lys Ser Gly Val Phe Gln Leu Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu
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Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg
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Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys
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Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg
245 250 255
Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys
260 265 270
Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe
275 280 285
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340 345 350
Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu
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485 490 495
Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe
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Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val
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Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met
565 570 575
Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln
580 585 590
Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu
595 600 605
Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Ala Gly Val Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala
1 5 10 15
Gly Ile Val Val Leu Val Ile
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EpCAM intracellular domain
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1 5 10 15
Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala
20 25
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
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Cys Thr
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Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys
1 5 10 15
Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu
20 25 30
Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro
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Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp
50 55 60
Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser
65 70 75 80
Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu
85 90 95
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<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF2
<400> 122
Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys
1 5 10 15
Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr
20 25 30
Gly Leu Arg Cys Glu
35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu DLL3 EGF 2+3
<400> 123
Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys
1 5 10 15
Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr
20 25 30
Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys
35 40 45
Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr
50 55 60
Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF3
<400> 124
Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro
20 25 30
Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu
35 40
<210> 125
<211> 78
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu DLL3 EGF 3+4
<400> 125
Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro
20 25 30
Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu
35 40 45
Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu
50 55 60
Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu
65 70 75
<210> 126
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF4
<400> 126
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
1 5 10 15
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
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Gly Pro Arg Cys Glu
35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 127
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Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
20 25 30
Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
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Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
50 55 60
Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg
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35
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<213> Artificial Sequence
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<400> 129
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20 25 30
Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His
35 40 45
Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala
50 55 60
Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu
65 70
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<211> 37
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<213> Artificial Sequence
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<400> 130
Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys
1 5 10 15
Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met
20 25 30
Gly Ala Arg Cys Glu
35
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<211> 64
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu DLL3 EGF6-membrane proximal peptide
<400> 131
Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys
1 5 10 15
Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met
20 25 30
Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu
35 40 45
Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu
50 55 60
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<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Membrane proximal peptide
<400> 132
Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu
20 25
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3#7 LCCDR1
<400> 133
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Asn Phe Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3#7 LCCDR2
<400> 134
Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3#7 LCCDR3
<400> 135
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Phe
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<220>
<223> DLL3#7 HCCDR2
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Val Ile Trp Leu Asp Gly Asp Asp Glu Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLL3#7 HCCDR3
<400> 138
Val Leu Asp Tyr
1
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<213> Artificial Sequence
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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Thr Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Val
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<223> DLL3#8 LCCDR2
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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
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<223> DLL3#8 LCCDR3
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Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val His
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 263
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD1-4 LC
<400> 263
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 264
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD1-5 HC
<400> 264
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 265
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD1-5 LC
<400> 265
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
Claims (47)
- DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 단위 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 단위를 포함하는 단백질로서, DLL3에 특이적으로 결합하는 상기 제 1 항원 결합 단위는 하기 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질:
i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
iii) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
iv) 서열 번호 19 (CDR1), 서열 번호 20 (CDR2) 및 서열 번호 21 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 22 (CDR1), 서열 번호 23 (CDR2) 및 서열 번호 24 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
v) 서열 번호 25 (CDR1), 서열 번호 26 (CDR2) 및 서열 번호 27 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 28 (CDR1), 서열 번호 29 (CDR2) 및 서열 번호 30 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
vi) 서열 번호 31 (CDR1), 서열 번호 32 (CDR2) 및 서열 번호 33 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 34 (CDR1), 서열 번호 35 (CDR2) 및 서열 번호 36 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
vii) 서열 번호 133 (CDR1), 서열 번호 134 (CDR2) 및 서열 번호 135 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 136 (CDR1), 서열 번호 137 (CDR2) 및 서열 번호 138 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
viii) 서열 번호 139 (CDR1), 서열 번호 140 (CDR2) 및 서열 번호 141 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 142 (CDR1), 서열 번호 143 (CDR2) 및 서열 번호 144 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
ix) 서열 번호 145 (CDR1), 서열 번호 146 (CDR2) 및 서열 번호 147 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 148 (CDR1), 서열 번호 149 (CDR2) 및 서열 번호 150 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
x) 서열 번호 151 (CDR1), 서열 번호 152 (CDR2) 및 서열 번호 153 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 154 (CDR1), 서열 번호 155 (CDR2) 및 서열 번호 156 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xi) 서열 번호 157 (CDR1), 서열 번호 158 (CDR2) 및 서열 번호 159 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 160 (CDR1), 서열 번호 161 (CDR2) 및 서열 번호 162 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xii) 서열 번호 163 (CDR1), 서열 번호 164 (CDR2) 및 서열 번호 165 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 166 (CDR1), 서열 번호 167 (CDR2) 및 서열 번호 168 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xiii) 서열 번호 169 (CDR1), 서열 번호 170 (CDR2) 및 서열 번호 171 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 172 (CDR1), 서열 번호 173 (CDR2) 및 서열 번호 174 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xiv) 서열 번호 175 (CDR1), 서열 번호 176 (CDR2) 및 서열 번호 177 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 178 (CDR1), 서열 번호 179 (CDR2) 및 서열 번호 180 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xv) 서열 번호 181 (CDR1), 서열 번호 182 (CDR2) 및 서열 번호 183 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 184 (CDR1), 서열 번호 185 (CDR2) 및 서열 번호 186 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xvi) 서열 번호 187 (CDR1), 서열 번호 188 (CDR2) 및 서열 번호 189 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 190 (CDR1), 서열 번호 191 (CDR2) 및 서열 번호 192 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
xvii) 서열 번호 193 (CDR1), 서열 번호 194 (CDR2) 및 서열 번호 195 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 196 (CDR1), 서열 번호 197 (CDR2) 및 서열 번호 198 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위; 및
xviii) 서열 번호 199 (CDR1), 서열 번호 200 (CDR2) 및 서열 번호 201 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 202 (CDR1), 서열 번호 203 (CDR2) 및 서열 번호 204 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위. - 제1항에 있어서, DLL3에 특이적으로 결합하는 상기 제 1 항원 결합 단위는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하고 하기 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질:
i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
iii) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
iv) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
v) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
vi) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
vii) 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
viii) 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
ix) 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
x) 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xi) 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xii) 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xiii) 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xiv) 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xv) 서열 번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xvi) 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
xvii) 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위; 및
xviii) 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위. - 제1항 또는 제2항에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 항원 결합 단위는 하기 i) 내지 iii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질:
i) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 6l (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위; 및
iii) 서열 번호 96 (CDR1), 서열 번호 97 (CDR2) 및 서열 번호 98 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 99 (CDR1), 서열 번호 100 (CDR2) 및 서열 번호 101 (CDR3)의 서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 단위. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 항원 결합 단위는 하기 i) 내지 iii)로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 경쇄 가변 도메인 및 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 단백질:
i) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위;
ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위; 및
iii) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단위. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
i) DLL3에 특이적으로 결합하는 상기 제 1 항원 결합 단위는 그의 N-에서 C-말단으로 제 1 경쇄 가변 도메인, 제 1 경쇄 불변 도메인, 제 1 펩티드 링커, 제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 중쇄 불변 CH1 도메인을 포함하고;
ii) CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 항원 결합 단위는 N-에서 C-말단으로 제 2 경쇄 가변 도메인, 제 2 경쇄 불변 도메인, 제 2 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 중쇄 불변 CH1 도메인을 포함하는,
단백질. - 제5항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 펩티드 링커는 26 내지 42 개의 아미노산, 바람직하게는 30 내지 40 개의 아미노산, 34 내지 40 개의 아미노산, 또는 36 내지 39 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 38 개의 아미노산 중 어느 하나를 포함하는 단백질.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제 1 링커 및/또는 제 2 링커는 바람직하게는 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 Gly-Ser 링커이고, 보다 바람직하게는 상기 제 1 및 제 2 펩티드 링커는 동일한 서열을 포함하는, 단백질.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 항원 결합 단위에 공유적으로 연결된 제 1 Fc 도메인, 및 상기 제 2 항원 결합 단위에 공유적으로 연결된 제 2 Fc 도메인을 추가로 포함하는 단백질.
- 제8항에 있어서,
i) 상기 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하고, 상기 제 2 Fc 도메인은 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하거나, 또는
ii) 상기 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고, 상기 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함하거나,
iii) 상기 제 2 Fc 도메인은 위치 366에 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하고, 상기 제 1 Fc 도메인은 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하거나,
iv) 상기 제 2 Fc 도메인은 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고, 상기 제 1 Fc 도메인은 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함하고,
바람직하게는 상기 제 1 또는 상기 제 2 Fc 도메인은 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에 페닐알라닌 [Y436F]을 추가로 포함하는,
단백질. - 제9항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 상기 제 2 Fc 도메인은 위치 234 [L234A] 및 위치 235 [L235A]에 알라닌을 추가로 포함하는, 단백질.
- 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 경쇄 불변 도메인 및 제 2 경쇄 불변 도메인은 인간 카파 또는 람다 도메인을 포함하는, 단백질.
- 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 241, 서열 번호 242, 서열 번호 243, 서열 번호 244, 서열 번호 245, 서열 번호 246, 서열 번호 247, 서열 번호 248, 서열 번호 249, 서열 번호 250, 서열 번호 251, 및 서열 번호 252로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 서열 번호 79, 서열 번호 80 또는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단백질.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단백질의 제 1 항원 결합 단위 및/또는 제 2 항원 결합 단위를 코딩하고, 임의로 제 1 및/또는 제 2 Fc 도메인을 추가로 코딩하는 단리된 핵산 분자.
- 제12항의 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
- 제13항 또는 제14항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제15항의 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
- i) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 제16항의 숙주 세포를 배양하는 단계;
ii) 단백질을 회수하는 단계; 및
임의로,
iii) 단백질을 추가로 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계를 포함하는,
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질을 제조하는 방법. - DLL3에 특이적으로 결합하는 제 1 폴리펩티드 쇄 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제 2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 상기 제 1 폴리펩티드 쇄는 제 1 경쇄, 제 1 링커 및 제 1 중쇄를 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드 쇄는 제 2 경쇄, 제 2 링커 및 제 2 중쇄를 포함하며, 바람직하게는 상기 제 1 경쇄의 C-말단은 상기 제 1 펩티드 링커를 통해 상기 제 1 중쇄의 N-말단에 공유적으로 연결되고, 상기 제 2 경쇄의 C-말단은 상기 제 2 펩티드 링커를 통해 상기 제 2 중쇄의 N-말단에 공유적으로 연결된, 단백질.
- 제18항에 있어서, DLL3에 특이적으로 결합하는 상기 제 1 폴리펩티드 쇄는 하기 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 단백질:
i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
ii) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
iii) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
iv) 서열 번호 19 (CDR1), 서열 번호 20 (CDR2) 및 서열 번호 21 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 22 (CDR1), 서열 번호 23 (CDR2) 및 서열 번호 24 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
v) 서열 번호 25 (CDR1), 서열 번호 26 (CDR2) 및 서열 번호 27 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 28 (CDR1), 서열 번호 29 (CDR2) 및 서열 번호 30 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
vi) 서열 번호 31 (CDR1), 서열 번호 32 (CDR2) 및 서열 번호 33 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 34 (CDR1), 서열 번호 35 (CDR2) 및 서열 번호 36 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
vii) 서열 번호 133 (CDR1), 서열 번호 134 (CDR2) 및 서열 번호 135 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 136 (CDR1), 서열 번호 137 (CDR2) 및 서열 번호 138 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
viii) 서열 번호 139 (CDR1), 서열 번호 140 (CDR2) 및 서열 번호 141 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 142 (CDR1), 서열 번호 143 (CDR2) 및 서열 번호 144 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
ix) 서열 번호 145 (CDR1), 서열 번호 146 (CDR2) 및 서열 번호 147 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 148 (CDR1), 서열 번호 149 (CDR2) 및 서열 번호 150 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
x) 서열 번호 151 (CDR1), 서열 번호 152 (CDR2) 및 서열 번호 153 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 154 (CDR1), 서열 번호 155 (CDR2) 및 서열 번호 156 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xi) 서열 번호 157 (CDR1), 서열 번호 158 (CDR2) 및 서열 번호 159 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 160 (CDR1), 서열 번호 161 (CDR2) 및 서열 번호 162 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xii) 서열 번호 163 (CDR1), 서열 번호 164 (CDR2) 및 서열 번호 165 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 166 (CDR1), 서열 번호 167 (CDR2) 및 서열 번호 168 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xiii) 서열 번호 169 (CDR1), 서열 번호 170 (CDR2) 및 서열 번호 171 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 172 (CDR1), 서열 번호 173 (CDR2) 및 서열 번호 174 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
서열 번호 175 (CDR1), 서열 번호 176 (CDR2) 및 서열 번호 177 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 178 (CDR1), 서열 번호 179 (CDR2) 및 서열 번호 180 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xiv) 서열 번호 181 (CDR1), 서열 번호 182 (CDR2) 및 서열 번호 183 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 184 (CDR1), 서열 번호 185 (CDR2) 및 서열 번호 186 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xv) 서열 번호 187 (CDR1), 서열 번호 188 (CDR2) 및 서열 번호 189 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 190 (CDR1), 서열 번호 191 (CDR2) 및 서열 번호 192 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
xvi) 서열 번호 193 (CDR1), 서열 번호 194 (CDR2) 및 서열 번호 195 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 196 (CDR1), 서열 번호 197 (CDR2) 및 서열 번호 198 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 및
xvii) 서열 번호 199 (CDR1), 서열 번호 200 (CDR2) 및 서열 번호 201 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 202 (CDR1), 서열 번호 203 (CDR2) 및 서열 번호 204 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR. - 제18항 또는 제19항에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 폴리펩티드 쇄는 하기 i) 내지 iii)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 단백질:
i) 서열 번호 55 (CDR1), 서열 번호 56 (CDR2) 및 서열 번호 57 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 58 (CDR1), 서열 번호 59 (CDR2) 및 서열 번호 60 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
ii) 서열 번호 61 (CDR1), 서열 번호 62 (CDR2) 및 서열 번호 63 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 64 (CDR1), 서열 번호 65 (CDR2) 및 서열 번호 66 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 및
iii) 서열 번호 96 (CDR1), 서열 번호 97 (CDR2) 및 서열 번호 98 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 99 (CDR1), 서열 번호 100 (CDR2) 및 서열 번호 101 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR. - 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, DLL3에 특이적으로 결합하는 상기 제 1 폴리펩티드 쇄는 하기 i) 내지 xviii)로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 단백질:
i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
ii) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
iii) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
iv) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
v) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
vi) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
vii) 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
viii) 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
ix) 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
x) 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
xi) 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
xii) 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
xiii) 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
xiv) 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
xv) 서열 번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
xvi) 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
xvii) 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
xviii) 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인. - 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제 2 폴리펩티드 쇄는 하기 i) 내지 iii)으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 단백질:
i) 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
ii) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
iii) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인. - 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 펩티드 링커는 26 내지 42 개의 아미노산, 바람직하게는 30 내지 40 개의 아미노산, 34 내지 40 개의 아미노산, 또는 36 내지 39 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 38 개의 아미노산 중 어느 하나를 포함하는, 단백질.
- 제23항에 있어서, 상기 제 1 링커 및/또는 제 2 링커는 바람직하게는 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 Gly-Ser 링커이고, 보다 바람직하게는 상기 제 1 및 제 2 펩티드 링커는 동일한 서열을 포함하는, 단백질.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
i) 상기 제 1 중쇄는 위치 366에 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하고, 상기 제 2 중쇄는 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하거나, 또는
ii) 상기 제 1 중쇄는 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고, 상기 제 2 중쇄는 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 위치 407에 발린 (V) [Y407V]을 포함하거나, 또는
iii) 상기 제 2 중쇄는 위치 366에 티로신 (Y) [T366Y]을 포함하고, 상기 제 1 중쇄는 위치 407에 트레오닌 (T) [Y407T]을 포함하거나, 또는
iv) 상기 제 2 중쇄는 위치 366에 트립토판 (W) [T366W]을 포함하고, 상기 제 1 중쇄는 위치 366에 세린 (S) [T366S], 위치 368에 알라닌 (A) [L368A] 및 407 위치의 발린 (V) [Y407V]을 포함하고,
바람직하게는 상기 제 1 또는 상기 제 2 중쇄는 위치 435에 아르기닌 [H435R] 및 위치 436에 페닐알라닌 [Y436F]을 추가로 포함하는,
단백질. - 제25항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 상기 제 2 중쇄는 234 [L234A] 및 위치 235 [L235A]에 알라닌을 추가로 포함하는, 단백질.
- 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 경쇄 및 상기 제 2 경쇄는 카파 또는 람다 도메인을 포함하는, 단백질.
- 제1항 내지 제12항 또는 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 단백질.
- 제1항 내지 제12항 또는 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 치료적 유효량의 제1항 내지 제12항 또는 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
- 암 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제12항 또는 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 단백질의 용도.
- 제1항 내지 제12항 또는 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료 방법에 사용하기 위한 단백질.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 DLL3 발현 종양이고, 바람직하게는 암은 SCLC, 교모세포종 또는 DLL3 발현 신경내분비 종양인, 방법, 용도 또는 단백질.
- 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 화학요법제, 혈관 신생을 억제하는 치료적 활성 화합물, 신호 전달 경로 억제제, EGFR 억제제, 면역 조절제, 면역 체크포인트 억제제 또는 호르몬 요법제와 조합하여 사용되는, 방법, 용도, 또는 단백질.
- 제34항에 있어서, 상기 단백질은 면역 체크포인트 억제제, 바람직하게는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체와 조합되는, 방법, 용도 또는 단백질.
- 제35항에 있어서, 항-PD-1 항체는 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법, 용도 또는 단백질.
- 다음을 포함하는 항-DLL3 항체 분자:
i) 서열 번호 1 (CDR1), 서열 번호 2 (CDR2) 및 서열 번호 3 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 4 (CDR1), 서열 번호 5 (CDR2) 및 서열 번호 6 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
ii) 서열 번호 7 (CDR1), 서열 번호 8 (CDR2) 및 서열 번호 9 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 10 (CDR1), 서열 번호 11 (CDR2) 및 서열 번호 12 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
iii) 서열 번호 13 (CDR1), 서열 번호 14 (CDR2) 및 서열 번호 15 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 16 (CDR1), 서열 번호 17 (CDR2) 및 서열 번호 18 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
iv) 서열 번호 19 (CDR1), 서열 번호 20 (CDR2) 및 서열 번호 21 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 22 (CDR1), 서열 번호 23 (CDR2) 및 서열 번호 24 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
v) 서열 번호 25 (CDR1), 서열 번호 26 (CDR2) 및 서열 번호 27 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 28 (CDR1), 서열 번호 29 (CDR2) 및 서열 번호 30 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
vi) 서열 번호 31 (CDR1), 서열 번호 32 (CDR2) 및 서열 번호 33 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 34 (CDR1), 서열 번호 35 (CDR2) 및 서열 번호 36 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
vii) 서열 번호 133 (CDR1), 서열 번호 134 (CDR2) 및 서열 번호 135 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 136 (CDR1), 서열 번호 137 (CDR2) 및 서열 번호 138 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
viii) 서열 번호 139 (CDR1), 서열 번호 140 (CDR2) 및 서열 번호 141 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 142 (CDR1), 서열 번호 143 (CDR2) 및 서열 번호 144 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
ix) 서열 번호 145 (CDR1), 서열 번호 146 (CDR2) 및 서열 번호 147 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 148 (CDR1), 서열 번호 149 (CDR2) 및 서열 번호 150 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
x) 서열 번호 151 (CDR1), 서열 번호 152 (CDR2) 및 서열 번호 153 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 154 (CDR1), 서열 번호 155 (CDR2) 및 서열 번호 156 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xi) 서열 번호 157 (CDR1), 서열 번호 158 (CDR2) 및 서열 번호 159 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 160 (CDR1), 서열 번호 161 (CDR2) 및 서열 번호 162 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xii) 서열 번호 163 (CDR1), 서열 번호 164 (CDR2) 및 서열 번호 165 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 166 (CDR1), 서열 번호 167 (CDR2) 및 서열 번호 168 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xiii) 서열 번호 169 (CDR1), 서열 번호 170 (CDR2) 및 서열 번호 171 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 172 (CDR1), 서열 번호 173 (CDR2) 및 서열 번호 174 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xiv) 서열 번호 175 (CDR1), 서열 번호 176 (CDR2) 및 서열 번호 177 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 178 (CDR1), 서열 번호 179 (CDR2) 및 서열 번호 180 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xv) 서열 번호 181 (CDR1), 서열 번호 182 (CDR2) 및 서열 번호 183 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 184 (CDR1), 서열 번호 185 (CDR2) 및 서열 번호 186 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xvi) 서열 번호 187 (CDR1), 서열 번호 188 (CDR2) 및 서열 번호 189 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 190 (CDR1), 서열 번호 191 (CDR2) 및 서열 번호 192 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xvii) 서열 번호 193 (CDR1), 서열 번호 194 (CDR2) 및 서열 번호 195 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 196 (CDR1), 서열 번호 197 (CDR2) 및 서열 번호 198 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
xviii) 서열 번호 199 (CDR1), 서열 번호 200 (CDR2) 및 서열 번호 201 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열 번호 202 (CDR1), 서열 번호 203 (CDR2) 및 서열 번호 204 (CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR. - 제37항에 있어서, 상기 항체 분자는 모노클로날, 키메라, 인간화 또는 인간 항체 분자인, 항-DLL3 항체 분자.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 항체 분자는 Fab, F(ab')2, Fab', Fv 또는 scFv인, 항-DLL3 항체 분자.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-DLL3 항체 분자.
- 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다인, 항-DLL3 항체 분자.
- (a) 샘플을 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항-DLL3 항체와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 샘플에서 항체-항원 복합체의 형성이 일어나도록 하는 단계; 및
(c) 항-DLL3 항체를 검출하는 단계를 포함하는,
생물학적 샘플에서 DLL3을 검출하는 방법. - 제42항에 있어서, 항-DLL3 항체는 검출 가능한 신호에 의해 검출되고, 바람직하게는 상기 신호는 면역 세포 화학 (ICC), 면역 조직 화학 (IHC), 웨스턴 블롯팅, 유세포 분석 및/또는 ELISA에 의해 검출되는, 방법.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 바람직하게는 고정 조직 샘플, 보다 바람직하게는 포르말린 고정 및 파라핀 포매 조직 샘플인, 방법.
- 제44항에 있어서, 항-DLL3 항체는 IHC에 의해 검출되는, 방법.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 샘플은 종양 조직 샘플, 보다 바람직하게는 SCLC, LCNEC, 신경교종, 교모세포종, 흑색종, 또는 다른 신경내분비 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양으로부터 단리된 종양 조직 샘플인, 방법.
- 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 및 사용 설명서를 포함하는 DLL3 검출용 키트.
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