CN112513092A - Dll3-cd3双特异性抗体 - Google Patents

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P·古普塔
J·舍尔
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Abstract

本发明涉及新颖的DLL3/CD3双特异性抗体。本发明亦涉及此类抗体或其组合物的用途，尤其出于治疗目的用于癌症疾病领域中的用途。

Description

DLL3-CD3双特异性抗体
发明背景
【技术领域】
本发明涉及多特异性结合蛋白，其包含对DLL3具有特异性的第一抗原结合单元及对CD3具有特异性的第二抗原结合单元。本发明亦涉及编码此类结合蛋白的核酸；用于制备此类结合蛋白的方法；表达或能够表达此类结合蛋白的宿主细胞；包含此类结合蛋白的组合物及此类结合蛋白或此类组合物的用途，尤其出于治疗目的用于癌症疾病领域的用途。
【背景技术】
DLL3属于Notch配位体家族的I型跨膜蛋白。DLL3主要参与体节发生，其中相比于位于细胞表面上的其他DLL家族成员DLL1及DLL4，其主要位于高基氏体且充当Notch信号传导的抑制剂。仅在过表达DLL3的癌细胞中，一些DLL3分子逃逸至细胞表面(Dylla，Molecular&Cellular Oncology 2016，第3卷，第2期)。通过使用若干方法已将DLL3鉴别为肿瘤特异性目标，例如肿瘤组织的LC/MS分析(WO 2014/125273)、RNA定序(WO 2017/021349)及免疫组织化学(Saunders等人，Sci Transl Med.2015年8月26日；7(302):302ra136；Saunders等人，AACR 2017；WO 2013/126746)分析。
DLL3表达已在神经内分泌肿瘤中有所描述，诸如大细胞神经内分泌癌瘤(largecell neuroendocrine carcinoma；LCNEC)、小细胞肺癌(small cell lung cancer；SCLC)、神经内分泌前列腺癌、神经内分泌胰脏癌及神经胶母细胞瘤(Saunders等人，Sci TranslMed.2015年8月26日；7(302):302ra136；Saunders等人，AACR 2017)。
SCLC表示具有极高医疗需求的适应症。SCLC占肺癌诊断的13％且相比NSCLC预后较差。这些癌症的常规治疗主要包括化学疗法、放射疗法、手术或其组合，尚不存在可用的靶向疗法。尽管对化学疗法的初始响应率较高，但许多患者迅速复发化疗抗性疾病，因此不存在可用的治疗选择。尽管在过去几年这些癌症治疗已有所改善，但这些肿瘤类型的总存活率仍未改变，因此，对更具针对性及强效的疗法的需求仍未满足。
一种靶向疗法方法由抗体药结合物(ADC)提供，然而，对于DLL3而言，此策略由于DLL3的低细胞表面表达及对化学疗法的高抵抗率而并非优选的。因为大多数患者在化学疗法治疗之后复发且由于DLL3在细胞表面上的低表达，用ADC靶向DLL3可能具有限制。另外，ADC方法常常因接头不稳定性或降解而具有由自由态药物引起的脱靶毒性。
已尝试将DLL3靶向与其他蛋白质的靶向组合。举例而言，WO2017/021349描述一种双特异性抗体构建体，其组合与靶细胞表面上的人类DLL3结合及与T细胞表面上的人类CD3。然而，尚未证明此类方法能否成功且迄今没有SCLC及神经胶母细胞瘤以及其他表达DLL3的肿瘤的靶向疗法可供使用。
鉴于此类癌症患者的较差前景，需要鉴别更加有效的疗法，尤其具有改善的耐受性的有效疗法。因此，本发明之一目标为提供药理学活性剂、组合物及/或治疗方法，其相比于目前使用及/或本领域中已知的药剂、组合物及/或方法提供某些优势。这些优势包括活体内功效、改善的治疗及药理学特性、特异性增加、改善的安全概况、副作用较少、免疫原性降低，及其他有利特性，诸如改善的制备容易性或降低的商品成本、较高的稳定性/较长的半衰期、对给药方案的需求频率较少，尤其相比于本领域中已知的候选药物。
【发明内容】
本发明为基于一种双特异性T细胞接合方法，其采用多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白具有与T细胞上的CD3结合的结合臂及与肿瘤细胞的细胞表面上的DLL3结合的结合臂。经由与T细胞及肿瘤细胞的同时结合，T细胞接合剂迫使在两个细胞之间形成溶细胞突触且因此选择性地重导向对靶向肿瘤细胞的T细胞活性。
在一个方面中，本发明提供多特异性结合蛋白，其包含与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，该与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元选自由i)至xviii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ IDNO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的重链CDR；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ IDNO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的重链CDR；
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ IDNO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的重链CDR；
iv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的重链CDR；
v)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的重链CDR；
vi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的重链CDR；
vii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ IDNO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的重链CDR；
viii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ IDNO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的重链CDR；
ix)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:145(CDR1)、SEQ IDNO:146(CDR2)及SEQ ID NO:147(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:148(CDR1)、SEQ ID NO:149(CDR2)及SEQ ID NO:150(CDR3)的重链CDR；
x)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:151(CDR1)、SEQ ID NO:152(CDR2)及SEQ ID NO:153(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:154(CDR1)、SEQ ID NO:155(CDR2)及SEQ ID NO:156(CDR3)的重链CDR；
xi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:157(CDR1)、SEQ IDNO:158(CDR2)及SEQ ID NO:159(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:160(CDR1)、SEQ ID NO:161(CDR2)及SEQ ID NO:162(CDR3)的重链CDR；
xii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:163(CDR1)、SEQ IDNO:164(CDR2)及SEQ ID NO:165(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:166(CDR1)、SEQ ID NO:167(CDR2)及SEQ ID NO:168(CDR3)的重链CDR；
xiii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:169(CDR1)、SEQ IDNO:170(CDR2)及SEQ ID NO:171(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:172(CDR1)、SEQ ID NO:173(CDR2)及SEQ ID NO:174(CDR3)的重链CDR；
xiv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:175(CDR1)、SEQ IDNO:176(CDR2)及SEQ ID NO:177(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:178(CDR1)、SEQ ID NO:179(CDR2)及SEQ ID NO:180(CDR3)的重链CDR；
xv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:181(CDR1)、SEQ IDNO:182(CDR2)及SEQ ID NO:183(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:184(CDR1)、SEQ ID NO:185(CDR2)及SEQ ID NO:186(CDR3)的重链CDR；
xvi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:187(CDR1)、SEQ IDNO:188(CDR2)及SEQ ID NO:189(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:190(CDR1)、SEQ ID NO:191(CDR2)及SEQ ID NO:192(CDR3)的重链CDR；
xvii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:193(CDR1)、SEQ IDNO:194(CDR2)及SEQ ID NO:195(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:196(CDR1)、SEQ ID NO:197(CDR2)及SEQ ID NO:198(CDR3)的重链CDR；以及
xviii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:199(CDR1)、SEQ IDNO:200(CDR2)及SEQ ID NO:201(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:202(CDR1)、SEQ ID NO:203(CDR2)及SEQ ID NO:204(CDR3)的重链CDR。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元包含第一轻链可变域及第一重链可变域且选自由i)至xviii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重链可变域；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链可变域；
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变域；
iv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的重链可变域；
v)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链可变域；
vi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的重链可变域；
vii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:205的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:206的重链可变域；
viii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:207的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:208的重链可变域；
ix)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:209的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:210的重链可变域；
x)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:211的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:212的重链可变域；
xi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:213的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:214的重链可变域；
xii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:215的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:216的重链可变域；
xiii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:218的重链可变域；
xiv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:219的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的重链可变域；
xv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的重链可变域；
xvi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:223的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:224的重链可变域；
xvii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链可变域；以及
xviii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的重链可变域。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，与CD3特异性结合的第二抗原结合单元选自由i)至iii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR；以及
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:96(CDR1)、SEQ IDNO:97(CDR2)及SEQ ID NO:98(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:99(CDR1)、SEQ ID NO:100(CDR2)及SEQ ID NO:101(CDR3)的重链CDR。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，与CD3特异性结合的第二抗原结合单元包含第二轻链可变域及第二重链可变域且选自由以下组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域；以及
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:102的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:103的重链可变域。
在本发明的一些实施方案中，与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元自其N端至C端包含：第一轻链可变域、第一轻链恒定域、第一肽接头、第一重链可变域及第一重链恒定CH1域；且与CD3特异性结合的第二抗原结合单元自其N端至C端包含：第二轻链可变域、第二轻链恒定域、第二肽接头、第二重链可变域及第二重链恒定CH1域。在本发明的一些实施方案中，第一及/或第二肽接头包含26至42个氨基酸，优选30至40个氨基酸中的任一者，34至40个氨基酸，或36至39个氨基酸，更优选地38个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，第一接头及/或第二接头为Gly-Ser接头，其优选地包含氨基酸序列SEQ ID NO:89，更优选地该第一及第二肽接头包含相同序列。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白进一步包含第一及第二Fc域，该第一Fc域共价连接至该第一抗原结合单元，且该第二Fc域共价连接至该第二抗原结合单元。
在本发明的一些实施方案中，
i)该第一Fc域包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，且该第二Fc域包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]，或
ii)该第一Fc域包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，且该第二Fc域包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]，或
iii)该第二Fc域包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，且该第一Fc域包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]，或
iv)该第二Fc域包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，且该第一Fc域包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]，
优选地该第一或该第二Fc域进一步包含在位置435处的精氨酸[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。在一些实施方案中，第一及/或第二Fc域进一步包含在位置234处的丙氨酸[L234A]及在位置235处的丙氨酸[L235A]。在一些实施方案中，第一轻链恒定域及第二轻链恒定域包含人类κ或λ域。
在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含选自由以下组成的群的氨基酸序列：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ IDNO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251及SEQ ID NO:252；及与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:105。
在另一方面中，本发明提供分离的核酸分子，其i)编码本发明的蛋白质的第一抗原结合单元及/或第二抗原结合单元，任选进一步编码第一及/或第二Fc域，或ii)编码本发明的蛋白质的第一及/或第二多肽链。本文提供的其他方面为包含本发明的核酸分子的表达载体、经此类表达载体转染的宿主细胞，及制造本发明的蛋白质的方法。
在本发明的另一方面中，本文提供一种多特异性结合蛋白，其包含与DLL3特异性结合的第一多肽链及与CD3特异性结合的第二多肽链，其中该第一多肽链包含第一轻链、第一接头及第一重链且该第二多肽链包含第二轻链、第二接头及第二重链，优选地该第一轻链的C端经由该第一肽接头共价键结至该第一重链的N端且该第二轻链的C端经由该第二肽接头共价键结至该第二重链的N端。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，与DLL3特异性结合的第一多肽链包含轻链可变域及重链可变域，该轻链可变域及重链可变域包含如对于本文所描述的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18的抗原结合单位所定义的CDR序列及/或VH/VL序列。在一些实施方案中，与CD3特异性结合的第二多肽链包含轻链可变域及重链可变域，该轻链可变域及重链可变域包含如对于本文所描述的CD3#1、CD3#2或CD3#3的抗原结合单位所定义的CDR序列及/或VH/VL序列。
涉及本发明的结合蛋白的其他方面、实施方案、用途及方法将由以下本发明的实施方式及随附权利要求而变得清楚。
本发明提供新颖的结合蛋白，其允许更高效治疗表达DLL3的癌症，诸如SCLC、神经胶母细胞瘤或表达DLL3的神经内分泌肿瘤。
【附图说明】
图1：本发明的双特异性结合蛋白的示意图
图2：用于表位域定位(mapping)的在HEK293细胞上表达的DLL3全长蛋白质及DLL3域构建体的示意图。对于DLL3域构建体，跨膜及胞内域来源于EpCAM。
图3A：七种例示性DLL3/CD3结合蛋白的DLL3表位域定位。例示性DLL3/CD3结合蛋白识别DLL3的近膜肽EGF4、EGF1及DSL域。y轴描绘计数，x轴描绘PE-A(藻红素信号区)。
图3B：六种例示性DLL3/CD3结合蛋白的DLL3表位域定位。例示性DLL3/CD3结合蛋白识别DLL3的EGF1、EGF3、EGF4或EGF6。y轴描绘计数，x轴描绘PE-A(藻红素信号)。
图3C：六种例示性DLL3/CD3结合蛋白的DLL3表位域定位。例示性DLL3/CD3结合蛋白识别DSL域，或既不识别DSL、EGF，亦不识别DLL3的近膜肽。y轴描绘计数，x轴描绘PE-A(藻红素信号)。
图4：七种例示性DLL3/CD3结合蛋白与表达人类及食蟹猕猴DLL3的细胞株的结合。y轴描绘计数，x轴描绘PE-A(藻红素信号区)。
图5：七种例示性DLL3/CD3结合蛋白与表达人类DLL1及DLL4的细胞株的结合，未检测到与人类DLL1及DLL4的结合。y轴描绘计数，x轴描绘PE-A(藻红素信号区)。
图6A：通过流式细胞计数分析的七种例示性DLL3/CD3结合蛋白与SCLC细胞株及人类T细胞的结合。
图6B：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对并非DSL、EGF1-6、近膜肽的肽)与SHP77细胞的结合。
图6C：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对DSL域)与SHP77细胞的结合。
图6D：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF1域)与SHP77细胞的结合。
图6E：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF3域)与SHP77细胞的结合。
图6F：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF4域)与SHP77细胞的结合。
图6G：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对DSL域)与SHP77细胞的结合。
图6H：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对近膜肽域)与SHP77细胞的结合。
图6I：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对并非DSL、EGF1-6、近膜肽的肽)与NCI-H82细胞的结合。
图6J：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对DSL域)与NCI-H82细胞的结合。
图6K：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF1域)与NCI-H82细胞的结合。
图6L：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF3域)与NCI-H82细胞的结合。
图6M：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF4域)与NCI-H82细胞的结合。
图6N：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对DSL域)与NCI-H82细胞的结合。
图6O：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对近膜肽域)与NCI-H82细胞的结合。
图6P：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对并非DSL、EGF1-6、近膜肽的肽)与T细胞的结合。
图6Q：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对DSL域)与T细胞的结合。
图6R：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF1域)与T细胞的结合。
图6S：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF3域)与T细胞的结合。
图6T：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF4域)与T细胞的结合。
图6U：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF6域)与T细胞的结合。
图6V：例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对近膜肽域)与T细胞的结合。
图7A：将非刺激性PBMC重导向人类SCLC细胞株的七种DLL3/CD3结合蛋白在溶解细胞中的效能。
图7B：将非刺激性T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对并非DSL、EGF1-6、近膜肽的肽)在溶解细胞中的效能。
图7C：将非刺激性T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对DSL域)在溶解细胞中的效能。
图7D：将非刺激性T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF1域)在溶解细胞中的效能。
图7E：将非刺激性T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF3域)在溶解细胞中的效能。
图7F：将非刺激性T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF4域)在溶解细胞中的效能。
图7G：将非刺激性T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF6域)在溶解细胞中的效能。
图7H：将非刺激性T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对近膜肽)在溶解细胞中的效能。
图7I：将非刺激性T细胞重导向人类NCI-H82细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对并非DSL、EGF1-6、近膜肽的肽)在溶解细胞中的效能。
图7J：将非刺激性T细胞重导向人类NCI-H82细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对DSL域)在溶解细胞中的效能。
图7K：将非刺激性T细胞重导向人类NCI-H82细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF1域)在溶解细胞中的效能。
图7L：将非刺激性T细胞重导向人类NCI-H82细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF3域)在溶解细胞中的效能。
图7M：将非刺激性T细胞重导向人类NCI-H82细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF4域)在溶解细胞中的效能。
图7N：将非刺激性T细胞重导向人类NCI-H82细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对EGF6域)在溶解细胞中的效能。
图7O：将非刺激性T细胞重导向人类NCI-H82细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白(针对近膜肽)在溶解细胞中的效能。
图8：利用两种例示性DLL3/CD3结合蛋白的活体外内化。使DLL3/CD3结合蛋白与DLL3阳性SHP77细胞一起预培育2及4小时，之后与人类PBMC共同培育48小时。
图9：两种例示性DLL3/CD3结合蛋白的药物动力学。在单次1mg/kg静脉内给药后DLL3#3/CD3#1(空心方块)及DLL3#3/CD3#2(实心方块)在雄性C57BL/6小鼠中的平均药物动力学概况。
图10：两种例示性DLL3/CD3结合蛋白的抗肿瘤活性。y轴描绘中值肿瘤体积且x轴描绘时间。
图11：将非刺激性PBMC重导向人类SHP77及RKO-E6细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白在溶解细胞中的效能。
图12：在SHP77细胞存在下例示性DLL3/CD3结合蛋白对T细胞活化的效能
图13：在SHP77细胞存在下例示性DLL3/CD3结合蛋白对T细胞脱粒的效能
图14A：在SHP77细胞存在下，例示性DLL3/CD3结合蛋白对PBMC的干扰素分泌的效能
图14B：在SHP77细胞存在下，例示性DLL3/CD3结合蛋白对PBMC的MCP-1分泌的效能
图15：在SHP77细胞存在下例示性DLL3/CD3结合蛋白对T细胞增殖的效能
图16：将非刺激性泛T细胞及原始T细胞重导向人类SHP77的例示性DLL3/CD3结合蛋白在溶解细胞中的效能。
图17：将非刺激性CD4+及CD4+中央记忆T细胞重导向人类SHP77细胞的例示性DLL3/CD3结合蛋白在溶解细胞中的效能
图18：将非刺激性CD4+及CD4+效应记忆T细胞重导向人类SHP77的例示性DLL3/CD3结合蛋白在溶解细胞中的效能
图19：将非刺激性CD8+及CD8+CD45RA+效应记忆T细胞重导向人类SHP77的例示性DLL3/CD3结合蛋白在溶解细胞中的效能
图20：将非刺激性CD8+及CD8+记忆T细胞重导向人类SHP77的例示性DLL3/CD3结合蛋白在溶解细胞中的效能
图21：具有例示性DLL3/CD3结合蛋白的SHP77异种移植肿瘤组织中的T细胞浸润。
图22：在ELISA分析中三种例示性抗-DLL3抗体与重组DLL3蛋白质的结合。y轴描绘计数，x轴描绘DLL3蛋白质的浓度。
图23：通过流式细胞计数测定的例示性抗-DLL3抗体与DLL3阳性SCLC细胞株的结合。y轴描绘计数，x轴描绘抗-DLL3抗体的浓度。
图24：具有5种例示性抗-DLL3抗体的SCLC组织样本的代表性染色。抗-DLL3抗体DLL3#1及DLL3#5显示，肿瘤细胞展现点状及/或分散细胞质及/或膜DLL3染色。已通过LEICASCN400自动化扫描仪，以10×放大倍数来电子产生影像。
图25：来自具有不同DLL3表达量的SCLC细胞株的细胞集结粒的代表性染色。Anti-DLL3抗体DLL3#5
【发明详述】
所使用的术语及定义
本发明的以上及其他方面及实施方案将由本文中的进一步描述而变得清楚，其中：
除非另外指明或定义，否则所用全部术语均具有其在本领域中的常用含义，其对本领域技术人员将为清楚的。例如参考标准手册，诸如Sambrook等人，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Lewin，“Genes IV”，Oxford University Press，New York，(1990)及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，Gower Medical Publishing，London，New York(1989)，以及本文中所引用之一般背景技术。此外，如本领域技术人员将清楚，除非另外指明，否则所有未特定详细描述的方法、步骤、技术及操作可以本身已知的方式进行且已以本身已知的方式进行。此外，针对实施例参照标准手册、上文所提及之一般先前技术及其中所引用的其他参考文献。
当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”及其变型，诸如“包含(comprises)”及“包含(comprise)”可经术语“含有”或“包括”或“具有”取代。
除非上下文需要更加受限的解释，否则如本文所用的术语“序列”(例如，比如以下术语，“重链/轻链序列”、“抗体序列”、“可变域序列”、“恒定域序列”或“蛋白质序列”)一般应理解为包括相关氨基酸序列以及编码其的核酸序列或核苷酸序列。
如本文所用的“抗原结合单元”是指能够结合至其特定目标或抗原且包含允许靶标结合的来源于抗体(通常存在于抗体中)的最小结构需求的多肽。因此，抗原结合单元包含至少三个轻链及三个重链CDR序列，优选至少轻链可变域及重链可变域的存在。
抗体或免疫球蛋白的通用型结构为本领域技术人员熟知。这些分子为杂四聚体糖蛋白，通常为约150,000道尔顿，由两个相同轻(L)链及两个相同重(H)链构成且通常称为全长抗体。每个轻链通过一个二硫键共价连接至重链以形成杂二聚体，且杂四聚体分子经由杂二聚体的两个相同重链之间的共价二硫键连接形成。尽管所述轻链及重链通过一个二硫键连接于一起，但两个重链之间的二硫键数目因免疫球蛋白同型而不同。各重链及轻链亦具有有规律间隔的链内二硫桥键。每个重链在N端处具有可变域(VH)，之后为三个或四个(就IgE而言)恒定域(CH1、CH2、CH3及CH4)，以及在CH1与CH2之间的铰链区。各轻链具有两个结构域：N端可变域(VL)及C端恒定域(CL)。VL域非共价缔合VH域，然而CL域通常经由二硫键共价连接至CH1域。已知特定氨基酸残基在轻链可变域与重链可变域之间形成界面(Chothia等人，1985，J.Mol.Biol.186:651-663)。可变域在本文中亦称为可变区或Fv且表示通过携带抗原结合位点赋予抗体对抗原的特异性的部分。
如本文所用的“轻链可变域”(或“轻链可变区”)及“重链可变域”(或“重链可变区”)具有相同的通式结构且每个域基本上由四个框架(FR)区组成，所述框架区的序列为广泛保守的，在本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；以及“框架区4”或“FR4”；所述框架区间杂有三个高变区HVR(或CDR)，其在本领域中及本文中下文分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；以及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变域的通用结构或序列可如下表示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。框架区采用β-片层构型且CDR可形成连接β-片层结构的回路。各链中的CDR通过框架区保持在其三维结构中且与来自其他链的CDR一起形成抗原结合位点。
在本发明的上下文内，对CDR的参考为基于CCG，亦称为IMGT的定义(Lefranc MP，PommiéC，Ruiz M，Giudicelli V，Foulquier E，Truong L，Thouvenin-Contet V，LefrancG.“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains.”Dev Comp Immunol.2003年1月；27(1):55-77；Giudicelli V，Brochet X，Lefranc MP.“IMGT/V-QUEST:IMGT standardizedanalysis of the immunoglobulin(IG)and T cell receptor(TR)nucleotidesequences”.Cold Spring Harb Protoc.2011；2011(6):695-715)。本领域中已知的CDR的替代定义为基于Chothia(Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.1987，196:901-917)以及卡贝特(E.A.Kabat，T.T.Wu，H.Bilofsky，M.Reid-Miller及H.Perry，Sequence of Proteins ofImmunological Interest，National Institutes of Health，Bethesda(1983))。
如本申请案内使用的术语“恒定域”或“恒定区”表示除可变区以外的抗体的结构域的总和。此类恒定域及恒定区为目前先进技术所熟知且例如由Kabat等人(“Sequence ofproteins of immunological interest”，US Public Health Services，NIH Bethesda，MD，公开案第91号)描述。
抗体的“Fc部分”或“Fc域”不直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应功能。“抗体的Fc部分/域”为本领域技术人员熟知的术语且界定于抗体的木瓜酶裂解的基体上。视其重链的恒定区的氨基酸序列而定，抗体或免疫球蛋白分成以下类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。根据重链恒定区，不同类别的免疫球蛋白分别称为α、δ、ε、γ及μ。这些中的若干者可进一步分成子类(同型)，例如IgGl、IgG2、IgG3及IgG4、IgAl及IgA2。抗体的Fc部分直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)及CDC(补体依赖性细胞毒性)，基于补体活化、C1q结合及Fc底物结合。补体活化(complement activation；CDC)通过补体因子C1q与大多数IgG抗体子类的Fc部分的结合来启动。虽然补体系统上的抗体的影响取决于某些条件，但C1q结合为由Fc部分内的界定结合位点造成。此类结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根据EU编号编号(Edelman等人，Proc Natl Acad Sci U SA.1969年5月；63(1):78-85))。这些残基中在介导IgG1中的C1q及Fcγ底物结合方面最关键的为L234及L235(Hezareh等人，J.Virology 75(2001)12161-12168，Shields等人，(2001)JBC，276(9):6591-6604)。亚类IgGl及IgG3的抗体通常展示补充活化及Clq及C3结合，而IgG2及IgG4不活化补体系统且不结合Clq及C3。
术语“抗体”或“抗体分子”(本文中同义使用)涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、人类抗体、人类化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段(尤其Fv、Fab、Fab'或F(ab')2片段)、单链抗体(尤其单链可变片段(scFv)、单链Fab片段(scFab))、小模块化免疫药物(SMIP)、结构域抗体、纳米抗体、双功能抗体。抗体可具有效应功能，诸如ADCC或CDC，其通常通过抗体的Fc部分(抗体恒定区)介导，或其可不具有效应功能，例如通过缺乏Fc部分或具有阻断、遮蔽的Fc部分，本质上免疫细胞或免疫系统组分(如补体系统)不识别或未充分识别的Fc部分。
单克隆抗体(mAb)为氨基酸序列相同的单特异性抗体。其可通过杂交瘤技术自杂交细胞株(称为杂交瘤)制备，该杂交细胞株代表产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤(B细胞癌症)细胞的融合的纯系(Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature 1975；256:495-7)。可替代地，单克隆抗体可通过在宿主细胞中的重组表达制备(Norderhaug L，Olafsen T，MichaelsenTE，Sandlie I.(1997年5月).“Versatile vectors for transient and stableexpression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.”J ImmunolMethods 204(1):77-87；亦参见下文)。“重组抗体”或“重组结合蛋白”为已通过以重组方式工程改造的宿主细胞产生的抗体或结合蛋白。其任选地经分离或纯化。
全长抗体可用诸如木瓜酶或胃蛋白酶的酶处理，以产生适用抗体片段。使用木瓜酶消化以产生两种相同的各具有单一抗原结合位点的称为“Fab”片段的抗原结合抗体片段，及残余“Fc”片段。Fab片段亦含有轻链的恒定域及重链的CH1域。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
Fab'片段与Fab片段的不同的处在于在CH1域的C端存在额外残基，其包括一或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。F(ab')2抗体片段为由铰链区中的半胱氨酸残基连接的Fab'片段对。抗体片段的其他化学偶合亦已知。
“Fv”片段含有由一个重链可变域及一个轻链可变域的紧密非共价缔合的二聚体组成的完整抗原识别及结合位点。在此组态中，各可变域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同地赋予抗体以抗原结合特异性。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段为包含抗体的VH及VL域的单链Fv变体，其中所述域存在于单一多肽链中。单链Fv能够识别且结合抗原。scFv多肽亦可任选含有位于VH与VL域之间的多肽接头以有助于通过scFv形成抗原结合所需的三维结构(参见例如Pluckthun，1994，The Pharmacology of monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页)。
“单链Fab”或“scFab”抗体片段为包含抗体的VL、CL、VH及CH1域的单链Fab变体，其中所述域存在于单一多肽链中。单链Fab能够识别且结合抗原。scFab多肽亦可任选含有位于CL与VH域之间的多肽接头(Hust等人，(2007)BMC Biotechnology)。
为用于人类，常常需要降低治疗分子(诸如包含如本文所述的抗原结合单元的抗体或结合蛋白)的免疫原性，所述治疗分子最初来源于其他物种，如小鼠。此可通过构建嵌合抗体/结合蛋白，或通过称为“人类化”的方法完成。在此上下文中，“嵌合抗体”；或“嵌合抗原结合单元”应理解为包含与来源于不同物种(例如人类)的序列部分(例如恒定域)融合的来源于一个物种(例如小鼠)的序列部分(例如可变域)的抗体或抗原结合单元。在此上下文中，“人类化抗体”、“人类化结合蛋白”或“人类化抗原结合单元”为包含最初来源于非人类物种的可变域的抗体、蛋白质或抗原结合单元，其中已使某些氨基酸突变以制备可变域更近似于人类可变域的序列的总体序列。抗体人类化的方法为本领域中熟知的(BillettaR，Lobuglio AF.“Chimeric antibodies”.Int Rev Immunol.1993；10(2-3):165-76；Riechmann L，Clark M，Waldmann H，Winter G(1988).“Reshaping human antibodies fortherapy”.Nature:332:323)。
“经优化抗体”或“经优化的抗原结合单元或蛋白质”为特定类型的人类化抗体或人类化抗原结合单元/蛋白，其包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，该人类化抗体或人类化抗原结合单元/蛋白能够与预定抗原结合且包含一或多个基本上具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的FR及一或多个基本上具有非人类免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR。通常称为“导入”序列的此非人类氨基酸序列通常获自“导入”抗体域、尤其可变域。一般而言，经优化抗体至少包括插入人类重链或轻链可变域的FR之间的非人类抗体或来源于非人类抗体的CDR(或HVL)。应理解，某些小鼠FR残基对于经优化抗体的功能而言为重要的且因此某些人类生殖为序列重链及轻链可变域残基经修饰为与相应小鼠序列的那些相同。在此过程期间，亦可移除或改变非所需氨基酸，例如以避免脱酰胺、非所需电荷或亲脂性或非特异性结合。“经优化抗体”、“经优化抗体片段”或“优化”有时可称为“人类化抗体”、“人类化抗体片段”或“人类化”，或“序列经优化”。
此外，已开发出用于基于来源于人类基因组的序列产生抗体或VH/VL域的技术，例如通过噬菌体呈现或使用转基因动物(WWW.Ablexis.com/technology-alivamab.php；WO90/05144；D.Marks，H.R.Hoogenboom，T.P.Bonnert，J.McCafferty，A.D.Griffiths及G.Winter(1991)“By-passing immunisation.Human antibodies from V-gene librariesdisplayed on phage.”J.Mol.Biol.，222，581-597；Knappik等人，J.Mol.Biol.296:57-86，2000；S.Carmen及L.Jermutus，“Concepts in antibody phage display”.BriefingsinFunctional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203；Lonberg N，Huszar D.“Human antibodies from transgenic mice”.Int Rev Immunol.1995；13(1):65-93.；Brüggemann M，Taussig MJ.“Production of human antibody repertoires in transgenicmice”.Curr Opin Biotechnol.1997年8月；8(4):455-8.)。在本发明的上下文中，此类抗体或抗原结合单位或VH/VL域为“人类抗体”、“人类抗原结合单位”或“人类VH/VL域”。
如本文所用的术语“人类抗体”、“人类抗原结合单元”或“人类VH/VL域”意欲包括具有来源于人类生殖为免疫球蛋白序列的可变(及恒定，若适用)区的抗体、抗原结合单位或VH/VL域。本发明技术的人类抗体、抗原结合单位、蛋白质或VH/VL域可包括并非由人类生殖为免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在活体外通过随机或位点特异性突变诱发或在活体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人类抗体”、“人类抗原结合单元”或“人类VH/VL域”不意欲包括其中来源于另一种(哺乳动物物种)(诸如小鼠、大鼠或兔)的生殖为的CDR序列已移植于人类构架序列上的抗体。因此，如本文所用，术语“人类抗体”、“人类抗原结合单元”或“人类VH/VL域”是指以下抗体、抗原结合单元或VH/VL域：其中基本上蛋白质的每一部分(例如CDR、构架、CL、CH域(例如CH1、CH2、CH3)、铰链、VL、VH)在人类中基本上为非免疫原性的，仅有微小序列改变或变化。此类改变或变化任选且优选相对于未修饰抗体或抗原结合单位保留或降低在人类或其他物种中的免疫原性。
因此，人类抗体、人类抗原结合单元或人类VH/VL域不同于例如嵌合或人类化抗体。应指出，人类抗体、人类抗原结合单元或人类VH/VL域可通过能够表达功能重排的人类免疫球蛋白(例如重链及/或轻链)基因的非人类动物或原核或真核生物细胞制备。
术语“单体”是指如本文所述的抗体或多特异性蛋白质的均质形式。举例而言，对于全长抗体，单体意谓具有两条相同重链及两条相同轻链的单体抗体。在本发明的上下文中，单体意谓具有如本文所述的对DLL3具有特异性的单一抗原结合单元，及对CD3具有特异性的单一抗原结合单元的本发明的蛋白质。举例而言，本文所描述的结合蛋白的单体可具有两条链：第一链，包含具有第一抗原结合单元的单链Fab及任选存在的第一Fc域；及第二链，其包含具有第二抗原结合单元的单链Fab及任选存在的第二Fc域。
表位为与抗体或抗原结合部分(例如本文所描述的蛋白质的抗原结合单元)结合的抗原区。术语“表位”包括能够特异性结合于抗体或抗原结合部分的任何多肽决定子。在某些实施方案中，表位决定子包括分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基)，且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特征，及/或特定电荷特征。构型表位与非构型表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合消失，但后者则不然。
可“结合”、“结合于”、“特异性结合”或“特异性结合于”某一表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)，对某一表位、抗原或蛋白质“具有亲和力”、“具有特异性(is specific for/has specificity for)”的抗原结合分子/蛋白质(诸如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元或此类抗原结合分子/蛋白质的片段)称为“对”或“针对”该表位、抗原或蛋白质或相对于此类表位、抗原或蛋白质“结合”分子/蛋白质。
如本文所用，术语“结合”及“特异性结合”是指在活体外分析中，优选在利用经纯化的野生型抗原的等离子共振分析(Malmqvist M.，“Surface plasmon resonance fordetection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.”，CurrOpin Immunol.1993年4月；5(2):282-6.)中，抗体或抗原结合部分(诸如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元或此类抗原结合分子/蛋白质的片段)与抗原的表位的结合。抗体亲和力亦可使用动力学排斥分析(KinExA)技术(Darling，R.J.,及Brault P-A.，“Kinetic exclusionassay technology:Characterization of Molecular Interactions.”ASSAY and DrugDevelopment Technologies.2004年12月2日(6):647-657)来测量。
一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子/蛋白质(诸如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元，或此类抗原结合分子/蛋白质的片段)可结合的不同类型的抗原或表位的数目。抗原结合分子/蛋白的特异性可基于其亲和力及/或亲合力进行测定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)表示的亲和力为表位与抗原结合分子/蛋白上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值愈小，表位与抗原结合分子之间的结合强度愈强(可替代地，亲和力亦可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。如熟练人员将清楚(例如基于本文中的其他公开内容)，亲和力可以本身已知的方式进行测定，其视相关特异性抗原而定。亲合力为抗原结合分子/蛋白(诸如免疫球蛋白、抗体、抗原结合单元，或此类抗原结合分子/蛋白的片段)与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与表位与抗原结合分子/蛋白上的其抗原结合位点之间的亲和力及抗原结合分子/蛋白上所存在的相关结合位点的数目两者有关。
如本文中所使用的术语“分离”是指物质脱离其原始或原生环境(例如天然环境(若其为天然存在的))。举例而言，存在于活动物中的天然产生的聚核苷酸或多肽未经分离，但通过人类干预而与天然系统中的一些或所有共存物质分离的相同聚核苷酸或多肽经分离。所述聚核苷酸可为载体的一部分且/或所述聚核苷酸或多肽可为组合物的一部分，且仍经分离以使得此载体或组合物不为自然界中发现其的环境的一部分。举例而言，当相较于自其获得核酸、蛋白质/多肽分子的该核酸、蛋白质/多肽分子的天然生物源及/或反应介质或培养介质时，当该核酸、蛋白质/多肽分子已与至少一种其他组分，诸如另一核酸、另一蛋白质/多肽、另一生物组分或大分子或至少一种掺杂物、杂质或微量组分分离，其中该核酸、蛋白质/多肽分子通常与该至少一种其他组分缔合于该源或介质中时，该核酸、蛋白质/多肽分子视为“(呈)基本上分离(形式)”。详言之，当以至少2倍，尤其至少10倍、较尤其至少100倍且高达1000倍或大于1000倍纯化核酸或蛋白质/多肽分子时，其视为“基本上分离”的。如使用适合技术，诸如适合的色谱技术，诸如聚丙烯酰胺-凝胶电泳所测定，“呈基本上分离形式”的核酸或蛋白质/多肽分子优选为基本上均质的。
如本文所使用，术语“一致”或“一致性百分比”在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下是指针对最大对应性比较及比对时两个或更多个序列或子序列相同或有指定百分比的核苷酸或氨基酸残基相同。为确定一致性百分比，出于最佳比较目的进行序列比对(例如为与第二氨基酸或核酸序列最佳比对，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入间隙)。接着比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。若第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则分子在该位置处一致。两个序列之间之一致性百分比为所述序列共有之一致位置数的函数(亦即，一致性％＝一致位置数/位置总数(亦即重叠位置)×100)。在一些实施方案中，适当时，在序列内引入间隙之后，进行比较的两个序列长度相同(例如不包括延长超过比较序列的额外序列)。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导序列及/或恒定域序列。对于两个序列之间的序列比较，“对应”CDR是指两个序列中相同位置的CDR(例如各序列的CDR-H1)。
可使用数学算法实现确定两个序列之间之一致性百分比或相似性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实施例为Karlin及Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，如Karlin及Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中所修改。将此类算法并入至Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)执行以获得与编码所关注蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)执行以获得与所关注蛋白质同源的氨基酸序列。为使间隙式比对达成比较目的，可如Altschul等人，1997，Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所述使用间隙式BLAST。可替代地，PSI-Blast可用于执行叠代检索，其检测分子间的远距离关系(同上)。当利用BLAST、间隙式BLAST及PSI-Blast程序时，可使用对应程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。用于比较序列的数学算法的另一个优选非限制性实施例为Myers及Miller，CABIOS(1989)的算法。将此类算法并入至ALIGN程序(2.0版)中，该ALIGN程序为GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、间隙长度罚分12及间隙罚分4。用于序列分析的额外算法在本领域中已知且包括如Torellis及Robotti，1994，Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA内，ktup为设定检索的敏感性及速度的对照选项。若ktup＝2，则通过观察比对残基对得到比较的两个序列中的类似区；若ktup＝1，则检查单一比对氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可设定为2或1，或对于DNA序列设定为1至6。若ktup未得以指定，则对于蛋白质默认值为2，且对于DNA为6。可替代地，可使用CLUSTAL W算法进行蛋白质序列比对，如Higgins等人，1996，Methods Enzymol.266:383-402所描述。
如本文所用的术语“共价连接”意谓残基之间的直接共价键，或间接缔合，其中两个残基不直接键结但皆共价键结于中间分子或域，例如免疫球蛋白的中间域。
术语“竞争”或“交叉竞争”在本文中可互换使用，其是指抗体分子干扰抗体分子(例如本发明的抗-DLL3抗体分子)结合至目标(例如人类DLL3)的能力。干扰结合可为直接或间接的(例如经由抗体分子或标靶的异位调节)。抗体分子能够干扰另一抗体分子结合至目标的程度且因此是否可称其竞争可使用竞争结合分析(例如FACS分析、ELISA或BIACORE分析)测定。在一些实施方案中，竞争结合分析为定量竞争分析。在一些实施方案中，当在竞争结合分析(例如本文所描述的竞争分析)中第一抗体分子与目标的结合减少10％或更多，例如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、99％或更多时，称第一抗-DLL3抗体分子与第二抗-DLL3抗体分子竞争结合于目标。
在无明确叙述下且除非另外预期，否则推断当本发明技术与多肽、蛋白质、聚核苷酸或抗体有关时，预期此类的等效物或生物等效物在本发明技术的范畴内。
如本文所用，当提及参考蛋白质、抗体、多肽、聚核苷酸或核酸时，术语“其生物等效物”意欲与“其等效物”同义，且意指那些具有最小的同源性同时仍维持所需结构或官能性。除非本文中专门叙述，否则预期本文中提及的任何核酸、聚核苷酸、多肽、蛋白质或抗体亦包括其等效物。举例而言，等效物意指至少约80％同源性或一致性且可替代地，至少约85％、或可替代地至少约90％、或可替代地至少约95％、或可替代地98％百分比同源性或一致性且展现与参考蛋白质、多肽、抗体或核酸基本上等效的生物活性。
如本文所用，术语“可检测标记”是指可产生可检测信号(亦即物理或化学信号，包括比色、荧光、电、放射及化学发光信号)的分子、化合物或组合物，该信号可通过目视或仪器方法测量，且其指示样本中标记的存在及/或数量/浓度。
“可检测信号”可通过各种机制来产生，包括光子(包括射频、微波频率、红外频率、可见频率及紫外线频率光子)的吸收、放射及/或散射且包括但不限于比色、荧光、电、放射及化学发光信号。
如本文所用，“表达”是指聚核苷酸转录为mRNA的过程及/或转录mRNA随后转译为肽、多肽或蛋白质的过程。若聚核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。基因的表达量可通过测量细胞或组织样本中mRNA或蛋白质的量来测定。
如本文所使用，术语“生物样本”意谓来源于活细胞或与活细胞接触的样本材料。该术语意欲包括自个体分离的组织、细胞及生物流体。如本文所用，术语“组织样本”应指代在离开获得该样本的个体时保留细胞之间的截面空间关系的细胞样本。生物样本亦可获自内脏的切片或癌症。
“组织化学”及“细胞化学”为用于通过用特异性结合于分子的试剂以可在显微镜上观测的方式标记样本来鉴别完整细胞的环境内的分子的技术。“免疫组织化学”及“免疫细胞化学”为使用抗体标记分子的组织化学及细胞化学的类型。
本发明的多特异性结合蛋白
本发明提供多特异性结合蛋白，其包含至少一个与DLL3特异性结合的抗原结合单元(第一抗原结合单元)，及至少一个与CD3特异性结合的抗原结合单元(第二抗原结合单元)。此类(多特异性)结合蛋白在本文中亦称为(多特异性)结合分子或DLL3/CD3结合蛋白或DLL3/CD3结合分子。
本发明人已惊讶地发现，本发明的多特异性结合蛋白在T细胞存在下诱导DLL3阳性SCLC细胞株的选择性溶解且已经在低效应物:目标细胞比率下具有活性。重要的是，本发明的结合蛋白在无DLL3阳性细胞存在下不引起T细胞活化、T细胞增殖及细胞因子分泌或DLL3阴性细胞溶解。
为避免疑问，如本文所用的DLL3是指UniProt Q9NYJ7的人类DLL3及编码该蛋白质的核酸序列。如本文所用的CD3是指人类CD3ε(UniProt P07766)及CD3γ(Uniprot:P09693)复合物(人类CD3εγ复合物)。
预期用双特异性T细胞接合方法靶向DLL3提供优于ADC方法的优势，因为重导向T细胞不受对化学疗法的抗性的影响且细胞表面上的低表达量对此作用模式不那么关键。T细胞接合剂为多特异性结合蛋白，其具有与T细胞上的CD3结合的结合臂及与肿瘤细胞的细胞表面上的抗原结合的结合臂。经由与T细胞及肿瘤细胞的同时结合，T细胞接合剂迫使在两个细胞之间形成溶细胞突触且因此选择性地重导向对靶向肿瘤细胞的T细胞活性。
在一个方面中，本发明的多特异性结合蛋白包含与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其中该第一结合单元选自由i)至xviii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ IDNO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#1)；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ IDNO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#2)；
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ IDNO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#3)；
iv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQID NO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#4)；
v)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#5)；
vi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQID NO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#6)；
vii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ IDNO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#7)；
viii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ IDNO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#8)；
ix)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:145(CDR1)、SEQ IDNO:146(CDR2)及SEQ ID NO:147(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:148(CDR1)、SEQ ID NO:149(CDR2)及SEQ ID NO:150(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#9)；
x)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:151(CDR1)、SEQ ID NO:152(CDR2)及SEQ ID NO:153(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:154(CDR1)、SEQ ID NO:155(CDR2)及SEQ ID NO:156(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#10)；
xi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:157(CDR1)、SEQ IDNO:158(CDR2)及SEQ ID NO:159(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:160(CDR1)、SEQ ID NO:161(CDR2)及SEQ ID NO:162(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#11)；
xii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:163(CDR1)、SEQ IDNO:164(CDR2)及SEQ ID NO:165(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:166(CDR1)、SEQ ID NO:167(CDR2)及SEQ ID NO:168(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#12)；
xiii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:169(CDR1)、SEQ IDNO:170(CDR2)及SEQ ID NO:171(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:172(CDR1)、SEQ ID NO:173(CDR2)及SEQ ID NO:174(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#13)；
xiv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:175(CDR1)、SEQ IDNO:176(CDR2)及SEQ ID NO:177(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:178(CDR1)、SEQ ID NO:179(CDR2)及SEQ ID NO:180(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#14)；
xv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:181(CDR1)、SEQ IDNO:182(CDR2)及SEQ ID NO:183(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:184(CDR1)、SEQ ID NO:185(CDR2)及SEQ ID NO:186(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#15)；
xvi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:187(CDR1)、SEQ IDNO:188(CDR2)及SEQ ID NO:189(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:190(CDR1)、SEQ ID NO:191(CDR2)及SEQ ID NO:192(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#16)；
xvii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:193(CDR1)、SEQ IDNO:194(CDR2)及SEQ ID NO:195(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:196(CDR1)、SEQ ID NO:197(CDR2)及SEQ ID NO:198(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#17)；以及
xviii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:199(CDR1)、SEQ IDNO:200(CDR2)及SEQ ID NO:201(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:202(CDR1)、SEQ ID NO:203(CDR2)及SEQ ID NO:204(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元DLL3#18)。
优选地，本发明的结合蛋白的第一抗原结合单元为如上述CDR序列所定义的i)至iii)中的任一者。
为避免疑问，本文中所列出的具体实施方案中的每一者亦可视为本发明的独立方面。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，该与CD3特异性结合的第二抗原结合单元选自由i)至iii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元CD3#1)；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元CD3#2)；以及
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:96(CDR1)、SEQ IDNO:97(CDR2)及SEQ ID NO:98(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:99(CDR1)、SEQ ID NO:100(CDR2)及SEQ ID NO:101(CDR3)的重链CDR(抗原结合单元CD3#3)。
如上文所概述的第一抗原结合单位i)至xviii)分别称为DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17及DLL3#18，且如上文所概述的第二抗原结合单位i)至iii)分别称为CD3#1、CD3#2及CD3#3。本文提供序列表，其容许容易地鉴别本发明的特定抗原结合单位及全长结合蛋白的单独氨基酸序列。将概述提供于实施例2中的表1中。
如本文所用，一般而言相对于抗原结合单位的术语“第一”及“第二”仅意欲指示这些单位为两种不同单位(因为其与不同目标抗原结合)。因此，这些术语不应理解是指代本发明的结合蛋白内单位的精确次序或序列。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：选自由如上文所述的各别CDR序列所定义的以下各者组成的群的第一抗原结合单元：DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17及DLL3#18及如上文所述的各别CDR序列所定义的CD3#1的第二抗原结合单元。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由如上文所述的各别CDR序列所定义的DLL3#1、DLL3#2及DLL3#3组成的群的第一抗原结合单元及如上文所述的各别CDR序列所定义的CD3#1的第二抗原结合单元。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：选自由如上文所述的各别CDR序列所定义的以下各者组成的群的第一抗原结合单元：DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17及DLL3#18及如上文所述的各别CDR序列所定义的CD3#2的第二抗原结合单元。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由如上文所述的各别CDR序列所定义的DLL3#1、DLL3#2及DLL3#3组成的群的第一抗原结合单元及如上文所述的各别CDR序列所定义的CD3#2的第二抗原结合单元。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：选自由如上文所述的各别CDR序列所定义的以下各者组成的群的第一抗原结合单元：DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17及DLL3#18及如上文所述的各别CDR序列所定义的CD3#3的第二抗原结合单元。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由如上文所述的各别CDR序列所定义的DLL3#1、DLL3#2及DLL3#3组成的群的第一抗原结合单元及如上文所述的各别CDR序列所定义的CD3#3的第二抗原结合单元。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ IDNO:6(CDR3)的重链CDR；以及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQID NO:12(CDR3)的重链CDR；以及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ IDNO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的重链CDR；以及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ IDNO:6(CDR3)的重链CDR；以及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQID NO:12(CDR3)的重链CDR；以及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ IDNO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的重链CDR；以及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR。
除了如本文所阐述的CDR序列之外，本发明的结合蛋白的抗原结合单位包括免疫球蛋白构架区(FR)序列。这些序列优选在人类中没有免疫原性，且因此优选为人类或人类化FR序列。适合的人类或人类化FR序列为本领域中已知的。具体优选的FR序列可取自下文所示的实施方案，其公开全部抗原结合单位且由此公开CDR序列以及FR序列。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，第一及第二结合单元各自包含来源于抗体分子的轻链可变域及重链可变域，所述轻链/重链可变域由第一抗原结合单元的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者的CDR序列定义且所述轻/重链可变域由第二抗原结合单元的CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者的CDR序列定义。在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17、DLL3#18、CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者或多者的抗原结合单位的VH及/或VL域为人类或人类化VH及/或VL域。
在本发明的优选实施方案中，第一抗原结合单元的轻/重链可变域进一步定义如下
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重链可变域(抗原结合单元DLL3#1)；或
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链可变域(抗原结合单元DLL3#2)；或
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变域(抗原结合单元DLL3#3)；或
iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的重链可变域(抗原结合单元DLL3#4)；或
v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链可变域(抗原结合单元DLL3#5)；或
vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的重链可变域(抗原结合单元DLL3#6)；或
vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:205的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:206的重链可变域(抗原结合单元DLL3#7)；或
viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:207的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ IDNO:208的重链可变域(抗原结合单元DLL3#8)；或
ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:209的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:210的重链可变域(抗原结合单元DLL3#9)；或
x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:211的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:212的重链可变域(抗原结合单元DLL3#10)；或
xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:213的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:214的重链可变域(抗原结合单元DLL3#11)；或
xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:215的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:216的重链可变域(抗原结合单元DLL3#12)；或
xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ IDNO:218的重链可变域(抗原结合单元DLL3#13)；或
xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:219的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的重链可变域(抗原结合单元DLL3#14)；或
xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的重链可变域(抗原结合单元DLL3#15)；或
xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:223的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:224的重链可变域(抗原结合单元DLL3#16)；或
xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ IDNO:226的重链可变域(抗原结合单元DLL3#17)；或
xviii)包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:228的重链可变域(抗原结合单元DLL3#18)。
优选地，本发明的结合蛋白的第一抗原结合单元为如上述VL及VH序列所定义的i)至iii)中的任一者。
在本发明的优选实施方案中，第二抗原结合单元的轻/重链可变域进一步定义如下
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域(抗原结合单元CD3#1)；或
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域(抗原结合单元CD3#2)；或
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:102的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:103的重链可变域(抗原结合单元CD3#3)。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的群的第一及第二抗原结合单元的组合：DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3、DLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3，第一及第二抗原结合单元由如上文所述的抗原结合单位的CDR及/或VH及VL序列定义。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含选自由以下组成的群的第一及第二抗原结合单元的组合：DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3及DLL3#3/CD3#3，第一及第二抗原结合单元由如上文所述的抗原结合单位的CDR及/或VH及VL序列定义。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:38的重链可变域及(ii)与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:40的重链可变域及(ii)与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:42的重链可变域及(ii)与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:38的重链可变域及(ii)与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:40的重链可变域及(ii)与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:42的重链可变域及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含i)与DLL3(例如，如上述各别CDR或VH/VL序列所定义的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者)特异性结合的第一抗原结合单元，其包含利用第一肽接头直接地或间接地共价连接至第一重链可变域的第一轻链可变域及/或ii)与CD3(例如，如上述各别CDR或VH/VL序列所定义的CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者)特异性结合的第二抗原结合单元，其包含利用第二肽接头直接地或间接地共价连接至第二重链可变域的第二轻链可变域。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，第一及/或第二抗原结合单元进一步包含如在常规抗体分子的轻/重Fab域中的CL及CH1域，因此该第一结合单元包含a)共价连接(直接地或间接地键结)至第一CL域的VL域(例如由DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者的轻链CDR(LCCDR)或VL序列定义)及b)共价连接(直接地或间接地键结)至第一CH1域的VH域(例如由DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者的重链CDR(HCCDR)或VH序列定义)且/或该第二抗原结合单元包含a)共价连接(直接地或间接地键结)至第二CL域的VL域(例如由CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者的LCCDR或VL序列定义)及b)共价连接(直接地或间接地键结)至第二CH1域的VH域(例如由CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者的HCCDR或VH序列定义)。
在本发明的上下文中，CL域为抗体轻链，例如κ或λ轻链的恒定域。κ轻链的恒定区的实施例示于SEQ ID NO:87中。λ轻链的恒定区的实施例示于SEQ ID NO:88中。在一些实施方案中，第一及第二CL域相同，例如第一及第二CL域皆为κ轻链恒定域或第一及第二CL域皆为λ轻链恒定域。在一些实施方案中，第一及第二CL域不同，例如第一CL域为恒定κ域且第二CL域为恒定λ域或反过来。
在本发明的上下文中，CH1域为抗体重链的第一恒定域。恒定CH1域的实施例示于SEQ ID NO:253中。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，本发明的结合蛋白的第一抗原结合单元(例如由如上文所概述的CDR及/或VH/VL序列定义的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者)自N端至C端包含：第一轻链可变域、第一CL域、第一接头肽、第一VH域及第一CH1域，且/或本发明的结合蛋白的第二结合单元(例如由如上文所概述的CDR及/或VH/VL序列定义的CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者)自N端至C端包含：第二轻链可变域、第二CL域、第二接头肽、第二VH域及第二CH1域。在此实施方案中，第一及/或第二结合单元具有单链Fab的结构。对于两者而言，第一及/或第二抗原结合单元在形成单链Fab时，顺序可颠倒使得自N端至C端该抗原结合单元包含：VH-CH1-[接头肽]-VL-CL。在本发明的蛋白质的一些实施方案中，当第一及/或第二抗原结合单元包含Fab或单链Fab时，恒定域可具有相同类型(例如两个CL域为κ或λ轻链恒定域)或不同类型(第一CL域为κ且第二CL域为λ轻链恒定域或反过来)。
在一个方面中，用于本发明的结合蛋白的接头包含26至42个氨基酸，例如30至40个氨基酸。在另一方面中，用于本发明的蛋白质的接头包含34至40个氨基酸，例如36至39个氨基酸，例如38个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含序列SEQ ID NO:89、90、91、92、93、94或95中的任一者，优选地SEQ ID NO:89。
接头序列可为天然存在的序列或非天然存在的序列。若出于治疗目的使用，接头优选在给予本发明的结合蛋白的个体中不具免疫原性。
如WO1996/34103及WO1994/04678中所述，接头序列之一个适用群为衍生自重链抗体的铰链区的接头。其他实施例为聚丙氨酸接头序列，诸如Ala-Ala-Ala。
接头序列的更优选实施例为具有不同长度的Gly/Ser接头，诸如(glyxsery)z接头，包括例如(gly4ser)3、(gly4ser)5、(gly4ser)7、(gly3ser)3、(gly3ser)5、(gly3ser)7、(gly3ser2)3、(gly3ser2)5及(gly3ser2)7或SEQ ID NO:89至95中的任一者的接头。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，第一抗原结合单元的VL域(例如由DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18的轻链CDR(LCCDR)或VL序列定义)经由第一Gly/Ser接头(例如26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸中的任一者，优选地38个氨基酸的Gly/Ser接头)共价连接(例如直接键结)至第一抗原结合单元的VH域(例如由DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18的重链CDR(HCCDR)或VH序列定义)；且第二抗原结合单元的VL域(例如由CD3#1、CD3#2或CD3#3的轻链CDR(LCCDR)或VL序列定义)经由第二Gly/Ser接头(例如26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸中的任一者，优选38个氨基酸的Gly/Ser接头)共价连接(例如直接键结)至第二抗原结合单元的VH域(例如由CD3#1、CD3#2或CD3#3的重链CDR(HCCDR)或VH序列定义)。更优选地，第一及第二接头相同。甚至更优选地，第一及第二接头各自包含氨基酸序列SEQ ID NO:89。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成对DLL3具有特异性的第一抗原结合单元且包含选自由以下组成的群的序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239及SEQ ID NO:240；及SEQID NO:71的第二单链Fab，其形成对CD3具有特异性的第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:49；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:71，形成第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:50；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:71，形成第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:51；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:71，形成第二抗原结合单元。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成对DLL3具有特异性的第一抗原结合单元且包含选自由以下组成的群的序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239及SEQ ID NO:240；及SEQID NO:72的第二单链Fab，其形成对CD3具有特异性的第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:49；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:72，形成第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:50；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:72，形成第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:51；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:72，形成第二抗原结合单元。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成对DLL3具有特异性的第一抗原结合单元且包含选自由以下组成的群的序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239及SEQ ID NO:240；及SEQID NO:104的第二单链Fab，其形成对CD3具有特异性的第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:49；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:104，形成第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:50；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:104，形成第二抗原结合单元。在一优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一单链Fab，其形成第一抗原结合单元，包含序列SEQ IDNO:51；及第二单链Fab，其包含序列SEQ ID NO:104，形成第二抗原结合单元。
在一些实施方案中，第一抗原结合单元(例如，如上文概述的CDR及/或VH/VL序列所定义的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18)及/或第二抗原结合单元(例如CD3#1、CD3#2或CD3#3)包含共价连接(例如直接键结)至CL域的VL域及连接于CH1域的VH域(亦即一起形成衍生自抗体的Fab片段)，且该CH1域进一步共价连接(例如直接键结)至Fc域，进而形成具有一个轻链及一个重链的常规Y形抗体分子的臂。在一些实施方案中，第一及第二抗原结合单元各自形成分别共价连接(例如直接键结)至第一及第二Fc域的Fab片段，亦即第一及第二Fab片段，进而形成常规杂四聚体双特异性及二价抗体分子。
在优选实施方案中，第一抗原结合单元(例如，如上文概述的CDR及/或VH/VL序列所定义的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者)及/或第二抗原结合单元(例如CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者)包含单链Fab，亦即经由肽接头(例如具有26至42个氨基酸、30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸中的任一者，优选地38个氨基酸的Gly/Ser接头，甚至更优选SEQ ID NO:89的接头)共价连接至重链的VH-CH1域的抗体轻链(VL-CL)。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含：第一多肽链，其包含与DLL3(例如，如由上文各别CDR或VH/VL序列所定义的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者，优选地第一抗原结合单元为DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3)特异性结合的第一单链Fab及第一Fc域(此多肽链在本文中亦称为“DLL3链”)；及第二多肽链，其包含与CD3(例如，如上文各别CDR或VH/VL序列所定义的CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者)特异性结合的第二单链Fab及第二Fc域(此多肽链在本文中亦称为“CD3链”)。在一些实施方案中，第一及第二Fc域相同。在优选实施方案中，第一及第二Fc域不同。本发明的所得结合蛋白具有完整Fc且具有两个独立结合位点：针对DLL3的第一结合单元及针对CD3的第二结合单元。在一些实施方案中，第一抗原结合单元由单一多肽链(DLL3链)组成。在一些实施方案中，第二抗原结合单元由单一多肽链(CD3链)组成。在一些实施方案中，第一及第二抗原结合单元两者分别由单一多肽链组成。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质的第一抗原结合单元为通过第一多肽链(DLL3链)形成且第二抗原结合单元为通过第二多肽链(CD3链)形成。因此，在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含两条不同多肽链，各自包含具有不同特异性的抗原结合单元、彼此共价连接，或经由二硫键或可能经由肽接头共价连接的多肽链。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白为双特异性二价杂二聚蛋白质，其包含两个多肽链，一条多肽链(第一多肽链或DLL3链)包含与DLL3(例如由各别CDR及/或VH/VL序列定义的DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18中的任一者)特异性结合的抗原结合单元且另一多肽链(第二多肽链或CD3链)包含与CD3(例如CD3#1、CD3#2或CD3#3中的任一者)特异性结合的抗原结合单元。
在本发明的上下文中，Fc域例如衍生自IgG，例如IgG1、IgG2或IgG4的重链。举例而言，本发明的Fc域为IgG1或IgG4的重链的Fc域且包含铰链区及两个恒定域(CH2及CH3)。Fc域(包括铰链区)的实施例示于SEQ ID NO:81及84中。
除非另外规定，否则本发明的蛋白质的氨基酸链中的氨基酸编号在本文中为根据EU编号体为((Edelman，Cunningham等人，1969)。除非另外规定，否则此意谓根据EU编号体为，本文中指示的氨基酸数目对应于在相应亚型(例如IgG1或IgG4)的重链中的位置。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质中的第一Fc域及第二Fc域各自包含一或多个氨基酸变化，所述氨基酸变化减少第一或第二多肽链的均二聚体而非第一及第二多肽链的杂二聚体的形成。经由这些变化，通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换来自其中一个重链的界面的一或多个小氨基酸侧链而在一个Fc域中生成“突起”。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链而在另一Fc域的界面上产生相同或类似尺寸的互补“空腔”。此提供一种相比于其他非所需最终产物(诸如均二聚体，尤其具有“突起”的Fc域的均二聚体)增加杂二聚体产率的机制(参见例如Ridgway等人，Protein Eng，1996.9(7):第617-21页；Atwell等人，JMB，1997，270，26-35)。在一些实施方案中，此类氨基酸变化为在第一Fc域的位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]及在第二Fc域的407位置处的苏氨酸(T)[Y407T]。在一些实施方案中，第一Fc域包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]且第二Fc域包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]。在优选实施方案中，第一Fc域包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，且该第二Fc域包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]。举例而言，根据EU编号的Fc域的位置366对应于SEQ ID NO:81的人类IgG1 Fc序列中的氨基酸位置146，其自SEQ ID NO:81中的位置146处的T改变为SEQ ID NO:82中的位置146处的W；且根据EU编号的位置366、368及407分别对应于SEQ ID NO:81中的氨基酸位置146、148及187，其自SEQ ID NO:81中的这些位置处的T、L及Y改变为SEQ ID NO:83中的这些位置处的S、A及V。在这些实施方案中的任一者中，针对第一Fc域描述的氨基酸变化可位于第二Fc域中且第二Fc域的各别氨基酸变化可位于第一Fc域中。换言之，术语“第一”及“第二”在这些实施方案中可互换。在一些实施方案中，此类Fc域为衍生自IgG1或IgG4的重链的Fc域。
在一些实施方案中，第一Fc域除了位置366处的色氨酸(W)[T366W]之外亦包含在位置354处的半胱氨酸(C)[S354C]且第二Fc域除了位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]之外亦包含在位置349处的半胱氨酸(C)[Y349C]。在一个方面中，此类Fc域为衍生自IgG4的重链的Fc域。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白中的第一Fc域或第二Fc域进一步包含一或多个氨基酸变化，所述氨基酸变化减少Fc域与蛋白质A的结合。在一些实施方案中，此类氨基酸变化为Fc域中之一者的位置435处的精氨酸[H435R]及位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。两种变化来源于人类IgG3的序列(IgG3不与蛋白质A结合)。这些两种突变位于CH3域中且并入Fc域中之一者中以减少与蛋白质A的结合(参见例如Jendeberg等人，J ImmunolMethods，1997.201(1):第25-34页)。这些两种变化促进在蛋白质纯化期间包含这些变化的重链的均二聚体的移除。
在一些实施方案中，在本发明的结合蛋白中，包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]的Fc域进一步包含在位置435处的精氨酸[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。在此情况下，另一条重链包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，但不包括在位置435及436处的两个变化。可替代地，在一些实施方案中，在本发明的蛋白质中，包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]的Fc域进一步包含在位置435处的[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。在此情况下，另一Fc域包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，但不包括在位置435及436处的两个变化。因此，包含产生如上文所述的“空腔”的氨基酸变化的Fc域亦包含减少与蛋白质A结合的氨基酸变化。包含此Fc域的均二聚体经由与蛋白质A的结合减少移除。包含“突起”的另一Fc域的均二聚体的产生因“突起”的存在而减少。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质的Fc域可能或可能不进一步包含YTE突变(M252Y/S254T/T256E，EU编号(Dall'Acqua，Kiener等人，2006))。已展示这些突变经由优选地提高在pH 6.0下对新生FcRn底物的结合亲和力来改善Fc域的药物动力学特性。
在一些实施方案中，来源于IgG1的本发明的第一及/或第二Fc域亦包括“KO”突变(L234A、L235A)。在另一方面中，来源于IgG4的本发明的第一及/或第二Fc域亦包括Pro铰链突变(S228P)。
在本发明的优选实施方案中，结合蛋白包含i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#1/CD3#1)，或ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:74的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#2/CD3#1)，或iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:75的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ IDNO:79的第二多肽链(DLL3#3/CD3#1)，或iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#4/CD3#1)，或v)包含氨基酸序列SEQ IDNO:77的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#5/CD3#1)，或vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:78的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#6/CD3#1)；或vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:241的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#7/CD3#1)；或viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:242的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#8/CD3#1)；或ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:243的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#9/CD3#1)；或x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:244的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQID NO:79的第二多肽链(DLL3#10/CD3#1)；或xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:245的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#11/CD3#1)；或xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:246的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#12/CD3#1)；或xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:247的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQID NO:79的第二多肽链(DLL3#13/CD3#1)；或xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:248的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#14/CD3#1)；或xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:249的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#15/CD3#1)，或xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:250的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ IDNO:79的第二多肽链(DLL3#16/CD3#1)；或xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:251的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#17/CD3#1)；或xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:252的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的第二多肽链(DLL3#18/CD3#1)。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在另一优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含选自由SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75组成的群的氨基酸序列；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:79。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:79。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:79。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:79。
在本发明的优选实施方案中，结合蛋白包含i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#1/CD3#2)，或ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:74的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#2/CD3#2)，或iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:75的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ IDNO:80的第二多肽链(DLL3#3/CD3#2)，或iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#4/CD3#2)，或v)包含氨基酸序列SEQ IDNO:77的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#5/CD3#2)，或vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:78的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#6/CD3#2)；或vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:241的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#7/CD3#2)；或viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:242的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#8/CD3#2)；或ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:243的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#9/CD3#2)；或x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:244的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQID NO:80的第二多肽链(DLL3#10/CD3#2)；或xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:245的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#11/CD3#2)；或xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:246的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#12/CD3#2)；或xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:247的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQID NO:80的第二多肽链(DLL3#13/CD3#2)；或xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:248的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#14/CD3#2)；或xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:249的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#15/CD3#2)，或xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:250的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ IDNO:80的第二多肽链(DLL3#16/CD3#2)；或xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:251的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#17/CD3#2)；或xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:252的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的第二多肽链(DLL3#18/CD3#2)。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在另一优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含选自由SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75组成的群的氨基酸序列；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:80。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:80。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:80。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:80。
在本发明的优选实施方案中，结合蛋白包含i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#1/CD3#3)，或ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:74的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#2/CD3#3)，或iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:75的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ IDNO:105的第二多肽链(DLL3#3/CD3#3)，或iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#4/CD3#3)，或v)包含氨基酸序列SEQID NO:77的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#5/CD3#3)，或vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:78的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#6/CD3#3)；或vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:241的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#7/CD3#3)；或viii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:242的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#8/CD3#3)；或ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:243的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#9/CD3#3)；或x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:244的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#10/CD3#3)；或xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:245的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#11/CD3#3)；或xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:246的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#12/CD3#3)；或xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:247的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#13/CD3#3)；或xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:248的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#14/CD3#3)；或xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:249的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#15/CD3#3)，或xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:250的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#16/CD3#3)；或xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:251的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#17/CD3#3)；或xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:252的第一多肽链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的第二多肽链(DLL3#18/CD3#3)。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接且形成类似于常规Y形抗体分子的抗体样结构(图1)。
在另一优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含选自由SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75组成的群的氨基酸序列；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:105。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:105。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:105。
在一个优选实施方案中，结合蛋白包含：对DLL3具有特异性的第一多肽链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75；及对CD3具有特异性的第二多肽链，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:105。
对于上述所有实施方案，应理解，通过使用术语“包含”，意欲亦包括其中各别结构域或分子“由”如所指示的氨基酸序列“组成”的实施方案。
在另一方面中，本发明提供一种蛋白质，其包含与DLL3特异性结合的第一多肽链及与CD3特异性结合的第二多肽链，其中该第一链包含共价连接(例如直接键结)至第一接头的第一轻链，该第一接头自身共价连接(例如直接键结)至第一重链，且其中与CD3特异性结合的第二链包含共价连接(例如直接键结)至第二接头的第二轻链，该第二接头自身共价连接(例如直接键结)至第二重链。
在一些实施方案中，自其N端起始，第一多肽链包含与DLL3特异性结合的第一轻链可变区、第一轻链恒定区、第一接头、对DLL3具有特异性的第一重链可变区及第一重链恒定区。在一些实施方案中，自其N端起始，第二多肽链包含与CD3特异性结合的第二轻链可变区、第二轻链恒定区、第二接头、对CD3具有特异性的第二重链可变区及第二重链恒定区。
所得蛋白质具有略大于IgG的完整Fc且具有两个独立的结合位点(例如各结合位点对各别抗原为单价的)：针对DLL3的第一结合位点及针对CD3的第二结合位点。优选地，第一及第二多肽链经由一或多个二硫键连接。因此，本发明的蛋白质为抗体样结构，具有常规全长抗体的Y形结构(参见图1)。此双特异性型式在表达及纯化之后极大地降低异质性(例如通过避免具有不同结合特异性的轻及重可变域的错配)，同时维持结构内结合部分不大可能产生非所需免疫原性反应物的功能特性。此亦允许杂二聚蛋白质(例如在哺乳动物细胞中)的良好表达。
在本发明的蛋白质的一些实施方案中，与DLL3特异性结合的第一多肽链包含第一轻链可变域及第一重链可变域，该第一轻链可变域及第一重链可变域包含选自由i)至xviii)组成的群的CDR序列：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ IDNO:6(CDR3)的重链CDR；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ IDNO:12(CDR3)的重链CDR；
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ IDNO:18(CDR3)的重链CDR；
iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ IDNO:24(CDR3)的重链CDR；
v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ IDNO:30(CDR3)的重链CDR；以及
vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ IDNO:36(CDR3)的重链CDR；
vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的重链CDR；
viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ IDNO:141(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的重链CDR；
ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:145(CDR1)、SEQ ID NO:146(CDR2)及SEQ ID NO:147(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:148(CDR1)、SEQ ID NO:149(CDR2)及SEQ ID NO:150(CDR3)的重链CDR；
x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:151(CDR1)、SEQ ID NO:152(CDR2)及SEQ ID NO:153(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:154(CDR1)、SEQ ID NO:155(CDR2)及SEQ ID NO:156(CDR3)的重链CDR；
xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:157(CDR1)、SEQ ID NO:158(CDR2)及SEQ ID NO:159(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:160(CDR1)、SEQ ID NO:161(CDR2)及SEQ ID NO:162(CDR3)的重链CDR；
xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:163(CDR1)、SEQ ID NO:164(CDR2)及SEQ ID NO:165(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:166(CDR1)、SEQ ID NO:167(CDR2)及SEQ ID NO:168(CDR3)的重链CDR；
xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:169(CDR1)、SEQ ID NO:170(CDR2)及SEQ IDNO:171(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:172(CDR1)、SEQ ID NO:173(CDR2)及SEQ ID NO:174(CDR3)的重链CDR；
xiv)包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:175(CDR1)、SEQ ID NO:176(CDR2)及SEQID NO:177(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:178(CDR1)、SEQ ID NO:179(CDR2)及SEQ ID NO:180(CDR3)的重链CDR；
xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:181(CDR1)、SEQ ID NO:182(CDR2)及SEQ ID NO:183(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:184(CDR1)、SEQ ID NO:185(CDR2)及SEQ ID NO:186(CDR3)的重链CDR；
xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:187(CDR1)、SEQ ID NO:188(CDR2)及SEQ ID NO:189(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:190(CDR1)、SEQ ID NO:191(CDR2)及SEQ ID NO:192(CDR3)的重链CDR；
xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:193(CDR1)、SEQ ID NO:194(CDR2)及SEQ IDNO:195(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:196(CDR1)、SEQ ID NO:197(CDR2)及SEQ ID NO:198(CDR3)的重链CDR；以及
xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:199(CDR1)、SEQ ID NO:200(CDR2)及SEQ IDNO:201(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:202(CDR1)、SEQ ID NO:203(CDR2)及SEQ ID NO:204(CDR3)的重链CDR。
由这些CDR序列定义的各别轻/重链可变域分别称为DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17及DLL3#18。优选地，CDR序列选自由如上文所定义的i)至iii)(DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3)组成的群。
在本发明的结合蛋白的优选实施方案中，该与CD3特异性结合的第二多肽链包含第二轻链可变域及第二重链可变域，该第二轻链可变域及第二重链可变域包含选自由以下组成的群的CDR序列：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ IDNO:60(CDR3)的重链CDR；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ IDNO:66(CDR3)的重链CDR；以及
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:96(CDR1)、SEQ ID NO:97(CDR2)及SEQ ID NO:98(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:99(CDR1)、SEQ ID NO:100(CDR2)及SEQID NO:101(CDR3)的重链CDR。
由这些CDR序列定义的各别轻/重链可变域分别称为CD3#1、CD3#2及CD3#3。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含第一轻链可变域，该第一轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR及第一重链可变域，该第一重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的重链CDR；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含第二轻链可变域，该第二轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR及第二重链可变域，该第二重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含第一轻链可变域，该第一轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR及第一重链可变域，该第一重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的重链CDR；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含第二轻链可变域，该第二轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR及第二重链可变域，该第二重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含第一轻链可变域，该第一轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR及第一重链可变域，该第一重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的重链CDR；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含第二轻链可变域，该第二轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ IDNO:57(CDR3)的轻链CDR及第二重链可变域，该第二重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含第一轻链可变域，该第一轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR及第一重链可变域，该第一重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的重链CDR；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含第二轻链可变域，该第二轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR及第二重链可变域，该第二重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含第一轻链可变域，该第一轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR及第一重链可变域，该第一重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的重链CDR；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含第二轻链可变域，该第二轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR及第二重链可变域，该第二重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含第一轻链可变域，该第一轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR及第一重链可变域，该第一重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的重链CDR；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含第二轻链可变域，该第二轻链可变域具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ IDNO:63(CDR3)的轻链CDR及第二重链可变域，该第二重链可变域具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR。
在本发明的蛋白质的优选实施方案中，该与DLL3特异性结合的第一多肽链包含选自由i)至xviii)组成的群的轻链可变域(第一轻链可变域)及重链可变域(第一重链可变域)：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重链可变域(DLL3#1)；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链可变域(DLL3#2)；
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变域(DLL3#3)；
iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的重链可变域(DLL3#4)；
v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链可变域(DLL3#5)；
vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的重链可变域(DLL3#6)；
vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:205的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:206的重链可变域(DLL3#7)；
viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:207的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ IDNO:208的重链可变域(DLL3#8)；
ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:209的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:210的重链可变域(DLL3#9)；
x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:211的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:212的重链可变域(DLL3#10)；
xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:213的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:214的重链可变域(DLL3#11)；
xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:215的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:216的重链可变域(DLL3#12)；
xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ IDNO:218的重链可变域(DLL3#13)；
xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:219的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的重链可变域(DLL3#14)；
xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的重链可变域(DLL3#15)；
xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:223的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:224的重链可变域(DLL3#16)；
xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ IDNO:226的重链可变域(DLL3#17)；以及
xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ IDNO:228的重链可变域(DLL3#18)。
优选地，轻链可变域及重链可变域序列选自由如上文所定义的i)至iii)(DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3)组成的群。
在本发明的蛋白质的优选实施方案中，该与CD3特异性结合的第二多肽链包含选自由以下组成的群的轻链可变域(第二轻链可变域)及重链可变域(第二重链可变域)：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域(CD3#1)；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域(CD3#2)；以及
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:102的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:103的重链可变域(CD3#3)。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一及第二多肽链，该第一及第二多肽链包含选自由以下组成的清单的轻/重链可变域的CDR及/或VH及VL序列：DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3及DLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3。在优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一及第二多肽链，该第一及第二多肽链包含选自由以下组成的清单的轻/重链可变域的CDR及/或VH及VL序列：DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3及DLL3#3/CD3#3。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含SEQ ID NO:37的轻链可变域及SEQ ID NO:38的重链可变域；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含SEQ ID NO:67的轻链可变域及SEQ ID NO:68的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含SEQ ID NO:39的轻链可变域及SEQ ID NO:40的重链可变域；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含SEQ ID NO:67的轻链可变域及SEQ ID NO:68的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含SEQ ID NO:41的轻链可变域及SEQ ID NO:42的重链可变域；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含SEQ ID NO:67的轻链可变域及SEQ ID NO:68的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含SEQ ID NO:37的轻链可变域及SEQ ID NO:38的重链可变域；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含SEQ ID NO:69的轻链可变域及SEQ ID NO:70的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含SEQ ID NO:39的轻链可变域及SEQ ID NO:40的重链可变域；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含SEQ ID NO:69的轻链可变域及SEQ ID NO:70的重链可变域。
在一个优选实施方案中，本发明的结合蛋白包含(i)与DLL3特异性结合的第一多肽链，其包含SEQ ID NO:41的轻链可变域及SEQ ID NO:42的重链可变域；及(ii)与CD3特异性结合的第二多肽链，其包含SEQ ID NO:69的轻链可变域及SEQ ID NO:70的重链可变域。
在本发明的一些实施方案中，第一及/或第二接头肽包含如上文所述的接头，例如来源于铰链区的接头、聚丙氨酸接头或Gly/Ser接头，其中该接头包含26至42个氨基酸，例如30至40个氨基酸、34至40个氨基酸，或36至39个氨基酸中的任一者，优选38个氨基酸。
在优选实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含以下中的任一者的氨基酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQID NO:239或SEQ ID NO:240且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
在一些实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含以下中的任一者的氨基酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQID NO:239或SEQ ID NO:240且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
在一些实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含以下中的任一者的氨基酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQID NO:239或SEQ ID NO:240且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:104。
在一个优选实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO:49且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
在一个优选实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO:50且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
在一个优选实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO:51且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
在一个优选实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO:49且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
在一个优选实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO:50且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
在一个优选实施方案中，对DLL3具有特异性的第一多肽链包含氨基酸序列SEQ IDNO:51且对CD3具有特异性的第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，第一及第二多肽链包含来源于IgG(例如IgG1、IgG2或IgG4)的重链的Fc域。举例而言，本发明的Fc域为IgG1或IgG4的重链的Fc域且包含铰链区及两个恒定域(CH2及CH3)。人类IgG的Fc域的实施例示于SEQ ID NO:81及84中。
在本发明的结合蛋白的一些实施方案中，重链包含一或多个氨基酸变化。举例而言，此类氨基酸变化为第一重链的在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]及第二重链的在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]。在一些实施方案中，第一重链包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]且第二重链包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]。在优选实施方案中，第一重链包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]且第二重链包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]。举例而言，根据EU编号的Fc域的位置366对应于SEQ ID NO:81的人类IgG1 Fc序列中的氨基酸位置146，其自SEQ ID NO:81中的位置146处的T改变为SEQ ID NO:82中的位置146处的W；且根据EU编号的位置366、368及407分别对应于SEQ ID NO:81中的氨基酸位置146、148及187，其自SEQ ID NO:81中的这些位置处的T、L及Y改变为SEQ ID NO:83中的这些位置处的S、A及V。在这些实施方案中的任一者中，针对第一重链所描述的氨基酸变化可位于第二重链中且第二重链的各别氨基酸变化可位于第一重链中。换言之，术语“第一”及“第二”在这些实施方案中可互换。在一些实施方案中，重链来源于IgG1或IgG4的重链。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质中的第一重链或第二重链进一步包含一或多个减少重链与蛋白质A结合的氨基酸变化。在一些实施方案中，此类氨基酸变化为重链中之一者的在位置435处的精氨酸[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。
在一些实施方案中，在本发明的蛋白质中，包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]的重链进一步包含在位置435处的精氨酸[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。在此情况下，另一条重链包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，但不包括在位置435及436处的两个变化。可替代地，在一些实施方案中，在本发明的蛋白质中，包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]的重链进一步包含在位置435处的精氨酸[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。在此情况下，另一条重链包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，但不包括在位置435及436处的两个变化。因此，包含产生如上文所述的“空腔”的氨基酸变化的重链亦包含减少与蛋白质A结合的氨基酸变化。包含这些重链的均二聚体经由与蛋白质A的减少结合移除。包含“突起”的另一重链的均二聚体的产生因“突起”的存在而减少。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质的重链可能或可能不进一步包含YTE突变(M252Y/S254T/T256E，EU编号(Dall'Acqua，Kiener等人，2006))。已展示这些突变经由优选地提高在pH 6.0下对新生FcRn底物的结合亲和力来改善重链的药物动力学特性。
在一些实施方案中，来源于IgG1的本发明的第一及/或第二重链亦包括“KO”突变(L234A、L235A)。在另一方面中，来源于IgG4的本发明的第一及/或第二重链亦包括Pro铰链突变(S228P)。
在另一方面中，本发明的蛋白质包含对人类及食蟹猕猴DLL3的亲和力优选≤10nM、更优选≤1nM、甚至更优选≤0.1nM、甚至更优选≤0.01nM的对DLL3具有特异性的第一抗原结合单元或多肽链。如例如在实施例或熟练人员所熟知的其他方法中所描述，可使用重组DLL3-蛋白质在SPR(BIAcore)分析中测量亲和力。蛋白质包含对人类及食蟹猕猴CD3εγ复合物的亲和力优选≤500nM、更优选地≤100nM、甚至更优选≤10nM的第二抗原结合单元或多肽链。
在另一方面中，本发明的DLL3/CD3结合蛋白不与DLL3阴性细胞结合且不与人类及DLL3旁为同源物DLL1及DLL4交叉反应，如实施例5中所示。
在另一方面中，本发明的DLL3/CD3结合蛋白包含与DLL3蛋白质的近膜肽特异性结合的第一抗原结合单元或第一多肽链。在另一方面中，本发明的蛋白质显示与DLL3蛋白质表达细胞的微弱结合，例如直至100nM的浓度亦未实现蛋白质与细胞表面的结合的饱和(参见例如图6)。
在另一方面中，本发明的DLL3/CD3结合蛋白能够通过以下介导对肿瘤细胞的细胞毒性：为在表达DLL3的肿瘤细胞与T细胞之间形成溶细胞突触提供最佳空间条件，以便选择性地重导向对靶向肿瘤细胞的T细胞活性，从而导致肿瘤细胞溶解。
可使用各种方法测量由本发明的DLL3/CD3结合蛋白介导的细胞毒性。举例而言，可使用实施例10中所描述的方法测量细胞毒性。效应细胞可为例如受刺激或未受刺激的(人类或食蟹猕猴)T细胞或其子组(例如CD4、CD8)或未受刺激的(人类或食蟹猕猴)周边血液单核细胞(PBMC)。靶细胞应至少表达(人类或食蟹猕猴)DLL3的胞外域且可为具有内源性(天然)DLL3表达的细胞，诸如人类小细胞肺癌瘤细胞株SHP77、NCI-H82，亦可替代地表达全长DLL3或DLL3的胞外域的重组细胞。效应子:目标细胞比率(E:T)通常为约10:1，但可变化。可例如在培育48或72小时之后在LDH-释放分析中测定DLL3/CD3结合分子的细胞毒活性。用于测定细胞毒性的培育时间及读出的修改为可能的且为熟练人员已知。细胞毒性的读出系统可包含MTT/MTS分析、基于ATP的分析、基于FACS的分析、51-铬释放分析、磺酰罗丹明B(SRB)分析、比色(WST)分析、细胞群落分析、ECIS技术及生物发光分析。
本发明的DLL3/CD3结合蛋白介导的细胞毒活性优选在基于细胞的细胞毒性分析中测量。细胞毒性由在细胞毒性分析中测量的EC90值表示。熟练人员意识到，当使用经纯化的T细胞作为效应细胞时，预期与PBMC相比EC90可能更低，熟练人员亦意识到，当使用受刺激的T细胞时EC90可能甚至更低。可进一步预期，相比于在细胞表面上表达较低数量DLL3分子的细胞，当靶细胞在细胞表面上表达大量DLL3时，EC90值更低。DLL3/CD3结合蛋白的EC90优选≤10nM，更优选≤5nM且甚至更优选≤1nM。
优选地，本发明的多特异性结合蛋白不诱导/介导DLL3阴性细胞的溶解。术语“不诱导/介导”DLL3阴性细胞的“溶解”意谓DLL3/CD3结合分子不诱导或介导超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％且尤其不超过5％的DLL3阴性细胞，而DLL3阳性肺癌瘤细胞株的溶解设定为100％。此通常适用于高达1000nM的结合蛋白浓度。
优选地，本发明的DLL3/CD3结合蛋白不被靶向细胞内化。可例如如实施例11中所描述分析内化率。优选地，在使DLL3/CD3结合蛋白与靶细胞一起预培育4小时之后，内化率(例如测量为细胞毒性降低)≤50％，更优选地≤40％且甚至更优选≤30％。
此外，本发明的DLL3/CD3结合蛋白示出为稳定的，其中单体含量高于95％(例如至少98％，参见实施例14)，具有有利的药物动力学特性及良好的下游可制造性且进一步预期具有良好的生物分布(参见例如实施例12)。本发明的蛋白质此外具有有利的免疫原性特征(参见实施例16)且具有良好的活体外及活体内稳定性(参见例如实施例12及15)。此外，本发明的DLL3/CD3结合蛋白(例如DLL3#3/CD3#1，DLL3#3/CD3#2)在人类化活体内异种移植小鼠模型中展示有利的功效。DLL3/CD3结合蛋白诱导强烈的肿瘤消退，该肿瘤消退在DLL3/CD3结合蛋白的第一剂量之后已经开始。此外，本发明的DLL3/CD3结合蛋白以每周一次(q7d)给予0.25mg/kg的极低剂量诱导肿瘤消退，进一步支持其治疗适用性。详言之，本发明的DLL3/CD3结合蛋白仅在DLL3阳性靶细胞存在下及DLL3阴性靶细胞不存在下诱导选择性T细胞增殖、T细胞活化、T细胞脱粒及细胞因子分泌(参见实施例18)，且进一步显著增加进入肿瘤组织的T细胞浸润(参见实施例20)。此外，实施例19表明DLL3/CD3结合蛋白介导CD4+以及CD8+T细胞重导引的溶解。详言之，原始T细胞以及CD4+效应记忆细胞、CD4+中央记忆细胞、CD8+CD45RA+效应细胞及CD8+记忆细胞有助于表达DLL3的肿瘤细胞的T细胞重导引的溶解。
本发明的另一方面提供分离的核酸分子，其编码本发明的多特异性结合蛋白的第一及/或第二抗原结合单元。在一些实施方案中，核酸分子进一步分别编码如本文所述的第一及/或第二Fc域，连接于编码第一及/或第二抗原结合单元的核酸分子的3'端的第一及/或第二Fc域。在一些实施方案中，核酸分子编码i)第一多肽链，其包含对DLL3(例如DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17及DLL3#18中的任一者)具有特异性的第一单链Fab，及任选存在的第一Fc域及/或ii)第二多肽链，其包含对CD3(例如CD3#1、CD3#2及CD3#3中的任一者)具有特异性的第二单链Fab及任选存在的第二Fc域。
优选地，核酸分子包含编码以下各者中的任一者的第一单链Fab：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240及/或SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:104的第二单链Fab的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码以下各者中的任一者的第一多肽链：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252及/或对CD3具有特异性的第二多肽链(其包含氨基酸序列SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:105)的核苷酸序列。
本发明的另一方面提供含有DNA分子的表达载体，该DNA分子包含编码第一及/或第二抗原结合域(例如本发明的第一及/或第二单链Fab)的核苷酸序列。优选地，表达载体另外包含编码连接于核酸分子的第一及/或第二Fc域的核酸分子，优选DNA分子，优选地编码第一及/或第二抗原结合域(例如分别地，第一及/或第二单链Fab)的DNA分子。因此，表达载体包含：编码包含连接于第一Fc域的第一单链Fab的多肽链的核苷酸序列；及/或编码包含连接于第二Fc域的第二单链Fab的多肽链的核苷酸序列。
在一优选实施方案中，表达载体含有DNA分子，该DNA分子包含编码本发明的第一及/或第二多肽链的核苷酸序列。在一优选实施方案中，表达载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码以下中的任一者的第一多肽链：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252及/或包含SEQ ID NO:79的第二多肽链。
在另外优选实施方案中，表达载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码以下中的任一者的第一多肽链：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ IDNO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252及/或包含SEQ ID NO:80的第二多肽链。
在另外优选实施方案中，表达载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码以下中的任一者的第一多肽链：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ IDNO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252及/或包含SEQ ID NO:105的第二多肽链。
在特定优选实施方案中，可使用两种表达载体，其中一种用于表达对DLL3具有特异性的第一多肽链，另一种用于表达对CD3具有特异性的第二多肽链，所述两种表达载体接着均可转染于宿主细胞中以供重组蛋白表达。
优选地，表达载体将为包含可操作地连接于至少一个调节序列的该核酸分子或所述核酸分子的载体，其中此类调节序列可为启动子、强化子或终止子序列，及最佳地异源启动子、强化子或终止子序列。
在另一方面中，本发明涉及一种宿主细胞，其具有编码本发明的对DLL3具有特异性的第一多肽链的表达载体及编码本发明的对CD3具有特异性的第二多肽链的表达载体。
根据尤其优选实施方案，所述宿主细胞为真核生物细胞，诸如哺乳动物细胞。在另一实施方案中，此类宿主细胞为细菌细胞。其他有用细胞系酵母细胞或其他真菌细胞。
适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞及类似细胞。然而，亦可使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞及用于本领域以表达异源蛋白质的任何其他细胞。
抗-DLL3抗体
DLL3一般表达在胞内膜上，包括胎脑中高基氏体的那些，且在近轴中胚层中的体节发生中起关键作用(Geffers等人，J Cell Biol.2007；178:465；Chapman等人，Hum.Mol.Genet.2011；20:905-916)。对一些肿瘤类型(包括SCLC、LCNEC及神经胶母细胞瘤)中DLL3表达的明显诱导导致定位至细胞表面：此连同非恶性细胞中可检测细胞表面DLL3的缺少为肿瘤细胞特异性疗法及抗-DLL3抗体作为诊断及预后工具的用途提供新的机会。
若干抗-DLL3抗体(诸如LS-c167440，Lifespan；AP21739PU-N，Acris；LS-C148700，LSBio)为可商购的。然而，这些抗体在免疫组织化学(IHC)、FACS及ELISA分析中表达不佳且未能特异性结合于在细胞，尤其肿瘤细胞上表达的DLL3蛋白质。抗-DLL3抗体亦例如在WO2007111733中有所报导且建议用于神经胶质瘤患者中的诊断用途，但未展示IHC分析的资料。因此，抗-DLL3抗体作为可靠诊断工具以准确测量患者(例如肿瘤细胞/组织)中的DLL3表达及/或评估DLL3靶向疗法的功效的用途仍具挑战性。
因此，需要鉴别替代的抗-DLL3抗体，其可用于准确及专门检测在各种分析(诸如FACS、ELISA、免疫沉淀、西方墨点法、ELISA、放射免疫分析、流式细胞计数、IHC及免疫测定分析)中任何种类的生物样本中的DLL3蛋白质表达且可用作可靠的诊断试剂。
因此，本发明的另一方面提供抗-DLL3抗体分子，其包含
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ IDNO:6(CDR3)的重链CDR；或
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ IDNO:12(CDR3)的重链CDR；或
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ IDNO:18(CDR3)的重链CDR；或
iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ IDNO:24(CDR3)的重链CDR；或
v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ IDNO:30(CDR3)的重链CDR；或
vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ IDNO:36(CDR3)的重链CDR；或
vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的重链CDR；或
viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ IDNO:141(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的重链CDR；或
ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:145(CDR1)、SEQ ID NO:146(CDR2)及SEQ ID NO:147(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:148(CDR1)、SEQ ID NO:149(CDR2)及SEQ ID NO:150(CDR3)的重链CDR；或
x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:151(CDR1)、SEQ ID NO:152(CDR2)及SEQ ID NO:153(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:154(CDR1)、SEQ ID NO:155(CDR2)及SEQ ID NO:156(CDR3)的重链CDR；或
xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:157(CDR1)、SEQ ID NO:158(CDR2)及SEQ ID NO:159(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:160(CDR1)、SEQ ID NO:161(CDR2)及SEQ ID NO:162(CDR3)的重链CDR；或
xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:163(CDR1)、SEQ ID NO:164(CDR2)及SEQ ID NO:165(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:166(CDR1)、SEQ ID NO:167(CDR2)及SEQ ID NO:168(CDR3)的重链CDR；或
xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:169(CDR1)、SEQ ID NO:170(CDR2)及SEQ IDNO:171(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:172(CDR1)、SEQ ID NO:173(CDR2)及SEQ ID NO:174(CDR3)的重链CDR；或
xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:175(CDR1)、SEQ ID NO:176(CDR2)及SEQ ID NO:177(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:178(CDR1)、SEQ ID NO:179(CDR2)及SEQ ID NO:180(CDR3)的重链CDR；或
xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:181(CDR1)、SEQ ID NO:182(CDR2)及SEQ ID NO:183(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:184(CDR1)、SEQ ID NO:185(CDR2)及SEQ ID NO:186(CDR3)的重链CDR；或
xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:187(CDR1)、SEQ ID NO:188(CDR2)及SEQ ID NO:189(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:190(CDR1)、SEQ ID NO:191(CDR2)及SEQ ID NO:192(CDR3)的重链CDR；或
xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:193(CDR1)、SEQ ID NO:194(CDR2)及SEQ IDNO:195(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:196(CDR1)、SEQ ID NO:197(CDR2)及SEQ ID NO:198(CDR3)的重链CDR；或
xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:199(CDR1)、SEQ ID NO:200(CDR2)及SEQ IDNO:201(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:202(CDR1)、SEQ ID NO:203(CDR2)及SEQ ID NO:204(CDR3)的重链CDR。
如上文所概述的抗体i)至xviii)分别称为DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18。本文提供序列表，其允许容易地鉴别本发明的特异性抗体的单独氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，抗体分子包含对应于DLL3#1或DLL3#5的如上文i)或v)所定义的CDR序列。
在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体为嵌合、人类化或人类抗体分子。在一些实施方案中，抗体分子为单克隆抗体Fab、F(ab)2、Fv或scFv。在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体分子包含选自由以下组成的群的重链恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体分子的轻链恒定区为κ或λ。
在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体具有重链可变域，该重链可变域包含与SEQ ID NO:38、40、42、44、46、48、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226及228中的任一者至少85％一致的氨基酸序列。优选地，抗体分子具有重链可变域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38、40、42、44、46、48、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226或228。
在一些实施方案中，抗-DLL3抗体分子具有轻链可变域，该轻链可变域包含与SEQID NO:37、39、41、43、45、47、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225及227中的任一者至少85％一致的氨基酸序列。优选地，抗体分子具有轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO:37、39、41、43、45、47、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225或227。
计算氨基酸序列一致性的方法为本领域中所熟知且进一步在本文中说明书的定义部分中论述。
在一些实施方案中，抗-DLL3抗体分子具有i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域(DLL3#1)；或ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域(DLL3#2)；或iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域(DLL3#3)，或iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的重链可变域及包含氨基酸序列SEQID NO:43的轻链可变域(DLL3#4)；或v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的轻链可变域(DLL3#5)；或vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的重链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的轻链可变域(DLL3#6)；或vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:205的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:206的重链可变域(DLL3#7)；或viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:207的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:208的重链可变域(DLL3#8)；或ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:209的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:210的重链可变域(DLL3#9)；或x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:211的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:212的重链可变域(DLL3#10)；或xi)包含氨基酸序列SEQID NO:213的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:214的重链可变域(DLL3#11)；或xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:215的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:216的重链可变域(DLL3#12)；或xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:218的重链可变域(DLL3#13)；或xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:219的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的重链可变域(DLL3#14)；或xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的重链可变域(DLL3#15)；或xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:223的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:224的重链可变域(DLL3#16)；或xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链可变域(DLL3#17)；或xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的重链可变域(DLL3#18)。
在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体为小鼠单克隆抗体。在本发明的上下文中，小鼠单克隆抗体包括以下抗体：其中VH及VL自以下获得：用人类DLL3蛋白质免疫接种小鼠，之后选择以一定亲和力与人类DLL3结合的适合VH及VL序列，且接着进一步通过重组技术将此类VH及VL序列连接至来源于小鼠的恒定域(例如小鼠IgG2a)；且其通过宿主细胞中的重组表达制得。本发明进一步涵盖嵌合抗体，例如包含来自不同物种的可变区及恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体分子为嵌合抗体，其包含如上文所述的来源于小鼠的VH及VL域且进一步包含来源于另一种物种(诸如人类、兔、大鼠、山羊、驴)的恒定域。在一些实施方案中，嵌合抗体包含来源于小鼠的VH及VL域且进一步如上文所定义人类化或序列优化且进一步包含来源于另一物种的恒定域。在一些实施方案中，嵌合抗体包含来源于包含人类IgG序列的转殖基因动物(例如小鼠)的VH及VL域，因此包含人类VH及VL序列，且进一步包含来源于另一物种的恒定域。在如上文所概述的嵌合抗体的实施方案中的任一者中，重链恒定区为小鼠、人类、兔、大鼠、山羊或驴重链区。
在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体分子具有选自由以下组成的群的恒定域：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恒定域。在一优选实施方案中，抗-DLL3抗体具有IgG2a的恒定域，其优选包含序列SEQ ID NO:254。在一些实施方案中，抗-DLL3抗体分子具有为κ或λ的轻链恒定域，优选地该轻链恒定域为κ轻链恒定域，其优选地包含序列SEQ IDNO:255。
在一些实施方案中，抗-DLL3抗体分子能够结合于人类及食蟹猕猴DLL3，解离常数(KD)优选≤10nM、更优选≤1nM、甚至更优选≤0.1nM、甚至更优选<0.01nM。亲和力(KD值)可在SPR(BIAcore)分析中使用重组DLL3蛋白质测量，如例如实施例或熟练人员所熟知的其他方法所描述。
在一些实施方案中，抗-DLL3抗体分子不与小鼠DLL3结合。
在一些实施方案中，抗-DLL3抗体分子能够检测组织样本(例如石蜡包埋/福尔马林固定组织样本)，诸如肿瘤组织样本或培养细胞株上的DLL3表达(例如细胞质及表面蛋白质表达)。任选地，石蜡包埋/福尔马林固定的细胞培养或组织样本进一步用表位取回器(诸如蛋白酶K)处理。
在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体分子结合于与以下中的任一者相同的表位：DLL3#1、DLL2#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18抗体。在一些实施方案中，本发明的抗-DLL3抗体分子与以下中的任一者交叉竞争结合于人类DLL3：DLL3#1、DLL2#2、DLL3#3、DLL3#4、DLL3#5、DLL3#6、DLL3#7、DLL3#8、DLL3#9、DLL3#10、DLL3#11、DLL3#12、DLL3#13、DLL3#14、DLL3#15、DLL3#16、DLL3#17或DLL3#18抗体分子。
本发明的另一方面提供分离的核酸分子，其编码本发明的抗-DLL3抗体分子的重链可变域及/或轻链可变域。
优选地，核酸分子包含编码以下中的任一者的重链可变域的核苷酸序列：SEQ IDNO:38、40、42、44、46、48、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226或228。优选地，核酸分子包含编码以下中的任一者的轻链可变域的核苷酸序列：SEQ ID NO:37、39、41、43、45、47、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225或227。
本发明的另一方面提供一种含有DNA分子的表达载体，该DNA分子包含编码本发明的抗-DLL3抗体分子的重链可变域及/或轻链可变域的核苷酸序列。
优选地，表达载体另外包含分别编码连接于核酸分子的重链恒定域及/或轻链恒定域的核酸分子，优选地DNA分子，优选地分别编码重链可变域及/或轻链可变域的DNA分子。
在具体优选实施方案中，可使用两种表达载体，其中一种用于表达重链，另一种用于表达轻链，所述两种表达载体接着均可转染于宿主细胞中以供重组蛋白表达。
优选地，表达载体将为包含可操作地连接于至少一个调节序列的该核酸分子或所述核酸分子的载体，其中此类调节序列可为启动子、强化子或终止子序列，及最佳地异源启动子、强化子或终止子序列。
在另一方面中，本发明涉及宿主细胞，其具有编码本发明的抗-DLL3抗体分子的重链的表达载体及编码本发明的抗-DLL3抗体分子的轻链的表达载体。
根据尤其优选实施方案，所述宿主细胞系真核生物细胞，诸如哺乳动物细胞。在另一实施方案中，此类宿主细胞系细菌细胞。其他有用细胞系酵母细胞或其他真菌细胞。
适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞及类似细胞。然而，亦可使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞及用于本领域以表达异源蛋白质的任何其他细胞。
制造及纯化方法
本发明进一步提供制造本发明的多特异性结合蛋白的方法，所述方法一般包含以下步骤：
-在允许形成本发明的结合蛋白条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含编码本发明的结合蛋白的核酸；及，
-自培养物回收由宿主细胞表达的结合蛋白；及
-任选进一步纯化及/或修饰及/或调配本发明的结合蛋白。
本发明进一步提供制造本发明的抗-DLL3抗体的方法，所述方法通常包含以下步骤：
-在允许形成抗体分子的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含编码本发明的抗体分子的核酸；及，
-自培养物回收由宿主细胞表达的抗体分子；及
-任选进一步纯化及/或修饰及/或调配本发明的抗体分子。
本发明的核酸可例如为包含编码序列以及调节序列及任选选用的天然或人工内含子的DNA分子或可为cDNA分子。其可具有其初始密码子或可具有优化密码子使用，其特别适用于表达于所需宿主细胞或宿主生物体中。根据本发明之一个实施方案，如上文所定义，本发明的核酸呈基本上分离的形式。
可基于本文中给出的关于本发明的蛋白质的氨基酸序列的信息，以本身已知的方式(例如通过自动化DNA合成及/或重组DNA技术)制备或获得本发明的核酸。
本发明的核酸通常将并入表达载体中，亦即可在转染于适合宿主细胞或其他表达系统中时提供蛋白质表达的载体。
为制造本发明的结合蛋白或抗体，熟练技术人员可从本领域中熟知的大量表达系统中进行选择，例如Kipriyanow及Le Gall，2004综述的那些。
表达载体包括质体、反转录病毒、黏质体、EBV源性游离基因体及类似物。选择表达载体及表达控制序列以与宿主细胞兼容。DLL3/CD3结合蛋白的编码第一抗原结合单元(例如本发明的结合蛋白的DLL3特异性单链Fab或全长DLL3链)的核苷酸序列及编码第二抗原结合单元(例如本发明的结合蛋白的CD3特异性单链Fab或全长CD3链)的核苷酸序列可插入至单独载体中。在某些实施方案中，两个DNA序列插入至相同表达载体中。编码DLL3抗体的轻链的核苷酸序列及编码DLL3抗体的重链的核苷酸序列可插入至单独载体中。在某些实施方案中，两个DNA序列插入至相同表达载体中。
适宜载体为编码功能完全人类CH(恒定重)免疫球蛋白序列的那些，合适的限制位点经工程改造以使得可轻易插入及表达如上文所述的任何抗原结合单元，诸如单链Fab序列或任何重/轻链可变域。对于抗体重链，其可为但不限于任何IgG同型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其他免疫球蛋白，包括对偶基因变异体。
重组表达载体亦可编码信号肽，该信号肽促进由宿主细胞分泌全长CD3或DLL3链或分泌抗-DLL3抗体的轻/重链。编码蛋白质链的DNA可克隆于载体中，使得信号肽框内连接至成熟的全长链DNA的氨基端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或来自非免疫球蛋白蛋白质的异源信号肽。可替代地，编码本发明的蛋白质的全长链的DNA序列可能已经含有信号肽序列。
除了编码DNA序列的DLL3/CD3链或编码DNA序列的DLL3抗体的重/轻链之外，重组表达载体通常携带调节序列，任选异源调节序列，所述调节序列包括启动子、强化子、终止及聚腺苷酸化信号及控制宿主细胞中蛋白链表达的其他表达控制组件。启动子序列的实施例(针对在哺乳动物细胞中表达所例示)为来源于CMV(诸如CMV猴病毒40(SV40)启动子/强化子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒的启动子及/或强化子，及强哺乳动物启动子，诸如天然免疫球蛋白及肌动蛋白启动子。聚腺苷酸化信号的实施例为BGH polyA、SV40晚期或早期polyA；可替代地，可使用免疫球蛋白基因的3′UTR等。
重组表达载体亦可携带调节宿主细胞中载体复制的序列(例如复制来源)及可选标记基因。可根据本领域中熟知的转染方法(包括脂质体介导的转染、聚阳离子介导的转染、原生质体融合、显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔或通过病毒载体的转移)将以下各者引入宿主细胞，例如细菌细胞或高级真核生物细胞，例如哺乳动物细胞中：编码具有第一抗原结合单元(单链Fab及Fc域)或其抗原结合部分的全长链及/或具有第二抗原结合单元(单链Fab及Fc域)或其抗原结合部分的全长链的核酸分子，及包含这些DNA分子的载体。
优选地，编码本发明的蛋白质的DLL3及CD3链的DNA分子存在于两种表达载体上，所述表达载体经共转染于宿主细胞，优选哺乳动物细胞中。
可用作宿主以表达的哺乳动物细胞株为本领域中所熟知且尤其包括中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、NS0、SP2/0细胞、HeLa细胞、婴儿仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类癌瘤细胞(例如Hep G2及A-549细胞)、3T3细胞或任何此类细胞株的衍生物/后代。可使用其他哺乳动物细胞，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴及啮齿动物细胞株；或其他真核生物细胞，包括但不限于酵母菌、昆虫及植物细胞；或原核细胞，诸如细菌。
本发明的蛋白质为通过将宿主细胞培养一段足以允许在宿主细胞中表达蛋白质的时间来制备。蛋白分子优选自培养基以分泌的多肽形式回收或若例如在无分泌信号下表达，则其可自宿主细胞溶解产物回收。有必要使用用于重组蛋白及宿主细胞蛋白的标准蛋白质纯化方法，以获得蛋白质的基本上均质的制剂方式纯化蛋白分子。借助于实施例，适用于获得本发明的蛋白分子的最先进纯化方法包括自培养基或溶解产物移除细胞及/或颗粒细胞碎片作为第一步骤。随后例如通过在免疫亲和力或离子交换管柱上分馏、乙醇沉淀、逆相HPLC、葡聚糖凝胶色谱、硅胶色谱或在阳离子交换树脂上自污染物可溶性蛋白质、多肽及核酸纯化蛋白质。作为用于获得蛋白质分子制剂的过程中的最终步骤，可干燥，例如冻干经纯化的蛋白质分子，如下文治疗应用所述。
本发明涉及结合蛋白，其具有对至少两种不同目标的结合特异性。相对于本发明，结合分子来源于抗体。用于制造结合分子的技术包括(但不限于)重组型共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白链(参见Milstein及Cuello，Nature 305:537(1983))，WO 93/08829，及Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991))，及“杵-臼结构(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利案第5,731,168号；Atwell等人，JMB，1997，270，26-35)。本发明的结合蛋白亦可如下制备：用于制备抗体Fc-杂二聚分子的工程改造静电导向效应(WO2009/089004A1)；使两种或更多种抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号及Brennan等人，Science，229:81(1985))；使用白氨酸拉链产生双特异性蛋白质(参见例如Kostelny等人，Immunol.，148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双功能抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.，152:5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所描述制备三特异性抗体。
本文公开的组合物(例如多特异性结合蛋白及抗-DLL3抗体)及方法涵盖具有指定序列，或与指定序列基本上相同或类似的序列，例如与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列的多肽及核酸。在氨基酸序列的情形下，术语“实质上一致”在本文中用于指第一氨基酸序列含有足够或最小数目的i)与第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基一致或ii)为第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基的保守取代的氨基酸残基，使得第一及第二氨基酸序列可具有共同结构域及/或共同功能活性。举例而言，含有常见结构域的氨基酸序列具有与参考序列，例如本文所提供的序列至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％之一致性。在核苷酸序列的上下文中，术语“基本上相同”在本文中用于指代第一核酸序列含有足够或最小数目的与第二核酸序列中的所比对核苷酸一致的核苷酸，使得第一及第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同结构多肽结构域或共同功能多肽活性，例如具有与参考序列至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的核苷酸序列。
本发明的核酸分子包括但不限于编码示于序列表中的多肽序列的DNA分子。另外，本发明亦涉及核酸分子，该核酸分子在高严格度结合及洗涤条件下与编码示于序列表中的多肽序列的DNA分子杂交，如WO 2007/042309中所定义。优选的分子(自mRNA视角)为具有与本文所描述的DNA分子中之一者至少75％或80％(优选至少85％，更优选地至少90％且最佳地至少95％)的同源性或序列一致性的那些分子。借助于实施例，鉴于表达真核生物细胞中的抗体，示于序列表中的DNA序列已设计成匹配真核生物细胞中的密码子使用。若需要在大肠杆菌中表达抗体，可改变这些序列以匹配大肠杆菌密码子使用。可以若干种不同方式构建本发明的DNA分子的变体，如例如WO2007/042309中所描述。
本发明的蛋白质可具有经修饰的N端序列，例如删除一或多个N端氨基酸，或交换例如第一N端氨基酸(例如麸氨酸与丙氨酸交换)，以优化分子以通过使用某些表达系统(诸如特定载体或宿主细胞)表达，或以包涵体或可溶形式表达，或分泌于培养基或周质空间中或含在细胞内，或用于获得更加均质的产物。本发明的多肽可具有经修饰的C端序列，诸如额外的丙氨酸，及/或C端部分中或框架区中的任一者内其他定义位置处的其他氨基酸交换，如例如WO2012/175741、WO2011/075861或WO2013/024059中所解释，以便例如进一步增强此类多肽的稳定性或降低此类多肽的免疫原性。
为避免疑问，考虑涉及如本文所述的药物组合物、试剂盒、治疗方法、医疗用途、组合、给药方法及剂量的所有实施方案用于本文所描述的多特异性结合蛋白单独或与其他治疗剂(如在下文更详细地指定)组合中的任一者。
药物组合物；给药方法；剂量
本发明进一步涉及用于治疗疾病(如下文更详细地指定)的药物组合物，其中此类组合物包含本发明的至少一种多特异性结合蛋白。本发明进一步涵盖使用本发明的至少一种多特异性蛋白质或如下文阐述的药物组合物治疗疾病(如下文更详细地指定)的方法，且进一步涵盖制备用于使用本发明的此类结合蛋白或药物组合物治疗此类疾病的药剂。
视待使用的具体药物调配物或组合物而定，可以任何适合方式向有需要的患者给予本发明的结合蛋白(例如DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3及DLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3中的任一者，优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)及/或包含其的组合物。因此，本发明的结合蛋白及/或包含其的组合物可例如以以下方式以有效量或剂量给予：静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、经皮、经口、舌下(例如呈置放于舌头下且经由黏膜吸收至舌头下的毛细血管网中的舌下锭剂、喷雾剂或滴剂形式)、经鼻(内)(例如呈鼻用喷雾剂形式及/或以气溶胶形式)、局部、借助于栓剂、通过吸入或任何其他适合方式。结合蛋白可通过输注、食团或注射给予。在优选实施方案中，给药为通过静脉内输注或皮下注射。
根据适合于治疗及/或缓解待治疗或缓解的疾病、病症或病状的治疗疗程来给予本发明的结合蛋白及/或包含其的组合物。临床医师一般将能够视因素而定确定适合的治疗方案，所述因素诸如待治疗或缓解的疾病、病症或病状、疾病的严重程度、其症状的严重程度、待使用的本发明的特异性结合蛋白、具体给药途径及待使用的药物调配物或组合物、患者的年龄、性别、重量、饮食、一般条件，及临床医师熟知的类似因素。一般而言，治疗方案将包含以治疗有效量或剂量给予本发明的一或多种结合蛋白，或包含其的一或多种组合物。
一般而言，为治疗及/或缓解本文中提及的疾病、病症及病状且视待治疗的具体疾病、病症或病状、待使用的本发明的特异性结合蛋白的效能、具体给药途径及所使用的具体药物调配物或组合物而定，本发明的结合蛋白一般将呈在每千克体重0.005与20.0mg之间的量及剂量，优选在0.05与10.0毫克/千克/剂之间，连续(例如通过输注)或更优选以单次剂量(诸如一周两次、每周一次或每月一次剂量；参见以下)给予，但可显著变化，尤其视上文所提及的参数而定。因此，在一些情况下，使用小于上文给出的最小剂量可为足够的，而在其他情况下可超过上限。当给予较大量时，在一天内将其分成多个较小剂量可为可取的。
视本发明的特异性结合蛋白及其特定药物动力学及其他特性而定，其可经每日、每两天、每三天、每四天、每五天或每六天、每周、每月一次及以类似方式给予。给药疗程可包括每周一次的长期治疗。“长期”意谓持续时间为至少两周且优选数月或数年。
可使用任何适合的活体外分析、基于细胞的分析、活体内分析及/或本身已知的动物模型或其任何组合测试本发明的多特异性蛋白质及包含其的组合物的功效，其视所涉及的特定疾病而定。适合的分析及动物模型对本领域技术人员将为清楚的，且例如包括以下实施例中所用的分析及动物模型。
调配物
对于药物用途，本发明的结合蛋白可调配为药物制剂，其包含(i)本发明的至少一种结合蛋白(例如DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3及DLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3中的任一者，优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)及(ii)至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、佐剂及/或稳定剂，及(iii)任选选用的一或多种其他药理学活性多肽及/或化合物。“药学上可接受”意谓当向个体给予时，相应物质不会显示任何生物或者不合需要的作用且不会以有害方式与药物组合物中所含有的其他组分(诸如药学上活性成分)中的任一者相互作用。特定实施例可见于标准手册，诸如雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack Publishing Company，USA(1990)。举例而言，本发明的结合蛋白可以对于常规抗体及抗体片段及其他药物活性蛋白质本身已知的任何方式调配及给予。因此，根据另一实施方案，本发明涉及一种药物组合物或制剂，其含有本发明的至少一种结合蛋白及至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、佐剂及/或稳定剂，及任选选用的一或多种其他药理学上活性物质，其呈冻干或以其他方式干燥的调配物或水溶液或非水溶液或悬浮液形式。
用于非经肠给药，诸如静脉内、肌肉内、皮下注射或静脉内输注的药物制剂可例如为包含活性成分且为任选在另一溶解或稀释步骤之后，适用于输注或注射的无菌溶液、悬浮液、分散液、乳液或粉末。针对所述制剂的适合的载剂或稀释剂例如包括(但不限于)无菌水及药学上可接受的缓冲水溶液及诸如磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、右旋糖溶液及汉克氏溶液(Hank's solution)的溶液；水油；甘油；乙醇；诸如丙二醇的二醇以及矿物油、动物油及植物油，例如花生油、大豆油以及其适合的混合物。
本发明的结合蛋白的溶液亦可含有防腐剂，诸如抗细菌剂及抗真菌剂以防止微生物生长，例如对羟基苯甲酸酯(p-hydroxybenzoate/paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞、乙二胺四乙酸(的碱金属盐)及其类似物。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。任选地，可使用乳化剂及/或分散剂。适当流动性可例如通过形成脂质体、在分散液的情况下通过维持所需粒度或通过使用表面活性剂来维持。亦可添加延迟吸收的其他试剂，例如单硬脂酸铝及明胶。可将溶液填充至注射小瓶、安瓿、输注瓶及其类似瓶中。
在所有情况下，最终剂型在制造及储存条件下均必须为无菌、流体且稳定。无菌可注射溶液为通过将所需量的活性化合物视需要与上文列举的各种其他成分一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，其产生预先无菌过滤的溶液中所存在的活性成分加任何额外所需成分的粉末。
通常，水溶液或悬浮液将为优选的。一般而言，用于治疗蛋白(诸如本发明的结合蛋白)的适合调配物为缓冲蛋白质溶液，诸如包括以下的溶液：呈适合浓度(诸如0.001至400mg/mL，优选0.005至200mg/mL，更优选地0.01至200mg/mL，更优选地1.0-100mg/mL，诸如1.0mg/ml(静脉内给药)或100mg/ml(皮下给药))的蛋白质及水性缓冲液诸如：
-磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，
-其他磷酸盐缓冲液，pH 6.2至pH 8.2，
-乙酸盐缓冲液，pH 3.2至pH 7.5，优选pH 4.8至pH 5.5
-组氨酸缓冲液，pH 5.5至pH 7.0，
-丁二酸盐缓冲液，pH 3.2至pH 6.6，及
-柠檬酸盐缓冲液，pH 2.1至pH 6.2，
及任选选用的提供溶液的等张性的盐(例如NaCl)及/或糖(诸如蔗糖及海藻糖)及/或其他多元醇(诸如甘露醇及甘油)。
此外，其他试剂，诸如清洁剂，例如0.02％Tween-20或Tween-80可包括于所述溶液中。皮下施用的调配物可包括显著较高浓度，诸如高达100mg/ml或甚至大于100mg/ml的本发明的抗体。然而，本领域技术人员将清楚，如上所给出的成分及其量仅表示一种优选选择。其替代方案及变体对本领域技术人员将直接显而易知，或可易于自以上公开内容开始进行构想。上述调配物可任选以将在溶液(例如注射用水(WFI))中重组的冻干调配物提供。
根据本发明的另一方面，本发明的结合蛋白可与适用于给予蛋白质的装置，诸如注射器、注射笔、微型泵或其他装置组合使用。
治疗方法
本发明的另一方面提供一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者给予治疗有效量的本发明的结合蛋白。
本发明的另一方面提供用于治疗癌症的方法的本发明的结合蛋白。
本发明的另一方面为本发明的结合蛋白用于制备用于治疗癌症的药物组合物的用途。
为避免疑问，本发明的医疗用途方面可包含如上文所述的本发明的特异性结合蛋白中的任一者(例如DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3及DLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3中的任一者，优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)。
如本文中所使用，术语“癌症”意欲包括所有类型的癌肿生长或致癌过程、转移性组织或恶性转型细胞、组织或器官(无论组织病理型或侵袭阶段)。
其生长可使用本文所描述的多特异性结合蛋白抑制的例示性癌症为任何表达DLL3的肿瘤，优选地SCLC、LCNEC、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、黑素瘤或其他表达DLL3的神经内分泌肿瘤(例如神经内分泌前列腺癌或神经内分泌胰脏癌、小细胞膀胱癌)。
神经内分泌肿瘤(NET)由分散的内分泌系统引起且可在许多不同身体区域中发生。传统地，NET已根据其原始解剖单位分类且通常具有高度侵袭性。其最常位于胃肠道、胰脏或肺部(小细胞肺癌瘤及大细胞神经内分泌癌瘤)以及肾或泌尿生殖道(气囊、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)中。NET包括胃肠道及胰岛细胞的某些肿瘤，某些胸腺及肺肿瘤，以及甲状腺的滤泡旁细胞的髓性癌。
其生长可使用本文所描述的多特异性结合蛋白抑制的其他癌症为伪神经内分泌肿瘤(pNET)，其与传统定义的神经内分泌肿瘤共享某些基因型、表达型或生物化学特征。
在一些实施方案中，以下癌症、肿瘤及其他增生性疾病可用本发明的多特异性结合蛋白治疗：肺癌；优选SCLC、NSCLC或LCNEC；乳癌；子宫颈癌；结肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；头颈癌；肝癌(肝母细胞瘤或肝细胞癌)；卵巢癌；胰脏癌；前列腺癌；皮肤癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；肾上腺癌；肾脏癌；气囊癌；子宫癌；食道癌；尿道上皮癌；脑瘤；淋巴瘤；尤文氏肉瘤；及其他神经内分泌及小蓝圆细胞肿瘤。
在本发明之一优选实施方案中，癌症为小细胞肺癌(SCLC)或神经胶母细胞瘤。
通过其在体内的特定位置/源表征的上述所有癌症、肿瘤、赘瘤等意谓包括原发肿瘤及自其衍生的转移性肿瘤。
若患者具有特征在于具有高DLL3表达的癌症，则有可能该患者更可能对用本发明的结合蛋白(如本文所述)的治疗起反应。因此，在一些实施方案中，待用本发明的结合蛋白治疗的癌症为具有高DLL3表达的癌症，例如DLL3表达高于在罹患相同类型的DLL3表达癌的患者群体的癌细胞中的平均表达。
本发明的结合蛋白可用于第一线、第二线或任何其他线治疗的情形中的治疗疗程中。
本发明的结合蛋白可用于预防、短期或长期治疗以上所提到的疾病，其任选亦与放射疗法、一或多种额外治疗剂及/或手术组合。
在优选实施方案中，本发明的蛋白质与PD-1拮抗剂(诸如抗PD-1抗体或抗PDL-1抗体)组合使用以用于治疗癌症。优选地，该抗PD-1抗体选自由以下组成的群：帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5，如本文(如下表A中的序列所定义)及WO2017/198741(以引用的方式并入本文中)中所述。优选地，该抗PDL-1抗体选自由阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)及德瓦鲁单抗(durvalumab)组成的群。在尤其优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2或DLL3#3/CD3#3中的任一者)为与PD1-1组合用于治疗癌症。在尤其优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选地，DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2或DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-2组合用于治疗癌症。在尤其优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选地，DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-3组合用于治疗癌症。在尤其优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选地，DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-4组合用于治疗癌症。在尤其优选的实施方案中，本发明的结合蛋白(优选地，DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-5组合用于治疗癌症。
表A：抗PD1抗体PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4、PD1-5的重链及轻链序列的氨基酸序列及SEQ ID NO.
Figure BDA0002927579820000771
Figure BDA0002927579820000781
Figure BDA0002927579820000791
Figure BDA0002927579820000801
根据这些优选实施方案及本发明的任何其他方面，抗体PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5为如WO2017/198741所公开的抗体分子，且由如上文表A中所示的序列定义。
因此，PD1-1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:256的重链及包含氨基酸序列SEQ IDNO:257的轻链；
PD1-2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:258的重链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:259的轻链；
PD1-3具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:260的重链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:261的轻链；
PD1-4具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:262的重链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:263的轻链；且
PD1-5具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:264的重链及包含氨基酸序列SEQ ID NO:265的轻链。
上文亦包括本发明的结合蛋白在通过向有需要的患者给予治疗有效剂量来治疗上文疾病的各种方法中的用途，以及这些结合蛋白用于制造用于治疗此类疾病的药剂的用途，以及包括本发明的此类结合蛋白的药物组合物，以及包括本发明的此类结合蛋白的药剂的制剂及/或制造，及类似者。
与其他活性物质或治疗的组合
本发明的结合蛋白可自行使用或与一或多种额外治疗剂组合使用，尤其与以下各者组合使用：化学治疗剂类DNA损伤剂、抑制血管生成的治疗活性化合物、信号转导路径抑制剂、EGFR抑制剂、免疫调节物、免疫检查点抑制剂、有丝分裂检查点抑制剂或激素疗法试剂。
额外治疗剂可任选与相同药物制剂的组分同时给予，或在给予DLL3/CD3结合蛋白之前或之后给予。
可与本发明的结合分子组合给予的细胞抑制及/或细胞毒性活性物质包括但不限于激素、激素类似物及抗激素、芳香酶抑制剂、LHRH激动剂及拮抗剂、生长因子(生长因子例如血小板衍生生长因子(PDGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、人类表皮生长因子(HER，例如HER2、HER3、HER4)及肝细胞生长因子(HGF))的抑制剂，抑制剂为例如(抗)生长因子抗体、(抗)生长因子底物抗体及酪氨酸激酶抑制剂，诸如西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼达尼布(nintedanib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、伯舒替尼(bosutinib)及曲妥珠单抗(trastuzumab)；抗代谢物(例如诸如甲胺喋呤的抗叶酸剂、雷替曲塞(raltitrexed)、诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)的嘧啶类似物、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)、小红莓、TAS-102、卡培他滨(capecitabine)及吉西他滨(gemcitabine)、嘌呤及腺苷类似物，诸如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他丁(pentostatin)、阿糖胞苷(ara C)、氟达拉宾(fludarabine))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素)；铂衍生物(例如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂)；烷基化试剂(例如雌莫司汀、氮芥、美法仑(melphalan)、氯芥苯丁酸、白消安、达喀尔巴嗪(dacarbazin)、环磷酰胺、异环磷酰胺、替莫唑胺、亚硝基脲诸如卡莫司汀(carmustin)及洛莫司汀(lomustin)、噻替派)、抗有丝分裂剂(例如长春花属生物碱，诸如长春碱、长春地辛(vindesin)、长春瑞宾(vinorelbin)及长春新碱；及紫杉烷，诸如太平洋紫杉醇、多西他赛)；血管生成抑制剂，包括贝伐单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)及阿柏西普(aflibercept)、微管蛋白抑制剂；DNA合成抑制剂、PARP抑制剂、拓朴异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，诸如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊甙(teniposide)、安吖啶(amsacrin)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone))、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如PDK1抑制剂、Raf抑制剂、A-Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、C-Raf抑制剂、mTOR抑制剂、mTORC1/2抑制剂、PI3K抑制剂、PI3Kα抑制剂、双mTOR/PI3K抑制剂、STK33抑制剂、AKT抑制剂、PLK1抑制剂(诸如伏拉塞替(volasertib)、CDK的抑制剂，包括CDK9抑制剂、Aurora激酶抑制剂)、酪氨酸激酶抑制剂(例如PTK2/FAK抑制剂)、蛋白质蛋白质相互作用抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、FLT3抑制剂、BRD4抑制剂、IGF-1R抑制剂、Bcl-xL抑制剂、Bcl-2抑制剂、Bcl-2/Bcl-xL抑制剂、ErbB底物抑制剂、BCR-ABL抑制剂、ABL抑制剂、Src抑制剂、雷帕霉素类似物(例如依维莫司(everolimus)、坦罗莫司(temsirolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、西罗莫司(sirolimus))、雄激素合成抑制剂、雄激素底物抑制剂、DNMT抑制剂、HDAC抑制剂、ANG1/2抑制剂、CYP17抑制剂、放射性药品、免疫治疗剂，诸如免疫检查点抑制剂(例如CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及TIM3结合分子/免疫球蛋白，诸如伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗)及各种化学治疗剂，诸如阿米福汀(amifostin)、阿那格雷(anagrelid)、氯膦酸盐(clodronat)、非格司亭(filgrastin)、干扰素、干扰素α、甲酰四氢叶酸、利妥昔单抗、丙卡巴肼、左旋咪唑、美司钠(mesna)、米托坦(mitotane)、帕米膦酸盐及卟吩姆；蛋白酶体抑制剂(诸如硼替佐米)；Smac及BH3模拟物；恢复p53功能性的药剂，包括mdm2-p53拮抗剂；Wnt/β-连环蛋白信号传导路径的抑制剂；及/或周期素依赖性激酶9抑制剂。
尤其优选的为用本发明的结合分子与一或多种免疫治疗剂(包括抗-PD-1及抗PD-L1药剂及抗LAG3药剂)组合治疗：例示性抗PD1药剂包括但不限于抗PD-1抗体PDR-001、帕博利珠单抗、纳武单抗、皮立珠单抗及如本文(表A)及WO2017/198741所公开的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。例示性抗PDL-1药剂包括但不限于阿特珠单抗、阿维鲁单抗(avelumab)及德瓦鲁单抗(durvalumab)。在优选实施方案中，本发明的结合分子(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-1组合。在优选实施方案中，使本发明的结合分子(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-2组合。在优选实施方案中，使本发明的结合分子(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-3组合。在优选实施方案中，使本发明的结合分子(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-4组合。在优选实施方案中，使本发明的结合分子(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)与PD1-5组合。
在某些实施方案中，额外治疗剂可为其他免疫治疗剂，诸如以下各者的调节物：TIM-1、TIM-3、TIM-4、PD-L2、LAG3、CTLA-4、半乳糖凝集素9、半乳糖凝集素-1、CD69、CD113、GPR56、CD48、GARP、CAECAM-1、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、2B4、CEACAM、CD39、TGFβ、IL-10、Fas配位体、ICOS、B7家族(B7-1、B7-2、B7-H1(PDL-1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)或B7-H6)。
在一些实施方案中，额外免疫治疗剂为与同源TNF底物家族成员结合的分子的TNF家族的成员，其包括CD40及CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-lBBL，CD137、GITR、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TLlA、TRAMP/DR3、EDAR、EDAl、XEDAR、EDA2、TNFRl、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR。
在一些实施方案中，额外治疗剂为SMAC模拟剂。SMAC模拟物为与细胞凋亡蛋白质的抑制剂(IAP)结合且具有免疫调节功能且在给予动物或人类时介导全身性细胞因子(例如IL-6、TNFα等)及趋化激素(例如MCP-1)的化合物。在一些实施方案中，SMAC模拟剂为(i)LCL161，亦即WO 2008/016893的实施例1(第28/29页；[122])中的化合物A，或其药学上可接受的盐；(ii)称为Debio-1143的SMAC模拟剂，或其药学上可接受的盐；(iii)称为比林纳潘特(birinapant)的SMAC模拟剂，或其药学上可接受的盐；(iv)称为ASTX-660的SMAC模拟剂，或其药学上可接受的盐；或(v)称为CUDC-427的SMAC模拟剂，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，额外的免疫治疗剂为选自(i)抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-B、VEGF；“免疫抑制性细胞因子”)的拮抗剂及/或(ii)刺激T细胞活化的细胞因子及/或用于刺激免疫反应，例如用于治疗增生性疾病(诸如癌症)的细胞因子(诸如IL2)的激动剂。
在一些实施方案中，额外的免疫治疗剂为刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，诸如CD28、GITRL、OX40L、CD27及CD28H。
在一些实施方案中，额外治疗剂为溶瘤病毒，包括但不限于来源于痘疮病毒、腺病毒(AdV)、单纯疱疹病毒(HSV1或HSV2)、呼肠孤病毒、黏液瘤病毒(MYXV)、脊髓灰白质炎病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、马拉巴病毒、水痘病毒、麻疹病毒(MV)或新城鸡瘟病毒(NDV)的溶瘤病毒。
诊断性用途
本发明的抗-DLL3抗体分子适用于诊断及预后方法且可用于通过连接对不同抗原具有结合特异性的染料、药物或另一种分子来标记、定位或鉴别表达DLL3的细胞或组织(例如在ELISA分析、FACS分析、免疫组织学或类似分析中)。举例而言，可检测标记可与本发明的抗-DLL3抗体分子结合或特异性结合于本发明的抗体分子且与可检测标记结合的第二试剂(例如二次抗体)可用于此类诊断方法。在一些实施方案中，DLL3特异性抗体特异性结合于在细胞中(在细胞质中及/或在细胞表面处)表达的DLL3，且用于定位及/或鉴别此类细胞。在一些实施方案中，本文提供的DLL3特异性抗体用于鉴别表达DLL3的细胞或组织(例如肿瘤细胞)。
选择本发明的抗体使得其具有高水平的表位结合特异性及与DLL3多肽的高结合亲和力。一般而言，抗体的结合亲和力愈高，在免疫检定中可进行更加严格的洗涤条件以在不移除靶多肽的情况下移除非特异性结合材料。
因此，本文进一步提供检测生物样本中DLL3的方法。具体而言，在一个方面中，本发明提供检测样本(例如组织样本、肿瘤组织样本)中DLL3的方法，其包括
(a)使样本与本发明的抗体接触；及
(b)检测与DLL3结合的抗-DLL3抗体。
生物样本可获自/分离自个体的任何组织(包括生物检体)、细胞或体液。在一优选实施方案中，样本为组织样本，优选地肿瘤组织样本。在特定实施方案中，样本为固定的(肿瘤)组织样本，优选地福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样本，更优选地福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织样本。
样本通常分成若干部分且贴附至培养基以供微观分析，诸如显微镜载片。在样本为组织样本的情况下，若干部分可为组织切片。在一些实施方案中，连续切片取自FFPE组织样本。在一些实施方案中，连续切片取自复数个不同的FFPE组块部位，可完成此以获取切片内异质性及块内异质性。在一些实施方案中，连续切片取自复数个自相同肿瘤的不同位置获取的不同的生检样本，可进行此以获取切片内异质性及肿瘤内异质性。通常，组织样本在抗原检测之前首先经历去石蜡化、抗原撷取(例如用蛋白酶K)。组织样本可获自/分离自多种组织(例如生检)，具体而言获自肿瘤的组织，所述肿瘤包括但不限于SCLC、LCNEC、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、黑素瘤或其他神经内分泌肿瘤(例如神经内分泌前列腺癌或神经内分泌胰脏癌、小细胞膀胱癌)。
可获得/分离(组织)样本的其他例示性肿瘤包括肺癌；优选SCLC、NSCLC或LCNEC；乳癌；子宫颈癌；结肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；头颈癌；肝癌(肝母细胞瘤或肝细胞癌)；卵巢癌；胰脏癌；前列腺癌；皮肤癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；肾上腺癌；肾脏癌；气囊癌；子宫癌；食道癌；尿道上皮癌；脑瘤；淋巴瘤；尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)；及其他神经内分泌(包括伪内分泌肿瘤)及小蓝圆细胞肿瘤。
样本中DLL3检测的例示性方法为免疫细胞化学(ICC)、免疫组织化学(IHC)、西方墨点法、流式细胞计数及/或ELISA。
在一优选实施方案中，使用IHC检测DLL3。
在本发明之一特定方面中，检测组织样本中DLL3的方法包含
a)使组织样本(例如肿瘤组织，诸如SCLC、神经胶母细胞瘤或神经内分泌肿瘤)与本发明的抗体(例如DLL3#1或DLL3#5)接触，优选地该组织样本为固定的组织样本(例如福尔马林固定及石蜡包埋)
b)允许在该样本中形成抗体-抗原复合物；以及
c)检测与DLL3结合的抗-DLL3抗体。
在本发明的方法的一些实施方案中，抗-DLL3抗体为通过可检测信号检测，优选地，可检测信号为通过可检测标记来产生。在本发明的方法之一优选实施方案中，可检测信号为在IHC分析中检测。在一些实施方案中，可检测信号为在ELISA分析中，通过流式细胞计数或通过西方墨点法检测。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于例如使用流式细胞计数检测存在于细胞(例如肿瘤细胞)的细胞表面上的DLL3。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于使用ELISA、西方墨点法或IHC检测组织样本(例如肿瘤组织样本)中DLL3的存在。
在一些实施方案中，可检测标记与抗-DLL3抗体直接结合且因此在抗-DLL3抗体与DLL3结合后沉积于样本上，此一般称为直接表示法。直接表示法常常可更加直接地定量，但常常缺少敏感性。在其他实施方案中，可检测标记的沉积为通过使用第二检测试剂来实现，该第二检测试剂与本发明的抗体分子特异性结合且与可检测标记(例如二次抗体)结合，此一般称为间接表示法。在一些实施方案中，特异性第二检测试剂可为物种特异性二次抗体、与半抗原结合的抗-DLL3抗体结合的抗半抗原抗体，或与生物素标记的抗-DLL3抗体结合的生物素结合蛋白。
可与本发明的抗-DLL3抗体或与第二检测试剂结合的可检测标记包括显色、荧光、磷光、发光及放射性分子及材料、将一种物质转化为另一种物质以提供可检测差异的催化剂(诸如通过将无色物质转化为着色物质或反过来，或通过产生沉淀物或增加样本浊度)、可经由抗体-半抗原结合相互作用使用额外的可检测标记的抗体结合物检测的半抗原，及顺磁性及磁性分子或材料。
举例而言，可检测标记可为酶，诸如辣根过氧化酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、酸性磷酸酵素、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖、β-葡萄糖醛酸苷酶及β-内酰胺酶；荧光团，诸如荧光素、发光体、香豆素、BODIPY染料、试卤灵及若丹明；纳米颗粒，诸如量子点(美国专利第6,815,064号、第6,682,596号及第6,649,138号)；金属螯合物，诸如放射性或顺磁性金属离子(Gd<3+>)的DOTA及DPTA螯合物；及脂质体，例如含有捕获的荧光分子的脂质体。
在可检测标记包括酶的情况下，可检测基质(诸如色素原、荧光化合物或发光化合物)可与酶组合使用以产生可检测信号。显色化合物的特定实施例包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、坚牢红(fast red)、溴氯吲哚基磷酸盐(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、坚牢红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-次偶氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻二甲氧苯胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝苯基--D-哌喃半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基--哌喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形基--D-哌喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝苯基-a-D-哌喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基--D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘基硝基四唑鎓(INT)、四唑蓝及四唑紫。
在一些实施例中，可检测部分为荧光团，其属于若干常见化学类别，包括香豆素、荧光素(或荧光素衍生物及类似物)、若丹明、试卤灵、发光体及花青。
在其他实施方案中，可检测部分为可经由亮视野显微镜术检测的分子，诸如染料，包括二氨基联苯胺(DAB)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺(DABSYL)、四甲基若丹明(DISCOVERY Purple)、N,N'-双羧基戊基-5,5'-二磺酸根基-吲哚-二羰花青(Cy5)及若丹明110(若丹明)。
半抗原为与抗体特异性结合的小分子，但其自身将不会引发动物中的免疫反应且必须首先连接至较大载体分子，诸如蛋白质以产生免疫反应。半抗原的实施例包括二-硝苯基、生物素、地高辛及荧光素。
本文在一个方面中进一步提供将肿瘤诊断或鉴别为表达DLL3的肿瘤(表达细胞质及/或细胞表面中的DLL3)的方法，其包括使用本发明的抗-DLL3抗体(例如肿瘤组织样本)(例如DLL3#1或DLL3#5)检测个体的样本(例如使用肿瘤组织样本上的IHC)中的DLL3。在另一方面中，本文提供选择用于个体的DLL3靶向疗法的方法，其包括使用本发明的抗-DLL3抗体(例如DLL3#1或DLL3#5)(例如使用肿瘤组织样本上的IHC)检测个体的样本(例如肿瘤组织样本)中的DLL3。在另一方面中，本文提供监测个体中的治疗效果(例如DLL3靶向疗法的治疗效果)的方法，其包括使用本发明的抗-DLL3抗体(例如DLL3#1或DLL3#5)(例如使用肿瘤组织样本上的IHC)检测个体的样本(例如肿瘤组织样本)中的DLL3。
本发明的抗-DLL3抗体分子亦可用于靶向细胞。在一些实施方案中，本文提供的DLL3特异性抗体用于通过将此类药物或细胞毒性剂连接至该DLL3抗体来将药物或细胞毒性剂递送至靶细胞(例如表达DLL3的肿瘤细胞)，进而例如杀灭该靶细胞。
试剂盒
本发明亦涵盖试剂盒，其至少包含本发明的多特异性结合蛋白(例如DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3及DLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3中的任一者，优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)及任选选用的选自由用于治疗如上文所述的疾病及病症的其他药物组成的群的一或多种其他组分。
在一个实施方案中，试剂盒包括在单位剂型中含有有效量的本发明的结合蛋白的组合物。
本发明亦涵盖试剂盒，其至少包含本发明的多特异性结合蛋白，及选自由如上文所述的用于治疗疾病及病症的其他药物组成的群的一或多种其他组分。
在一个实施方案中，该试剂盒包括组合物，其在单位剂型中含有有效量的本发明的多特异性结合蛋白(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)。在另一实施方案中，该试剂盒包括以下两者：在单位剂型中含有有效量的本发明的多特异性结合蛋白(优选地DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3中的任一者)的组合物；及在单位剂型中含有有效量的PD-1拮抗剂(诸如如本文(例如表A)及WO2017/198741所述的抗PD-1抗体，最佳地PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5)的组合物。
在一些实施方案中，试剂盒包含无菌容器，其含有此类组合物；这些容器可为盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡壳包装或本领域中已知的其他合适的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔片或适合于保存药剂的其他材料制成。另外，该试剂盒可包含在具有本发明的结合蛋白的第一容器中呈冻干形式的药物组合物及具有用于注射的药学上可接受的稀释剂(例如无菌水)的第二容器。药学上可接受的稀释剂可用于重组或稀释结合蛋白。
视需要，本发明的多特异性结合蛋白连同用于向患有癌症的个体给予多特异性结合蛋白的说明书一起提供。所述说明书一般将包括关于治疗或预防癌症的组合物的用途的信息。在其他实施方案中，所述说明书包括以下中的至少一者：治疗剂的说明书、治疗或预防癌症或其症状的剂量时程及给药、注意事项、警告、适应症、不适应症、过量信息、不良反应、动物药理学、临床研究及/或参考文献。所述说明书可直接印刷在容器(若存在)上或作为施加于容器上的标签，或作为供应于容器中或与容器一起供应的独立纸片、小册子、卡片或文件夹。
如本文所阐述，本发明进一步提供用于测定生物样本中DLL3表达的诊断方法。在一个方面中，本发明提供用于执行这些方法的试剂盒以及用于实施本发明的方法(诸如收集组织及/或执行检测分析，及/或分析结果)的说明书。
该试剂盒包含本发明的DLL3抗体组合物(例如单克隆抗体)及使用说明书，或可替代地基本上由其组成，或又进一步由其组成。所述试剂盒适用于检测生物样本(例如任何体液或身体组织的生检)中DLL3多肽的存在。在一些实施方案中，该试剂盒可包含：一或多种能够结合样本中DLL3多肽的DLL3抗体(例如抗-DLL3抗体DLL3#1或DLL3#5)；用于检测样本中DLL3多肽的构件；及任选选用的用于比较样本中DLL3多肽的信号/量与对照的构件。可标记本发明的一或多种抗-DLL3抗体。试剂盒组分(例如试剂)可包装在合适容器中。该试剂盒可进一步包含使用试剂盒检测DLL3多肽的说明书。在某些实施方案中，该试剂盒包含本发明的抗-DLL3抗体(第一抗体)及不同的第二抗体，该第二抗体与DLL3多肽或第一抗体结合且与可检测标记结合。
试剂盒亦可包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。试剂盒可进一步包含用于检测可检测标记必需的组分，例如酶或受质。试剂盒亦可含有对照样本或一系列对照样本，其可经分析且与测试样本比较。试剂盒的各组分可密封于单独的容器内，且全部多个容器可连同用于解释使用试剂盒所进行的分析的结果的说明书一起在单一包装内。本发明的试剂盒可含有在试剂盒容器上或中的书面产品。书面产品描述如何使用包含于试剂盒中的试剂。
为了方便起见，这些表明试剂盒组分可以本领域技术人员惯用的方式封装。举例而言，这些表明试剂盒组分可呈溶液或呈液体分散液或类似形式提供。
实施例
以下实施例说明本发明。这些实施例不应理解为限制本发明的范畴。
实施例1：设计及构建CD3/DLL3结合蛋白
本发明人已开发出多特异性结合蛋白，其结合DLL3及CD3且诱导T细胞活化，从而导致表达DLL3的肿瘤细胞的溶解。所使用的分子设计具有IgG抗体骨架及IgG样结构。其特征在于Fc中的杵臼技术以用于杂二聚杵(抗-DLL3)及臼(抗-CD3)臂。另外，结合蛋白在各臂中的轻链与相应重链之间具有柔性肽序列。因此，结合蛋白包含两个臂，一个结合于CD3，另一个结合于DLL3，各臂包含单链Fab及Fc区。
优选地，结合分子为双特异性的及二价的(对于两个目标中的每一者为单价)。
使用自杂交瘤及培养的单B细胞回收的高通量V基因制备识别DLL3及CD3的结合域
为获得抗-DLL3结合子，在活体外培养来源于经DLL3免疫接种的野生型及AlivaMab人类化小鼠(Ablexis，San Francisco，CA，USA:具有人类免疫球蛋白基因座的AlivaMab基因转殖小鼠平台)的杂交瘤或单B细胞。通过AlphaLISA(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)针对对重组人类DLL3的反应性，及通过流式细胞计数针对对表达人类DLL3的SHP77细胞(
Figure BDA0002927579820000901
CRL-2195TM)筛分上清液。
随后自鉴别的阳性纯系扩增免疫球蛋白(Ig)VH及VL基因。为自杂交瘤RNA，将约2×106个来自单一纯系的细胞粒化且用作源材料。对于单一B细胞，将自单独分离的B细胞扩增的100至500个细胞用作源材料。使用RNeasy Plus(Qiagen，Hilden，Germany)分离RNA。随后根据制造商的说明书使用Smarter cDNA合成试剂盒(Clontech，Mountain View，CA)合成cDNA。为促进cDNA合成，使用oligodT引发所有信使RNA的逆转录，之后用Smarter IIA寡核苷酸“5'加帽”。使用靶向Smarter IIA端帽的5'引子及靶向CH1中的共有区的3'引子，使用2步骤PCR扩增进行VH及VL片段之后续扩增。简言之，各50μl PCR反应物由20μM正向及反向引子混合物、25μl PrimeStar Max DNA聚合酶预混合物(Clontech)、2μl未纯化的cDNA，及21μl双蒸馏H2O组成。循环程序在94℃下开始持续3min，继之以35个周期(94℃持续30秒，50℃持续1min，68℃持续1min)，且在72℃下持续7min结束。用VL及VH第2轮引子进行第二轮PCR，所述引子含有“重叠”其各别pTT5母载体中的各别区域(VH及VL)的15bp互补延伸。用以下程序进行第二轮PCR：94℃持续3min；35个周期(94℃持续30秒，50℃持续1min，68℃持续1min)，及在72℃下持续7min结束。
使用
Figure BDA0002927579820000911
HD克隆试剂盒(Clontech，U.S.A.)将VL基因定向克隆于pTT5huIgK载体中且将VH基因定向克隆于pTT5 huIgG1KO载体中。为促进
Figure BDA0002927579820000912
HD克隆，PCR产物在In-Fusion HD克隆之前经纯化且用克隆增强剂处理。根据制造商的方案(Clontech，U.S.A.)进行克隆及转化。使少量制备的DNA(Mini-prep DNA)进行桑格定序(Sanger sequencing)以证实获得完整的V基因片段。
使用此方法，制备Ig VH及VL基因对，其编码对DLL3具有特异性的结合域。通过用相应的重链及轻链编码质体瞬时转染CHO-E37细胞制备重组抗体。
重组抗体的证实筛选
通过流式细胞计数针对与表达人类或食蟹猕猴DLL3的细胞株的结合分析含有所表达重组抗体的上清液。简言之，使细胞与重组上清液一起培育，洗涤，且用抗人类-IgG-APC检测来自上清液的结合mAb(Jackson ImmunoResearch 109-136-098)。通过以样本的中值荧光强度(MFI)除以同型对照的中值荧光强度来计算信号/背景比(S/B)(可变区对不相关蛋白质及不同恒定区主链)。
在Biacore 400上对重组上清液进行表面等离子共振(SPR)。简言之，经由蛋白质A/G将HTP上清液中的非优化的IgG捕获于传感器表面上，在10ul/min下持续60秒。监测100nM人类DLL3与捕获IgG的结合，在30ul/min下缔合180秒，之后在HBS-EP缓冲液中解离120秒。在每个结合循环之间用甘氨酸pH 2.1进行蛋白质A/G表面的再生。将以下材料用于此分析：蛋白质试剂：以重组方式表达的人类DLL3。系统操作缓冲液：HBS-EP(10mM HEPESpH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA及0.005％v/v聚山梨醇酯P20)。捕获试剂：蛋白质A/G G(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)，具有对所有人类IgG同型的特异性。
选择相关纯系(Kd<300pM)以用于多特异性格式化。生成多特异性结合蛋白且进一步在机制及功能性筛分中评估(诸如如下所述的细胞结合、细胞毒性及T细胞活化)。
DLL3及CD3结合子的人类化
如上文所述的DLL3结合子以及文献(Pessano等人，EMBO J.1985年2月；4(2):337-44；Salmerón A等人，J Immunol.1991年11月1日；147(9):3047-52)中所描述的CD3结合子的序列经人类化及/或优化。抗体的序列优化/人类化为用于工程改造在非人类物种中产生(对特异性抗原/表位)的用作治疗剂的抗体的方法，所述抗体与在人类中产生的抗体类似且藉此在保留特异性的同时消除可能存在的不良影响，诸如免疫原性。本文利用的序列优化/人类化方法为由Singh等人，2015(Singh S等人，mAbs 2015:7(4):778-91)描述。简言之，电子杂交鉴别接近匹配的人类生殖为，且使用噬菌体筛选方法评估优化/人类化变体。基于结合、百分比人类评分及Epivax(潜在免疫原性的电子杂交预测工具)评分选择最终前导候选序列。
构建结合DLL3及CD3的双特异性蛋白质
使用常见分子生物学技术，将DLL3及CD3结合子的可变区克隆于表达载体pTT5(国家研究委员会(National Research Council)，加拿大)中，以形成双特异性结合蛋白，其具有：一个DLL3特异性结合单元，该结合单元包含结合于DLL3的单链Fab及Fc区(此类结合单元在本文中亦称为“DLL3臂”或“DLL3链”)；及CD3特异性结合单元，该结合单元包含结合于CD3的单链Fab及Fc区(此类结合单元在本文中亦称为“CD3臂”或“CD3链”)。DLL3及CD3臂的Fc区包括“杵”或“臼”突变(Atwell等人，JMB，1997，270，26-35)且各别链称为杵或臼链。对于多片段DNA组装，根据制造商的方案，使用Gibson组装及NEBuilder HiFi DNA组装方法(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)。对少量制备的DNA进行定序。
各表达载体含有链编码基因(DLL3或CD3臂/链)，亦即编码信号序列及轻链及重链的基因的真核生物启动子组件、原核生物选择标记基因的表达卡匣(诸如氨苄西林(ampicillin)、及复制起点。使这些DNA质体在氨苄西林抗性大肠杆菌菌落及培养物中繁殖且纯化。
实施例2：结合DLL3及CD3的双特异性二价结合蛋白的表达及纯化
通过用携带DLL3/CD3-链编码基因的pTT5载体瞬时转染CHO-E细胞来制备结合DLL3及CD3的双特异性分子。简言之，在140rpm搅拌下，37℃及5％CO2下，于摇瓶中培育在无血清培养基中的悬浮液中生长的经转染的CHO-E细胞且保持在指数生长的条件下。在转染当天，用杵-链质体及臼-链质体，依1:3质量比，以化学方式转染细胞。随后依1至2×10^6个细胞/毫升，接种于1L
Figure BDA0002927579820000932
FreeStyleTMCHO表达培养基(LifeTechnologies，NY，US)中。随后在环绕式振荡下培育细胞10天，一次进料200ml商业进料溶液，以供蛋白质表达。使用
Figure BDA0002927579820000933
仪器(Pall ForteBio，CA，US)及portA生物传感器探针头，根据制造商的说明书，测定细胞培养上清液中的抗体力价。
以两步法，自培养上清液纯化重组DLL3/CD3结合蛋白：首先通过蛋白质A亲和色谱法，使用MabSelectTM管柱(GE Healthcare)；第二，通过阳离子交换色谱使用50HS管柱(Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)。将经两步骤纯化的材料储存于50mM乙酸钠及100mM NaCl，pH 5.0纯度的最终缓冲液中且通过分析型尺寸排阻色谱、质谱分析及分析型超速离心评估样本的异质性程度。进行功能性测试的样本包含经两步骤纯化的材料，具有约99％单体含量。
表1：本文所描述的蛋白质/抗体构建体的CDR、VH、VL、scFab、DLL3臂及CD3臂的氨基酸序列及SEQ ID NO：
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*带下划线的序列表明铰链区
实施例3：产生重组蛋白
·人类DLL3-His
使用HEK-293细胞(Thermo Fisher)、Lenti-X慢病毒系统(Clontech)，及编码人类DLL3-His的质体(人类DLL3寄存编号Q9NYJ7 huDLL3-His:SEQ ID NO:106)生成用以产生人类DLL3-His的细胞株。为了表达，在37℃，5％CO2及140rpm振荡下培养及扩增细胞。在表达第0天，粒化细胞且再悬浮于Expi293培养基中。在表达第3天，通过在4700rpm下将细胞粒化40分钟来收集经调节的培养上清液。在纯化之前将蛋白酶抑制剂添加至生物质。通过西方墨点法证实表达。用0.5mM TCEP，0.02％CHAPS，10mM咪唑调节经调节的培养上清液。在HisTrap Ni excel管柱及缓冲液A：50mM MES，50mM NaCl，0.5mM TCEP，0.02％CHAPS，pH6.5上进行纯化。在补充有0.5M咪唑的缓冲液A，pH 8.5中，使用自20mM咪唑至500mM咪唑的洗脱梯度洗脱所关注蛋白质。将经汇集的级分在以下缓冲液中渗析：50mM MES，50mM NaCl，1mM TCEP，0.02％CHAPS，0.2M精氨酸，3％甘油，pH 6.5。通过质谱分析及分析型超速离心检核纯化材料。
·食蟹猕猴DLL3-His
使用HEK-293细胞(Thermo Fisher)、Lenti-X慢病毒系统(Clontech)及编码食蟹猕猴DLL3-His的质体(食蟹猕猴DLL3寄存编号：XM_005589196.1(RefSeq)；食蟹猕猴DLL3-His:SEQ ID NO:107)生成用以制备食蟹猕猴DLL3-His的细胞株。为了表达，在37℃，5％CO2及140rpm振荡下培养及扩增细胞。在表达第0天，粒化细胞且再悬浮于Expi 293培养基中。在表达第3天，通过在4700rpm下将细胞粒化40分钟来收集经调节的培养上清液。在纯化之前将蛋白酶抑制剂添加至生物质。通过西方墨点法证实表达。用0.5mM TCEP，0.02％CHAPS，10mM咪唑调节经调节的培养上清液。在HisTrap Ni excel管柱及缓冲液A：50mM MES，50mMNaCl，0.5mM TCEP，0.02％CHAPS，pH 6.5上进行纯化。在补充有0.5M咪唑的缓冲液A，pH 8.5中，使用自20mM咪唑至500mM咪唑的洗脱梯度洗脱所关注蛋白质。将经汇集的级分在以下缓冲液中渗析：50mM MES，50mM NaCl，1mM TCEP，0.02％CHAPS，0.2M精氨酸，3％甘油，pH 6.5。通过质谱分析及分析型超速离心检核纯化材料。
·人类CD3 E+G HuFc-6xHis(E+G指示εγ子单元)
使用HEK-293细胞(Thermo Fisher)、Lenti-X慢病毒系统(Clontech)及编码人类CD3 E+G HuFc-6xHis的质体(人类CD3E寄存编号：P07766；人类CD3E+G-HuFc-His:SEQ IDNO:108)生成用以制备人类CD3 E+G HuFc-6xHis的细胞株。为了表达，在37℃，潮湿的8％CO2环境及135rpm振荡下在Freestyle 293培养基中培养及扩增细胞。在第6天通过在9300xg下离心30分钟收集经调节的培养上清液。通过SDS-PAGE及西方墨点法监测表达。用0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS及10mM咪唑调节经调节的培养上清液。随后将pH值调节至7.2。在两步法中进行纯化：使用Ni/NTA树脂亲和纯化(在4℃下隔夜培育，且用250mM咪唑洗脱)；之后在Superdex 200管柱上在含有0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS、1mM TCEP，pH7.2的目标缓冲液PBS中进行尺寸排阻色谱。在最终分析及储存之前，使用10K MWCO PES膜viva细胞100离心装置浓缩汇集的材料。通过质谱分析及分析型超速离心检核纯化材料。
·食蟹猕猴CD3 E+G HuFc-6xHis(E+G指示εγ子单元)
使用HEK-293细胞(Thermo Fisher)、Lenti-X慢病毒系统(Clontech)及编码食蟹猕猴CD3 E+G HuFc-6xHis的质体(猕猴CD3E寄存编号：Q95LI5<；食蟹猕猴CD3E+G-huFc-His:SEQ ID NO:109)生成用以制备食蟹猕猴CD3 E+G HuFc-6xHis的细胞株。为了表达，在37℃，潮湿的8％CO2环境及135rpm振荡下在Freestyle 293培养基中培养及扩增细胞。在第6天通过在9300xg下离心30分钟收集经调节的培养上清液。通过SDS-PAGE及西方墨点法监测表达。用0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS及10mM咪唑调节经调节的培养上清液。随后将pH值调节至7.2。在两步法中进行纯化：使用Ni/NTA树脂亲和纯化(在4℃下隔夜培育，且用250mM咪唑洗脱)；之后在Superdex 200管柱上在含有0.2M蔗糖、5％甘油、0.01％CHAPS、1mMTCEP，pH7.2的目标缓冲液PBS中进行尺寸排阻色谱。在最终分析及储存之前，使用10K MWCOPES膜viva细胞100离心装置浓缩汇集的材料。通过质谱分析及分析型超速离心检核纯化材料。
实施例4A：基于SPR测定与重组DLL3及CD3εγ子单元的亲和力及种间交叉反应
通过表面等离子共振(SPR)，使用ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad)测定经纯化的DLL3/CD3双特异性构建体对人类及食蟹猕猴CD3εγ子单元的重组人类及食蟹猕猴DLL3-ECD及Fc融合蛋白的结合亲和力。在PBS-T-EDTA中获得操作缓冲液及所有稀释液(除非另有说明)。GLM传感器芯片(Bio-Rad)根据制造商的建议标准化及预调节。用EDC/s-NHS的等量混合物在水平方向上以30ul/min的流动速率活化传感器芯片300秒且用蛋白质A/G(在10mM乙酸盐pH4.5中为20ug/ml)在水平方向上以30ul/min的流动速率固定300秒，在表面上获得约5000RU蛋白质A/G。传感器芯片在水平方向用1M乙醇胺盐酸盐以30μl/min的流动速率去活化300秒。传感器芯片用0.85％磷酸以100μl/min的流动速率稳定18秒，水平方向3次及竖直方向3次。
对于对DLL3的结合动力学测定，分别在蛋白质A/G表面上以25μl/min的流动速率竖直地捕获250秒双特异性分子。通过以40μl/min的流动速率水平地注射PBS-T-EDTA 60秒来稳定基线。以40μl/min的流动速率将分析物(hu DLL3或cy DLL3)水平注射于捕捉的抗体上600秒且解离2700秒。分析物的浓度为20nM、10nM、5nM、2.5nM及1.25nM。表面通过以100μl/min的流动速率注射0.85％磷酸18秒，水平方向一次及竖直方向一次而再生。
对于对CD3的结合动力学测定，经由以30μl/min的流动速率竖直地胺偶合140秒将hu CD3εγ-Fc及cy CD3εγ-Fc(溶解于pH 4.5乙酸盐中)直接固定于传感器表面上。通过以40μl/min的流动速率水平地注射PBS-T-EDTA 60秒来稳定基线。以40μl/min的流动速率将分析物(双特异性分子)水平注射于CD3εγ-Fc构建体上600秒且解离600秒。分析物的浓度为250nM、125nM、62.5nM、31.3nM及15.6nM或2μM、1μM、0.5μM、0.25μM及0.125μM。表面通过以100μl/min的流动速率注射0.85％磷酸18秒，水平方向一次及竖直方向一次而再生。
自原始资料减去间点(与传感器表面的相互作用)及空白(PBS-T-EDTA)。随后相对于1:1动力学模型拟合传感器图谱以提供对hu DLL3及cy DLL3的速率常数(ka，kd)以及亲和力(KD)值，且相对于平衡全局拟合以提供对hu CD3εγ及cy CD3εγ的亲和力(KD)值。
本文所描述的DLL3/CD3结合蛋白显示在pM范围中对DLL3的亲和力。对CD3εγ子单元的亲和力处于低nM范围。平衡人类与食蟹猕猴之间的种间差异。三种例示性DLL3/CD3结合蛋白(分别包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:105的CD3链的DLL3/CD3结合蛋白)的亲和力展示于表2A中。
表2A：如通过SPR分析所测定的DLL3/CD3结合蛋白对人类及食蟹猕猴DLL3及CD3εγ子单元的亲和力(KD，及种间差异
Figure BDA0002927579820001201
实施例4B：基于SPR测定对重组DLL3及CD3εγ的亲和力
通过表面等离子共振(SPR)，使用ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad)测定经纯化的DLL3/CD3双特异性构建体对人类CD3εγ子单元的重组人类DLL3-ECD及Fc融合蛋白的结合亲和力。该方法与实施例4A相似，少量差异如下文概述。
对于对DLL3的结合动力学测定，分别在蛋白质A/G表面上以30μl/min的流动速率竖直地捕获200秒抗-DLL3/CD3分子。通过以30μl/min的流动速率水平地注射PBS-T-EDTA60秒来稳定基线。以30μl/min的流动速率将分析物(hu DLL3)水平注射于捕捉的抗体上300秒且解离1800秒。分析物的浓度为20nM、10nM、5nM、2.5nM及1.25nM。表面通过以100μl/min的流动速率注射0.85％磷酸18秒，水平方向一次及竖直方向一次而再生。
对于对CD3的结合动力学测定，经由以30μl/min的流动速率竖直地胺偶合360秒将HuCD3E_HuCD3G-Fc(溶解于pH 4.5乙酸盐中)直接固定于传感器表面上。通过以30μl/min的流动速率水平地注射PBS-T-EDTA60秒来稳定基线。以30μl/min的流动速率将分析物(所有抗-DLL3/CD3分子)水平注射于捕捉的抗体上600秒且解离1800秒。分析物的浓度为250nM、83.3nM、27.8nM、9.3nM及3.1nM。表面通过以100μl/min的流动速率注射0.85％磷酸18秒，水平方向一次及竖直方向一次而再生。
例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链；包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白；及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:105的CD3链的DLL3结合蛋白)的亲和力展示于2B中。
表2B：如通过SPR分析所测定的DLL3/CD3结合蛋白对人类DLL3及CD3εγ子单元的亲和力(KD)
Figure BDA0002927579820001211
Figure BDA0002927579820001221
实施例5：在细胞表面上产生表达胞外域及其子域的HEK293细胞
为产生分别表达全长人类DLL3(Uniprot:Q9NYJ7)、猕猴DLL3(UPI0003AB95BD)、人类DLL1(Q00548)及人类DLL4(Q9NR61)的稳定HEK293细胞，将各别编码序列克隆于pcDNA3.1()中且将FLAG卷标插入在信号序列与胞外域之间。通过使用抗FLAG抗体(纯系M2，Sigma)继之以单克隆抗小鼠IgG1(Acris)检验在细胞表面上的表达。
DLL3的胞外域由不同子域组成：
·Hu DLL3信号肽：aa 1-26
·Hu DLL3 N端ECD域：aa 27-175
·Hu DLL3 DSL：aa 176-215
·Hu DLL3 EGF1：aa 216-249
·Hu DLL3 EGF2：aa 274-310
·Hu DLL3 EGF3：aa 312-351
·Hu DLL3 EGF4：aa 353-389
·Hu DLL3 EGF5：aa 391-427
·Hu DLL3 EGF6：aa 429-465
·近膜肽：aa 466-492
DLL3的以下子域表达在HEK293细胞的细胞表面上：
·Hu DLL3 EGF1+2:Uniprot：Q9NYJ7 aa 216-310
·Hu DLL3 EGF 2+3:Uniprot：Q9NYJ7 aa 274-351
·Hu DLL3 EGF3+4:Uniprot：Q9NYJ7 aa 312-389
·Hu DLL3 EGF4+5:Uniprot：Q9NYJ7 aa 353-427
·Hu DLL3 EGF5+6:Uniprot：Q9NYJ7 aa 391-465
·Hu DLL3 EGF6+近膜肽：Uniprot：Q9NYJ7 aa 429-492
为产生表达人类DLL3的6-His-myc标记的子域的HEK293细胞，将各别编码序列克隆于pcDNA 3.1(Thermo Fisher Scientific)中。构建体含有N端小鼠IgG Vk前导序列，继之以6-Histidin-myc标签及各别人类DLL3结构域。为确保人类DLL3域的细胞表面定位，所有构建体继之以Ser/Gly-接头、人类EpCAM(P16422)的跨膜域(aa266-288)及胞内域(aa289-314)。使用对各种结构域的小鼠单克隆IgG2a抗体检验子域表达，如WO 2013126746所描述。用山羊抗小鼠IgG(F(ab')2)-RPE(Jackson Immuno Research)检测结合的单克隆抗体。样本通过流式细胞测量术测量。人类DLL1及DLL4的表达为通过FACS分析使用抗DLL1(R&D Systems，MAB1818)及抗DLL4 R&D系统MAB1506)抗体继之以经PE标记的抗小鼠或抗大鼠二级抗体证实(参见图5，右图)。
表3：在HEK293细胞上表达的各种DLL3子域的序列
Figure BDA0002927579820001231
Figure BDA0002927579820001241
Figure BDA0002927579820001251
实施例6：DLL3/CD3结合蛋白的表位结构域定位
通过DLL3/CD3结合蛋白与表达DLL3子域的重组细胞株测定表位结构域(参见图2)。这些细胞株的产生在实施例5下描述。
通过用携带链编码基因的pTT5载体瞬时转染CHO-E细胞制备DLL3/CD3结合蛋白，如实施例2中所描述。
用经两步骤纯化的DLL3/CD3结合蛋白在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中的1.6nM下染色表达DLL3子域的细胞。用PE结合的抗人类二次抗体(Sigma-Aldrich，#P8047)检测结合分子。作为阴性对照，仅使细胞与二次抗体一起培育。样本通过流式细胞测量术测量。图3A-C展示与DLL3的不同区结合的例示性结合子(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ IDNO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链，及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白)。表位结构域的序列在实施例5，表3中列举。
实施例7：种间交叉反应
种间交叉反应为通过DLL3/CD3结合蛋白与NCI-H82(HTB-175TM)及SHP77(
Figure BDA0002927579820001261
CRL-2195TM)细胞、两种SCLC细胞株，以及与表达猕猴DLL3的重组细胞株(描述于实施例5中的细胞株产生)的结合测定。
通过用携带链编码基因的pTT5载体瞬时转染CHO-E细胞制备DLL3/CD3结合蛋白，如实施例2中所描述。用1.6nM经两步骤纯化的DLL3/CD3结合蛋白在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中染色表达人类或猕猴DLL3的细胞。用PE结合的抗人类二次抗体(Sigma-Aldrich，#P8047)检测结合分子。作为阴性对照，仅使细胞与二次抗体一起培育。样本通过流式细胞测量术测量。图4展示与具有七种例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQ ID NO:74的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链、SEQ ID NO:76的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQID NO:77的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链或SEQ ID NO:78的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链)的人类及食蟹猕猴DLL3表达细胞的结合。
实施例8：确认不存在与人类DLL1及DLL4的结合
通过DLL3/CD3结合蛋白与表达人类DLL1或DLL4的重组细胞(描述于实施例5中的细胞株产生)的结合测定不存在与人类DLL1及DLL4的交叉反应。
通过用携带链编码基因的pTT5载体瞬时转染CHO-E细胞制备DLL3/CD3结合蛋白，如实施例2中所描述。
用1.6nM经两步骤纯化的DLL3/CD3结合蛋白以在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中增加的浓度染色表达DLL1及DLL4的细胞。用PE结合的抗人类二次抗体(Sigma-Aldrich，#P8047)检测结合分子。作为阴性对照，仅使细胞与二次抗体一起培育。样本通过流式细胞测量术测量。人类DLL1及DLL4的表达为通过FACS分析使用抗DLL1(R&DSystems，MAB1818)及抗DLL4 R&D Systems，MAB1506)抗体继之以经PE标记的抗小鼠或抗大鼠二级抗体证实。图5展示七种例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQ ID NO:74的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQID NO:80的CD3链、SEQ ID NO:76的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链、SEQ ID NO:77的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链或SEQ ID NO:78的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链)与人类DLL1及DLL4表达细胞的结合。
实施例9：DLL3/CD3结合蛋白与SCLC细胞株及T细胞的结合
通过NCI-H82(HTB-175TM)及SHP77(
Figure BDA0002927579820001271
CRL-2195TM)的流式细胞计数测试DLL3/CD3结合蛋白与人类SCLC细胞株的结合。制备DLL3/CD3结合蛋白，如实施例2中所描述。
通过Ficoll密度梯度离心，自富集淋巴球的制剂(白血球层)(收集输注用血液的血库的副产物)制备人类周边血液单核细胞(PBMC)。在根据赫尔辛基宣言获得知情同意书之后且在奥地利的cantonal道德委员会批准下获得所有白血球层且在收集同一天制备PBMC。因此，通过Ficoll密度梯度离心(35min，在1400rpm下无减速)分离单核细胞且用PBS大量洗涤。剩余红血球通过在ACK溶解缓冲液(Thermo Fisher Scientific，A1049201)中培育3分钟移除，之后在PBS中洗涤，然后悬浮于含有RPMI 1640GlutaMAX(Gibco#61870-010)、5％人类AB血清AB(Gemini，GemCell cat#100-512LOT#H56500I)+1％MEM-NEAA(Gibco#11140-035)、10mM HEPES(Affymetrix#7365-49-9)、10μMβ-巯基乙醇(Gibco#21985-023)及丙酮酸钠(Gibco#11360-039)的分析培养基中。
使用盘式T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)通过阴性选择分离T细胞。简言之，将细胞再悬浮于40μl缓冲液PBS/0.5％BSA(Gibco ref#041-94553M)/2mMEDTA(Invitrogen ref#15575-038)/10个Mio细胞且与每10个Mio细胞10μl生物素-抗体混合物一起在4℃下培育5min。接着，添加30μl缓冲液及20μl抗生物素MicroBeds/1千万个细胞且在4℃下培育10min。接着，在适合MACS分离器(Miltenyi Biotec)的磁场中将混合物置放于预冲洗的25LS管柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)中。收集流过物且在分析培养基中洗涤。
用增加浓度的经两步骤纯化的DLL3/CD3结合蛋白以在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中增加的浓度染色细胞(T细胞或人类SCLC细胞)。用PE结合的抗人类二次抗体(Sigma-Aldrich，#P8047)检测结合分子。相比于靶向近膜肽(DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3)的DLL3/CD3结合蛋白，靶向DSL(DLL3#6)、EGF1(DLL3#5)或EGF4(DLL#4)结构域的DLL3/CD3结合蛋白展示与表达DLL3的SCLC细胞株更强的结合。对不同表位结构域的例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252的DLL3链及SEQ IDNO:79的CD3链；包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白)与SHP77、NCI-H82细胞及T细胞的结合展示于图6A-V中。
实施例10A：重导向非受激PBMC对人类SCLC细胞株的效能
非受激PBMC对SCLC细胞株的效能为使用乳酸脱氢酶(LDH)释放作为细胞溶解的读数来测定。在此分析中，使DLL3阳性SCLC细胞株、SHP77及NCI-H82与作为效应细胞的人类PBMC及增加浓度的DLL3/CD3结合蛋白以10:1的效应:靶细胞比率共同培养72小时。通过用携带链编码基因的pTT5载体瞬时转染CHO-E细胞来制备DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链，以及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白)，如实施例2中所描述。
通过Ficoll密度梯度离心，自富集淋巴球的制剂(白血球层)(收集输注用血液的血库的副产物)制备人类周边血液单核细胞(PBMC)。在根据赫尔辛基宣言获得知情同意书之后且在奥地利的cantonal道德委员会批准下获得所有白血球层且在收集同一天制备PBMC。因此，通过Ficoll密度梯度离心(35min，在1400rpm下无减速)分离单核细胞且用PBS大量洗涤。剩余红血球通过在ACK溶解缓冲液(Thermo Fisher Scientific，A1049201)中培育3分钟移除，之后在PBS中洗涤，然后悬浮于含有RPMI 1640GlutaMAX(Gibco#61870-010)、5％人类AB血清AB(Gemini，GemCell cat#100-512LOT#H56500I)+1％MEM-NEAA(Gibco#11140-035)、10mM HEPES(Affymetrix#7365-49-9)、10μMβ-巯基乙醇(Gibco#21985-023)及丙酮酸钠(Gibco#11360-039)的分析培养基中。
接着，使靶细胞、SHP77及NCI-H82，以及PBMC以1:10的比率与DLL3/CD3结合蛋白在0.0001nM至100nM的浓度下一起培育72小时。
使用细胞毒性检测试剂盒PLUS(Roche)，根据制造商的说明书测定细胞毒活性。简言之，此方法为基于利用自死亡或质膜损伤细胞释放LDH。使细胞培养上清液与来自试剂盒的反应混合物一起培育30分钟且在分光亮度计中在500nm下测量作为细胞溶解的替代的因LDH活性而引起的甲臜形成。根据下式计算相对于最大溶解对照细胞毒性的百分比：
Figure BDA0002927579820001291
背景：靶细胞+效应细胞
最大溶解：靶细胞+5％Triton X-100
最小溶解：靶细胞
使用GraphPad Prism 5软件，针对相应DLL3/CD3结合蛋白浓度绘制细胞毒性相对于最大溶解对照的百分比。用四参数对数公式模型分析剂量反应曲线，以评估S形剂量-反应曲线且计算EC90值(EC90值展示于表4A中)。
图7A展示与不同表位结构域结合的七种例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77或SEQ ID NO:78的DLL3链，及SEQ ID NO:79的CD3链，以及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白)的细胞溶解的效能实施例。
表4A：如在非受激PBMC作为效应细胞及SCLC细胞株、NCI-H82及SHP77作为靶细胞的72小时细胞毒性分析中所测量的DLL3/CD3结合蛋白的EC90值[nM]。
DLL3/CD3结合蛋白 NCI-H82 SHP77
DLL3#1/CD3#1 1.7 1.4
DLL3#2/CD3#1 2.9 3.4
DLL3#3/CD3#1 0.9 1.5
DLL3#3/CD3#2 3.9 16.5
DLL3#4/CD3#1 在100nM下无饱和 在100nM下无饱和
DLL3#5/CD3#1 在100nM下无饱和 在100nM下无饱和
DLL3#6/CD3#1 在100nM下无饱和 在100nM下无饱和
实施例10B：重导向非受激T细胞对人类SCLC细胞株的效能
如实施例9中所描述分离T细胞。随后纯化的T细胞在细胞毒性分析中用作效应细胞，其中SHP77及NCI-H82细胞作为靶细胞，如实施例10A中所描述。剂量反应曲线展示于图7B-H(SHP77细胞)及图7I-O(NCI-H82细胞)中。计算的EC90值展示于表4B中。
图7B-O展示19种例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQID NO:252的DLL3链)的细胞溶解效能的实施例。
表4B：如在利用经纯化T细胞作为效应细胞且SCLC及NCI-H82细胞株作为靶细胞的72小时细胞毒性分析中所测量的DLL3/CD3结合蛋白的EC90值[nM]
Figure BDA0002927579820001301
Figure BDA0002927579820001311
实施例11：活体外内化分析
测量在与作为靶细胞的DLL3阳性SHP77细胞一起预培育之后DLL3/CD3结合蛋白的效能变化。若DLL3/CD3结合蛋白内化，则有效浓度应因此减少且因此表观效能应减少。
制备DLL3/CD3结合蛋白，如实施例2中所描述。人类周边血液单核细胞(PBMC)如实施例10中所描述制备。
接种SHP77靶细胞且使其与DLL3/CD3结合蛋白以0.0001至100nM的浓度一起培育2及4小时，之后添加非受激PBMC持续48小时。效应细胞与靶细胞的比率为10:1。如实施例10中所描述，使用细胞毒性检测试剂盒PLUS(Roche)测定细胞毒活性。
图8展示两种例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ IDNO:79的CD3链的DLL3/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3/CD3结合蛋白)的溶解细胞效能及功效无差异。相比于未预培育的样本(0h)已观测到效能及功效。结果表明，用DLL3/CD3结合蛋白未出现显著内化。
实施例12：小鼠PK研究
在单次1mg/kg静脉内给药之后评估C57BL/6小鼠中DLL3/CD3结合蛋白的PK。使用DLL3捕获/CD3检测分析测定DLL3/CD3结合蛋白的血清浓度。
简言之，雄性C57BL/6小鼠接受单次1mg/kg静脉内(IV)给药(n＝3/分子)。在给药前及给药后0.15、2、8、24、72、96、168、240及336小时收集血液样本。利用基于MSD的配位体结合分析，使用生物素标记的DLL3作为捕捉试剂及磺酸基标记的CD3作为检测试剂测量血清药物含量。根据血清浓度时间-特征曲线，使用非房室模型分析计算药物动力学(PK)参数。评估以下PK参数：AUCtlast(自时间零至最后可定量时间点血清浓度-时间曲线下面积)、AUCinf(外推至无穷的血清浓度-时间曲线下面积)、CL(全身清除率)、Vss(稳态分布体积)及t1/2(终半衰期)。
例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链的DLL3/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3/CD3结合蛋白)的平均(SD)血清浓度时间-特征曲线概述于图9中。这些例示性DLL3/CD3结合蛋白的平均(SD)PK参数概述于表5中。
表5：在单次1mg/kg静脉内给药之后在雄性C57BL/6小鼠中例示性DLL3/CD3结合蛋白的平均(SD)PK参数
Figure BDA0002927579820001321
实施例13：活体内异种移植功效研究
使用用人类T细胞重组的人类异种移植小鼠模型进行功效研究。详言之，将人类SHP77小细胞肺癌细胞(2×107)皮下注射(s.c.)于经亚致死辐射(2Gy，第1天)的雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac小鼠的右背侧(第1天)中。同时，在活体外扩增人类CD3阳性T细胞(自健康人类血液供体分离)。
人类周边血液单核细胞(PBMC)如实施例10中所描述制备。
使用盘式T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)通过阴性选择分离T细胞。简言之，将细胞再悬浮于40μl缓冲液PBS/0.5％BSA(gibco ref#041-94553M)/2mMEDTA(Invitrogen ref#15575-038)/10个Mio细胞且与每10个Mio细胞10μl生物素-抗体混合物一起在4℃下培育5min。接着，添加30μl缓冲液及20μl抗生物素MicroBeds/1千万个细胞且在4℃下培育10min。接着，在适合MACS分离器(Miltenyi Biotec)的磁场中将混合物置放于预冲洗的25LS管柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)中。收集流过物且在分析培养基中洗涤。
随后，使用T细胞活化/扩增试剂盒人类(Miltenyi Biotec Cat#130-091-441，Lot#5170720843)将T细胞扩增20天。简言之，抗生物素MACSiBeadTM粒子经装载有CD2生物素、CD3生物素、CD28生物素且以每个粒子2个细胞的比率转移至经纯化的T细胞且在20个单位重组IL-2(R&D#202-IL-050/CF)存在下以0.5-1 106个细胞/毫升的密度培育20天。细胞每三天补充20个单位新鲜IL-2。在注射于动物中三天之前，用装载有CD2生物素、CD3生物素、CD28生物素的抗生物素MACSiBeadTM粒子以每4个细胞1个珠粒的比率再刺激T细胞额外三天。最后，用MACSiMAG分离器(Miltenyi Biotec)移除珠粒且在PBMC中洗涤T细胞。
在第14天，基于肿瘤体积将动物随机分为治疗组且腹膜内(i.p.)注射2×107个人类T细胞。在第17天开始治疗且在q7d给药方案中通过静脉内(i.v.)快速注射将DLL3/CD3结合蛋白(包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链的DLL3/CD3结合蛋白，及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3/CD3结合蛋白)或媒剂缓冲液(50mMNaOAc，100mM NaCl，pH 5.0)给予外侧尾部静脉中。通过外部测径规测量监测肿瘤生长且使用标准半椭球公式计算肿瘤体积。在研究结束时，通过对人类CD3免疫组织化学(IHC)染色在脾中评估人类T细胞植入。仅将在研究结束时展示人类T细胞植入的那些动物包括于统计分析中。在研究期间早期出于道德原因对达到处死准则的动物安乐死。用DLL3/CD3结合蛋白以0.25mg/kg每周一次静脉内治疗携带肿瘤的小鼠诱导显著的肿瘤消退(图10)。
实施例14：DLL3/CD3结合蛋白的单体含量百分比
通过分析型尺寸排阻色谱(aSEC)测定例示性DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ IDNO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链；包含SEQ IDNO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白；及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:105的CD3链的DLL3结合蛋白)的单体百分比(示于表6中)。在Waters(Milfrod，MA，USA)Acquity UPLC系统上使用蛋白质BEH SEC管柱
Figure BDA0002927579820001331
1.7μm，4.6×150mm(目录号186005225)进行aSEC。操作条件如下：流动相：50mM磷酸钠，200mM精氨酸及0.05％叠氮化钠；流动速率：0.5ml/min；运行时间：5分钟；样本负载量：10μg；峰值检测：A280nm；色谱图的自动化处理方法。
表6：第一及第二纯化步骤之后的单体百分比
Figure BDA0002927579820001332
Figure BDA0002927579820001341
实施例15A：热稳定性
通过差示扫描热测量定(DSC)测定热稳定性且DLL3/CD3结合蛋白的第一熔化转变(Tm1)结果展示于表7中。DSC热熔融提供关于溶液中的蛋白质相对于缓冲液对照的热稳定性的信息。经由自动化毛细管DSC在60℃/小时的扫描速率下监测自20℃至110℃，1mg/ml蛋白质于20mM柠檬酸盐，115mM NaCl，pH 6的溶液的热去折叠及聚集。
表7A
DLL3/CD3结合蛋白 Tm1
DLL3#3/CD3#1 64
DLL3#3/CD3#2 60
DLL3#3/CD3#3 63
DLL3#4/CD3#1 63
实施例15B：热稳定性
通过热转变分析(TSA)测定热稳定性且DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQID NO:251或SEQ ID NO:252的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链；包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白；及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:105的CD3链的DLL3结合蛋白)的第一熔化转变(Tm1)的结果展示于表7B中。使用QuantStudio 6Flex实时PCR系统(Applied Biosystems，Waltham，MA)，利用SYPRO Orange(Invitrogen，Carlsbad，CA)作为外源性荧光团采集随温度而变的荧光强度特征曲线。用40mM氯化钠及0.02％叠氮化钠将样本在10mM组氨酸，pH 6.0中稀释至0.4mg/ml。以2℃/min的速率用25℃至95℃的热斜变生成熔融曲线，经由‘ROX’过滤器组(Ex：580±10nm，Em：623±14nm)大约每0.4℃收集资料。使用蛋白质热转变软件版本1.3(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)分析资料。
表7B
DLL3/CD3结合蛋白 Tm1(℃)
DLL3#1/CD3#1 65.6
DLL3#2/CD3#1 65.5
DLL3#3/CD3#1 65.6
DLL3#3/CD3#2 63.0
DLL3#3/CD3#3 65.5
DLL3#4/CD3#1 65.8
DLL3#5/CD3#1 65.6
DLL3#6/CD3#1 65.8
DLL3#7/CD3#1 65.6
DLL3#8/CD3#1 65.8
DLL3#9/CD3#1 65.9
DLL3#10/CD3#1 64.6
DLL3#11/CD3#1 66.0
DLL3#12/CD3#1 65.9
DLL3#13/CD3#1 65.8
DLL3#14/CD3#1 65.9
DLL3#15/CD3#1 na
DLL3#16/CD3#1 65.8
DLL3#17/CD3#1 65.8
DLL3#18/CD3#1 65.8
实施例16：通过Epivax电子杂交预测的免疫原性评分
用数学算法电子杂交评估序列免疫原性。具体而言，测定DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ IDNO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链；包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白；及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:105的CD3链的DLL3结合蛋白)作为免疫原性评分的测量的经EpiMatrix Treg调节的评分且使其与各种Fc序列的评分比较。这些评分将T细胞表位及Treg表位纳入考虑。免疫原性评分愈低，序列愈不可能具有免疫原性。一般而言，负评分视为免疫原性风险低，而高正评分视为可能的免疫原性的指示。如下表中所示，本文所描述的DLL3/CD3结合蛋白具有极低的免疫原性评分，表明这些结合蛋白具有免疫原性的风险较低。
表8：DLL3/CD3结合蛋白的经调节Epivax评分
Figure BDA0002927579820001361
表9：Fc域的经调节的Epivax评分
Fc蛋白质链 经调节的EpiVax评分
Fc-IgG1-WT -25.64
Fc-IgG1-LALA -29.83
Fc-IgG1-LALA-KNOB -31.76
Fc-IgG1-LALA-HOLE -18.01
实施例17A：非特异性结合于表面
使用高度带电荷蛋白质在基于SPR的分析中进一步测试本发明的DLL3/CD3结合蛋白的特异性。使用生物传感器技术研发非特异性结合分析以测定结合蛋白是否显著结合至不相关带电蛋白质。在此分析中，使DLL3/CD3结合蛋白通过两个SPR表面上方，一个涂布有带负电荷蛋白质(胰蛋白酶抑制剂)且一个涂布有带正电蛋白质(溶菌酶)。当蛋白质显示与这些表面的显著非特异性结合时，结合的原因可能为在候选物上存在带正电荷或带负电荷表面片。蛋白质的非特异性结合可转变为不佳药物动力学(PK)及生物分布，且亦可在下游可制造性上有影响。
在Biacore T200上进行实验。在25℃下，在由10×HBS-EP制备的1×HBS-EP缓冲液中执行稀释、表面制备及结合实验。固定方案与结合实验的流动速率皆为5μL/min。
为制备用于非特异性结合实验的表面，使用胺偶合试剂盒根据制造说明书将鸡蛋白溶菌酶及来自大豆(glycine max/soybean)的胰蛋白酶抑制剂手动偶合至S系列CM5芯片，其中表面密度为3000-5000RU。
在1X HBS-EP缓冲液中以1μM制备样本。将样本注射在活化表面上，进行10min缔合及10min解离。使用2.0.1版Biacore T200控制软件收集数据使用3.0版Biacore T200评估软件分析。
DLL3/CD3结合蛋白不与这些高度带电荷表面结合。表10A展示不存在两种例示性DLL3/CD3结合蛋白与两种高度带电荷蛋白质-胰蛋白酶抑制剂及溶菌酶的结合。
表10A:
Figure BDA0002927579820001371
实施例17B：非特异性结合于表面
在基于SPR的分析中，使用高度带电荷的蛋白质进一步测试DLL3/CD3结合蛋白(包含以下的DLL3/CD3结合蛋白：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ IDNO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252的DLL3链及SEQ ID NO:79的CD3链；包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:80的CD3链的DLL3结合蛋白；及包含SEQ ID NO:75的DLL3链及SEQ ID NO:105的CD3链的DLL3结合蛋白)的特异性，如实施例17a所描述，进行10min缔合及15min解离。结果展示于表10B中。
表10B：低RU数目指示不与不相关带电荷蛋白质显著结合
Figure BDA0002927579820001381
实施例18：在DLL3阳性及DLL3阴性肿瘤细胞存在下诱导溶解、T细胞活化、T细胞脱粒、T细胞增殖及细胞因子分泌
如实施例9中所描述纯化PBMC。为测定T细胞活化、T细胞脱粒及细胞因子分泌，如实施例10B中所描述设置利用PBMC及DLL3阳性SHP77或DLL3阴性RKO-E6细胞作为靶细胞的细胞毒性分析。如实施例10A中所描述测定通过将T细胞重导向人类SHP77或RKO-E6细胞实现的细胞溶解效能。为测定T细胞活化，且对T细胞脱粒细胞离心及用对CD4(BD#550630)、CD8(BD#557834)、CD25(BD#340907)的抗体染色，随后使用固定/渗透溶液(BD#554714)透化细胞且用对穿孔素(BioLegend#308120)及颗粒酶B(BD#560221)的抗体染色且通过流动式细胞测量术测量。通过U-PLEX生物标记第1组(hu)分析(MSD，#K15067L-2，试剂盒)测定上清液中的细胞因子含量。
为测定T细胞的增殖，用5μM细胞TraceTM CFSE(Invitrogen，C34554)标记PBMC且用抗CD3抗体(BioLegend目录号：317336)对T细胞染色。随后，使经标记的PBMC与SHP77或RKO-E6细胞以10:1的比率及增加浓度的DLL3/CD3结合蛋白一起培育6天。
图11-15展示在SHP77或RO-E6细胞及DLL3/CD3结合蛋白存在下，对T细胞重导引的SHP77或RKO-E6细胞溶解的诱导(图11)及对剂量依赖型T细胞活化(图12)、T细胞脱粒(图13)、细胞因子分泌(图14A：干扰素γ；14B：MCP-1)及T细胞增殖(图15)的诱导。
实施例19：将T细胞亚群复位向至SHP77细胞
如实施例10a中所描述分离PBMC。随后，使用以下试剂及方案分离T细胞亚群：
表11：用于分离T细胞子组的试剂及方案
T细胞亚群 所使用试剂及方案
原始T细胞 Miltenyi Biotech；#130-097-095
CD4<sup>+</sup>T细胞 Miltenyi Biotech；#130-096-533
CD4<sup>+</sup>效应记忆T细胞 Miltenyi Biotech；#130-094-125
CD4<sup>+</sup>中央记忆T细胞 Miltenyi Biotech；#130-094-302
CD8<sup>+</sup>T细胞 Miltenyi Biotech；#130-096-495
CD8<sup>+</sup>CD45RA<sup>+</sup>效应T细胞 Miltenyi Biotech；#130-094-485
CD8<sup>+</sup>记忆T细胞 Miltenyi Biotech；#130-094-412
图16-20展示DLL3/CD3结合蛋白对人类SHP77细胞重导向Pan T细胞(图16)、原始T细胞(图16)、CD4+T细胞(图17，18)、CD4+效应记忆T细胞(图18)、CD4+中央记忆T细胞(图17)、CD8+ T细胞(图19，20)、CD8+CD45RA+效应T细胞(图19)、CD8+记忆T细胞(图20)的效能。
实施例20：具有例示性DLL3/CD3结合蛋白的SHP77异种移植肿瘤组织中的T细胞浸润
制备在实施例13中所描述的研究中来自小鼠的剩余肿瘤组织，固定在福尔马林中且包埋于石蜡中。随后，制备组织切片且对T细胞上的CD3表达染色(2GV6 Ventana)。具有例示性DLL3/CD3结合蛋白的SHP77异种移植肿瘤组织中的T细胞浸润显示于图21中。使用表12中的评分定量异种移植肿瘤组织中的CD3表达。
表12：针对浸润性CD3阳性T细胞的定量评分
评分 描述
0 在切片平面中无CD3+细胞
1 有稀少的分散细胞或小簇，大多数在基质中
2 有稀少的分散细胞或小簇，在基质及边缘中
3 在基质、上皮及边缘中低细胞数目或簇
4 在基质及边缘中中度细胞数目或簇；低数目上皮内细胞
5 在基质及边缘中高细胞数目或簇；低数目上皮内细胞
实施例21：产生抗-DLL3抗体
为获得抗-DLL3结合子，在活体外培养来源于经DLL3免疫接种的野生型及AlivaMab人类化小鼠(Ablexis，San Francisco，CA，USA:具有人类免疫球蛋白基因座的AlivaMab基因转殖小鼠平台)的杂交瘤或单B细胞。通过AlphaLISA(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)针对对重组人类DLL3的反应性，及通过流式细胞计数针对对表达人类DLL3的SHP-77细胞(
Figure BDA0002927579820001403
CRL-2195TM)筛分上清液。
随后自鉴别的阳性纯系扩增免疫球蛋白(Ig)VH及VL基因。为自杂交瘤RNA，将约2×106个来自单一纯系的细胞粒化且用作源材料。对于单一B细胞，将自单独分离的B细胞扩增的100至500个细胞用作源材料。使用RNeasy Plus(Qiagen，Hilden，Germany)分离RNA。随后根据制造商的说明书使用Smarter cDNA合成试剂盒(Clontech，Mountain View，CA)合成cDNA。为促进cDNA合成，使用oligodT引发所有信使RNA的逆转录，之后用Smarter IIA寡核苷酸“5'加帽”。使用靶向Smarter IIA端帽的5'引子及靶向CH1中的共有区的3'引子，使用2步骤PCR扩增进行VH及VL片段之后续扩增。简言之，各50μl PCR反应物由20μM正向及反向引子混合物、25μl PrimeStar Max DNA聚合酶预混合物(Clontech)、2μl未纯化的cDNA，及21μl双蒸馏H2O组成。循环程序在94℃下开始持续3min，继之以35个周期(94℃持续30秒，50℃持续1min，68℃持续1min)，且在72℃下持续7min结束。用VL及VH第2轮引子进行第二轮PCR，所述引子含有“重叠”其各别pTT5母载体中的各别区域(VH及VL)的15bp互补延伸。用以下程序进行第二轮PCR：94℃持续3min；35个周期(94℃持续30秒，50℃持续1min，68℃持续1min)，及在72℃下持续7min结束。
使用
Figure BDA0002927579820001401
HD克隆试剂盒(Clontech，U.S.A.)将VL基因定向克隆于pTT5huIgK载体中且将VH基因定向克隆于pTT5 huIgG1KO载体中。为促进
Figure BDA0002927579820001402
HD克隆，PCR产物在In-Fusion HD克隆之前经纯化且用克隆增强剂处理。根据制造商的方案(Clontech，U.S.A.)进行克隆及转化。使少量制备的DNA进行桑格定序以证实获得完整的V基因片段。
使用此方法，制备Ig VH及VL基因对，其编码对DLL3具有特异性的结合域。通过用相应的重链及轻链编码质体瞬时转染CHO-E37细胞制备重组抗体。
重组抗体的证实筛选
通过流式细胞计数针对与表达人类DLL3的细胞株的结合分析含有所表达重组抗体的上清液。简言之，使细胞与重组上清液一起培育，洗涤，且用抗人类-IgG-APC检测来自上清液的结合mAb(Jackson ImmunoResearch109-136-098)。通过以样本的中值荧光强度(MFI)除以同型对照的中值荧光强度来计算信号/背景比(S/B)。
在Biacore 400上对重组上清液进行表面等离子共振(SPR)。简言之，经由蛋白质A/G将HTP上清液中的非优化的IgG捕获于传感器表面上，在10ul/min下持续60秒。监测100nM人类DLL3与捕获IgG的结合，在30ul/min下缔合180秒，之后在HBS-EP缓冲液中解离120秒。在每个结合循环之间用甘氨酸pH 2.1进行蛋白质A/G表面的再生。将以下材料用于此分析：蛋白质试剂：以重组方式表达的人类DLL3。系统操作缓冲液：HBS-EP(10mM HEPESpH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA及0.005％v/v聚山梨醇酯P20)。捕获试剂：蛋白质A/G，对所有人类IgG同型均具有特异性。
选择相关纯系(Kd<300pM)且如下所述在各种检测分析中进一步评估。
实施例22：抗-DLL3抗体与重组人类DLL3蛋白质的结合
在ELISA中进行抗体结合。简言之，在4℃下以2μg/ml的浓度涂布抗-DLL3抗体隔夜。在洗涤之后，在室温下用阻断缓冲液(Gibco，Gibco#043-90309A)阻断培养盘一小时，之后洗涤且以增加浓度与重组DLL3蛋白质一起培育。为了检测，使结合DLL3蛋白质与多克隆抗-DLL3抗体(R&D Systems，AB4315)继之以SULFO-TAG标记的抗山羊抗体(R32AG-1)一起培育一小时。在Sector imager 6000(MSD)中通过使用读取缓冲区(MSD)定量结合的抗体。图22展示三种例示性抗-DLL3抗体与重组蛋白的结合。相比于靶向EGF4(DLL3#4)或EGF1结构域(DLL3#5)的抗-DLL3抗体，靶向近膜肽结构域(DLL3#3)的抗-DLL3抗体展示与重组DLL3蛋白质的更强结合。
实施例23：抗-DLL3抗体与SCLC细胞株的结合
用在FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％叠氮化钠)中浓度增加的增加浓度的抗-DLL3抗体染色细胞(T细胞或人类SCLC细胞)。通过FACS分析用PE结合的抗小鼠二次抗体(Jackson Immuno Research，115-116-072)检测结合分子。相比于靶向C端肽(DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3)的抗-DLL3抗体，靶向DSL(DLL3#6)、EGF1(DLL3#5)或EGF4(DLL3#4)结构域的抗-DLL3抗体展示与表达DLL3的SCLC细胞株的更强结合，如图23中所示。
实施例24：(IHC)
根据制造商的说明书，使用Ventana Discovery ultra(Ventana MedicalSystems，Inc，Arizona)以20μg/ml浓度对DLL3 mRNA阳性SCLC样本测试抗-DLL3抗体。简言之，对福尔马林固定，石蜡包埋的组织及切片(4μm)进行IHC，其中用抗-DLL3抗体染色。使用RUO Discovery Universal方案在Ventana Discovery Ultra平台上进行IHC分析。使用蛋白酶K作为表位撷取优化抗-DLL3抗体染色12分钟。培育抗-DLL3抗体60分钟，继之以抗小鼠HQ检测系统及抗HQ HRP两种12分钟。对与测试载片相同地处理的各组织切片进行阴性对照(IgG抗体)。
人类SCLC细胞株SHP77用作阳性对照。使用Leica SCN400组织学扫描仪(LeicaMicrosystems，Milton Keynes，UK)采集完整组织切片的数字影像。
具有例示性抗-DLL3抗体的人类SCLC样本的免疫组织化学分析显示于图24中。
实施例25：测定在SCLC细胞株上的表达量
使用QIFIKIT(K0078；Dako)定量抗-DLL3抗体的细胞表面表达。简言之，用抗-DLL3抗体(DL309，WO 2011/093097)或不相关抗体(同型对照)以5μg/ml标记SCLC细胞株(SHP77、NCI-H82及NCI-H2286)。在单独小瓶中。随后，提供于试剂盒中的细胞及珠粒与荧光素结合的抗小鼠二级抗体平行标记。在BD CantoII Fluorocytometer中测量样本且因此，荧光与细胞及珠粒上结合抗-DLL3抗体的数目相关。表12展示在三种SCLC细胞株的细胞表面上表达的DLL3分子。
表13：在SCLC细胞株的细胞表面上表达的DLL3分子
Figure BDA0002927579820001421
实施例26：测定IHC方案对SCLC细胞株块的敏感性
为评估IHC方案的敏感性，处理SCLC细胞株(SHP77、NCI-H82及NCI-H2286)(如医院中的组织)且固定于福尔马林中且随后包埋于石蜡中。
根据ATCC说明书培养SCLC细胞株。自培养板刮擦细胞且固定于福尔马林中且随后添加至溶解的Histogel(Thermo Fisher scientific，HG-4000-012)中且在4℃下培育隔夜，继之以在常规病变实验室中进行的标准石蜡包埋程序。简言之，在包埋石蜡(roti-Plast，#6642.5)中之前在乙醇及异丙醇中培育细胞块。进行细胞小球块的切片且用如实施例24中所描述的方案染色切片。展示于图25中的结果显示，利用抗-DLL3抗体DLL3#5的IHC方案能够检测具有极低DLL3表达的细胞。
序列表
<110> 勃林格殷格翰国际有限公司
<120> DLL3-CD3双特异性抗体
<130> 12-0431-WO-1
<160> 265
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3# 1LCCDR1
<400> 1
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1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 2
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<212> PRT
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<220>
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<400> 3
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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Ile Ile Asp Pro Ser Val Gly Ser Lys Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Leu
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
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<211> 11
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 11
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1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr
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<211> 17
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Ile Ile Asn Pro Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Leu
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Glu Ala Val Thr Gly Asn Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Phe Gly Tyr Ser Phe Met His
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<213> 人工序列
<220>
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Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
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Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Trp Thr
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<220>
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Val Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Met Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly Asn Ser Asn Leu Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Asn
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Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Asp Tyr
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Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
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<212> PRT
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<220>
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Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
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<212> PRT
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<220>
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Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Thr Trp Thr
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Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 29
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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1
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Phe Ala
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<220>
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Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
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<212> PRT
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Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<220>
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Phe Trp Ser
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#6 HCCDR2
<400> 35
Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Asn Ser
1 5 10 15
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#6 HCCDR3
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Arg Gly Asp Trp Gly Gly Phe Asp Ile
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#1 VL
<400> 37
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asp Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#1 VH
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Pro Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Val Gly Ser Lys Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Asp Leu Tyr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Lys Arg Phe Gly Glu Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 39
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#2 VL
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Val Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#2 VH
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ala Val Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#3 VL
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Val Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Val Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#3 VH
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Val Ile Ile Asn Pro Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ala Val Thr Gly Asn Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#4 VL
<400> 43
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 44
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#4 VH
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Val Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Phe Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly Asn Ser Asn Leu Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#5 VL
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Thr
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#5 VH
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Ser Ser Ile Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#6 VL
<400> 47
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#6 VH
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Asn
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Gly Asp Trp Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#1 scFab
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asp Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
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Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met His
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
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Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
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Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
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Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
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Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
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Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 76
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Val Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#5链
<400> 77
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Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
245 250 255
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
260 265 270
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile
290 295 300
Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
305 310 315 320
Val Thr Met Thr Arg Asp Ser Ser Ile Asn Thr Ala Phe Met Glu Leu
325 330 335
Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
340 345 350
Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
355 360 365
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
370 375 380
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
405 410 415
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
420 425 430
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
435 440 445
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
450 455 460
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
465 470 475 480
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
485 490 495
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
500 505 510
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
515 520 525
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
530 535 540
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
545 550 555 560
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
565 570 575
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
580 585 590
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
595 600 605
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
610 615 620
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
625 630 635 640
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
645 650 655
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
660 665 670
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
675 680 685
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 78
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#6链
<400> 78
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
245 250 255
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Phe Trp Ser Trp
275 280 285
Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr
290 295 300
Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Asn Ser Arg Leu Thr
305 310 315 320
Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser
325 330 335
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asp
340 345 350
Trp Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
370 375 380
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
405 410 415
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
420 425 430
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
435 440 445
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
450 455 460
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
465 470 475 480
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
485 490 495
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
500 505 510
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
515 520 525
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
530 535 540
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
545 550 555 560
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
565 570 575
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
580 585 590
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
595 600 605
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
610 615 620
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
625 630 635 640
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
645 650 655
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
660 665 670
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
675 680 685
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 79
<211> 707
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#1链
<400> 79
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
325 330 335
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
530 535 540
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
565 570 575
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
580 585 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
610 615 620
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
625 630 635 640
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
660 665 670
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly
705
<210> 80
<211> 707
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#2链
<400> 80
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
325 330 335
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
530 535 540
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
565 570 575
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
580 585 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
610 615 620
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
625 630 635 640
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
660 665 670
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly
705
<210> 81
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc域* (IgG1)
<400> 81
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 82
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcknob域 (IgG1,LALA)
<400> 82
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 83
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fchole域 (IgG1,RF/LALA)
<400> 83
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 84
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc域 (IgG4Pro)
<400> 84
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 85
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcknob域(IgG4Pro)
<400> 85
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 86
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fchole域(IgG4Pro,RF)
<400> 86
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> constantregionofakappalightchain
<400> 87
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 88
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> lambda轻链的恒定区
<400> 88
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 89
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 89
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser
1 5 10 15
Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
20 25 30
Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 90
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 90
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 91
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 91
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 92
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 92
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 93
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 93
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 94
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 94
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 95
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 95
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 LCCDR1
<400> 96
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 LCCDR2
<400> 97
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 LCCDR3
<400> 98
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 HCCDR1
<400> 99
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 100
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 HCCDR2
<400> 100
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Ala Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 101
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 HCCDR3
<400> 101
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 102
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 VL
<400> 102
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 103
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 HL
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Ala Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
<210> 104
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3 scFab
<400> 104
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Tyr Ala Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
325 330 335
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys
<210> 105
<211> 707
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3#3链
<400> 105
Glu Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Leu Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Tyr Ala Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
325 330 335
Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
530 535 540
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
565 570 575
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
580 585 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
610 615 620
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
625 630 635 640
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
660 665 670
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly
705
<210> 106
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuDLL3(ECD)-His
<400> 106
Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly
1 5 10 15
Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu
20 25 30
Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu
35 40 45
Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr
50 55 60
Thr Glu Gln Pro Gly Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly
65 70 75 80
Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe
85 90 95
Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro
100 105 110
Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu
130 135 140
Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala
145 150 155 160
Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro
165 170 175
Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu
180 185 190
Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro
195 200 205
Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val
210 215 220
Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala
225 230 235 240
Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro
245 250 255
Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys
260 265 270
Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val
275 280 285
Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly
290 295 300
Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln
305 310 315 320
Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys
325 330 335
Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg
340 345 350
Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp
355 360 365
Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly
370 375 380
Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys
385 390 395 400
Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly
405 410 415
Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly
420 425 430
Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser
435 440 445
Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg
450 455 460
Tyr Leu Ala Gly Ser Ala His His His His His His
465 470 475
<210> 107
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CynoDLL3(ECD)-His
<400> 107
Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly
1 5 10 15
Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Gly Pro Cys Arg Leu
20 25 30
Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu
35 40 45
Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr
50 55 60
Thr Glu Gln Pro Glu Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asn Gly
65 70 75 80
Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu
85 90 95
Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro
100 105 110
Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Thr Arg Arg Arg Arg Leu Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu
130 135 140
Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Leu Pro Ala Val Gly Thr Ala
145 150 155 160
Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro
165 170 175
Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro
180 185 190
Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Leu Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro
195 200 205
Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Met Val
210 215 220
Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Gly Leu Arg Gly Pro Ser Ser Thr
225 230 235 240
Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro
245 250 255
Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys
260 265 270
Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val
275 280 285
Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly
290 295 300
Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln
305 310 315 320
Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys
325 330 335
Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg
340 345 350
Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp
355 360 365
Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly
370 375 380
Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asn Cys
385 390 395 400
Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly
405 410 415
Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly
420 425 430
Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Val Ser
435 440 445
Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg
450 455 460
Tyr Leu Ala Gly Ser Ala His His His His His His
465 470 475
<210> 108
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuCD3E+G-HuFc-His
<400> 108
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp
130 135 140
Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys
145 150 155 160
Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu
165 170 175
Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly
180 185 190
Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val
195 200 205
Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile
210 215 220
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Gly Ser
465 470 475 480
Ala His His His His His His
485
<210> 109
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CynoCD3E+G-Fc-His
<400> 109
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Gly Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Gln Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
85 90 95
Val Met Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ser Phe Glu
115 120 125
Glu Asn Arg Lys Leu Asn Val Tyr Asn Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu
130 135 140
Leu Thr Cys His Val Lys Asn Thr Asn Ile Thr Trp Phe Lys Glu Gly
145 150 155 160
Lys Met Ile Asp Ile Leu Thr Ala His Lys Asn Lys Trp Asn Leu Gly
165 170 175
Ser Asn Thr Lys Asp Pro Arg Gly Val Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Ser Lys Thr Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys
195 200 205
Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys Ala Gly Ser Ala His His His His His His
465 470 475
<210> 110
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG-标记的人类DLL3全长
<400> 110
Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Lys Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly
35 40 45
Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys
50 55 60
Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala
65 70 75 80
Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro
85 90 95
Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro
100 105 110
Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe
115 120 125
Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly
130 135 140
Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu
145 150 155 160
Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp
165 170 175
Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly
180 185 190
Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys
195 200 205
Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala
210 215 220
Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu
225 230 235 240
Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys
245 250 255
Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser
260 265 270
Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly
275 280 285
Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe
290 295 300
Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser
305 310 315 320
Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val
325 330 335
Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly
340 345 350
Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln
355 360 365
Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg
370 375 380
Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu
405 410 415
Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg
420 425 430
Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His
435 440 445
Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala
450 455 460
Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly
465 470 475 480
Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro
485 490 495
Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly
500 505 510
Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu Val His Val Arg Arg Arg Gly His
515 520 525
Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser
530 535 540
Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly
545 550 555 560
Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp
565 570 575
Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala
580 585 590
Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala
595 600 605
Gly Gln Arg Gln His Leu Leu Phe Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser
610 615 620
Val Lys
625
<210> 111
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG-标记的cyno DLL3全长
<400> 111
Met Val Ser Pro Arg Met Ser Arg Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Phe Ile Pro Gln Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Lys Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly
35 40 45
Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Gly Pro Cys
50 55 60
Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala
65 70 75 80
Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro
85 90 95
Val Tyr Thr Glu Gln Pro Glu Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro
100 105 110
Asn Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe
115 120 125
Ser Leu Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly
130 135 140
Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Thr Arg Arg Arg Arg Leu
145 150 155 160
Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp
165 170 175
Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Leu Pro Ala Val Gly
180 185 190
Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys
195 200 205
Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala
210 215 220
Pro Pro Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Leu Glu His Gly Phe Cys Glu
225 230 235 240
Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys
245 250 255
Met Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Gly Leu Arg Gly Pro Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly
275 280 285
Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe
290 295 300
Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser
305 310 315 320
Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val
325 330 335
Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly
340 345 350
Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln
355 360 365
Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg
370 375 380
Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu
405 410 415
Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg
420 425 430
Asn Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His
435 440 445
Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala
450 455 460
Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly
465 470 475 480
Val Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro
485 490 495
Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly
500 505 510
Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu Val His Val Arg Arg Arg Gly His
515 520 525
Ala Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser
530 535 540
Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly
545 550 555 560
Pro Gly Asp Val Pro Ser Ser Ser Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp
565 570 575
Val Asp Ser Arg Gly Ile Tyr Val Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala
580 585 590
Arg Glu Val Ala Met Pro Leu Phe Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala
595 600 605
Gly Gln Arg Gln Asn Leu Leu Phe Pro Phe Pro Ser Ser Ile Leu Ser
610 615 620
Val Lys
625
<210> 112
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG-标记的人类DLL1全长
<400> 112
Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu
1 5 10 15
Cys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val
20 25 30
Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly
35 40 45
Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys
50 55 60
Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser
65 70 75 80
Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly
85 90 95
Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe
100 105 110
Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe
115 120 125
Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala
130 135 140
Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His
145 150 155 160
Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg
165 170 175
Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr
180 185 190
Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly
195 200 205
His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp
210 215 220
Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu
225 230 235 240
Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly
245 250 255
Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu
260 265 270
His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp
275 280 285
Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys
290 295 300
Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly
325 330 335
Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr
340 345 350
Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly
355 360 365
Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe
370 375 380
Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg
385 390 395 400
Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr
405 410 415
Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly
420 425 430
Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys
435 440 445
Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly
450 455 460
Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly
465 470 475 480
Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala
485 490 495
Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys His Glu Arg Gly His Arg Tyr Val
500 505 510
Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu
515 520 525
Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu
530 535 540
Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val
545 550 555 560
Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys
565 570 575
Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg
580 585 590
Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys
595 600 605
Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn
610 615 620
Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe
625 630 635 640
Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys
645 650 655
Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys
660 665 670
Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly Glu Glu Lys Gly Thr Pro Thr Thr
675 680 685
Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu Arg Lys Arg Pro Asp Ser Gly Cys
690 695 700
Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr Gln Ser Val Tyr Val Ile Ser Glu
705 710 715 720
Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val
725 730
<210> 113
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG-标记的人类DLL4全长
<400> 113
Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Lys Ser Gly Val Phe Gln Leu Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu
35 40 45
Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr
50 55 60
Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly
65 70 75 80
Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser
85 90 95
Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln
100 105 110
Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu
115 120 125
Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro
130 135 140
Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly
145 150 155 160
Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg
165 170 175
Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys
180 185 190
Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys
195 200 205
Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr
225 230 235 240
Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg
245 250 255
Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys
260 265 270
Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe
275 280 285
Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn
290 295 300
Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys
305 310 315 320
Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys
325 330 335
Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp
340 345 350
Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu
355 360 365
His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser
370 375 380
Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro
385 390 395 400
Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser
405 410 415
Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg
420 425 430
Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His
435 440 445
Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His
450 455 460
Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly
465 470 475 480
Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro
485 490 495
Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe
500 505 510
Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro
515 520 525
Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val
530 535 540
Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val
545 550 555 560
Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met
565 570 575
Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln
580 585 590
Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu
595 600 605
Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn
610 615 620
Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro
625 630 635 640
His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser
645 650 655
Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser
660 665 670
Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val
675 680 685
Ile Ala Thr Glu Val
690
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG tag
<400> 114
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 115
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Vk leader
<400> 115
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 116
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6His-myc标签
<400> 116
His His His His His His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10 15
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser/Gly 接头
<400> 117
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 118
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM跨膜域
<400> 118
Ala Gly Val Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala
1 5 10 15
Gly Ile Val Val Leu Val Ile
20
<210> 119
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM细胞内域
<400> 119
Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu
1 5 10 15
Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala
20 25
<210> 120
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF1
<400> 120
Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys
1 5 10 15
Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu
20 25 30
Cys Thr
<210> 121
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu DLL3 EGF 1+2
<400> 121
Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys
1 5 10 15
Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu
20 25 30
Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro
35 40 45
Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp
50 55 60
Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser
65 70 75 80
Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu
85 90 95
<210> 122
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF2
<400> 122
Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys
1 5 10 15
Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr
20 25 30
Gly Leu Arg Cys Glu
35
<210> 123
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu DLL3 EGF 2+3
<400> 123
Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys
1 5 10 15
Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr
20 25 30
Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys
35 40 45
Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr
50 55 60
Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu
65 70 75
<210> 124
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF3
<400> 124
Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro
20 25 30
Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu
35 40
<210> 125
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu DLL3 EGF 3+4
<400> 125
Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro
20 25 30
Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu
35 40 45
Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu
50 55 60
Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu
65 70 75
<210> 126
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF4
<400> 126
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
1 5 10 15
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
20 25 30
Gly Pro Arg Cys Glu
35
<210> 127
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu DLL3 EGF 4+5
<400> 127
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
1 5 10 15
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
20 25 30
Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
35 40 45
Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
50 55 60
Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg
65 70 75
<210> 128
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF5
<400> 128
Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys
1 5 10 15
Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly
20 25 30
Gly Arg Asp Cys Arg
35
<210> 129
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu DLL3 EGF 5+6
<400> 129
Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg
20 25 30
Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His
35 40 45
Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala
50 55 60
Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu
65 70
<210> 130
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF6
<400> 130
Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys
1 5 10 15
Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met
20 25 30
Gly Ala Arg Cys Glu
35
<210> 131
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu DLL3 EGF6-膜近端肽
<400> 131
Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys
1 5 10 15
Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met
20 25 30
Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu
35 40 45
Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu
50 55 60
<210> 132
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 膜近端肽
<400> 132
Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu
20 25
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#7 LCCDR1
<400> 133
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Asn Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#7 LCCDR2
<400> 134
Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#7 LCCDR3
<400> 135
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#7 HCCDR1
<400> 136
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Phe
1 5 10
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#7 HCCDR2
<400> 137
Val Ile Trp Leu Asp Gly Asp Asp Glu Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 138
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#7 HCCDR3
<400> 138
Val Leu Asp Tyr
1
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#8 LCCDR1
<400> 139
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Thr Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Val
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#8 LCCDR2
<400> 140
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#8 LCCDR3
<400> 141
Gln His Tyr Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#8 HCCDR1
<400> 142
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#8 HCCDR2
<400> 143
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Glu Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#8 HCCDR3
<400> 144
Asp Ala Val Val Ile Pro Met Asp Tyr
1 5
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#9 LCCDR1
<400> 145
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#9 LCCDR2
<400> 146
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#9 LCCDR3
<400> 147
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Ile Thr
1 5
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#9 HCCDR1
<400> 148
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 149
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#9 HCCDR2
<400> 149
Tyr Arg Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#9 HCCDR3
<400> 150
Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#10 LCCDR1
<400> 151
Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asn Ser Ile Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#10 LCCDR2
<400> 152
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#10 LCCDR3
<400> 153
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Met Asn Thr
1 5
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#10 HCCDR1
<400> 154
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#10 HCCDR2
<400> 155
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Phe Ala Gln Arg Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#10 HCCDR3
<400> 156
Asp Phe Gly Asp Thr Val Gly Asn Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#11 LCCDR1
<400> 157
Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#11 LCCDR2
<400> 158
Arg Thr Ser Tyr Leu Ala Ser
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#11 LCCDR3
<400> 159
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#11 HCCDR1
<400> 160
Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr Trp Ile Thr
1 5 10
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#11 HCCDR2
<400> 161
Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Ser Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 162
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#11 HCCDR3
<400> 162
Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser His Tyr Leu Asp Thr
1 5 10
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#12 LCCDR1
<400> 163
Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#12 LCCDR2
<400> 164
Arg Thr Ser Tyr Leu Ala Ser
1 5
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#12 LCCDR3
<400> 165
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#12 HCCDR1
<400> 166
Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr Trp Ile Thr
1 5 10
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#12 HCCDR2
<400> 167
Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Ser Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#12 HCCDR3
<400> 168
Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Leu Asp Thr
1 5 10
<210> 169
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#13 LCCDR1
<400> 169
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#13 LCCDR2
<400> 170
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#13 LCCDR3
<400> 171
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#13 HCCDR1
<400> 172
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val Thr
1 5 10
<210> 173
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#13 HCCDR2
<400> 173
Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Asn
1 5 10 15
Gly
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#13 HCCDR3
<400> 174
Leu Asp Asp Tyr Asp Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#14 LCCDR1
<400> 175
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 176
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#14 LCCDR2
<400> 176
Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser
1 5
<210> 177
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#14 LCCDR3
<400> 177
Gln Gln Ser Asp Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#14 HCCDR1
<400> 178
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 179
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#14 HCCDR2
<400> 179
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#14 HCCDR3
<400> 180
Ser Gly Gly Ser Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 181
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#15 LCCDR1
<400> 181
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#15 LCCDR2
<400> 182
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#15 LCCDR3
<400> 183
Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Arg Thr
1 5
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#15 HCCDR1
<400> 184
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#15 HCCDR2
<400> 185
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 186
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#15 HCCDR3
<400> 186
Phe His Phe Ser Ser Asn Gly Asp Ala Met Asp Asn
1 5 10
<210> 187
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#16 LCCDR1
<400> 187
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#16 LCCDR2
<400> 188
Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#16 LCCDR3
<400> 189
Gln Leu Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro Thr
1 5
<210> 190
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#16 HCCDR1
<400> 190
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Thr
1 5 10
<210> 191
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#16 HCCDR2
<400> 191
Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 192
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#16 HCCDR3
<400> 192
Asp Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 193
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#17 LCCDR1
<400> 193
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 194
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#17 LCCDR2
<400> 194
Asn Thr Asn Ser Leu Glu Asp
1 5
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#17 LCCDR3
<400> 195
Lys Gln Ala Tyr Asp Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#17 HCCDR1
<400> 196
Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#17 HCCDR2
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Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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435 440 445
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Gly
705
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#9链
<400> 243
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165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val His
245 250 255
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser
275 280 285
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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595 600 605
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<220>
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Met
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Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
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Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
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Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
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Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
435 440 445
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450 455 460
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Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
595 600 605
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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<220>
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys
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Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser
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Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Val
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Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile
275 280 285
His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
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Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp
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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Asn Pro Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
325 330 335
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
660 665 670
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675 680 685
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695 700
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<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 249
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50 55 60
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130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
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355 360 365
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
370 375 380
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
385 390 395 400
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
405 410 415
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
420 425 430
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
435 440 445
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
450 455 460
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
465 470 475 480
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
485 490 495
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
500 505 510
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
515 520 525
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
530 535 540
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
545 550 555 560
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
565 570 575
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
580 585 590
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
595 600 605
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
610 615 620
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
625 630 635 640
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
645 650 655
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
660 665 670
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
675 680 685
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
690 695 700
Pro Gly
705
<210> 250
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#16链
<400> 250
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val His Leu
245 250 255
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
260 265 270
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Thr Trp
275 280 285
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys
290 295 300
Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
305 310 315 320
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn
325 330 335
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Trp
340 345 350
Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
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370 375 380
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
385 390 395 400
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
405 410 415
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
420 425 430
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
435 440 445
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Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
485 490 495
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
500 505 510
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
515 520 525
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
660 665 670
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
675 680 685
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 251
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#17链
<400> 251
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1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
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Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser
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Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu
245 250 255
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260 265 270
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Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Glu
340 345 350
Gly Asn Ala Met Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
370 375 380
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
405 410 415
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
420 425 430
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
435 440 445
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
450 455 460
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
465 470 475 480
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
485 490 495
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
500 505 510
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
515 520 525
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530 535 540
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
545 550 555 560
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
565 570 575
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
580 585 590
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
595 600 605
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610 615 620
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
625 630 635 640
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
645 650 655
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
660 665 670
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
675 680 685
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 252
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DLL3#18链
<400> 252
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
245 250 255
Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
260 265 270
Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Phe Ile His Trp
275 280 285
Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp
290 295 300
Pro Phe Asn Asp Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys Gly Lys Ala
305 310 315 320
Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ala Tyr Met Glu Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr
340 345 350
Ser Ala Thr Leu Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
370 375 380
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
385 390 395 400
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
405 410 415
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
420 425 430
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
435 440 445
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
450 455 460
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
465 470 475 480
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
485 490 495
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
500 505 510
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
515 520 525
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
530 535 540
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
545 550 555 560
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
565 570 575
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
580 585 590
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
595 600 605
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
610 615 620
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
625 630 635 640
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
645 650 655
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
660 665 670
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
675 680 685
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695
<210> 253
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链区
<400> 253
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
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Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
50 55 60
<210> 254
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠
<400> 254
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
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Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
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145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
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195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
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260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 255
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠
<400> 255
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
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<210> 256
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-1 HC
<400> 256
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ser
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35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 257
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-1 LC
<400> 257
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Thr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 258
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-2 HC
<400> 258
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg His Ser Asn Pro Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 259
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-2 LC
<400> 259
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Thr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 260
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-3 HC
<400> 260
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 261
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-3 LC
<400> 261
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 262
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4 HC
<400> 262
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 263
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-4 LC
<400> 263
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 264
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-5 HC
<400> 264
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 265
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1-5 LC
<400> 265
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (47)

1.一种蛋白质，其包含与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元及与CD3特异性结合的第二抗原结合单元，其中该与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元选自由i)至xviii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ IDNO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的重链CDR；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ IDNO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的重链CDR；
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ IDNO:17(CDR2)及SEQ ID NO:18(CDR3)的重链CDR；
iv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ IDNO:23(CDR2)及SEQ ID NO:24(CDR3)的重链CDR；
v)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ IDNO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的重链CDR；
vi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ IDNO:35(CDR2)及SEQ ID NO:36(CDR3)的重链CDR；
vii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQ ID NO:138(CDR3)的重链CDR；
viii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQ ID NO:144(CDR3)的重链CDR；
ix)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:145(CDR1)、SEQ ID NO:146(CDR2)及SEQ ID NO:147(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:148(CDR1)、SEQID NO:149(CDR2)及SEQ ID NO:150(CDR3)的重链CDR；
x)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:151(CDR1)、SEQ ID NO:152(CDR2)及SEQ ID NO:153(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:154(CDR1)、SEQID NO:155(CDR2)及SEQ ID NO:156(CDR3)的重链CDR；
xi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:157(CDR1)、SEQ ID NO:158(CDR2)及SEQ ID NO:159(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:160(CDR1)、SEQID NO:161(CDR2)及SEQ ID NO:162(CDR3)的重链CDR；
xii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:163(CDR1)、SEQ ID NO:164(CDR2)及SEQ ID NO:165(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:166(CDR1)、SEQ ID NO:167(CDR2)及SEQ ID NO:168(CDR3)的重链CDR；
xiii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:169(CDR1)、SEQ ID NO:170(CDR2)及SEQ ID NO:171(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:172(CDR1)、SEQ ID NO:173(CDR2)及SEQ ID NO:174(CDR3)的重链CDR；
xiv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:175(CDR1)、SEQ ID NO:176(CDR2)及SEQ ID NO:177(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:178(CDR1)、SEQ ID NO:179(CDR2)及SEQ ID NO:180(CDR3)的重链CDR；
xv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:181(CDR1)、SEQ ID NO:182(CDR2)及SEQ ID NO:183(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:184(CDR1)、SEQID NO:185(CDR2)及SEQ ID NO:186(CDR3)的重链CDR；
xvi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:187(CDR1)、SEQ ID NO:188(CDR2)及SEQ ID NO:189(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:190(CDR1)、SEQ ID NO:191(CDR2)及SEQ ID NO:192(CDR3)的重链CDR；
xvii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:193(CDR1)、SEQ ID NO:194(CDR2)及SEQ ID NO:195(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:196(CDR1)、SEQ ID NO:197(CDR2)及SEQ ID NO:198(CDR3)的重链CDR；以及
xviii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:199(CDR1)、SEQ ID NO:200(CDR2)及SEQ ID NO:201(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:202(CDR1)、SEQ ID NO:203(CDR2)及SEQ ID NO:204(CDR3)的重链CDR。
2.如权利要求1的蛋白质，其中该与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元包含第一轻链可变域及第一重链可变域且选自由i)至xviii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重链可变域；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链可变域；
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变域；
iv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的重链可变域；
v)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链可变域；
vi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的重链可变域；
vii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:205的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:206的重链可变域；
viii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:207的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:208的重链可变域；
ix)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:209的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:210的重链可变域；
x)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:211的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:212的重链可变域；
xi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:213的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:214的重链可变域；
xii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:215的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:216的重链可变域；
xiii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:218的重链可变域；
xiv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:219的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的重链可变域；
xv)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的重链可变域；
xvi)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:223的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:224的重链可变域；
xvii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链可变域；以及
xviii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的重链可变域。
3.如权利要求1或2的蛋白质，其中该与CD3特异性结合的第二抗原结合单元选自由i)-iii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ IDNO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ IDNO:65(CDR2)及SEQ ID NO:66(CDR3)的重链CDR；以及
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:96(CDR1)、SEQ ID NO:97(CDR2)及SEQ ID NO:98(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:99(CDR1)、SEQ IDNO:100(CDR2)及SEQ ID NO:101(CDR3)的重链CDR。
4.如权利要求1至3中任一项的蛋白质，其中该与CD3特异性结合的第二抗原结合单元包含第二轻链可变域及第二重链可变域，该第二轻链可变域及第二重链可变域选自由i)至iii)组成的群：
i)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域；
ii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域；以及
iii)包含以下的抗原结合单元：包含氨基酸序列SEQ ID NO:102的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:103的重链可变域。
5.如权利要求1至4中任一项的蛋白质，其中
i)该与DLL3特异性结合的第一抗原结合单元自其N端至C端，包含第一轻链可变域、第一轻链恒定域、第一肽接头、第一重链可变域及第一重链恒定CH1域；且
ii)该与CD3特异性结合的第二抗原结合单元自其N端至C端，包含第二轻链可变域、第二轻链恒定域、第二肽接头、第二重链可变域及第二重链恒定CH1域。
6.如权利要求5的蛋白质，其中该第一及/或第二肽接头包含26至42个氨基酸，优选地30至40个氨基酸、34至40个氨基酸，或36至39个氨基酸中的任一者，更优选地38个氨基酸。
7.如权利要求5或6的蛋白质，其中该第一接头及/或第二接头为Gly-Ser接头，其优选地包含氨基酸序列SEQ ID NO:89，更优选地该第一及第二肽接头包含相同序列。
8.如权利要求5至7中任一项的蛋白质，其进一步包含第一及第二Fc域，该第一Fc域共价连接至该第一抗原结合单元，且该第二Fc域共价连接至该第二抗原结合单元。
9.如权利要求8的蛋白质，其中
i)该第一Fc域包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，且该第二Fc域包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]，或
ii)该第一Fc域包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，且该第二Fc域包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]，或
iii)该第二Fc域包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，且该第一Fc域包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]，或
iv)该第二Fc域包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，且该第一Fc域包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]，
优选地其中该第一或该第二Fc域进一步包含在位置435处的精氨酸[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。
10.如权利要求9的蛋白质，其中该第一及/或该第二Fc域进一步包含在位置234处的丙氨酸[L234A]及在位置235处的丙氨酸[L235A]。
11.如权利要求5至10中任一项的蛋白质，其中该第一轻链恒定域及该第二轻链恒定域包含人类κ或λ域。
12.一种蛋白质，其包含：与DLL3特异性结合的第一多肽链，该第一多肽链包含选自由以下组成的群的氨基酸序列：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ IDNO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251及SEQ ID NO:252；及与CD3特异性结合的第二多肽链，该第二多肽链包含氨基酸序列SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:105。
13.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至5中任一项的蛋白质的第一抗原结合单元及/或第二抗原结合单元，其任选进一步编码第一及/或第二Fc域。
14.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求12的第一及/或第二多肽链。
15.一种表达载体，其包含如权利要求13或14的核酸分子。
16.一种宿主细胞，其通过如权利要求15的表达载体转染。
17.一种制造如权利要求1至12中任一项的蛋白质的方法，其包括
i)在允许表达如权利要求1至12中任一项的蛋白质的条件下培育如权利要求16的宿主细胞；及，
ii)回收该蛋白质；及任选
iii)进一步纯化及/或修饰及/或调配该蛋白质。
18.一种蛋白质，其包含与DLL3特异性结合的第一多肽链及与CD3特异性结合的第二多肽链，其中该第一多肽链包含第一轻链、第一接头及第一重链，且该第二多肽链包含第二轻链、第二接头及第二重链，优选地其中该第一轻链的C端经由该第一肽接头共价连接至该第一重链的N端，且其中该第二轻链的C端经由该第二肽接头共价连接至该第二重链的N端。
19.如权利要求18的蛋白质，其中该与DLL3特异性结合的第一多肽链包含轻链可变域及重链可变域，其包含选自由i)至xviii)组成的群的CDR序列：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的重链CDR；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的重链CDR；
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ IDNO:18(CDR3)的重链CDR；
iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ IDNO:24(CDR3)的重链CDR；
v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的重链CDR；
vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ IDNO:36(CDR3)的重链CDR；
vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的轻链CDR及包含氨基酸序列SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQID NO:138(CDR3)的重链CDR；
viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQID NO:144(CDR3)的重链CDR；
ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:145(CDR1)、SEQ ID NO:146(CDR2)及SEQ ID NO:147(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:148(CDR1)、SEQ ID NO:149(CDR2)及SEQID NO:150(CDR3)的重链CDR；
x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:151(CDR1)、SEQ ID NO:152(CDR2)及SEQ ID NO:153(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:154(CDR1)、SEQ ID NO:155(CDR2)及SEQID NO:156(CDR3)的重链CDR；
xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:157(CDR1)、SEQ ID NO:158(CDR2)及SEQ ID NO:159(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:160(CDR1)、SEQ ID NO:161(CDR2)及SEQID NO:162(CDR3)的重链CDR；
xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:163(CDR1)、SEQ ID NO:164(CDR2)及SEQ ID NO:165(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:166(CDR1)、SEQ ID NO:167(CDR2)及SEQID NO:168(CDR3)的重链CDR；
xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:169(CDR1)、SEQ ID NO:170(CDR2)及SEQ ID NO:171(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:172(CDR1)、SEQ ID NO:173(CDR2)及SEQID NO:174(CDR3)的重链CDR；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:175(CDR1)、SEQ ID NO:176(CDR2)及SEQ ID NO:177(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:178(CDR1)、SEQ ID NO:179(CDR2)及SEQID NO:180(CDR3)的重链CDR；
xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:181(CDR1)、SEQ ID NO:182(CDR2)及SEQ ID NO:183(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:184(CDR1)、SEQ ID NO:185(CDR2)及SEQID NO:186(CDR3)的重链CDR；
xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:187(CDR1)、SEQ ID NO:188(CDR2)及SEQ ID NO:189(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:190(CDR1)、SEQ ID NO:191(CDR2)及SEQID NO:192(CDR3)的重链CDR；
xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:193(CDR1)、SEQ ID NO:194(CDR2)及SEQ ID NO:195(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:196(CDR1)、SEQ ID NO:197(CDR2)及SEQID NO:198(CDR3)的重链CDR；以及
xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:199(CDR1)、SEQ ID NO:200(CDR2)及SEQ ID NO:201(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:202(CDR1)、SEQ ID NO:203(CDR2)及SEQID NO:204(CDR3)的重链CDR。
20.如权利要求18或19的蛋白质，其中该与CD3特异性结合的第二多肽链包含轻链可变域及重链可变域，其包含选自由i)至iii)组成的群的CDR序列：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55(CDR1)、SEQ ID NO:56(CDR2)及SEQ ID NO:57(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:58(CDR1)、SEQ ID NO:59(CDR2)及SEQ ID NO:60(CDR3)的重链CDR；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)及SEQ ID NO:63(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)及SEQ IDNO:66(CDR3)的重链CDR；以及
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:96(CDR1)、SEQ ID NO:97(CDR2)及SEQ ID NO:98(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:99(CDR1)、SEQ ID NO:100(CDR2)及SEQID NO:101(CDR3)的重链CDR。
21.如权利要求18至20中任一项的蛋白质，其中该与DLL3特异性结合的第一多肽链包含轻链可变域及重链可变域，其选自由i)至xviii)组成的群：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重链可变域；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链可变域；
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变域；
iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的重链可变域；
v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的重链可变域；
vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的重链可变域；
vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:205的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:206的重链可变域；
viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:207的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:208的重链可变域；
ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:209的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:210的重链可变域；
x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:211的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:212的重链可变域；
xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:213的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:214的重链可变域；
xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:215的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:216的重链可变域；
xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:217的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:218的重链可变域；
xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:219的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的重链可变域；
xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的重链可变域；
xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:223的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:224的重链可变域；
xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:225的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:226的重链可变域；以及
xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:227的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:228的重链可变域。
22.如权利要求19至22中任一项的蛋白质，其中该与CD3特异性结合的第二多肽链包含轻链可变域及重链可变域，其选自由i)-iii)组成的群：
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的重链可变域；
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的重链可变域；以及
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:102的轻链可变域及包含氨基酸序列SEQ ID NO:103的重链可变域。
23.如权利要求18至22中任一项的蛋白质，其中该第一及/或第二肽接头包含26至42个氨基酸，优选地30至40个氨基酸、34至40个氨基酸或36至39个氨基酸中的任一者，更优选地38个氨基酸。
24.如权利要求23的蛋白质，其中该第一接头及/或第二接头为Gly-Ser接头，其优选地包含氨基酸序列SEQ ID NO:89，更优选地该第一及第二肽接头包含相同序列。
25.如权利要求18至24中任一项的蛋白质，其中
i)该第一重链包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，且该第二重链包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]，或
ii)该第一重链包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，且该第二重链包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]，或
iii)该第二重链包含在位置366处的酪氨酸(Y)[T366Y]，且该第一重链包含在位置407处的苏氨酸(T)[Y407T]，或
iv)该第二重链包含在位置366处的色氨酸(W)[T366W]，且该第一重链包含在位置366处的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368处的丙氨酸(A)[L368A]及在位置407处的缬氨酸(V)[Y407V]，
优选地其中该第一或该第二重链进一步包含在位置435处的精氨酸[H435R]及在位置436处的苯丙氨酸[Y436F]。
26.如权利要求25的蛋白质，其中该第一及/或该第二重链进一步包含在位置234处的丙氨酸[L234A]及在位置235处的丙氨酸[L235A]。
27.如权利要求18至26中任一项的蛋白质，其中该第一轻链及该第二轻链包含人类κ或λ域。
28.如权利要求1至12或18至27中任一项的蛋白质，其用于药物。
29.一种药物组合物，其包含如权利要求1至12或18至27中任一项的蛋白质及药学上可接受的载剂。
30.一种用于治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者给予治疗有效量的如权利要求1至12或18至27中任一项的蛋白质。
31.一种如权利要求1至12或18至27中任一项的蛋白质的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物组合物。
32.如权利要求1至12或18至27中任一项的蛋白质，其用于治疗癌症的方法。
33.如权利要求30的方法、如权利要求31的用途或如权利要求32所用的蛋白质，其中该癌症为表达DLL3的肿瘤，优选地其中该癌症为SCLC、神经胶母细胞瘤或表达DLL3的神经内分泌肿瘤。
34.如权利要求30或33的方法、如权利要求31或33的用途或如权利要求32或33所用的蛋白质，其中该蛋白质与以下组合使用：化学治疗剂、抑制血管生成的治疗活性化合物、信号转导路径抑制剂、EGFR抑制剂、免疫调节物、免疫检查点抑制剂或激素疗法药剂。
35.如权利要求34的方法、用途或所用的蛋白质，其中该蛋白质与免疫检查点抑制剂(优选为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)组合。
36.如权利要求35的方法、用途或所用的蛋白质，其中该抗PD-1抗体选自由PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5组成的群。
37.一种抗-DLL3抗体分子，其包含
i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)的重链CDR；或
ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7(CDR1)、SEQ ID NO:8(CDR2)及SEQ ID NO:9(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:10(CDR1)、SEQ ID NO:11(CDR2)及SEQ ID NO:12(CDR3)的重链CDR；或
iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13(CDR1)、SEQ ID NO:14(CDR2)及SEQ ID NO:15(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:16(CDR1)、SEQ ID NO:17(CDR2)及SEQ IDNO:18(CDR3)的重链CDR；或
iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19(CDR1)、SEQ ID NO:20(CDR2)及SEQ ID NO:21(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22(CDR1)、SEQ ID NO:23(CDR2)及SEQ IDNO:24(CDR3)的重链CDR；或
v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25(CDR1)、SEQ ID NO:26(CDR2)及SEQ ID NO:27(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:28(CDR1)、SEQ ID NO:29(CDR2)及SEQ ID NO:30(CDR3)的重链CDR；或
vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31(CDR1)、SEQ ID NO:32(CDR2)及SEQ ID NO:33(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:34(CDR1)、SEQ ID NO:35(CDR2)及SEQ IDNO:36(CDR3)的重链CDR；或
vii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:133(CDR1)、SEQ ID NO:134(CDR2)及SEQ ID NO:135(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:136(CDR1)、SEQ ID NO:137(CDR2)及SEQID NO:138(CDR3)的重链CDR；或
viii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:139(CDR1)、SEQ ID NO:140(CDR2)及SEQ ID NO:141(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:142(CDR1)、SEQ ID NO:143(CDR2)及SEQID NO:144(CDR3)的重链CDR；或
ix)包含氨基酸序列SEQ ID NO:145(CDR1)、SEQ ID NO:146(CDR2)及SEQ ID NO:147(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:148(CDR1)、SEQ ID NO:149(CDR2)及SEQID NO:150(CDR3)的重链CDR；或
x)包含氨基酸序列SEQ ID NO:151(CDR1)、SEQ ID NO:152(CDR2)及SEQ ID NO:153(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:154(CDR1)、SEQ ID NO:155(CDR2)及SEQID NO:156(CDR3)的重链CDR；或
xi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:157(CDR1)、SEQ ID NO:158(CDR2)及SEQ ID NO:159(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:160(CDR1)、SEQ ID NO:161(CDR2)及SEQID NO:162(CDR3)的重链CDR；或
xii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:163(CDR1)、SEQ ID NO:164(CDR2)及SEQ ID NO:165(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:166(CDR1)、SEQ ID NO:167(CDR2)及SEQID NO:168(CDR3)的重链CDR；或
xiii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:169(CDR1)、SEQ ID NO:170(CDR2)及SEQ ID NO:171(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:172(CDR1)、SEQ ID NO:173(CDR2)及SEQID NO:174(CDR3)的重链CDR；或
xiv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:175(CDR1)、SEQ ID NO:176(CDR2)及SEQ ID NO:177(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:178(CDR1)、SEQ ID NO:179(CDR2)及SEQID NO:180(CDR3)的重链CDR；或
xv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:181(CDR1)、SEQ ID NO:182(CDR2)及SEQ ID NO:183(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:184(CDR1)、SEQ ID NO:185(CDR2)及SEQID NO:186(CDR3)的重链CDR；或
xvi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:187(CDR1)、SEQ ID NO:188(CDR2)及SEQ ID NO:189(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:190(CDR1)、SEQ ID NO:191(CDR2)及SEQID NO:192(CDR3)的重链CDR；或
xvii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:193(CDR1)、SEQ ID NO:194(CDR2)及SEQ ID NO:195(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:196(CDR1)、SEQ ID NO:197(CDR2)及SEQID NO:198(CDR3)的重链CDR；或
xviii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:199(CDR1)、SEQ ID NO:200(CDR2)及SEQ ID NO:201(CDR3)的轻链CDR；及包含氨基酸序列SEQ ID NO:202(CDR1)、SEQ ID NO:203(CDR2)及SEQ ID NO:204(CDR3)的重链CDR。
38.如权利要求37的抗-DLL3抗体分子，其中该抗体分子为单克隆、嵌合、人类化或人类抗体分子。
39.如权利要求37或38的抗-DLL3抗体分子，其中该抗体分子为Fab、F(ab')2、Fab'、Fv或scFv。
40.如权利要求37至39中任一项的抗-DLL3抗体分子，其中重链恒定区选自由以下组成的群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恒定区。
41.如权利要求37至40中任一项的抗-DLL3抗体分子，其中该轻链恒定区为κ或λ。
42.一种检测生物样本中的DLL3的方法，其包括
(a)使该样本与如权利要求37至41中任一项的抗-DLL3抗体接触；
(b)允许在该样本中形成抗体-抗原复合物；及
(c)检测该抗-DLL3抗体。
43.如权利要求42的方法，其中该抗-DLL3抗体为通过可检测信号检测，优选地该信号为通过免疫细胞化学(ICC)、免疫组织化学(IHC)、西方墨点法、流式细胞计数及/或ELISA检测。
44.如权利要求42或43中任一项的方法，其中该生物样本为组织样本，优选地为固定组织样本，更优选地为福尔马林固定及石蜡包埋组织样本。
45.如权利要求44的方法，其中该抗-DLL3抗体为通过IHC检测。
46.如权利要求42至45中任一项的方法，其中该组织样本为肿瘤组织样本，更优选地自选自由以下组成的群的肿瘤分离的肿瘤组织样本：SCLC、LCNEC、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、黑素瘤或其他神经内分泌肿瘤。
47.一种检测DLL3的试剂盒，其包含如权利要求37至41中任一项的抗体，及使用说明书。
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