BR112020022898A2 - anticorpos biespecíficos dll3-cd3 - Google Patents

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Rajkumar Ganesan
Philip Nicholas GORMAN
Priyanka Gupta
Pankaj Gupta
Justin Scheer
Vladimir H. Voynov
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Abstract

ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DLL3-CD3. A presente invenção refere-se a novas proteínas de ligação à DLL3/CD3. A invenção também se refere a ácidos nucleicos que codificam tais proteínas; a métodos para preparar tais proteínas; a células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais proteínas; a composições que compreendem tais proteínas; e aos usos de tais proteínas ou composições, em particular para fins terapêuticos no campo de doenças cancerosas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DLL3-CD3".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO TÉCNICO
[0001] A presente invenção refere-se a proteínas de ligação multiespecíficas que compreendem uma primeira unidade de ligação a antígeno específica para DLL3 e uma segunda unidade de ligação a antígeno específica para CD3. A invenção também se refere a ácidos nucleicos que codificam tais proteínas de ligação, a métodos para preparar tais proteínas de ligação; células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais proteínas de ligação, composições que compreendem tais proteínas de ligação e usos de tais proteínas de ligação ou composições, em particular para fins terapêuticos no campo de doenças cancerosas.
INFORMAÇÕES ANTECEDENTES
[0002] A DLL3 é uma proteína transmembrana de tipo I que pertence à família de ligantes Notch. A DLL3 está envolvida principalmente na somitogênese, onde ela está localizada predominantemente no aparelho de Golgi e atua como um inibidor da sinalização a Notch, em contraste com os outros membros da família DLL, DLL1 e DLL4, os quais estão localizados na superfície celular. Apenas em células cancerosas, onde a DLL3 é superexpressa, algumas moléculas de DLL3 escapam para a superfície celular (Dylla, Molecular & Cellular Oncology 2016, Vol. 3, N° 2). A DLL3 foi identificada como um alvo específico para tumor usando vários métodos, por exemplo, Análise LC/MS de tecidos tumorais (documento WO 2014/125273), sequenciamento de RNA (documento WO 2017/021349) e análise imuno-histoquímica (Saunders et al., Sci Transl Med. 26 de agosto de 2015; 7 (302): 302ra136; Saunders et al., AACR 2017; documento WO 2013/126746).
[0003] A expressão de DLL3 foi descrita em tumores neuroendócrinos, tais como carcinoma neuroendócrino de células grandes (Large Cell Neuroendocrine Carcinoma, LCNEC), câncer de pulmão de células pequenas (Small Cell Lung Cancer, SCLC), câncer de bexiga de células pequenas, câncer de próstata neuroendócrino, câncer pancreático neuroendócrino e glioblastoma (Saunders et al., Sci Transl Med. 26 de agosto de 2015; 7 (302): 302ra136; Saunders et al., AACR 2017).
[0004] O SCLC representa uma indicação de necessidade médica extremamente alta. O SCLC é responsável por 13 % dos diagnósticos de câncer de pulmão e tem um prognóstico pior do que o NSCLC. Os tratamentos convencionais para estes cânceres incluem principalmente quimioterapia, radioterapia, cirurgia ou combinações dos mesmos, não havendo terapias-alvo disponíveis ainda. Embora a taxa de resposta inicial à quimioterapia seja alta, muitos pacientes recaem rapidamente com doença resistente à quimio, para a qual não há opções de tratamento disponíveis. Embora tenha havido melhorias no tratamento destes cânceres nos últimos anos, as taxas de sobrevida global para estes tipos de tumor permanecem inalteradas, portanto, há uma necessidade médica não atendida de terapias mais direcionadas e potentes.
[0005] Uma abordagem para uma terapia-alvo é fornecida por conjugados de fármaco e anticorpo (Antibody Drug Conjugates, ADCs). No entanto, para a DLL3, esta estratégia não é preferida em virtude da baixa expressão na superfície celular da DLL3 e alta taxa de resistência à quimioterapia. Uma vez que a maioria dos pacientes recai após o tratamento quimioterapêutico e em virtude da baixa expressão de DLL3 na superfície celular, direcionar a DLL3 com ADCs pode ter limitações. Além disso, as abordagens de ADC muitas vezes têm toxicidades fora do alvo causadas pelo fármaco livre como um resultado da instabilidade ou degradação do ligante.
[0006] Houve tentativas de combinar o direcionamento de DLL3 com o direcionamento de outras proteínas. Por exemplo, o documento WO2017/021349 descreve uma construção de anticorpo biespecífico que combina a ligação à DLL3 humana na superfície de uma célula alvo e a ligação à CD3 humana na superfície de uma célula T. No entanto, não está provado se tais abordagens serão bem-sucedidas e, até o momento, nenhuma terapia-alvo para SCLC e glioblastoma, bem como outros tumores que expressam DLL3, estão disponíveis.
[0007] Em vista da perspectiva ruim para tais pacientes com câncer, há uma necessidade de identificar terapias mais eficazes, particularmente terapias eficazes com tolerabilidade aprimorada. Assim, é um objetivo da invenção fornecer agentes farmacologicamente ativos, composições e/ou métodos de tratamento que confiram determinadas vantagens comparado com os agentes, composições e/ou métodos atualmente usados e/ou conhecidos na técnica. Estas vantagens incluem eficácia in vivo, propriedades terapêuticas e farmacológicas aprimoradas, especificidade aumentada, perfil de segurança aprimorado, menos efeitos colaterais, imunogenicidade reduzida e outras propriedades vantajosas, tal como melhor facilidade de preparação ou custos reduzidos de produtos, maior estabilidade/meia- vida mais longa, necessidade de regimes de administração menos frequentes, especialmente comparado com fármacos candidatos já conhecidos na técnica.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] A presente invenção se baseia em uma abordagem de acoplamento de células T biespecíficas ao empregar proteínas de ligação multiespecíficas com um braço de ligação à CD3 em células T e um braço de ligação à DLL3 sobre a superfície celular de células tumorais. Através da ligação simultânea a células T e células tumorais,
acopladores de células T forçam a formação de uma sinapse citolítica entre as duas células e, assim, redirecionam a atividade das células T seletivamente para as células tumorais alvo.
[0009] Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação multiespecífica que compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3, a dita primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 selecionada a partir do grupo que consiste em i) a xviii): i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: l3 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); iv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: l9 (CDR1), SEQ ID NO: 20 (CDR2) e SEQ ID NO: 21
(CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (CDR1), SEQ ID NO: 23 (CDR2) e SEQ ID NO: 24 (CDR3); v) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1), SEQ ID NO: 26 (CDR2) e SEQ ID NO: 27 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (CDR1), SEQ ID NO: 29 (CDR2) e SEQ ID NO: 30 (CDR3); vi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (CDR1), SEQ ID NO: 32 (CDR2) e SEQ ID NO: 33 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (CDR1), SEQ ID NO: 35 (CDR2) e SEQ ID NO: 36 (CDR3); vii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (CDR1), SEQ ID NO: 134 (CDR2) e SEQ ID NO: 135 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 (CDR1), SEQ ID NO: 137 (CDR2) e SEQ ID NO: 138 (CDR3); viii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 (CDR1), SEQ ID NO: 140 (CDR2) e SEQ ID NO: 141 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 (CDR1), SEQ ID NO: 143 (CDR2) e SEQ ID NO: 144 (CDR3); ix) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (CDR1), SEQ ID NO: 146 (CDR2) e SEQ ID NO:
147 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 (CDR1), SEQ ID NO: 149 (CDR2) e SEQ ID NO: 150 (CDR3); x) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 (CDR1), SEQ ID NO: 152 (CDR2) e SEQ ID NO: 153 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 (CDR1), SEQ ID NO: 155 (CDR2) e SEQ ID NO: 156 (CDR3); xi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 (CDR1), SEQ ID NO: 158 (CDR2) e SEQ ID NO: 159 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 (CDR1), SEQ ID NO: 161 (CDR2) e SEQ ID NO: 162 (CDR3); xii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 (CDR1), SEQ ID NO: 164 (CDR2) e SEQ ID NO: 165 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 (CDR1), SEQ ID NO: 167 (CDR2) e SEQ ID NO: 168 (CDR3); xiii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (CDR1), SEQ ID NO: 170 (CDR2) e SEQ ID NO: 171 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 (CDR1), SEQ ID NO: 173 (CDR2) e SEQ ID NO: 174 (CDR3); xiv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 (CDR1), SEQ ID NO: 176 (CDR2) e SEQ ID NO:
177 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 (CDR1), SEQ ID NO: 179 (CDR2) e SEQ ID NO: 180 (CDR3); xv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 (CDR1), SEQ ID NO: 182 (CDR2) e SEQ ID NO: 183 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 (CDR1), SEQ ID NO: 185 (CDR2) e SEQ ID NO: 186 (CDR3); xvi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 (CDR1), SEQ ID NO: 188 (CDR2) e SEQ ID NO: 189 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 190 (CDR1), SEQ ID NO: 191 (CDR2) e SEQ ID NO: 192 (CDR3); xvii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 (CDR1), SEQ ID NO: 194 (CDR2) e SEQ ID NO: 195 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 (CDR1), SEQ ID NO: 197 (CDR2) e SEQ ID NO: 198 (CDR3); e xviii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 (CDR1), SEQ ID NO: 200 (CDR2) e SEQ ID NO: 201 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 (CDR1), SEQ ID NO: 203 (CDR2) e SEQ ID NO: 204 (CDR3)
[0010] Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, a primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve e um primeiro domínio variável de cadeia pesada e é selecionada a partir do grupo que consiste em i) a xviii): i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; iv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; v) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; vi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; vii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
206; viii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; ix) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; x) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; xi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; xii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; xiii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
218; xiv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 219 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; xv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; xvi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; xvii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; e xviii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 228
[0011] Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, a segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 é selecionada a partir do grupo que consiste em i) a iii):
i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3); ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3); e iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 (CDR1), SEQ ID NO: 97 (CDR2) e SEQ ID NO: 98 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 (CDR1), SEQ ID NO: 100 (CDR2) e SEQ ID NO: 101 (CDR3).
[0012] Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, a segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 compreende um segundo domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio variável de cadeia pesada e é selecionada a partir do grupo que consiste em: i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; e iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
103.
[0013] Em algumas modalidades da invenção, a primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 compreende, a partir de seu N- para C-término: um primeiro domínio variável de cadeia leve, um primeiro domínio constante de cadeia leve, um primeiro ligante peptídico, um primeiro domínio variável de cadeia pesada e um primeiro domínio CH1 constante de cadeia pesada; e a segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 compreende, a partir de seu N- para C-término: um segundo domínio variável de cadeia leve, um segundo domínio constante de cadeia leve, um segundo ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio constante CH1 de cadeia pesada. Em algumas modalidades da invenção, os primeiro e/ou segundo ligantes peptídicos compreendem 26 a 42 aminoácidos, de preferência qualquer um de 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos ou 36 a 39 aminoácidos, mais preferivelmente 38 aminoácidos. Em algumas modalidades da invenção, os primeiro e/ou segundo ligantes são um ligante de Gly-Ser, de preferência que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, mais preferivelmente os ditos primeiro e segundo ligantes peptídicos compreendem a mesma sequência.
[0014] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende ainda um primeiro e um segundo domínio Fc, o dito primeiro domínio Fc ligado covalentemente à dita primeira unidade de ligação a antígeno e o dito segundo domínio Fc ligado covalentemente à dita segunda unidade de ligação a antígeno.
[0015] Em algumas modalidades da invenção, i) o primeiro domínio Fc compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] e o segundo domínio Fc compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], ou ii) o primeiro domínio Fc compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e o segundo domínio Fc compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], ou iii) o segundo domínio Fc compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] e o primeiro domínio Fc compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], ou iv) o segundo domínio Fc compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e o primeiro domínio Fc compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], de preferência, o primeiro ou o segundo domínio Fc compreende ainda uma arginina na posição 435 [H435 R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F]. Em algumas modalidades, os primeiro e/ou segundo domínios Fc compreendem ainda uma alanina na posição 234 [L234A] e na posição 235 [L235A]. Em algumas modalidades, o primeiro domínio constante de cadeia leve e o segundo domínio constante de cadeia leve compreendem um domínio humano capa ou lambda.
[0016] Em modalidades preferidas, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO; 242, SEQ ID NO: 243,
SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 e SEQ ID NO: 252 e uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 105.
[0017] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ácidos nucleicos isolada i) que codifica uma primeira unidade de ligação a antígeno e/ou uma segunda unidade de ligação a antígeno de uma proteína da invenção, opcionalmente que codifica ainda um primeiro e/ou um segundo domínio Fc ou ii) codifica uma primeira e/ou segunda cadeia polipeptídica de uma proteína da invenção. Em outros aspectos fornecidos aqui, há vetores de expressão que compreendem a molécula de ácidos nucleicos da invenção, células hospedeiras transfectadas com tais vetores de expressão e métodos de produção de uma proteína da invenção.
[0018] Em um outro aspecto da invenção, é fornecida aqui uma proteína de ligação multiespecífica que compreende uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 e uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3, onde a primeira cadeia polipeptídica compreende uma primeira cadeia leve, um primeiro ligante e uma primeira cadeia pesada e a segunda cadeia polipeptídica compreendem uma segunda cadeia leve, um segundo ligante e uma segunda cadeia pesada, de preferência o C-término da dita primeira cadeia leve é covalentemente ligado ao N-término da dita primeira cadeia pesada através do dito primeiro ligante peptídico e o C-término da dita segunda cadeia leve é covalentemente ligado ao N-término da dita segunda cadeia pesada através do dito segundo ligante peptídico.
[0019] Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, a primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 compreende um domínio um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada que compreendem sequências de CDR e/ou sequências de VH/VL conforme definido para as unidades de ligação a antígeno de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18 descritas aqui. Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada que compreendem sequências de CDR e/ou sequências de VH/VL conforme definido para as unidades de ligação a antígeno de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3 descritas aqui.
[0020] Outros aspectos, modalidades, usos e métodos envolvendo as proteínas de ligação da invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir da invenção e das reivindicações em anexo.
[0021] A invenção fornece novas proteínas de ligação que permitem um tratamento mais eficiente de cânceres que expressam DLL3, tais como SCLC, glioblastoma ou um tumor neuroendócrino que expressa DLL3.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] Figura 1: Representação esquemática de uma proteína de ligação biespecífica da invenção.
[0023] Figura 2: Representação esquemática da proteína DLL3 de comprimento total e construções de domínio de DLL3 expressas em células HEK293 para mapeamento de domínio de epítopo. Para as construções de domínio de DLL3, os domínios transmembrana e intracelular são derivados de EpCAM.
[0024] Figura 3A: Mapeamento de domínios de epítopo de DLL3 de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas. Proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas que reconhecem o peptídeo proximal da membrana, domínios EGF4, EGF1 e DSL de DLL3. O eixo y representa as contagens, o eixo x representa PE-A (área de sinal de ficoeritrina).
[0025] Figura 3B: Mapeamento de domínios de epítopo de DLL3 de seis proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas. Proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas que reconhecem EGF1, EGF3, EGF4 ou EGF6 de DLL3. O eixo y representa as contagens, o eixo x representa PE-A (sinal de ficoeritrina).
[0026] Figura 3C: Mapeamento de domínios de epítopo de DLL3 de seis proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas. Proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas que reconhecem os domínios DSL ou nenhum de DSL, EGF, nem o peptídeo proximal da membrana de DLL3. O eixo y representa as contagens, o eixo x representa PE-A (sinal de ficoeritrina).
[0027] Figura 4: Ligação de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas a linhagens de células que expressam DLL3 humana e de cyno. O eixo y representa as contagens, o eixo x representa PE-A (área de sinal de ficoeritrina).
[0028] Figura 5: Ligação de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas a linhagens de células que expressam DLL1 e DLL4 humanas, sem ligação detectada à DLL1 e DLL4 humanas. O eixo y representa as contagens, o eixo x representa PE-A (área de sinal de ficoeritrina).
[0029] Figura 6A: Ligação de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas a linhagens de células de SCLC e células T humanas por meio de análise de citometria de fluxo.
[0030] Figura 6B: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (direcionadas a um peptídeo que não é o DSL nem o EGF1-6 nem o peptídeo proximal da membrana) a células SHP77.
[0031] Figura 6C: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio DSL) a células SHP77.
[0032] Figura 6D: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF1) a células SHP77.
[0033] Figura 6E: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF3) a células SHP77.
[0034] Figura 6F: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF4) a células SHP77.
[0035] Figura 6G: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio DSL) a células SHP77.
[0036] Figura 6H: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio do peptídeo proximal da membrana) a células SHP77.
[0037] Figura 6I: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (direcionadas a um peptídeo que não é o DSL nem o EGF1-6 nem o peptídeo proximal da membrana) a células NCI-H82.
[0038] Figura 6J: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio DSL) a células NCI-H82.
[0039] Figura 6K: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF1) a células NCI-H82.
[0040] Figura 6L: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF3) a células NCI-H82.
[0041] Figura 6M: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF4) a células NCI-H82.
[0042] Figura 6N: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio DSL) a células NCI-H82.
[0043] Figura 6O: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio do peptídeo proximal da membrana) a células NCI-H82.
[0044] Figura 6P: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (direcionadas a um peptídeo que não é o DSL nem o
EGF1-6 nem o peptídeo proximal da membrana) às células T.
[0045] Figura 6Q: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio DSL) a células T.
[0046] Figura 6R: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF1) a células T.
[0047] Figura 6S: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF3) a células T.
[0048] Figura 6T: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF4) a células T.
[0049] Figura 6U: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF6) a células T.
[0050] Figura 6V: Ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio do peptídeo proximal da membrana) a células T.
[0051] Figura 7A: Potência na lise de células de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 que redirecionam PBMCs não estimuladas para linhagens de células de SCLC humanas.
[0052] Figura 7B: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (direcionadas a um peptídeo que não é o DSL nem o EGF1-6 nem o peptídeo proximal da membrana) que redirecionam células T não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0053] Figura 7C: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio DSL) que redirecionam células T não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0054] Figura 7D: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF1) que redireciona células T não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0055] Figura 7E: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF3) que redirecionam células T não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0056] Figura 7F: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF4) que redirecionam células T não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0057] Figura 7G: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF6) que redirecionam células T não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0058] Figura 7H: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o peptídeo proximal da membrana) que redireciona células T não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0059] Figura 7I: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (direcionadas a um peptídeo que não é o DSL nem o EGF1-6 nem o peptídeo proximal da membrana) que redirecionam células T não estimuladas para células NCI-H82 humanas.
[0060] Figura 7J: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio DSL) que redirecionam células T não estimuladas para células NCI-H82 humanas.
[0061] Figura 7K: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF1) que redireciona células T não estimuladas para células NCI-H82 humanas.
[0062] Figura 7L: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF3)
que redirecionam células T não estimuladas para células NCI-H82 humanas.
[0063] Figura 7M: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF4) que redirecionam células T não estimuladas para células NCI-H82 humanas.
[0064] Figura 7N: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o domínio EGF6) que redirecionam células T não estimuladas para células NCI-H82 humanas.
[0065] Figura 7O: Potência na lise de células de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (dirigidas contra o peptídeo proximal da membrana) que redireciona células T não estimuladas para células NCI-H82 humanas.
[0066] Figura 8: Ensaio de internalização in vitro com duas proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas. As proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram pré-incubadas com células SHP77 positivas para DLL3 durante 2 e 4 horas antes de coincubação durante 48 horas com PBMCs humanas.
[0067] Figura 9: Farmacocinética de duas proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas. Perfis farmacocinéticos médios de DLL3#3/CD3#1 (quadrados vazados) e DLL3#3/CD3#2 (quadrados sólidos) em camundongos C57BL/6 machos após uma única dose intravenosa de 1 mg/kg.
[0068] Figura 10: Atividade antitumoral de duas proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas. O eixo y representa os volumes medianos do tumor e o eixo x representa o tempo.
[0069] Figura 11: Potência na lise de células de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa que redireciona PBMCs não estimuladas para células humanas SHP77 e RKO-E6.
[0070] Figura 12: Potência na ativação de células T na presença de células SHP77 de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa.
[0071] Figura 13: Potência na desgranulação de células T na presença de células SHP77 de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa.
[0072] Figura 14A: Potência de secreção de Interferon gama por PBMCs na presença de células SHP77 de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa.
[0073] Figura 14B: Potência de secreção de MCP-1 por PBMCs na presença de células SHP77 de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa.
[0074] Figura 15: Potência na proliferação de células T na presença de células SHP77 de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa.
[0075] Figura 16: Potência na lise de células de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa que redireciona células T Pan não estimuladas e células T virgens para células SHP77 humanas.
[0076] Figura 17: Potência na lise de células de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa que redireciona células T de memória central CD4+ e CD4+ não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0077] Figura 18: Potência na lise de células de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa que redireciona células T de memória efetoras não estimuladas CD4+ e CD4+ para células SHP77 humanas.
[0078] Figura 19: Potência na lise de células de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa que redireciona células T de memória efetoras não estimuladas CD8+ e CD8+ CD45RA+ para células SHP77 humanas.
[0079] Figura 20: Potência na lise de células de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa que redireciona células T de memória CD8+ e CD8+ não estimuladas para células SHP77 humanas.
[0080] Figura 21: Infiltração de células T em tecido de tumor de xenoenxerto SHP77 com uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa.
[0081] Figura 22: Ligação de três anticorpos anti-DLL3 exemplificativos à proteína DLL3 recombinante em ensaio ELISA. O eixo y representa as contagens, o eixo x representa a concentração da proteína DLL3.
[0082] Figura 23: Ligação de seis anticorpos anti-DLL3 exemplificativos a linhagens de células de SCLC positivas para DLL3 determinada por citometria de fluxo. O eixo y representa as contagens, o eixo x representa a concentração de anticorpo anti-DLL3.
[0083] Figura 24: Coloração representativa de uma amostra de tecido de SCLC com 5 exemplos de anticorpos anti-DLL3. Os anticorpos anti-DLL3 DLL3#1 e DLL3#5 mostraram que as células tumorais exibem uma coloração citoplasmática pontual e/ou difusa de DLL3 e/ou na membrana. As imagens foram geradas eletronicamente pelo scanner automatizado LEICA SCN400 com uma ampliação de 10x.
[0084] Figura 25: Coloração representativa de péletes celulares de linhagens de células de SCLC com diferentes níveis de expressão de DLL3. Anticorpo anti-DLL3 DLL3#5.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO TERMOS E DEFINIÇÕES USADOS
[0085] O acima e outros aspectos e modalidades da invenção se tornarão evidentes a partir da descrição adicional aqui, em que:
[0086] A menos que indicado ou definido de outra forma, todos os termos usados têm seu significado usual na técnica, o qual será evidente para aqueles versados na técnica. Referência é feita, por exemplo, a manuais padrão, tais como Sambrook et al., "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual" (2ª Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990) e Roitt et al., "Immunology" (2ª Ed.), Gower Medical Publishing, Londres, New York (1989), bem como à técnica geral de base citada aqui. Além disso, a menos que indicado de outra forma, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritos em detalhes podem ser realizados e foram realizados de uma maneira conhecida per se, conforme será evidente para aqueles versados na técnica. Referência é feita, por exemplo, novamente a manuais padrão, à técnica geral de referência supracitada e às referências adicionais citadas nas mesmas.
[0087] Quando usado aqui, o termo "que compreende(m)" e variações do mesmo, tais como "compreende" e "compreende(m)", pode ser substituído pelo termo "que contém/contêm" ou "que inclui/incluem" ou "que tem/têm".
[0088] O termo "sequência", conforme usado aqui (por exemplo em termos tais como "sequência de cadeia pesada/leve", "sequência de anticorpo", "sequência de domínio variável", "sequência de domínio constante" ou "sequência de proteína") deve, em geral, ser entendido como incluindo tanto a sequência de aminoácidos relevante quanto as sequências de ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas, a menos que o contexto exija uma interpretação mais limitada.
[0089] Uma "unidade de ligação a antígeno", conforme usado aqui, se refere a um polipeptídeo capaz de se ligar ao seu alvo ou antígeno específico e que compreende os requisitos estruturais mínimos derivados de um anticorpo (tipicamente presentes em um anticorpo) que permite a ligação ao alvo. Assim, uma unidade de ligação a antígeno compreende pelo menos a presença de três sequências de CDR de cadeia leve e três de cadeia pesada, de preferência pelo menos um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada.
[0090] A estrutura generalizada de um anticorpo ou imunoglobulina é bem conhecida por aqueles versados na técnica. Estas moléculas são glicoproteínas heterotetraméricas, tipicamente de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas e normalmente são denominadas como anticorpos de comprimento total. Cada cadeia leve é covalentemente ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação de dissulfeto para formar um heterodímero e a molécula heterotetramérica é formada através de uma ligação de dissulfeto covalente entre as duas cadeias pesadas idênticas dos heterodímeros. Embora as cadeias leve e pesada estejam ligadas entre si através de uma ligação de dissulfeto, o número de ligações de dissulfeto entre as duas cadeias pesadas varia de acordo com o isotipo da imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem, no N-término, um domínio variável (VH), seguido por três ou quatro (no caso de IgE) domínios constantes (CH1, CH2, CH3 e CH4), bem como uma região de dobradiça entre CH1 e CH2. Cada cadeia leve tem dois domínios, um domínio variável N-terminal (VL) e um domínio constante C-terminal (CL). O domínio VL se associa de forma não covalente ao domínio VH, enquanto que o domínio CL normalmente está ligado covalentemente ao domínio CH1 através de uma ligação de dissulfeto. Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leve e pesada (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663). Os domínios variáveis também são denominados aqui como regiões variáveis ou Fv e denotam a parte que confere especificidade a um anticorpo para o antígeno ao portar o sítio de ligação a antígeno.
[0091] O "domínio variável de cadeia leve" (ou "região variável de cadeia leve") e "domínio variável de cadeia pesada" (ou "região variável de cadeia pesada"), conforme usado aqui, têm a mesma estrutura geral e cada domínio consiste essencialmente em quatro regiões estruturais (FR) cujas sequências são amplamente conservadas, as quais são denominadas na técnica e daqui em diante como "região estrutural 1" ou "FR1"; como "região estrutural 2" ou "FR2"; como "região estrutural 3" ou "FR3"; e como "região estrutural 4" ou "FR4", respectivamente; regiões estruturais as quais são interrompidas por três regiões hipervariáveis, HVRs (ou CDRs), as quais são denominadas na técnica e daqui em diante como "região determinante de complementaridade 1" ou "CDR1"; como "região determinante de complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "região determinante de complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente. Assim, a estrutura geral ou sequência de um domínio variável de imunoglobulina pode ser indicada como segue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. As regiões estruturais adotam uma conformação de beta folha e as CDRs podem formar loops que conectam a estrutura de beta folha. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões estruturais e formam, juntamente com as CDRs da outra cadeia, o sítio de ligação a antígeno.
[0092] No contexto da presente invenção, referência às CDRs é com base na definição de CCG, também denominada como IMGT (Lefranc M.P., Pommié C., Ruiz M., Giudicelli V., Foulquier E., Truong L., Thouvenin-Contet V., Lefranc G. "IMGT Unique Numbering for Immunoglobulin and T Cell Receptor Variable Domains and Ig Superfamily V-Like Domains." Dev Comp Immunol. Janeiro de 2003; 27(1): 55-77; Giudicelli V., Brochet X., Lefranc M.P. "IMGT/V-QUEST: IMGT Standardized Analysis of the Immunoglobulin (IG) and T Cell Receptor (TR) Nucleotide Sequences". Cold Spring Harb Protoc. 2011; 2011(6): 695–715. Uma definição alternativa de CDRs conhecida na técnica é com base em Chothia (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901–917), juntamente com Kabat (E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller e H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)).
[0093] O termo "domínios constantes" ou "região constante", conforme usado no presente pedido, denota a soma dos domínios de um anticorpo diferente da região variável. Tais domínios e regiões constantes são bem conhecidos no estado da técnica e são, por exemplo, descritos por Kabat et al. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicação N° 91).
[0094] A "parte Fc" ou "domínio Fc" de um anticorpo não está envolvida diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibe várias funções efetoras. Uma "parte/domínio Fc de um anticorpo" é um termo bem conhecido por aqueles versados na técnica e definido com base na clivagem de anticorpos com papaína. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. De acordo com as regiões constantes da cadeia pesada, as diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. Várias destas podem ser divididas em subclasses (isótopos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. A parte Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity, ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity, CDC) com base na ativação do complemento, ligação a C1q e ligação ao receptor Fc. A ativação de complemento (CDC) é iniciada pela ligação do fator de complemento C1q à parte Fc da maioria das subclasses de anticorpos IgG. Embora a influência de um anticorpo sobre o sistema de complemento seja dependente de determinadas condições, a ligação a C1q é causada por sítios de ligação definidos na parte Fc. Estes sítios de ligação são, por exemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com a numeração EU (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. maio de 1969; 63 (1): 78-85)). Os mais cruciais dentre estes resíduos na mediação da ligação do receptor C1q e Fcgama em IgG1 são L234 e L235 (Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Shields et al. (2001) JBC, 276 (9): 6591–6604). Os anticorpos das subclasses IgG1 e IgG3 geralmente mostram ativação de complemento e ligação a C1q e C3, enquanto que IgG2 e IgG4 não ativam o sistema de complemento e não se ligam a C1q e C3.
[0095] O termo "anticorpo" ou "molécula de anticorpo" (usado como sinônimo aqui) abrange um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), um fragmento de um anticorpo, em particular um fragmento Fv, Fab, Fab' ou F(ab')2, um anticorpo com uma única cadeia, em particular um fragmento variável com uma única cadeia (scFv), um fragmento Fab com uma única cadeia (scFab), um produto ImunoFarmacêutico Modular Pequeno (Small Modular ImmunoPharmaceutical, SMIP), um anticorpo de domínio, um nanocorpo, um diacorpo. O anticorpo pode ter uma função efetora, tal como ADCC ou CDC, a qual geralmente é mediada pela parte Fc (região constante de anticorpo) do anticorpo, ou pode não ter função efetora, por exemplo, por falta de uma parte Fc ou ter uma parte Fc bloqueada e mascarada, em essência uma parte Fc que não é ou é insuficientemente reconhecida por células imunes ou componentes do sistema imune, tal como o sistema complemento.
[0096] Os anticorpos monoclonais (mAb) são anticorpos monoespecíficos que são idênticos quanto à sequência de aminoácidos. Eles podem ser produzidos por meio da tecnologia de hibridoma a partir de uma linhagem de células híbrida (denominada de hibridoma) que representa um clone de uma fusão de uma célula B produtora de anticorpos específicos com uma célula de mieloma (câncer de células B) (Kohler G, Milstein C. Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity. Nature 1975; 256: 495-7). Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por meio de expressão recombinante em células hospedeiras (Norderhaug L., Olafsen T., Michaelsen T.E., Sandlie I. (maio de 1997). "Versatile Vectors for Transient and Stable Expression of Recombinant Antibody Molecules in Mammalian Cells." J Immunol Methods 204 (1): 77–87; consulte também abaixo). Um "anticorpo recombinante" ou "proteína de ligação recombinante" é um anticorpo ou proteína de ligação que foi produzida por uma célula hospedeira manipulada de forma recombinante. Ele é opcionalmente isolado ou purificado.
[0097] Os anticorpos de comprimento total podem ser tratados com enzimas, tais como papaína ou pepsina, para gerar fragmentos de anticorpo úteis. A digestão com papaína é usada para produzir dois fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno idênticos denominados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação a antígeno e um fragmento "Fc" residual. O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeia leve e o domínio CH1 de cadeia pesada. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de ligação a antígeno e ainda é capaz de se ligar de forma cruzada ao antígeno.
[0098] Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela presença de resíduos adicionais, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo no C-término do domínio CH1. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 são pares de fragmentos Fab' ligados por resíduos de cisteína na região de dobradiça. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[0099] O fragmento "Fv" contém um sítio de reconhecimento antigênico completo e um sítio de ligação que consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de cadeia leve em associação estreita e não covalente. Nesta configuração, as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo.
[0100] Um fragmento de anticorpo "Fv com uma única cadeia" ou "scFv" é uma variante de Fv que tem uma única cadeia que compreende os domínios VH e VL de um anticorpo, em que os domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. O Fv com uma única cadeia é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno. O polipeptídeo scFv também pode conter opcionalmente um ligante polipeptídico posicionado entre os domínios VH e VL a fim de facilitar a formação de uma estrutura tridimensional desejada para ligação do antígeno pelo scFv (consulte, por exemplo, Pluckthun, 1994, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer- Verlag, New York, páginas 269-315).
[0101] Um fragmento de anticorpo "Fab com uma única cadeia" ou "scFab" é uma variante de Fab com uma única cadeia que compreende os domínios VL, CL, VH e CH1 de um anticorpo, em que os domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. O Fab com uma única cadeia é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno. O polipeptídeo scFab também pode conter opcionalmente um ligante polipeptídico posicionado entre os domínios CL e VH (Hust et al. (2007) BMC Biotechnology).
[0102] Para aplicação no homem, frequentemente é desejável reduzir a imunogenicidade de moléculas terapêuticas, tais como anticorpos ou proteínas de ligação que compreendem uma unidade de ligação a antígeno conforme descrito aqui, originalmente derivadas de outras espécies, tal como camundongo. Isto pode ser feito pela construção de anticorpos quiméricos/proteínas de ligação ou através de um processo denominado "humanização". Neste contexto, um "anticorpo quimérico" ou "unidade de ligação a antígeno quimérica" deve ser entendida como um anticorpo ou uma unidade de ligação a antígeno que compreende uma parte da sequência (por exemplo, um domínio variável) derivada de uma espécie (por exemplo, camundongo) fundida a uma parte da sequência (por exemplo, os domínios constantes) derivada de uma espécie diferente (por exemplo, ser humano). Neste contexto, um "anticorpo humanizado", "uma proteína de ligação humanizada" ou uma "unidade de ligação a antígeno humanizada" é um anticorpo, uma proteína ou unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável originalmente derivado de uma espécie não humana, em que determinados aminoácidos sofreram mutação para fazer com que a sequência geral deste domínio variável se assemelhe mais a uma sequência de um domínio variável humano. Métodos de humanização de anticorpos são bem conhecidos na técnica (Billetta R., Lobuglio A.F. "Chimeric Antibodies". Int Rev Immunol. 1993; 10(2-3): 165-76; Riechmann L., Clark M., Waldmann H., Winter G. (1988). "Reshaping Human Antibodies for Therapy". Nature: 332: 323).
[0103] Um "anticorpo otimizado" ou uma "unidade ou proteína de ligação a antígeno otimizada" é um tipo específico de anticorpo humanizado ou unidade/proteína de ligação a antígeno humanizado que inclui uma variante de sequência de aminoácidos de imunoglobulina, ou fragmento da mesma, que é capaz de se ligar a um predeterminado antígeno e que compreende uma ou mais FRs que têm substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma ou mais CDRs que têm substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina não humana. Esta sequência de aminoácidos não humana, frequentemente denominada como uma sequência de "importação" é, tipicamente, retirada de um domínio de anticorpo de "importação", particularmente um domínio variável. Em geral, um anticorpo otimizado inclui pelo menos as CDRs (ou HVLs) de um anticorpo não humano ou derivadas de um anticorpo não humano inseridas entre as FRs de um domínio variável de cadeia pesada ou leve humana. Será entendido que determinados resíduos de FR de camundongo podem ser importantes para a função dos anticorpos otimizados e, portanto, determinados resíduos de domínios variáveis de cadeias pesada e leve da sequência de linhagem germinativa humana são modificados para serem os mesmos da sequência de camundongo correspondente. Durante este processo, aminoácidos indesejados também podem ser removidos ou alterados, por exemplo, para evitar desamidação, cargas indesejáveis ou lipofilicidade ou ligação não específica. Um "anticorpo otimizado", um "fragmento de anticorpo otimizado" ou "otimizado" pode, algumas vezes, ser denominado como "anticorpo humanizado", "fragmento de anticorpo humanizado" ou "humanizado" ou como "de sequência otimizada".
[0104] Além disso, foram desenvolvidas tecnologias para a criação de anticorpos ou domínios VH/VL com base em sequências derivadas do genoma humano, por exemplo, por meio de exibição em fagos ou uso de animais transgênicos (WWW.Ablexis.com/technology- alivamab.php; documento WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths e G. Winter (1991) "By-pass Immunization. Human Anticorpos From V-Gene Libraries Display on Phage." J. Mol. Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57- 86, 2000; S. Carmen e L. Jermutus, "Concepts in Antibody Phage Display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 (2):
189-203; Lonberg N., Huszar D. "Human Antibodies From Transgenic Mice". Int Rev Immunol. 1995; 13(1): 65-93; Brüggemann M., Taussig M.J. "Production of Human Antibody Repertoires in Transgenic Mice". Curr Opin Biotechnol. Agosto de 1997; 8(4): 455-8). Tais anticorpos ou unidades de ligação a antígeno ou domínios VH/VL são "anticorpos humanos", "unidades de ligação a antígeno humano" ou "domínios VH/VL humanos" no contexto da presente invenção.
[0105] Os termos "anticorpo humano", "unidade de ligação a antígeno humano" ou "domínio VH/VL humano", conforme usado aqui, se destinam a incluir anticorpos, unidades de ligação a antígeno ou domínios VH/VL que têm regiões variáveis (e constantes, se aplicável) derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos, unidades de ligação a antígeno, proteínas ou domínios VH/VL da presente tecnologia podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou sítio específica in vitro ou mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", "unidade de ligação a antígeno humano" ou "domínio VH/VL humano", conforme usado aqui, não se destina a incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra (espécie de mamífero), tais como um camundongo, rato ou coelho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. Assim, conforme usado aqui, o termo "anticorpo humano", "unidade de ligação a antígeno humano" ou "domínio VH/VL humano" se refere a um anticorpo, unidade de ligação a antígeno ou domínio VH/VL no qual substancialmente todas as partes da proteína (por exemplo, CDR, região estrutural, CL, domínios CH (por exemplo, CH1, CH2, CH3), dobradiça, VL, VH) são substancialmente não imunogênicas em seres humanos, com apenas pequenas alterações ou variações de sequência.
Tais mudanças ou variações, opcionalmente e de preferência, retêm ou reduzem a imunogenicidade em seres humanos ou outras espécies em relação aos anticorpos ou unidades de ligação a antígeno não modificados.
[0106] Assim, um anticorpo humano, unidade de ligação a antígeno humano ou domínio VH/VL humano é distinto, por exemplo, de um anticorpo quimérico ou humanizado. Deve ser destacado que um anticorpo humano, unidade de ligação a antígeno humano ou domínio VH/VL humano pode ser produzido por um animal não humano ou célula procariota ou eucariota que é capaz de expressar imunoglobulina humana funcionalmente rearranjada (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeia leve).
[0107] O termo "monômero" se refere a uma forma homogênea de um anticorpo ou uma proteína multiespecífica conforme descrito aqui. Por exemplo, para um anticorpo de comprimento total, monômero significa um anticorpo monomérico que tem duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. No contexto da presente invenção, um monômero significa uma proteína da presente invenção com uma única unidade de ligação a antígeno específica para DLL3 e uma única unidade de ligação a antígeno específica para CD3, conforme descrito aqui. Por exemplo, um monômero de uma proteína de ligação descrita aqui pode ter duas cadeias, uma primeira cadeia que compreende um Fab com uma única cadeia que tem uma primeira unidade de ligação a antígeno e, opcionalmente, um primeiro domínio Fc e uma segunda cadeia que compreende um Fab com uma única cadeia que tem uma segunda unidade de ligação a antígeno e, opcionalmente, um segundo domínio Fc.
[0108] Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo ou porção de ligação a antígeno (por exemplo, a unidade de ligação a antígeno das proteínas descritas aqui). O termo "epítopo"
inclui qualquer determinante polipeptídico capaz de ligação específica a um anticorpo ou porção de ligação a antígeno. Em determinadas modalidades, os determinantes de epítopo incluem agrupamentos de moléculas na superfície quimicamente ativos, tais como aminoácidos, cadeias laterais de glicana, fosforila ou sulfonila e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais se distinguem pelo fato de que a ligação ao primeiro, mas não ao último, se perde na presença de solventes desnaturantes.
[0109] Uma molécula/proteína de ligação a antígeno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, uma unidade de ligação a antígeno ou um fragmento de tal molécula/proteína de ligação a antígeno) que pode se "ligar", "ligar-se a", "se ligar especificamente" ou "ligar-se especificamente a", que "tem afinidade por", é "específica para" e/ou que "tem especificidade por" um determinado epítopo, antígeno ou proteína (ou pelo menos uma parte, fragmento ou epítopo do mesmo) é denominada como sendo "contra" ou "dirigida contra" o dito epítopo, antígeno ou proteína ou é uma molécula/proteína de "ligação" em relação a este epítopo, antígeno ou proteína.
[0110] Conforme usado aqui, os termos "ligação" e "ligação específica" se referem à ligação do anticorpo ou porção de ligação a antígeno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, uma unidade de ligação a antígeno ou um fragmento de tal molécula/proteína de ligação a antígeno) a um epítopo do antígeno em um ensaio in vitro, de preferência em um ensaio de ressonância de plasmônio (Malmqvist M., "Surface Plasmon Resonance for Detection and Measurement of Antibody-Antigen Affinity and Kinetics.", Curr Opin Immunol. Abril de 1993; 5 (2): 282-6) com antígeno de tipo selvagem purificado. A afinidade do anticorpo também pode ser medida usando a tecnologia de ensaio de exclusão cinética (KinExA) (Darling, R.J. e Brault P.A., "Kinetic Exclusion Assay Technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies. 02 de dezembro de 2004, (6): 647-657).
[0111] Em geral, o termo "especificidade" se refere ao número de diferentes tipos de antígenos ou epítopos para os quais uma determinada molécula/proteína de ligação a antígeno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, uma unidade de ligação a antígeno ou um fragmento de tal molécula/proteína de ligação a antígeno) pode se ligar. A especificidade de ligação a antígeno de uma molécula/proteína pode ser determinada com base em sua afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante em equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação a antígeno (KD), é uma medida para a intensidade de ligação entre um epítopo e um sítio de ligação a antígeno na molécula/proteína de ligação a antígeno: quanto menor o valor de KD, mais forte é a intensidade de ligação entre um epítopo e a molécula/proteína de ligação a antígeno (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), a qual é 1/KD). Conforme será evidente para aqueles versados na técnica (por exemplo, com base na descrição adicional aqui), a afinidade pode ser determinada de uma maneira conhecida per se, dependendo do antígeno específico de interesse. Avidez é a medida da intensidade de ligação entre uma molécula/proteína de ligação a antígeno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, uma unidade de ligação a antígeno ou fragmento de tal molécula/proteína de ligação a antígeno) e o antígeno pertinente. A avidez está relacionada à afinidade entre um epítopo e seu sítio de ligação a antígeno na molécula/proteína de ligação a antígeno e ao número de sítios de ligação pertinentes presentes na molécula/proteína de ligação a antígeno.
[0112] O termo "isolado", conforme usado aqui, se refere ao material que é removido de seu ambiente original ou nativo (por exemplo, o ambiente natural se ele ocorrer naturalmente). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, porém, o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado por intervenção humana de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição e ainda ser isolados pelo fato de que tal vetor ou composição não faz parte do ambiente no qual ele é encontrado na natureza. Por exemplo, um ácido nucleico, molécula de proteína/polipeptídeo é considerado como "sendo (estando na forma) essencialmente isolado" - quando comparado com sua fonte biológica nativa e/ou meio de reação ou meio de cultivo a partir do qual ele foi obtido - quando foi separado de pelo menos um outro componente com o qual ele está normalmente associado na dita fonte ou meio, tal como outro ácido nucleico, outra proteína/polipeptídeo, outro componente biológico ou macromolécula ou pelo menos um contaminante, impureza ou componente secundário. Em particular, um ácido nucleico ou molécula de proteína/polipeptídeo é considerada "essencialmente isolada" quando foi purificada pelo menos 2 vezes, em particular pelo menos 10 vezes, mais particularmente pelo menos 100 vezes e até 1000 vezes ou mais. Um ácido nucleico ou molécula de proteína/polipeptídeo que está "na forma essencialmente isolada" é, de preferência, essencialmente homogênea, conforme determinado usando uma técnica adequada, tal como uma técnica cromatográfica adequada, por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida.
[0113] Conforme usado aqui, os termos "idêntica" ou "percentagem de identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídicas, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos iguais quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima. Para determinar a porcentagem de identidade, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos para alinhamento ideal com uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são, então, comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então, as moléculas são idênticas nesta posição. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % identidade = # de posições idênticas/# total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em algumas modalidades, as duas sequências que são comparadas têm o mesmo comprimento após lacunas serem introduzidas nas sequências, conforme apropriado (por exemplo, excluindo a sequência adicional que se estende além das sequências que estão sendo comparadas). Por exemplo, quando sequências de região variável são comparadas, as sequências de domínio líder e/ou constante não são consideradas. Para comparações de sequências entre duas sequências, uma CDR "correspondente" se refere a uma CDR na mesma localização em ambas as sequências (por exemplo, CDR-H1 de cada sequência).
[0114] A determinação da identidade percentual ou similaridade percentual entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido e não limitativo de um algoritmo matemático usado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
2264-2268, modificado conforme em Karlin e Altschul, 1993, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 90: 5873-5877. Este algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J.
Mol.
Biol. 215: 403-410. As pesquisas de nucleotídeos no BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse.
As pesquisas de proteína no BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína de interesse.
Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, o Gapped BLAST pode ser usado, conforme descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamente, o PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). Ao usar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.
Outro exemplo preferido e não limitativo de um algoritmo matemático usado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). Este algoritmo é incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), o qual faz parte do pacote de software de alinhamento de sequência GCG.
Ao usar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade por extensão de lacuna de 12 e uma penalidade por lacuna de 4 podem ser usadas.
Algoritmos adicionais para análise de sequência são conhecidos na técnica e incluem ADVANCE e ADAM, conforme descrito em Torellis e Robotti, 1994, Comput.
Appl.
Biosci. 10: 3-5; e FASTA, descrito em Pearson e Lipman, 1988, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 85: 2444-8. No FASTA, ktup é uma opção de controle que define a sensibilidade e a velocidade da pesquisa.
Se ktup = 2, regiões similares nas duas sequências a serem comparadas são encontradas buscando pares de resíduos alinhados; se ktup = 1, aminoácidos alinhados simples são examinados. ktup pode ser definido como 2 ou 1 para sequências de proteínas ou de 1 a 6 para sequências de DNA. Se o padrão ktup não for especificado, ele é 2 para proteínas e 6 para DNA. Alternativamente, o alinhamento de sequência da proteína pode ser realizado usando o algoritmo CLUSTAL W, conforme descrito por Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402.
[0115] O termo "ligado covalentemente", conforme usado aqui, significa uma ligação covalente direta entre os resíduos ou uma associação indireta na qual dois resíduos não estão ligados diretamente, mas estão ambos ligados covalentemente a uma molécula ou domínio intermediário, por exemplo, um domínio intermediário de uma imunoglobulina.
[0116] Os termos "competir" ou "competição cruzada" são usados indistintamente aqui para se referir à capacidade de uma molécula de anticorpo de interferir com a ligação de uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção, a um alvo, por exemplo, DLL3 humana. A interferência com a ligação pode ser direta ou indireta (por exemplo, através de uma modulação alostérica da molécula de anticorpo ou do alvo). A extensão até a qual uma molécula de anticorpo é capaz de interferir na ligação de outra molécula de anticorpo ao alvo e, portanto, se ela pode competir, pode ser determinada usando um ensaio de ligação competitiva, por exemplo, um ensaio FACS, um ensaio ELISA ou ensaio BIACORE. Em algumas modalidades, um ensaio de ligação competitiva é um ensaio de competição quantitativa. Em algumas modalidades, diz-se que uma primeira molécula de anticorpo anti-DLL3 compete pela ligação ao alvo com uma segunda molécula de anticorpo anti-DLL3 quando a ligação da primeira molécula de anticorpo ao alvo é reduzida em 10 % ou mais,
por exemplo, 20 % ou mais, 30 % ou mais, 40 % ou mais, 50 % ou mais, 55 % ou mais, 60 % ou mais, 65 % ou mais, 70 % ou mais, 75 % ou mais, 80 % ou mais, 85 % ou mais, 90 % ou mais, 95 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais em um ensaio de ligação competitiva (por exemplo, um ensaio competitivo descrito aqui).
[0117] Deve ser inferido, sem citação explícita e salvo intenção em contrário que, quando a presente tecnologia se refere a um polipeptídeo, proteína, polinucleotídeo ou anticorpo, um equivalente ou equivalente biologicamente do mesmo é considerado dentro do escopo da presente tecnologia.
[0118] Conforme usado aqui, o termo "seu equivalente biológico" se destina a ser sinônimo de "seu equivalente" quando de referência a uma proteína, anticorpo, polipeptídeo, polinucleotídeo ou ácido nucleico de referência e inclui aqueles com homologia mínima, ao mesmo tempo em que ainda retêm a estrutura ou funcionalidade desejada. A menos que especificamente citado aqui, considera-se que qualquer ácido nucleico, polinucleotídeo, polipeptídeo, proteína ou anticorpo citado aqui também inclua seus equivalentes. Por exemplo, um equivalente inclui pelo menos cerca de 80 % de homologia ou identidade e, alternativamente, pelo menos cerca de 85 % ou, alternativamente, pelo menos cerca de 90 % ou, alternativamente, pelo menos cerca de 95 % ou, alternativamente, 98 % por cento de homologia ou identidade e exibe atividade biológica substancialmente equivalente à proteína, polipeptídeo, anticorpo ou ácido nucleico de referência.
[0119] Conforme usado aqui, o termo "marcador detectável" se refere a uma molécula, composto ou composição que pode produzir um sinal detectável, isto é, sinal físico ou químico, incluindo um sinal colorimétrico, fluorescente, elétrico, radioativo e quimioluminescente, que pode ser medido através de métodos visuais ou instrumentais e que indica a presença e/ou quantidade/concentração do marcador em uma amostra.
[0120] Um "sinal detectável" pode ser gerado através de vários mecanismos, incluindo absorção, emissão e/ou dispersão de um fóton (incluindo radiofrequência, frequência de micro-ondas, frequência de infravermelho, frequência visível e fótons de frequência ultravioleta) e inclui, porém sem limitações, fótons colorimétricos, sinais fluorescentes, elétricos, radioativos e quimioluminescentes.
[0121] Conforme usado aqui, "expressão" se refere ao processo pelo qual os polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariota. O nível de expressão de um gene pode ser determinado ao medir a quantidade de mRNA ou proteína em uma amostra de célula ou tecido.
[0122] Conforme usado aqui, o termo "amostra biológica" significa um material de amostra derivado de ou contatado por células vivas. O termo se destina a incluir tecidos, células e fluidos biológicos isolados de um indivíduo. Conforme usado aqui, o termo "amostra de tecido" se refere a uma amostra celular que preserva a relação espacial da seção transversal entre as células conforme elas existiam dentro do indivíduo do qual a amostra foi obtida. As amostras biológicas também podem ser obtidas de biópsias de órgãos internos ou de câncer.
[0123] "Histoquímica" e "citoquímica" são técnicas usadas para identificar uma molécula no contexto de células intactas ao marcar as amostras com um agente que se liga especificamente à molécula de uma maneira que pode ser visualizada em um microscópio. "Imuno- histoquímica" e "imunocitoquímica" são tipos de histoquímica e citoquímica que usam anticorpos para marcar as moléculas.
PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MULTIESPECÍFICAS DA INVENÇÃO
[0124] A presente invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que compreendem pelo menos uma unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 (uma primeira unidade de ligação a antígeno) e pelo menos uma unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 (uma segunda unidade de ligação a antígeno). Tais proteínas de ligação (multiespecíficas) também são denominadas aqui como moléculas de ligação (multiespecíficas) ou proteínas de ligação à DLL3/CD3 ou moléculas de ligação à DLL3/CD3.
[0125] Os inventores descobriram, surpreendentemente, que as proteínas de ligação multiespecíficas da invenção induzem à lise seletiva de linhagens de células de SCLC positivas para DLL3 na presença de células T e já são ativas em baixas proporções de células efetoras para células alvo. É importante observar que as proteínas de ligação da invenção não causam ativação de células T, proliferação de células T e secreção de citocinas na ausência de células DLL3-positivas ou lise de células DLL3-negativas.
[0126] Para evitar dúvidas, DLL3, conforme usado aqui, se refere à DLL3 humana de UniProt Q9NYJ7 e à sequência de ácidos nucleicos que codifica tal proteína. CD3, conforme usado aqui, se refere a complexos de CD3 épsilon (UniProt P07766) e CD3 gama (UniProt: P09693) humanas (complexos de CD3εγ humana).
[0127] Espera-se que o direcionamento de DLL3 com uma abordagem de acoplamento de células T biespecíficas forneça vantagens em relação a uma abordagem de ADC, uma vez que o redirecionamento de células T não é influenciado pela resistência à quimioterapia e os baixos níveis de expressão na superfície celular são menos críticos para este modo de ação. Os acopladores de células T são proteínas de ligação multiespecíficas com braços de ligação à CD3 nas células T e braços de ligação a um antígeno na superfície celular das células tumorais. Através de ligação simultânea a células T e células tumorais, acopladores de células T forçam a formação de uma sinapse citolítica entre as duas células e, assim, redirecionam a atividade das células T seletivamente para as células tumorais alvo.
[0128] Em um aspecto, a proteína de ligação multiespecífica da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3, em que a dita primeira unidade de ligação é selecionada a partir do grupo que consiste em i) a xviii): i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#1); ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#2); iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#3); iv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (CDR1), SEQ ID NO: 20 (CDR2) e SEQ ID NO: 21
(CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (CDR1), SEQ ID NO: 23 (CDR2) e SEQ ID NO: 24 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#4); v) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1), SEQ ID NO: 26 (CDR2) e SEQ ID NO: 27 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (CDR1), SEQ ID NO: 29 (CDR2) e SEQ ID NO: 30 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#5); vi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (CDR1), SEQ ID NO: 32 (CDR2) e SEQ ID NO: 33 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (CDR1), SEQ ID NO: 35 (CDR2) e SEQ ID NO: 36 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#6); vii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (CDR1), SEQ ID NO: 134 (CDR2) e SEQ ID NO: 135 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 (CDR1), SEQ ID NO: 137 (CDR2) e SEQ ID NO: 138 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#7); viii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 (CDR1), SEQ ID NO: 140 (CDR2) e SEQ ID NO: 141 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 (CDR1), SEQ ID NO: 143 (CDR2) e SEQ ID NO: 144 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#8); ix) uma unidade de ligação a antígeno que compreende
CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (CDR1), SEQ ID NO: 146 (CDR2) e SEQ ID NO: 147 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 (CDR1), SEQ ID NO: 149 (CDR2) e SEQ ID NO: 150 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#9); x) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 (CDR1), SEQ ID NO: 152 (CDR2) e SEQ ID NO: 153 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 (CDR1), SEQ ID NO: 155 (CDR2) e SEQ ID NO: 156 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#10); xi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 (CDR1), SEQ ID NO: 158 (CDR2) e SEQ ID NO: 159 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 (CDR1), SEQ ID NO: 161 (CDR2) e SEQ ID NO: 162 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#11); xii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 (CDR1), SEQ ID NO: 164 (CDR2) e SEQ ID NO: 165 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 (CDR1), SEQ ID NO: 167 (CDR2) e SEQ ID NO: 168 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#12); xiii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (CDR1), SEQ ID NO: 170 (CDR2) e SEQ ID NO:
171 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 (CDR1), SEQ ID NO: 173 (CDR2) e SEQ ID NO: 174 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#13); xiv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 (CDR1), SEQ ID NO: 176 (CDR2) e SEQ ID NO: 177 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 (CDR1), SEQ ID NO: 179 (CDR2) e SEQ ID NO: 180 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#14); xv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 (CDR1), SEQ ID NO: 182 (CDR2) e SEQ ID NO: 183 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 (CDR1), SEQ ID NO: 185 (CDR2) e SEQ ID NO: 186 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#15); xvi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 (CDR1), SEQ ID NO: 188 (CDR2) e SEQ ID NO: 189 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 190 (CDR1), SEQ ID NO: 191 (CDR2) e SEQ ID NO: 192 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#16); xvii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 (CDR1), SEQ ID NO: 194 (CDR2) e SEQ ID NO: 195 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 (CDR1), SEQ ID NO:
197 (CDR2) e SEQ ID NO: 198 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#17); e xviii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 (CDR1), SEQ ID NO: 200 (CDR2) e SEQ ID NO: 201 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 (CDR1), SEQ ID NO: 203 (CDR2) e SEQ ID NO: 204 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno DLL3#18).
[0129] De preferência, a primeira unidade de ligação a antígeno da proteína de ligação da invenção é qualquer uma de i) a iii), conforme definido pelas sequências de CDR acima.
[0130] Para evitar dúvidas, cada uma das modalidades específicas listadas aqui também pode ser considerada aspectos independentes da invenção.
[0131] Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, a dita segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 é selecionada a partir do grupo que consiste em i) a iii): i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno CD3#1); ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ
ID NO: 66 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno CD3#2); e iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 (CDR1), SEQ ID NO: 97 (CDR2) e SEQ ID NO: 98 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 (CDR1), SEQ ID NO: 100 (CDR2) e SEQ ID NO: 101 (CDR3) (unidade de ligação a antígeno CD3#3).
[0132] As primeiras unidades de ligação de antígeno i) a xviii) conforme descrito acima são denominadas DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 e DLL3#18, respectivamente, e as segundas unidades de ligação de antígeno i) a iii) conforme descrito acima são denominadas CD3#1, CD3#2 e CD3#3, respectivamente. É fornecida aqui uma tabela de sequências que permite identificar prontamente sequências de aminoácidos individuais para unidades de ligação de antígeno específicas e proteínas de ligação de comprimento total da presente invenção. Um resumo é fornecido na Tabela 1 do Exemplo 2.
[0133] Os termos "primeira" e "segunda", em relação às unidades de ligação a antígeno em geral, conforme usado aqui, se destinam exclusivamente a indicar que tais unidades são duas unidades diferentes (uma vez que se ligam a diferentes antígenos alvo). Assim, estes termos não devem ser entendidos como se referindo à ordem ou sequência exata das unidades dentro da proteína de ligação da invenção.
[0134] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 e
DLL3#18 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima e uma segunda unidade de ligação a antígeno de CD3#1 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima. Em modalidades preferidas, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em DLL3#1, DLL3#2 e DLL3#3 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima e uma segunda unidade de ligação a antígeno de CD3#1 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima.
[0135] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 e DLL3#18 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima e uma segunda unidade de ligação a antígeno de CD3#2 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima. Em modalidades preferidas, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em DLL3#1, DLL3#2 e DLL3#3 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima e uma segunda unidade de ligação a antígeno de CD3#2 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima.
[0136] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 e
DLL3#18 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima e uma segunda unidade de ligação a antígeno de CD3#3 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima. Em modalidades preferidas, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em DLL3#1, DLL3#2 e DLL3#3 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima e uma segunda unidade de ligação a antígeno de CD3#3 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR descritas acima.
[0137] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3) e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs da cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3).
[0138] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de
SEQ ID NO: 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3) e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3).
[0139] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3) e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3).
[0140] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3) e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3).
[0141] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3) e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3).
[0142] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3) e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61
(CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3).
[0143] Além das sequências de CDR conforme apresentado aqui, as unidades de ligação a antígeno das proteínas de ligação da invenção incluem sequências da região estrutural de imunoglobulina (FR). Estas sequências são, de preferência, não imunogênicas em seres humanos e, portanto, de preferência, são sequências de FR humanas ou humanizadas. Sequências de FR humanas ou humanizadas adequadas são conhecidas na técnica. As sequências de FR especificamente preferidas podem ser retiradas das modalidades mostradas aqui que descrevem as unidades de ligação a antígeno completas e, assim, as sequências de CDR, bem como as sequências de FR.
[0144] Em modalidades preferidas das proteínas de ligação da invenção, as primeira e segunda unidades de ligação compreendem, cada uma, um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada derivados de uma molécula de anticorpo, os ditos domínios variáveis de cadeias leve/pesada definidos pelas sequências de CDR de qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18 para a primeira unidade de ligação a antígeno e os ditos domínios variáveis de cadeias leve/pesada definidos pelas sequências de CDR de qualquer uma de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3 para a segunda unidade de ligação a antígeno. Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, o domínio VH e/ou VL das unidades de ligação a antígeno de qualquer uma ou mais de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17,
DLL3#18, CD3#1, CD3#2 ou CD3#3 é um domínio VH e/ou VL humano ou humanizado.
[0145] Em modalidades preferidas da invenção, os domínios variáveis de cadeias leve/pesada da primeira unidade de ligação a antígeno são ainda definidos como segue: i) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 (unidade de ligação a antígeno DLL3#1); ou ii) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 (unidade de ligação a antígeno DLL3#2); ou iii) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 (unidade de ligação a antígeno DLL3#3); ou iv) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 (unidade de ligação a antígeno DLL3#4); ou v) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 (unidade de ligação a antígeno DLL3#5); ou vi) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 (unidade de ligação a antígeno DLL3#6); ou vii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 (unidade de ligação a antígeno DLL3#7); ou viii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 (unidade de ligação a antígeno DLL3#8); ou ix) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 (unidade de ligação a antígeno DLL3#9); ou x) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212 (unidade de ligação a antígeno DLL3#10); ou xi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 (unidade de ligação a antígeno DLL3#11); ou xii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216 (unidade de ligação a antígeno DLL3#12); ou xiii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 218 (unidade de ligação a antígeno DLL3#13); ou xiv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 219 e domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 220 (unidade de ligação a antígeno DLL3#14); ou xv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222 (unidade de ligação a antígeno DLL3#15); ou xvi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 e domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 224 (unidade de ligação a antígeno DLL3#16); ou xvii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 226 (unidade de ligação a antígeno DLL3#17); ou xviii) que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 (unidade de ligação a antígeno DLL3#18).
[0146] De preferência, a primeira unidade de ligação a antígeno da proteína de ligação da invenção é qualquer uma de i) a iii), conforme definido pelas sequências de VL e VH acima.
[0147] Em modalidades preferidas da invenção, os domínios variáveis de cadeias leve/pesada da segunda unidade de ligação a antígeno são ainda definidos como segue: i) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 (unidade de ligação a antígeno CD3#1); ou ii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 (unidade de ligação a antígeno CD3#2); ou iii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 (unidade de ligação a antígeno CD3#3).
[0148] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende uma combinação de uma primeira e uma segunda unidades de ligação a antígeno selecionadas a partir do grupo que consiste em DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3, DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3, as primeira e segunda unidades de ligação a antígeno sendo definidas pelas sequências de CDR e/ou VH e VL das unidades de ligação a antígeno conforme descrito acima. Em modalidades preferidas, a proteína de ligação da invenção compreende uma combinação de uma primeira e uma segunda unidades de ligação a antígeno selecionadas a partir do grupo que consiste em DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2,
DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3 e DLL3#3/CD3#3, as primeira e segunda unidades de ligação a antígeno sendo definidas pelas sequências de CDR e/ou VH e VL das unidades de ligação a antígeno conforme descrito acima.
[0149] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e (ii) uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
[0150] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e (ii) uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
[0151] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e (ii) uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
[0152] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e (ii) uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
[0153] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e (ii) uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
[0154] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70
[0155] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende i) uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR ou VH/VL acima) que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve covalentemente ligado, seja direta ou indiretamente, a um primeiro domínio variável de cadeia pesada através de um primeiro ligante peptídico e/ou ii) uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 (por exemplo, qualquer uma de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR ou VH/VL acima) que compreende um segundo domínio variável de cadeia leve covalentemente ligado, seja direta ou indiretamente, a um segundo domínio variável de cadeia pesada através de um segundo ligante peptídico.
[0156] Em algumas modalidades das proteínas de ligação da invenção, as primeira e/ou segunda unidades de ligação a antígeno compreendem ainda um domínio CL e um domínio CH1, tal como em um domínio Fab leve/pesado de uma molécula de anticorpo convencional, assim, a dita primeira unidade de ligação compreende a) um domínio VL (por exemplo, definido pelas sequências de CDR de cadeia leve (LCCDR) ou VL de qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18) covalentemente ligado (direta ou indiretamente ligado) a um primeiro domínio CL e b) um domínio VH (por exemplo, definido pelas sequências de CDR de cadeia pesada (HCCDR) ou VH de qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6 DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18) covalentemente ligado (direta ou indiretamente ligado) a um primeiro domínio CH1 e/ou a dita segunda unidade de ligação a antígeno compreende a) um domínio VL (por exemplo, definido pelas sequências de LCCDR ou VL de qualquer uma de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3) covalentemente ligado (direta ou indiretamente ligado) a um segundo domínio CL e b) um domínio VH (por exemplo, definido pelas sequências de HCCDR ou VH de qualquer uma de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3) covalentemente ligado (direta ou indiretamente ligado) a um segundo domínio CH1.
[0157] No contexto da presente invenção, um domínio CL é o domínio constante de uma cadeia leve de anticorpo, por exemplo, uma cadeia leve capa () ou lambda (). Um exemplo de uma região constante de uma cadeia leve capa é mostrado em SEQ ID NO: 87. Um exemplo de uma região constante de uma cadeia leve lambda é mostrado em SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios CL são iguais, por exemplo, os primeiro e segundo domínios CL são ambos um domínio constante de cadeia leve capa ou os primeiro e segundo domínios CL são ambos um domínio constante de cadeia leve lambda. Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios CL são diferentes, por exemplo, o primeiro domínio CL é um domínio capa constante e o segundo domínio CL é um domínio lambda constante ou vice-versa.
[0158] No contexto da presente invenção, um domínio CH1 é o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada de anticorpo. Um exemplo de um domínio CH1 constante é mostrado em SEQ ID NO:
253.
[0159] Em modalidades preferidas das proteínas de ligação da invenção, a primeira unidade de ligação a antígeno (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18 definida pelas sequências de CDR e/ou VH/VL conforme descrito acima) das proteínas de ligação da invenção compreendem, a partir do N- para o C-término: um primeiro domínio variável de cadeia leve, um primeiro domínio CL, um primeiro ligante peptídico, um primeiro domínio VH e um primeiro domínio CH1 e/ou a segunda unidade de ligação (por exemplo, qualquer uma de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3 definida pelas sequências de CDR e/ou VH/VL conforme descrito acima) das proteínas de ligação da invenção compreendem, a partir do N- para o C-término: um segundo domínio variável de cadeia leve, um segundo domínio CL, um segundo ligante peptídico, um segundo domínio VH e um segundo domínio CH1. Nesta modalidade, as primeira e/ou segunda unidades de ligação têm a estrutura de um Fab com uma única cadeia. Tanto para as primeira e/ou segunda unidades de ligação a antígeno, ao formar um Fab com uma única cadeia, a ordem pode ser invertida de modo que, do N- para o C- término, a unidade de ligação a antígeno compreenda: VH-CH1- [ligante peptídico]-VL-CL. Em algumas modalidades da proteína da invenção, quando as primeira e/ou segunda unidades de ligação a antígeno compreendem um Fab ou um Fab com uma única cadeia, os domínios constantes podem ser do mesmo tipo (por exemplo, ambos os domínios CL são domínios constantes de cadeia leve capa ou lambda) ou de diferentes tipos (o primeiro domínio CL é um capa e o segundo domínio CL é um domínio constante de cadeia leve lambda ou vice-versa).
[0160] Em um aspecto, um ligante usado em uma proteína de ligação da presente invenção compreende 26 a 42 aminoácidos, por exemplo, 30 a 40 aminoácidos. Em um aspecto adicional, um ligante usado em uma proteína da presente invenção compreende 34 a 40 aminoácidos, por exemplo, 36 a 39 aminoácidos, por exemplo, 38 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante compreende uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95, de preferência SEQ ID NO: 89.
[0161] A sequência ligante pode ser uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência de ocorrência não natural. Se usado para fins terapêuticos, o ligante é, de preferência, não imunogênico no indivíduo ao qual a proteína de ligação da invenção é administrada.
[0162] Um grupo útil de sequências de ligação são ligantes derivados da região de dobradiça de anticorpos de cadeia pesada, conforme descrito nos documentos WO1996/34103 e WO1994/04678. Outros exemplos são sequências de ligação de poli-alanina, tais como Ala-Ala-Ala.
[0163] Outros exemplos preferidos de sequências de ligação são ligantes de Gly/Ser de comprimentos diferentes, tais como ligantes (glixsery)z incluindo, por exemplo, (gly4ser)3, (gly4ser)5, (gly4ser)7, (gly3ser)3, (gly3ser)5, (gly3ser)7, (gly3ser2)3, (gly3ser2)5 e (gly3ser2)7 ou um ligante de qualquer uma de SEQ ID Nos: 89 a 95.
[0164] Em algumas modalidades das proteínas de ligação da invenção, o domínio VL da primeira unidade de ligação a antígeno (por exemplo, definido pelas sequências de CDR de cadeia leve (LCCDR) ou VL de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6,
DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18) é covalentemente ligado (por exemplo, diretamente ligado) através de um primeiro ligante de Gly/Ser (por exemplo, ligante de Gly/Ser de qualquer um de 26 a 42 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos ou 36 a 39 aminoácidos, de preferência 38 aminoácidos) ao domínio VH da primeira unidade de ligação a antígeno (por exemplo, definido pelas sequências de CDR de cadeia pesada (HCCDR) ou VH de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18); e o domínio VL da segunda unidade de ligação a antígeno (por exemplo, definido pelas sequências de CDR de cadeia leve (LCCDR) ou VL de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3) é covalentemente ligado (por exemplo, ligado diretamente) através de um segundo ligante de Gly/Ser (por exemplo, ligante de Gly/Ser de qualquer um de 26 a 42 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos ou 36 a 39 aminoácidos, de preferência 38 aminoácidos) ao domínio VH da segunda unidade de ligação a antígeno (por exemplo, definida pelas sequências de CDR de cadeia pesada (HCCDR) ou VH de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3). Mais preferivelmente, os primeiro e segundo ligantes são iguais. Ainda mais preferivelmente, os primeiro e segundo ligantes compreendem, cada um, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
89.
[0165] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno específica para DLL3 e que compreende a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID
NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 e SEQ ID NO: 240 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 71 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno específica para CD3. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 49 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 71 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 50 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 71 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 51 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 71 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno.
[0166] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno específica para DLL3 e que compreende a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 e SEQ ID NO: 240 e um segundo Fab com uma única cadeia de SEQ ID NO: 72 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno específica para CD3. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 49 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 72 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 50 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 72 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 51 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 72 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno.
[0167] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno específica para DLL3 e que compreende a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 e SEQ ID NO: 240 e um segundo Fab com uma única cadeia de SEQ ID NO: 104 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno específica para CD3. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 49 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 104 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 50 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 104 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que forma uma primeira unidade de ligação a antígeno que compreende a sequência de SEQ ID NO: 51 e um segundo Fab com uma única cadeia que compreende a sequência de SEQ ID NO: 104 que forma uma segunda unidade de ligação a antígeno.
[0168] Em algumas modalidades, a primeira unidade de ligação a antígeno (por exemplo, DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18 conforme definido pelas sequências de CDR e/ou VH/VL descritas acima) e/ou a segunda unidade de ligação a antígeno (por exemplo, CD3#1, CD3#2 ou CD3#3) compreende um domínio VL covalentemente ligado (por exemplo, ligado diretamente) a um domínio CL e um domínio VH ligado a um domínio CH1 (isto é, juntos formam um fragmento Fab derivado de um anticorpo) e o dito domínio CH1 é ainda covalentemente ligado (por exemplo, diretamente ligado) a um domínio Fc o qual, assim, forma um braço de uma molécula de anticorpo em formato de Y convencional com uma cadeia leve e uma pesada. Em algumas modalidades, as primeira e segunda unidades de ligação a antígeno formam, cada uma, um fragmento Fab, isto é, um primeiro e um segundo fragmentos Fab, que está covalentemente ligado (por exemplo, ligado diretamente) a um primeiro e um segundo domínios Fc, respectivamente, que forma, assim, um molécula de anticorpo heterotetramérica biespecífica e bivalente convencional.
[0169] Em modalidades preferidas, a primeira unidade de ligação a antígeno (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18 conforme definido pelas sequências de CDR e/ou VH/VL descritas acima) e/ou a segunda unidade de ligação a antígeno (por exemplo, qualquer uma de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3) compreende um Fab com uma única cadeia, isto é, uma cadeia leve de anticorpo (VL- CL) ligada covalentemente ao domínio VH-CH1 de uma cadeia pesada através de um ligante peptídico (por exemplo, ligante de Gly/Ser de qualquer um de 26 a 42 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos ou 36 a 39 aminoácidos, de preferência 38 aminoácidos, ainda mais preferivelmente um ligante de SEQ ID NO: 89). Em modalidades preferidas, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira cadeia polipeptídica que compreende um primeiro Fab com uma única cadeia que se liga especificamente à DLL3 (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18, conforme definido pelas respectivas sequências de CDR ou VH/VL acima, de preferência a primeira unidade de ligação a antígeno é DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3) e um primeiro domínio Fc (esta cadeia polipeptídica também denominada aqui como "cadeia de DLL3") e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende um segundo Fab com uma única cadeia que se liga especificamente à CD3 (por exemplo, qualquer uma de CD3#1 CD3#2 ou CD3#3 conforme definido pelas respectivas sequências de CDR ou VH/VL acima) e um segundo domínio Fc (esta cadeia polipeptídica também denominada aqui como "cadeia de CD3"). Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios Fc são iguais. Em modalidades preferidas, os primeiro e segundo domínios Fc são diferentes. As proteínas de ligação resultantes da invenção trazem um Fc completo e têm dois sítios de ligação independentes, uma primeira unidade de ligação à DLL3 e uma segunda unidade de ligação à CD3. Em algumas modalidades, a primeira unidade de ligação a antígeno consiste em uma única cadeia polipeptídica (uma cadeia de DLL3). Em algumas modalidades, a segunda unidade de ligação a antígeno consiste em uma única cadeia polipeptídica (uma cadeia de CD3). Em algumas modalidades, as primeira e segunda unidades de ligação a antígeno consistem em uma única cadeia polipeptídica, respectivamente.
[0170] Em algumas modalidades, a primeira unidade de ligação a antígeno da proteína da invenção é formada por uma primeira cadeia polipeptídica (uma cadeia de DLL3) e a segunda unidade de ligação a antígeno é formada por uma segunda cadeia polipeptídica (uma cadeia de CD3). Assim, em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende duas cadeias polipeptídicas diferentes, cada uma compreendendo uma unidade de ligação a antígeno com especificidade diferente, as cadeias polipeptídicas ligadas covalentemente umas às outras por meio de ligações de dissulfeto ou potencialmente através de um ligante peptídico. Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção é uma proteína heterodimérica bivalente biespecífica que compreende duas cadeias polipeptídicas, uma cadeia polipeptídica (uma primeira cadeia polipeptídica ou cadeia de DLL3) que compreende uma unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou
DLL3#18 definida pelas respectivas sequências de CDR e/ou VH/VL) e outra cadeia polipeptídica (uma segunda cadeia polipeptídica ou cadeia de CD3) que compreende uma unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 (por exemplo, qualquer uma de CD3#1, CD3#2 ou CD3#3).
[0171] No contexto da presente invenção, um domínio Fc é, por exemplo, derivado da cadeia pesada de uma IgG, por exemplo, uma IgG1, IgG2 ou IgG4. Por exemplo, um domínio Fc da presente invenção é um domínio Fc de uma cadeia pesada de uma IgG1 ou IgG4 e compreende uma região de dobradiça e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Exemplos de domínios Fc (incluindo uma região de dobradiça) são mostrados em SEQ ID NOs: 81 e 84.
[0172] A numeração dos aminoácidos nas cadeias de aminoácidos de uma proteína da presente invenção é aqui de acordo com o sistema de numeração EU (Edelman, Cunningham et al. 1969), a menos que especificado de outra forma. Isto significa que os números de aminoácidos indicados aqui correspondem às posições em uma cadeia pesada do subtipo correspondente (por exemplo, IgG1 ou IgG4), de acordo com o sistema de numeração EU, a menos que especificado de outra forma.
[0173] Em algumas modalidades, o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc em uma proteína da presente invenção compreendem, cada um, uma ou mais alterações de aminoácidos que reduzem a formação de homodímeros das primeira ou segunda cadeias polipeptídicas em vez de heterodímeros de uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica. Através destas mudanças, uma "protusão" é gerada em um dos domínios Fc ao substituir uma ou mais cadeias laterais de pequenos aminoácidos da interface de uma das cadeias pesadas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar são criadas na interface do outro domínio Fc ao substituir grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros, em particular homodímeros do domínio Fc com a "saliência" (consulte, por exemplo, Ridgway et al.
Protein Eng, 1996. 9 (7): páginas 617-21; Atwell et al., JMB, 1997, 270, 26-35). Em algumas modalidades, estas alterações de aminoácidos são uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] do primeiro domínio Fc e uma treonina (T) na posição 407 [Y407T] do segundo domínio Fc.
Em algumas modalidades, o primeiro domínio Fc compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S] e o segundo domínio Fc compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V]. Em modalidades preferidas, o primeiro domínio Fc compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e o segundo domínio Fc compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V]. Por exemplo, a posição 366 do domínio Fc de acordo com a numeração EU, que corresponde à posição de aminoácido 146 na sequência Fc de IgG1 humana de SEQ ID NO: 81, é alterada de T na posição 146 em SEQ ID NO: 81 para W na posição 146 em SEQ ID NO: 82; e as posições 366, 368 e 407 de acordo com a numeração EU, que correspondem às posições de aminoácidos 146, 148 e 187, respectivamente, em SEQ ID NO: 81, são alteradas de T, L e Y nestas posições em SEQ ID NO: 81 para S, A e V nestas posições em SEQ ID NO: 83. Em qualquer uma destas modalidades, as alterações de aminoácidos descritas para o primeiro domínio Fc podem estar localizadas no segundo domínio Fc e as respectivas alterações de aminoácidos para o segundo domínio Fc podem estar localizadas no primeiro domínio Fc.
Em outras palavras, os termos "primeiro" e
"segundo" podem ser trocados nestas modalidades. Em algumas modalidades, tal domínio Fc é um domínio Fc derivado da cadeia pesada de uma IgG1 ou IgG4.
[0174] Em algumas modalidades, o primeiro domínio Fc compreende uma cisteína (C) na posição 354 [S354C], além de triptofano (W) na posição 366 [T366W] e o segundo domínio Fc compreende uma cisteína (C) na posição 349 [Y349C] além de serina (S) na posição 366 [T366S], a alanina (A) na posição 368 [L368A] e a valina (V) na posição 407 [Y407V]. Em um aspecto, tal domínio Fc é um domínio Fc derivado da cadeia pesada de uma IgG4.
[0175] Em algumas modalidades, o primeiro domínio Fc ou o segundo domínio Fc em uma proteína de ligação da presente invenção compreende ainda uma ou mais alterações de aminoácidos que reduzem a ligação do domínio Fc à proteína A. Em algumas modalidades, tais alterações de aminoácidos são uma arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F] de um dos domínios Fc. Ambas as alterações são derivadas da sequência de IgG3 humana (IgG3 não se liga à proteína A). Estas duas mutações estão localizadas no domínio CH3 e são incorporadas em um dos domínios Fc para reduzir a ligação à Proteína A (consulte, por exemplo, Jendeberg et al., J Immunol Methods, 1997. 201 (1): páginas 25-34). Estas duas trocas facilitam a remoção de homodímeros de cadeias pesadas que compreendem tais mudanças durante a purificação de proteínas.
[0176] Em algumas modalidades, em uma proteína de ligação da presente invenção, o domínio Fc, o qual compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], compreende ainda uma arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F]. Neste caso, a outra cadeia pesada compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y], mas não inclui as duas alterações nas posições 435 e 436.
Alternativamente, em algumas modalidades, em uma proteína da presente invenção, o domínio Fc, o qual compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], compreende ainda uma arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F]. Neste caso, o outro domínio Fc compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W], mas não inclui as duas trocas nas posições 435 e 436. Assim, o domínio Fc que compreende a troca de aminoácido que resulta em uma "cavidade" conforme descrito acima também compreende as alterações de aminoácidos, as quais reduzem a ligação à Proteína A. Os homodímeros que compreendem este domínio Fc são removidos através da ligação reduzida à Proteína A. A produção de homodímeros do outro domínio Fc, o qual compreende a "saliência", é reduzida pela presença da "saliência".
[0177] Em algumas modalidades, o domínio Fc de uma proteína da presente invenção pode ou não compreender ainda as mutações YTE (M252Y/S254T/T256E, numeração EU (Dall'Acqua, Kiener et al. 2006)). Foi demonstrado que estas mutações melhoram as propriedades farmacocinéticas dos domínios Fc através de aumento preferencial da afinidade de ligação pelo receptor FcRn neonatal em um pH de 6,0.
[0178] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo domínio Fc da presente invenção derivado de uma IgG1 também inclui mutações "KO" (L234A, L235A). Em um aspecto adicional, o primeiro e/ou o segundo domínio Fc da presente invenção derivado de uma IgG4 também inclui a mutação Pro na dobradiça (S228P).
[0179] Em modalidades preferidas da invenção, a proteína de ligação compreende i) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#1/CD3#1) ou ii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#2/CD3#1) ou iii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#3/CD3#1) ou iv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#4/CD3#1) ou v) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#5/CD3#1) ou vi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#6/CD3#1); ou vii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 241 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#7/CD3#1); ou viii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 242 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#8/CD3#1); ou ix) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#9/CD3#1); ou x) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#10/CD3#1); ou xi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 245 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#11/CD3#1); ou xii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#12/CD3#1); ou xiii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#13/CD3#1); ou xiv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 248 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#14/CD3#1); ou xv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 249 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#15/CD3#1); ou xvi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 250 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#16/CD3#1); ou xvii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 251 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#17/CD3#1); ou xviii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 252 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 (DLL3#18/CD3#1). De preferência, as primeira e segunda cadeias polipeptídicas são ligadas através de uma ou mais ligações de dissulfeto e formam uma estrutura similar a um anticorpo (Figura 1) similar a uma molécula de anticorpo em formato de
Y convencional.
[0180] Em outra modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.
[0181] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.
[0182] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.
[0183] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.
[0184] Em modalidades preferidas da invenção, a proteína de ligação compreende i) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#1/CD3#2) ou ii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#2/CD3#2) ou iii)
uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#3/CD3#2) ou iv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#4/CD3#2) ou v) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#5/CD3#2) ou vi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#6/CD3#2); ou vii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 241 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#7/CD3#2); ou viii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 242 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#8/CD3#2); ou ix) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#9/CD3#2); ou x) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#10/CD3#2); ou xi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 245 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#11/CD3#2); ou xii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246 e um segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#12/CD3#2); ou xiii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#13/CD3#2); ou xiv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 248 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#14/CD3#2); ou xv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 249 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#15/CD3#2); ou xvi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 250 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#16/CD3#2); ou xvii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 251 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#17/CD3#2); ou xviii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 252 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 (DLL3#18/CD3#2). De preferência, as primeira e segunda cadeias polipeptídicas são ligadas através de uma ou mais ligações de dissulfeto e formam uma estrutura similar a um anticorpo (Figura 1) similar a uma molécula de anticorpo em formato de Y convencional.
[0185] Em outra modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.
[0186] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.
[0187] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.
[0188] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.
[0189] Em modalidades preferidas da invenção, a proteína de ligação compreende i) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#1/CD3#3) ou ii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#2/CD3#3) ou iii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105
(DLL3#3/CD3#3) ou iv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#4/CD3#3) ou v) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#5/CD3#3) ou vi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#6/CD3#3); ou vii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 241 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#7/CD3#3); ou viii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 242 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#8/CD3#3); ou ix) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#9/CD3#3); ou x) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#10/CD3#3); ou xi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 245 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#11/CD3#3); ou xii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105
(DLL3#12/CD3#3); ou xiii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#13/CD3#3); ou xiv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 248 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#14/CD3#3); ou xv) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 249 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#15/CD3#3); ou xvi) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 250 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#16/CD3#3); ou xvii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 251 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#17/CD3#3); ou xviii) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 252 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 (DLL3#18/CD3#3). De preferência, as primeira e segunda cadeias polipeptídicas são ligadas através de uma ou mais ligações de dissulfeto e formam uma estrutura similar a um anticorpo (Figura 1) similar a uma molécula de anticorpo em formato de Y convencional.
[0190] Em outra modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
[0191] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
[0192] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
[0193] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
[0194] Para todas as modalidades anteriores, deve ser entendido que, ao usar o termo "que compreende ", pretende-se também incluir uma modalidade na qual o respectivo domínio ou molécula "consiste" na sequência de aminoácidos conforme indicado.
[0195] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína que compreende uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 e uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3, em que a primeira cadeia compreende uma primeira cadeia leve ligada covalentemente (por exemplo, ligada diretamente) a um primeiro ligante a qual, por sua vez, está ligada covalentemente (por exemplo, diretamente ligada) a uma primeira cadeia pesada e em que a segunda cadeia que se liga especificamente à CD3 compreende uma segunda cadeia leve ligada covalentemente (por exemplo, diretamente ligada) a um segundo ligante a qual está, em si, ligada covalentemente (por exemplo diretamente ligada) a uma segunda cadeia pesada.
[0196] Em algumas modalidades, a partir de seu N-término, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma primeira região variável de cadeia leve que se liga especificamente à DLL3, uma primeira região constante de cadeia leve, um primeiro ligante, uma primeira região variável de cadeia pesada específica para DLL3 e uma primeira região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, a partir de seu N-término, a segunda cadeia polipeptídica compreende uma segunda região variável de cadeia leve que se liga especificamente à CD3, uma segunda região constante de cadeia leve, um segundo ligante, uma segunda região variável de cadeia pesada específica para CD3 e uma segunda região constante de cadeia pesada.
[0197] As proteínas resultantes trazem um Fc completo, o qual é marginalmente maior do que uma IgG e tem dois sítios de ligação independentes (por exemplo, cada sítio de ligação sendo monovalente para o respectivo antígeno), um primeiro sítio de ligação à DLL3 e um segundo sítio de ligação à CD3. De preferência, as primeira e segunda cadeias polipeptídicas são ligadas através de uma ou mais ligações de dissulfeto. Como tal, as proteínas da invenção são estruturas similares a anticorpos que têm a estrutura em formato de Y de um anticorpo de comprimento total convencional (consulte Figura 1). Este formato biespecífico reduz grandemente a heterogeneidade após expressão e purificação (por exemplo, ao evitar o emparelhamento incorreto de domínios variáveis leves e pesados com diferentes especificidades de ligação), ao mesmo tempo em que retém as propriedades funcionais das porções de ligação dentro de uma estrutura menos provável de gerar reações imunogênicas indesejadas. Isto também permite uma boa expressão de proteínas heterodiméricas, por exemplo, em células de mamíferos.
[0198] Em algumas modalidades da proteína da invenção, a primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve e um primeiro domínio variável de cadeia pesada que compreende sequências de CDR selecionadas a partir do grupo que consiste em i) a xviii): i) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e um CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); ii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); iii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); iv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (CDR1), SEQ ID NO: 20 (CDR2) e SEQ ID NO: 21 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 22 (CDR1), SEQ ID NO: 23 (CDR2) e SEQ ID NO: 24 (CDR3); v) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1), SEQ ID NO: 26 (CDR2) e SEQ ID NO: 27 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 28 (CDR1), SEQ ID NO: 29 (CDR2) e SEQ ID NO: 30 (CDR3); e vi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (CDR1), SEQ ID NO: 32 (CDR2) e SEQ ID NO: 33 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (CDR1), SEQ ID NO: 35 (CDR2) e SEQ ID NO: 36 (CDR3); vii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (CDR1), SEQ ID NO: 134 (CDR2) e SEQ ID NO: 135 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 136 (CDR1), SEQ ID NO: 137 (CDR2) e SEQ ID NO: 138 (CDR3); viii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 (CDR1), SEQ ID NO: 140 (CDR2) e SEQ ID NO: 141 (CDR3) e pesado CDRs da cadeia que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 (CDR1), SEQ ID NO: 143 (CDR2) e SEQ ID NO: 144 (CDR3); ix) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (CDR1), SEQ ID NO: 146 (CDR2) e SEQ ID NO: 147 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 148 (CDR1), SEQ ID NO: 149 (CDR2) e SEQ ID NO: 150 (CDR3); x) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 (CDR1), SEQ ID NO: 152 (CDR2) e SEQ ID NO: 153 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 154 (CDR1), SEQ ID NO: 155 (CDR2) e SEQ ID NO: 156 (CDR3); xi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 (CDR1), SEQ ID NO: 158 (CDR2) e SEQ ID NO: 159 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 160 (CDR1), SEQ ID NO: 161 (CDR2) e SEQ ID NO: 162 (CDR3);
xii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 (CDR1), SEQ ID NO: 164 (CDR2) e SEQ ID NO: 165 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 166 (CDR1), SEQ ID NO: 167 (CDR2) e SEQ ID NO: 168 (CDR3); xiii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (CDR1), SEQ ID NO: 170 (CDR2) e SEQ ID NO: 171 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 172 (CDR1), SEQ ID NO: 173 (CDR2) e SEQ ID NO: 174 (CDR3); xiv) que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 (CDR1), SEQ ID NO: 176 (CDR2) e SEQ ID NO: 177 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 (CDR1), SEQ ID NO: 179 (CDR2) e SEQ ID NO: 180 (CDR3); xv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 (CDR1), SEQ ID NO: 182 (CDR2) e SEQ ID NO: 183 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 184 (CDR1), SEQ ID NO: 185 (CDR2) e SEQ ID NO: 186 (CDR3); xvi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 (CDR1), SEQ ID NO: 188 (CDR2) e SEQ ID NO: 189 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 190 (CDR1), SEQ ID NO: 191 (CDR2) e SEQ ID NO: 192 (CDR3); xvii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 (CDR1), SEQ ID NO: 194 (CDR2) e SEQ ID NO: 195 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 196
(CDR1), SEQ ID NO: 197 (CDR2) e SEQ ID NO: 198 (CDR3); e xviii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 (CDR1), SEQ ID NO: 200 (CDR2) e SEQ ID NO: 201 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 202 (CDR1), SEQ ID NO: 203 (CDR2) e SEQ ID NO: 204 (CDR3).
[0199] Os respectivos domínios variáveis de cadeias leve/pesada definidos por estas sequências de CDR são denominados DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 e DLL3#18, respectivamente. De preferência, as sequências de CDR são selecionadas a partir do grupo que consiste em i) a iii) (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3) conforme definido acima.
[0200] Em modalidades preferidas da proteína de ligação da invenção, a dita segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 compreende um segundo domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio variável de cadeia pesada que compreende sequências de CDR selecionadas a partir do grupo que consiste em: i) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3); ii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3); e iii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 (CDR1), SEQ ID NO: 97 (CDR2) e SEQ ID NO: 98 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 (CDR1), SEQ ID NO: 100 (CDR2) e SEQ ID NO: 101 (CDR3).
[0201] Os respectivos domínios variáveis de cadeias leve/pesada definidos por estas sequências de CDR são denominados CD3#1, CD3#2 e CD3#3, respectivamente.
[0202] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e um primeiro domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um segundo domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e um segundo domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3).
[0203] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e um primeiro domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um segundo domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e um segundo domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3)
[0204] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e um primeiro domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um segundo domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e um segundo domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3).
[0205] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2
(CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e um primeiro domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um segundo domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e um segundo domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3).
[0206] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e um primeiro domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um segundo domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e um segundo domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3)
[0207] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e um primeiro domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um segundo domínio variável de cadeia leve com CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e um segundo domínio variável de cadeia pesada com CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3)
[0208] Em modalidades preferidas da proteína da invenção, a dita primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 compreende um domínio variável de cadeia leve (um primeiro domínio variável de cadeia leve) e um domínio variável de cadeia pesada (um primeiro domínio variável de cadeia pesada) selecionado a partir do grupo que consiste em i) a xviii): i) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 (DLL3#1); ii) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 (DLL3#2); iii) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de
SEQ ID NO: 42 (DLL3#3); iv) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 (DLL3#4); v) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 (DLL3#5); vi) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 (DLL3#6); vii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 (DLL3#7); viii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 (DLL3#8); ix) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 (DLL3#9); x) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212 (DLL3#10); xi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 (DLL3#11); xii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216 (DLL3#12); xiii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 218 (DLL3#13); xiv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 219 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220 (DLL3#14); xv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222 (DLL3#15); xvi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 224 (DLL3#16); xvii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 226 (DLL3#17); e xviii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 228 (DLL3#18).
[0209] De preferência, as sequências de domínio variável de cadeia leve e variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste em i) a iii) (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3) conforme definido acima.
[0210] Em modalidades preferidas da proteína da invenção, a dita segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 compreende um domínio variável de cadeia leve (um segundo domínio variável de cadeia leve) e um domínio variável de cadeia pesada (um segundo domínio variável de cadeia pesada) selecionado a partir do grupo consiste em: i) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 (CD3#1); ii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 (CD3#2); e iii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 (CD3#3).
[0211] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira e uma segunda cadeias polipeptídicas que compreendem sequências de CDR e/ou VH e VL dos domínios variáveis de cadeias leve/pesada selecionados a partir da lista que consiste em DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1,
DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 e DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, D LL3#18/CD3#3. Em modalidades preferidas, a proteína de ligação da invenção compreende uma primeira e uma segunda cadeias polipeptídicas que compreendem sequências de CDR e/ou VH e VL dos domínios variáveis de cadeias leve/pesada selecionados a partir da lista que consiste em DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3 e DLL3#3/CD3#3.
[0212] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 38; e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 68.
[0213] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 40; e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N O: 67 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 68.
[0214] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42; e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 68.
[0215] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 38; e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 70.
[0216] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 40; e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 70.
[0217] Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação da invenção compreende (i) uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42; e (ii) uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 70.
[0218] Em algumas modalidades da invenção, os primeiro e/ou segundo ligantes peptídicos compreendem um ligante conforme descrito acima, por exemplo, um ligante derivado de uma região de dobradiça, um ligante de poli-alanina ou um ligante de Gly/Ser, em que o ligante compreende 26 a 42 aminoácidos, por exemplo, qualquer um de 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos ou 36 a 39 aminoácidos, de preferência 38 aminoácidos.
[0219] Em modalidades preferidas, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 ou SEQ ID NO: 240 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
[0220] Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 ou SEQ ID NO: 240 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.
[0221] Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 ou SEQ ID NO: 240 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104.
[0222] Em uma modalidade preferida, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
[0223] Em uma modalidade preferida, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
[0224] Em uma modalidade preferida, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
[0225] Em uma modalidade preferida, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.
[0226] Em uma modalidade preferida, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.
[0227] Em uma modalidade preferida, a primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.
[0228] Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, as primeira e segunda cadeias polipeptídicas compreendem um domínio Fc derivado da cadeia pesada de uma IgG, por exemplo, uma IgG1, IgG2 ou IgG4. Por exemplo, um domínio Fc da presente invenção é um domínio Fc de uma cadeia pesada de uma IgG1 ou IgG4 e compreende uma região de dobradiça e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Exemplos de domínios Fc de IgGs humanas são mostrados em SEQ ID NOs: 81 e 84.
[0229] Em algumas modalidades da proteína de ligação da invenção, a cadeia pesada compreende uma ou mais alterações de aminoácidos. Por exemplo, estas alterações de aminoácidos são uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] da primeira cadeia pesada e uma treonina (T) na posição 407 [Y407T] da segunda cadeia pesada. Em algumas modalidades, a primeira cadeia pesada compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S] e a segunda cadeia pesada compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V]. Em modalidades preferidas, a primeira cadeia pesada compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e a segunda cadeia pesada compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V]. Por exemplo, a posição 366 do domínio Fc de acordo com a numeração EU,
que corresponde à posição de aminoácido 146 na sequência Fc de IgG1 humana de SEQ ID NO: 81, é alterada de T na posição 146 em SEQ ID NO: 81 para W na posição 146 em SEQ ID NO: 82; e as posições 366, 368 e 407 de acordo com a numeração EU, que correspondem às posições de aminoácidos 146, 148 e 187, respectivamente, em SEQ ID NO: 81, são alteradas de T, L e Y nestas posições em SEQ ID NO: 81 para S, A e V nestas posições em SEQ ID NO: 83. Em qualquer uma destas modalidades, as alterações de aminoácidos descritas para a primeira cadeia pesada podem estar localizadas na segunda cadeia pesada e as respectivas alterações de aminoácidos para a segunda cadeia pesada podem estar localizadas na primeira cadeia pesada. Em outras palavras, os termos "primeiro" e "segundo" podem ser trocados nestas modalidades. Em algumas modalidades, a cadeia pesada é derivada da cadeia pesada de uma IgG1 ou IgG4.
[0230] Em algumas modalidades, a primeira cadeia pesada ou a segunda cadeia pesada em uma proteína da presente invenção compreende ainda uma ou mais alterações de aminoácidos que reduzem a ligação da cadeia pesada à proteína A. Em algumas modalidades, tais alterações de aminoácidos são um arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F] de uma das cadeias pesadas.
[0231] Em algumas modalidades, em uma proteína da presente invenção, a cadeia pesada, a qual compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], compreende ainda uma arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F]. Neste caso, a outra cadeia pesada compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y], mas não inclui as duas trocas nas posições 435 e 436. Alternativamente, em algumas modalidades, em uma proteína da presente invenção, a cadeia pesada, a qual compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], compreende ainda uma arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F]. Neste caso, a outra cadeia pesada compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W], mas não inclui as duas trocas nas posições 435 e 436. Assim, a cadeia pesada que compreende a troca de aminoácido que resulta em uma "cavidade" conforme descrito acima também compreende as alterações de aminoácidos que reduzem a ligação à Proteína A. Os homodímeros que compreendem estas cadeias pesadas são removidos através da ligação reduzida à Proteína A. A produção de homodímeros da outra cadeia pesada, a qual compreende a "saliência", é reduzida pela presença da "saliência".
[0232] Em algumas modalidades, a cadeia pesada de uma proteína da presente invenção pode ou não compreender ainda mutações YTE (M252Y/S254T/T256E, numeração EU (Dall'Acqua, Kiener et al. 2006)). Foi demonstrado que estas mutações melhoram as propriedades farmacocinéticas da cadeia pesada através de aumento preferencial da afinidade de ligação pelo receptor FcRn neonatal em um pH de 6,0.
[0233] Em algumas modalidades, as primeira e/ou segunda cadeias pesadas da presente invenção derivadas de uma IgG1 também incluem mutações "KO" (L234A, L235A). Em um aspecto adicional, as primeira e/ou segunda cadeias pesadas da presente invenção derivadas de uma IgG4 também incluem a mutação Pro na dobradiça (S228P).
[0234] Em um outro aspecto, as proteínas da invenção compreendem uma primeira unidade de ligação a antígeno ou cadeia polipeptídica específica para DLL3 que tem, de preferência, uma afinidade de ≤ 10 nM, mais preferivelmente ≤ 1 nM, ainda mais preferivelmente ≤ 0,1 nM, ainda mais preferivelmente < 0,01 nM pela DLL humana e de macaco cynomolgus. A afinidade pode ser medida em um ensaio SPR (BIAcore) usando proteína DLL3 recombinante conforme descrito, por exemplo, nos exemplos ou outros métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. As proteínas compreendem uma segunda unidade de ligação a antígeno ou cadeia polipeptídica que tem, de preferência, uma afinidade de < 500 nM, mais preferivelmente < 100 nM, ainda mais preferivelmente < 10 nM pelo complexo CD3Ɛγ humano e de macaco cynomolgus.
[0235] Em um aspecto adicional, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da invenção não se ligam a células negativas para DLL3 e não apresentam reação cruzada com os parálogos DLL1 e DLL4 humano e DLL3, conforme mostrado no Exemplo 5.
[0236] Em um aspecto adicional, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da presente invenção compreendem uma primeira unidade de ligação a antígeno ou uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente ao peptídeo proximal da membrana da proteína DLL3. Em um aspecto adicional, as proteínas da invenção exibem ligação fraca a células que expressam a proteína DLL3, por exemplo, nenhuma saturação da ligação da proteína à superfície celular é alcançada até uma concentração de 100 nM (consulte, por exemplo, Figura 6).
[0237] Em um aspecto adicional, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da presente invenção são capazes de mediar a citotoxicidade contra células tumorais, fornecendo condições estéricas ideais para a formação de uma sinapse citolítica entre uma célula tumoral que expressa DLL3 e uma célula T, a fim de redirecionar a atividade das células T seletivamente para as células tumorais alvo, levando à lise das células tumorais.
[0238] Vários métodos podem ser usados para medir a citotoxicidade mediada pelas proteínas de ligação à DLL3/CD3 da presente invenção. Por exemplo, a citotoxicidade pode ser medida usando o método descrito no Exemplo 10. As células efetoras podem ser, por exemplo, células T estimuladas ou não estimuladas (ser humano ou macaco cynomolgus) ou seus subconjuntos (por exemplo,
CD4, CD8) ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) não estimuladas (ser humano ou macaco cynomolgus). As células alvo devem expressar pelo menos o domínio extracelular de DLL3 (ser humano ou macaco cynomolgus) e podem ser células com expressão de DLL3 endógena (natural), tais como as linhagens de células de carcinoma de pulmão de células pequenas humanas SHP77, NCI-H82, alternativamente também células recombinantes que expressam a DLL3 de comprimento total ou o domínio extracelular de DLL3. A proporção de efetor para a célula alvo (E:T) é geralmente cerca de 10:1, mas pode variar. A atividade citotóxica de moléculas de ligação à DLL3/CD3 pode ser determinada, por exemplo, em um ensaio de liberação de LDH após 48 ou 72 horas de incubação. Modificações no tempo de incubação e na leitura usada para determinação da citotoxicidade são possíveis e conhecidas por aqueles versados na técnica. Os sistemas de leitura para citotoxicidade podem compreender ensaios MTT/MTS, ensaios com base em ATP, ensaios com base em FACS, ensaios de liberação de 51-cromo, ensaios sulforrodamina B (SRB), ensaios colorimétricos (WST), ensaios clonogênicos, a tecnologia ECIS e ensaios bioluminescentes.
[0239] A atividade citotóxica mediada pelas proteínas de ligação à DLL3/CD3 da presente invenção é, de preferência, medida em um ensaio de citotoxicidade com base em células. A citotoxicidade é representada pelos valores de EC90 medidos no ensaio de citotoxicidade. Aqueles versados na técnica estão cientes de que pode- se esperar uma EC90 menor quando células T purificadas são usadas como células efetoras, comparado com PBMCs. Aqueles versados na técnica também estão cientes de que a EC90 pode ser ainda mais baixa quando células T estimuladas são usadas. Além disso, pode-se esperar que os valores de EC90 sejam mais baixos quando as células alvo expressam um alto número de moléculas de DLL3 na superfície celular comparado com a célula que expressa um baixo número de moléculas de DLL3 na superfície celular. A EC90 da proteína de ligação à DLL3/CD3 é, de preferência, < 10 nM, mais preferivelmente < 5 nM e, ainda mais preferivelmente, < 1 nM.
[0240] De preferência, as proteínas de ligação multiespecíficas da invenção não induzem/mediam a lise de células DLL3-negativas. O termo "não induz/media a lise" de células DLL3-negativas significa que uma molécula de ligação à DLL3/CD3 não induz ou media a lise de mais de 30 %, de preferência não mais de 20 %, mais preferivelmente não mais de 10 % e, em particular, não mais de 5 % ou células DLL3- negativas, enquanto que a lise da linha de células de carcinoma do pulmão DLL3-positivas é definida como 100 %. Isto geralmente se aplica a concentrações da proteína de ligação de até 1000 nM.
[0241] De preferência, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da invenção não são internalizadas pelas células alvo. A taxa de internalização pode ser avaliada, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 11. De preferência, a taxa de internalização (por exemplo, medida como uma diminuição na citotoxicidade) é de < 50 % após uma pré-incubação de 4 horas das proteínas de ligação à DLL3/CD3 com as células alvo, mais preferivelmente < 40 % e, ainda mais preferivelmente, < 30 %.
[0242] Além disso, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da invenção são mostradas como estáveis com um teor de monômeros acima de 95 % (por exemplo, pelo menos 98 %, consulte Exemplo 14), têm propriedades farmacocinéticas favoráveis e boa capacidade de produção a jusante e espera-se ainda que tenham uma boa biodistribuição (consulte, por exemplo, Exemplo 12). As proteínas da presente invenção, além disso, têm um perfil de imunogenicidade favorável (consulte Exemplo 16) e têm boa estabilidade in vitro e in vivo (consulte, por exemplo, Exemplos 12 e 15). Além disso, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da invenção (por exemplo, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2) mostram eficácia favorável em um modelo de xenoenxerto de camundongo in vivo humanizado. As proteínas de ligação à DLL3/CD3 induziram à forte regressão tumoral começando já após a primeira dose de proteínas de ligação à DLL3/CD3. Além disso, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da invenção induzem à regressão do tumor em doses muito baixas de 0,25 mg/kg administradas uma vez por semana (q7d), sustentando adicionalmente sua aplicabilidade terapêutica. Em particular, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 da invenção induzem à proliferação seletiva de células T, ativação de células T, desgranulação de células T e secreção de citocinas (consulte Exemplo 18) apenas na presença de células alvo DLL3-positivas e não na presença de células alvo DLL3-negativas e aumentam ainda mais significativamente a infiltração de células T no tecido tumoral (consulte Exemplo 20). Além disso, o Exemplo 19 demonstra que as proteínas de ligação à DLL3/CD3 mediam a lise redirecionada de células T CD4+, bem como CD8+. Em particular, as células T virgens, bem como células T de memória efetoras CD4+, de memória central CD4+, efetoras CD8+ CD45RA+ e de memória CD8+ contribuem para a lise redirecionada das células T das células tumorais que expressam DLL3.
[0243] Um outro aspecto da presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificam as primeira e/ou segunda unidades de ligação a antígeno de uma proteína de ligação multiespecífica da invenção. Em algumas modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos codificam ainda um primeiro e/ou segundo domínio Fc, conforme descrito aqui, os primeiro e/ou segundo domínios Fc ligados à extremidade 3' da molécula de ácidos nucleicos que codifica as primeira e/ou segunda unidade de ligação a antígeno, respectivamente. Em algumas modalidades, a molécula de ácidos nucleicos codifica i) uma primeira cadeia polipeptídica que compreende um primeiro Fab com uma única cadeia específico para DLL3 (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 e DLL3#18) e opcionalmente um primeiro domínio Fc e/ou ii) uma segunda cadeia polipeptídica que compreende um segundo Fab com uma única cadeia específico para CD3 (por exemplo, qualquer uma de CD3#1, CD3#2 e CD3#3) e opcionalmente um segundo domínio Fc.
[0244] De preferência, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um primeiro Fab com uma única cadeia de qualquer uma de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO : 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 ou SEQ ID NO: 240 e/ou um segundo Fab com uma única cadeia de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 104. Em algumas modalidades, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma primeira cadeia polipeptídica de qualquer uma de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO; 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e/ou uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 105.
[0245] Um outro aspecto da invenção fornece um vetor de expressão que contém uma molécula de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica os primeiro e/ou segundo domínios de ligação a antígeno (por exemplo, um primeiro e/ou segundo
Fab com uma única cadeia da invenção). De preferência, o vetor de expressão compreende, além disso, uma molécula de ácidos nucleicos, de preferência uma molécula de DNA, que codifica um primeiro e/ou segundo domínio Fc, ligado à molécula de ácidos nucleicos, de preferência a molécula de DNA que codifica os primeiro e/ou segundo domínios de ligação a antígeno (por exemplo, primeiro e/ou segundo Fab com uma única cadeia, respectivamente). Como tal, o vetor de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia polipeptídica que compreende um primeiro Fab com uma única cadeia ligado a um primeiro domínio Fc e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia polipeptídica que compreende um segundo Fab com uma única cadeia ligado a um segundo domínio Fc.
[0246] Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém uma molécula de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica as primeira e/ou segunda cadeias polipeptídicas da invenção. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica uma primeira cadeia polipeptídica de qualquer uma de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO; 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e/ou uma segunda cadeia polipeptídica que compreende SEQ I D NO: 79.
[0247] Em outras modalidades preferidas, o vetor de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica uma primeira cadeia polipeptídica de qualquer uma de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO; 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248,
SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e/ou uma segunda cadeia polipeptídica que compreende SEQ ID NO: 80.
[0248] Em outras modalidades preferidas, o vetor de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica uma primeira cadeia polipeptídica de qualquer uma de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO; 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e/ou uma segunda cadeia polipeptídica que compreende SEQ ID NO: 105.
[0249] Em uma modalidade especificamente preferida, dois vetores de expressão podem ser usados, um deles para a expressão da primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3, o outro para a expressão da segunda cadeia polipeptídica específica para CD3, em que dois vetores de expressão podem, então, ser ambos transfectados em uma célula hospedeira para expressão de proteína recombinante.
[0250] De preferência, o vetor de expressão será um vetor que compreende a dita molécula ou moléculas de ácidos nucleicos operativamente ligada a pelo menos uma sequência reguladora, em que tal sequência reguladora pode ser um promotor, intensificador ou sequência terminadora e, mais preferivelmente, um promotor, intensificador ou sequência terminadora heteróloga.
[0251] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira que tem um vetor de expressão que codifica uma primeira cadeia polipeptídica específica para DLL3 da invenção e um vetor de expressão que codifica uma segunda cadeia polipeptídica específica para CD3 da invenção.
[0252] De acordo com uma modalidade particularmente preferida,
as ditas células hospedeiras são células eucariotas, tais como células de mamíferos. Em outra modalidade, tais células hospedeiras são células bacterianas. Outras células úteis são células de levedura ou outras células fúngicas.
[0253] Células de mamífero adequadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS e assim por diante. No entanto, células de anfíbios, células de insetos, células vegetais e quaisquer outras células usadas na técnica para expressão de proteínas heterólogas também podem ser usadas. ANTICORPOS ANTI-DLL3
[0254] A DLL3 é normalmente expressa em membranas intracelulares, incluindo aquelas do aparelho de Golgi no cérebro fetal, e desempenha um papel fundamental na somitogênese no mesoderma paraxial (Geffers et al., J Cell Biol. 2007; 178: 465; Chapman et al., Hum. Mol. Genet. 2011; 20: 905–916). A indução marcada da expressão de DLL3 em alguns tipos de tumor, incluindo SCLC, LCNEC e glioblastoma, resulta na localização na superfície celular: isto, juntamente com a ausência de DLL3 na superfície celular detectável em células não malignas, abre uma nova janela de oportunidade para terapia de células tumorais e para o uso de anticorpos anti-DLL3 como ferramentas de diagnóstico e prognóstico.
[0255] Vários anticorpos anti-DLL3 (tais como LS-c167440, Lifespan; AP21739PU-N, Acris; LS-C148700, LSBio) estão disponíveis comercialmente. No entanto, estes anticorpos não têm um bom desempenho em ensaios de imuno-histoquímica (IHC), FACS e ELISA e não se ligam especificamente à proteína DLL3 expressa nas células, particularmente células tumorais. Anticorpos anti-DLL3 também foram relatados, por exemplo, no documento WO2007111733, e sugeridos para uso diagnóstico em pacientes com glioma, mas nenhum dado de ensaios de IHC são mostrados. Assim, o uso de anticorpos anti-DLL3 como ferramentas diagnósticas confiáveis para medir com precisão a expressão de DLL3 em pacientes, por exemplo, em células/tecidos tumorais, e/ou para avaliar a eficácia de terapias direcionadas à DLL3 permanece um desafio.
[0256] Assim, há uma necessidade de identificar anticorpos anti- DLL3 alternativos os quais possam ser usados para detecção precisa e específica da expressão da proteína DLL3 em vários ensaios, tais como FACS, ELISA, imunoprecipitação, Western blotting, ELISA, radioimunoensaio, citometria de fluxo, IHC e ensaios imunométricos em qualquer tipo de amostra biológica e possam ser usados como reagentes diagnósticos confiáveis.
[0257] Portanto, um outro aspecto da invenção fornece moléculas de anticorpo anti-DLL3 que compreendem: i) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); ou ii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); ou iii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); ou iv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (CDR1), SEQ ID NO: 20 (CDR2) e
SEQ ID NO: 21 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 22 (CDR1), SEQ ID NO: 23 (CDR2) e SEQ ID NO: 24 (CDR3); ou v) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1), SEQ ID NO: 26 (CDR2) e SEQ ID NO: 27 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 28 (CDR1), SEQ ID NO: 29 (CDR2) e SEQ ID NO: 30 (CDR3); ou vi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (CDR1), SEQ ID NO: 32 (CDR2) e SEQ ID NO: 33 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 34 (CDR1), SEQ ID NO: 35 (CDR2) e SEQ ID NO: 36 (CDR3); ou vii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (CDR1), SEQ ID NO: 134 (CDR2) e SEQ ID NO: 135 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 136 (CDR1), SEQ ID NO: 137 (CDR2) e SEQ ID NO: 138 (CDR3); ou viii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 (CDR1), SEQ ID NO: 140 (CDR2) e SEQ ID NO: 141 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 142 (CDR1), SEQ ID NO: 143 (CDR2) e SEQ ID NO: 144 (CDR3); ou ix) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (CDR1), SEQ ID NO: 146 (CDR2) e SEQ ID NO: 147 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 148 (CDR1), SEQ ID NO: 149 (CDR2) e SEQ ID NO: 150 (CDR3); ou x) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 (CDR1), SEQ ID NO: 152 (CDR2) e
SEQ ID NO: 153 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 154 (CDR1), SEQ ID NO: 155 (CDR2) e SEQ ID NO: 156 (CDR3); ou xi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 (CDR1), SEQ ID NO: 158 (CDR2) e SEQ ID NO: 159 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 160 (CDR1), SEQ ID NO: 161 (CDR2) e SEQ ID NO: 162 (CDR3); ou xii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 (CDR1), SEQ ID NO: 164 (CDR2) e SEQ ID NO: 165 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 166 (CDR1), SEQ ID NO: 167 (CDR2) e SEQ ID NO: 168 (CDR3); ou xiii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (CDR1), SEQ ID NO: 170 (CDR2) e SEQ ID NO: 171 (CDR3) e CDRs da cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 (CDR1), SEQ ID NO: 173 (CDR2) e SEQ ID NO: 174 (CDR3); ou xiv) que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 (CDR1), SEQ ID NO: 176 (CDR2) e SEQ ID NO: 177 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 (CDR1), SEQ ID NO: 179 (CDR2) e SEQ ID NO: 180 (CDR3); ou xv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 (CDR1), SEQ ID NO: 182 (CDR2) e SEQ ID NO: 183 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 184 (CDR1), SEQ ID NO: 185 (CDR2) e SEQ ID NO: 186 (CDR3); ou xvi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 (CDR1), SEQ ID NO: 188 (CDR2) e SEQ ID NO: 189 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 190 (CDR1), SEQ ID NO: 191 (CDR2) e SEQ ID NO: 192 (CDR3); ou xvii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 (CDR1), SEQ ID NO: 194 (CDR2) e SEQ ID NO: 195 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 196 (CDR1), SEQ ID NO: 197 (CDR2) e SEQ ID NO: 198 (CDR3); ou xviii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 (CDR1), SEQ ID NO: 200 (CDR2) e SEQ ID NO: 201 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 202 (CDR1), SEQ ID NO: 203 (CDR2) e SEQ ID NO: 204 (CDR3).
[0258] Os anticorpos i) para xviii), conforme descrito acima, são denominados DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18, respectivamente. É fornecida aqui uma tabela de sequências que permite prontamente a identificação de sequências de aminoácidos individuais para anticorpos específicos da presente invenção.
[0259] Em modalidades preferidas da invenção, a molécula de anticorpo compreende sequências de CDR conforme definido em i) ou v) acima, que correspondem a DLL3#1 ou DLL3#5.
[0260] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-DLL3 da invenção é uma molécula de anticorpo quimérica, humanizada ou humana. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo é um anticorpo monoclonal Fab, F(ab)2, Fv ou scFv. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção compreende uma região constante de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia leve da molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção é capa ou lambda.
[0261] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-DLL3 da invenção tem um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85 % idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 e 228. De preferência, a molécula de anticorpo tem um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 ou 228.
[0262] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 tem um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85 % idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 e 227. De preferência, a molécula de anticorpo tem um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 ou 227.
[0263] Métodos de cálculo de identidades de sequência de aminoácidos são bem conhecidos na técnica e discutidos aqui na seção Definições do relatório descritivo.
[0264] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 tem i) um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 (DLL3#1) ou ii) um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 (DLL3#2); ou iii) um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 (DLL3#3) ou iv) um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 (DLL3#4); ou v) um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 (DLL3#5); ou vi) um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 (DLL3#6); ou vii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 (DLL3#7); ou viii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 (DLL3#8); ou ix) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 (DLL3#9); ou x) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212 (DLL3#10); ou xi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 (DLL3#11); ou xii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216 (DLL3#12); ou xiii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 218 (DLL3#13); ou xiv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 219 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220 (DLL3#14); ou xv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222 (DLL3#15); ou xvi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 224 (DLL3#16); ou xvii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 226 (DLL3#17); ou xviii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 (DLL3#18).
[0265] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-DLL3 da invenção é um anticorpo monoclonal de camundongo. No contexto da presente invenção, um anticorpo monoclonal de camundongo inclui um anticorpo no qual a VH e a VL são obtidas a partir da imunização de camundongos com a proteína DLL3 humana, subsequente seleção de sequências de VH e VL adequadas que se ligam com determinada afinidade à DLL3 humana e, em seguida, união de tais sequências de VH e VL a domínios constantes que são derivados de camundongo (por exemplo, de IgG2a de camundongo) através de técnicas recombinantes; e que são produzidos por meio de expressão recombinante em células hospedeiras. Ainda abrangidos pela invenção estão anticorpos quiméricos, por exemplo, que compreendem regiões variáveis e constantes de diferentes espécies. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo da invenção é um anticorpo quimérico que compreende domínios VH e VL derivados de camundongo, conforme descrito acima, e que compreendem ainda domínios constantes derivados de outras espécies, tais como ser humano, coelho, rato, cabra, burro. Em algumas modalidades, o anticorpo quimérico compreende domínios VH e VL derivados de camundongo e ainda humanizados ou com sequência otimizada conforme definido acima e compreende ainda domínios constantes derivados de outra espécie. Em algumas modalidades, o anticorpo quimérico compreende domínios VH e VL derivados de um animal transgênico (por exemplo, um camundongo) que compreende sequências de IgG humana, portanto, compreende sequências de VH e VL humanas e compreende ainda domínios constantes derivados de outra espécie. Em qualquer uma das modalidades de anticorpos quiméricos, conforme descrito acima, a região constante de cadeia pesada é uma região de cadeia pesada de camundongo, humano, coelho, rato, cabra ou burro.
[0266] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção tem um domínio constante selecionado a partir do grupo que consiste nos domínios constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-DLL3 tem um domínio constante de IgG2a, de preferência que compreende a sequência de SEQ ID NO: 254. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 tem um domínio constante de cadeia leve que é capa ou lambda, de preferência o domínio constante de cadeia leve é um domínio constante de cadeia leve capa, de preferência que compreende a sequência de SEQ ID NO: 255.
[0267] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 é capaz de se ligar à DLL3 humana e de macaco cynomolgus com uma constante de dissociação (KD), de preferência, de ≤ 10 nM, mais preferivelmente ≤ 1 nM, ainda mais preferivelmente ≤ 0,1 nM, mais preferivelmente < 0,01 nM. A afinidade (valor KD) pode ser medida em um ensaio SPR (BIAcore) usando proteína DLL3 recombinante conforme descrito, por exemplo, nos exemplos ou outros métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0268] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 não se liga à DLL3 de camundongo.
[0269] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 é capaz de detectar a expressão de DLL3 (por exemplo, expressão de proteína citoplasmática e na superfície) em amostras de tecido (por exemplo, amostras de tecido embebidas em parafina/fixadas em formalina), tais como amostras de tecido tumoral ou linhagens de células em cultura. Opcionalmente, a cultura de células embebidas em parafina/fixadas em formalina ou amostras de tecido são ainda tratadas com um recuperador de epítopo, tal como Proteinase K.
[0270] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção se liga ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos DLL3#1, DLL2#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção compete de forma cruzada pela ligação à DLL3 humana com qualquer uma das moléculas de anticorpo DLL3#1, DLL2#2, DLL3#3, DLL3#4, DLL3#5, DLL3#6, DLL3#7, DLL3#8, DLL3#9, DLL3#10, DLL3#11, DLL3#12, DLL3#13, DLL3#14, DLL3#15, DLL3#16, DLL3#17 ou DLL3#18.
[0271] Outro aspecto da presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificam o domínio variável de cadeia pesada e/ou o domínio variável de cadeia leve de uma molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção.
[0272] De preferência, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável de cadeia pesada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 ou 228. De preferência, a molécula de ácidos nucleicos compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável de cadeia leve de qualquer uma de SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 43, 45, 47, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 ou 227.
[0273] Um outro aspecto da invenção fornece um vetor de expressão que contém uma molécula de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável de cadeia pesada e/ou o domínio variável de cadeia leve de uma molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção.
[0274] De preferência, o vetor de expressão compreende, além disso, uma molécula de ácidos nucleicos, de preferência uma molécula de DNA, que codifica os domínios constantes de uma cadeia pesada e/ou o domínio constante de uma cadeia leve, respectivamente, ligada à molécula de ácidos nucleicos, de preferência a molécula de DNA, que codifica o domínio variável de cadeia pesada e/ou o domínio variável de cadeia leve, respectivamente.
[0275] Em uma modalidade especificamente preferida, dois vetores de expressão podem ser usados, um deles para expressão da cadeia pesada, o outro para expressão da cadeia leve, em que dois vetores de expressão podem, então, ser transfectados em uma célula hospedeira para a expressão da proteína recombinante.
[0276] De preferência, o vetor de expressão será um vetor que compreende a dita molécula, ou moléculas de ácido nucleico, operativamente ligada a pelo menos uma sequência reguladora, em que tal sequência reguladora pode ser um promotor, intensificador ou sequência terminadora e, mais preferivelmente, um promotor, intensificador ou sequência terminadora heteróloga.
[0277] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira que tem um vetor de expressão que codifica uma cadeia pesada de uma molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção e um vetor de expressão que codifica uma cadeia leve de uma molécula de anticorpo anti-DLL3 da invenção.
[0278] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, as ditas células hospedeiras são células eucariotas, tais como células de mamíferos. Em outra modalidade, tais células hospedeiras são células bacterianas. Outras células úteis são células de levedura ou outras células fúngicas.
[0279] Células de mamífero adequadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS e assim por diante. No entanto, células de anfíbios, células de insetos, células vegetais e quaisquer outras células usadas na técnica para expressão de proteínas heterólogas também podem ser usadas.
MÉTODOS DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO
[0280] A invenção fornece ainda métodos de produção de uma proteína de ligação multiespecífica da invenção, tais métodos geralmente compreendendo as etapas de: - cultivar células hospedeiras que compreendem um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação da invenção sob condições que permitam a formação da proteína de ligação da invenção; e, - recuperar a proteína de ligação expressa pelas células hospedeiras da cultura; e
- opcionalmente purificar e/ou modificar e/ou formular a proteína de ligação da invenção.
[0281] A invenção fornece ainda métodos de produção de um anticorpo anti-DLL3 da invenção, tais métodos geralmente compreendendo as etapas de: - cultivar células hospedeiras que compreendem um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica uma molécula de anticorpo da invenção sob condições que permitam a formação da molécula de anticorpo; e, - recuperar a molécula de anticorpo expressa pelas células hospedeiras da cultura; e - opcionalmente purificar e/ou modificar e/ou formular a molécula de anticorpo da invenção.
[0282] Um ácido nucleico da invenção pode, por exemplo, ser uma molécula de DNA que compreende sequências de codificação, bem como sequências regulatórias e, opcionalmente, íntrons naturais ou artificiais ou pode ser uma molécula de cDNA. Pode ter seus códons originais ou pode ter um uso de códon otimizado que foi especificamente adaptado para expressão na célula hospedeira pretendida ou organismo hospedeiro. De acordo com uma modalidade da invenção, o ácido nucleico da invenção está na forma essencialmente isolada, conforme definido acima.
[0283] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados ou obtidos de uma maneira conhecida per se (por exemplo, por síntese automática de DNA e/ou tecnologia de DNA recombinante), com base nas informações sobre as sequências de aminoácidos para as proteínas da invenção aqui fornecidas.
[0284] O ácido nucleico da invenção será, tipicamente, incorporado em um vetor de expressão, isto é, um vetor que pode permitir a expressão da proteína quando transfectado em uma célula hospedeira adequada ou outro sistema de expressão.
[0285] Para a produção das proteínas de ligação ou anticorpos da invenção, aqueles versados na técnica podem escolher entre uma grande variedade de sistemas de expressão bem conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles revisados por Kipriyanow e Le Gall, 2004.
[0286] Vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, cosmídeos, epissomas derivados de EBV e assim por diante. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira. A sequência de nucleotídeos que codifica a primeira unidade de ligação a antígeno (por exemplo, o Fab específico para DLL3 com uma única cadeia ou a cadeia de DLL3 de comprimento total da proteína de ligação da invenção) e a sequência de nucleotídeos que codifica a segunda unidade de ligação a antígeno (por exemplo, Fab específico para CD3 com uma única cadeia ou a cadeia de CD3 de comprimento total da proteína de ligação da invenção) da proteína de ligação à DLL3/CD3 podem ser inseridas em vetores separados. Em determinadas modalidades, ambas as sequências de DNA são inseridas no mesmo vetor de expressão. A sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve de um anticorpo anti-DLL3 e a sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada de um anticorpo anti-DLL3 podem ser inseridas em vetores separados. Em determinadas modalidades, ambas as sequências de DNA são inseridas no mesmo vetor de expressão.
[0287] Vetores convenientes são aqueles que codificam uma sequência de imunoglobulina CH humana funcionalmente completa (pesada constante), com sítios de restrição apropriados concebidos de modo que qualquer unidade de ligação a antígeno, tal como uma sequência Fab com uma única cadeia ou qualquer domínio variável de cadeia pesada/leve, possa ser facilmente inserida e expressa, conforme descrito acima. Quanto à cadeia pesada do anticorpo, ela pode ser, sem limitação, qualquer isotipo de IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ou outras imunoglobulinas, incluindo variantes alélicas.
[0288] O vetor de expressão recombinante também pode codificar um peptídeo sinalizador que facilita a secreção da cadeia de CD3 ou DLL3 de comprimento total de uma célula hospedeira ou das cadeias leve/pesada de um anticorpo anti-DLL3. O DNA que codifica a cadeia da proteína pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinalizador seja ligado in-frame ao terminal amino do DNA de cadeia completa madura. O peptídeo sinalizador pode ser um peptídeo sinalizador de imunoglobulina ou um peptídeo heterólogo de uma proteína não imunoglobulina. Alternativamente, a sequência de DNA que codifica as cadeias de comprimento total da proteína da invenção pode já conter uma sequência de peptídeo sinalizador.
[0289] Além das sequências de DNA que codificam a cadeia de DLL3/CD3 ou a cadeia pesada/leve de um anticorpo anti-DLL3 que codifica sequências de DNA, os vetores de expressão recombinantes trazem, tipicamente, sequências reguladoras, opcionalmente sequências reguladoras heterólogas, incluindo promotores, intensificadores, sinais de término e poliadenilação e outros elementos de controle de expressão que controlam a expressão das cadeias de proteínas em uma célula hospedeira. Exemplos de sequências promotoras (exemplificadas para expressão em células de mamíferos) são promotores e/ou intensificadores derivados de CMV (tal como o promotor/intensificador do vírus Simian 40 (SV40) de CMV), adenovírus (por exemplo, o principal promotor tardio de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores fortes de mamíferos, tais como imunoglobulina nativa e promotores de actina. Exemplos de sinais de poliadenilação são BGH poliA, SV40 tardio ou poliA inicial; alternativamente, 3´UTRs de genes de imunoglobulina, etc., podem ser usadas.
[0290] Vetores de expressão recombinantes também podem portar sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. Moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia de comprimento total com a primeira unidade de ligação a antígeno (domínio Fab e Fc com uma única cadeia) ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e/ou a cadeia de comprimento total com a segunda unidade de ligação a antígeno (domínio Fab e Fc com uma única cadeia) ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e vetores que compreendem estas moléculas de DNA podem ser introduzidos nas células hospedeiras, por exemplo, células bacterianas ou células eucariotas superiores, por exemplo, células de mamífero, de acordo com métodos de transfecção bem conhecidos na técnica, incluindo transfecção mediada por lipossomas, transfecção mediada por policátions, fusão de protoplastos, microinjeções, precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação ou transferência por vetores virais.
[0291] De preferência, as moléculas de DNA que codificam as cadeias de DLL3 e CD3 da proteína da invenção estão presentes em dois vetores de expressão que são cotransfectados na célula hospedeira, de preferência uma célula de mamífero.
[0292] Linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, inter alia, células de ovário de hamster Chinês (CHO), NS0, células SP2/0, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma humano (por exemplo, células Hep G2 e A-549), células 3T3 ou os derivados/progênies de qualquer linhagem de células. Outras células de mamífero incluindo, porém sem limitações, linhagens de células humanas, de camundongo, rato, macaco e roedor ou outras células eucariotas incluindo, porém sem limitações, células de levedura, inseto e planta, ou células procariotas, tais como bactérias, podem ser usadas.
[0293] As proteínas da invenção são produzidas ao cultivar as células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão da proteína nas células hospedeiras. As moléculas de proteína são, de preferência, recuperadas do meio de cultura como um polipeptídeo secretado ou podem ser recuperadas de lisatos de células hospedeiras se, por exemplo, expressas sem um sinal secretor. É necessário purificar as moléculas de proteína usando métodos de purificação de proteína padrão usados para proteínas recombinantes e proteínas de células hospedeiras de uma forma que sejam obtidas preparações substancialmente homogêneas da proteína. A título de exemplo, métodos de purificação do estado da técnica úteis para a obtenção de moléculas de proteína da invenção incluem, como uma primeira etapa, a remoção de células e/ou fragmentos celulares em partículas do meio de cultura ou lisato. A proteína é, então, purificada a partir de proteínas solúveis contaminantes, polipeptídeos e ácidos nucleicos, por exemplo, por meio de fracionamento em imunoafinidade ou colunas de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia Sephadex, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica. Como uma etapa final no processo de obtenção de uma preparação de moléculas de proteína, a molécula de proteína purificada pode ser seca, por exemplo, liofilizada, conforme descrito abaixo para aplicações terapêuticas.
[0294] A presente invenção se refere a proteínas de ligação que têm especificidades de ligação por pelo menos dois alvos diferentes. Em relação à presente invenção, as moléculas de ligação são derivadas de anticorpos. Técnicas para produzir moléculas de ligação incluem, porém sem limitações, coexpressão recombinante de duas cadeias de imunoglobulina com especificidades diferentes (consulte Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) e a engenharia "knob-in-hole"
(consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana N° 5.731.168; Atwell et al., JMB, 1997, 270, 26-35). As proteínas de ligação da invenção também podem ser feitas por meio de manipulação de efeitos de direção eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas de Fc de anticorpo (documento WO 2009/089004A1); ligação cruzada de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, Patente Norte- Americana N° 4.676.980 e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); uso de zíperes de leucina para produzir proteínas biespecíficas (ver, por exemplo, Kostelny et al., Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)); uso da tecnologia de "diacorpo" para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-64 48 (1993)); e uso de dímeros de Fv (sFv) com uma única cadeia (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e a preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
[0295] As composições (por exemplo, proteínas de ligação multiespecíficas e anticorpos anti-DLL3) e métodos descritos aqui abrangem polipeptídeos e ácidos nucleicos que têm as sequências especificadas ou sequências substancialmente idênticas ou similares às mesmas, por exemplo, sequências pelo menos 85 %, 90 %, 95 % idênticas ou mais à sequência especificada. No contexto de uma sequência de aminoácidos, o termo "substancialmente idêntico" é usado aqui para se referir a uma primeira sequência de aminoácidos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos que são i) idênticos a ou ii) substituições conservativas de resíduos de aminoácidos alinhados em uma segunda sequência de aminoácidos, de modo que as primeira e segunda sequências de aminoácidos possam ter um domínio estrutural em comum e/ou atividade funcional em comum. Por exemplo, as sequências de aminoácidos que contêm um domínio estrutural em comum têm pelo menos cerca de 85 %, 90 %, 91
%, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com uma sequência de referência, por exemplo, uma sequência fornecida aqui. No contexto da sequência de nucleotídeos, o termo "substancialmente idêntica" é usado aqui para se referir a uma primeira sequência de ácidos nucleicos que contém um número suficiente ou mínimo de nucleotídeos que são idênticos aos nucleotídeos alinhados em uma segunda sequência de ácidos nucleicos, de modo que as primeira e segunda sequências de nucleotídeos codifiquem um polipeptídeo com atividade funcional em comum ou codifiquem um domínio polipeptídico estrutural em comum ou uma atividade polipeptídica funcional em comum, por exemplo, sequências de nucleotídeos que têm pelo menos cerca de 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com uma sequência de referência.
[0296] As moléculas de ácidos nucleicos da invenção incluem, porém sem limitações, moléculas de DNA que codificam as sequências polipeptídicas mostradas na listagem de sequências. Além disso, a presente invenção também se refere a moléculas de ácidos nucleicos que hibridizam com as moléculas de DNA que codificam as sequências polipeptídicas mostradas na listagem de sequências sob condições de ligação e lavagem de alto rigor, conforme definido no documento WO 2007/042309. Moléculas preferidas (do ponto de vista de mRNA) são aquelas que têm pelo menos 75 % ou 80 % (de preferência pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95 %) de homologia ou identidade de sequência com uma das moléculas de DNA descritas aqui. A título de exemplo, tendo em vista a expressão dos anticorpos em células eucariotas, as sequências de DNA apresentadas na listagem de sequências foram concebidas para corresponder ao uso de códons em células eucariotas. Se for desejado expressar os anticorpos, por exemplo, em E. coli, estas sequências podem ser alteradas para corresponder ao uso dos códons, por exemplo, de E. coli. As variantes de moléculas de DNA da invenção podem ser construídas de várias maneiras diferentes conforme descrito, por exemplo, no documento WO 2007/042309.
[0297] As proteínas da invenção podem ter uma sequência N- terminal modificada, por exemplo, uma eliminação de um ou mais dos aminoácidos N-terminais ou uma troca, por exemplo, do primeiro aminoácido N-terminal (por exemplo, glutamato por alanina) para otimizar a molécula a ser expressa usando determinados sistemas de expressão (tais como vetores ou células hospedeiras específicos) ou ser expressas como corpos de inclusão ou na forma solúvel ou ser secretadas no meio ou no espaço periplasmático ou estarem contidas na célula ou produzir um produto mais homogêneo. Os polipeptídeos da invenção podem ter uma sequência C-terminal modificada, tal como uma alanina adicional e/ou outras trocas de aminoácidos na porção C- terminal ou em outras posições definidas em qualquer uma das regiões estruturais conforme explicado, por exemplo, nos documentos WO2012/175741, WO2011/075861 ou WO2013/024059 a fim, por exemplo, de aumentar ainda mais a estabilidade ou reduzir a imunogenicidade de tais polipeptídeos.
[0298] Para evitar dúvidas, todas as modalidades relacionadas a composições farmacêuticas, kits, métodos de tratamento, usos médicos, combinações, métodos de administração e dosagens conforme descrito aqui são considerados para qualquer uma das proteínas de ligação multiespecíficas descritas aqui, individualmente ou em combinação com outros agentes terapêuticos (conforme especificado em mais detalhes abaixo). COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS; MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO; DOSAGENS
[0299] A invenção também se refere a composições farmacêuticas para o tratamento de uma doença (conforme especificado em mais detalhes abaixo), em que tais composições compreendem pelo menos uma proteína de ligação multiespecífica da invenção. A invenção abrange ainda métodos de tratamento de uma doença (conforme especificado em mais detalhes abaixo) que usam pelo menos uma proteína multiespecífica ou composição farmacêutica da invenção conforme apresentado abaixo e abrange ainda a preparação de um medicamento para o tratamento de tal doença usando tal proteína de ligação ou composição farmacêutica da invenção.
[0300] As proteínas de ligação da invenção (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 e DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3, de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) e/ou as composições que compreendem as mesmas podem ser administradas a um paciente que precisa através de qualquer maneira adequada, dependendo da formulação ou composição farmacêutica específica a ser usada. Assim, as proteínas de ligação da invenção e/ou as composições que compreendem as mesmas podem, por exemplo, ser administradas por via intravenosa (iv), subcutânea (sc), intramuscular (im), intraperitoneal (ip), transdérmica, oral, sublingual (por exemplo, na forma de um comprimido sublingual, spray ou gota colocada sob a língua e adsorvida através das membranas mucosais na rede capilar sob a língua), (intra- )nasalmente (por exemplo, na forma de um spray nasal e/ou como um aerossol), topicamente, por meio de um supositório, através de inalação ou qualquer outra forma adequada em uma quantidade ou dose eficaz. A proteína de ligação pode ser administrada por meio de infusão, bolus ou injeção. Em modalidades preferidas, a administração é através de infusão intravenosa ou injeção subcutânea.
[0301] As proteínas de ligação da invenção e/ou as composições que compreendem as mesmas são administradas de acordo com um regime de tratamento que é adequado para tratar e/ou aliviar a doença, transtorno ou condição a ser tratada ou aliviada. O médico será, em geral, capaz de determinar um regime de tratamento adequado, dependendo de fatores tais como a doença, transtorno ou condição a ser tratada ou aliviada, a gravidade da doença, a gravidade dos sintomas da mesma, a proteína de ligação específica da invenção a ser usada, a via de administração específica e a formulação ou composição farmacêutica a ser usada, a idade, sexo, peso, dieta, condição geral do paciente e fatores similares bem conhecidos do médico. Em geral, o regime de tratamento compreenderá a administração de uma ou mais proteínas de ligação da invenção ou uma ou mais composições que compreendem as mesmas em quantidades ou doses terapeuticamente eficazes.
[0302] Em geral, para o tratamento e/ou alívio das doenças, transtornos e condições mencionados aqui e dependendo da doença,
transtorno ou condição específica a ser tratada, a potência da proteína de ligação específica da invenção a ser usada, a via específica de administração e a formulação ou composição farmacêutica específica usada, as proteínas de ligação da invenção serão, em geral, administradas em uma quantidade entre 0,005 e 20,0 mg por quilograma de peso corporal e dose, de preferência entre 0,05 e 10,0 mg/kg/dose, continuamente (por exemplo, através de infusão) ou, mais preferivelmente, como doses únicas (tal como, por exemplo, duas vezes por semana, doses semanais ou mensais; cf. abaixo), mas pode variar significativamente, especialmente dependendo dos parâmetros mencionados anteriormente. Assim, em alguns casos pode ser suficiente usar menos do que a dose mínima fornecida acima enquanto que, em outros casos, pode ser necessário exceder o limite máximo. Ao administrar grandes quantidades, pode ser aconselhável dividi-las em várias doses menores, distribuídas ao longo do dia.
[0303] Dependendo da proteína de ligação específica da invenção e sua farmacocinética específica e outras propriedades, ela pode ser administrada diariamente, a cada dois, três, quatro, cinco ou seis dias, semanalmente, mensalmente e assim por diante. Um regime de administração pode incluir tratamento semanal a longo prazo. Por "longo prazo" entenda-se pelo menos duas semanas e, de preferência, meses ou anos de duração.
[0304] A eficácia da proteína multiespecífica da invenção e de composições que compreendem as mesmas pode ser testada usando qualquer ensaio in vitro adequado, ensaio com base em células, ensaio in vivo e/ou modelo animal conhecido per se ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo da doença específica envolvida. Ensaios e modelos animais adequados serão evidentes para aqueles versados na técnica e, por exemplo, incluem os ensaios e modelos animais usados nos Exemplos abaixo.
FORMULAÇÕES
[0305] Para uso farmacêutico, as proteínas de ligação da invenção podem ser formuladas como uma preparação farmacêutica que compreende (i) pelo menos uma proteína de ligação da invenção (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 e DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3, de preferência qualquer um de D LL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) e (ii) pelo menos um carreador, diluente, excipiente, adjuvante e/ou estabilizante farmaceuticamente aceitável e (iii) opcionalmente um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmacologicamente ativos adicionais. Por "farmaceuticamente aceitável" entenda-se que o respectivo material não mostra quaisquer efeitos biológicos ou indesejáveis quando administrado a um indivíduo e não interage de forma deletéria com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica (tal como, por exemplo, o ingrediente farmaceuticamente ativo) no qual ele está contido. Exemplos específicos podem ser encontrados em manuais padrão tais como, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990). Por exemplo, as proteínas de ligação da invenção podem ser formuladas e administradas de qualquer maneira conhecida per se para anticorpos convencionais e fragmentos de anticorpos e outras proteínas farmaceuticamente ativas. Assim, de acordo com outra modalidade, a invenção se refere a uma composição ou preparação farmacêutica que contém pelo menos uma proteína de ligação da invenção e pelo menos um carreador, diluente, excipiente, adjuvante e/ou estabilizante farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, uma ou mais de outras substâncias farmacologicamente ativas, na forma de formulações liofilizadas ou de outro modo secas ou soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas.
[0306] As preparações farmacêuticas para administração parentérica, tais como injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea ou infusão podem ser, por exemplo, soluções estéreis, suspensões, dispersões, emulsões ou pós que compreendem o ingrediente ativo e que são adequados, opcionalmente após uma etapa adicional de dissolução ou diluição, para infusão ou injeção. Carreadores ou diluentes adequados para tais preparações incluem, por exemplo, sem limitação, água estéril e tampões e soluções aquosas farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfato fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank; óleos; água; glicerol; etanol; glicóis, tal como propileno glicol, bem como óleos minerais, óleos animais e óleos vegetais, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja, bem como misturas adequadas dos mesmos.
[0307] As soluções das proteínas de ligação da invenção também podem conter um conservante para prevenir o crescimento de micro- organismos, tais como agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, p-hidroxibenzoatos, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal, (sais de metais alcalinos de) ácido etilenodiamina tetra-acético e assim por diante. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. Opcionalmente, emulsificantes e/ou dispersantes podem ser usados. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões ou pelo uso de tensoativos. Outros agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina, também podem ser adicionados. As soluções podem ser colocadas em frascos para injeção, ampolas, frascos para infusão e assim por diante.
[0308] Em todos os casos, a forma de dosagem final deve ser estéril, fluida e estável sob as condições de produção e armazenamento. As soluções injetáveis estéreis são preparadas ao incorporar o composto ativo na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização em filtro. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e técnicas de liofilização, os quais produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado presente nas soluções previamente esterilizadas por filtração.
[0309] Normalmente, soluções ou suspensões aquosas serão preferidas. Em geral, as formulações adequadas para proteínas terapêuticas, tais como as proteínas de ligação da invenção, são soluções de proteína tamponadas, tais como soluções que incluem a proteína em uma concentração adequada (tal como 0,001 a 400 mg/ml, de preferência 0,005 a 200 mg/ml, mais preferivelmente 0,01 a 200 mg/ml, mais preferivelmente 1,0 - 100 mg/ml, tal como 1,0 mg/ml (administração iv) ou 100 mg/ml (administração sc) e um tampão aquoso tal como: - solução salina tamponada com fosfato, pH de 7,4, - outros tampões de fosfato, pH de 6,2 a 8,2, - tampões de acetato, pH de 3,2 a 7,5, de preferência pH de 4,8 a 5,5 - tampões de histidina, pH de 5,5 a 7,0, - tampões de succinato, pH de 3,2 a 6,6, e - tampões de citrato, pH de 2,1 a 6,2, e, opcionalmente, sais (por exemplo, NaCl) e/ou açúcares (tais como, por exemplo, sacarose e trealose) e/ou outros poliálcoois (tais como, por exemplo, manitol e glicerol) para conferir isotonicidade à solução.
[0310] Além disso, outros agentes, tal como um detergente, por exemplo, Tween-20 ou Tween-80 a 0,02 %, podem ser incluídos em tais soluções. As formulações para aplicação subcutânea podem incluir concentrações significativamente mais elevadas do anticorpo da invenção, tal como até 100 mg/ml ou mesmo acima de 100 mg/ml. No entanto, será evidente para aqueles versados na técnica que os ingredientes e suas quantidades, conforme fornecido acima, representam apenas uma opção preferida. As alternativas e variações das mesmas serão imediatamente evidentes para aqueles versados na técnica ou podem ser facilmente concebidas a partir da descrição acima. As formulações descritas acima podem ser fornecidas opcionalmente como formulação liofilizada que deve ser reconstituída em uma solução, por exemplo, em água para injeção (WFI).
[0311] De acordo com um outro aspecto da invenção, uma proteína de ligação da invenção pode ser usada em combinação com um dispositivo útil para a administração de proteína, tal como uma seringa, caneta injetora, microbomba ou outro dispositivo.
MÉTODO DE TRATAMENTO
[0312] Um outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de câncer que compreende administrar a um paciente que precisa uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação da invenção.
[0313] Um outro aspecto da invenção fornece uma proteína de ligação da invenção para uso em um método de tratamento de câncer.
[0314] Um outro aspecto da invenção é o uso da proteína de ligação da invenção para preparar uma composição farmacêutica para o tratamento do câncer.
[0315] Para evitar dúvidas, os aspectos de uso médico da invenção podem compreender qualquer uma das proteínas de ligação específicas da invenção, conforme descrito acima (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 e DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3, de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3).
[0316] Conforme usado aqui, o termo "câncer" se destina a incluir todos os tipos de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos,
tecidos metastáticos ou células, tecidos ou órgãos transformados de forma maligna, independentemente do tipo histopatológico ou da fase de invasividade.
[0317] Cânceres exemplificativos cujo crescimento pode ser inibido usando as proteínas de ligação multiespecíficas descritas aqui são quaisquer tumores que expressam DLL3, de preferência SCLC, LCNEC, glioma, glioblastoma, melanoma ou outros tumores neuroendócrinos que expressam DLL3 (por exemplo, câncer de próstata neuroendócrino ou câncer pancreático neuroendócrino, câncer de bexiga de células pequenas).
[0318] Os tumores neuroendócrinos (TNEs) surgem a partir do sistema endócrino disperso e podem ocorrer em muitas áreas diferentes do corpo. Tradicionalmente, os TNEs são classificados por seu local anatômico de origem e são, tipicamente, altamente agressivos. Eles estão mais frequentemente localizados no trato gastrintestinal, pâncreas ou pulmões (carcinoma pulmonar de células pequenas e carcinoma neuroendócrino de células grandes), bem como nos rins ou no trato geniturinário (bexiga, próstata, ovário, colo do útero e endométrio). Os TNEs incluem determinados tumores do trato gastrintestinal e das células das ilhotas pancreáticas, determinados tumores do timo e do pulmão e carcinoma medular das células parafoliculares da tireoide.
[0319] Cânceres adicionais cujo crescimento pode ser inibido usando as proteínas de ligação multiespecíficas descritas aqui são tumores pseudo-neuroendócrinos (pNETs) que compartilham determinadas características genotípicas, fenotípicas ou bioquímicas com tumores neuroendócrinos tradicionalmente definidos.
[0320] Em algumas modalidades, os seguintes cânceres, tumores e outras doenças proliferativas podem ser tratados com proteínas de ligação multiespecíficas da invenção: câncer de pulmão; de preferência
SCLC, NSCLC ou LCNEC; seios nasais; cervical; cólon; colorretal; endometrial; cabeça e pescoço; fígado (hepatoblastoma ou carcinoma hepatocelular); ovariano; pancreático; próstata; pele; gástrico; testículo; tireoide; ad-renal; renal; bexiga; uterino; esofágico; urotelial; tumor cerebral; linfoma; Sarcoma de Ewing; e outros tumores neuroendócrinos e pequenos tumores de células redondas azuis.
[0321] Em uma modalidade preferida da invenção, o câncer é câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) ou glioblastoma.
[0322] Todos os cânceres, tumores, neoplasias, etc., supracitados, os quais são caracterizados por sua localização/origem específica no corpo, se destinam incluir tanto tumores primários quanto tumores metastáticos derivados dos mesmos.
[0323] É possível que um paciente seja mais propenso a responder ao tratamento com uma proteína de ligação da invenção (conforme descrito aqui) se este paciente tiver um câncer que é caracterizado por ter uma alta expressão de DLL3. Assim, em algumas modalidades, o câncer a ser tratado com as proteínas de ligação da invenção é um câncer com alta expressão de DLL3, por exemplo, a expressão de DLL3 é maior do que a expressão média em células cancerosas de uma população de pacientes que sofrem do mesmo tipo de um câncer que expressa DLL3.
[0324] As proteínas de ligação da invenção podem ser usadas em regimes terapêuticos no contexto de primeira linha, segunda linha ou qualquer outro tratamento de linha e tratamento de manutenção.
[0325] As proteínas de ligação da invenção podem ser usadas para a prevenção, tratamento de curto ou longo prazo das doenças supracitadas, opcionalmente também em combinação com radioterapia, um ou mais agentes terapêuticos adicionais e/ou cirurgia.
[0326] Em modalidades preferidas, a proteína da invenção é usada para o tratamento de câncer em combinação com um antagonista de
PD-1, tal como um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PDL-1. De preferência, o dito anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1 5 conforme descrito aqui (conforme definido pelas sequências na Tabela A abaixo) e no documento WO2017/198741 (aqui incorporado por referência). De preferência, o dito anticorpo anti-PDL-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.
Em modalidades preferidas particulares, a proteína de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2 ou DLL3#3/CD3#3) é usada para o tratamento de câncer em combinação com PD1-1. Em modalidades preferidas particulares, a proteína de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2 ou DLL3#3/CD3#3) é usada para o tratamento de câncer em combinação com PD1-2. Em modalidades preferidas particulares, a proteína de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é usada para o tratamento de câncer em combinação com PD1-3. Em modalidades preferidas particulares, a proteína de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é usada para o tratamento de câncer em combinação com PD1-4. Em modalidades preferidas particulares, a proteína de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2,
DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é usada para o tratamento de câncer em combinação com PD1-5. Tabela A: Sequências de aminoácidos e SEQ ID NOs das sequências de cadeia pesada e cadeia leve dos anticorpos anti-PD1 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4, PD1-5. SEQ ID Breve descrição da Sequência Número: sequência
EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVRQAPGKGLE WVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
SEQ ID TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG PD1-1 HC NO:256 GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNWYQQKPGQAP KLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKE
SEQ ID PD1-1 LC VPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR NO:257
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVRQAPGKGLE WVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARHSNPNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
SEQ ID TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG PD1-2 HC NO:258 GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNWYQQKPGQAP KLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKE
SEQ ID PD1-2 LC VPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR NO:259
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVRQAPGKGLE WVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES
SEQ ID PD1-3 HC TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV NO:260
TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS
SEQ ID Breve descrição da Sequência Número: sequência
SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNWYQQKPGQAP KLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKE
SEQ ID PD1-3 LC VPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR NO:261
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVRQAPGKGLE WVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
SEQ ID TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG PD1-4 HC NO:262 GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNWYQQKPGQAP KLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKE
SEQ ID PD1-4 LC VPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR NO:263
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVRQAPGKGLE WVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARHSNVNYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
SEQ ID TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG PD1-5 HC NO:264 GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNWYQQKPGQAP KLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKE
SEQ ID PD1-5 LC VPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR NO:265
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0327] De acordo com estas modalidades preferidas e qualquer outro dos aspectos da presente invenção, os anticorpos PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 são moléculas de anticorpo conforme descrito no documento WO2017/198741 e são definidos pelas sequências conforme mostrado na Tabela A acima.
[0328] Consequentemente, PD1-1 tem uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 256 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 257;
[0329] PD1-2 tem uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 258 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 259;
[0330] PD1-3 tem uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 260 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 261;
[0331] PD1-4 tem uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 263; e
[0332] PD1-5 tem uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 264 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 265.
[0333] O acima também inclui o uso das proteínas de ligação da invenção em vários métodos de tratamento das doenças acima através da administração de uma dose terapeuticamente eficaz a um paciente que precisa, bem como o uso destas proteínas de ligação para a produção de medicamentos para o tratamento de tais doenças, bem como composições farmacêuticas que incluem tais proteínas de ligação da invenção, bem como a preparação e/ou produção de medicamentos que incluem tais proteínas de ligação da invenção e assim por diante.
COMBINAÇÕES COM OUTRAS SUBSTÂNCIAS OU TRATAMENTOS ATIVOS
[0334] Uma proteína de ligação da invenção pode ser usada individualmente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, em particular em combinação com um agente quimioterapêutico, tais como agentes de dano ao DNA, um composto terapeuticamente ativo que inibe a angiogênese, um inibidor da via de transdução de sinal, um inibidor de EGFR, um modulador imune, um inibidor do ponto de verificação imune, um inibidor do ponto de verificação mitótico ou um agente de terapia hormonal.
[0335] O agente terapêutico adicional pode ser administrado simultaneamente, opcionalmente como um componente da mesma preparação farmacêutica ou antes ou após administração da proteína de ligação à DLL3/CD3.
[0336] Substâncias ativas citostáticas e/ou citotóxicas que podem ser administradas em combinação com as moléculas de ligação da invenção incluem, porém sem limitações, hormônios, análogos hormonais e anti-hormônios, inibidores de aromatase, agonistas e antagonistas de LHRH, inibidores de fatores de crescimento (fatores de crescimento tais como, por exemplo, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fatores de crescimento similares à insulina (IGF), fator de crescimento epidérmico humano (HER, por exemplo, HER2, HER3, HER4) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF)), inibidores os quais são, por exemplo, anticorpos (anti)fator de crescimento, anticorpos ao receptor de (anti)fator de crescimento e inibidores de tirosina quinase tais como, por exemplo, cetuximabe, gefitinibe, afatinibe, nintedanibe, imatinibe, lapatinibe, bosutinibe e trastuzumabe; antimetabólitos (por exemplo, antifolatos, tais como metotrexato, raltitrexede, análogos de pirimidina, tais como 5-fluorouracil (5-FU), gencitabina, irinotecano, doxorrubicina, TAS-102, capecitabina e gencitabina, purina e análogos de adenosina, tais como mercibaptopuratina, pentibaptopurina, citarabina (ara C), fludarabina); antibióticos antitumorais (por exemplo, antraciclinas); derivados de platina (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina); agentes de alquilação (por exemplo, estramustina, mecloretamina, melfalano, clorambucil, busulfan, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, temozolomida, nitrosoureia tais como, por exemplo, carmustina e lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por exemplo, vinca alcaloides tais como, por exemplo, vinblastina, vindesina, vinorelbina e vincristina; e taxanos, tais como paclitaxel, docetaxel); inibidores de angiogênese, incluindo bevacizumabe, ramucirumabe e aflibercepte, inibidores de tubulina; inibidores da síntese de DNA, inibidores de PARP, inibidores de topoisomerase (por exemplo, epipodofilotoxinas tais como, por exemplo, etoposídeo e etofos, teniposídeo, ansacrina, topotecano, irinotecano, mitoxantrona), inibidores de serina/treonina quinase (por exemplo, inibidores de PDK1, inibidores de Raf, inibidores de A-Raf, inibidores de Raf, inibidores de C-Raf, inibidores de mTOR, inibidores de mTORC1/2, inibidores de PI3K, inibidores de PI3Kα, inibidores duplos de mTOR/PI3K, inibidores de STK33, inibidores de AKT, inibidores de PLK1 (tal como volasertibe), inibidores de CDKs, incluindo inibidores de CDK9, Inibidores de quinase Aurora), inibidores de tirosina quinase (por exemplo, inibidores de PTK2/FAK), inibidores da interação proteína-proteína, inibidores de MEK, inibidores de ERK, inibidores de FLT3, inibidores de BRD4, inibidores de IGF-1R, inibidores de Bcl-xL, inibidores de Bcl-2, Bcl Inibidores de 2/Bcl-xL, inibidores do receptor ErbB, inibidores de BCR ABL, inibidores de ABL, inibidores de Src, análogos de rapamicina (por exemplo, everolímus, tensirolímus, ridaforolímus, sirolímus), inibidores da síntese de androgênios, inibidores do receptor de androgênio, inibidores de DNMT, inibidores de HDAC, inibidores de ANG1/2, inibidores de CYP17, radiofármacos, agentes imunoterapêuticos, tais como inibidores do ponto de verificação imune (por exemplo, CTLA4, PD1, PD-L1, LAG3 e moléculas de ligação a TIM3/imunoglobulinas, tais como ipilimumabe, nivolumabe, pembrolizumabe) e vários agentes quimioterapêuticos, tais como amifostina, anagrelida, clodronato, filgrastina, interferon, interferon alfa, leucovorina, rituazina, levamisol, mesna, mitotano, pamidronato e porfímero; inibidores de proteassoma (tal como Bortezomibe); miméticos de Smac e BH3; agentes que restauram a funcionalidade de p53, incluindo antagonista de mdm2-p53; inibidores da via de sinalização Wnt/beta-catenina; e/ou inibidores de quinase 9 dependente de ciclina.
[0337] Particularmente preferidos são os tratamentos com as moléculas de ligação da invenção em combinação com um ou mais agentes imunoterapêuticos, incluindo agentes anti-PD-1 e anti-PD-L1 e agentes anti-LAG3: agentes anti-PD1 exemplificativos incluem, porém sem limitações, anticorpo anti-PD-1 PDR-001, pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe e PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 conforme descrito aqui (Tabela A) e no documento WO2017/198741. Agentes anti-PDL-1 exemplificativos incluem, porém sem limitações, atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe. Em modalidades preferidas, a molécula de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é combinada com PD1-1. Em modalidades preferidas, a molécula de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é combinada com PD1-2. Em modalidades preferidas, a molécula de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é combinada com PD1-3. Em modalidades preferidas, a molécula de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1,
DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é combinada com PD1-4. Em modalidades preferidas, a molécula de ligação da invenção (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) é combinada com PD1-5.
[0338] Em determinadas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser um outro agente imunoterapêutico, tais como moduladores de: TIM-1, TIM-3, TIM-4, PD-L2, LAG3, CTLA-4, Galectina 9, Galectina-1, CD69, CD113, GPR56, CD48, GARP, CAECAM-1, BTLA, TIGIT, CD160, LAIR1, 2B4, CEACAM, CD39, TGFβ, IL-10, ligante Fas, ICOS, família B7 (B7-1, B7-2, B7 -H1 (PDL-1), B7-DC (PD- L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) ou B7-H6).
[0339] Em algumas modalidades, o agente imunoterapêutico adicional é um membro da família TNF de moléculas que se ligam a membros da família de receptores de TNF cognatos, os quais incluem CD40 e CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, GITR, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, LIGHT, TACI, APRIL, LIGHT DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Linfotoxina α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, Linfotoxina α1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, TROY, RELT.
[0340] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um mimético de SMAC. Miméticos de SMAC são compostos que se ligam a proteínas inibidoras de apoptose (IAPs) e têm função imunomoduladora e mediam a indução de citocinas sistêmicas (por exemplo, IL-6, TNFα, etc.) e quimiocinas (por exemplo, MCP-1) quando administrados a animais ou seres humanos. Em algumas modalidades, o mimético de SMAC é (i) LCL161, isto é, o composto A no Exemplo 1 do documento WO 2008/016893 (página 28/29; [122]) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (ii) o mimético de SMAC conhecido como Debio-1143 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (iii) o mimético de SMAC conhecido como Birinapante ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; (iv) o mimético de SMAC conhecido como ASTX-660 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ou (v) o mimético de SMAC conhecido como CUDC-427 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0341] Em algumas modalidades, o agente imunoterapêutico adicional é selecionado a partir de (i) antagonistas de citocinas que inibem a ativação de células T (por exemplo, IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF; "citocinas imunossupressoras") e/ou (ii) agonistas de citocinas que estimulam a ativação de células T e/ou citocinas, tal como IL2, para estimular uma resposta imune, por exemplo, para tratar doenças proliferativas, tal como câncer.
[0342] Em algumas modalidades, o agente imunoterapêutico adicional é um agonista de uma proteína que estimula a ativação de células T, tais como CD28, GITRL, OX40L, CD27 e CD28H.
[0343] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um vírus oncolítico incluindo, porém sem limitações, um vírus oncolítico derivado de vírus vaccinia, adenovírus (AdV), vírus do herpes simplex (HSV1 ou HSV2), reovírus, vírus mixoma (MYXV), poliovírus, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus Maraba, vírus da varicela, vírus do sarampo (MV) ou vírus da doença de Newcastle (NDV).
USOS DIAGNÓSTICOS
[0344] As moléculas de anticorpo anti-DLL3 da invenção são úteis em métodos diagnósticos e prognósticos e podem ser empregadas para marcar, localizar ou identificar células ou tecidos que expressam DLL3 (por exemplo, em ensaios ELISA, análise FACS, imuno-histologia ou similar), ao ligar um corante, um fármaco ou outra molécula com especificidade de ligação por um antígeno diferente. Por exemplo, um marcador detectável pode ser conjugado à molécula de anticorpo anti- DLL3 da invenção ou um reagente secundário que se liga especificamente à molécula de anticorpo da invenção e que foi conjugado com um marcador detectável (por exemplo, um anticorpo secundário) pode ser usado em tais métodos diagnósticos. Em algumas modalidades, os anticorpos específicos para DLL3 se ligam especificamente à DLL3 expressa em células, tanto no citoplasma e/ou na superfície celular, e são usados para localizar e/ou identificar estas células. Em algumas modalidades, os anticorpos específicos para DLL3 fornecidos aqui são usados para identificar células ou tecidos que expressam DLL3 (por exemplo, células tumorais).
[0345] Os anticorpos da invenção são selecionados de modo que tenham um alto nível de especificidade de ligação a epítopo e alta afinidade de ligação ao polipeptídeo de DLL3. Em geral, quanto maior a afinidade de ligação de um anticorpo, mais rigorosas as condições de lavagem em um imunoensaio para remover o material ligado não especificamente sem remover o polipeptídeo alvo.
[0346] Assim, são fornecidos ainda aqui métodos de detecção de DLL3 em uma amostra biológica. Especificamente, em um aspecto, a invenção fornece um método de detecção de DLL3 em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido, uma amostra de tecido tumoral) que compreende (a) contatar a amostra com um anticorpo da invenção; e (b) detectar o anticorpo anti-DLL3 ligado à DLL3.
[0347] Uma amostra biológica pode ser obtida/isolada de qualquer tecido (incluindo biópsias), célula ou fluido corporal de um indivíduo. Em uma modalidade preferida, a amostra é uma amostra de tecido, de preferência uma amostra de tecido tumoral. Em uma modalidade específica, a amostra é uma amostra de tecido fixo (tumor), de preferência uma amostra de tecido fixado em formalina e incrustado em parafina (FFPE), mais preferivelmente uma amostra de tecido tumoral fixado em formalina e incrustado em parafina (FFPE).
[0348] Normalmente, as amostras são divididas em várias porções e afixadas a um meio para análise microscópica, tal como uma lâmina de microscópio. Quando a amostra é uma amostra de tecido, as várias porções podem ser seções teciduais. Em algumas modalidades, as seções seriais são retiradas de amostras de tecido FFPE. Em algumas modalidades, as seções seriais são retiradas de uma pluralidade de diferentes locais de um bloco de FFPE, o que pode ser feito para capturar tanto a heterogeneidade intra-seção quanto a heterogeneidade intra-bloco. Em algumas modalidades, as seções seriais são retiradas de uma pluralidade de diferentes amostras de biópsia retiradas de diferentes locais no mesmo tumor, o que pode ser feito para capturar a heterogeneidade intra-seção e a heterogeneidade intra-tumoral. Normalmente, as amostras de tecido passam primeiro por desparafinização, recuperação de antígeno (por exemplo, com Proteinase K) antes de detecção do antígeno. A amostra de tecido pode ser obtida/isolada a partir de uma variedade de tecidos (por exemplo, de uma biópsia), especificamente tecidos obtidos de tumores incluindo, porém sem limitações, SCLC, LCNEC, glioma, glioblastoma, melanoma ou outros tumores neuroendócrinos (por exemplo, câncer de próstata neuroendócrino ou câncer pancreático neuroendócrino, câncer de bexiga de células pequenas).
[0349] Outros tumores exemplificativos a partir dos quais uma amostra (de tecido) pode ser obtida/isolada incluem câncer de pulmão; de preferência SCLC, NSCLC ou LCNEC; seios nasais; cervical; cólon; colorretal; endometrial; cabeça e pescoço; fígado (hepatoblastoma ou carcinoma hepatocelular); ovariana; pancreático; próstata; pele; gástrico; testículo; tireoide; ad-renal; renal; bexiga; uterino; esofágico;
câncer urotelial; tumor cerebral; linfoma; sarcoma de Ewing; e outros tumores neuroendócrinos (incluindo tumores pseudo-endócrinos) e pequenos tumores de células redondas azuis.
[0350] Métodos exemplificativos de detecção de DLL3 em uma amostra são imunocitoquímica (ICC), imuno-histoquímica (IHC), Western Blotting, citometria de fluxo e/ou ELISA.
[0351] Em uma modalidade preferida, a DLL3 é detectada usando IH C.
[0352] Em um aspecto específico da invenção, o método de detecção de DLL3 em uma amostra de tecido compreende: a) contatar uma amostra de tecido (por exemplo, um tecido tumoral, tal como SCLC, glioblastoma ou tumores neuroendócrinos), de preferência, a dita amostra de tecido é uma amostra de tecido fixada (por exemplo, fixada em formalina e incrustada em parafina), com um anticorpo da invenção (por exemplo, DLL3#1 ou DLL3#5), b) permitir a formação de complexos de anticorpo-antígeno na amostra, e c) detectar o anticorpo anti-DLL3 ligado à DLL3.
[0353] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o anticorpo anti-DLL3 é detectado por um sinal detectável, de preferência, o sinal detectável é gerado por um marcador detectável. Em uma modalidade preferida do método da invenção, o sinal detectável é detectado em um ensaio IHC. Em algumas modalidades, o sinal detectável é detectado em um ensaio ELISA, através de citometria de fluxo ou Western blotting. Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem ser usados para detectar DLL3 presente na superfície celular de uma célula (por exemplo, uma célula tumoral), por exemplo, usando citometria de fluxo. Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem ser usados para detectar a presença de DLL3 em uma amostra de tecido (por exemplo, amostra de tecido tumoral) usando ELISA, Western blotting ou IHC.
[0354] Em algumas modalidades, o marcador detectável é conjugado diretamente ao anticorpo anti-DLL3 e, portanto, é depositado na amostra quando de ligação do anticorpo anti-DLL3 à DLL3; isto é denominado em geral como um método de marcação direta). Os métodos de marcação direta costumam ser quantificáveis de maneira mais direta, porém, costumam apresentar falta de sensibilidade. Em outras modalidades, a deposição do marcador detectável é realizada mediante uso de um reagente de detecção secundário que se liga especificamente à molécula de anticorpo da invenção e que foi conjugado com um marcador detectável (por exemplo, um anticorpo secundário); isto é denominado em geral como método de marcação indireto. Em algumas modalidades, o reagente de detecção secundário específico pode ser um anticorpo secundário específico para espécie, um anticorpo anti-hapteno que se liga a um anticorpo anti-DLL3 conjugado com hapteno ou uma proteína de ligação à biotina ligada a um anticorpo anti-DLL3 biotinilado.
[0355] Exemplos particulares de marcadores detectáveis que podem ser conjugados com o anticorpo anti-DLL3 da invenção ou com um reagente de detecção secundário incluem moléculas e materiais cromogênicos, fluorescentes, fosforescentes, luminescentes e radioativos, catalisadores (tais como enzimas) que convertem uma substância em outra substância para fornecer uma diferença detectável (tal como ao converter uma substância incolor em uma substância colorida ou vice-versa ou produzir um precipitado ou aumentar a turbidez da amostra), haptenos que podem ser detectados por meio de interações de ligação de hapteno-anticorpo usando marcadores de detecção adicionais conjugados a anticorpos e moléculas ou materiais paramagnéticos e magnéticos.
[0356] Por exemplo, o marcador detectável pode ser uma enzima,
tal como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), fosfatase ácida, glicose oxidase, β-galactosidase, β-glucuronidase e β-lactamase; um fluoroforo, tal como fluoresceínas, luminoforos, cumarinas, corantes BODIPY, resorrufinas e rodaminas; nanopartículas, tais como pontos quânticos (Patentes Norte-Americanas Nos 6.815.064, 6.682.596 e
6.649.138); quelatos metálicos, tais como quelatos DOTA e DPTA, íons metálicos radioativos ou paramagnéticos, tal como Gd3+; e lipossomas, por exemplo, lipossomas que contêm moléculas fluorescentes retidas.
[0357] Quando o marcador detectável inclui uma enzima, um substrato detectável, tal como um cromogênio, um composto fluorogênico ou um composto luminogênico pode ser usado em combinação com a enzima para gerar um sinal detectável. Exemplos particulares de compostos cromogênicos incluem diaminobenzidina (DAB), 4-nitrofenilfosfato (pNPP), Fast Red, fosfato de bromocloroindolila (BCIP), azul de nitro tetrazólio (NBT), BCIP/NBT, Orange AP, Blue AP, tetrametilbenzidina (TMB), sulfonato de 2,2'-azino- di-[3-etilbenzotiazolina] (ABTS), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-D-galactopiranosídeo (ONPG), o-fenilenodiamina (OPD), 5- bromo-4-cloro-3-indolil-galactopiranosídeo (X-Gal), metilumbeliferil-D- galactopiranosídeo (MU-Gal), p-nitrofenil-aD-galactopiranosídeo (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuronida (X-Gluc), 3-amino-9- etilcarbazol (AEC), fucsina, iodonitrotetrazólio (INT), azul de tetrazólio e violeta de tetrazólio.
[0358] Em alguns exemplos, a porção detectável é um fluoroforo que pertence a várias classes químicas comuns, incluindo cumarinas, fluoresceínas (ou derivados e análogos de fluoresceína), rodaminas, resorrufinas, luminoforos e cianinas.
[0359] Em outras modalidades, a porção detectável é uma molécula detectável por meio de microscopia de campo claro, tais como corantes que incluem diaminobenzidina (DAB), 4-(dimetilamino)azobenzeno-4'-
sulfonamida (DABSYL), tetrametilrodamina (DISCOVERY Purple), N,N'- biscarboxipentil-5,5'-dissulfonato-indodicarbocianina (Cy5) e Rodamina 110 (Rodamina).
[0360] Os haptenos são pequenas moléculas que são especificamente ligadas por anticorpos embora, em si, não produzam uma resposta imune em um animal e devem primeiro ser ligados a uma molécula carreadora maior, tal como uma proteína, para gerar uma resposta imune. Exemplos de haptenos incluem di-nitrofenila, biotina, digoxigenina e fluoresceína.
[0361] São ainda fornecidos aqui, em um aspecto, métodos diagnósticos ou para a identificação de um tumor como tumor que expressa DLL3 (expressa DLL3 no citoplasma e/ou na superfície celular) que compreendem detectar a DLL3 em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido tumoral) do indivíduo usando o anticorpos anti-DLL3 (por exemplo, DLL3#1 ou DLL3#5) da invenção (por exemplo, usando IHC em uma amostra de tecido tumoral). Em um aspecto adicional, são fornecidos aqui métodos de seleção de uma terapia-alvo para DLL3 para um indivíduo que compreendem detectar a DLL3 em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido tumoral) do indivíduo usando os anticorpos anti-DLL3 (por exemplo, DLL3#1 ou DLL3#5) da invenção (por exemplo, usando IHC em uma amostra de tecido tumoral). Em um aspecto adicional, são fornecidos aqui métodos de monitoramento do efeito terapêutico (por exemplo, de uma terapia- alvo para DLL3) em um indivíduo que compreendem detectar a DLL3 em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido tumoral) do indivíduo usando os anticorpos anti-DLL3 ( por exemplo, DLL3#1 ou DLL3#5) da invenção (por exemplo, usando IHC em uma amostra de tecido tumoral).
[0362] As moléculas de anticorpo anti-DLL3 da invenção também podem ser usadas para direcionar células. Em algumas modalidades,
os anticorpos específicos para DLL3 fornecidos aqui são usados para a distribuição de um fármaco ou agente citotóxico a uma célula alvo (por exemplo, uma célula tumoral que expressa DLL3) ao ligar tal fármaco ou agente citotóxico ao dito anticorpo DLL3, assim, por exemplo, matando a dita célula Alvo.
KITS
[0363] A invenção também abrange kits que compreendem pelo menos uma proteína de ligação multiespecífica da invenção (por exemplo, qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#2/CD3#1, DLL3#3/CD3#1, DLL3#4/CD3#1, DLL3#5/CD3#1, DLL3#6/CD3#1, DLL3#7/CD3#1, DLL3#8/CD3#1, DLL3#9/CD3#1, DLL3#10/CD3#1, DLL3#11/CD3#1, DLL3#12/CD3#1, DLL3#13/CD3#1, DLL3#14/CD3#1, DLL3#15/CD3#1, DLL3#16/CD3#1, DLL3#17/CD3#1, DLL3#18/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#2/CD3#2, DLL3#3/CD3#2, DLL3#4/CD3#2, DLL3#5/CD3#2, DLL3#6/CD3#2, DLL3#7/CD3#2, DLL3#8/CD3#2, DLL3#9/CD3#2, DLL3#10/CD3#2, DLL3#11/CD3#2, DLL3#12/CD3#2, DLL3#13/CD3#2, DLL3#14/CD3#2, DLL3#15/CD3#2, DLL3#16/CD3#2, DLL3#17/CD3#2, DLL3#18/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#3, DLL3#4/CD3#3, DLL3#5/CD3#3 e DLL3#6/CD3#3, DLL3#7/CD3#3, DLL3#8/CD3#3, DLL3#9/CD3#3, DLL3#10/CD3#3, DLL3#11/CD3#3, DLL3#12/CD3#3, DLL3#13/CD3#3, DLL3#14/CD3#3, DLL3#15/CD3#3, DLL3#16/CD3#3, DLL3#17/CD3#3, DLL3#18/CD3#3, de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) e, opcionalmente, um ou mais de outros componentes selecionados a partir do grupo que consiste em outros medicamentos usados para o tratamento das doenças e transtornos descritos acima.
[0364] Em uma modalidade, o kit inclui uma composição que contém uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação da invenção na forma de dosagem unitária.
[0365] A invenção também abrange kits que compreendem pelo menos uma proteína de ligação multiespecífica da invenção e um ou mais de outros componentes selecionados a partir do grupo que consiste em outros medicamentos usados para o tratamento das doenças e transtornos descritos acima.
[0366] Em uma modalidade, o kit inclui uma composição que contém uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica da invenção na forma de dosagem unitária (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3). Em uma outra modalidade, o kit inclui uma composição que contém uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica da invenção na forma de dosagem unitária (de preferência qualquer uma de DLL3#1/CD3#1, DLL3#1/CD3#2, DLL3#1/CD3#3, DLL3#2/CD3#1, DLL3#2/CD3#2, DLL3#2/CD3#3, DLL3#3/CD3#1, DLL3#3/CD3#2, DLL3#3/CD3#3) e uma composição que contém uma quantidade eficaz de um antagonista de PD-1 na forma de dosagem unitária, tal como um anticorpo anti-PD- 1, mais preferivelmente PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1 5 conforme descrito aqui (por exemplo, Tabela A) e no documento WO2017/198741.
[0367] Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente estéril que contém tal composição; tais recipientes podem ser caixas, ampolas, garrafas, frascos, tubos, bolsas, sacos, embalagens de blister ou outras formas de recipientes adequadas conhecidas na técnica. Estes recipientes podem ser feitos de plástico, vidro, papel laminado, folha metálica ou outros materiais adequados para conter medicamentos. Além disso, o kit pode compreender a composição farmacêutica em um primeiro recipiente que tem a proteína de ligação da invenção na forma liofilizada e um segundo recipiente com um diluente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água estéril) para injeção. O diluente farmaceuticamente aceitável pode ser usado para reconstituição ou diluição da proteína de ligação.
[0368] Se desejado, uma proteína de ligação multiespecífica da invenção é fornecida juntamente com instruções para administrar as proteínas de ligação multiespecíficas a um indivíduo que tem câncer. As instruções incluirão, em geral, informações sobre o uso da composição para o tratamento ou prevenção de um câncer. Em outras modalidades, as instruções incluem pelo menos um dos seguintes: descrição do agente terapêutico; esquema de dosagem e administração para tratamento ou prevenção de câncer ou seus sintomas; precauções; avisos; indicações; contraindicações; informações de sobredosagem; reações adversas; farmacologia animal; estudos clínicos; e/ou referências. As instruções podem ser impressas diretamente no recipiente (quando presente) ou como uma etiqueta aplicada ao recipiente ou como uma folha separada, panfleto, cartão ou bula fornecida em ou com o recipiente.
[0369] Conforme apresentado aqui, a presente invenção fornece ainda métodos diagnósticos para determinar a expressão de DLL3 em uma amostra biológica. Em um aspecto, a presente invenção fornece kits para realizar estes métodos, bem como instruções para realizar os métodos da presente invenção, tal como coleta de tecido e/ou realização do ensaio de detecção e/ou análise dos resultados.
[0370] O kit compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em, uma composição de anticorpo DLL3 da invenção (por exemplo, anticorpos monoclonais) e instruções de uso. Os kits são úteis para detectar a presença de polipeptídeos de DLL3 em uma amostra biológica, por exemplo, qualquer fluido corporal ou amostras de biópsia de tecido corporal. Em algumas modalidades, o kit pode compreender: um ou mais anticorpos anti-DLL3 capazes de se ligar a um polipeptídeo de DLL3 em uma amostra (por exemplo, anticorpo anti-DLL3 DLL3#1 ou DLL3#5); meios para detectar o polipeptídeo de DLL3 na amostra; e, opcionalmente, meios para comparar o sinal/quantidade do polipeptídeo de DLL3 na amostra com um controle. Um ou mais dos anticorpos anti-DLL3 da invenção podem ser marcados. Os componentes do kit (por exemplo, reagentes) podem ser embalados em um recipiente adequado. O kit pode ainda compreender instruções para usar o kit para detectar os polipeptídeos de DLL3. Em determinadas modalidades, o kit compreende um anticorpo anti-DLL3 da invenção (um primeiro anticorpo) e um segundo anticorpo diferente que se liga ao polipeptídeo de DLL3 ou ao primeiro anticorpo e é conjugado a um marcador detectável.
[0371] O kit também pode compreender, por exemplo, um agente tampão, um conservante ou um agente estabilizante de proteína. O kit pode ainda compreender componentes necessários para detectar o marcador detectável, por exemplo, uma enzima ou um substrato. O kit também pode conter uma amostra de controle ou uma série de amostras de controle, as quais podem ser analisadas e comparadas com a amostra de teste. Cada componente do kit pode ser colocado dentro de um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de uma única embalagem, juntamente com as instruções para interpretar os resultados dos ensaios realizados usando o kit. Os kits da presente invenção podem conter um produto por escrito em ou dentro do recipiente do kit. O produto por escrito descreve como usar os reagentes contidos no kit.
[0372] Conforme adequado, estes componentes de kit sugeridos podem ser embalados de uma maneira usual para uso por aqueles versados na técnica. Por exemplo, estes componentes de kit sugeridos podem ser fornecidos em solução ou como uma dispersão líquida ou similar.
EXEMPLOS
[0373] Os exemplos a seguir ilustram a invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção. Exemplo 1: Concepção e Construção de Proteínas de Ligação à CD3/DLL3
[0374] Os presentes inventores desenvolveram proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam à DLL3 e CD3 e que induzem à ativação de células T, levando à lise de células tumorais que expressam DLL3. O design molecular usado tem um andaime de anticorpo IgG e uma estrutura similar à IgG. Ele tem a tecnologia knob-in-hole no Fc para heterodimerização dos braços Knob (anti-DLL3) e Hole (anti-CD3). Além disso, a proteína de ligação tem sequências peptídicas flexíveis entre a cadeia leve e a cadeia pesada correspondente em cada braço. Assim, a proteína de ligação compreende dois braços, um que se liga à CD3, o outro que se liga à DLL3, cada braço compreendendo um Fab com uma única cadeia e uma região Fc.
[0375] De preferência, a molécula de ligação é biespecífica e bivalente (monovalente para cada um dos dois alvos). Preparação de domínios de ligação que reconhecem DLL3 e CD3 usando recuperação de gene V de alto rendimento de hibridomas e células B isoladas em cultura.
[0376] Para obter ligantes anti-DLL3, hibridomas ou células B únicas derivadas de camundongos de tipo selvagem imunizados com DLL3 e AlivaMab humanizados (Ablexis, San Francisco, CA, EUA: plataforma de camundongo transgênico AlivaMab com loci de imunoglobulina humana) foram cultivados in vitro. Os sobrenadantes foram avaliados quanto à reatividade contra DLL3 humana recombinante pelo AlphaLISA (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) e contra células SHP77
(ATCC, CRL-2195TM) que expressam DLL3 humana através de Citometria de Fluxo.
[0377] Os genes VH e VL da imunoglobulina (Ig) foram, então, amplificados a partir de clones positivos identificados. Para isolar RNA de hibridomas, cerca de 2x106 células de clones únicos foram sedimentadas e usadas como material de origem. Para células B únicas, 100 a 500 células expandidas a partir de células B isoladas foram usadas como material de origem. O RNA foi isolado usando RNeasy Plus (Qiagen, Hilden, Alemanha). O cDNA foi, então, sintetizado usando o kit de síntese de cDNA Smarter (Clontech, Mountain View, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Para facilitar a síntese de cDNA, o oligodT foi usado para iniciar a transcrição reversa de todos os RNAs mensageiros seguido por "capeamento 5' " com um oligonucleotídeo Smarter IIA. A subsequente amplificação dos fragmentos VH e VL foi realizada usando uma amplificação por PCR em 2 etapas usando iniciadores 5' direcionados ao cap Smarter IIA e iniciadores 3' direcionados às regiões de consenso em CH1. Resumidamente, cada reação de PCR de 50 μl consiste em misturas de iniciador direto e reverso a 20 μM, 25 μl de pré-mistura de DNA polimerase PrimeStar Max (Clontech), 2 μl de cDNA não purificado e 21 μl de H2O bidestilada. O programa de ciclagem começa a 94 °C durante 3 min, seguido por 35 ciclos (94 °C durante 30 seg., 50 °C durante 1 min, 68 °C durante 1 min) e termina a 72 °C durante 7 min. O segundo ciclo de PCR foi realizado com os iniciadores de segundo ciclo VL e VH que contêm extensões complementares de 15 pb que "se sobrepõem" às respectivas regiões em seus respectivos vetores mãe pTT5 (VH e VL). O segundo ciclo de PCR foi realizado com o seguinte programa: 94 °C durante 3 min; 35 ciclos (94 °C durante 30 seg, 50 °C durante 1 min, 68 °C durante 1 min) e termina a 72 °C durante 7 min.
[0378] O kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech, U.S.A.) foi usado para clonagem direcional do gene VL em um vetor pTT5 huIgK e do gene VH em um vetor pTT5 huIgG1KO. Para facilitar a clonagem In- Fusion HD, os produtos de PCR foram purificados e tratados com Cloning Enhancer antes da clonagem In-Fusion HD. A clonagem e a transformação foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante (Clontech, U.S.A.). Os DNAs mini-prep foram submetidos a sequenciamento de Sanger para confirmar que fragmentos completos do gene V foram obtidos.
[0379] Usando esta metodologia, pares de genes VH e VL de Ig que codificam domínios de ligação com especificidade pela DLL3 foram preparados. Os anticorpos recombinantes foram produzidos por meio de transfecção transitória de células CHO-E37 com os plasmídeos que codificam as cadeias pesada e leve correspondentes. Triagem Confirmatória de Anticorpos Recombinantes
[0380] Os sobrenadantes que contêm anticorpos recombinantes expressos foram testados por meio de citometria de fluxo quanto à ligação a linhagens de células que expressam DLL3 humana ou cyno. Resumidamente, as células foram incubadas com sobrenadantes recombinantes, lavadas e os mAbs ligados dos sobrenadantes foram detectados com anti-IgG-humana-APC (Jackson ImmunoResearch 109- 136-098). As proporções sinal-para-fundo (S/B) foram calculadas ao dividir a intensidade mediana de fluorescência (MFI) da amostra pela do controle de isotipo (regiões variáveis contra uma proteína não relacionada e diferentes backbones da região constante).
[0381] Ressonância de plasmônio em superfície (SPR) em Biacore 400 foi realizada em sobrenadantes recombinantes. Resumidamente, as IgGs não otimizadas nos sobrenadantes de HTP foram capturadas via Proteína A/G na superfície do sensor durante 60 segundos a 10 µl/min. A ligação de DLL3 humana a 100 nM às IgGs capturadas foi monitorada durante 180 segundos de associação a 30 µl/min, seguido por 120 segundos de dissociação no tampão HBS-EP. A regeneração da superfície da Proteína A/G foi realizada com Glicina, pH de 2,1, entre cada ciclo de ligação. Os seguintes materiais foram usados neste ensaio: Reagente de proteína: DLL3 humana de expressão recombinante. Tampão contínuo do sistema: HBS-EP (HEPES a 10 mM, pH de 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM e polissorbato P20 a 0,005 % v/v). Reagente de captura: Proteína A/G G (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA), com especificidade por todos os isotipos de IgG humana.
[0382] Os clones de interesse (com Kd < 300 pM) foram selecionados para formatação multiespecífica. Proteínas de ligação multiespecíficas foram geradas e posteriormente avaliadas em triagem mecanística e funcional (tal como ligação celular, citotoxicidade e ativação de células T, conforme descrito abaixo). Humanização de Ligantes de DLL3 e CD3
[0383] Sequências de ligantes de DLL3 conforme descrito acima, bem como ligantes de CD3 descritos na literatura (Pessano et al., EMBO J. Fev. 1985; 4(2): 337-44; Salmerón A. et al., J Immunol. 01 de novembro de 1991; 147 (9): 3047-52) foram humanizados e/ou otimizados. Otimização/humanização de sequência de anticorpos é uma metodologia para conceber anticorpos criados em espécies não humanas (contra um antígeno/epítopo específico) para uso como produto terapêutico similar a anticorpos produzidos em seres humanos e, assim, eliminando potenciais efeitos adversos, tal como imunogenicidade, ao mesmo tempo em que retém a especificidade. A abordagem de otimização/humanização de sequência usada aqui foi conforme descrito por Singh et al., 2015 (Singh S. et al., MAbs 2015: 7 (4): 778-91). Em suma, linhages germinativas humanas similares foram identificadas in silico e as variantes de otimização/humanização foram avaliadas usando um método de triagem de fago. As sequências candidatas principais finais foram selecionadas com base na ligação, pontuação humana percentual e pontuação Epivax (ferramenta preditiva in silico para imunogenicidade potencial). Construção de proteínas biespecíficas que se ligam à DLL3 e CD3
[0384] As regiões variáveis dos ligantes de DLL3 e CD3 foram clonadas no vetor de expressão pTT5 (National Research Council, Canadá), usando técnicas comuns de biologia molecular para formar proteínas de ligação biespecíficas com uma unidade de ligação específica pela DLL3 que compreende um Fab com uma única cadeia que se liga à DLL3 e uma região Fc (tal unidade de ligação também denominada aqui como "braço de DLL3" ou "cadeia de DLL3") e uma unidade de ligação específica para CD3 que compreende um Fab com uma única cadeia que se liga à CD3 e uma região Fc (tal unidade de ligação também denominada aqui como "braço de CD3" ou "cadeia de CD3". As regiões Fc dos braços de DLL3 e CD3 incluem mutações "Knob" ou "Hole" (Atwell et al., JMB, 1997, 270, 26-35) e as respectivas cadeias são denominadas ditas como cadeias Knob ou Hole. Para montagem de múltiplos fragmentos de DNA, foram usadas abordagens de montagem Gibson e NEBuilder HiFi DNA, seguindo os protocolos do fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA). As mini- preparações de DNA foram sequenciadas.
[0385] Cada vetor de expressão contém elementos promotores eucariotas para o gene que codifica a cadeia (braço/cadeia de DLL3 ou CD3), isto é, o gene que codifica a sequência sinalizadora e a cadeia leve e pesada, um cassete de expressão para um gene marcador de seleção procariota, tal como ampicilina e uma origem de replicação. Estes plasmídeos de DNA foram propagados em colônias e culturas de por exemplo, E. coli, resistentes à ampicilina e foram purificados. Exemplo 2: Expressão e Purificação de Proteínas de Ligação Bivalentes Biespecíficas que se Ligam à DLL3 e CD3
[0386] Moléculas biespecíficas que se ligam à DLL3 e CD3 foram produzidas por meio de transfecção transitória de células CHO-E com os vetores pTT5 que trazem os genes que codificam a cadeia de DLL3/CD3. Resumidamente, células CHO-E transfectadas que crescem em suspensão em meio isento de soro foram cultivadas em frascos agitados sob agitação a 140 rpm, 37 °C e 5 % de CO2 e mantidos sob condições de crescimento exponencial. No dia da transfecção, as células foram transfectadas quimicamente com plasmídeo de cadeia Knob e plasmídeo de cadeia Hole na proporção em massa de 1:3. Elas foram, então, semeadas a 1 a 2x106 células/ml em 1 L de meio de expressão Gibco FreeStyle™ CHO (LifeTechnologies, NY, US). As células foram, então, incubadas sob agitação orbital durante 10 dias com alimentação única de 200 ml de solução alimentar comercial para permitir a expressão das proteínas. As titulações de anticorpos nos sobrenadantes da cultura celular foram determinados usando um instrumento Octet (Pall ForteBio, CA, US) e pontas de biossensores protA de acordo com as instruções do fabricante.
[0387] Proteínas de ligação à DLL3/CD3 recombinantes foram purificadas do sobrenadante da cultura em um processo em duas etapas: primeiro por meio de cromatografia de afinidade em Proteína A usando a coluna MabSelect™ (GE Healthcare); segundo, através de cromatografia de troca catiônica usando uma coluna Poros 50 HS (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). O material purificado em duas etapas foi armazenado em tampão final de acetato de sódio a 50 mM e NaCl a 100 mM, pH de 5,0. A pureza e o grau de heterogeneidade das amostras foram avaliados por meio de cromatografia analítica de exclusão, espectrometria de massa e ultracentrifugação analítica. As amostras que foram avançadas para teste funcional compreendiam material purificado em duas etapas, com cerca de 99 % de conteúdo monomérico.
Tabela 1: Sequências de aminoácidos e SEQ ID NOs de CDRs, VH, VL, scFabs, sequências do braço de DLL3 e do braço de CD3 das proteínas/construções de anticorpo descritos aqui: SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: DLL3#1
RASQSVSSNFLV 1 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#1
GASTRAS 2 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#1
QQYGDSPYT 3 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#1
GNTFTNYYMH 4 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#1
IIDPSVGSKSYAQKFLG 5 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#1
AGKRFGESYFDY 6 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#2
RASQGISNYLA 7 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#2
AASSLQS 8 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#2
LQHNSSPYT 9 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#2
GYTFTSYYMH 10 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#2
IINPSGGSTSYAQKFQG 11 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#2
GEAVGGNYYYYGMDV 12 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#3
RASQGISNYLV 13 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#3
AVSSLYS 14 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#3
LQHDSYPYT 15 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#3
GYTFTSYYVH 16 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#3
IINPGGGTTSYAQKFLG 17 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#3
GEAVTGNYFYYGMDV 18 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#4
RASKSVSSFGYSFMH 19 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#4
LASNLES 20 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#4
QHSRELPWT 21 LCCDR3
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: DLL3#4
VYTFTSYFMY 22 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#4
EISPTNGNSNLNERFKN 23 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#4
GGDGYLDY 24 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#5
QASQDISNYLN 25 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#5
DASNLET 26 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#5
QQYDNLPTWT 27 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#5
GFTFTGYYIH 28 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#5
WINPNSGGTNYAQKFQG 29 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#5
GWDY 30 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#6
RASQDISNYFA 31 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#6
AASTLQS 32 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#6
QQLNSYPYT 33 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#6
GGSISSYFWS 34 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#6
RIYTSGSTNYNPSLNS 35 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#6
RGDWGGFDI 36 HCCDR3
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNFLVWYQQKPGQAP SEQ ID NO: DLL3#1
RPLIYGASTRASGIPDRFSGSGSGADFTLTISRLEPEDFALYYCQQ 37 VL
YGDSPYTFGQGTTLEIK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFTNYYMHWVRQAPGP SEQ ID NO: DLL3#1
GLEWMGIIDPSVGSKSYAQKFLGRVTIARDTSTSTVFLDLYSLRSE 38 VH
DTAVYFCARAGKRFGESYFDYWGQGTLVTVSS
DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKVPE SEQ ID NO: DLL3#2
PLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSVTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQH 39 VL
NSSPYTFGQGTKLEIK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQ SEQ ID NO: DLL3#2
GLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS 40 VH
EDTAVYYCARGEAVGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLVWFQQKPGKAPK SEQ ID NO: DLL3#3
RLIYAVSSLYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQH 41 VL
DSYPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: DLL3#3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYVHWVRQAPGQ
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência 42 VH GLEWMVIINPGGGTTSYAQKFLGRVTMTRDTSTNTVYMELKSLRS
EDTAVYYCARGEAVTGNYFYYGMDVWGQGTTVTVSS
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSFGYSFMHWYQQKPG SEQ ID NO: DLL3#4
QPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYY 43 VL
CQHSRELPWTFGGGTKLEIK
QVQLQQSGTELVKPGASVKLSCKASVYTFTSYFMYWVKQRPGHG SEQ ID NO: DLL3#4
LEWIGEISPTNGNSNLNERFKNKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSED 44 VH
SAVYYCTRGGDGYLDYWGQGTTLTVSS
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGKAP SEQ ID NO: DLL3#5
KLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQY 45 VL
DNLPTWTFGQGTKVEIK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTGYYIHWVRQAPGQG SEQ ID NO: DLL3#5
LEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDSSINTAFMELSRLTS 46 VH
DDTAVYYCAAGWDYWGQGTLVTVSS
DIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCRASQDISNYFAWYQQKPGKAPKL SEQ ID NO: DLL3#6
LIYAASTLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLN 47 VL
SYPYTFGQGTKLEIK
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYFWSWIRQPAGKGL SEQ ID NO: DLL3#6
EWIGRIYTSGSTNYNPSLNSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTA 48 VH
VYYCARRGDWGGFDIWGQGTVVTVSS EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNFLVWYQQKPGQAP RPLIYGASTRASGIPDRFSGSGSGADFTLTISRLEPEDFALYYCQQ YGDSPYTFGQGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSS SEQ ID NO: DLL3#1
GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG 49 scFab
ASVKVSCKASGNTFTNYYMHWVRQAPGPGLEWMGIIDPSVGSKS YAQKFLGRVTIARDTSTSTVFLDLYSLRSEDTAVYFCARAGKRFGE SYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKVPE PLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSVTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQH NSSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS SEQ ID NO: DLL3#2
GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGAS 50 scFab
VKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYA QKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEAVGGN YYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLVWFQQKPGKAPK
RLIYAVSSLYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQH SEQ ID NO: DLL3#3
DSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN 51 scFab
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGAS VKVSCKASGYTFTSYYVHWVRQAPGQGLEWMVIINPGGGTTSYA QKFLGRVTMTRDTSTNTVYMELKSLRSEDTAVYYCARGEAVTGNY FYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSFGYSFMHWYQQKPG QPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYY CQHSRELPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEG SEQ ID NO: DLL3#4
KSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQSGTELVK 52 scFab
PGASVKLSCKASVYTFTSYFMYWVKQRPGHGLEWIGEISPTNGNS NLNERFKNKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRGGDGY LDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGKAP KLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQY DNLPTWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSS SEQ ID NO: DLL3#5
GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG 53 scFab
ASVKVSCKASGFTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTN YAQKFQGRVTMTRDSSINTAFMELSRLTSDDTAVYYCAAGWDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCRASQDISNYFAWYQQKPGKAPKL LIYAASTLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLN SYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA
DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGSG SEQ ID NO: DLL3#6
SESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLS 54 scFab
LTCTVSGGSISSYFWSWIRQPAGKGLEWIGRIYTSGSTNYNPSLNS RLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRGDWGGFDIWGQ GTVVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC
NVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID NO: CD3#1
RSSTGAVTTSNYAN 55 LCCDR1 SEQ ID NO: CD3#1
GTNKRAP 56 LCCDR2 SEQ ID NO: CD3#1
ALWYSNLWV 57 LCCDR3 SEQ ID NO: CD3#1
GFTFNTYAMN 58 HCCDR1
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: CD3#1
RIRSKYNNYATYYADSVKD 59 HCCDR2 SEQ ID NO: CD3#1
HGNFGNSYVSWFAY 60 HCCDR3 SEQ ID NO: CD3#2 RSSTGAVTTSNYAN 61 LCCDR1 SEQ ID NO: CD3#2 GTNKRAP 62 LCCDR2 SEQ ID NO: CD3#2 ALWYSNLWV 63 LCCDR3 SEQ ID NO: CD3#2
GFTFNTYAMN 64 HCCDR1 SEQ ID NO: CD3#2
RIRSKYINYATYYADSVKD 65 HCCDR2 SEQ ID NO: CD3#2
HGNFGNSYVSWFAY 66 HCCDR3
EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL SEQ ID NO: CD3#1
PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC 67 VL
ALWYSNLWVFGGGTKLTVL
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGK SEQ ID NO: CD3#1
GLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNL 68 VH
KTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA
EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL SEQ ID NO: CD3#2
PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC 69 VL
ALWYSNLWVFGGGTKLTVL
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGK SEQ ID NO: CD3#2
GLEWVARIRSKYINYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLK 70 VH
TEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC ALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL VCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSY
LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECSGGGGSEGKS SEQ ID NO: CD3#1
SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVQLVESGGGLVQP 71 scFab
GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY ATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGN FGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC
ALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL SEQ ID NO: CD3#2 VCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSY 72 scFab LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECSGGGGSEGKS
SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVQLVESGGGLVQP GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYINYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNF
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
GNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNFLVWYQQKPGQAP RPLIYGASTRASGIPDRFSGSGSGADFTLTISRLEPEDFALYYCQQ YGDSPYTFGQGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSS GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG
ASVKVSCKASGNTFTNYYMHWVRQAPGPGLEWMGIIDPSVGSKS SEQ ID NO: DLL3#1 YAQKFLGRVTIARDTSTSTVFLDLYSLRSEDTAVYFCARAGKRFGE 73 cadeia SYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKVPE PLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSVTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQH NSSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGAS
VKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYA SEQ ID NO: DLL3#2 QKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEAVGGN 74 cadeia YYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLVWFQQKPGKAPK RLIYAVSSLYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQH DSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS SEQ ID NO: DLL3#3 GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGAS 75 cadeia VKVSCKASGYTFTSYYVHWVRQAPGQGLEWMVIINPGGGTTSYA
QKFLGRVTMTRDTSTNTVYMELKSLRSEDTAVYYCARGEAVTGNY FYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSFGYSFMHWYQQKPG QPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYY CQHSRELPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEG KSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQSGTELVK
PGASVKLSCKASVYTFTSYFMYWVKQRPGHGLEWIGEISPTNGNS SEQ ID NO: DLL3#4 NLNERFKNKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRGGDGY 76 cadeia LDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGKAP KLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQY DNLPTWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSS GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG
ASVKVSCKASGFTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTN SEQ ID NO: DLL3#5 YAQKFQGRVTMTRDSSINTAFMELSRLTSDDTAVYYCAAGWDYW 77 cadeia GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCRASQDISNYFAWYQQKPGKAPKL LIYAASTLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLN SYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA
DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGSG SEQ ID NO: DLL3#6
SESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLS 78 cadeia
LTCTVSGGSISSYFWSWIRQPAGKGLEWIGRIYTSGSTNYNPSLNS RLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRGDWGGFDIWGQ GTVVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC ALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL VCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSY LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECSGGGGSEGKS SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVQLVESGGGLVQP
GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY SEQ ID NO: CD3#1 ATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGN 79 cadeia FGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC ALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL VCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSY LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECSGGGGSEGKS SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVQLVESGGGLVQP
GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYINYA SEQ ID NO: CD3#2 TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNF 80 cadeia GNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH SEQ ID NO: domínio Fc* QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR 81 (IgG1) EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PG
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SEQ ID NO: Domínio Fc W SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH 82 (IgG1, LALA) QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH SEQ ID NO: Domínio Fc SAV QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR 83 (IgG1, RF/LALA) EEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLS PG ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV SEQ ID NO: Domínio Fc LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP 84 (IgG4Pro) SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLG ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV SEQ ID NO: LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP Domínio Fc W (IgG4Pro) 85 SQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLG ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV SEQ ID NO: Domínio Fc SAV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP 86 (IgG4Pro, RF) SQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLS LSLG
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN SEQ ID NO: região constante de uma
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT 87 cadeia leve capa
HQGLSSPVTKSFNRGEC
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVKVAWKAD SEQ ID NO: região constante de uma GSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQV 88 cadeia leve lambda THEGSTVEKTVAPAECS SEQ ID NO: Ligante GGGGSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGS 89 SEQ ID NO: GGGGSGGGGSGGSGGSGGGGGS Ligante 90 SEQ ID NO: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS Ligante 91 SEQ ID NO: Ligante GGGGSGGGGGGSGGGGGGSGGGGSGGGGGS 92 SEQ ID NO: Ligante GGGGSGGGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS 93 SEQ ID NO: Ligante GGGGSGGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGGS 94 SEQ ID NO: GGGGSGGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGGSGGGSGGG Ligante 95 GS
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: CD3#3
RSSTGAVTTSNYAN 96 LCCDR1 SEQ ID NO: CD3#3
GTNKRAP 97 LCCDR2 SEQ ID NO: CD3#3
ALWYSNLWV 98 LCCDR3 SEQ ID NO: CD3#3
GFTFNTYAMN 99 HCCDR1 SEQ ID NO: CD3#3
RIRSKYANYATYYADSVKD 100 HCCDR2 SEQ ID NO: CD3#3
HGNFGNSYVSWFAY 101 HCCDR3
EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL SEQ ID NO: CD3#3
PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC 102 VL
ALWYSNLWVFGGGTKLTVL
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGK SEQ ID NO: CD3#3
GLEWVARIRSKYANYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNL 103 HL
KTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC ALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL VCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSY
LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECSGGGGSEGKS SEQ ID NO: CD3#3
SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVQLVESGGGLVQP 104 scFab
GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYANY ATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGN FGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQL PRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYFC ALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATL VCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSY LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECSGGGGSEGKS SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVQLVESGGGLVQP
GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYANY SEQ ID NO: CD3#3 ATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGN 105 cadeia FGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG SEQ ID NO: DLL3#7
RASQSVNSNFLA 133 LCCDR1
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: DLL3#7
GTSSRAT 134 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#7
QQYGSSPWT 135 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#7
GFTFSSYGMF 136 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#7
VIWLDGDDEDYVDSVKG 137 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#7
VLDY 138 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#8
KSSQSVLDTSNNKNYLV 139 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#8
WASTRES 140 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#8
QHYYNSPYT 141 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#8
GYTFTDYYMH 142 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#8
WINPNSGGTNYEQKFQG 143 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#8
DAVVIPMDY 144 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#9
RASQSISRSYLA 145 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#9
GASSRAT 146 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#9
QQYGTSPIT 147 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#9
GGSISSYYWS 148 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#9
YRYYSGNTNYNPSLKS 149 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#9
IGVAGFYFDY 150 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#10
RASQSLNSIFLA 151 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#10
GASSRAT 152 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#10
QQYGGSMNT 153 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#10
GYTFTGYYMH 154 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#10
WINPNSGGTIFAQRFQG 155 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#10
DFGDTVGNAFDI 156 HCCDR3
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: DLL3#11
SASSSVTYIH 157 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#11
RTSYLAS 158 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#11
QQRSSYPRT 159 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#11
GYAFSDYWIT 160 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#11
DIYPGSGSTKSSEKFKN 161 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#11
LYYYGSHYLDT 162 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#12
SASSSVTYIH 163 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#12
RTSYLAS 164 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#12
QQRSSYPRT 165 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#12
GYAFSDYWIT 166 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#12
DIYPGSGSTKSSEKFKN 167 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#12
LYYYGSYYLDT 168 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#13
RSSQSIVHSNGNTYLE 169 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#13
KVSNRFS 170 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#13
FQGSHVPYT 171 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#13
GYTFTNYGVT 172 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#13
WINTYSGAPTYADDFNG 173 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#13
LDDYDLYYFDY 174 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#14
KASQSVDYDGDSYMN 175 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#14
AASTLES 176 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#14
QQSDEDPWT 177 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#14
GYTFTDYYIH 178 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#14
YIYPGNSYTAYNQKFKD 179 HCCDR2
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: DLL3#14
SGGSAMDY 180 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#15
KASQSVDYDGDSYLN 181 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#15
AASNLES 182 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#15
QQSSEDPRT 183 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#15
GYTFTNYGMN 184 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#15
WINTYTGEPTYADDFKG 185 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#15
FHFSSNGDAMDN 186 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#16
RASQSVSDWLA 187 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#16
RASSLES 188 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#16
QLYNSYSPT 189 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#16
GFTFSSYWMT 190 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#16
NIKEDGSEKYYVDSVKG 191 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#16
DWGYFDY 192 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#17
RASENIYYSLA 193 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#17
NTNSLED 194 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#17
KQAYDFPLT 195 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#17
GYTFISYYIH 196 HCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#17
WIYPGDGSTNNNEKFKG 197 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#17
GEGNAMDD 198 HCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#18
RASENIYYSLA 199 LCCDR1 SEQ ID NO: DLL3#18
NANSLED 200 LCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#18
KQAYDVPLT 201 LCCDR3 SEQ ID NO: DLL3#18
GYTFTAYFIH 202 HCCDR1
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência SEQ ID NO: DLL3#18
YIDPFNDDTNYNVKFKG 203 HCCDR2 SEQ ID NO: DLL3#18
GTSATLDY 204 HCCDR3
EIVLTQSPDTLSLSPGERATLSCRASQSVNSNFLAWYQQKPGQTP SEQ ID NO: DLL3#7
RLLIFGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY 205 VL
GSSPWTFGQGTKVEIR
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMFWVRQAPGK SEQ ID NO: DLL3#7
GLEWVAVIWLDGDDEDYVDSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRV 206 VH
DDTAIYYCARVLDYWGQGTLVTVSS
DIVMAQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLDTSNNKNYLVWYQQK SEQ ID NO: DLL3#8
PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAV 207 VL
YYCQHYYNSPYTFGQGTKLEIK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQ SEQ ID NO: DLL3#8
GLEWMGWINPNSGGTNYEQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLR 208 VH
SDDTAVYYCTRDAVVIPMDYWGQGTLVTVSS
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISRSYLAWYQQKPGQAP SEQ ID NO: DLL3#9
RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ 209 VL
YGTSPITFGQGTRLEIK
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQTPGKGL SEQ ID NO: DLL3#9
DWIGYRYYSGNTNYNPSLKSRVTISLDMSNNQFSLKLSSVTAADTA 210 VH
IYYCASIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSS
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLNSIFLAWYQQKPGQAP SEQ ID NO: DLL3#10
WLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCQQ 211 VL
YGGSMNTFGQGTKLEIK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRLAPGQ SEQ ID NO: DLL3#10
GLEWMGWINPNSGGTIFAQRFQGRVTMTRDTSISTVYMDLNRLRS 212 VH
DDTAVYYCARDFGDTVGNAFDIWGQGTMVTVSS
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVTYIHWFQQNPGTSPKLWI SEQ ID NO: DLL3#11
YRTSYLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSS 213 VL
YPRTFGGGTKLEIK
QVQLQQPGAELVQPGSSVKMSCKASGYAFSDYWITWVKQRPGQ SEQ ID NO: DLL3#11
GLEWIGDIYPGSGSTKSSEKFKNKATLTADTSSSKAYIQFSSLTPED 214 VH
SAVYYCVSLYYYGSHYLDTWGQGTTLTVSS
QVVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVTYIHWFQQNPGTSPKLW SEQ ID NO: DLL3#12
IYRTSYLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRS 215 VL
SYPRTFGGGTKLEIK
QVQLQQPGAEFVQPGSSVKMSCKASGYAFSDYWITWVKQRPGQ SEQ ID NO: DLL3#12
GLEWIGDIYPGSGSTKSSEKFKNRATLTADTSSSTAYIQFSSLTPED 216 VH
SAVYYCVSLYYYGSYYLDTWGQGTTLTVSS
DVLMTQTPLSLPVSLGDQAAISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKP SEQ ID NO: DLL3#13
GQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVY 217 VL
YCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGVTWVKQAPGKGL SEQ ID NO: DLL3#13
KWMGWINTYSGAPTYADDFNGRFALSLETSASTAYLQINNLKNED 218 VH
TATYFCARLDDYDLYYFDYWGQGTALTVSS SEQ ID NO: DLL3#14 DIVLTQSPASLSVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPG
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência 219 VL QPPKLLIYAASTLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
QQSDEDPWTFGGGTKLEIK
QIQLQQSGPELVKPGVKISCKASGYTFTDYYIHWMKQRPGQGLEW SEQ ID NO: DLL3#14
IGYIYPGNSYTAYNQKFKDKATLTADNPSSTAYMQLSSLTSEDSAV 220 VH
YFCARSGGSAMDYWGQGTSVTVSS
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQKPG SEQ ID NO: DLL3#15
QPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC 221 VL
QQSSEDPRTFGGGTKLEIK
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGL SEQ ID NO: DLL3#15
KWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNED 222 VH
MATYFCTKFHFSSNGDAMDNWGQGTSVTVSS
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVSDWLAWYQQKPGKAP SEQ ID NO: DLL3#16
KFLIYRASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPADFATYYCQLY 223 VL
NSYSPTFGQGTKVEIK
EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGK SEQ ID NO: DLL3#16
GLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA 224 VH
EDTALYYCARDWGYFDYWGQGTLVTVSS
DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQL SEQ ID NO: DLL3#17
LIYNTNSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQA 225 VL
YDFPLTFGAGTKLELK
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFISYYIHWVKQRPGQGLE SEQ ID NO: DLL3#17
WIGWIYPGDGSTNNNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDS 226 VH
AVYFCARGEGNAMDDWGQGTSVTVSS
DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQL SEQ ID NO: DLL3#18
LIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINNMQPEDTATYFCKQA 227 VL
YDVPLTFGAGTKLELK
QVQLQQSGPDLVKPGASVKMSCEASGYTFTAYFIHWVKQKPGQG SEQ ID NO: DLL3#18
LEWIGYIDPFNDDTNYNVKFKGKATLTSDTSSSIAYMELSSLTSEDS 228 VH
SFYYCARGTSATLDYWGHGTTLTVSS EIVLTQSPDTLSLSPGERATLSCRASQSVNSNFLAWYQQKPGQTP RLLIFGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY GSSPWTFGQGTKVEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS SEQ ID NO: DLL3#7
GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRS 229 scFab
LRLSCAASGFTFSSYGMFWVRQAPGKGLEWVAVIWLDGDDEDYV DSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRVDDTAIYYCARVLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIVMAQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLDTSNNKNYLVWYQQK PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAV
YYCQHYYNSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS SEQ ID NO: DLL3#8
VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL 230 scFab
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGS EGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINP
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
NSGGTNYEQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCTR DAVVIPMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISRSYLAWYQQKPGQAP RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ YGTSPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS SEQ ID NO: DLL3#9
GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVHLQESGPGLVKPSETL 231 scFab
SLTCTVSGGSISSYYWSWIRQTPGKGLDWIGYRYYSGNTNYNPSL KSRVTISLDMSNNQFSLKLSSVTAADTAIYYCASIGVAGFYFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLNSIFLAWYQQKPGQAP WLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCQQ YGGSMNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSS SEQ ID NO: DLL3#10
GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG 232 scFab
ASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRLAPGQGLEWMGWINPNSGGTI FAQRFQGRVTMTRDTSISTVYMDLNRLRSDDTAVYYCARDFGDTV GNAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVTYIHWFQQNPGTSPKLWI YRTSYLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSS YPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA
DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGSG SEQ ID NO: DLL3#11
SESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQPGAELVQPGSSV 233 scFab
KMSCKASGYAFSDYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGSTKSSE KFKNKATLTADTSSSKAYIQFSSLTPEDSAVYYCVSLYYYGSHYLD TWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC QVVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVTYIHWFQQNPGTSPKLW IYRTSYLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRS SYPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK SEQ ID NO: DLL3#12 ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS 234 scFab GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQPGAEFVQPGSS
VKMSCKASGYAFSDYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGSTKSS EKFKNRATLTADTSSSTAYIQFSSLTPEDSAVYYCVSLYYYGSYYL DTWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DVLMTQTPLSLPVSLGDQAAISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKP GQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVY YCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSE SEQ ID NO: DLL3#13
GKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLVQSGPELK 235 scFab
KPGETVKISCKASGYTFTNYGVTWVKQAPGKGLKWMGWINTYSG APTYADDFNGRFALSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARLDDY DLYYFDYWGQGTALTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIVLTQSPASLSVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPG QPPKLLIYAASTLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQSDEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEG SEQ ID NO: DLL3#14
KSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLQQSGPELVK 236 scFab
PGVKISCKASGYTFTDYYIHWMKQRPGQGLEWIGYIYPGNSYTAY NQKFKDKATLTADNPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSGGSAM DYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQKPG QPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQSSEDPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKS SEQ ID NO: DLL3#15
SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLVQSGPELKKPG 237 scFab
ETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPT YADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCTKFHFSSNG DAMDNWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVSDWLAWYQQKPGKAP KFLIYRASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPADFATYYCQLY NSYSPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS SEQ ID NO: DLL3#16
GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVHLVESGGGLVQPGGSL 238 scFab
RLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDWGYFDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT
YICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID NO: DLL3#17 DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQL 239 scFab LIYNTNSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQA
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
YDFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLQQSGPEVVKPGASV KISCKASGYTFISYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTNNNEKF KGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDSAVYFCARGEGNAMDDWG QGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQL LIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINNMQPEDTATYFCKQA YDVPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS SEQ ID NO: DLL3#18
GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQSGPDLVKPGAS 240 scFab
VKMSCEASGYTFTAYFIHWVKQKPGQGLEWIGYIDPFNDDTNYNV KFKGKATLTSDTSSSIAYMELSSLTSEDSSFYYCARGTSATLDYWG HGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSC EIVLTQSPDTLSLSPGERATLSCRASQSVNSNFLAWYQQKPGQTP RLLIFGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY GSSPWTFGQGTKVEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRS
LRLSCAASGFTFSSYGMFWVRQAPGKGLEWVAVIWLDGDDEDYV SEQ ID NO: DLL3#7 DSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRVDDTAIYYCARVLDYWGQG 241 cadeia TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIVMAQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLDTSNNKNYLVWYQQK PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAV YYCQHYYNSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGS SEQ ID NO: DLL3#8
EGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAE 242 cadeia
VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINP NSGGTNYEQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCTR DAVVIPMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISRSYLAWYQQKPGQAP RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ YGTSPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVHLQESGPGLVKPSETL
SLTCTVSGGSISSYYWSWIRQTPGKGLDWIGYRYYSGNTNYNPSL SEQ ID NO: DLL3#9 KSRVTISLDMSNNQFSLKLSSVTAADTAIYYCASIGVAGFYFDYWG 243 cadeia QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP
VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLNSIFLAWYQQKPGQAP WLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCQQ YGGSMNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSS GSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLVQSGAEVKKPG
ASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRLAPGQGLEWMGWINPNSGGTI SEQ ID NO: DLL3#10 FAQRFQGRVTMTRDTSISTVYMDLNRLRSDDTAVYYCARDFGDTV 244 cadeia GNAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVTYIHWFQQNPGTSPKLWI YRTSYLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSS YPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF
YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA SEQ ID NO: DLL3#11 DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGSG 245 cadeia SESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQPGAELVQPGSSV
KMSCKASGYAFSDYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGSTKSSE KFKNKATLTADTSSSKAYIQFSSLTPEDSAVYYCVSLYYYGSHYLD TWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG QVVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVTYIHWFQQNPGTSPKLW IYRTSYLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRS SYPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQPGAEFVQPGSS
VKMSCKASGYAFSDYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGSTKSS SEQ ID NO: DLL3#12 EKFKNRATLTADTSSSTAYIQFSSLTPEDSAVYYCVSLYYYGSYYL 246 cadeia DTWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY
FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DVLMTQTPLSLPVSLGDQAAISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKP GQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVY YCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSE GKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLVQSGPELK
KPGETVKISCKASGYTFTNYGVTWVKQAPGKGLKWMGWINTYSG SEQ ID NO: DLL3#13 APTYADDFNGRFALSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARLDDY 247 cadeia DLYYFDYWGQGTALTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIVLTQSPASLSVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPG QPPKLLIYAASTLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQSDEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS SEQ ID NO: DLL3#14
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEG 248 cadeia
KSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLQQSGPELVK PGVKISCKASGYTFTDYYIHWMKQRPGQGLEWIGYIYPGNSYTAY NQKFKDKATLTADNPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSGGSAM DYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQKPG QPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQSSEDPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKS SGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLVQSGPELKKPG
ETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPT SEQ ID NO: DLL3#15 YADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCTKFHFSSNG 249 cadeia DAMDNWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVSDWLAWYQQKPGKAP KFLIYRASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPADFATYYCQLY NSYSPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSEVHLVESGGGLVQPGGSL
RLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVD SEQ ID NO: DLL3#16 SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDWGYFDYW 250 cadeia GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQL LIYNTNSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQA
YDFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN SEQ ID NO: DLL3#17 NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS 251 cadeia KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS
GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQIQLQQSGPEVVKPGASV KISCKASGYTFISYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTNNNEKF KGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDSAVYFCARGEGNAMDDWG
SEQ ID Breve Descrição da Sequência Número Sequência
QGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQL LIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINNMQPEDTATYFCKQA YDVPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEGKSSGS GSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSQVQLQQSGPDLVKPGAS
VKMSCEASGYTFTAYFIHWVKQKPGQGLEWIGYIDPFNDDTNYNV SEQ ID NO: DLL3#18 KFKGKATLTSDTSSSIAYMELSSLTSEDSSFYYCARGTSATLDYWG 252 cadeia HGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Região constante de ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA SEQ ID NO: cadeia pesada LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN 253 CH1 TKVDKRVEPKSC
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGS LSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASST
KVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLS SEQ ID NO: PIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLR Mouse IgG2a HC 254 VVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAP
QVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNY KNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNH
HTTKSFSRTPGK LC capa de RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGS SEQ ID NO: camundongo ERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEAT 255
HKTSTSPIVKSFNRNEC * A sequência sublinhada indica a região de dobradiça Exemplo 3: Produção de Proteínas Recombinantes • DLL3-His humana
[0388] Uma linhagem de células para produzir DLL3-His humana foi gerada usando células HEK-293 (Thermo Fisher), o Lenti-X Lentiviral
System (Clontech) e plasmídeo que codifica DLL3-His humana (DLL3 humana N° de Acesso Q9NYJ7 huDLL3-His: SEQ ID NO: 106). Para a expressão, as células foram cultivadas e expandidas a 37 °C, 5 % de CO2 e agitação a 140 rpm. No Dia 0 de expressão, as células foram sedimentadas e ressuspensas em meio Expi 293. No dia 3 de expressão, o sobrenadante da cultura condicionado foi coletado ao sedimentar as células durante 40 minutos a 4700 rpm. Inibidores de protease foram adicionados à biomassa antes de purificação. A expressão foi confirmada por Western blot. O sobrenadante da cultura condicionado foi ajustado com TCEP a 0,5 mM, CHAPS a 0,02 %, imidazol a 10 mM. A purificação foi realizada em uma coluna HisTrap Ni Excel e Tampão A: MES a 50 mM, NaCl a 50 mM, TCEP a 0,5 mM, CHAPS a 0,02 %, pH de 6,5. A proteína de interesse foi eluída em tampão A suplementado com imidazol a 0,5 M, pH de 8,5, usando um gradiente de eluição de imidazol a 20 mM a imidazol a 500 mM. As frações reunidas foram dialisadas em tampão: MES a 50 mM, NaCl a 50 mM, TCEP a 1 mM, CHAPS a 0,02 %, Arginina a 0,2 M, glicerol a 3 %, pH de 6,5. O material purificado foi qualificado por meio de espectrometria de massa e ultracentrifugação analítica. • Cyno DLL3-His
[0389] Uma linhagem de células para produzir Cyno DLL3-His foi gerada usando células HEK-293 (Thermo Fisher), o Lenti-X Lentiviral System (Clontech) e o plasmídeo que codifica Cyno DLL3-His (Cyno DLL3 N° de Acesso XM_005589196.1 (RefSeq) ; Cyno DLL3-His: SEQ ID NO: 107). Para expressão, as células foram cultivadas e expandidas a 37 °C, 5 % de CO2 e agitadas a 140 rpm. No Dia 0 de expressão, as células foram sedimentadas e ressuspensas em meio Expi 293. No dia 3 de expressão, o sobrenadante da cultura condicionado foi coletado ao sedimentar as células durante 40 minutos a 4700 rpm. Inibidores de protease foram adicionados à biomassa antes de purificação. A expressão foi confirmada por Western blot. O sobrenadante da cultura condicionado foi ajustado com TCEP a 0,5 mM, CHAPS a 0,02 %, imidazol a 10 mM. A purificação foi realizada em uma coluna HisTrap Ni Excel e Tampão A: MES a 50 mM, NaCl a 50 mM, TCEP a 0,5 mM, CHAPS a 0,02 %, pH de 6,5. A proteína de interesse foi eluída em tampão A suplementado com imidazol a 0,5 M, pH de 8,5, usando um gradiente de eluição de imidazol a 20 mM a imidazol a 500 mM. As frações reunidas foram dialisadas em tampão: MES a 50 mM, NaCl a 50 mM, TCEP a 1 mM, CHAPS a 0,02 %, Arginina a 0,2 M, glicerol a 3 %, pH de 6,5. O material purificado foi qualificado por meio de espectrometria de massa e ultracentrifugação analítica. • CD3 E+G HuFc-6xHis humana (E+G indica subunidades )
[0390] Uma linhagem de células para produzir CD3 E+G HuFc- 6xHis humana foi gerada usando células HEK-293 (Thermo Fisher), o Lenti-X Lentiviral System (Clontech) e plasmídeo que codifica CD3 E+G HuFc-6xHis humana (CD3E Humana, N° de Acesso: P07766; CD3E+G- HuFc-His humana: SEQ ID NO: 108). Para expressão, as células foram cultivadas e expandidas em meio Freestyle 293, a 37 °C, ambiente com 8 % de CO2 umidificado e agitação a 135 rpm. O sobrenadante da cultura condicionado foi coletado no Dia 6 por meio de centrifugação durante 30 minutos a 9300xg. A expressão foi monitorada por SDS- PAGE e Western Blotting. O sobrenadante da cultura condicionado foi ajustado com sacarose a 0,2 M, glicerol a 5 %, CHAPS a 0,01 % e imidazol a 10 mM. O pH foi, então, ajustado para 7,2. A purificação foi realizada em um processo em duas etapas: purificação por afinidade usando resina Ni/NTA (incubação durante a noite a 4 °C e eluição com Imidazol a 250 mM); seguido por cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna Superdex 200 em tampão de PBS com sacarose a 0,2 M, glicerol a 5 %, CHAPS a 0,01 %, TCEP a 1 mM, pH de 7,2. O material agrupado foi concentrado usando um dispositivo de centrifugação em membrana Viva Cell 100 com MWCO de 10K antes da análise final e armazenamento. O material purificado foi qualificado por meio de espectrometria de massa e ultracentrifugação analítica. • Cyno CD3 E+G HuFc-6xHis (E+G indica subunidades )
[0391] Uma linhagem de células para produzir Cyno CD3 E+G HuFc-6xHis foi gerada usando células HEK-293 (Thermo Fisher), o Lenti-X Lentiviral System (Clontech) e o plasmídeo que codifica Cyno CD3 E+G HuFc-6xHis (CD3E de Cynomolgus, N° de Acesso: Q95LI5, CD3 E+G huFc-His de cyno: SEQ ID NO: 109). Para expressão, as células foram cultivadas e expandidas em meio Freestyle 293 a 37 °C, ambiente com 8 % de CO2 umidificado e agitação a 135 rpm. O sobrenadante da cultura condicionado foi coletado no Dia 6 por meio de centrifugação durante 30 minutos a 9300xg. A expressão foi monitorada por SDS-PAGE e Western Blotting. O sobrenadante da cultura condicionado foi ajustado com sacarose a 0,2 M, glicerol a 5 %, CHAPS a 0,01 % e imidazol a 10 mM. O pH foi, então, ajustado para 7,2. A purificação foi realizada em um processo em duas etapas: purificação por afinidade usando resina Ni/NTA (incubação durante a noite a 4 °C e eluição com Imidazol a 250 mM); seguido por cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna Superdex 200 em tampão de PBS com sacarose a 0,2 M, glicerol a 5 %, CHAPS a 0,01 %, TCEP a 1 mM, pH de 7,2. O material agrupado foi concentrado usando um dispositivo de centrifugação em membrana Viva Cell 100 com MWCO de 10K antes da análise final e armazenamento. O material purificado foi qualificado por meio de espectrometria de massa e ultracentrifugação analítica. Exemplo 4A: Determinação Com Base em SPR de Afinidades por DLL3 e Subunidades Ɛ de CD3 Recombinantes e Reatividade Cruzada Entre Espécies
[0392] A afinidade de ligação de construções biespecíficas de DLL3/CD3 purificadas para proteínas de fusão de DLL3-ECD e Fc de cyno e humanas e subunidades Ɛ de CD3 de cyno e humanas foi determinada por meio de ressonância de plasmônio em superfície (SPR), usando um instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad). O tampão contínuo e todas as diluições (exceto onde indicado) foram feitas em PBS-T-EDTA. O chip sensor GLM (Bio-Rad) foi normalizado e pré- condicionado de acordo com as recomendações do fabricante. O chip sensor foi ativado com mistura igual de EDC/s-NHS na direção horizontal durante 300 segundos em uma vazão de 30 μl/min e imobilizado com proteína A/G (20 μg/ml em acetato a 10 mM, pH de 4,5) em na direção horizontal durante 300 segundos em uma vazão de 30 μl/min, resultando em ~ 5000 RU de proteína A/G na superfície. O chip sensor foi desativado com etanolamina.HCl a 1 M na direção horizontal durante 300 segundos em uma vazão de 30 µl/min. O chip sensor foi estabilizado durante 18 segundos com ácido fosfórico a 0,85 % em uma vazão de 100 µl/min 3 vezes horizontalmente e 3 vezes verticalmente.
[0393] Para determinação da cinética de ligação à DLL3, as moléculas biespecíficas foram capturadas individualmente na superfície da proteína A/G verticalmente durante 250 segundos em uma vazão de 25 µl/min. A linha de base foi estabilizada pela injeção de PBS-T-EDTA durante 60 segundos em uma vazão de 40 µl/min horizontalmente. O analito (hu DLL3 ou cy DLL3) foi injetado horizontalmente sobre o anticorpo capturado durante 600 segundos em uma vazão de 40 µl/min e uma dissociação durante 2700 segundos. As concentrações do analito foram de 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2,5 nM e 1,25 nM. A superfície foi regenerada pela injeção de solução de ácido fosfórico a 0,85 % durante 18 segundos em uma vazão de 100 µl/min uma vez horizontalmente e uma vez verticalmente.
[0394] Para a determinação da cinética de ligação à CD3, hu CD3Ɛ-Fc e cy CD3Ɛ-Fc (dissolvido em acetato com pH de 4,5) foi imobilizada diretamente na superfície do sensor por meio de acoplamento de amina durante 140 segundos em uma vazão de 30 µl/min verticalmente. A linha de base foi estabilizada pela injeção de PBS-T-EDTA durante 60 segundos em uma vazão de 40 µl/min horizontalmente. O analito (a molécula biespecífica) foi injetado horizontalmente sobre a construção de CD3Ɛ-Fc capturada durante 600 segundos em uma vazão de 40 µl/min e uma dissociação durante 600 segundos. As concentrações do analito foram 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, 31,3 nM e 15,6 nM ou 2 µM, 1 µM, 0,5 µM, 0,25 µM e 0,125 µM. A superfície foi regenerada pela injeção de solução de ácido fosfórico a 0,85 % durante 18 segundos em uma vazão de 100 µl/min uma vez horizontalmente e uma vez verticalmente.
[0395] O ponto intermediário (interações com a superfície do sensor) e o branco (PBS-T-EDTA) foram subtraídos dos dados brutos. Os sensorgramas foram, então, ajustados ao modelo cinético de 1:1 para fornecer as constantes de taxa (ka, kd), bem como valor de afinidade (KD) para hu DLL3 e cy DLL3 e ajustados globalmente ao equilíbrio para fornecer valor de afinidade (KD) para hu CD3Ɛ e cy CD3Ɛ.
[0396] As proteínas de ligação à DLL3/CD3 descritas aqui mostraram afinidades pela DLL3 na faixa de pM. As afinidades pela subunidade CD3Ɛ estavam na faixa de baixo nM. A lacuna entre espécies entre seres humanos e cyno é equilibrada. Afinidades de três proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 105, respectivamente) são mostradas na Tabela 2A. Tabela 2A: Afinidades (KD) de proteínas de ligação à DLL3/CD3 pela DLL3 e subunidade CD3Ɛ de macaco cynomolgus e ser humano, conforme determinado por meio de análise SPR e lacunas entre espécies.
Proteína de DLL3 DLL3 ligação Lacuna de afinidde CD3Ɛ recomb. CD3Ɛ recomb. Lacuna de afinidade recomb. recomb. DLL3/CD3 KD hu/cyno DLL3 humana de cyno KD hu/cyno CD3Ɛ humana de cyno DLL3#3/ < 10 pM < 10 pM 1 7 nM 8 nM 1,1 CD3#1 DLL3#3/ < 10 pM < 10 pM 1 90 nM 100 nM 1,1 CD3#2 DLL3#3/ < 10 pM < 10 pM 1 68 nM 71 nM 1,04 CD3#3 Exemplo 4B: Determinação Com Base em SPR de Afinidades por DLL3 e CD3Ɛ Recombinantes
[0397] A afinidade de ligação de construções biespecíficas de DLL3/CD3 purificadas pela proteína de fusão Fc e DLL3-ECD humana e subunidades CD3Ɛ humana foi determinada por meio de Ressonância de Plasmônio em Superfície (SPR) usando um instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad). O método foi similar àquele do Exemplo 4A, com algumas diferenças, conforme descrito abaixo.
[0398] Para determinação da cinética de ligação à DLL3, as moléculas anti-DLL3/CD3 foram capturadas individualmente sobre a superfície da proteína A/G verticalmente durante 200 segundos em uma vazão de 30 µl/min. A linha de base foi estabilizada pela injeção de PBS- T-EDTA durante 60 segundos em uma vazão de 30 µl/min horizontalmente. O analito (hu DLL3) foi injetado horizontalmente sobre o anticorpo capturado durante 300 segundos em uma vazão de 30 µl/min e uma dissociação durante 1800 segundos. As concentrações do analito foram de 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2,5 nM e 1,25 nM. A superfície foi regenerada pela injeção de solução de ácido fosfórico a 0,85 % durante 18 segundos em uma vazão de 100 µl/min uma vez horizontalmente e uma vez verticalmente.
[0399] Para determinação da cinética de ligação à CD3, HuCD3E_HuCD3G-Fc (dissolvido em acetato com pH de 4,5) foi imobilizado diretamente sobre a superfície do sensor através de acoplamento de amina durante 360 segundos em uma vazão de 30 µl/min verticalmente. A linha de base foi estabilizada pela injeção de PBS-T-EDTA durante 60 segundos em uma vazão de 30 µl/min horizontalmente. Os analitos (todas as moléculas anti-DLL3/CD3) foram injetados horizontalmente sobre o anticorpo capturado durante 600 segundos em uma vazão de 30 µl/min e uma dissociação durante 1800 segundos. As concentrações do analito foram 250 nM, 83,3 nM, 27,8 nM, 9,3 nM e 3,1 nM. A superfície foi regenerada pela injeção de solução de ácido fosfórico a 0,85 % durante 18 segundos em uma vazão de 100 µl/min uma vez horizontalmente e uma vez verticalmente.
[0400] As afinidades de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO : 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO : 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 105) são mostradas na Tabela 2B. Tabela 2B: Afinidades (KD) de proteínas de ligação à DLL3/CD3 pela DLL3 humana e subunidade CD3Ɛ conforme determinado por análise SPR Proteína de ligação huDLL3 recomb. huCD3Ɛ recomb. à DLL3/CD3 humana humana DLL3#1/ 52 pM 2 nM CD3#1 DLL3#2/ 91 pM 3 nM CD3#1
Proteína de ligação huDLL3 recomb. huCD3Ɛ recomb. à DLL3/CD3 humana humana DLL3#3/ 75 pM 2 nM CD3#1 DLL3#3/ 120 pM 7 nM CD3#2 DLL3#3/ 116 pM 4 nM CD3#3 DLL3#4/ < 20 pM 2 nM CD3#1 DLL3#5/ < 20 pM 3 nM CD3#1 DLL3#6/ 152 pM 2 nM CD3#1 DLL3#7/ 637 pM 1 nM CD3#1 DLL3#8/ 40 pM 2 nM CD3#1 DLL3#9/ 46 pM 2 nM CD3#1 DLL3#10/ 141 pM na CD3#1 DLL3#11/ 37 pM 2 nM CD3#1 DLL3#12/ < 20 pM 2 nM CD3#1 DLL3#13/ 23 pM 3 nM CD3#1 DLL3#14/ 60 pM 3 nM CD3#1 DLL3#15/ na na CD3#1 DLL3#16/ 228 pM 2 nM CD3#1 DLL3#17/ < 20pM 2 nM CD3#1 DLL3#18/ < 20 pM 3 nM
Proteína de ligação huDLL3 recomb. huCD3Ɛ recomb. à DLL3/CD3 humana humana CD3#1 Exemplo 5: Geração de Células HEK293 que Expressam o Domínio Extracelular e seus Subdomínios na Superfície Celular
[0401] Para a geração de células HEK293 estáveis que expressam DLL3 humana de comprimento total (Uniprot: Q9NYJ7), DLL3 de cynomolgus (UPI0003AB95BD), DLL1 humana (Q00548) e DLL4 humana (Q9NR61), respectivamente, a respectiva sequência codificadora foi clonada em pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) e uma etiqueta FLAG foi inserida entre a sequência sinalizadora e o domínio extracelular. A expressão na superfície celular foi verificada usando um anticorpo anti-FLAG (clone M2, Sigma) seguido por um anticorpo anti- IgG1 de camundongo monoclonal (Acris).
[0402] O domínio extracelular do DLL3 consiste em diferentes subdomínios: • Peptídeo sinalizador de Hu DLL3: aa 1-26 • Domínio ECD N-terminal de Hu DLL3: aa 27-175 • Hu DLL3 DSL: aa 176-215 • Hu DLL3 EGF1: aa 216-249 • Hu DLL3 EGF2: aa 274-310 • Hu DLL3 EGF3: aa 312-351 • Hu DLL3 EGF4: aa 353-389 • Hu DLL3 EGF5: aa 391-427 • Hu DLL3 EGF6: aa 429-465 • Peptídeo proximal da membrana: aa 466-492
[0403] Os seguintes subdomínios de DLL3 foram expressos na superfície celular de células HEK293: • Hu DLL3 EGF1+2: Uniprot: Q9NYJ7 aa 216-310 • Hu DLL3 EGF2+3: Uniprot: Q9NYJ7 aa 274-351 • Hu DLL3 EGF3+4: Uniprot: Q9NYJ7 aa 312-389
• Hu DLL3 EGF4+5: Uniprot: Q9NYJ7 aa 353-427 • Hu DLL3 EGF5+6: Uniprot: Q9NYJ7 aa 391-465 • Hu DLL3 EGF6+peptídeo proximal da membrana: Uniprot: Q9NYJ7 aa 429-492
[0404] Para a geração de células HEK293 que expressam subdomínios marcados com 6-His-myc de DLL3 humana, as respectivas sequências codificadoras foram clonadas em pcDNA 3.1 (Thermo Fisher Scientific). As construções contêm uma sequência principal Vk de IgG de camundongo N-terminal, seguido por um marcador 6-Histidina-myc e o respectivo domínio de DLL3 humana. Para assegurar a localização na superfície celular dos domínios de DLL3 humana, todas as construções foram seguidas por um ligante de Ser/Gly, o domínio transmembrana (aa266-288) e o domínio intracelular (aa 289-314) de EpCAM humana (P16422). A expressão dos subdomínios foi verificada usando anticorpos IgG2a monoclonais de camundongo contra vários domínios, conforme descrito no documento WO 2013126746. O anticorpo monoclonal ligado foi detectado com uma IgG (F(ab')2)-RPE de cabra anti-camundongo (Jackson Immuno Research). As amostras foram medidas por citometria de fluxo. A expressão de DLL1 e DLL4 humana foi confirmada por meio de análise FACS usando anticorpos anti-DLL1 (R&D Systems, MAB1818) e anti- DLL4 R&D Systems, MAB1506) seguido por anticorpos secundários anti-camundongo ou anti-camundongo marcados com PE (consulte Figura 5, painel direito).
Tabela 3: Sequências de vários subdomínios de DLL3 expressos em células HEK293 ID Construção Sequência
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPDYKDDDDKAGVFELQIHSF GPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALG AALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFII ETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAG AWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCA
PLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTV DLL3 humana de PVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSET SEQ ID NO: comprimento completo PRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPD 110 marcada com FLAG SAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRC
RCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCA LGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGY MGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVA AGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALN NLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVAT PLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK MVSPRMSRLLSQTVILALIFIPQARPDYKDDDDKAGVFELQIHSF GPGPGPGAPRSPCSARGPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALG AALSARGPVYTEQPEAPAPDLPLPNGLLQVPFRDAWPGTFSLII ETWREELGDQIGGPAWSLLARVTRRRRLAAGGPWARDIQRAG AWELRFSYRARCELPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAP
LEDECEAPPVCRAGCSLEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCMVP DLL3 de cyno de VSTSSCLGLRGPSSTTTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETP SEQ ID NO: comprimento completo GSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDS 111 marcada com FLAG AYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRC
RCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCA LGFGGRNCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGY MGARCEFPVHPDGVSALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVA AGVAGAALLLVHVRRRGHAQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALN NLRTQEGPGDVPSSSVDWNRPEDVDSRGIYVISAPSIYAREVA MPLFPPLHTGRAGQRQNLLFPFPSSILSVK
ID Construção Sequência
MGSRCALALAVLSALLCDYKDDDDKQVWSSGVFELKLQEFVNK KGLLGNRNCCRGGAGPPPCACRTFFRVCLKHYQASVSPEPPC TYGSAVTPVLGVDSFSLPDGGGADSAFSNPIRFPFGFTWPGTF SLIIEALHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHS SGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGER GEKVCNPGWKGPYCTEPICLPGCDEQHGFCDKPGECKCRVG WQGRYCDECIRYPGCLHGTCQQPWQCNCQEGWGGLFCNQD
LNYCTHHKPCKNGATCTNTGQGSYTCSCRPGYTGATCELGIDE DLL1 humana de SEQ ID NO: CDPSPCKNGGSCTDLENSYSCTCPPGFYGKICELSAMTCADGP comprimento completo 112 CFNGGRCSDSPDGGYSCRCPVGYSGFNCEKKIDYCSSSPCSN marcada com FLAG
GAKCVDLGDAYLCRCQAGFSGRHCDDNVDDCASSPCANGGT CRDGVNDFSCTCPPGYTGRNCSAPVSRCEHAPCHNGATCHER GHRYVCECARGYGGPNCQFLLPELPPGPAVVDLTEKLEGQGG PFPWVAVCAGVILVLMLLLGCAAVVVCVRLRLQKHRPPADPCR GETETMNNLANCQREKDISVSIIGATQIKNTNKKADFHGDHSAD KNGFKARYPAVDYNLVQDLKGDDTAVRDAHSKRDTKCQPQGS SGEEKGTPTTLRGGEASERKRPDSGCSTSKDTKYQSVYVISEE KDECVIATEV MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGDYKDDDDKSGVFQLQL QEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFG TVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEA WHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLT RLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLS CLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRL
CNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTH DLL4 humana de HSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNP SEQ ID NO: comprimento completo CRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNG 113 marcada com FLAG GSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGG
QCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCH DLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDL STDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSFPWVAVSLGVGLAVLL VLLGMVAVAVRQLRLRRPDDGSREAMNNLSDFQKDNLIPAAQL KNTNQKKELEVDCGLDKSNCGKQQNHTLDYNLAPGPLGRGTM PGKFPHSDKSLGEKAPLRLHSEKPECRISAICSPRDSMYQSVCLI
SEERNECVIATEV SEQ ID NO: Etiqueta FLAG DYKDDDDK 114 SEQ ID NO: Líder Vk METDTLLLWVLLLWVPGSTGD 115 SEQ ID NO: Etiqueta 6His-myc HHHHHHEQKLISEEDL 116 SEQ ID NO: Ligante de Ser/Gly SGGGGS 117 SEQ ID NO: Domínio transmembrana
AGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVI 118 de EpCAM SEQ ID NO: Domínio intracelular de
SRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA 119 EpCAM
ID Construção Sequência SEQ ID NO: EGF1 APLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCT 120
APLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSC SEQ ID NO: Hu DLL3 EGF 1+2 LSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECT 121
CPRGFYGLRCE SEQ ID NO: EGF2 GPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCE 122 SEQ ID NO: GPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVT Hu DLL3 EGF 2+3 123 CADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCE SEQ ID NO: EGF3 SGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCE 124 SEQ ID NO: SGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKR Hu DLL3 EGF 3+4 125 VDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCE SEQ ID NO: EGF4 RVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCE 126 SEQ ID NO: RVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDD Hu DLL3 EGF 4+5 127 CAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCR SEQ ID NO: EGF5 DLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCR 128 SEQ ID NO: DDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPC Hu DLL3 EGF 5+6 129 AARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCE SEQ ID NO: EGF6 RADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCE 130 SEQ ID NO: Hu DLL3 EGF6-peptídeo RADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHP 131 proximal da membrana DGASALPAAPPGLRPGDPQRYL SEQ ID NO: Peptídeo proximal da
FPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYL 132 membrana Exemplo 6: Mapeamento de Domínios de Epítopo de Proteínas de Ligação à DLL3/CD3
[0405] Os domínios de epítopo foram determinados pela ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 a linhagens de células recombinantes que expressam subdomínios de DLL3 (consulte Figura 2). A geração destas linhagens de células é descrita no Exemplo 5.
[0406] As proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram produzidas por meio de transfecção transitória de células CHO-E com os vetores pTT5 que portam os genes que codificam a cadeia conforme descrito no Exemplo 2.
[0407] Células que expressam subdomínios de DLL3 foram coradas com proteínas de ligação à DLL3/CD3 purificadas em duas etapas em tampão de FACS a 1,6 nM (PBS/BSA a 0,05 %/azida de sódio a 0,05
%). As moléculas ligadas foram detectadas com anticorpo secundário anti-humano conjugado com PE (Sigma-Aldrich,#P8047). Como controle negativo, as células foram incubadas apenas com anticorpo secundário. As amostras foram medidas por meio de citometria de fluxo. As Figuras 3A-C mostram ligantes exemplificativos (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80) que se liga a diferentes regiões de DLL3. As sequências dos domínios de epítopo estão listadas no Exemplo 5, Tabela 3. Exemplo 7: Reatividade Cruzada Entre Espécies
[0408] A reatividade cruzada entre espécies foi determinada pela ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 a células NCI-H82 (HTB- 175TM) e SHP77 (ATCC, CRL-2195TM), duas linhagens de células de SCLC, bem como a uma linhagem de células recombinante que expressa DLL3 de cynomolgus (geração da linhagem de células descrita no Exemplo 5).
[0409] As proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram produzidas por meio de transfecção transitória de células CHO-E com os vetores pTT5 que portam os genes que codificam a cadeia, conforme descrito no Exemplo 2. Células que expressam DLL3 humana ou de cynomolgus foram coradas com proteínas de ligação à CD3/DLL3 a 1,6 nM purificadas em duas etapas com concentrações crescentes em tampão de FACS (PBS/BSA a 0,05 %/azida de sódio a 0,05 %). As moléculas ligadas foram detectadas com anticorpo secundário anti-humano conjugado com PE (Sigma-Aldrich,#P8047). Como controle negativo, as células foram incubadas apenas com anticorpo secundário. As amostras foram medidas por meio de citometria de fluxo. A Figura 4 mostra a ligação a células humanas e de cyno que expressam DLL3 de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de S EQ ID NO: 73 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 74 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 76 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 77 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 ou uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 78 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79). Exemplo 8: Confirmação da Ausência de Ligação à DLL1 e DLL4 humanas
[0410] A ausência de reatividade cruzada com DLL1 e DLL4 humana foi determinada pela ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 a células recombinantes que expressam DLL1 ou DLL4 humana (geração de linhagens de células descritas no Exemplo 5).
[0411] As proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram produzidas por meio de transfecção transitória de células CHO-E com os vetores pTT5 que portam os genes que codificam a cadeia, conforme descrito no Exemplo 2.
[0412] Células que expressam DLL1 e DLL4 foram coradas com proteínas de ligação à DLL3/CD3 a 1,6 nM purificadas em duas etapas com concentrações crescentes em tampão FACS (PBS/BSA a 0,05 %/azida de sódio a 0,05 %). As moléculas ligadas foram detectadas com anticorpo secundário anti-humano conjugado com PE (Sigma- Aldrich,#P8047). Como controle negativo, as células foram incubadas apenas com anticorpo secundário. As amostras foram medidas por meio de citometria de fluxo. A expressão de DLL1 e DLL4 humana foi confirmada através de análise FACS usando anticorpos anti-DLL1 (R&D Systems, MAB1818) e anti-DLL4 R&D Systems, MAB1506) seguido por anticorpos secundários anti-camundongo ou anti-camundongo marcados com PE. A Figura 5 mostra a ligação de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 74 e um Cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 76 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 77 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 ou uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 78 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79) para células humanas que expressam DLL1 e DLL4. Exemplo 9: Ligação de Proteínas de Ligação à DLL3/CD3 a Linhagens de Células de SCLC e Células T
[0413] A ligação de proteínas de ligação à DLL3/CD3 a linhagens de células de SCLC humano foi testada por meio de citometria de fluxo de NCI-H82 (HTB-175TM) e SHP77 (ATCC, CRL-2195TM). As proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram produzidas conforme descrito no Exemplo 2.
[0414] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humanas foram preparadas por meio de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll a partir de preparações de linfócitos enriquecidos (leucócitos), um produto secundário de bancos de sangue que coletam sangue para transfusões. Todas as camadas leucocitárias foram obtidas após consentimento informado de acordo com a Declaração de
Helsinque e com a aprovação do comitê de ética cantonal da Áustria e as PBMCs foram preparadas no mesmo dia da coleta. Portanto, as células mononucleares foram isoladas por meio de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll (35 min sem parar a 1400 rpm) e lavagens extensas com PBS. Os eritrócitos restantes foram removidos através de incubação durante 3 minutos em tampão de lise ACK (Thermo Fisher Scientific, A1049201), seguido por lavagem em PBS, antes de suspensão em meio de ensaio que contém RPMI 1640 GlutaMAX (Gibco#61870-010), soro AB humano a 5 % (Gemini, GemCell cat#100- 512 LOT#H56500I) + MEM-NEAA a 1 % (Gibco#11140-035), HEPES a 10 mM (Affymetrix#7365-49-9), beta-Mercaptoetanol a 10 μM (Gibco#21985-023) e piruvato de sódio (Gibco#11360-039).
[0415] As células T foram isoladas por meio de seleção negativa usando o kit Pan T Cell Isolation II (Miltenyi Biotec#130-091-156). Em suma, as células foram ressuspensas em 40 μl de tampão PBS/BSA a 0,05 % (Gibco ref#041-94553 M)/EDTA a 2 mM (Invitrogen ref#15575- 038) por 10 células Mio e incubadas com 10 μl de coquetel de Biotina- Anticorpo 10 células Mio durante 5 min a 4 °C. Subsequentemente, 30 µl de tampão e 20 µl de MicroBeds anti-biotina/10 milhões de células foram adicionados e incubados durante 10 min a 4 °C. Posteriormente, a mistura foi colocada em uma coluna 25LS pré-enxaguada (Miltenyi Biotec#130-042-401) no campo magnético de um separador MACS adequado (Miltenyi Biotec). O fluxo foi coletado novamente e lavado em meio de ensaio.
[0416] As células (células T ou células de SCLC humano) foram coradas com concentrações crescentes de proteínas de ligação à DLL3/CD3 purificadas em duas etapas com concentrações crescentes em tampão de FACS (PBS/BSA A 0,5 %/azida de sódio a 0,05 %). As moléculas ligadas foram detectadas com anticorpo secundário anti- humano conjugado com PE (Sigma-Aldrich,#P8047). As proteínas de ligação à DLL3/CD3 direcionadas aos domínios DSL (DLL3#6), EGF1 (DLL3#5) ou EGF4 (DLL#4) mostram uma ligação mais forte às linhagens de células de SCLC que expressam DLL3, comparado com as proteínas de ligação à DLL3/CD3 que têm como alvo o peptídeo proximal da membrana (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3). A ligação a células SHP77, células NCI-H82 e células T das proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO : 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 24 8, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80) contra diferentes domínios de epítopo é mostrada nas Figuras 6A-V. Exemplo 10A: Potência de Redirecionamento de PBMCs Não Estimuladas Contra Linhagens de Células de SCLC Humano
[0417] A potência de PBMCs não estimuladas contra linhagens de células de SCLC foi determinada usando a liberação de lactato- desidrogenase (LDH) como leitura para lise celular. Neste ensaio, as linhagens de células de SCLC DLL3-positivas, SHP77 e NCI-H82, foram cocultivadas com PBMCs humanas como células efetoras e concentrações crescentes de proteínas de ligação à DLL3/CD3 durante 72 horas em uma proporção de efetor para célula alvo de 10:1. Proteínas de ligação à DLL3/CD3 (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80) foram produzidas por meio de transfecção transitória de células CHO-E com os vetores pTT5 que portam os genes que codificam a cadeia, conforme descrito no Exemplo 2.
[0418] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humanas foram preparadas por meio de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll a partir de preparações de linfócitos enriquecidos (leucócitos), um produto secundário de bancos de sangue que coletam sangue para transfusões. Todas as camadas leucocitárias foram obtidas após consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque e com a aprovação do comitê de ética cantonal da Áustria e as PBMCs foram preparadas no mesmo dia da coleta. Portanto, as células mononucleares foram isoladas por meio de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll (35 min sem parar a 1400 rpm) e lavagens extensas com PBS. Os eritrócitos restantes foram removidos através de incubação durante 3 minutos em tampão de lise ACK (Thermo Fisher Scientific, A1049201), seguido por lavagem em PBS, antes de suspensão em meio de ensaio que contém RPMI 1640 GlutaMAX (Gibco#61870-010), soro AB humano a 5 % (Gemini, GemCell cat#100- 512 LOT#H56500I) + MEM-NEAA a 1 % (Gibco#11140-035), HEPES a 10 mM (Affymetrix#7365-49-9), beta-Mercaptoetanol a 10 μM (Gibco#21985-023) e piruvato de sódio (Gibco#11360-039).
[0419] Subsequentemente, as células alvo, SHP77 e NCI-H82, e PBMCs em uma proporção de 1:10 foram incubadas com proteínas de ligação à DLL3/CD3 em concentrações de 0,0001 nM a 100 nM durante 72 horas.
[0420] A atividade citotóxica foi determinada usando o Kit Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche), seguindo as instruções do fabricante. Em suma, este método é com base no uso da liberação de LDH de células mortas ou plasmáticas danificadas pela membrana. O sobrenadante da cultura de células é incubado com a mistura de reação do kit durante 30 minutos e a formação de Formazano, como um resultado da atividade de LDH, é medida em um espectrofotômetro a 500 nm como substituto para a lise celular. A porcentagem de citotoxicidade em relação ao controle de lise máxima foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: valor medido − fundo Citotoxicidade (em relação ao controle) = lise máxima − lise mínima Fundo: células alvo + células efetoras Lise máxima: células alvo + Triton X-100 a 5 % Lise mínima: células alvo
[0421] Usando o software GraphPad Prism 5, a porcentagem de citotoxicidade em relação ao controle de lise máximo foi representada graficamente contra as concentrações de proteína de ligação à DLL3/CD3 correspondentes. As curvas de resposta à dose foram analisadas com o modelo de equação logística de quatro parâmetros para avaliação da curva de resposta à dose sigmoidal e os valores de EC90 foram calculados (os valores de EC90 são mostrados na Tabela 4A).
[0422] A Figura 7A mostra um exemplo de potência sobre a lise celular de sete proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO : 76, SEQ ID NO: 77 ou SEQ ID NO: 78 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO : 80) a diferentes domínios de epítopo. Tabela 4A: Valores de EC90 [nM] de proteínas de ligação à DLL3/CD3 medidos em um ensaio de citotoxicidade de 72 horas com PBMCs não estimuladas como células efetoras e linhagens de células de SCLC, NCI-H82 e SHP77, como células alvo.
Proteínas de ligação à NCI-H82 SHP77 DLL3/CD3 DLL3#1/CD3#1 1,7 1,4 DLL3#2/CD3#1 2,9 3,4 DLL3#3/CD3#1 0,9 1,5 DLL3#3/CD3#2 3,9 16,5 nenhuma saturação a 100 nenhuma saturação a 100 DLL3#4/CD3#1 nM nM nenhuma saturação a 100 nenhuma saturação a 100 DLL3#5/CD3#1 nM nM nenhuma saturação a 100 nenhuma saturação a 100 DLL3#6/CD3#1 nM nM Exemplo 10B: Potência de Redirecionamento de Células T Não Estimuladas Contra Linhagens de Células de SCLC Humano
[0423] As células T foram isoladas conforme descrito no Exemplo 9. Subsequentemente, as células T purificadas foram usadas como células efetoras em um ensaio de citotoxicidade com células SHP77 e NCI-H82 como células alvo, conforme descrito no Exemplo 10A. As curvas de resposta à dose são mostradas nas Figuras 7B-H (células SHP77) e na Figura 7I-O (células NCI-H82). Os valores calculados de EC90 são mostrados na Tabela 4B.
[0424] As Figuras 7B-O mostram exemplos de potência sobre a lise celular de 19 proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252. Tabela 4B: Valores de EC90 [nM] de proteínas de ligação à DLL3/CD3 conforme medido em um ensaio de citotoxicidade de 72 horas com células T purificadas como células efetoras e linhagens de células de SCLC e NCI-H82 como células alvo. Proteínas de ligação à DLL3/CD3 NCI-H82 SHP77 DLL3#1/CD3#1 0,66 0,15 DLL3#2/CD3#1 1,51 0,16 DLL3#3/CD3#1 0,27 0,02 DLL3#3/CD3#2 2,50 3,00 DLL3#4/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#5/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#6/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#7/CD3#1 21,84 8,37 DLL3#8/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#9/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#10/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#11/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#12/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#13/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#14/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#15/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#16/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#17/CD3#1 sem atividade sem atividade DLL3#18/CD3#1 sem atividade sem atividade Exemplo 11: Ensaio de Internalização In Vitro
[0425] As alterações na potência das proteínas de ligação à DLL3/CD3 após pré-incubadas com células SHP77 DLL3-positivas como células alvo foram medidas. Se a proteína de ligação à DLL3/CD3 for internalizada, a concentração efetiva deve diminuir com isto e, portanto, a potência aparente deve diminuir.
[0426] As proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram produzidas conforme descrito no Exemplo 2. Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) foram preparadas conforme descrito no Exemplo 10.
[0427] As células alvo SHP77 foram semeadas e incubadas com proteínas de ligação à DLL3/CD3 em concentrações de 0,0001 a 100 nM durante 2 e 4 horas antes da adição de PBMCs não estimuladas por 48 horas. A proporção do efetor para a célula alvo foi de 10:1. A atividade citotóxica foi determinada usando o Kit Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche) conforme descrito no Exemplo 10.
[0428] A Figura 8 não mostra nenhuma diferença na potência e eficácia sobre a lise de células de duas proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteína de ligação à DLL3/CD3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 e proteína de ligação à DLL3/CD3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80). A potência e eficácia foram observadas comparado com amostras não pré-incubadas (0h). Os resultados sugerem que nenhuma internalização significativa ocorre com as proteínas de ligação à DLL3/CD3. Exemplo 12: Estudo de PK em Camundongos
[0429] A PK das proteínas de ligação à DLL3/CD3 foi avaliada em camundongos C57BL/6 após uma única dose de 1 mg/kg i.v. As concentrações séricas de proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram determinadas usando um ensaio de captura e detecção de DLL3/CD3.
[0430] Em suma, camundongos C57BL/6 machos receberam uma única dose intravenosa de 1 mg/kg (IV) (n = 3 por molécula). Amostras de sangue foram coletadas antes da dose e 0,15, 2, 8, 24, 72, 96, 168, 240 e 336 horas após a dose. Os níveis séricos do fármaco foram medidos com um ensaio de ligação de ligante com base em MSD usando DLL3 biotinilada como o reagente de captura e CD3 marcada com sulfo como o reagente de detecção. Os parâmetros farmacocinéticos (PK) foram calculados a partir de perfis de tempo de concentração sérica usando análise não compartimental. Os seguintes parâmetros PK foram avaliados: AUCtúltimo (área sob a curva de concentração sérica-tempo a partir do tempo zero até o último ponto de tempo quantificável), AUCinf (área sob a curva de concentração sérica- tempo extrapolada ao infinito), CL (depuração sistêmica), Vss (volume de distribuição no estado estacionário) e t1/2 (meia-vida terminal).
[0431] Os perfis de tempo de concentração sérica média (SD) para proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteína de ligação à DLL3/CD3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 e proteína de ligação à DLL3/CD3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80) estão resumidos na Figura 9. Os parâmetros de PK médios (SD) para estas proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5: Parâmetros PK médios (SD) de proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas em camundongos C57BL/6 machos após uma única dose intravenosa de 1 mg/kg Proteínas de ligação à AUC0-última AUC0-inf CL Vss t 1/2 DLL3/CD3 (µg*d/mL) (µg*d/mL) (mL/dia/kg) (mL/kg) (dias) 1180 1760 178 10,6 DLL3#3/CD3#1 13,7 (1,48) (127) (179) (57,7) (4,67) 1260 1440 109 4,97 DLL3#3/CD3#2 16,8 (1,74) (170) (154) (19,5) (0,78) Exemplo 13: Estudo de Eficácia De Xenoenxerto In Vivo
[0432] Os estudos de eficácia foram realizados usando um modelo de camundongo xenoenxerto humano reconstituído com células T humanas. Em detalhe, células humanas SHP77 de câncer de pulmão de células pequenas (2 x 107) foram injetadas por via subcutânea (s.c.) no flanco dorsal direito de camundongos fêmeas NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac irradiados subletalmente (2 Gy, dia -1) (Dia 1). Paralelamente, células T positivas para CD3 humana (isoladas de doadores de sangue humano saudável) foram expandidas in vitro.
[0433] Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) foram preparadas conforme descrito no Exemplo 10.
[0434] As células T foram isoladas por meio de seleção negativa usando o kit Pan T Cell Isolation II (Miltenyi Biotec#130-091-156). Em suma, as células foram ressuspensas em 40 μl de tampão PBS/BSA a 0,5 % (Gibco ref#041-94553 M)/EDTA a 2 mM (Invitrogen ref#15575- 038) por 10 células Mio e incubadas com 10 μl de coquetel de Biotina- Anticorpo por 10 células Mio durante 5 min a 4 °C. Subsequentemente, 30 µl de tampão e 20 µl de MicroBeds anti-biotina/10 milhões de células foram adicionados e incubados durante 10 min a 4 °C. Posteriormente, a mistura foi colocada em uma coluna 25LS pré-enxaguada (Miltenyi Biotec#130-042-401) no campo magnético de um separador MACS adequado (Miltenyi Biotec). O fluxo foi coletado novamente e lavado em meio de ensaio.
[0435] Subsequentemente, as células T foram expandidas usando o kit T Cell Activation/Expansion (Miltenyi Biotec Cat#130-091-441, lote#5170720843) durante 20 dias. Em suma, as partículas MACSiBeadTM anti-Biotina são carregadas com Biotina CD2-, CD3-, CD28 e são transferidas para as células T purificadas em uma proporção de 2 células por partícula e incubadas na presença de 20 unidades de IL-2 recombinante (R&D#202-IL-050/CF) em uma densidade de 0,5-1 106 células/ml durante 20 dias. As células foram suplementadas com 20 unidades de IL-2 fresca a cada três dias. Três dias antes de injeção nos animais, as células T foram reestimuladas com MACSiBeadTM anti-Biotina. As partículas são carregadas com CD2- , CD3-, CD28 e Biotina em uma proporção de 1 esfera por 4 células durante mais três dias. Finalmente, as esferas foram removidas com um Separador MACSiMAG (Miltenyi Biotec) e as células T foram lavadas em PBMCs.
[0436] No dia 14, os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento com base no volume do tumor e 2 x 107 células T humanas foram injetadas intraperitonealmente (i.p.). O tratamento foi iniciado no dia 17 e a proteína de ligação à DLL3/CD3 (proteína de ligação à DLL3/CD3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79 e proteína de ligação à DLL3/CD3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80) ou tampão de veículo (NaOAc a 50 mM, NaCl a 100 mM, pH de 5,0) foi administrado em um regime de dosagem q7d através de injeção intravenosa (iv) em bolus na veia lateral da cauda. O crescimento do tumor foi monitorado por meio de medições de um calibrador externo e os volumes do tumor foram calculados usando uma fórmula hemi-elipsoide padrão. A enxertia de células T humanas foi avaliada no baço através de coloração imuno- histoquímica (IHC) para CD3 humana ao final do estudo. Apenas os animais que apresentaram enxertia de células T humanas ao final do estudo foram incluídos na análise estatística. Os animais que atingiram os critérios de sacrifício foram sacrificados no início dos estudos por razões éticas. Tratamento de camundongos com tumor com proteínas de ligação à DLL3/CD3 uma vez por semana i.v. a 0,25 mg/kg induziu à regressão significativa do tumor (Figura 10). Exemplo 14: Porcentagem de Conteúdo Monomérico de Proteínas de Ligação à DLL3/CD3
[0437] A porcentagem de monômeros foi determinada para proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 105) por meio de Cromatografia de Exclusão por Tamanho Analítica (aSEC) (mostrado na Tabela 6). aSEC foi executada em um sistema Waters (Milfrod, MA, EUA) Acquity UPLC usando uma coluna Protein BEH SEC 200Å, 1,7 µm, 4,6 x 150 mm (Cat#186005225). As condições de operação foram as seguintes: Fase móvel: Fosfato de Sódio a 50 mM, Arginina a 200 mM e Azida de Sódio a 0,05 %; Vazão: 0,5ml/min; Tempo de execução: 5 minutos; Quantidade de carregamento da amostra: 10 µg; Detecção de pico: A280 nm; Método de processamento automatizado de cromatogramas.
Tabela 6: Porcentagem de monômero após as primeira e segunda etapas de purificação Percentagem de Percentagem de Proteínas de ligação à monômeros após monômeros após DLL3/CD3 1ª etapa de purificação 2ª etapa de purificação DLL3#1/CD3#1 76,4 99,4 DLL3#2/CD3#1 54,4 98,0 DLL3#3/CD3#1 69,5 99,8 DLL3#3/CD3#2 77,6 99,5 DLL3#3/CD3#3 70,8 98,3 DLL3#4/CD3#1 72,2 99,1 DLL3#5/CD3#1 70,5 99,1 DLL3#6/CD3#1 55,2 99,9 DLL3#7/CD3#1 78,1 99,0 DLL3#8/CD3#1 54,8 99,5 DLL3#9/CD3#1 72,0 99,0 DLL3#10/CD3#1 70,2 98,3 DLL3#11/CD3#1 68,2 94,7 DLL3#12/CD3#1 66,2 98,7 DLL3#13/CD3#1 52,8 99,9
DLL3#14/CD3#1 52,6 87,0 DLL3#15/CD3#1 61,5 na DLL3#16/CD3#1 71,8 99,5 DLL3#17/CD3#1 60,2 94,7 DLL3#18/CD3#1 61,5 98,2 Exemplo 15A: Termostabilidade
[0438] A termoestabilidade foi determinada por meio de Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) e os resultados das primeiras transições de fusão (Tm1) das proteínas de ligação à DLL3/CD3 são mostrados na Tabela 7. As termofusões de DSC fornecem informações sobre a estabilidade térmica de uma proteína em solução em relação a um tampão ao controle. O desdobramento térmico e a agregação de uma solução a 1 mg/ml de proteínas em Citrato a 20 mM, NaCl a 115 mM, pH de 6, foram monitorados de 20 °C a 110 °C em uma taxa de varredura de 60 °C/h por meio de um DSC capilar automatizado. Tabela 7A Proteínas de ligação à DLL3/CD3 Tm1 DLL3#3/CD3#1 64 DLL3#3/CD3#2 60 DLL3#3/CD3#3 63 DLL3#4/CD3#1 63 Exemplo 15B: Termoestabilidade
[0439] A termoestabilidade foi determinada por meio de análise de deslocamento térmico (TSA) e os resultados das primeiras transições de fusão (Tm1) de proteínas de ligação à DLL3/CD3 (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO : 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79,
uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 105) são mostrados na Tabela 7B.
O perfil de intensidade de fluorescência em função da temperatura foi adquirido usando um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems, Waltham, MA) com SYPRO Orange (Invitrogen, Carlsbad, CA) como o fluoroforo extrínseco.
A amostra foi diluída para 0,4 mg/ml em histidina a 10 mM, pH de 6,0, com cloreto de sódio a 40 mM e azida de sódio a 0,02 %. A curva de fusão foi gerada com uma elevação térmica de 25 °C para 95 °C em uma taxa de 2 °C/min, com dados coletados aproximadamente a cada 0,4 °C através do conjunto de filtros 'ROX' (Ex: 580 ± 10 nm, Em: 623 ± 14 nm). Os dados foram analisados sando o Software Protein Thermal Shift, Versão 1.3 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Tabela 7B Proteínas de ligação à DLL3/CD3 Tm1 (C) DLL3#1/CD3#1 65,6 DLL3#2/CD3#1 65,5 DLL3#3/CD3#1 65,6 DLL3#3/CD3#2 63,0 DLL3#3/CD3#3 65,5 DLL3#4/CD3#1 65,8 DLL3#5/CD3#1 65,6 DLL3#6/CD3#1 65,8 DLL3#7/CD3#1 65,6 DLL3#8/CD3#1 65,8 DLL3#9/CD3#1 65,9 DLL3#10/CD3#1 64,6 DLL3#11/CD3#1 66,0
Proteínas de ligação à DLL3/CD3 Tm1 (C) DLL3#12/CD3#1 65,9 DLL3#13/CD3#1 65,8 DLL3#14/CD3#1 65,9 DLL3#15/CD3#1 na DLL3#16/CD3#1 65,8 DLL3#17/CD3#1 65,8 DLL3#18/CD3#1 65,8 Exemplo 16: Pontuações de Imunogenicidade Previstas In Silico Pela Epivax:
[0440] A imunogenicidade das sequências foi avaliada in silico com um algoritmo matemático. Especificamente, as pontuações ajustadas de EpiMatrix Treg (EpiVax Inc., Providence RI)) como uma medida das pontuações de imunogenicidade foram determinadas para proteínas de ligação à DLL3/CD3 (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 105) e comparadas com as pontuações de várias sequências Fc. Estas pontuações estão levando em consideração epítopos de células T e epítopos Treg. Quanto mais baixo for a pontuação de imunogenicidade, menor será a probabilidade de uma sequência ser imunogênica. Em geral, uma pontuação negativa é considerada de baixo risco de imunogenicidade, enquanto que uma pontuação altamente positiva é considerada como indicação de potencial imunogenicidade. Conforme mostrado nas tabelas abaixo, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 descritas aqui têm pontuações de imunogenicidade muito baixas, indicando que o risco de serem imunogênicas é baixo para estas proteínas de ligação. Tabela 8: Pontuações Epivax ajustadas de proteínas de ligação à DLL3/CD3 Cadeia polipeptídica completa Proteínas de Ligação à DLL3/CD3 VH VL (VL-CL-ligante-VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3) DLL3#1 DLL3 cadeia -36,88 -59,85 -43,31 DLL3#2 DLL3 cadeia -46,99 31,40 -33,53 DLL3#3 DLL3 cadeia -34,44 2,84 -35,50 DLL3#4 DLL3 cadeia 25,97 28,92 -21,93 DLL3#5 DLL3 cadeia -59,87 -46,45 -44,95 DLL3#6 DLL3 cadeia 29,70 -14,55 -27,26 CD3#1 CD3 cadeia -9,68 -50,52 -35,25 CD3#2 CD3 cadeia -15,54 -50,52 -36,23 CD3#3 CD3 cadeia -13,49 -50,52 -35,88 DLL3#7 DLL3 cadeia -48,55 -34,92 -41,60 DLL3#8 DLL3 cadeia -54,39 -37,79 -42,89 DLL3#9 DLL3 cadeia 35,95 -60,37 -31,83 DLL3#10 DLL3 cadeia -33,82 -34,60 -40,73 DLL3#11 DLL3 cadeia -24,00 26,66 -30,50 DLL3#12 DLL3 cadeia -30,43 25,68 -31,67 DLL3#13 DLL3 cadeia 8,64 18,63 -25,96 DLL3#14 DLL3 cadeia 1,58 -10,63 -31,72 DLL3#15 DLL3 cadeia 8,93 -8,31 -29,91 DLL3#16 DLL3 cadeia -55,14 13,98 -35,59 DLL3#17 DLL3 cadeia 11,89 12,55 -26,52 DLL3#18 DLL3 cadeia 5,82 15,85 -27,01 Tabela 9: Pontuações Epivax ajustadas dos domínios Fc Cadeia de proteína Fc Pontuação Epivax ajustada Fc-IgG1-WT -25,64 Fc-IgG1-LALA -29,83 Fc-IgG1-LALA-KNOB -31,76 Fc-IgG1-LALA-HOLE -18,01 Exemplo 17A: Ligação Não Específica a Superfícies
[0441] A especificidade das proteínas de ligação à DLL3/CD3 da invenção foi ainda testada em um ensaio com base em SPR usando proteínas altamente carregadas. Um ensaio de ligação não específico foi desenvolvido usando a tecnologia de biossensor para determinar se as proteínas de ligação têm ligação significativa a proteínas carregadas não relacionadas. Neste ensaio, as proteínas de ligação à DLL3/CD3 foram passadas sobre duas superfícies de SPR, uma revestida com uma proteína negativamente carregada (inibidor de tripsina) e uma revestida com uma proteína positivamente carregada (lisozima). Quando uma proteína exibe uma ligação não específica significativa a estas superfícies, é provável que a causa da ligação seja a presença de placas carregadas positivas ou negativas sobre a superfície no candidato. A ligação não específica de proteínas pode se traduzir em farmacocinética (PK) e biodistribuição deficientes e também pode ter impactos sobre a capacidade de produção a jusante.
[0442] O experimento foi realizado em um Biacore T200. Os experimentos de diluição, preparação de superfície e ligação foram realizados a 25 °C em 1X tampão HBS-EP preparado a partir de 10X HBS-EP. A vazão tanto para o protocolo de imobilização conforme para o experimento de ligação foi de 5 µL/min.
[0443] Para preparar a superfície para o experimento de ligação não específica, lisozima de clara de ovo de galinha e inibidor de tripsina de soja Glycine max foram acoplados manualmente a um chip CM5 série S com uma densidade superficial de 3000-5000 RU usando o kit de acoplamento de amina de acordo com as instruções do fabricante.
[0444] As amostras foram preparadas a 1 µM em 1X tampão HBS- EP. As amostras foram injetadas sobre superfícies ativadas com uma associação de 10 min e uma dissociação de 10 min. Os dados foram coletados usando o software de controle Biacore T200 versão 2.0.1 e analisados usando o software de avaliação Biacore T200 versão 3.0.
[0445] As proteínas de ligação à DLL3/CD3 não se ligaram a estas superfícies altamente carregadas. A Tabela 10A mostra a ausência de ligação às duas proteínas altamente carregadas, Inibidor de Tripsina e Lisozima, com duas proteínas de ligação à DLL3/CD3 exemplificativas. Tabela 10A: Ligação não específica Proteína de ligação à DLL3/CD3 Inibidor Lisozima (positivo) Tripsina (negativo) DLL3#3/CD3#1 Não Não DLL3#3/CD3#2 Não Não Exemplo 17B: Ligação Não Específica a Superfícies
[0446] A especificidade das proteínas de ligação à DLL3/CD3 (proteínas de ligação à DLL3/CD3 que compreendem uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 252 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 79, uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 80 e uma proteína de ligação à DLL3 que compreende uma cadeia de DLL3 de SEQ ID NO: 75 e uma cadeia de CD3 de SEQ ID NO: 105) foi ainda testada em um ensaio com base em SPR usando proteínas altamente carregadas, conforme descrito no Exemplo 17a, com uma associação de 10 min e uma dissociação de 15 min. Os resultados são mostrados na Tabela 10B. Tabela 10B: Ligação não específica (RU) Proteína de ligação à Inibidor DLL3/CD3 Lisozima Tripsina (positivo) (negativo) DLL3#1/CD3#1 4 1
DLL3#2/CD3#1 7 2 DLL3#3/CD3#1 54 85 DLL3#3/CD3#2 44 36 DLL3#3/CD3#3 17 28 DLL3#4/CD3#1 16 37 DLL3#5/CD3#1 4 0 DLL3#6/CD3#1 6 0 DLL3#7/CD3#1 9 3 DLL3#8/CD3#1 39 18 DLL3#9/CD3#1 15 27 DLL3#10/CD3#1 25 12 DLL3#11/CD3#1 11 13 DLL3#12/CD3#1 8 9 DLL3#13/CD3#1 11 3 DLL3#14/CD3#1 18 6 DLL3#15/CD3#1 na na DLL3#16/CD3#1 6 0 DLL3#17/CD3#1 15 8 DLL3#18/CD3#1 23 81 *Números de RU baixos indicam que não há ligação significativa a proteínas carregadas não relacionadas Exemplo 18: Indução de Lise, Ativação de Células T, Desgranulação de Células T, Proliferação de Células T e Secreção de Citocinas na Presença de Células Tumorais DLL3-positivas e DLL3-negativas
[0447] PBMCs foram purificadas conforme descrito no Exemplo 9. Para determinar a ativação de células T, desgranulação de células T e secreção de citocinas, um ensaio de citotoxicidade com PBMCs e células SHP77 DLL3-positivas ou células RKO-E6 DLL3-negativas como células alvo foi configurado conforme descrito no Exemplo 10B. A potência de lise celular que redirecionam as células T para as células SHP77 ou RKO-E6 humanas foi determinada conforme descrito no Exemplo 10A. Para determinar a ativação das células T e a desgranulação celular, as células T foram centrifugadas e coradas com anticorpos contra CD4 (BD#550630), CD8 (BD#557834), CD25 (BD#340907), subsequentemente, as células foram permabilizadas usando a Fixation/Permeabilization Solution (BD#554714) e coradas com anticorpos contra Perforina (BioLegend#308120) e Granzyme B (BD#560221) e medição através de citometria de fluxo. Os níveis de citocina nos sobrenadantes foram determinados através de Ensaios U- PLEX Biomarker Group 1 (hu) (MSD,#K15067L-2, Kit).
[0448] Para determinar a proliferação de células T, PBMCs foram marcadas com Cell TraceTM CFSE a 5 µM (Invitrogen, C34554) e células T coradas com um anticorpo anti-CD3 (BioLegend cat#: 317336). Posteriormente, as PBMCs marcadas foram incubadas com células SHP77 ou RKO-E6 em uma proporção de 10:1 e concentrações crescentes de uma proteína de ligação à DLL3/CD3 durante 6 dias.
[0449] As Figuras 11-15 mostram a indução de lise redirecionada de células T de células SHP77 ou RKO-E6 (Figura 11) e a indução de ativação de células T dependente da dose (Figura 12), desgranulação de células T (Figura 13), secreção de citocinas (Figura 14A: Interferon gama; 14B: MCP-1) e proliferação de células T (Figura 15) na presença de células SHP77 ou RO-E6 e uma proteína de ligação à DLL3/CD3. Exemplo 19: Redirecionamento de Subconjuntos de Células T para Células SHP77
[0450] PBMCs foram isoladas conforme descrito no Exemplo 10a. Subsequentemente, subconjuntos de células T foram isolados usando os seguintes reagentes e protocolos: Tabela 11: Reagentes e protocolos para isolamento de subconjuntos de células T Subconjunto de células T Reagentes e protocolos usados Células T virgens Miltenyi Biotech; #130-097-095 Células T CD4+ Miltenyi Biotech; #130-096-533 Células T CD4+ de Memória Efetoras Miltenyi Biotech; #130-094-125 Células T CD4+ de Memória Centrais Miltenyi Biotech; #130-094-302 Células T CD8+ Miltenyi Biotech; #130-096-495 Células T CD8+CD45RA+ Efetoras Miltenyi Biotech; #130-094-485 Células T CD8+ de Memória Miltenyi Biotech; #130-094-412
[0451] As Figuras 16-20 mostram a potência de redirecionamento de células T Pan (Figura 16), células T virgens (Figura 16), células T CD4+ (Figuras 17, 18), células T CD4+ de Memória Efetoras (Figura 18), células T CD4+ de Memória Centrais (Figura 17), células T CD8+ (Figuras 19, 20), células T CD8+ CD45RA+ Efetoras (Figura 19), células T CD8+ de Memória (Figura 20) contra células SHP77 humanas de uma proteína de ligação à DLL3/CD3. Exemplo 20: Infiltração de Células T em Tecido de Tumor de Xenoenxerto SHP77 com uma Proteína de Ligação à DLL3/CD3 Exemplificativa.
[0452] Os tecidos tumorais restantes de camundongos no estudo descrito no Exemplo 13 foram preparados, fixados em formalina e incrustados em parafina. Posteriormente, seções teciduais foram preparadas e coradas para expressão de CD3 em células T (2GV6 Ventana). A infiltração de células T em tecido tumoral de xenoenxerto SHP77 com uma proteína de ligação à DLL3/CD3 exemplificativa é mostrada na Figura 21. A pontuação na Tabela 12 foi usada para quantificar a expressão de CD3 em tecidos tumorais de xenoenxerto. Tabela 12: Pontuação para quantificação de células T CD3- positivas infiltrantes Pontuação Descrição 0 Nenhuma célula CD3+ no plano da seção 1 Raras células dispersas ou pequenos aglomerados, principalmente no estroma
Pontuação Descrição 2 Raras células dispersas ou pequenos aglomerados, no estroma e na margem 3 Baixos números de células ou aglomerados no estroma, epitélio e margem Números moderados de células ou aglomerados no estroma e margem; baixo número de 4 células intra-epiteliais Alto número de células ou aglomerados no estroma e margem; baixo número de células 5 intra-epiteliais Exemplo 21: Produção de Anticorpos Anti-DLL3
[0453] Para obter ligantes anti-DLL3, hibridomas ou células B únicas derivadas de camundongos de tipo selvagem imunizados com DLL3 e AlivaMab humanizados (Ablexis, San Francisco, CA, EUA: plataforma de camundongo transgênico AlivaMab com loci de imunoglobulina humana) foram cultivados in vitro. Os sobrenadantes foram avaliados quanto à reatividade contra DLL3 humana recombinante por AlphaLISA (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) e contra células SHP-77 (ATCC, CRL-2195TM) que expressam DLL3 humana por meio de Citometria de Fluxo.
[0454] Os genes VH e VL da imunoglobulina (Ig) foram, então, amplificados a partir de clones positivos identificados. Para isolar RNA de hibridomas, cerca de 2x106 células de clones individuais foram sedimentadas e usadas como material de origem. Para células B individuais, 100 a 500 células expandidas a partir de células B isoladas foram usadas como material de origem. O RNA foi isolado usando RNeasy Plus (Qiagen, Hilden, Alemanha). O cDNA foi, então, sintetizado usando o kit de síntese de cDNA Smarter (Clontech, Mountain View, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Para facilitar a síntese de cDNA, o oligodT foi usado para iniciar a transcrição reversa de todos os RNAs mensageiros seguidos por "capeamento 5' " com um oligonucleotídeos Smarter IIA. Subsequente amplificação dos fragmentos VH e VL foi realizada usando uma amplificação por PCR em 2 etapas usando iniciadores 5' direcionados ao cap Smarter IIA e iniciadores 3' direcionados às regiões de consenso em CH1.
Resumidamente, cada reação de PCR de 50 μl consiste em misturas de iniciador direto e reverso a 20 μM, 25 μl de pré-mistura de DNA polimerase PrimeStar Max (Clontech), 2 μl de cDNA não purificado e 21 μl de H2O bidestilada. O programa de ciclagem começa a 94 °C durante 3 min, seguido por 35 ciclos (94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 1 min, 68 °C durante 1 min) e termina a 72 °C durante 7 min. O segundo ciclo de PCR foi realizado com os iniciadores de segundo ciclo VL e VH que contêm extensões complementares de 15 pb que "se sobrepõem" às respectivas regiões em seus respectivos vetores mãe pTT5 (VH e VL). O segundo ciclo de PCR foi realizado com o seguinte programa: 94 °C durante 3 min; 35 ciclos (94 °C durante 30 seg, 50 °C durante 1 min, 68 °C durante 1 min) e termina a 72 °C durante 7 min.
[0455] O kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech, U.S.A.) foi usado para clonagem direcional do gene VL em um vetor pTT5 huIgK e do gene VH em um vetor pTT5 huIgG1KO. Para facilitar a clonagem In- Fusion HD, os produtos de PCR foram purificados e tratados com Cloning Enhancer antes da clonagem In-Fusion HD. A clonagem e a transformação foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante (Clontech, U.S.A.). Os DNAs mini-prep foram submetidos a sequenciamento de Sanger para confirmar que fragmentos completos do gene V foram obtidos.
[0456] Usando esta metodologia, pares de genes de VH e VL de Ig que codificam domínios de ligação com especificidade pela DLL3 foram preparados. Os anticorpos recombinantes foram produzidos por meio de transfecção transitória de células CHO-E37 com os plasmídeos que codificam as cadeias pesada e leve correspondentes. Triagem Confirmatória de Anticorpos Recombinantes
[0457] Os sobrenadantes que contêm anticorpos recombinantes expressos foram testados por meio de citometria de fluxo quanto à ligação a linhagens de células que expressam DLL3 humana ou cyno.
Resumidamente, as células foram incubadas com sobrenadantes recombinantes, lavadas e os mAbs ligados dos sobrenadantes foram detectados com anti-IgG-humana-APC (Jackson ImmunoResearch 109- 136-098). As proporções sinal-para-fundo (S/B) foram calculadas ao dividir a intensidade mediana de fluorescência (MFI) da amostra pela do controle de isotipo.
[0458] Ressonância de plasmônio em superfície (SPR) em Biacore 400 foi realizada em sobrenadantes recombinantes. Resumidamente, as IgGs não otimizadas nos sobrenadantes de HTP foram capturadas via Proteína A/G na superfície do sensor durante 60 segundos a 10 µl/min. A ligação de DLL3 humana a 100 nM às IgGs capturadas foi monitorada durante 180 segundos de associação a 30 µl/min, seguido por 120 segundos de dissociação no tampão HBS-EP. A regeneração da superfície da Proteína A/G foi realizada com Glicina, pH de 2,1, entre cada ciclo de ligação. Os seguintes materiais foram usados neste ensaio: Reagente de proteína: DLL3 humana de expressão recombinante. Tampão contínuo do sistema: HBS-EP (HEPES a 10 mM, pH de 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM e polissorbato P20 a 0,005 % v/v). Reagente de captura: Proteína A/G G (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA), com especificidade por todos os isotipos de IgG humana.
[0459] Os clones de interesse (com Kd < 300 pM) foram selecionados e avaliados em vários ensaios de detecção, conforme descrito abaixo. Exemplo 22: Ligação de Anticorpos Anti-DLL3 à Proteína DLL3 Humana Recombinante
[0460] A ligação dos anticorpos foi realizada em um ELISA. Em suma, os anticorpos anti-DLL3 foram revestidos em uma concentração de 2 µg/ml a 4 °C durante a noite. Após a lavagem, as placas foram bloqueadas com tampão de bloqueio (Gibco, Gibco#043-90309A)
durante uma hora em temperatura ambiente, seguido por lavagem e incubação com proteína DLL3 recombinante em concentrações crescentes. Para detecção, a proteína DLL3 ligada foi incubada com um anticorpo policlonal anti-DLL3 (R&D Systems, AB4315) seguido por um anticorpo anti-cabra marcado com SULFO-TAG (R32AG-1) durante uma hora. O anticorpo ligado foi quantificado usando um Tampão de Leitura (MSD) em um Sector Imager 6000 (MSD). A Figura 22 mostra a ligação de três anticorpos anti-DLL3 exemplificativos à proteína recombinante. O anticorpo anti-DLL3 direcionado ao domínio do peptídeo proximal da membrana (DLL3#3) mostra uma ligação mais forte à proteína DLL3 recombinante, comparado com os anticorpos anti- DLL3 que têm como alvo o domínio EGF4 (DLL3#4) ou EGF1 (DLL3#5). Exemplo 23: Ligação de Anticorpos Anti-DLL3 a Linhagens de Células de SCLC
[0461] As células (células T ou células SCLC humano) foram coradas com concentrações crescentes de anticorpo anti-DLL3 com concentrações crescentes em tampão de FACS (PBS/BSA a 0,5 %/azida de sódio a 0,05 %). As moléculas ligadas foram detectadas com anticorpo secundário anticamundongo conjugado com PE (Jackson Immuno Research, 115-116-072) através de análise FACS. Os anticorpos anti-DLL3 direcionados aos domínios DSL (DLL3#6), EGF1 (DLL3#5) ou EGF4 (DLL3#4) mostram uma ligação mais forte às linhagens de células de SCLC que expressam DLL3, comparado com os anticorpos anti-DLL3 que têm como alvo o peptídeo C-terminal (DLL3#1, DLL3#2, DLL3#3), conforme mostrado na Figura 23. Exemplo 24: (IHC)
[0462] Os anticorpos anti-DLL3 foram testados em uma amostra de SCLC positiva para mRNA de DLL3 em uma concentração de 20 µg/ml usando Ventana Discovery ultra (Ventana Medical Systems, Inc, Arizona) seguindo as instruções do fabricante. Em suma, IHC foi realizada em tecido e seções fixadas em formalina e incrustadas em parafina (4 μm) que foram coradas com anticorpos anti-DLL3. O ensaio de IHC foi realizado na plataforma Ventana Discovery Ultra usando o protocolo RUO Discovery Universal. A coloração do anticorpo anti-DLL3 foi otimizada usando Proteinase K como recuperação de epítopo durante 12 minutos. O anticorpo anti-DLL3 foi incubado durante 60 minutos, seguido pelo sistema de detecção HQ anti-Mouse e HRP anti- HQ, ambos durante 12 minutos. Controles negativos (anticorpo IgG) foram realizados para cada seção tecidual, tratada de forma idêntica às lâminas de teste.
[0463] A linhagem de células de SCLC humana SHP77 foi usada como controle positivo. Imagens digitais de seções teciduais completas foram adquiridas usando um scanner de histologia Leica SCN400 (Leica Microsystems, Milton Keynes, Reino Unido).
[0464] A análise imuno-histoquímica de uma amostra de SCLC humano com anticorpos anti-DLL3 exemplificativos é mostrada na Figura 24. Exemplo 25: Determinação dos Níveis de Expressão em Linhagens de Células de SCLC
[0465] A expressão na superfície celular de anticorpos anti-DLL3 foi quantificada usando o QIFIKIT (K0078; Dako). Em suma, as linhagens de células de SCLC (SHP77, NCI-H82 e NCI-H2286) foram marcadas com o anticorpo anti-DLL3 (DL309, documento WO 2011/093097) ou anticorpo irrelevante (controle de isotipo) a 5 µg/ml em um frasco separado. Posteriormente, as células e esferas fornecidas no kit foram marcadas em paralelo com anticorpos secundários anti-camundongo conjugados com fluoresceína. As amostras foram medidas em um fluorocitômetro BD CantoII e, subsequentemente, a fluorescência é correlacionada com o número de anticorpos anti-DLL3 ligados nas células e nas esferas. A Tabela 12 mostra moléculas de DLL3 expressas na superfície celular de três linhagens de células de SCLC. Tabela 13: Moléculas de DLL3 expressas na superfície celular de linhagens de células de SCLC MOLÉCULAS DE DLL3 NA SUPERFÍCIE
LINHAGEM DE CÉLULAS DE SCLC CELULAR/CÉLULA SHP77 (ATCC®, CRL-2195TM 2061 NCI-H82 (HTB-175TM) 824 NCI-H2286 129 Exemplo 26: Determinação de Sensibilidade do Protocolo de IHC em Blocos de Linhagens de Células SCLC
[0466] Para avaliar a sensibilidade do protocolo de IHC, as linhagens de células de SCLC (SHP77, NCI-H82 e NCI-H2286) foram processadas como tecidos em hospitais e fixadas em Formalina e subsequentemente incrustadas em parafina.
[0467] As linhagens de células de SCLC foram cultivadas de acordo com as instruções da ATCC. As células foram raspadas da placa e fixadas em Formalina e subsequentemente adicionadas a Histogel solubilizado (Thermo Fisher Scientific, HG-4000-012) e incubadas durante a noite a 4 °C, seguido por um procedimento de inclusão em parafina padrão realizado em um laboratório de patologia de rotina. Em suma, o bloco de células é incubado em etanol e isopropanol antes de ser incrustado em parafina (roti-Plast,#6642.5). As seções dos blocos de sedimento celular foram realizadas e as seções foram coradas com o protocolo conforme descrito no Exemplo 24. Os resultados mostrados na Figura 25 mostram que um protocolo de IHC com anticorpo anti-DLL3 DLL3#5 é capaz de detectar células com expressão de DLL3 muito baixa.

Claims (47)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína que compreende uma primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 e uma segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3, caracterizada pelo fato de que a dita primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 é selecionada a partir do grupo que consiste em i) a xviii): i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID N O: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); iv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (CDR1), SEQ ID NO: 20 (CDR2) e SEQ ID NO: 21 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (CDR1), SEQ ID NO: 23 (CDR2) e SEQ
ID NO: 24 (CDR3); v) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1), SEQ ID NO: 26 (CDR2) e SEQ ID NO: 27 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (CDR1), SEQ ID NO: 29 (CDR2) e SEQ ID NO: 30 (CDR3); vi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (CDR1), SEQ ID NO: 32 (CDR2) e SEQ ID NO: 33 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (CDR1), SEQ ID NO: 35 (CDR2) e SEQ ID NO: 36 (CDR3); vii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (CDR1), SEQ ID NO: 134 (CDR2) e SEQ ID NO: 135 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 (CDR1), SEQ ID NO: 137 (CDR2) e SEQ ID NO: 138 (CDR3); viii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 (CDR1), SEQ ID NO: 140 (CDR2) e SEQ ID NO: 141 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 (CDR1), SEQ ID NO: 143 (CDR2) e SEQ ID NO: 144 (CDR3); ix) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (CDR1), SEQ ID NO: 146 (CDR2) e SEQ ID NO: 147 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 148 (CDR1), SEQ ID NO:
149 (CDR2) e SEQ ID NO: 150 (CDR3); x) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 (CDR1), SEQ ID NO: 152 (CDR2) e SEQ ID NO: 153 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 (CDR1), SEQ ID NO: 155 (CDR2) e SEQ ID NO: 156 (CDR3); xi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 (CDR1), SEQ ID NO: 158 (CDR2) e SEQ ID NO: 159 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 (CDR1), SEQ ID NO: 161 (CDR2) e SEQ ID NO: 162 (CDR3); xii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 (CDR1), SEQ ID NO: 164 (CDR2) e SEQ ID NO: 165 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 (CDR1), SEQ ID NO: 167 (CDR2) e SEQ ID NO: 168 (CDR3); xiii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (CDR1), SEQ ID NO: 170 (CDR2) e SEQ ID NO: 171 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 (CDR1), SEQ ID NO: 173 (CDR2) e SEQ ID NO: 174 (CDR3); xiv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 (CDR1), SEQ ID NO: 176 (CDR2) e SEQ ID NO: 177 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 (CDR1), SEQ ID NO:
179 (CDR2) e SEQ ID NO: 180 (CDR3); xv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 (CDR1), SEQ ID NO: 182 (CDR2) e SEQ ID NO: 183 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 (CDR1), SEQ ID NO: 185 (CDR2) e SEQ ID NO: 186 (CDR3); xvi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 (CDR1), SEQ ID NO: 188 (CDR2) e SEQ ID NO: 189 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 190 (CDR1), SEQ ID NO: 191 (CDR2) e SEQ ID NO: 192 (CDR3); xvii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 (CDR1), SEQ ID NO: 194 (CDR2) e SEQ ID NO: 195 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 (CDR1), SEQ ID NO: 197 (CDR2) e SEQ ID NO: 198 (CDR3); e xviii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 (CDR1), SEQ ID NO: 200 (CDR2) e SEQ ID NO: 201 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada c omitindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 (CDR1), SEQ ID NO: 203 (CDR2) e SEQ ID NO: 204 (CDR3).
2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve e um primeiro domínio variável de cadeia pesada e é selecionado a partir do grupo que consiste em i) a xviii):
i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; iv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; v) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; vi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; vii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; viii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; ix) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; x) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; xi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; xii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; xiii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; xiv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 219 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; xv) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; xvi) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; xvii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; e xviii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
228.
3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 é selecionada a partir do grupo que consiste em i)-iii): i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de
SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3); ii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3); e iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 (CDR1), SEQ ID NO: 97 (CDR2) e SEQ ID NO: 98 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 (CDR1), SEQ ID NO: 100 (CDR2) e SEQ ID NO: 101 (CDR3).
4. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a dita segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 compreende um segundo domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste em i) a iii): i) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ii) uma unidade de ligação antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; e iii) uma unidade de ligação a antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
103.
5. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que: i) a dita primeira unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à DLL3 compreende, a partir de seu N- para C-término, um primeiro domínio variável de cadeia leve, um primeiro domínio constante de cadeia leve, um primeiro ligante peptídico, um primeiro domínio variável de cadeia pesada e um primeiro domínio CH1 constante de cadeia pesada; e ii) a dita segunda unidade de ligação a antígeno que se liga especificamente à CD3 compreende, a partir de seu N- para C-término, um segundo domínio variável de cadeia leve, um segundo domínio constante de cadeia leve, um segundo ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio constante CH1 de cadeia pesada.
6. Proteína, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os ditos primeiro e/ou segundo ligantes peptídicos compreendem 26 a 42 aminoácidos, de preferência qualquer um de 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos ou 36 a 39 aminoácidos, mais preferivelmente 38 aminoácidos.
7. Proteína, de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que o ditos primeiro e/ou segundo ligantes é um ligante de Gly-Ser, de preferência que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, mais preferivelmente os ditos primeiro e segundo ligantes peptídicos compreendem a mesma sequência.
8. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um primeiro e um segundo domínio Fc, o dito primeiro domínio Fc ligado covalentemente à dita primeira unidade de ligação a antígeno e um dito segundo domínio Fc ligado covalentemente à dita segunda unidade de ligação a antígeno.
9. Proteína, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que: i) o dito primeiro domínio Fc compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] e o dito segundo domínio Fc compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], ou ii) o dito primeiro domínio Fc compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e o dito segundo domínio Fc compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], ou iii) o dito segundo domínio Fc compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] e o dito primeiro domínio Fc compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], ou iv) o dito segundo domínio Fc compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e o dito primeiro domínio Fc compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], preferencialmente, em que o dito primeiro ou segundo domínio Fc compreende ainda uma arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F].
10. Proteína, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os ditos primeiro e/ou segundo domínios Fc compreendem ainda uma alanina na posição 234 [L234A] e na posição 235 [L235A].
11. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio constante de cadeia leve e o segundo domínio constante de cadeia leve compreendem um domínio capa ou lambda humano.
12. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO; 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 e SEQ ID NO: 252 e uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 105.
13. Molécula de ácidos nucleicos isolada, caracterizada pelo fato de que codifica a primeira unidade de ligação a antígeno e/ou a segunda unidade de ligação a antígeno de uma proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que codifica ainda opcionalmente um primeiro e/ou um segundo domínio Fc.
14. Molécula de ácidos nucleicos isolada, caracterizada pelo fato de que codifica as primeira e/ou segunda cadeias polipeptídicas, de acordo com a reivindicação 12.
15. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 13 ou 14.
16. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é transfectada com o vetor de expressão como definido na reivindicação
15.
17. Método de produção de uma proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende: i) cultivo da célula hospedeira como definida na reivindicação
16 sob condições que permitam a expressão da proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e, ii) recuperação da proteína; e opcionalmente iii) purificação adicional e/ou modificação e/ou formulação da proteína.
18. Proteína que compreende uma primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 e uma segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma primeira cadeia leve, um primeiro ligante e uma primeira cadeia pesada e a dita segunda cadeia polipeptídica compreende um segunda cadeia leve, um segundo ligante e uma segunda cadeia pesada, de preferência em que o C-término da dita primeira cadeia leve está covalentemente ligado ao N-término da dita primeira cadeia pesada através do dito primeiro ligante peptídico e em que o C-término da dita segunda cadeia leve está covalentemente ligado ao N-término da dita segunda cadeia pesada através do dito segundo ligante peptídico.
19. Proteína, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada que compreendem sequências de CDR selecionadas a partir do grupo que consiste em i) a xviii): i) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e um CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); ii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ
ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); iii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); iv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (CDR1), SEQ ID NO: 20 (CDR2) e SEQ ID NO: 21 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 22 (CDR1), SEQ ID NO: 23 (CDR2) e SEQ ID NO: 24 (CDR3); v) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1), SEQ ID NO: 26 (CDR2) e SEQ ID NO: 27 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 28 (CDR1), SEQ ID NO: 29 (CDR2) e SEQ ID NO: 30 (CDR3); vi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (CDR1), SEQ ID NO: 32 (CDR2) e SEQ ID NO: 33 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 34 (CDR1), SEQ ID NO: 35 (CDR2) e SEQ ID NO: 36 (CDR3) vii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (CDR1), SEQ ID NO: 134 (CDR2) e SEQ ID NO: 135 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 136 (CDR1), SEQ ID NO: 137 (CDR2) e SEQ ID NO: 138 (CDR3); viii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 (CDR1), SEQ ID NO: 140 (CDR2)
e SEQ ID NO: 141 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 142 (CDR1), SEQ ID NO: 143 (CDR2) e SEQ ID NO: 144 (CDR3); ix) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (CDR1), SEQ ID NO: 146 (CDR2) e SEQ ID NO: 147 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 148 (CDR1), SEQ ID NO: 149 (CDR2) e SEQ ID NO: 150 (CDR3); x) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 (CDR1), SEQ ID NO: 152 (CDR2) e SEQ ID NO: 153 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 154 (CDR1), SEQ ID NO: 155 (CDR2) e SEQ ID NO: 156 (CDR3); xi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 (CDR1), SEQ ID NO: 158 (CDR2) e SEQ ID NO: 159 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 160 (CDR1), SEQ ID NO: 161 (CDR2) e SEQ ID NO: 162 (CDR3); xii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 (CDR1), SEQ ID NO: 164 (CDR2) e SEQ ID NO: 165 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 166 (CDR1), SEQ ID NO: 167 (CDR2) e SEQ ID NO: 168 (CDR3); xiii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (CDR1), SEQ ID NO: 170 (CDR2) e SEQ ID NO: 171 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 172 (CDR1), SEQ ID NO: 173 (CDR2) e SEQ ID NO: 174 (CDR3); CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 (CDR1), SEQ ID NO: 176 (CDR2) e
SEQ ID NO: 177 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 (CDR1), SEQ ID NO: 179 (CDR2) e SEQ ID NO: 180 (CDR3); xiv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 (CDR1), SEQ ID NO: 182 (CDR2) e SEQ ID NO: 183 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 184 (CDR1), SEQ ID NO: 185 (CDR2) e SEQ ID NO: 186 (CDR3); xv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 (CDR1), SEQ ID NO: 188 (CDR2) e SEQ ID NO: 189 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 190 (CDR1), SEQ ID NO: 191 (CDR2) e SEQ ID NO: 192 (CDR3); xvi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 (CDR1), SEQ ID NO: 194 (CDR2) e SEQ ID NO: 195 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 196 (CDR1), SEQ ID NO: 197 (CDR2) e SEQ ID NO: 198 (CDR3); e xvii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 (CDR1), SEQ ID NO: 200 (CDR2) e SEQ ID NO: 201 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 202 (CDR1), SEQ ID NO: 203 (CDR2) e SEQ ID NO: 204 (CDR3).
20. Proteína, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que a dita segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada que compreendem sequências de CDR selecionadas a partir do grupo que consiste em i) a iii): i) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 (CDR1), SEQ ID NO: 56 (CDR2) e SEQ ID NO: 57 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 58 (CDR1), SEQ ID NO: 59 (CDR2) e SEQ ID NO: 60 (CDR3); ii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 (CDR1), SEQ ID NO: 62 (CDR2) e SEQ ID NO: 63 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 64 (CDR1), SEQ ID NO: 65 (CDR2) e SEQ ID NO: 66 (CDR3); e iii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 (CDR1), SEQ ID NO: 97 (CDR2) e SEQ ID NO: 98 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 99 (CDR1), SEQ ID NO: 100 (CDR2) e SEQ ID NO: 101 (CDR3).
21. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica que se liga especificamente à DLL3 compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de i) a xviii): i) um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; ii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; iii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 42; iv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; v) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; vi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; vii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; viii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; ix) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; x) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 212; xi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; xii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216; xiii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 218; xiv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 219 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 220; xv) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 222; xvi) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; xvii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; e xviii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 228.
22. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que a dita segunda cadeia polipeptídica que se liga especificamente à CD3 compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste em i) -iii): i) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; e iii) um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103.
23. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizada pelo fato de que os ditos primeiro e/ou segundo ligantes peptídicos compreendem 26 a 42 aminoácidos, de preferência qualquer um de 30 a 40 aminoácidos, 34 a 40 aminoácidos ou 36 a 39 aminoácidos ácidos, mais preferivelmente 38 aminoácidos.
24. Proteína, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o ditos primeiro e/ou segundo ligantes é um ligante de Gly-Ser, de preferência que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, mais preferivelmente os ditos primeiro e segundo ligante peptídico compreendem a mesma sequência.
25. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizada pelo fato de que: i) a dita primeira cadeia pesada compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] e a dita segunda cadeia pesada compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], ou ii) a dita primeira cadeia pesada compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e a dita segunda cadeia pesada compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], ou iii) a dita segunda cadeia pesada compreende uma tirosina (Y) na posição 366 [T366Y] e a dita primeira cadeia pesada compreende uma treonina (T) na posição 407 [Y407T], ou iv) a dita segunda cadeia pesada compreende um triptofano (W) na posição 366 [T366W] e a dita primeira cadeia pesada compreende uma serina (S) na posição 366 [T366S], uma alanina (A) na posição 368 [L368A] e uma valina (V) na posição 407 [Y407V], preferencialmente em que a dita primeira ou segunda cadeia pesada compreende ainda uma arginina na posição 435 [H435R] e uma fenilalanina na posição 436 [Y436F].
26. Proteína, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a dita primeira e/ou a dita segunda cadeia pesada compreendem ainda uma alanina na posição 234 [L234A] e na posição 235 [L235A].
27. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia leve e a dita segunda cadeia leve compreendem um domínio capa ou lambda humano.
28. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 18 a 27, caracterizada pelo fato de que é para uso em medicina.
29. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 18 a 27 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
30. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente que precisa uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 18 a 27.
31. Uso da proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 18 a 27, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer.
32. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 18 a 27, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método de tratamento de câncer.
33. Método, de acordo com a reivindicação 30, uso de acordo com a reivindicação 31 ou proteína para uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor que expressa DLL3, de preferência em que o câncer é SCLC, glioblastoma ou um tumor neuroendócrino que expressa DLL3.
34. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 33, uso de acordo com a reivindicação 31 ou 33 ou proteína para uso de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que a dita proteína é usada em combinação com um agente quimioterapêutico, um composto terapeuticamente ativo que inibe a angiogênese, um inibidor da via de transdução de sinal, um inibidor de EGFR, um modulador imune, um inibidor do ponto de verificação imune ou um agente de terapia hormonal.
35. Método, uso ou proteína para uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a dita proteína está em combinação com um inibidor do ponto de verificação imune, de preferência um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1.
36. Método, uso ou proteína para uso, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5.
37. Molécula de anticorpo anti-DLL3, caracterizada pelo fato de que compreende: i) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2) e SEQ ID NO: 3 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5 (CDR2) e SEQ ID NO: 6 (CDR3); ou ii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR1), SEQ ID NO: 8 (CDR2) e SEQ ID NO: 9 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 10 (CDR1), SEQ ID NO: 11 (CDR2) e SEQ ID NO: 12 (CDR3); ou iii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR1), SEQ ID NO: 14 (CDR2) e SEQ ID NO: 15 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 16 (CDR1), SEQ ID NO: 17 (CDR2) e SEQ ID NO: 18 (CDR3); ou iv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (CDR1), SEQ ID NO: 20 (CDR2) e SEQ ID NO: 21 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 22 (CDR1), SEQ ID NO: 23 (CDR2) e SEQ ID NO: 24 (CDR3); ou v) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1), SEQ ID NO: 26 (CDR2) e SEQ ID NO: 27 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 28 (CDR1), SEQ ID NO: 29 (CDR2) e SEQ ID NO: 30 (CDR3); ou vi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (CDR1), SEQ ID NO: 32 (CDR2) e SEQ ID NO: 33 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 34 (CDR1), SEQ ID NO: 35 (CDR2) e SEQ ID NO: 36 (CDR3); ou vii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (CDR1), SEQ ID NO: 134 (CDR2) e SEQ ID NO: 135 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 136 (CDR1), SEQ ID NO: 137 (CDR2) e SEQ ID NO: 138 (CDR3); ou viii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 139 (CDR1), SEQ ID NO: 140 (CDR2) e SEQ ID NO: 141 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 142 (CDR1), SEQ ID NO: 143 (CDR2) e SEQ ID NO: 144 (CDR3); ou ix) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (CDR1), SEQ ID NO: 146 (CDR2) e SEQ ID NO: 147 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 148 (CDR1), SEQ ID NO: 149 (CDR2) e SEQ ID NO: 150 (CDR3); ou x) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 (CDR1), SEQ ID NO: 152 (CDR2) e SEQ ID NO: 153 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 154 (CDR1), SEQ ID NO: 155 (CDR2) e SEQ ID NO: 156 (CDR3); ou xi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 (CDR1), SEQ ID NO: 158 (CDR2) e SEQ ID NO: 159 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 160 (CDR1), SEQ ID NO: 161 (CDR2) e SEQ ID NO: 162 (CDR3); ou xii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 163 (CDR1), SEQ ID NO: 164 (CDR2) e SEQ ID NO: 165 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 166 (CDR1), SEQ ID NO: 167 (CDR2) e SEQ ID NO: 168 (CDR3); ou xiii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 169 (CDR1), SEQ ID NO: 170 (CDR2) e SEQ ID NO: 171 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 172 (CDR1), SEQ ID NO: 173 (CDR2) e SEQ ID NO: 174 (CDR3); ou xiv) que compreende CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 (CDR1), SEQ ID NO: 176 (CDR2) e SEQ ID NO: 177 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 (CDR1), SEQ ID NO: 179 (CDR2) e SEQ ID NO: 180 (CDR3); ou xv) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 (CDR1), SEQ ID NO: 182 (CDR2) e SEQ ID NO: 183 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 184 (CDR1), SEQ ID NO: 185 (CDR2) e SEQ ID NO: 186 (CDR3); ou xvi) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 (CDR1), SEQ ID NO: 188 (CDR2) e SEQ ID NO: 189 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 190 (CDR1), SEQ ID NO: 191 (CDR2) e SEQ ID NO: 192 (CDR3); ou xvii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 193 (CDR1), SEQ ID NO: 194 (CDR2)
e SEQ ID NO: 195 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 196 (CDR1), SEQ ID NO: 197 (CDR2) e SEQ ID NO: 198 (CDR3); ou xviii) CDRs de cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 (CDR1), SEQ ID NO: 200 (CDR2) e SEQ ID NO: 201 (CDR3) e CDRs de cadeia pesada que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO : 202 (CDR1), SEQ ID NO: 203 (CDR2) e SEQ ID NO: 204 (CDR3).
38. Molécula de anticorpo anti-DLL3, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de anticorpo é monoclonal, quimérica, humanizada ou humana.
39. Molécula de anticorpo anti-DLL3, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de anticorpo é um Fab, F(ab')2, Fab', Fv ou scFv.
40. Molécula de anticorpo anti-DLL3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizada pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é selecionada a partir do grupo que consiste nas regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE.
41. Molécula de anticorpo anti-DLL3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizada pelo fato de que a região constante de cadeia leve é capa ou lambda.
42. Método de detecção de DLL3 em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar a amostra com um anticorpo anti-DLL3 como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 41; (b) permitir a formação de complexos de anticorpo-antígeno na amostra; e (c) detectar o anticorpo anti-DLL3.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-DLL3 é detectado por um sinal detectável, de preferência o dito sinal é detectado por meio de imunocitoquímica (ICC), imuno-histoquímica (IHC), Western Blotting, citometria de fluxo e/ou ELISA.
44. Método, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de tecido, de preferência uma amostra de tecido fixada, mais preferivelmente uma amostra de tecido fixada em formalina e incrustada em parafina.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-DLL3 é detectado por IHC.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 45, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é uma amostra de tecido tumoral, mais preferivelmente uma amostra de tecido tumoral isolada de um tumor selecionado a partir do grupo que consiste em SCLC, LCNEC, glioma, glioblastoma, melanoma ou outros tumores neuroendócrinos.
47. Kit para detecção de DLL3, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 41 e instruções de uso.
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