KR20240006541A - Ilt4에 대한 항체, 이중특이적 항-ilt4/pd-l1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Ilt4에 대한 항체, 이중특이적 항-ilt4/pd-l1 항체 및 이의 용도 Download PDF

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조엘 골드슈타인
마이클 비 머피
토마스 오닐
로라 에이 비탈레
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셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본원은 신규 ILT4 항체 및 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라, 적어도 하나의 추가 결합제에 연결된 이러한 항체를 포함하는, ILT4 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물도 제공한다. 상기 항체(또는 단편), 이중특이적 구축물 또는 조성물을 투여함으로써, 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법 및 암을 치료하는 방법도 기재되어 있다.

Description

ILT4에 대한 항체, 이중특이적 항-ILT4/PD-L1 항체 및 이의 용도
본원은 2021년 4월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/172,997호를 우선권으로 주장하며, 상기 가특허 출원의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
억제 면역 체크포인트 수용체 "면역글로불린 유사 전사체 4"(ILT4)는 면역 세포(예컨대, T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 비만 세포)에서 발현되는 비촉매성 티로신 인산화된 수용체 패밀리의 구성원이다. 이 패밀리의 다른 수용체와 마찬가지로, ILT4는 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)로서 지칭되는, 세포질 도메인 내의 보존된 아미노산 서열을 함유한다(Veillette et al. (2002) Annual Review of Immunology 20(1):669-707). 동족 리간드(골수 세포의 HLA-G 및 HLA 클래스 I)에 의한 ILT4의 결합 및 활성화는 다수의 기작을 통해 면역억제 효과를 발휘한다. ILT4는 다양한 암의 종양 미세환경에 있는 종양 세포 및 간질 세포에서도 발견되며 종양 세포의 생물학적 거동을 조절함으로써, 그의 면역 탈출을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(Gao et al. (2018) Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer 1869(2):278-285). 따라서, 여러 종양 유형에서 ILT4의 발현은 좋지 않은 결과와 관련되어 있다.
프로그래밍된 사멸-리간드 1(PD-L1)은 특정 사건, 예컨대, 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환 및 다른 질환 상태, 예컨대, 간염 동안 면역 시스템을 억제하는 것과 관련된 40 kDa 제1형 막횡단 단백질이다. 정상적으로, 면역 시스템은 항원 특이적 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ 헬퍼 세포의 증식을 촉발하는, 외인성 또는 내인성 위험 신호와 관련된 외부 항원에 반응한다. PD-L1과 수용체인 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)의 결합은 이 T 세포들의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전달하고, 유전자 Bcl-2의 보다 낮은 조절에 의해 추가로 매개되는 아폽토시스도 유도할 수 있다. T 세포에 대한 PD-1의 잘 확립된 억제 역할 외에도, 이의 발현은 식세포작용과 같은 항종양 기능을 음성적으로 조절할 수 있는 종양 침윤 대식세포에서도 관찰된다(Gordon et al. (2017) Nature 545: 495-9). PD-L1은 다양한 인간 암에 풍부하다(Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구의 감소, T 세포 수용체 매개 증식의 감소 및 암세포에 의한 면역 회피를 초래한다(Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 되돌릴 수 있고, PD-1과 PD-L2의 상호작용도 차단될 때 효과는 상가적이다(Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).
항체 요법과 관련된 진보에도 불구하고, 예를 들어, 면역 반응의 자극이 요구되는 질병 또는 질환을 치료하기 위한 새로운 개선된 치료제에 대한 필요성이 당분야에 존재한다. 따라서, 본 발명의 목적은 이러한 질병 또는 질환, 예컨대, 암을 가진 대상체를 치료하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본원은 인간 ILT4에 결합하는 신규 항체 및 이의 항원 결합 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv와 같은 단편)을 제공한다. 적어도 하나의 추가 결합제(예를 들어, 리간드, 수용체/트랩 서열, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 예를 들어, 인간 PD-L1 및/또는 인간 PD-1에 결합하는 추가 항체(또는 단편)에 연결된 이러한 항체(또는 단편)를 포함하는 이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물도 기재되어 있다. 본원에 더 기재된 바와 같이, 본 발명의 ILT4 항체(및 단편) 및 구축물은 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법 및 질환 또는 질병(예를 들어, 암)을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 서열을 가진 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다:
(i) 컨센서스 서열: G Y T (I,M) H(서열번호 21)로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
(ii) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
(iii) 컨센서스 서열: E R P G G S Q F I Y Y Y (P,A) (M,L) D Y(서열번호 22)로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
(iv) 컨센서스 서열: R A S (A,E) N I Y S Y L A(서열번호 23)로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
(v) 컨센서스 서열: N A (I,D) T L A E(서열번호 24)로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
(vi) 서열번호 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형.
예시적 ILT4 항체는 본원에 기재된 항체 7A3이다. 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7A3의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9에 제시된 서열을 가진 항체 7A3의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 10에 제시된 서열을 가진 항체 7A3의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합은 각각 서열번호 1, 3 및 5에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합은 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합은 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 각각 서열번호 25 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
또 다른 예시적 ILT4 항체는 본원에 기재된 항체 7B1이다. 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7B1의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 19에 제시된 서열을 가진 항체 7B1의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 20에 제시된 서열을 가진 항체 7B1의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 11, 13 및 15에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 19 및 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합은 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합은 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 각각 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 ILT4 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는
(a) 서열번호 9, 19, 97, 98, 99, 103, 104 및 105로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 상기 언급된 서열들 중 어느 한 서열과 적어도 80% 동일한 서열; 및/또는
(b) 서열번호 10, 20, 100, 101, 102, 106, 107 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 상기 언급된 서열들 중 어느 한 서열과 적어도 80% 동일한 서열
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 ILT4 항체는
(a) 서열번호 25 또는 27에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 또는 이들 중 어느 한 서열과 적어도 80% 동일한 서열; 및/또는
(b) 서열번호 26 또는 28에 제시된 경쇄 아미노산 서열, 또는 이들 중 어느 한 서열과 적어도 80% 동일한 서열
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 서열(예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역 서열)은 본원에 기재된 항체(예를 들어, 항체 7A3 또는 7B1)와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 보존적 서열 변형을 포함하면서도 ILT4에 효과적으로 결합하는 능력을 여전히 보유하는 항체 7A3 또는 7B1의 서열을 포함한다. 이러한 서열 변형은 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 아미노산 추가, 결실 또는 치환, 예를 들어, 보존적 서열 변형을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 항체 7A3 또는 7B1의 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 본원에 기재된 ILT4 항체 또는 항원 결합 단편과 실질적으로 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열도 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9, 서열번호 19, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10, 서열번호 20, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25, 서열번호 27, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26, 서열번호 28, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체는 서열번호 25를 포함하는 중쇄 및 서열번호 26을 포함하는 경쇄, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체는 서열번호 27을 포함하는 중쇄 및 서열번호 28을 포함하는 경쇄, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
결합을 위해 본원에 기재된 임의의 항체(또는 단편)와 경쟁하거나, 본원에 기재된 임의의 항체(또는 단편)와 동일한 에피토프에 결합하는 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ILT4에 결합하기 위해 항체 7A3 및/또는 항체 7B1과 경쟁한다.
또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 특성들:
a. ILT4 리간드(예를 들어, HLA-G 리간드)가 인간 ILT4에 결합하는 것을 차단하는 특성;
b. 인간 대식세포에 의한 사이토카인 또는 케모카인 방출을 향상시키거나 증가시키는 특성;
c. 대식세포에 대한 LPS 및 IFNγ의 활성화 효과를 강화시키는 특성;
d. M1 대식세포 분극화를 촉진하는 특성;
e. 10-9 M 이하의 평형 해리 상수 Kd, 또는 대안적으로 10+9 M-1 이상의 평형 결합 상수 Ka로 인간 ILT4에 결합하는 특성;
f. 다른 ILT 패밀리 구성원과의 교차반응성의 결여;
g. 사이노몰구스 ILT4와의 교차반응성; 및/또는
h. ILT4를 발현하는 종양 세포를 억제하는 특성
중 하나 이상을 나타낸다.
본 발명은 적어도 하나의 추가 결합제(예를 들어, 리간드 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편)에 연결된 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 구축물(또는 다중특이적 구축물)도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 이중특이적 구축물은
(a) 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
(b) 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 38, 39 및 40에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
(c) 각각 서열번호 41, 42 및 43에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 44, 45 및 46에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
(d) 각각 서열번호 47, 48 및 49에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 50, 51 및 52에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
(e) 각각 서열번호 53, 54 및 55에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 56, 57 및 58에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
(f) 각각 서열번호 29, 30 및 31에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
예를 들어, 이중특이적 구축물은 ILT4 항체와 제2 결합제, 예를 들어, 리간드 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예컨대, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 화학적 접합에 의해 제조될 수 있는 화학적 접합체일 수 있다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 불변 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 이의 ILT4 항원 결합 단편은 scFv, 예를 들어, VH44 및 VL100에서 Cys 치환을 가진 디설파이드 안정화 변형을 추가로 포함하는 scFv이다.
또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 불변 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 이의 PD-L1 항원 결합 단편은 scFv이다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 구축물은 ILT4 scFv에 연결된 PD-L1 항체를 포함하고, 이때
(a) PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하고;
(b) ILT4 scFv는
(i) 각각 서열번호 1, 3 및 5에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 또는
(ii) 각각 서열번호 11, 13 및 15에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적(또는 다중특이적) 구축물의 ILT4 scFv는 VH44 및 VL100에서 Cys 치환을 가진 디설파이드 안정화 변형을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 이중특이적 구축물(다중특이적 구축물), 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물뿐만 아니라, 본원에 기재된 임의의 이중특이적 구축물(다중특이적 구축물), 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 사용 설명서를 포함하는 키트도 제공한다.
추가 측면에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이중특이적 또는 다중특이적 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이중특이적 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 발현 벡터의 형태로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 대상체 생체내에 투여될 때 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이중특이적 구축물을 발현하는 발현 벡터의 형태로 존재한다.
한 실시양태에서, 핵산 분자는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 항체 가변 영역은 서열번호 9, 10, 19, 20, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 또는 108에 제시된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열들 중 하나 이상의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 항체 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 항체 쇄는 서열번호 25, 26, 27 또는 28에 제시된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열들 중 하나 이상의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 9 및 108 또는 서열번호 19 및 20에 제시된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 중쇄 및 경쇄는 서열번호 25 및 26 또는 서열번호 27 및 28에 제시된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 (예를 들어, 항원에 대한) 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법으로서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물 중 어느 하나를, 대상체에서 (예를 들어, 항원에 대한) 면역 반응을 유도하거나 향상시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 대상체에서 질병 또는 질환(예를 들어, 암)을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물 중 어느 하나를, 상기 질병 또는 질환을 치료하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에서 종양(예를 들어, ILT4, HLA-G, HLA 클래스 I, 안지오포이에틴(angiopoietin) 유사 2, Nogo 또는 ILT4 리간드를 발현하는 종양)을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물 중 어느 하나를, 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
대상체는 예를 들어, 면역 반응의 자극이 요구되는 질병 또는 질환을 앓고 있는 대상체일 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 반응의 자극이 요구되는 질병 또는 질환은 암이다. 대상체에서 (예를 들어, 항원에 대한) 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법은 항원을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물과 공투여되기에 바람직한 항원은 종양 항원이다.
도 1a 및 1b는 항체 7A3과 이의 구축물(도 1a) 및 항체 7B1과 이의 구축물(도 1b)에 대한 항원 결합 동역학을 보여주는 표이다.
도 2a, 2b 및 2c는 항체 7A3(도 2a), 항체 7B1(도 2b) 및 대조군 항체(도 2c)에 대한 항원 결합 동역학 데이터의 대표적인 트레이스(trace)를 보여주는 그래프이다.
도 3a 및 3b는 ELISA를 이용하여 키메라 및 인간화 단일클론 항체와 인간 ILT4의 결합을 보여주는 그래프이다; 항체 7A3(도 3a) 및 항체 7B1(도 3b).
도 4a 및 4b는 항체 7A3과 이의 구축물(도 4a) 및 항체 7B1과 이의 구축물(도 4b)에 대해 인간 ILT4를 발현하는 HEK293 세포와의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 5a 및 5b는 항체 7A3과 이의 구축물(도 5a) 및 항체 7B1과 이의 구축물(도 5b)에 대해 대식세포 TNF-α 생성을 보여주는 그래프이다.
도 6a 내지 6f는 대식세포에서 인간화 항체 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21에 의한 TNF-α 및 MIP1-γ 생성의 유도를 보여주는 그래프이다; 비처리(도 6a 및 6d), LPS 처리(도 6b 및 6e), 및 IFN-γ 처리(도 6c 및 6f).
도 7a, 7b 및 7c는 인간화 항체 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21에서 상대적인 유전자 발현을 보여주는 그래프이다; 도 7a(CD86), 도 7b(CD54) 및 도 7c(iNOS).
도 8a(항체 7A3) 및 8b(항체 7B1)는 ILT 패밀리 구성원을 발현하는 세포에 대한 인간화 단일클론 항체 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21의 교차반응성을 보여주는 그래프이다.
도 9a(단핵구), 9b(대식세포) 및 9c(수지상 세포)는 인간화 단일클론 항체 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21과 골수 세포의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 10a(PD-L1 x ILT4) 및 10b(PD-1 x ILT4)는 이중특이적 구축물의 묘사를 보여주는 개략도이다.
도 11은 이중특이적 항체 구축물에 대해 인간 ILT4에 대한 항원 결합 동역학을 보여주는 표이다.
도 12a(9H9-7A3 HL 및 9H9-7A3 LH) 및 12b(9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)는 ELISA를 이용하여 인간 PD-L1에 대한 인간화 이중특이적 항체 결합 특성을 보여주는 그래프이다.
도 13a(9H9-7A3 HL 및 9H9-7A3 LH) 및 13b(9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)는 인간 PD-L1을 발현하는 HEK293 세포에 대한 인간화 이중특이적 항체 결합 특성을 보여주는 그래프이다.
도 14a(9H9-7A3 HL 및 9H9-7A3 LH) 및 14b(9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)는 인간 ILT4를 발현하는 HEK293 세포에 대한 인간화 이중특이적 항체 결합 특성을 보여주는 그래프이다.
도 15a(9H9-7A3 HL 및 9H9-7A3 LH) 및 15b(9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)는 인간 ILT4 및 PD-L1을 발현하는 HEK293 세포에 대한 인간화 항체의 이기능적 결합 특성을 보여주는 그래프이다.
도 16a(9H9-7A3 HL 및 9H9-7A3 LH) 및 16b(9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)는 인간화 이중특이적 항체에 의한 T 세포 PD-1/PD-L1 차단을 보여주는 그래프이다.
도 17a(9H9-7A3 HL 및 9H9-7A3 LH) 및 17b(9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)는 대식세포에서 인간화 이중특이적 항체에 의한 TNF-α 생성의 유도를 보여주는 그래프이다.
도 18a(9H9-7A3 HL 및 9H9-7A3 LH) 및 18b(9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)는 인간화 이중특이적 항체에 의한 HLA-G와 ILT4의 결합의 억제를 보여주는 그래프이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 일부 용어를 정의한다. 추가 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
A. 정의
본원에서 사용된 용어 "면역글로불린 유사 전사체 4" 또는 "ILT4"는 억제 면역 체크포인트 수용체 및 비촉매성 티로신 인산화된 수용체 패밀리의 구성원을 의미한다. ILT4는 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B2(LILRB2), LIR2, MIR10 및 CD85d로서도 지칭된다. ILT4는 면역 세포에서 발현되고, 이 세포에서 항원 제시 세포의 MHC 클래스 I 분자에 결합하고, 예를 들어, 면역 반응에 초점을 맞추고 자가반응성을 제한하도록 염증 반응 및 세포독성을 조절함으로써 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 전달한다. 인간 ILT4의 여러 이소폼(isoform)이 확인되었다. 이소폼 1(수탁번호 Q8N423-1; 서열번호 89)은 598개의 아미노산 잔기로 구성된 표준 서열을 나타낸다. 본 발명의 ILT4 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 인간 이외의 종으로부터의 ILT4와 교차반응할 수 있다. 대안적으로, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 ILT4에 특이적일 수 있으며 다른 종과의 임의의 교차반응성을 나타내지 않을 수 있다. ILT4 또는 이의 임의의 변이체 및 이소폼은 이를 천연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 단리될 수 있거나, 당분야에 널리 알려진 기법 및/또는 본원에 기재된 기법을 이용함으로써 재조합적으로 생성될 수 있다.
ILT4에 결합하는 리간드는 당분야에 알려져 있고, 특히 HLA-G, HLA 클래스 I, 안지오포이에틴 유사 2, b-아밀로이드, SEMA4A, CD1c/d, CSP 및 미엘린 억제제, 예컨대, Nogo66, MAG, OMgp를 포함한다.
용어 "인간 백혈구 항원 G" 또는 "HLA-G"("조직적합성 항원, 클래스 I, G"로서도 알려짐)는 ILT4에 대한 리간드를 의미한다. HLA-G는 HLA 비고전적 클래스 I 중쇄 파랄로그(paralogue)에 속한다. 이 클래스 I 분자는 중쇄와 경쇄로 구성된 이종이량체이다(베타-2 마이크로글로불린). 중쇄는 막에 고정되어 있다. HLA-G는 태아 유래 태반 세포에서 발현된다. 중쇄는 대략 45 kDa이고 이의 유전자는 8개의 엑손을 함유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로그래밍된 세포 사멸 1 리간드 1", "PD-L1", "PDCD1 리간드 1", "프로그래밍된 사멸 리간드 1", "B7 동족체 1", "B7-H1" 및 "ILT44"는 교환 가능하게 사용되고, 인간 PD-L1의 변이체, 이소폼, 종 동족체, 및 PD-L1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다. 완전한 PD-L1 서열은 서열번호 176에 제시된 진뱅크(GenBank) 수탁번호 NP_001254635 하에 발견될 수 있다.
프로그래밍된 사멸-리간드 1(PD-L1)은 특정 사건, 예컨대, 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환 및 다른 질환 상태, 예컨대, 간염 동안 면역 시스템을 억제하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 추측되는 40 kDa 제1형 막횡단 단백질이다. 정상적으로, 면역 시스템은 항원 특이적 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ 헬퍼 세포의 증식을 촉발하는, 외인성 또는 내인성 위험 신호와 관련된 외부 항원에 반응한다. PD-L1과 PD-1의 결합은 이들 T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전달하고 유전자 Bcl-2의 보다 낮은 조절에 의해 추가로 매개되는 아폽토시스도 유도할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로그래밍된 사멸 1", "프로그래밍된 세포 사멸 1", "단백질 PD-1", "PD-1," PD1," "PDCD1," "hPD-1" 및 "hPD-I"은 교환 가능하게 사용되고, 인간 PD-1의 변이체, 이소폼, 종 동족체, 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다. 완전한 PD-1 서열은 서열번호 175에 제시된 진뱅크 수탁번호 NP_005009 하에 발견될 수 있다.
PD-L1은 다양한 인간 암에 풍부하다(Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구의 감소, T 세포 수용체 매개 증식의 감소 및 암세포에 의한 면역 회피를 초래한다(Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blanket al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishiet al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 되돌릴 수 있고, PD-1과 PD-L2의 상호작용도 차단될 때 효과는 상가적이다(Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brownet al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 면역 장애를 가진 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 언급된 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 이의 항원 결합 단편을 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL이라는 하나의 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로서 지칭되는, 더 보존된 영역에 의해 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로서 지칭되는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자와 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 단편"(또는 간단히 "항체 단편")은 항원(예를 들어, 인간 ILT4)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편 또는 부분을 의미한다. 이러한 "단편"은 예를 들어, 약 8개 내지 약 1500개 아미노산의 길이, 적절하게는 약 8개 내지 약 745개 아미노산의 길이, 적절하게는 약 8개 내지 약 300개, 예를 들어, 약 8개 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 50개 또는 100개 아미노산의 길이를 가진다. 항체의 항원 결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 임의로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL과 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 이용하여 이들이 단일 단백질 쇄로서 만들어질 수 있게 하는 합성 링커로 이들을 연결할 수 있고, 이때 VL 영역과 VH 영역은 페어링하여 1가 분자(단일쇄 Fv(sFv)로서 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포함된다. 이 항체 단편들은 당분야에서 기술을 가진 자에게 알려진 통상적인 기법을 이용함으로써 수득되고, 상기 단편들은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기법, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 도메인"은 항원과 상호작용하는 아미노산 잔기를 포함하는 단백질 또는 항체 부분을 의미한다. 결합 도메인은 항체(예를 들어, 전체 길이 항체)뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편도 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 결합 도메인은 항원에 대한 특이성과 친화성을 결합제에 부여한다. 이 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인에 대해 상동성을 갖거나 대체로 상동성을 가진 결합 도메인을 가진 임의의 단백질을 커버한다. 이러한 단백질은 천연 공급원으로부터 유래할 수 있거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체를 의미한다. 따라서, 용어 "인간 단일클론 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내고 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역과 임의적 불변 영역을 가진 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 인간 단일클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된, 인간 중쇄 형질전환유전자 및 경쇄 형질전환유전자를 포함하는 게놈을 가진 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체, 예컨대, (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대한 형질전환 또는 염색체전환 동물인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 형질감염종으로부터 단리된 항체, (c) 재조합 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 생식세포계열 유전자에 의해 코딩된 특정 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열을 사용하는 가변 및 불변 영역을 포함하지만, 예를 들어, 항체 성숙 동안 발생하는 후속 재배열 및 돌연변이를 포함한다. 당분야에 알려진 바와 같이(예를 들어, 문헌[Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125] 참조), 가변 영역은 재배열되어 외래 항원에 특이적인 항체를 형성하는 다양한 유전자들에 의해 코딩되는 항원 결합 도메인을 함유한다. 가변 영역은 재배열 이외에, 외래 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 다수의 단일 아미노산 변화(체세포 돌연변이 또는 과돌연변이로서 지칭됨)에 의해 더 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원에 대한 추가 반응으로 변경될 것이다(즉, 이소타입 전환). 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드를 코딩하는, 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 원래의 핵산 분자와 서열 동일성을 갖지 않을 수 있으나, 그 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다(즉, 적어도 80% 동일성을 가질 것이다).
용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)을 가진 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다(문헌[Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859)]; 문헌[Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; 문헌[Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93]; 및 문헌[Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546] 참조). 그러나, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식되어 있는 항체(즉, 키메라 항체 및 인간화 항체)를 포함하지 않는다.
"인간화" 항체는 비인간 항체의 CDR 도메인의 외부에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터 유래한 상응하는 아미노산으로 교체되어 있는 항체를 의미한다. 인간화 형태의 항체의 한 실시양태에서, CDR 도메인의 외부에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 인간 면역글로불린의 아미노산으로 교체된 반면, 하나 이상의 CDR 영역 내의 일부, 대부분 또는 모든 아미노산은 변경되지 않는다. 아미노산의 작은 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은, 이것이 특정 항원에 결합하는 항체의 능력을 없애지 않는 한, 허용될 수 있다. "인간화" 항체는 원래의 항체의 항원 특이성과 유사한 항원 특이성을 보유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체를 실질적으로 갖지 않는 항체를 의미하기 위한 것이다(예를 들어, 인간 ILT4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 인간 ILT4 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 갖지 않고; 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 인간 PD-L1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 갖지 않는다). 그러나, 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 상이한 종의 동일한 항원에 대한 교차반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 전형적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 갖지 않는다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정인자"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 부위를 의미한다. 에피토프는 인접 아미노산, 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출될 때 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리할 때 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조로 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 어떤 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지를 확인하는 방법(즉, 에피토프 맵핑)은 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 면역블롯팅 및 면역침전 어세이를 포함하고, 이때 항원(예를 들어, ILT4 또는 PD-L1)의 중첩 또는 연속 펩티드는 주어진 항체(예를 들어, ILT4 또는 PD-L1 항체)와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간적 입체구조를 확인하는 방법은 당분야의 기법 및 본원에 기재된 기법, 예를 들어, X-선 결정학 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다(예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
또 다른 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"라는 용어는 기준 ILT4 항체와 동일한 인간 ILT4의 구조적 영역과 상호작용하는, 즉 이러한 구조적 영역에 결합하는 항체를 포괄하기 위한 것이다. 항체가 결합하는 "동일한 에피토프"는 선형 에피토프, 또는 항원의 3차 폴딩에 의해 형성된 입체구조적 에피토프일 수 있다.
용어 "경쟁 항체"는 인간 ILT4에 결합하기 위해 기준 ILT4 항체와 경쟁하는, 즉 기준 ILT4 항체와 ILT4의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 의미한다. "경쟁 항체"는 기준 ILT4 항체와 동일한 ILT4의 에피토프에 결합할 수 있거나, 중첩되는 에피토프에 결합할 수 있거나, 기준 ILT4 항체와 ILT4의 결합을 입체적으로 방해할 수 있다.
동일한 에피토프를 인식하거나 결합을 위해 경쟁하는 항체는 관용적인 기법을 이용함으로써 확인될 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어, 한 항체가 또 다른 항체와 표적 항원의 결합을 차단하는 능력을 보여주는 면역어세이, 즉 경쟁 결합 어세이를 포함한다. 경쟁 결합은 시험되는 면역글로불린이 기준 항체와 공통 항원, 예컨대, ILT4의 특이적 결합을 억제하는 어세이에서 확인된다. 다양한 유형의 경쟁 결합 어세이, 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사면역어세이(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역어세이(EIA), 샌드위치 경쟁 어세이(문헌[Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)] 참조); 고체상 직접 표지부착 어세이, 고체상 직접 표지부착 샌드위치 어세이(문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 및 직접 표지부착 RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))가 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 어세이는 이 표지부착되지 않은 시험 면역글로불린 및 표지부착된 기준 면역글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁 억제는 시험 면역글로불린의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 이것은 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때 기준 항체와 공통 항원의 특이적 결합을 적어도 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 또는 더 많이 억제할 것이다.
다른 기법은 예를 들어, 에피토프 맵핑 방법, 예컨대, 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체 결정의 X-선 분석을 포함한다. 다른 방법은 항체와 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체의 결합을 모니터링하고, 이때 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 구성요소의 표시로서 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑을 위한 전산 조합적 방법도 이용될 수 있다. 이 방법은 조합적 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특정 짧은 펩티드를 친화성 단리하는 관심 있는 항체의 능력에 의존한다. 그 다음, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용되는 항체에 상응하는 에피토프의 정의를 위한 리드(lead)로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해, 입체구조적 불연속 에피토프를 맵핑하는 것으로 확인된 전산 알고리즘도 개발하였다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"는 항체가 소정의 항원의 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 전형적으로, 항체는 (예를 들어, 재조합 인간 ILT4를 피분석물로서 사용하고 항체를 리간드로서 사용하여) 비아코어(BIACORE) 2000 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술로 측정할 때 대략 10-7 M 미만, 예컨대, 대략 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 심지어 더 낮은 평형 해리 상수(KD)로 결합하고, 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하기 위한 그의 친화성보다 적어도 2배 더 큰 친화성으로 소정의 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 어구와 교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하기 위한 것이다. 전형적으로, 본 발명의 인간 항체는 (예를 들어, 재조합 인간 ILT4를 피분석물로서 사용하고 항체를 리간드로서 사용하여) 비아코어 2000 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술로 측정할 때 대략 10-8 M 이하, 예컨대, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 심지어 더 낮은 해리 평형 상수(KD)로 ILT4에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "kd"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 해리 속도 상수를 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ka"는 항체와 항원의 결합에 대한 결합 속도 상수를 지칭하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "EC50"은 시험관내 또는 생체내 어세이에서 최대 반응의 50%, 즉, 최대 반응과 기준선 사이의 절반인 반응을 유도하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 의미한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 IgG1 이소타입의 단일클론 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 IgG2 이소타입의 단일클론 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제한다" 또는 "차단한다"(예를 들어, HLA-G 리간드와 ILT4의 결합 및/또는 PD1과 PD-L1 리간드의 결합을 억제/차단하는 것을 의미함)는 교환 가능하게 사용되고 부분적 억제/차단 및 완전한 억제/차단 둘 다를 포함한다. 억제/차단은 바람직하게는 결합이 억제 또는 차단 없이 일어날 때 발생하는 정상적인 수준 또는 유형의 활성을 감소시키거나 변경시킨다. 억제 및 차단은 ILT4 항체와 접촉하지 않은 HLA-G에 비해 ILT4 항체와 접촉하였을 때 HLA-G의 결합 친화성의 임의의 측정 가능한 감소도 포함하기 위한 것이고, 예를 들어, ILT4 항체는 HLA-G의 결합을 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 억제한다. 한 실시양태에서, ILT4 항체는 HLA-G의 결합을 적어도 약 70% 억제한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체는 HLA-G의 결합을 적어도 80% 억제한다. 억제 및 차단은 PD-L1 항체와 접촉하지 않은 PD1에 비해 PD-L1 항체와 접촉하였을 때 PD1의 결합 친화성의 임의의 측정가능한 감소도 포함하기 위한 것이고, 예를 들어, PD-L1 항체는 PD1의 결합을 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 억제한다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체는 PD1의 결합을 적어도 약 70% 억제한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체는 PD1의 결합을 적어도 80% 억제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "교차반응한다"는 각각 상이한 종으로부터의 ILT4 또는 PD-L1에 결합하는 본 발명의 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 능력을 의미한다. 예를 들어, 인간 ILT4에 결합하는 본 발명의 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또 다른 종의 ILT4에도 결합할 수 있다. 유사하게, 인간 PD-L1에 결합하는 본 발명의 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또 다른 종의 PD-L1에도 결합할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 교차반응성은 결합 어세이(예를 들어, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출하거나 ILT4를 생리학적으로 발현하는 세포와의 결합 또는 다른 방식의 기능적 상호작용을 검출함으로써 측정된다. 교차반응성을 측정하는 방법은 본원에 기재된 표준 결합 어세이, 예를 들어, 비아코어™ 2000 SPR 기기(Biacore AB, 스웨덴 업살라)를 사용한 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석, 또는 유세포분석 기법을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 물체에 적용되는 용어 "천연 발생"은 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 발생된 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하기 위한 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
ILT4 및/또는 PD-L1에 결합하는 결합 도메인, 항체 또는 항체 부분(예를 들어, VH, VL, CDR3)을 코딩하는 핵산과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 핵산 분자"는 항체 또는 항체 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 ILT4 및/또는 PD-L1 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 부분을 코딩하는 다른 뉴클레오타이드 서열을 갖지 않는 핵산 분자를 의미하기 위한 것이고, 이때 상기 다른 서열은 인간 게놈 DNA에서 상기 핵산을 천연적으로 플랭킹할 수 있다.
핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당분야에 잘 알려진 다른 기법을 비롯한 표준 기법에 의해 다른 세포 구성요소 또는 다른 오염물질, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리되거나" "실질적으로 순수해진다". 예를 들어, 문헌[F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.
본 발명의 핵산 분자는 종종 천연 서열(변형된 제한 부위 등을 제외함)로 존재하지만, 유전자 서열을 제공하는 표준 기법에 따라 cDNA, 게놈 또는 이들의 혼합물로부터 돌연변이될 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이 돌연변이는 요구된 경우 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 본원에 기재된 천연 V, D, J, 불변, 스위치 및 다른 이러한 서열과 실질적으로 동일하거나 이로부터 유래한 DNA 서열이 고려된다(이때 "유래한"은 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또 다른 서열로부터 변형됨을 표시한다).
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때 "작동적으로 연결"되어 있거나 "작동 가능하게 연결"되어 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열과 관련하여, 작동 가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우, 인접하고 판독 프레임 내에 있음을 의미한다. 스위치 서열의 경우, 작동 가능하게 연결된다는 것은 서열이 스위치 재조합에 영향을 미칠 수 있음을 표시한다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 서열의 "보존적 서열 변형", 즉 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 함유하는 VH 및 VL 서열과 항원의 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 변형도 포함한다. 이러한 보존적 서열 변형은 보존적 뉴클레오타이드 및 아미노산 치환뿐만 아니라, 뉴클레오타이드 및 아미노산 추가 및 결실도 포함한다. 예를 들어, 변형은 당분야에 알려진 표준 기법, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발에 의해 서열에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 교체되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 이 패밀리는 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지된 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, ILT4 항체에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 교체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993)]; 문헌[Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)]; 및 문헌[Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)] 참조).
특정 실시양태에서, 보존적 아미노산 서열 변형은 본원에 기재된 CDR 서열에 대한 최대 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 각각의 이러한 CDR은 최대 5개의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 최대 4개(즉, 4개 이하)의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 최대 3개(즉, 3개 이하)의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 최대 2개(즉, 2개 이하)의 보존적 아미노산 치환, 또는 1개 이하의 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다.
대안적으로, 또 다른 실시양태에서, 돌연변이는 예컨대, 포화 돌연변이유발에 의해 ILT4 또는 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 이로써 얻은 변형된 ILT4 또는 PD-L1 또는 PD-1 항체는 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"은 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되었을 때 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 가지면서 뉴클레오타이드의 적어도 약 80%, 통상적으로 뉴클레오타이드의 적어도 약 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%에서 동일함을 표시한다. 대안적으로, 분절이 선택적 하이브리드화 조건 하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화할 때 실질적인 상동성이 존재한다.
아미노산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"은 2개의 아미노산 서열 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되었을 때 적절한 아미노산 삽입 또는 결실을 가지면서 아미노산의 적어도 약 80%, 통상적으로 아미노산의 적어도 약 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99% 또는 99.5%에서 동일함을 표시한다.
2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 2개의 서열들 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 측정은 하기 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다.
2개의 뉴클레오타이드 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지(http://www.gcg.com에서 입수 가능함)의 GAP 프로그램을 사용함으로써 측정될 수 있다. 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점 및 4의 갭 벌점을 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 혼입된, 문헌[E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)))의 알고리즘을 사용함으로써 측정될 수도 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지(http://www.gcg.com에서 입수 가능함)의 GAP 프로그램 내로 혼입된, 니들만과 분슈(Needleman and Wunsch)(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 공용 데이터베이스에 대한 검색을 수행하여, 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위한 "조회(query) 서열"로서 사용될 수도 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용함으로써 수행될 수 있다. NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어길이 = 12를 사용하여 BLAST 뉴클레오타이드 검색을 수행함으로써, 본 발명의 핵산 분자와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행함으로써, 본 발명의 단백질 분자와 동일한 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭을 가진 정렬을 수득하기 위해, 갭핑(Gapped) BLAST를 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭핑 BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
B. ILT4 항체 및 이의 항원 결합 단편
본원은 특정 기능적 특징 또는 특성을 특징으로 하는 신규 ILT4 항체(또는 이의 항원 결합 단편), 예를 들어, 인간화 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 항체(또는 단편)는 다음 특성들 중 하나 이상의 특성을 나타낸다:
a. ILT4 리간드(예를 들어, HLA-G 리간드)와 인간 ILT4의 결합을 차단하는 특성;
b. 인간 대식세포에 의한 사이토카인 또는 케모카인 방출을 향상시키거나 증가시키는 특성;
c. 대식세포에 대한 LPS 및 IFNγ의 활성화 효과를 강화시키는 특성;
d. M1 대식세포 분극화를 촉진하는 특성;
e. 10-9 M 이하의 평형 해리 상수 Kd, 또는 대안적으로 10+9 M-1 이상의 평형 결합 상수 Ka로 인간 ILT4에 결합하는 특성;
f. 다른 ILT 패밀리 구성원과의 교차반응성의 결여;
g. 사이노몰구스 ILT4와의 교차반응성; 및/또는
h. ILT4를 발현하는 종양 세포를 억제하는 특성.
예시적 ILT4 항체는 본원에 기재된 항체 7A3이다. 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7A3의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 9에 제시된 서열을 가진 항체 7A3의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 10에 제시된 서열을 가진 항체 7A3의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 1, 3 및 5에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 대안적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 2, 4 및 5에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 97, 98 또는 99에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 100, 101 또는 102에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 (a) 중쇄 가변 영역은 서열번호 9, 97, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, (b) 경쇄 가변 영역은 서열번호 10, 100, 101 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 9 및 10에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 예시적 ILT4 항체는 본원에 기재된 항체 7B1이다. 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7B1의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 19에 제시된 서열을 가진 항체 7B1의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 20에 제시된 서열을 가진 항체 7B1의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 11, 13 및 15에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 대안적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 12, 14 및 15에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 103, 104 또는 105에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 106, 107 또는 108에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 (a) 중쇄 가변 영역은 서열번호 19, 103, 104 및 105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, (b) 경쇄 가변 영역은 서열번호 20, 106, 107 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 19 및 20에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
항체 서열은 여러 항체의 컨센서스 서열일 수도 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 항원 결합 단편은 컨센서스 서열: G Y T (I,M) H(서열번호 21)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 항원 결합 단편은 컨센서스 서열: E R P G G S Q F I Y Y Y (P,A) (M,L) D Y(서열번호 22)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항원 결합 단편은 컨센서스 서열: R A S (A,E) N I Y S Y L A(서열번호 23)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 항원 결합 단편은 컨센서스 서열: N A (I,D) T L A E(서열번호 24)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 8을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
기재된 항체 각각이 인간 ILT4에 결합할 수 있다는 점을 고려하면, 본원에 기재된 VH 서열과 VL 서열은 "혼합되고 매칭"되어 다양한 ILT4 항체들 또는 이들의 항원 결합 단편을 생성할 수 있다. 이러한 "혼합되고 매칭된" 항체와 인간 ILT4의 결합은 당분야에 알려져 있고 실시예에 기재된 결합 어세이(예를 들어, ELISA)를 이용함으로써 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ILT4 항체 및 이의 항원 결합 단편은 표 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열과 경쇄 가변 영역 서열의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 ILT4 항체 및 이의 항원 결합 단편과 실질적으로 동일한 서열(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열)도 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9, 97, 98, 99, 19, 103, 104 또는 105, 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10, 100, 101, 102, 20, 106, 107 또는 108, 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 (a) 서열번호 9, 97, 98, 99, 19, 103, 104 또는 105, 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (b) 서열번호 10, 100, 101, 102, 20, 106, 107 또는 108, 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 이와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열, 및 서열번호 19 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 이와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 대안적으로, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 이와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열, 및 서열번호 20 또는 이와 적어도 80% 동일한(예를 들어, 이와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
다른 예시적 항체는 결합을 위해 본원에 기재된 임의의 ILT4 항체 또는 이의 단편과 경쟁하거나, 본원에 기재된 임의의 ILT4 항체 또는 이의 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 ILT4 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ILT4에 결합하기 위해 항체 7A3(또는 항체 7A3에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ILT4에 결합하기 위해 항체 7B1(또는 항체 7B1에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7A3(또는 항체 7A3에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 동일한 ILT4의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7B1(또는 항체 7B1에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 동일한 ILT4의 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 1, 3 및 5에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 대안적으로, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 2, 4 및 5에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 상기 언급된 서열과 적어도 80% 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 11, 13 및 15에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 대안적으로, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 12, 14 및 15에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 상기 언급된 서열과 적어도 80% 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
C. PD-L1 항체 및 이의 항원 결합 단편
본원은 예를 들어, 이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물에서 본 발명의 ILT4 항체 또는 항원 결합 단편과 함께 사용하기 위한 PD-L1 항체 및 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라, 치료 방법도 제공한다.
예시적 PD-L1 항체는 본원에 기재된 항체 7H7이다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7H7의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 77에 제시된 서열을 가진 항체 7H7의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 78에 제시된 서열을 가진 항체 7H7의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 29, 30 및 31에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 77 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 예시적 PD-L1 항체는 본원에 기재된 항체 1B3이다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 1B3의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 79에 제시된 서열을 가진 항체 1B3의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 80에 제시된 서열을 가진 항체 1B3의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 38, 39 및 40에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 79 및 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 예시적 PD-L1 항체는 본원에 기재된 항체 3B6이다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 3B6의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 81에 제시된 서열을 가진 항체 3B6의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 82에 제시된 서열을 가진 항체 3B6의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 41, 42 및 43에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 44, 45 및 46에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 81에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 82에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 81 및 서열번호 82에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 예시적 PD-L1 항체는 본원에 기재된 항체 8B1이다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 8B1의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 83에 제시된 서열을 가진 항체 8B1의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 84에 제시된 서열을 가진 항체 8B1의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 47, 48 및 49에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 50, 51 및 52에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 83에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 84에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 83 및 서열번호 84에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 예시적 PD-L1 항체는 본원에 기재된 항체 4A3이다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 4A3의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 85에 제시된 서열을 가진 항체 4A3의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 86에 제시된 서열을 가진 항체 4A3의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 53, 54 및 55에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 56, 57 및 58에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 85에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 86에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 85 및 서열번호 86에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 예시적 PD-L1 항체는 본원에 기재된 항체 9H9이다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 9H9의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 87에 제시된 서열을 가진 항체 9H9의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 서열번호 88에 제시된 서열을 가진 항체 9H9의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 서열 또는 이의 보존적 서열 변형을 가진 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 87에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 88에 제시된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 87 및 서열번호 88에 제시된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
항체 서열은 여러 항체의 컨센서스 서열일 수도 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 컨센서스 서열: (T,S)(S,Y,H)WMS(서열번호 167)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 168을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 169를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 170을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 171을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 172를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
본원에 기재된 PD-L1 항체 및 이의 항원 결합 단편과 실질적으로 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열도 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 87, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 88, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 78을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 80을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 81을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 82를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 83을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 84를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 85를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 86을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 서열번호 87을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 88을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
다른 예시적 항체는 결합을 위해 본원에 기재된 임의의 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하거나 본원에 기재된 임의의 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 PD-L1 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합하기 위해 항체 7H7(또는 항체 7H7에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 7H7(또는 항체 7H7에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합하기 위해 항체 1B3(또는 항체 1B3에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 1B3(또는 항체 1B3에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합하기 위해 항체 3B6(또는 항체 3B6에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 3B6(또는 항체 3B6에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합하기 위해 항체 8B1(또는 항체 8B1에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 8B1(또는 항체 8B1에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합하기 위해 항체 4A3(또는 항체 4A3에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 4A3(또는 항체 4A3에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)과 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합하기 위해 항체 9H9(또는 항체 9H9에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)와 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 9H9(또는 항체 9H9에 상응하는 중쇄 및 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 가진 항체)와 동일한 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, PD-L1 항원 결합 단편은 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 29, 30 및 31에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 78을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 38, 39 및 40에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 80을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 41, 42 및 43에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 44, 45 및 46에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 81을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 82를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 47, 48 및 49에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 50, 51 및 52에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 83을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 84를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 53, 54 및 55에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 56, 57 및 58에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 85를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 86을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 87을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 88을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 기능적 특징들 중 하나 이상의 특징을 가진다: (a) PD1과 PD-L1의 결합을 (예를 들어, 부분적으로 또는 완전히) 차단함, (b) NFAT 경로 활성화를 유도함, 및/또는 (c) 혼합된 림프구 반응을 유도함.
D. 결합제
본 발명의 ILT4 항체 또는 항원 결합 단편과 함께 사용하기 위한 추가 결합제(예를 들어, 리간드, 수용체/트랩 서열, 또는 항체 및 이의 항원 결합 단편)는 예를 들어, 면역 체크포인트 분자(예컨대, PD-1, PD-L1 CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, VISTA, AXL, ILT2 또는 ILT3), 면역 보조자극 분자(예컨대, CD27, CD40, 4-1BB, OX40 또는 GITR) 또는 종양 항원(예컨대, HER2, EGFR, ErB3 또는 CD24)에 결합하는 결합제를 포함한다. 예시적 결합제는 인간 PD-1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, PD-1 길항제를 포함한다. 예시적 PD-1 항체는 니볼루맙(nivolumab)(국제 특허 출원 공개 제WO 2006/121168호에서 5C4로서 지칭됨; BMS-936558, MDX-1106 또는 ONO-4538로서도 알려짐)이다. 구체적인 예시적 결합제는 PD-L1 및 PD-1 항체(또는 이의 항원 결합 단편), 예컨대, 두르발루맙(durvalumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(Keytruda®), 세미플리맙(cemiplimab)(Libtaylo®), 아벨루맙(avelumab)(Bavencio®), 두르발루맙(Imfinzi®) 및 아테졸리주맙(atezolizumab)(Tecentriq®)을 포함한다.
E. 이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물
본원은 제2 결합제, 예를 들어, 면역 체크포인트 분자(예컨대, PD-1, PD-L1 CTLA-4, LAG-3 TIGIT, TIM-3, VISTA, AXL, ILT2 또는 ILT3), 면역 보조자극 분자(예컨대, CD27, CD40, 4-1BB, OX40 또는 GITR) 또는 종양 항원(예컨대, HER2, EGFR, ErB3 또는 CD24)에 결합하는 제2 결합제에 연결된 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 구축물, 예를 들어, PD-L1 또는 PD-1 항체(또는 이의 항원 결합 단편)에 연결된 ILT4 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 포함하는 이중특이적 구축물도 제공한다. 다중특이적 구축물을 형성하기 위해 하나 이상의 추가 결합제에 연결된 이러한 이중특이적 구축물도 기재되어 있다.
"이중특이적" 또는 "이기능적" 구축물은 2개의 상이한 결합 도메인(예를 들어, 중쇄/경쇄) 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 가진 인공 하이브리드이다. 이중특이적 구축물은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 의미한다. 연결은 공유 또는 비공유 연결일 수 있다. 연결은 또한 유전적 연결(즉, 재조합적 융합)일 수 있다. 이러한 연결은 당분야에서 인정된 매우 다양한 기법들, 예컨대, 화학적 접합 및 재조합 단백질 제조를 이용함으로써 달성될 수 있다.
화학적 접합의 경우, 2개 이상의 모이어티, 특히 2개 이상의 항체들 또는 이들의 단편들을 함께 커플링하기에 적합한 시약 및 방법이 당분야에 알려져 있다. 다양한 커플링제 또는 가교연결제가 시판되고 있으며 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합시키는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 설포-SMCC, 단백질 A, 카르보이미드, 디말레이미드, 디티오-비스-니트로벤조산(DTNB) 및 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)를 포함한다. 설포-SMCC, SPDP 및 DTNB가 바람직한 작용제이고, 설포-SMCC가 특히 바람직하다. 가교연결제로 구성요소(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 가교연결하는 다른 적합한 절차는 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Karpovsky, B. et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686]; 문헌[Liu, M. A. et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:8648]; 미국 특허 제4,676,980호(Segal, D. M. and Perez, P.); 및 문헌[Brennan, M. (1986) Biotechniques 4:424]을 참조한다.
유전적 조작을 위해, 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 적절한 발현 벡터에 삽입할 수 있다. ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 작동 가능하게 연결(예를 들어, 인-프레임 클로닝)되도록 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자(들)도 동일한 발현 벡터에 삽입함으로써, 이중특이적 구축물인 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 생성할 수 있다. 바람직하게는, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 C-말단 영역에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 기재된 이중특이적 구축물을 제조하기 위한 다른 적합한 발현 벡터 및 클로닝 전략은 당분야에 알려져 있다.
숙주 세포에서 이중특이적 구축물을 발현시키기 위해, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 코딩 영역을 클로닝된 프로모터, 리더 서열, 번역 개시, 리더 서열, 불변 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화 및 전사 종결 서열과 조합하여 발현 벡터 구축물을 형성한다. 이러한 구축물을 사용하여, 예를 들어, 전체 길이 인간 IgG1κ 또는 IgG4κ 항체를 발현시킬 수 있다. 본원에 기재된 이중특이적 구축물에 사용되는 전체 인간 항체, 인간화 항체 및 키메라 항체는 IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM 및 IgD 항체도 포함한다. 다른 중쇄 이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 유사한 플라스미드를 구축할 수 있다.
이중특이적 구축물을 코딩하는 발현 벡터의 제조 후, 표준 형질감염 방법을 이용하여 숙주 세포에서 이중특이적 구축물을 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 국제 특허 출원 공개 제WO 87/04462호, 국제 특허 출원 공개 제WO 89/01036호 및 유럽 특허 제338841호에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당분야에 잘 알려진 다른 발현 시스템에 의해 사용된 바와 같이, 이중특이적 구축물을 코딩하는 핵산을 발현 벡터, 예컨대, 진핵 발현 플라스미드에 라이게이션시킬 수 있다. 클로닝된 이중특이적 구축물 유전자를 가진 정제된 플라스미드를 진핵 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포 또는 NSO 세포, 또는 대안적으로 다른 진핵 세포, 예컨대, 식물 유래 세포, 진균 또는 효모 세포에 도입할 수 있다. 이 유전자들을 도입하는 데 이용되는 방법은 당분야에 기재된 방법, 예컨대, 전기천공, 리포펙틴, 리포펙타민 등일 수 있다. 발현 벡터를 숙주 세포에 도입한 후, 이중특이적 구축물을 발현하는 세포를 확인하고 선택할 수 있다. 이 세포들은 그들의 발현 수준을 위해 증폭되고 규모확장되어 이중특이적 구축물을 생성할 수 있는 형질감염종(transfectoma)을 대표한다. 대안적으로, 이 클로닝된 이중특이적 구축물은 에스케리키아 콜라이(E. coli)와 같은 다른 발현 시스템 또는 완전한 유기체에서 발현될 수 있거나 합성적으로 발현될 수 있다. 재조합 이중특이적 구축물은 이 배양 상청액 및/또는 세포로부터 단리되고 정제될 수 있다.
화학적 접합에 의해 제조되든 아니면 유전적 조작에 의해 제조되든 관계없이, 본 발명의 이중특이적 구축물은 당분야에 잘 확립된 하나 이상의 단백질 정제 방법을 이용함으로써 단리되고 정제될 수 있다. 바람직한 단리 및 정제 방법은 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 등을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 특히 바람직한 방법은 예를 들어, 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피이다. 단리되고 정제된 이중특이적 구축물은 SDS-PAGE 분석과 같은 표준 방법을 이용함으로써 평가될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 유전적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학적으로 접합된다. 한 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 불변 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 이의 ILT4 항원 결합 단편은 scFv이다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 불변 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 이의 PD-L1 또는 PD-1 항원 결합 단편은 scFv이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물은 변형된 인간 Fc 도메인(예를 들어, 변형된 IgG1 Fc 도메인), 예를 들어, (a) 카바트(Kabat)에 제시된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 비천연 발생 아미노산 234A, 235Q 및 322Q 를 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인, (b) 카바트에 제시된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 비천연 발생 아미노산 252Y, 254T 및 256E를 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인, 및/또는 (c) 카바트에 제시된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 비천연 발생 아미노산 234A, 235Q 및 322Q를 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다.
예시적 이중특이적 구축물은 하기 표 2 및 3에 제시되어 있으며, 이때 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR 서열(표 2) 또는 가변 영역 서열(표 3)에 의해 정의된다.
본원은 상기 언급된 ILT4 및 PD-L1 서열(즉, CDR 및 가변 영역 서열)과 실질적으로 동일한 서열(예를 들어, 보존적 서열 변형을 가진 서열, 및/또는 상기 언급된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열)을 포함하는 이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물도 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물은 다음 특성들 중 하나 이상의 특성을 나타낸다:
a. ILT4 리간드(예를 들어, HLA-G 리간드)와 인간 ILT4의 결합을 차단하는 특성;
b. 인간 대식세포에 의한 사이토카인 또는 케모카인 방출을 향상시키거나 증가시키는 특성;
c. 대식세포에 대한 LPS 및 IFNγ의 활성화 효과를 강화시키는 특성;
d. M1 대식세포 분극화를 촉진하는 특성;
e. 10-9 M 이하의 평형 해리 상수 Kd, 또는 대안적으로 10+9 M-1 이상의 평형 결합 상수 Ka로 인간 ILT4에 결합하는 특성;
f. 다른 ILT 패밀리 구성원과의 교차반응성의 결여;
g. 사이노몰구스 ILT4와의 교차반응성; 및/또는
h. ILT4를 발현하는 종양 세포를 억제하는 특성.
F. 조성물
본원은 조성물, 예를 들어, 담체(예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체)와 함께 제제화된, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 또는 다중특이적 구축물 중 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물도 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "담체" 및 "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 염, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물(즉, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 또는 다중특이적 구축물)은 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 또는 다중특이적 구축물과 함께 사용될 수 있는 면역보강제(adjuvant)의 예는 프로인트(Freund) 불완전 면역보강제 및 완전 면역보강제(Difco Laboratories, 미시간주 디트로이트); 머크(Merck) 면역보강제 65(Merck and Company, Inc., 뉴저지주 라헤이); AS-2(SmithKline Beecham, 펜실베니아주 필라델피아); 알루미늄 염, 예컨대, 수산화알루미늄 겔(명반) 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 사이토카인, 예컨대, GM-CSF, 인터류킨-2, 인터류킨-7, 인터류킨-12 및 기타 유사한 인자; 3D-MPL; CpG 올리고뉴클레오타이드; 및 모노포스포릴 지질 A, 예를 들어, 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
MPL 면역보강제는 코릭사 코포레이션(Corixa Corporation)(워싱턴주 시애틀; 예를 들어, 미국 특허 제4,436,727호, 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조)으로부터 입수될 수 있다. CpG 함유 올리고뉴클레오타이드(CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되어 있지 않음)는 잘 알려져 있고, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 96/02555호 및 제WO 99/33488호, 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기재되어 있다. 면역자극 DNA 서열도 예를 들어, 문헌[Sato et al., Science 273:352, 1996]에 기재되어 있다.
추가 대안적 면역보강제는 예를 들어, Quil A와 같은 사포닌, 또는 QS21 및 QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc., 매사추세츠주 프레이밍햄)을 포함하는 이의 유도체; 에스신(Escin); 디지토닌(Digitonin); 또는 안개꽃(Gypsophila) 또는 명아주 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌; 몬타나이드(Montanide) ISA 720(Seppic, 프랑스); SAF(Chiron, 미국 캘리포니아주); ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron); SBAS 계열의 면역보강제(예를 들어, 벨기에 릭센사르트 소재의 스미스클라인 비참(SmithKline Beecham)으로부터 입수 가능한 SBAS-2 또는 SBAS-4); 디톡스(Detox)(Enhanzyn™)(Corixa, 몬타나주 해밀턴); RC-529(Corixa, 몬타나주 해밀턴) 및 다른 아미노알킬 글루코사미나이드 4-포스페이트(AGP); 국제 특허 출원 공개 제WO 99/52549A1호에 기재된 면역보강제와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 면역보강제; 합성 이미다조퀴놀린, 예컨대, 이미퀴모드[S-26308, R-837](Harrison, et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001); 및 레시퀴모드[S-28463, R-848](Vasilakos, et al., Cellular immunology 204: 64-74, 2000); 항원 제시 세포 및 T 세포 표면에서 항시적으로 발현되는 카르보닐 및 아민의 Schiff 염기, 예컨대, 투카레솔(tucaresol)(Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995); 예를 들어, 염증촉진성 사이토카인, 예컨대, 인터페론, GM-CSF, IL-1 알파, IL-1 베타, TGF-알파 및 TGF-베타, Th1 유도제, 예컨대, 인터페론 감마, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21, Th2 유도제, 예컨대, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13, 및 다른 케모카인 및 보조자극 유전자, 예컨대, MCP-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 및 CD40L을 포함하는 단백질 또는 펩티드로서의 사이토카인, 케모카인 및 보조자극 분자; CTLA-4 및 L-셀렉틴과 같은 리간드를 표적화하는 면역자극제, 아폽토시스 자극 단백질 및 펩티드, 예컨대, Fas; 합성 지질 기반 면역보강제, 예컨대, 백스펙틴(vaxfectin)(Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001), 스쿠알렌, 알파-토코페롤, 폴리소르베이트 80, DOPC 및 콜레스테롤; 내독소, [LPS](Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); Toll 수용체를 유발하여 Th1 유도 사이토카인을 생성하는 리간드, 예컨대, 합성 마이코박테리아 지단백질, 마이코박테리아 단백질 p19, 펩티도글리칸, 테이코산 및 지질 A; 및 CT(콜레라 독소, 서브유닛 A 및 B) 및 LT(에스케리키아 콜라이의 열 불안정성 장독소, 서브유닛 A 및 B), 열 충격 단백질 패밀리(HSP) 및 LLO(리스테리오라이신(listeriolysin) O, 국제 특허 출원 공개 제WO 01/72329호)를 포함한다. 이들 및 다양한 추가 Toll 유사 수용체(TLR) 아고니스트는 예를 들어, 문헌[Kanzler et al, Nature Medicine, May 2007, Vol 13, No 5]에 기재되어 있다.
"약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 원치 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다(예를 들어, 문헌[Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 무독성 무기산으로부터 유도된 염뿐만 아니라, 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐 치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 설폰산 및 방향족 설폰산 등과 같은 무독성 유기산으로부터 유도된 염도 포함한다. 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리 토금속으로부터 유도된 염뿐만 아니라, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 무독성 유기 아민으로부터 유도된 염도 포함한다.
본 발명의 조성물은 당분야에 알려진 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 당업자가 이해할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 활성 화합물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 신속 방출, 예컨대, 제어 방출 제제로부터 화합물을 보호할 담체를 사용함으로써 제조될 수 있다. 생분해 가능한 생체적합성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리젖산을 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 많은 방법들은 특허를 받았거나 당업자에게 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
특정 투여 경로로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나 화합물을 이러한 물질과 공투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 적절한 담체, 예를 들어, 리포좀 또는 희석제 중의 화합물을 대상체에게 투여할 수 있다. 허용되는 희석제는 식염수 및 수성 완충제 용액을 포함한다. 리포좀은 수중유중수 CGF 에멀젼뿐만 아니라 통상의 리포좀도 포함한다(Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당분야에 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물에 적합하지 않은 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물에서의 이의 사용은 예상된다. 보충 활성 화합물도 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균 상태이어야 하고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 앞서 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 필요한 양의 활성 화합물을 적절한 용매에 혼입시킨 후 멸균 미세여과를 수행함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 앞서 열거된 성분들 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 임의의 추가 원하는 성분으로 이루어진 분말을 이의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조(동결건조)이다.
최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 용량 용법을 조절한다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 여러 분할된 용량을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 의해 표시될 때 용량을 비례적으로 감소시킬 수 있거나 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 피하 또는 근육내 주사에 의해 매주 1회 또는 2회 투여될 수 있거나, 피하 또는 근육내 주사에 의해 매월 1회 또는 2회 투여될 수 있다.
투여의 용이성과 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 유닛 제형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 유닛 제형은 치료될 대상체를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 유닛을 의미하고; 각각의 유닛은 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정의 양의 활성 화합물을 필요한 약학 담체와 함께 함유한다. 본 발명의 유닛 제형에 대한 세부요건은 (a) 활성 화합물의 고유한 특성과 달성될 구체적인 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 내재된 한계에 의해 좌우되고 이들에 직접 의존한다.
약학적으로 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대, 구연산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 주석산, 인산 등을 포함한다.
치료 조성물의 경우, 본 발명의 제제는 경구, 비강, 국소(협측 및 설하를 포함함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 제제를 포함한다. 제제는 유닛 제형으로 편리하게 제공될 수 있으며, 약학 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체 및 구체적인 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이 양은 100% 중에서 약 0.001% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 30%의 활성 성분일 것이다.
질 투여에 적합한 본 발명의 제제는 당분야에서 적절하다고 알려진 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분무제 제제도 포함한다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 제형은 산제, 분무제, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에서 약학적으로 허용되는 담체 및 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
본원에서 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 일반적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 보조제, 예컨대, 보존제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기 멸균 절차, 및 다양한 항균제와 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 추가로, 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사용 약학 제형의 장기간 흡수를 달성할 수 있다.
본 발명의 화합물이 인간 및 동물에게 의약으로서 투여될 때, 이들은 단독으로 제공될 수 있거나, 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 예를 들어, 0.001% 내지 90%(보다 바람직하게는 0.005% 내지 70%, 예컨대, 0.01% 내지 30%)의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물로서 제공될 수 있다.
선택된 투여 경로와 관계없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 제형으로 제제화된다.
본 발명의 약학 조성물에서 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성을 야기하지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변경될 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용된 본 발명의 구체적인 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료의 지속시간, 사용되는 구체적인 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 잘 알려진 유사한 요인을 비롯한 다양한 약동학적 요인에 의해 좌우될 것이다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약학 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 수준보다 더 낮은 수준으로 약학 조성물에 사용된 본 발명의 화합물의 용량을 시작할 수 있고 원하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 전술된 요인에 의해 좌우될 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여인 것이 바람직하며, 바람직하게는 표적 부위에 인접하게 투여된다. 원하는 경우, 치료 조성물의 유효 1일 용량은 임의로 유닛 제형으로 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 별도로 투여되는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 하위용량으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 약학 제제(조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물은 당분야에 알려진 의료 장치에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 미국 특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 개시된 장치와 같은 무바늘 피하 주사 장치에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예는 제어된 속도로 의약을 분배하는 이식용 미세주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장치를 개시하는 미국 특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하는 의약 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 유동 이식용 주입 장치를 개시하는 미국 특허 제4,447,224호; 다중챔버 구획을 가진 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제4,439,196호; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제4,475,196호를 포함한다. 많은 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 생체내에서 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 친수성이 높은 많은 화합물들을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우) BBB를 횡단할 수 있게 하기 위해, 이 화합물을 예를 들어, 리포좀으로 제제화할 수 있다. 리포좀 제조 방법에 대해서는 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송됨으로써, 표적화 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴(예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호(Low et al.) 참조); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)(이의 다양한 종은 본 발명의 제제뿐만 아니라 발명된 분자의 구성요소도 포함할 수 있음); p120(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다(문헌[K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273] 또한 참조). 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀으로 제제화되고; 보다 바람직한 실시양태에서, 리포좀은 표적화 모이어티를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 리포좀 내의 치료 화합물은 종양 또는 감염에 인접한 부위에 볼루스 주사함으로써 전달된다. 조성물은 용이한 주사 가능성이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하며 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다.
암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 화합물의 억제 능력을 숙련된 기술자에게 알려진 어세이로 시험관내에서 조사함으로써 평가될 수 있다. 치료 유효량의 치료 화합물은 대상체에서 종양 크기를 감소시킬 수 있거나 다른 방식으로 증상을 완화할 수 있다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도, 및 선택된 구체적인 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인을 기반으로 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 멸균 상태이어야 하고 조성물이 주사기에 의해 전달될 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 물 이외에, 담체는 등장성 완충 식염수 용액, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아르산알루미늄 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
활성 화합물이 전술된 바와 같이 적합하게 보호되는 경우, 화합물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다.
G. 핵산
본원은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 및 다중특이적 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 단편, 이중특이적 구축물, 또는 다중특이적 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 발현 벡터의 형태로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 대상체 생체내에 투여될 때 항체 또는 이의 항원 단편, 이중특이적 구축물, 또는 다중특이적 구축물을 발현하는 발현 벡터의 형태로 존재한다.
한 실시양태에서, 핵산 분자는 항체 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 항체 가변 영역은 서열번호 9, 10, 19, 20, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 또는 108로 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열들 중 하나 이상의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 핵산 분자는 항체 쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 상기 쇄는 서열번호 25, 26, 27 또는 28로 나타낸 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한(예를 들어, 상기 언급된 서열들 중 하나 이상의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 9 및 10, 및 서열번호 19 및 20으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 언급된 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 25 및 26, 및 서열번호 27 및 28로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 언급된 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 그 자신에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하기 위한 것이다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 분절에 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 이때 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 일부 벡터는 그 자신이 도입되어 있는 숙주 세포에서 자율 복제를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 가진 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으므로, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 일부 벡터는 그 자신에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이므로 교환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 세포를 의미하기 위한 것이다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하기 위한 것임을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 일부 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
H. 조합 요법
본원에 기재된 임의의 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 및/또는 다중특이적 구축물은 추가 요법과 함께, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "공투여"는 투약 용법의 일부로서의 투여를 포함하는, 본원에 기재된 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 또는 다중특이적 구축물을 면역보강제 및 다른 작용제와 함께 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여하는 것 중 임의의 투여 또는 모든 투여를 포함한다. 예를 들어, 조합 요법은 본원에 기재된 임의의 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 및/또는 다중특이적 구축물을 적어도 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대, 소염제, DMARD(질환 변형 항-류마티스 약물), 면역억제제, 화학요법제, 방사선 요법, 다른 항체, 세포독소 및/또는 약물뿐만 아니라, 면역보강제, 면역자극제 및/또는 면역억제제와 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다.
종양의 치료에 있어서 본원에 기재된 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 및/또는 다중특이적 구축물과 공투여되기에 적합한 화학요법제는 예를 들어, 탁솔(taxol), 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 에티듐 브로마이드, 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론(mitoxantrone), 미쓰라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol) 및 퓨로마이신(puromycin), 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 추가 작용제는 예를 들어, 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캡토퓨린(mercaptopurine), 6-티오구아닌(thioguanine), 사이타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(decarbazine)), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine)(BSNU) 및 로무스틴(lomustine)(CCNU), 사이클로토스파마이드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴(cisplatin)), 안쓰라사이클린(anthracycline)(예를 들어, 다우노루비신(이전 명칭: 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전 명칭: 악티노마이신), 블레오마이신(bleomycin), 미쓰라마이신 및 안쓰라마이신(AMC)), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴) 및 테모졸로마이드(temozolomide)를 포함한다.
예를 들어, 면역 세포(예를 들어, 조절 T 세포, NKT 세포, 대식세포, 골수 유래 억제자 세포, 미성숙 또는 억제 수지상 세포)에 의한 면역억제 활성을 없애거나 억제하는 작용제, 또는 종양에 의해 생성되거나 종양의 국소 미세환경 내의 숙주 세포에 의해 생성된 억제 인자(예를 들어, TGFβ, 인돌아민 2,3 디옥시게나제 - IDO)도 본원에 기재된 결합 도메인, 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 및/또는 다중특이적 구축물과 함께 투여될 수 있다. 이러한 작용제는 항체 및 소분자 약물, 예컨대, IDO 억제제, 예컨대, 1 메틸 트립토판 또는 유도체를 포함한다.
이러한 면역 장애의 치료를 위해 본원에 기재된 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 및/또는 다중특이적 구축물과 공투여되기에 적합한 작용제는 예를 들어, 면역억제제, 예컨대, 라파마이신(rapamycin), 사이클로스포린(cyclosporin) 및 FK506; 항-TNF 작용제, 예컨대, 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab) 및 인플릭시맙(infliximab); 및 스테로이드를 포함한다. 특정 천연 스테로이드 및 합성 스테로이드의 예는 예를 들어, 알도스테론(aldosterone), 베클로메타손(beclomethasone), 베타메타손(betamethasone), 부데소나이드(budesonide), 클로프레드놀(cloprednol), 코르티손(cortisone), 코르티바졸(cortivazol), 데옥시코르톤(deoxycortone), 데소나이드(desonide), 데속시메타손(desoximetasone), 덱사메타손(dexamethasone), 디플루오로코르톨론(difluorocortolone), 플루클로롤론(fluclorolone), 플루메타손(flumethasone), 플루니솔라이드(flunisolide), 플루오시놀론(fluocinolone), 플루오시노나이드(fluocinonide), 플루오코르틴(fluocortin) 부틸, 플루오로코르티손(fluorocortisone), 플루오로코르톨론(fluorocortolone), 플루오로메톨론(fluorometholone), 플루란드레놀론(flurandrenolone), 플루티카손(fluticasone), 할시노나이드(halcinonide), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 이코메타손(icomethasone), 메프레드니손(meprednisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 파라메타손(paramethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 틱소코르톨(tixocortol) 및 트리암시놀론(triamcinolone)을 포함한다.
면역 반응의 유도 또는 향상을 위해 본원에 기재된 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 및/또는 다중특이적 구축물과 공투여되기에 적합한 작용제는 예를 들어, 면역보강제 및/또는 면역자극제를 포함하고, 이들의 비제한적인 예는 본원에 앞서 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 면역자극제는 폴리 IC와 같은 TLR3 아고니스트이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역자극제"는 항원 제시 세포(APC), 예컨대, 수지상 세포(DC) 및 대식세포를 자극할 수 있는 화합물들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 면역자극제는 APC의 성숙 과정이 가속화되고/되거나, APC의 증식이 증가되고/되거나, 보조자극 분자(예를 들어, CD80, CD86, ICAM-1, MHC 분자 및 CCR7) 및 염증촉진성 사이토카인(예를 들어, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-15 및 IFN-γ)의 동원 또는 방출이 상향조절되도록 APC를 자극할 수 있다. 적합한 면역자극제는 T 세포 증식을 증가시킬 수도 있다. 이러한 면역자극제는 CD40 리간드; FLT 3 리간드; IFN-α, IFN-β, IFN-γ 및 IL-2와 같은 사이토카인; G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자) 및 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니 자극 인자)와 같은 콜로니 자극 인자; CTLA-4 항체, PD-1 항체, 41BB 항체 또는 OX-40 항체; LPS(내독소); ssRNA; dsRNA; 바실 칼메트-게랑(Bacille Calmette-Guerin)(BCG); 레바미솔(Levamisole) 염산염; 및 정맥내 면역 글로불린을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 면역자극제는 Toll 유사 수용체(TLR) 아고니스트일 수 있다. 예를 들어, 면역자극제는 TLR3 아고니스트, 예컨대, 이중 가닥 이노신:사이토신 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 미국 펜실베니아주 소재의 헤미스페릭스 바이파마(Hemispherx Bipharma)로부터 Ampligen™으로서 입수될 수 있는 폴리 I:C, 또는 온코비르(Oncovir)로부터 입수될 수 있는 폴리 IC:LC) 또는 폴리 A:U; TLR4 아고니스트, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 RC-529(예를 들어, 영국 소재의 GSK로부터 입수될 수 있음); TLR5 아고니스트, 예컨대, 플라겔린(flagellin); TLR7 또는 TLR8 아고니스트, 예컨대, 이미다조퀴놀린 TLR7 또는 TLR8 아고니스트, 예를 들어, 이미퀴모드(예를 들어, Aldara™) 또는 레시퀴모드 및 관련 이미다조퀴놀린 작용제(예를 들어, 3M 코포레이션(Corporation)으로부터 입수될 수 있음); 또는 TLR9 아고니스트, 예컨대, 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 가진 데옥시뉴클레오타이드(예를 들어, 콜리 파마슈티칼(Coley Pharmaceutical)로부터 입수될 수 있는 소위 "CpG")일 수 있다. 이러한 면역자극제는 본원에 기재된 항체, 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물 및/또는 다중특이적 구축물과 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
I. 본 발명의 용도 및 방법
본원은 본원에 기재된 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 조성물을, 면역 반응의 유도 또는 향상, 또는 암 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써, 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법 및 암을 치료하는 방법도 제공한다.
용어 "면역 반응을 유도하는" 및 "면역 반응을 향상시키는"은 교환 가능하게 사용되며 특정 항원에 대한 면역 반응(즉, 수동 또는 적응)의 자극을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 본원에 기재된 치료적 또는 예방적 조치를 의미한다. "치료" 방법은 장애 또는 재발성 장애의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치유하거나, 지연시키거나, 중증도를 감소시키거나 완화하기 위해, 또는 대상체의 생존을 이러한 치료의 부재 하에서 예상된 생존을 넘어서는 수준으로 연장하기 위해 본원에 기재된 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 조성물을, 이러한 치료가 필요한 대상체, 예를 들어, 특정 항원에 대한 향상된 면역 반응이 필요한 대상체, 또는 궁극적으로 이러한 장애를 획득할 수 있는 대상체에게 투여하는 단계를 이용한다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 복용량"은 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로서 정의된다. 용어 "치료 유효 용량"은 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로서 정의된다. 이 용도에 효과적인 양은 치료되는 장애의 중증도 및 환자 자신의 면역 시스템의 일반적인 상태에 의해 좌우될 것이다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, (예를 들어, 세포를 언급할 때) 용어 "생장을 억제한다"는 임의의 측정 가능한 세포 생장의 감소, 예를 들어, 세포 생장의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100% 억제를 포함하기 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 (예를 들어, 항원에 대한) 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법으로서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물 중 어느 하나를, 대상체에서 (예를 들어, 항원에 대한) 면역 반응을 유도하거나 향상시키기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물 중 어느 하나를, 질병 또는 질환을 치료하기에 효과적인 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나를 또 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 본원에 기재된 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나와 함께 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 별도로 투여된다. 한 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 순차적으로 투여된다. 예를 들어, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 먼저 투여된 후(예를 들어, 직후)에 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여될 수 있거나, 그 반대의 경우가 가능하다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 함께 투여된다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동시에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 제제로 동시에 투여된다. 대안적으로, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 별도의 투여를 위해 제제화되고 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 이러한 동시 또는 순차적 투여는 바람직하게는 두 항체가 치료된 환자에 동시에 존재하게 한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 본원에 기재된 임의의 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 투여하는 것은 어느 한 항체 단독의 사용에 비해 (예를 들어, 생체내에서 면역 반응을 향상시키는 데 있어서) 상승작용적 효과를 생성한다.
대상체는 예를 들어, 면역 반응의 자극이 요구되는 질병 또는 질환을 앓고 있는 대상체일 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 질병 또는 질환은 암이다. 암의 유형은 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수모세포 전골수구 골수단핵구성 단핵구 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 버킷 림프종 및 변연부 B 세포 림프종, 진성 적혈구증가증 림프종, 호지킨병, 비호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 고형 종양, 육종 및 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 육종, 대장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간종, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 비소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 비인두 암종, 식도 암종, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 중추신경계(CNS) 암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장직장암, 결합 조직 암, 소화기계의 암, 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암, 상피내 신생물, 신장암, 후두암, 간암, 폐암(소세포, 대세포), 흑색종, 신경모세포종; 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두), 난소암, 췌장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암; 호흡기계의 암, 육종, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 및 비뇨기계의 암을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 암은 만성 림프구성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 버킷 림프종 및 변연부 B 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 ILT4 발현 종양을 포함한다. 다른 질환 징후는 박테리아, 진균, 바이러스 및 기생충 감염성 질환을 포함한다.
본원에 기재된 대상체에서 (예를 들어, 항원에 대한) 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법은 항원을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질, 예컨대, 단백질, 펩티드, 합텐, 다당류 및/또는 지질을 의미한다. 본원에 기재된 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 조성물과 항원은 동시에 투여될 수 있거나, 대안적으로 상기 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 조성물은 항원이 투여되기 전 또는 후에 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 조성물은 백신 항원, 예를 들어, 종양 항원에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해(이로써 종양에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해), 또는 감염성 질환 병원체의 항원에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해(이로써 감염성 질환 병원체에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해) 백신과 함께 투여된다. 따라서, 한 실시양태에서, 백신 항원은 예를 들어, 종양 또는 감염성 질환 병원체, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 포함할 수 있다. 항원 또는 항원들, 예컨대, 본원에 앞서 개시된 다양한 종양 항원들은 종양으로부터 유래할 수 있다. 대안적으로, 항원 또는 항원들은 바이러스, 박테리아, 기생충 및/또는 진균과 같은 병원체로부터 유래할 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물과 함께 공투여될 바람직한 항원은 종양 항원 및 백신 항원(예를 들어, 백신접종 목적으로 대상체에서 보호 면역을 일으키고자 하는 박테리아, 바이러스 또는 다른 병원체 항원)을 포함한다. 적합한 병원체 항원의 추가 예는 EGFR, EGFRvIII, gp100 또는 Pmel17, HER2/neu, 메소텔린, CEA, MART1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MUC-1, GPNMB, HMW-MAA, TIM1, ROR1, CD19 및 생식세포 유래 종양 항원의 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 포함하나 이들로 제한되지 않는 종양 관련 항원(TAA)을 포함한다.
다른 적합한 항원은 바이러스 질환의 예방 또는 치료를 위한 바이러스 항원을 포함한다. 바이러스 항원의 예는 HIV-1 env, HBsAg, HPV, FAS, HSV-1, HSV-2, p17, ORF2 및 ORF3 항원을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 또한, 바이러스 항원 또는 항원성 결정인자는 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(특히 인간, 예컨대, gB 또는 이의 유도체); 엡스타인 바 바이러스(예컨대, gp350); 플라비바이러스(예를 들어, 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스); 간염 바이러스, 예컨대, B형 간염 바이러스(예를 들어, B형 간염 표면 항원, 예컨대, EP-A-414 374; EP-A-0304 578 및 EP-A-198474에 기재된 PreS1, PreS2 및 S 항원), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스; HIV-1(예컨대, tat, nef, gpl20 또는 gpl60); 인간 헤르페스 바이러스, 예컨대, gD 또는 이의 유도체 또는 즉시 초기 단백질, 예컨대, HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27; 인간 유두종 바이러스(예를 들어, HPV6, HPV11, HPV16, HPV18); 인플루엔자 바이러스(전체 생바이러스 또는 불활성화된 바이러스, 난자 또는 MDCK 세포 또는 Vero 세포에서 생장된 분할 인플루엔자 바이러스, 또는 전체 독감 비로좀(문헌[Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920]에 기재됨), 또는 이들의 정제된 또는 재조합 단백질, 예컨대, NP, NA, HA 또는 M 단백질); 홍역 바이러스; 볼거리 바이러스; 파라인플루엔자 바이러스; 광견병 바이러스; 호흡기 세포융합 바이러스(예컨대, F 및 G 단백질); 로타바이러스(약독화된 생바이러스를 포함함); 천연두 바이러스; 수두 대상포진 바이러스(예컨대, gpI, II 및 IE63); 및 자궁경부암의 원인인 HPV 바이러스(예를 들어, HPV16으로부터의 단백질 D-E6 또는 E7 융합체를 형성하기 위해 단백질 D 담체와 융합된 초기 단백질 E6 또는 E7, 또는 이들의 조합; 또는 E6 또는 E7과 L2의 조합(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 96/26277호 참조))로부터 유래할 수 있다.
박테리아 항원의 예는 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii) 또는 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 박테리아 항원은 박테리아 질환, 예컨대, 탄저병, 보툴리누스중독증, 파상풍, 클라미디아, 콜레라, 디프테리아, 라임병, 매독 및 결핵의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 박테리아 항원 또는 항원성 결정인자는 예를 들어, 바실러스 안쓰라시스(B. anthracis)(예컨대, 보툴리눔 독소)를 포함하는 바실러스(Bacillus) 종; 보르데텔라 퍼투시스(B. pertussis)(예를 들어, 퍼탁틴(pertactin), 백일해 독소, 섬유상 헤마글루티닌, 아데닐레이트 사이클라제, 핌브리아(fimbriae))를 포함하는 보르데텔라(Bordetella) 종; 보렐리아 부르그도르페리(B. burgdorferi)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 가리니이(B. garinii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 아프젤리이(B. afzelii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 안데르소니이(B. andersonii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 보렐리아 헤름시이(B. hermsii)를 포함하는 보렐리아(Borrelia) 종; 캄필로박터 제주니(C. jejuni)(예를 들어, 독소, 어드헤신 및 인바신) 및 캄필로박터 콜라이(C. coli)를 포함하는 캄필로박터(Campylobacter) 종; 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis)(예를 들어, MOMP, 헤파린 결합 단백질), 클라미디아 뉴모니에(C. pneumonie)(예를 들어, MOMP, 헤파린 결합 단백질), 클라미디아 피타시(C. psittaci)를 포함하는 클라미디아(Chlamydia) 종; 클로스트리듐 테타니(C. tetani)(예컨대, 파상풍 독소), 클로스트리듐 보툴리눔(C. botulinum)(예를 들어, 보툴리눔 독소), 클로스트리듐 디피사일(C. difficile)(예를 들어, 클로스트리듐 독소 A 또는 B)를 포함하는 클로스트리듐(Clostridium) 종; 코리네박테리움 디프테리아(C. diphtheriae)(예를 들어, 디프테리아 독소)를 포함하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종; 에를리히아 에퀴(E. equi) 및 인간 과립구성 에를리히증(Granulocytic Ehrlichiosis)의 병원체를 포함하는 에를리히아(Ehrlichia) 종; 리케차 리케치(R. rickettsii)를 포함하는 리케차(Rickettsia) 종; 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis), 엔테로코커스 패시움(E. faecium)을 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus) 종; 장독성 에스케리키아 콜라이(E. coli)(예를 들어, 콜로니화 인자, 열 불안정성 독소 또는 이의 유도체, 또는 열 안정성 독소), 장출혈성 에스케리키아 콜라이, 장병원성 에스케리키아 콜라이(예를 들어, 시가(shiga) 독소 유사 독소)를 포함하는 에스케리키아(Escherichia) 종; 헤모필루스 인플루엔자(H. influenzae) B형(예를 들어, PRP), 유형화 불가능한 헤모필루스 인플루엔자, 예를 들어, OMP26, 고분자량 어드헤신, P5, P6, 단백질 D 및 지단백질 D, 및 핌브린(fimbrin) 및 핌브린 유래 펩티드를 포함하는 헤모필루스(Haemophilus) 종(예를 들어, 미국 특허 제5,843,464호 참조); 헬리코박터 파이로리(H. pylori)(예를 들어, 우레아제, 카탈라제, 액포화 독소)를 포함하는 헬리코박터(Helicobacter) 종; 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa)를 포함하는 슈도모나스(Pseudomonas) 종; 레지오넬라 뉴모필라(L. pneumophila)를 포함하는 레지오넬라(Legionella) 종; 렙토스피라 인터로간스(L. interrogans)를 포함하는 렙토스피라(Leptospira) 종; 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes)를 포함하는 리스테리아(Listeria) 종; 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis)로서도 알려져 있는 모락셀라 카타랄리스(M. catarrhalis)(예를 들어, 고분자량 및 저분자량 어드헤신 및 인바신)를 포함하는 모락셀라(Moraxella) 종; 모렉셀라 카타랄리스(Morexella Catarrhalis)(이의 외막 소포 및 OMP106을 포함함(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제W097/41731호 참조)); 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis)(예를 들어, ESAT6, 항원 85A, 85B 또는 85C), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 레프라(M. leprae), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 파라투버쿨로시스(M. paratuberculosis), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 종; 네이세리아 고노레아(N. gonorrhea) 및 네이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis)(예를 들어, 피막 다당류 및 이의 접합체, 트랜스페린 결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 어드헤신)를 포함하는 네이세리아(Neisseria) 종; 네이세리아 멘기티디스(Neisseria mengitidis) B(이의 외막 소포 및 NspA를 포함함(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 96/29412호 참조)); 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 파라티피(S. paratyphi), 살모넬라 콜레라수이스(S. choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis)를 포함하는 살모넬라(Salmonella) 종; 쉬겔라 소네이(S. sonnei), 쉬겔라 디센테리아(S. dysenteriae), 쉬겔라 플렉스네리이(S. flexnerii)를 포함하는 쉬겔라(Shigella) 종; 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(S. epidermidis)를 포함하는 스타필로코커스(Staphylococcus) 종; 스트렙토코커스 뉴모니에(S. pneumonie)(예를 들어, 피막 다당류 및 이의 접합체, PsaA, PspA, 스트렙토라이신, 콜린 결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴몰라이신을 포함하는 스트렙토코커스(Streptococcus) 종(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenes, 25, 337-342), 및 이들의 돌연변이체 해독된 유도체(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 90/06951호 및 제WO 99/03884호 참조); 트레포네마 팔리둠(T. pallidum)(예를 들어, 외막 단백질), 트레포네마 덴티콜라(T. denticola), 트레포네마 하이오디센테리아(T. hyodysenteriae)를 포함하는 트레포네마(Treponema) 종; 비브리오 콜레라(V. cholera)(예를 들어, 콜레라 독소)를 포함하는 비브리오(Vibrio) 종; 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica)(예를 들어, Yop 단백질), 예르시니아 페스티스(Y. pestis), 예르시니아 슈도투버쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)를 포함하는 예르시니아(Yersinia) 종으로부터 유래할 수 있다.
기생충/진균 항원 또는 항원성 결정인자는 예를 들어, 바베시아 마이크로티(B. microti)를 포함하는 바베시아(Babesia) 종; 칸디다 알비칸스(C. albicans)를 포함하는 칸디다(Candida) 종; 크립토코커스 네오포르만스(C. neoformans)를 포함하는 크립토코커스(Cryptococcus) 종; 엔타모에바 히스톨라이티카(E. histolytica)를 포함하는 엔타모에바(Entamoeba) 종; 기아르디아 람블리아(G. lamblia)를 포함하는 기아르디아(Giardia) 종; 레쉬마니아 메이저(L. major)를 포함하는 레쉬마니아(Leshmania) 종; 플라스모듐 파시파룸(Plasmodium. faciparum)(MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 세퀘스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230, 및 플라스미듐 종에서의 이들의 유사체); 뉴모사이스티스 카리니이(P. carinii)를 포함하는 뉴모사이스티스(Pneumocystis) 종; 스키소스토마 만소니(S. mansoni)를 포함하는 스키소스토마(Schisostoma) 종; 트리코모나스 바지날리스(T. vaginalis)를 포함하는 트리코모나스(Trichomonas) 종; 톡소플라스마 곤디이(T. gondii)를 포함하는 톡소플라스마(Toxoplasma) 종(예를 들어, SAG2, SAG3, Tg34); 트리파노소마 크루지(T. cruzi)를 포함하는 트리파노소마(Trypanosoma) 종으로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 이 측면에 따라 항원 및 항원성 결정인자는 많은 상이한 형태로 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 항원 또는 항원성 결정인자는 (예를 들어, 소위 "서브유닛 백신"에서) 단리된 단백질 또는 펩티드로서 존재할 수 있거나, (예를 들어, 살아있거나 사멸된 병원체 균주에서) 예를 들어, 세포 관련 또는 바이러스 관련 항원 또는 항원성 결정인자로서 존재할 수 있다. 살아있는 병원체는 바람직하게는 알려진 방식에 의해 약독화될 것이다. 대안적으로, 항원 또는 항원성 결정인자는 (소위 "DNA 백신접종"에서와 같이) 항원 또는 항원성 결정인자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 사용에 의해 대상체 내의 제자리에서 생성될 수 있지만, 이 접근법과 함께 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드는 DNA로 제한되지 않고 앞서 논의된 바와 같이 RNA 및 변형된 폴리뉴클레오타이드도 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
한 실시양태에서, 백신 항원은 또한 예를 들어, 특정 세포 유형 또는 특정 조직으로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 백신 항원은 예를 들어, 항원 제시 세포(APC) 표면 수용체, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 2009/061996호(Celldex Therapeutics, Inc)에 논의된 DEC-205, 또는 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 03040169호(Medarex, Inc.)에 논의된 만노스 수용체(CD206)로 표적화되는 항체와 같은 작용제의 사용에 의해 APC로 표적화될 수 있다.
J. 키트
임의로 사용 설명서와 함께, 본원에 기재된 하나 이상의 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 구축물, 다중특이적 구축물 또는 조성물을 포함하는 키트(예를 들어, 진단 키트)도 제공한다. 키트는 정보제공 팜플렛, 예를 들어, 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해 시약을 사용하는 방법을 알려주는 팜플렛도 포함할 수 있다. 용어 "팜플렛"은 키트 위에 또는 키트와 함께 제공되거나 키트를 동반하는 임의의 서면, 마케팅 자료 또는 기록된 자료를 포함한다.
본 발명은 추가 제한으로서 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 더 예시된다. 본원 전반에 걸쳐 인용된 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참고로 명시적으로 포함된다.
V. 실시예
실시예 1: 뮤린 항체의 생성
BALB/c 마우스를 가용성 인간 ILT4 항원으로 예방접종하여 뮤린 ILT4 단클론 항체를 생성하였다. 사용된 항원은 HIS 태그(R&D Systems® 또는 AcroBiosystems®)와 함께 ILT4 세포외 도메인을 포함하는 가용성 융합 단백질이었다. 항원(즉, PBS 중의 5 내지 20 마이크로그램 가용성 재조합 ILT4 항원)을 MPL + TDM 면역보강제 시스템(Sigma®)과 1:1 비로 혼합하였다. 200 마이크로리터의 제조된 항원을 대략 14일마다 마우스의 복막강에 주사하였다. 융합 3일 내지 4일 전에 1 내지 10 마이크로그램의 가용성 재조합 ILT4 항원의 정맥내 주사를, 항-ILT4 역가를 발생시킨 동물에게 제공하였다. 마우스 비장을 수거하고, 단리된 비장세포를 하이브리도마 제조에 사용하였다.
10% FBS를 함유하는 RPMI 1640(Invitrogen®)에서 배양된 P3x63Ag8.653 뮤린 골수종 세포주(ATCC CRL 1580)를 융합에 사용하였다. 최대 10% 하이브리도마 클로닝 보충제(Sigma), 10% FBS(Sigma), L-글루타민(Gibco®), 0.1% 젠타마이신(Gibco) 및 2-머캡토에탄올(Gibco)을 포함하는 추가 배지 보충제를, HAT(Sigma; 1.0 x 104 M 하이포잔틴, 4.0 x 10-7 M 아미노프테린, 1.6 x 10-5 M 티미딘) 배지와 함께 하이브리도마 생장 배지에 첨가하였다.
6:1 비로 비장 세포를 P3x63Ag8.653 골수종 세포와 혼합하고 원심분리로 펠릿화하였다. 융합을 촉진하기 위해 조심스럽게 혼합하면서 폴리에틸렌 글리콜을 적가하였다. 눈에 보이는 콜로니가 확립될 때까지 2주 내지 3주 동안 하이브리도마를 배양하였다. 상청액을 수거하고 인간 가용성 ILT4 융합 단백질을 사용한 ELISA 및 마우스 Fc 특이적 검출을 통해 마우스 IgG에 대해 초기 스크리닝하는 데 사용하였다. 그 다음, 유세포분석을 통해 ILT4 특이성에 대해 IgG 양성 상청액을 어세이하였다. 사이노몰구스 마카크(macaque) ILT4와의 교차반응성에 대해서도 하이브리도마를 스크리닝하였고, 모두가 결합에 대해 양성이었다.
하이브리도마 세포를 증폭시키고 RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포 펠릿을 냉동시켰다. 상응하는 하이브리도마의 RNA를 사용하여 인간 단일클론 항체의 VH 및 VL 코딩 영역을 확인하였다. RNA를 cDNA로 역전사시키고, V 코딩 영역을 PCR로 증폭시키고, PCR 생성물을 시퀀싱하고, 인간 IgG4 벡터에 삽입하고, IgG4 키메라 항체로서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 특히 관심 있는 2개의 항체를 단리하였고, 이들의 가변 영역 서열을 7A3(서열번호 9 및 10) 및 7B1(서열번호 19 및 20)로서 명명하였다.
실시예 2: 인간화 항체의 생성
실시예 1의 항체 7A3 및 7B1의 모 중쇄 및 경쇄 가변 영역 도메인(즉, VH 및 VL 도메인)의 컴퓨터 모델을 생성하였고 인간화 과정을 안내하는 데 사용하였다. 항체 7A3 및 7B1의 원래 마우스 가변 서열을 모든 인간 생식세포계열 서열에 정렬하였다. 원래 마우스 및 가장 일치하는 생식세포계열 서열을 서열 불안정성에 대해 분석하였고 가장 적절한 생식세포계열 프레임워크를 선택하였다. 모 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 적절한 수의 인간 프레임워크에 이식하였고 필요에 따라 역 돌연변이를 도입하였다.
항체 7A3에 대해 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄 인간화 변이체를 설계하였다. 7A3 중쇄 변이체를 7A3-H1(서열번호 97), 7A3-H2(서열번호 9), 7A3-H3(서열번호 98) 및 7A3-H4(서열번호 99)로 명명하였다. 7A3 경쇄 변이체를 7A3-L1(서열번호 10), 7A3-L2(서열번호 100), 7A3-L3(서열번호 101) 및 7A3-L4(서열번호 102)로 명명하였다.
항체 7B1에 대해 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄 인간화 변이체를 설계하였다. 7B1 중쇄 변이체를 7B1-H1(서열번호 103), 7B1-H2(서열번호 19), 7B1-H3(서열번호 104) 및 7B1-H4(서열번호 105)로 명명하였다. 7B1 경쇄 변이체를 7B1-L1(서열번호 20), 7B1-L2(서열번호 106), 7B1-L3(서열번호 107) 및 7B1-L4(서열번호 108)로 명명하였다. 이 가변 도메인 서열들의 페어링은 표 4에 제시되어 있다. 항체 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21을 단백질 A 정제하였고, 이들의 Fc 도메인을 돌연변이시켰고(AQQ), 이하에 기재된 바와 같이 추가 조사를 위해 선택하였다.
실시예 3: 생물층 간섭측정(BLI)에 의한 인간화 단일클론 항체의 친화성 및 속도 상수의 측정
제조업체의 지침에 따라 Octet™ QKe 기기(ForteBio Sartorius®, 캘리포니아주 프레몬트)를 사용하여 생물층 간섭측정(BLI)으로 다양한 인간화 ILT4 항체의 결합 친화성 및 결합 동역학을 조사하였다.
정제된 키메라 항체(7A3-huG4 및 7B1-huG4) 및 인간화 항체(7A3 VH6-L17, 7A3 VH6-L18, 7A3 VH6-L20, 7B1 VH10-L21, 7B1 VH10-L22 및 7B1 VH10-L24)를 항-인간 Fc 포획(AHC) 바이오센서(Fortebio 제품번호 18-5060)에 포획하였다. 각각의 항체를 희석 완충제(10 mM PO4 + 150 mM NaCl + 1 mg/㎖ BSA + 0.05% Tween 20, pH 7.2)에서 0.5 ㎍/㎖로 제조하였고, 30℃에서 1000 rpm 플레이트 진탕 속도로 새로 수화된 사전컨디셔닝 AHC 바이오센서에 300초 동안 로딩하였다. 한 어세이를 위해, 8개의 바이오센서를 동일한 항체로 로딩하였다.
항체가 로딩된 바이오센서 중 7개의 바이오센서를 피분석물인 가용성 인간 ILT4-HIS(His 태그가 부착된 ILT4 세포외 도메인)에 노출시켜 결합을 확인하였다. 희석 완충제에 의해 25 nM부터 0.4 nM까지 2배 연속 희석된 피분석물의 희석물을 30℃에서 1000 rpm 플레이트 진탕 속도로 사용하여 친화성 측정을 확인하였다. 피분석물 웰에서 항체가 로딩된 바이오센서의 결합을 300초 동안 수행한 다음, 해리 측정을 위해 1500초 동안 바이오센서를 희석 완충제 웰로 이동시켰다.
결합 및 해리 단계를 위해 포획된 항체를 가진 나머지 바이오센서를 희석 완충제에서 유지함으로써 각각의 경우에 상응하는 대조군을 수행하였다. 대조군 바이오센서에 대한 데이터를 사용하여, 배경을 차감하고 바이오센서 표류(drift) 및 바이오센서로부터의 항체 해리를 해결하였다.
포르테바이오(Fortebio)의 데이터 분석 소프트웨어 버전 10.0.3.1(ForteBio Sartorius, 캘리포니아주 프레몬트)을 각각의 경우에 사용하여, 포획된 항체에 결합하는 희석 완충제 중의 피분석물의 농도 시리즈로부터 동역학 파라미터를 유도하였다. 제조업체의 지침에 따라 상기 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결합 및 해리 곡선을 1:1 결합 모델에 피팅하였다.
측정된 친화성 및 동역학 파라미터(배경이 차감됨)는 도 1a 및 1b에 제시되어 있고, 이때 kon = 결합 속도, kdis = 해리 속도, 및 KD = 비 kdis/kon에 의해 결정된 친화성 상수. 대표적인 트레이스는 도 2에 제시되어 있다.
실시예 4: ELISA를 사용한 키메라 및 인간화 단일클론 항체와 인간 ILT4의 결합
마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 재조합 인간 ILT4-카파로 코팅한 후, PBS 중의 5% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 단백질 A 정제된 키메라 단일클론 항체(7A3-huG4, 7B1-huG4), 이들의 여러 인간화 버전(7A3 VH6-L17, 7A3 VH6-L18, 7A3 VH6-L20, 7B1 VH10-L21, 7B1 VH10-L22 및 7B1 VH10-L24) 및 이소타입 대조군을 다양한 농도로 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음, 37℃에서 호스라디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 다중클론 시약과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP 기질로 현상하고 마이크로타이터 플레이트 판독기를 이용하여 OD 450에서 분석하였다. 대표적인 결합 곡선은 도 3a 및 3b에 제시되어 있다.
실시예 5: 키메라 및 인간화 단일클론 항체와, 인간 ILT4를 발현하는 세포의 결합
표면에서 인간 ILT4를 발현하는 인간 HEK293 세포주와의 결합에 대해 항체를 시험하였다. 단백질 A 정제된 키메라 단일클론 항체(7A3-huG4, 7B1-huG4), 다양한 인간화 버전(7A3 VH6-L17, 7A3 VH6-L18, 7A3 VH6-L20, 7B1 VH10-L21, 7B1 VH10-L22 및 7B1 VH10-L24) 및 이소타입 대조군을, 실온에서 플레이트 진탕기 상에서 인간 ILT4를 발현하는 HEK293 세포와 함께 인큐베이션하였다. 20분 후, 세포를 0.1% BSA 및 0.05% NaN3(PBA)이 함유된 PBS로 세척하고, 세포를 PE 표지가 부착된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 프로브와 함께 인큐베이션함으로써, 결합된 항체를 검출하였다. PBA를 사용하여 과량의 프로브를 세포로부터 세척하고, 제조업체의 지침에 따라 FACSCanto II™ 기기(BD Biosciences, 미국 뉴저지주)를 이용하여 분석함으로써 세포 관련 형광을 측정하였다. 대표적인 결합 곡선은 도 4a 및 4b에 제시되어 있다.
실시예 6: 대식세포에서 키메라 및 인간화 단일클론 항체에 의한 TNF-α 생성의 유도
대식세포를 다음과 같이 인간 단핵구로부터 유도하였다: PBMC를 T175 cm2 플라스크에 첨가하고 단핵구를 37℃ 및 6% CO2에서 약 2시간 동안 부착시켰다. 비-부착성 세포를 제거하고 단핵구를 10% FBS 및 50 ng/㎖ M-CSF(R&D Systems®)가 함유된 RPMI에서 7일 동안 배양하였다.
그 다음, 37℃ 및 6% CO2에서 세포를 단백질 A 정제된 키메라 단일클론 항체(7A3-huG4, 7B1-huG4), 이들의 인간화 버전(7A3 VH6-L17, 7A3 VH6-L18, 7A3 VH6-L20, 7B1 VH10-L21, 7B1 VH10-L22 및 7B1 VH10-L24) 및 이소타입 대조군, 및 50 ng/㎖ LPS(Invivogen)의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 수거하고 상청액을 모아 사이토카인 분석을 위해 저장하였다. 모은 상청액에서 TNF-α의 유도를 ELISA(R&D Systems)로 평가하였다. 도 5a 및 5b는 다양한 ILT4 항체에 의한 TNF-α 생성의 증가를 보여준다.
실시예 7: 대식세포에서 인간화 단일클론 항체에 의한 TNF-α 및 MIP1-γ 생성의 유도
인간 PBMC를 MCSF(100 ng/㎖)로 7일 동안 분화시켰다. 분화 후, 인간 대식세포를 1.5x106개 세포/웰로 플레이팅하고 밤새 부착시켰다. 다음날, 배지를 제거하고 세포를 LPS(10 ng/㎖) 또는 IFNγ(10 ng/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 24시간 동안 단일클론 항체(100 nM)로 처리하였다. 처리 후, 컨디셔닝된 상청액을 제거하고 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 TNF-α 및 MIP1-α(R&D Systems)에 대해 ELISA를 실행할 준비가 될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 실험을 삼중으로 수행하였다. 결과는 도 6a 내지 6f에 제시되어 있다.
실시예 8: 대식세포에서의 인간화 단일클론 항체의 유전자 발현 분석
인간 PBMC를 MCSF(100 ng/㎖)로 7일 동안 분화시켰다. 분화 후, 인간 대식세포를 1.5x106개 세포/웰로 플레이팅하고 밤새 부착시켰다. 다음날, 배지를 제거하고, 세포를 LPS(10 ng/㎖)의 존재 하에서 24시간 동안 단일클론 항체(100 nM)로 처리하였다. 처리 후, 세포를 RLT 완충제로 용해시키고 제조업체의 프로토콜에 따라 RNEasy 미니키트 플러스(MiniKit Plus)(Qiagen®)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 입력 총 RNA를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수퍼스크립트(Superscript) IV VILO 마스터믹스(Mastermix)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. SYBR Green 마스터믹스(Applied Biosystems®)를 사용하는 정량적 실시간 PCR로 유전자 발현을 측정하였고(HPRT, CD86, iNOS, CD54) 플레이트를 7900HT 신속 실시간(Fast Real-Time) PCR 시스템(ThermoFisher®)에서 실행하였다. 2-ΔΔCt 방법을 이용하고 HPRT를 하우스킵핑 유전자로서 사용하여 상대적인 유전자 발현을 측정하였다. 실험을 이중으로 수행하였다. 결과는 도 7a, 7b 및 7c에 제시되어 있다.
실시예 9: 인간화 단일클론 항체의 교차반응성: ILT 패밀리 구성원을 발현하는 세포와의 결합
실온에서 플레이트 진탕기 상에서 단백질 A 정제된 인간화 단일클론 항체 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21과 이소타입 대조군을, ILT4에 대한 상동성이 가장 높은 인간 ILT 패밀리 구성원, 예를 들어, LILRA1, LILRA2(ILT1), LILRA4(ILT7), LILRA5(ILT11), LILRB1(ILT2) 및 LILRB2를 발현하는 CHO 세포와 함께 인큐베이션하였다. 20분 후, 세포를 0.1% BSA 및 0.05% NaN3(PBA)이 함유된 PBS로 세척하였고, 세포를 PE 표지가 부착된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 프로브와 함께 인큐베이션함으로써, 결합된 항체를 검출하였다. PBA로 과량의 프로브를 세포로부터 세척하고 제조업체의 지침에 따라 FACSCanto II™ 기기(BD Biosciences®, 미국 뉴저지주)를 이용하여 분석함으로써 세포 관련 형광을 측정하였다. 대표적인 결합은 도 8a 및 8b에 제시되어 있다.
실시예 10: 인간화 단일클론 항체와 골수 세포의 결합
대식세포를 실시예 6에 이미 기재된 바와 같이 준비하였다. 수지상 세포를 다음과 같이 준비하였다: PBMC를 T175 cm2 플라스크에 첨가하고 단핵구를 37℃ 및 6% CO2에서 약 2시간 동안 부착시켰다. 비-부착성 세포를 제거하고 단핵구를 10% FBS, 100 ng/㎖ GM-CSF(R&D 시스템) 및 10 ng/㎖ IL-4(R&D 시스템)가 함유된 RPMI에서 7일 동안 배양하였다.
실온에서 플레이트 진탕기 상에서 단백질 A 정제된 단일클론 항체 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21과 이소타입 대조군을 인간 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포와 함께 인큐베이션하였다. 20분 후, 세포를 0.1% BSA 및 0.05% NaN3(PBA)이 함유된 PBS로 세척하고, 세포를 PE 표지가 부착된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 프로브와 함께 인큐베이션함으로써, 결합된 항체를 검출하였다. PBA로 과량의 프로브를 세포로부터 세척하고 제조업체의 지침에 따라 FACSCanto II™ 기기(BD Biosciences, 미국 뉴저지주)를 이용하여 분석함으로써 세포 관련 형광을 측정하였다. 대표적인 결합은 도 9a, 9b 및 9c에 제시되어 있다.
실시예 11: 이중특이적 항체의 구축 및 생성
PD-L1 단일클론 항체 서열(9H9; 중쇄 및 경쇄 서열에 대해서는 국제 특허 출원 공개 제WO2019204462호의 서열번호 87 및 88 참조)에 대한 돌연변이된 전체 인간 IgG1 골격, 및 링커를 통해 9H9 중쇄의 C-말단에 유전적으로 연결된 ILT4 단일클론 항체의 scFv를 사용하여 4가 이중특이적 항체 구축물을 개발하였다. 7A3 및 7B1 항체 둘 다의 scFv 버전으로 이러한 이중특이적 항체를 생성하였다. 이중특이적 항체에 사용된 인간화 항체 scFv 서열을 각각 7A3 VH6-L17 및 7B1 VH10-L21로부터 얻었다. Fc 도메인을 돌연변이시켰고(AQQ) 일부 다른 아미노산 잔기도 변형시켰다. 이 구축물들은 각각 9H9-7A3 HL 및 9H9-7B1 HL로서 표시되며, 이때 scFv는 VH-VL 방향으로 존재한다.
항-ILT4 scFv의 중쇄와 경쇄를 역방향으로 사용하여 대안적 이중특이적 항체 구축물을 생성하였고, 이때 scFv는 VL-VH 방향으로 존재한다. 이 구축물들은 각각 9H9-7A3 LH 및 9H9-7B1 LH로서 표시된다.
네 가지 경우 모두에서 동일한 9H9 경쇄를 사용하였다. 4가 이중특이적 항체의 전체 서열은 다음을 포함한다:
이중특이적 구축물을 CHO 세포주에서 발현시켰다. 도 10a는 이중특이적 구축물의 개략도를 보여준다. 도 10b는 항-PD-L1 항체 대신에 항-PD-1 항체를 가진 대안적 이중특이적 구축물을 보여준다.
실시예 12: 생물층 간섭측정(BLI)에 의한 인간화 이중특이적 항체의 친화성 및 속도 상수의 측정
제조업체의 지침에 따라 Octet™ QKe 기기(ForteBio Sartorius®, 캘리포니아주 프레몬트)를 이용하여 생물층 간섭측정(BLI)으로 다양한 인간 ILT4 이중특이적 항체의 결합 친화성 및 결합 동역학을 조사하였다. 정제된 이중특이적 항체(실시예 11에 기재된 바와 같은 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL, 9H9-7B1 LH)를 항-인간 Fc 포획(AHC) 바이오센서(Fortebio 제품번호 18-5060)에 포획하였다. 각각의 항체를 희석 완충제(10 mM PO4 + 150 mM NaCl + 1 mg/㎖ BSA + 0.05% Tween 20, pH 7.2)에서 0.5 ㎍/㎖로 제조하였고, 30℃에서 1000 rpm 플레이트 진탕 속도로 새로 수화된 사전컨디셔닝 AHC 바이오센서에 300초 동안 로딩하였다. 한 어세이를 위해, 8개의 바이오센서를 동일한 항체로 로딩하였다.
항체가 로딩된 바이오센서 중 6개의 바이오센서를 피분석물인 가용성 인간 ILT4-HIS(Celldex 사내제조 시약)에 노출시켜 결합을 확인하였다. 희석 완충제에 의해 25 nM부터 0.4 nM까지 2배 연속 희석된 피분석물의 희석물을 30℃에서 1000 rpm 플레이트 진탕 속도로 사용하여 친화성 측정을 확인하였다. 피분석물 웰에서 항체가 로딩된 바이오센서의 결합을 300초 동안 수행한 다음, 해리 측정을 위해 1500초 동안 바이오센서를 희석 완충제 웰로 이동시켰다.
결합 및 해리 단계를 위해 포획된 항체를 가진 나머지 바이오센서를 희석 완충제에서 유지함으로써 각각의 경우에 상응하는 대조군을 수행하였다. 대조군 바이오센서에 대한 데이터를 사용하여, 배경을 차감하고 바이오센서 표류 및 바이오센서로부터의 항체 해리를 해결하였다.
포르테바이오의 데이터 분석 소프트웨어 버전 8.2.0.7(ForteBio Sartorius, 캘리포니아주 프레몬트)을 각각의 경우에 사용하여, 포획된 항체에 결합하는 희석 완충제 중의 피분석물의 농도 시리즈로부터 동역학 파라미터를 유도하였다. 제조업체의 지침에 따라 상기 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결합 및 해리 곡선을 1:1 결합 모델에 피팅하였다.
측정된 친화성 및 동역학 파라미터(배경이 차감됨)는 도 11에 제시되어 있고, 이때 kon = 결합 속도, kdis = 해리 속도, 및 KD = 비 kdis/kon에 의해 결정된 친화성 상수.
실시예 13: ELISA를 사용한 인간화 이중특이적 항체와 인간 PD-L1의 결합
마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 재조합 인간 PD-L1-msFc로 코팅한 후, PBS 중의 5% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 단백질 A 정제된 항-PD-L1 단일클론 항체 9H9, 이중특이적 항체 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL, 9H9-7B1 LH(실시예 11에 기재됨) 및 이소타입 대조군을 다양한 농도로 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음, 37℃에서 호스라디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 다중클론 시약과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP 기질로 현상하고 마이크로타이터 플레이트 판독기를 이용하여 OD 450에서 분석하였다. 대표적인 결합 곡선은 도 12a 및 12b에 제시되어 있다.
실시예 14: 인간화 이중특이적 항체와, 인간 PD-L1을 발현하는 세포의 결합
단백질 A 정제된 단일클론 항체, 이중특이적 항체(실시예 11에 기재된 바와 같은 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL, 9H9-7B1 LH) 및 이소타입 대조군을, 실온에서 플레이트 진탕기 상에서 인간 PD-L1을 발현하는 HEK293 세포와 함께 인큐베이션하였다. 20분 후, 세포를 0.1% BSA 및 0.05% NaN3(PBA)이 함유된 PBS로 세척하고, 세포를 PE 표지가 부착된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 프로브와 함께 인큐베이션함으로써, 결합된 항체를 검출하였다. PBA를 사용하여 과량의 프로브를 세포로부터 세척하고, 제조업체의 지침에 따라 FACSCanto II™ 기기(BD Biosciences, 미국 뉴저지주)를 이용하여 분석함으로써 세포 관련 형광을 측정하였다. 대표적인 결합 곡선은 도 13a 및 13b에 제시되어 있다.
실시예 15: 인간화 이중특이적 항체와, 인간 ILT4를 발현하는 세포의 결합
단백질 A 정제된 단일클론 항체, 이중특이적 단일클론 항체(실시예 11에 기재된 바와 같은 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL, 9H9-7B1 LH) 및 이소타입 대조군을, 실온에서 플레이트 진탕기 상에서 인간 ILT4를 발현하는 HEK293 세포와 함께 인큐베이션하였다. 20분 후, 세포를 0.1% BSA 및 0.05% NaN3(PBA)이 함유된 PBS로 세척하고, 세포를 PE 표지가 부착된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 프로브와 함께 인큐베이션함으로써, 결합된 항체를 검출하였다. PBA를 사용하여 과량의 프로브를 세포로부터 세척하고, 제조업체의 지침에 따라 FACSCanto II™ 기기(BD Biosciences, 미국 뉴저지주)를 이용하여 분석함으로써 세포 관련 형광을 측정하였다. 대표적인 결합 곡선은 도 14a 및 14b에 제시되어 있다.
실시예 16: 인간화 이중특이적 항체와, 세포에서 발현된 인간 ILT4 및 인간 PD-L1의 이기능적 결합
인간 ILT4를 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 이중특이적 구축물과 ILT4 및 PD-L1의 결합을 평가하였다. 간략히 말하면, 이중특이적 구축물의 희석물이 ILT4 발현 세포에 결합되게 한 후, PE 표지가 부착된 염소 항-마우스 IgG Fc 특이적 프로브에 의해 검출되는 인간 PD-L1-msFc를 첨가하였다. 4개의 이중특이적 구축물(실시예 11에 기재된 바와 같은 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL 및 9H9-7B1 LH)에 대한 대표적인 결합 곡선은 도 15a 및 15b에 제시되어 있다. 4개의 이중특이적 항체 모두가 ILT4 및 PD-L1 둘 다와의 유의미한 결합을 나타내었다.
실시예 17: 인간화 이중특이적 항체의 T 세포 PD1/PD-L1 차단
프로메가(Promega)®로부터 시판되는 PD-1/PD-L1 차단 어세이를 이용하여 PD1/PD-L1 상호작용의 차단에 대한 이중특이적 항체(실시예 11에 기재된 바와 같은 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL, 9H9-7B1 LH)의 효과를 측정하였다. 2종의 조작된 세포주인 PD1 이펙터 세포 및 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포를 항체의 존재 하에서 6시간 동안 공배양하였다. PD1/PD-L1 상호작용의 차단은 TCR 활성화를 야기하고 NFAT 경로를 통해 발광을 유도한다. Bio-Glo 시약을 첨가하여 발광을 검출하고 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)® 빅터(Victor) X4 발광측정기에서 정량하였다. 도 16a 및 16b에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1 항체 및 이중특이적 항체는 세포 사이의 PD1/PD-L1 상호작용을 효과적으로 차단하여, NFAT 경로의 활성화를 유발한다.
실시예 18: 대식세포에서 인간화 이중특이적 항체에 의한 TNF-α 생성의 유도
대식세포를 다음과 같이 인간 단핵구로부터 유도하였다: PBMC를 T175 cm2 플라스크에 첨가하고 단핵구를 37℃ 및 6% CO2에서 약 2시간 동안 부착시켰다. 비-부착성 세포를 제거하고 단핵구를 10% FBS 및 50 ng/㎖ M-CSF(R&D Systems)가 함유된 RPMI에서 7일 동안 배양하였다.
그 다음, 37℃ 및 6% CO2에서 세포를 이중특이적 항체(실시예 11에 기재된 바와 같은 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL, 9H9-7B1 LH) 및 적절한 항체 대조군의 존재 하에서 50 ng/㎖ LPS(Invivogen)와 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 수거하고 상청액을 모아 사이토카인 분석을 위해 저장하였다. 모은 상청액에서 TNF-α의 유도를 ELISA(R&D Systems)로 평가하였다. 도 17a 및 17b는 이중특이적 항체에 의한 TNF-α 생성의 증가를 보여준다.
실시예 19: 인간화 이중특이적 항체에 의한 HLA-G와 ILT4의 결합의 억제
실온에서 플레이트 진탕기 상에서 이중특이적 항체(실시예 11에 기재된 바와 같은 9H9-7A3 HL, 9H9-7A3 LH, 9H9-7B1 HL, 9H9-7B1 LH) 및 항체 대조군의 희석물을, 인간 ILT4를 발현하는 HEK293 세포와 함께 인큐베이션하였다. 30분 후, 세포를 세척하고 PE 표지가 부착된 HLA-G 사량체(FredHutch)를 첨가하였다. 추가 30분 후, 세포를 PBA로 세척하고 제조업체의 지침에 따라 FACSCanto II™ 기기(BD Biosciences, 미국 뉴저지주)를 이용하여 분석함으로써 세포 관련 형광을 측정하였다. 대표적인 차단 곡선이 도 18a 및 18b에 제시되어 있다.
균등 내용
당업자는 관용적인 실험만을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태의 많은 균등 내용을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등 내용은 하기 청구범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CELLDEX THERAPEUTICS, INC. <120> ANTIBODIES AGAINST ILT4 AND USES THEREOF <130> CDJ-403PC <140> PCT/US2022/023961 <141> 2022-04-08 <150> US 63/172,997 <151> 2021-04-09 <160> 150 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A3 VH CDR1 (Kabat) <400> 1 Gly Tyr Thr Ile His 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A3 VH CDR1 (Chothia) <400> 2 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A3 VH CDR2 (Kabat) <400> 3 Leu Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A3 VH CDR2 (Chothia) <400> 4 Asn Pro Tyr Thr Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A3 VH CDR3 <400> 5 Glu Arg Pro Gly Gly Ser Gln Phe Ile Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 11 <212> 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cagcggagga 420 acagccgctc tgggctgtct ggtgaaggac tatttcccag agcccgtgac cgtgagctgg 480 aactctggcg ccctgaccag cggagtgcat acatttcctg ctgtgctgca gtccagcggc 540 ctgtactctc tgtcttccgt ggtgaccgtg ccaagctctt ccctgggcac ccagacatat 600 atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660 agctgtgata agacccatac atgcccccct tgtcctgctc cagaggctca gggaggacca 720 tccgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gacaccctga tgatctctag gaccccagag 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggatcccg aggtgaagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccaa gggaggagca gtacaatagc 900 acctatcggg tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgcc aggtgtctaa taaggccctg cccgctccta tcgagaagac catctccaag 1020 gccaagggcc agcctaggga gccacaggtg tacacactgc ctccaagccg ggacgagctg 1080 accaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct tctatccctc tgatatcgct 1140 gtggagtggg agtccaatgg ccagcctgag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg 1200 gactccgatg gcagcttctt tctgtattcc aagctgaccg tggataagag caggtggcag 1260 cagggcaacg tgttttcttg ttccgtgatg catgaggctc tgcacaatca ttacacacag 1320 aagagcctgt ctctgtcccc tggcaaaggc tcgagcgggg gaggaggtag cgacatccag 1380 atgacacaga gcccaagctc tctgagcgcc agcgtgggag atagggtgac aatcacttgt 1440 agggccagcg agaacatcta cagctatctg gcttggtacc agcagaagcc cggcaaggcc 1500 ccaaagtttc tggtgtacaa cgccgacact ctcgctgagg gcgtcccttc taggttttcc 1560 ggcagcggct ccggcactga cttcacactg actatcagct ctctgcagcc agaggatttc 1620 gccacatact actgccagca ccactacggc actcctttca cattcggctg cggcactaag 1680 ctggagatca agggaggggg cggttccgga ggaggcggca gcgggggagg aggtagcggc 1740 ggaggtgggt ctcaagtgca gctggtgcag agcggcgctg aggtgaagaa gcccggcgcc 1800 agcgtgaaag tgagctgtaa ggcctccggc tacagcttca ctggctacac tatgcactgg 1860 gtcagacaag cccccggcca atgcctggag tggatgggac tgatcaaccc ttacactggc 1920 ggcactgact acaaccagaa gttccaagga agggtgacta tgactgtgga taggtccaca 1980 agcacagcct acatggagct gtcctctctg agatccgagg acactgccgt gtactactgt 2040 gctagggaga gacccggcgg cagccagttc atctactact acgctctgga ctactggggc 2100 caaggcacaa cagtcacagt gagcagc 2127 <210> 150 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 9H9 LC <400> 150 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt ggctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tattatggtt cttctcggac gttcggccaa 300 gggaccaatg tggaaatcaa acgtacggtg gccgctccaa gcgtgttcat ctttccccct 360 tctgacgagc agctgaagtc tggcacagcc tccgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagtctgg caattcccag 480 gagagcgtga ccgagcagga ctctaaggat tccacatata gcctgagctc taccctgaca 540 ctgtctaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac ccatcagggc 600 ctgtccagcc cagtgacaaa gtccttcaat cgcggcgagt gt 642

Claims (58)

  1. 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (i) 컨센서스 서열: G Y T (I,M) H(서열번호 21)로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
    (ii) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
    (iii) 컨센서스 서열: E R P G G S Q F I Y Y Y (P,A) (M,L) D Y(서열번호 22)로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
    (iv) 컨센서스 서열: R A S (A,E) N I Y S Y L A(서열번호 23)로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형;
    (v) 컨센서스 서열: N A (I,D) T L A E(서열번호 24)로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형; 및
    (vi) 서열번호 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (a) 각각 서열번호 1, 3 및 5에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형; 또는
    (b) 각각 서열번호 11, 13 및 15에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형, 및 각각 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 보존적 서열 변형
    을 포함하는, 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (a) 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열, 및 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열;
    (b) 서열번호 19에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열, 및 서열번호 20에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열;
    (c) 서열번호 25에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열, 및 서열번호 26에 제시된 경쇄 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열; 또는
    (d) 서열번호 27에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열, 및 서열번호 28에 제시된 경쇄 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열
    을 포함하는, 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (a) 서열번호 9, 19, 97, 98, 99, 103, 104 및 105로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열; 및
    (b) 서열번호 10, 20, 100, 101, 102, 106, 107 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80% 동일한 서열
    을 포함하는, 인간 ILT4에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 특성들:
    a. ILT4 리간드(예를 들어, HLA-G 리간드)가 인간 ILT4에 결합하는 것을 차단하는 특성;
    b. 인간 대식세포에 의한 사이토카인 또는 케모카인 방출을 향상시키거나 증가시키는 특성;
    c. 대식세포에 대한 LPS 및 IFNγ의 활성화 효과를 강화시키는 특성;
    d. M1 대식세포 분극화를 촉진하는 특성;
    e. 10-9 M 이하의 평형 해리 상수 Kd, 또는 대안적으로 10+9 M-1 이상의 평형 결합 상수 Ka로 인간 ILT4에 결합하는 특성;
    f. 다른 ILT 패밀리 구성원과의 교차반응성의 결여;
    g. 사이노몰구스 ILT4와의 교차반응성; 및/또는
    h. ILT4를 발현하는 종양 세포를 억제하는 특성
    중 하나 이상을 나타내는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv인 항원 결합 단편.
  7. 제2 결합제에 연결된 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 구축물.
  8. 제7항에 있어서, 제2 결합제는 면역 체크포인트 분자, 면역 보조자극 분자, 또는 종양 항원에 결합하는 것인 이중특이적 구축물.
  9. 제8항에 있어서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1 CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, VISTA, AXL, ILT2 또는 ILT3인 이중특이적 구축물.
  10. 제8항에 있어서, 면역 보조자극 분자는 CD27, CD40, 4-1BB, OX40 또는 GITR인 이중특이적 구축물.
  11. 제8항에 있어서, 종양 항원은 HER2, EGFR, ErB3 또는 CD24인 이중특이적 구축물.
  12. 제8항에 있어서, 결합제는 PD-L1에 결합하고,
    (a) 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (b) 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 38, 39 및 40에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (c) 각각 서열번호 41, 42 및 43에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 44, 45 및 46에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (d) 각각 서열번호 47, 48 및 49에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 50, 51 및 52에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (e) 각각 서열번호 53, 54 및 55에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 56, 57 및 58에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
    (f) 각각 서열번호 29, 30 및 31에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  13. 제12항에 있어서, PD-L1 결합제는
    (a) 서열번호 87에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 88에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 79에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 80에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (c) 서열번호 81에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 82에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (d) 서열번호 83에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 84에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (e) 서열번호 85에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 86에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및
    (f) 서열번호 77에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 78에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv인 이중특이적 구축물.
  15. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv인 이중특이적 구축물.
  16. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제2 결합제는 인간 IgG1 불변 도메인을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (a) ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제2 결합제의 중쇄의 C-말단에 연결되거나, 또는 (b) 제2 결합제는 ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 C-말단에 연결된 것인 이중특이적 구축물.
  18. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 제2 결합제는 유전적으로 융합된 것인 이중특이적 구축물.
  19. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 제2 결합제는 화학적으로 접합된 것인 이중특이적 구축물.
  20. ILT4 scFv에 연결된, 인간 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 구축물로서,
    (a) PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) ILT4 scFv는
    (i) 각각 서열번호 1, 3 및 5에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 또는
    (ii) 각각 서열번호 11, 13 및 15에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  21. 제20항에 있어서,
    (a) PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 87에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 88에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) ILT4 scFv는
    (i) 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열번호 19에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 20에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, ILT4 scFv는 VH44 및 VL100에서 Cys 치환을 가진 디설파이드 안정화 변형을 추가로 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 항체 또는 이의 결합 단편은 인간 IgG1 불변 도메인을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  24. PD-L1 scFv에 연결된, 인간 ILT4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 구축물로서,
    (a) ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (i) 각각 서열번호 1, 3 및 5에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 또는
    (ii) 각각 서열번호 11, 13 및 15에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
    을 포함하고;
    (b) PD-L1 scFv는 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  25. 제24항에 있어서,
    (a) ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (i) 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열번호 19에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 20에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
    을 포함하고;
    (b) PD-L1 scFv는 서열번호 87에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 88에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, ILT4 항체 또는 이의 결합 단편은 인간 IgG1 불변 도메인을 포함하는 것인 이중특이적 구축물.
  27. 제7항 내지 제26항 중 어느 한 항의 이중특이적 구축물 및 제3 결합제를 포함하는 다중특이적 구축물.
  28. 제27항에 있어서, PD-L1 또는 PD-1 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 도메인을 포함하고, ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 도메인에 결합된 것인 다중특이적 구축물.
  29. 제27항에 있어서, PD-L1 또는 PD-1 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 도메인을 포함하고, ILT4 scFv는 Fc 도메인에 결합된 것인 다중특이적 구축물.
  30. 제27항에 있어서, PD-L1 또는 PD-1 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 도메인을 포함하고, ILT4 scFv는 항체 중쇄들 중 적어도 하나의 카르복시 말단에 결합된 것인 다중특이적 구축물.
  31. 제27항에 있어서, PD-L1 또는 PD-1 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 도메인을 포함하고, ILT4 scFv는 항체 중쇄들 중 하나의 카르복시 말단에 결합되며, 추가 scFv 펩티드가 다른 중쇄의 카르복시 말단에 결합된 것인 다중특이적 구축물.
  32. 제2 결합제에 연결된 항-ILT4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  33. 제32항에 있어서, 제2 결합제는 면역 체크포인트 분자, 면역 보조자극 분자, 또는 종양 항원에 결합하는 것인 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  34. 제32항에 있어서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1 CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, VISTA, AXL, ILT2 또는 ILT3인 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  35. 제32항에 있어서, 면역 보조자극 분자는 CD27, CD40, 4-1BB, OX40 또는 GITR인 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  36. 제32항에 있어서, 종양 항원은 HER2, EGFR, ErB3 또는 CD24인 이중특이적 구축물.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 카바트(Kabat)에 제시된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 비천연 발생 아미노산 234A, 235Q 및 322Q를 포함하는 돌연변이된 인간 IgG1 Fc 도메인을 가진 변형된 IgG1 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인은 카바트에 제시된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 비천연 발생 아미노산 252Y, 254T 및 256E를 추가로 포함하는 것인 이중특이적 또는 다중특이적 구축물.
  41. 카바트에 제시된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 비천연 발생 아미노산 234A, 235Q 및 322Q를 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 구축물.
  42. 카바트에 제시된 EU 지수에 의해 넘버링될 때 비천연 발생 아미노산 252Y, 254T 및 256E를 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 구축물.
  43. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이중특이적 또는 다중특이적 구축물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  44. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이중특이적 또는 다중특이적 구축물, 또는 제43항의 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  45. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  46. 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이중특이적 또는 다중특이적 구축물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  47. 적어도 하나의 제45항 또는 제46항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  48. 제47항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  49. 대식세포를 활성화하는 방법으로서, 대식세포를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이중특이적 또는 다중특이적 구축물, 또는 제43항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 대식세포를 활성화하는 방법.
  50. 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이중특이적 또는 다중특이적 구축물, 또는 제43항의 조성물을, 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 향상시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  51. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이중특이적 또는 다중특이적 구축물, 또는 제43항의 조성물을, 암을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 암은 결장직장암, 난소암, 신장 세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 유방암, 폐암, 방광암, 전립선암, 흑색종, 부인과암, 육종, 림프종 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  53. 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항의 이중특이적 또는 다중특이적 구축물, 또는 제43항의 조성물을, 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 종양은 ILT4, HLA-G, HLA 클래스 I, 안지오포이에틴(angiopoietin) 유사 2, Nogo 또는 ILT4 리간드를 발현하는 것인 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 별도로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 각각 서열번호 59, 60 및 61에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 62, 63 및 64에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (b) 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 38, 39 및 40에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (c) 각각 서열번호 41, 42 및 43에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 44, 45 및 46에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (d) 각각 서열번호 47, 48 및 49에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 50, 51 및 52에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    (e) 각각 서열번호 53, 54 및 55에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 56, 57 및 58에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
    (f) 각각 서열번호 29, 30 및 31에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 서열번호 87에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 88에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 79에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 80에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (c) 서열번호 81에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 82에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (d) 서열번호 83에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 84에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열;
    (e) 서열번호 85에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 86에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및
    (f) 서열번호 77에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 78에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것인 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 연속적으로 또는 동시에 투여되는 것인 방법.
KR1020237038398A 2021-04-09 2022-04-08 Ilt4에 대한 항체, 이중특이적 항-ilt4/pd-l1 항체 및 이의 용도 KR20240006541A (ko)

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