KR20210038919A - 항원 정제 방법 - Google Patents

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쿠날 박쉬
마신 크르지스토프 부그노
수마나 챈드라몰리
매튜 앨버트 타이슨
지하오 왕
마크 조나단 윌슨
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드와 관련된 방법, 조성물, 공정 및 용도가 제공된다.

Description

항원 정제 방법
본 발명은 다양한 샘플로부터 항원을 정제하기 위한 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 상기 항원의 사용을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과에 속하는 중요한 인간 병원체이다. 밀접하게 관련된 바이러스는 볼거리, 홍역 및 파라인플루엔자 바이러스를 포함한다. RSV는 유아 입원의 주요 원인이며, 초기 아동기 감염은 천명 및 아동기 천식 발생 증가와 강한 상관관계가 있다. 이는 아동, 부모 및 의료 시스템에 상당한 부담을 초래하며, 개입 비용은 매년 수십억 달러로 추정된다. 이는 말라리아 다음으로 1개월 내지 1세 연령의 아동에서 단일의 가장 흔한 전염성 사망 원인이다.
현재 RSV에 대한 백신은 없으며, 유일한 예방 방법은 융합 단백질 F를 표적으로 하는 모노클로날 항체인 팔리비주맙의 수동적 투여를 통한 것이다. 이 전략의 엄청난 비용으로 인해 매년 RSV 시즌이 시작될 때 고위험 유아에게 그의 사용이 제한되었고, 광범위하게 이용가능한 효과적인 백신의 필요성이 더욱 강조된다. 한편, 모노클로날 항체에 의해 부여되는 보호는 바이러스에 대한 체액성 면역이 감염 예방에 효과적임을 시사한다.
바이러스에 대한 중화 항체의 1차 표적인 RSV F는 바이러스 외피에 풍부한 클래스 I 융합 당단백질이다. 다른 바이러스 융합 단백질과 마찬가지로, F는 바이러스 표면에 삼량체 "융합전" 상태로 존재한다. 일단 진입이 촉발되면, 이는 소수성 융합 루프를 세포막에 삽입하고, 광범위한 형태 변화를 거쳐 에너지적으로 유리한 삼량체 "융합후" 상태로 폴딩하여, 이 프로세스에서 바이러스 및 세포막을 함께 융합한다.
전구체 RSV F 단백질 서열은 신호 펩티드 (25개 잔기), 3개의 헵타드 반복부 (HRA, HRB 및 HRC)를 포함하는 529개 잔기 엑토도메인, 막횡단 영역 및 짧은 세포질 꼬리를 함유한다. 야생형 단백질은 결국 2개의 푸린 부위에서 내부적으로 절단되는 단일 폴리펩티드 (F0)로서 발현된다. 푸린 단백질분해는 27개 아미노산 펩티드 (p27)를 방출하고, 단백질을 2개의 디술피드 결합 (C37-C439; C69-C212)에 의해 연결된 상태를 유지하는 2개의 쇄, F1 및 F2로 분리한다. 이들 절단은 소수성 융합 펩티드 (F1 N-말단)의 N-말단을 해방시켜, 이를 최종 막 삽입에 이용가능하게 하며, F가 융합생성원으로 기능할 수 있도록 한다. 최종 성숙한 RSV F 단백질은 또한 3개의 N-연결된 글리코실화 부위 (N27, N70 및 N500)에 글리코실화를 함유한다.
외인적으로 발현된 F 엑토도메인은 융합후 형태의 고도로-안정적인 삼량체로 자발적으로 폴딩한다. 융합후 F 결정 구조가 해결되었으며, 2개의 중요한 표면 노출된 중화 에피토프인 부위 A 및 부위 C의 보존을 보여준다.
융합전 F 구조는 융합전 F-특이적 항체의 Fab 단편과 F 엑토도메인을 공동-발현함으로써 해결되었다. 그것과 2개의 관련 항체는 부위 Ø로 지정된 그의 융합전 형태에 고유한 F 상의 에피토프를 인식한다. 이 에피토프는 분자 상단 근처에 있으며, 잔기 60-75 (F2) 및 HRA 나선 잔기 196-209 (F1)에 의해 형성된다. F가 그의 융합후 형태로 플립할 때 발생하는 광범위한 구조적 재배열에서, 이 에피토프가 파괴되며, 융합전 및 융합후 분자에서 HRA 나선과 관련하여 루프의 상대적 위치가 ~180°변화된다. 대조적으로, F에서 다른 2개의 중화 부위인 부위 A 및 부위 C는 융합전 및 융합후 형태 둘 다에서 보존된다. 4차 에피토프 부위 V는 β3-β4 모티프와 중첩되고, 융합전 RSV-F의 삼량체 형태에 존재한다. 문헌 [McLellan et al (2015) "Characterization of a Prefusion-Specific Antibody That Recognizes a Quaternary, Cleavage-Dependent Epitope on RSV Fusion Glycoprotein," PLOS Pathog, 11:e1005035]을 참조한다. 부위 V는 도 2에 제시되어 있다.
F 엑토도메인을 그의 융합전 형태로 안정화시키기 위해, 엑토도메인 서열에 3개의 주요 변화가 필요하다. C-말단 삼량체화 도메인이 필요하다. 한 예는 발현 시 자발적으로 삼량체화하는 T4 박테리오파지 피브리틴 분자의 C-말단으로부터 27-잔기 도메인인 폴돈이다. 이 도메인이 없지만 추가 변화가 있는 경우, F 단백질은 융합전 형태를 차지할 것이나, 삼량체를 형성하지 못하고 면역원성이 높지 않다. 폴돈은 짧은 4-잔기 비-절단가능한 링커인 Ser-Ala-Ile-Gly에 의해 F C-말단에 연결되었다.
다른 두 가지 변화는 항체 첨가 없이 F를 그의 융합전 상태로 유지하는데 도움이 되는 항체-결합 구조를 기반으로 설계된 안정화 돌연변이이다. 여러 번의 시험/설계 반복 후, 두 세트의 돌연변이의 조합이 최상의 결과를 제공하였다. 문헌 [McLellan et al. Science (2013) vol. 342 p. 592]에서 DS-Cav1이라고 하는 이 분자는 155 및 290에서 Ser 잔기를 Cys로 돌연변이 (S155C-S290C)시킴으로써 도입된 디술피드 ("DS")를 함유하여, 융합후 상태로 플립하는 것을 방지한다. 또한, 이는 정점에서 부위 Ø를 안정화시키기 위해 공동-충전 돌연변이, S190F 및 V207L을 함유한다. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 이러한 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 융합후 F보다 훨씬 더 강력하게 중화 항체를 발생시키고, 인간 혈청에서 RSV-특이적 중화 항체의 85% 초과를 고갈시킬 수 있다.
RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 벤치-탑 양을 생산하기 위한 공개된 방법이 현재 이용가능함에도 불구하고, 친화성 태그를 포함하지 않는 (즉, 태그없는) 순수하고 안정적인 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 대한 필요성이 여전히 남아있으며; 친화성 태그는 그 자체가 거짓 면역 반응을 유도할 수 있거나, 절단되더라도 거짓 면역 반응을 유도할 수 있는 인공적 절단후 아미노산 서열을 남길 수 있다. 더욱이, 백신에 사용하기에 충분한 양으로 재조합적으로 생산될 때, 이 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 면역원성을 감소시키거나 재조합 산물을 단백질분해하거나 면역 반응을 유도할 수 있는 숙주-세포 단백질과 공동-정제한다. 따라서, 숙주-세포 단백질이 실질적으로 없는 백신 제조 규모에서 순수하고 안정적인 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 대한 필요성이 여전히 남아있다.
본원의 출원인은 S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 고도로 순수하고 태그없는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 조성물의 제조 방법, 그의 고도로 안정적인 조성물의 제조 방법, 뿐만 아니라 고도로 순수한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 집단을 포함하는 항원 조성물이 제공되며, 여기서 상기 집단의 각 삼량체는 (a) S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F 프로토머"); 및 (b) p27 펩티드의 적어도 10개의 아미노산을 추가로 포함하는, S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F' 프로토머")로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 3개의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로 구성되고 하기 화학식으로 기재되며;
nF + (3-n)F' (화학식 I)
여기서 n은 0-3의 정수이고, F는 F 프로토머이고, F'는 F' 프로토머임; 여기서 삼량체의 집단 중 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 적어도 1%, 예컨대 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8% 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%는 F' 프로토머이다.
도 1a 야생형 RSV F 단백질 서열은 개략적 형태로 도시된다: 신호 펩티드 (25개 잔기), 3개의 헵타드 반복부 (HRA, HRB 및 HRC)를 포함하는 529개 잔기 엑토도메인, 막횡단 영역 (TM), 짧은 세포질 꼬리, 글리코실화 부위 (원문자 G), 및 푸린 절단 부위 (가위). 신호 펩티드 (SP) 및 p27 펩티드는 단백질 성숙 동안 제거되어, F1 및 F2 쇄가 생성된다 (다이아몬드 기호 = p27 제거 후 남은 절단후 부위).
도 1b 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환 (수직 글자) 및 폴돈으로 제시되며; 다른 도면 라벨은 도 1a에 기재된 바와 같다.
도 2 다양한 항체 결합 부위는 부위 Ø를 포함하는 융합전 RSV F 단백질의 표시 위에 제시된다.
도 3a 생산-규모 생물반응기에서 생산 시간의 증가에 대한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드-생산 CHO 세포 클론의 생존가능한 세포 밀도 및 생존율.
도 3b. 생산-규모 생물반응기에서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 역가 축적.
도 4 실시예에 개시된 공정에 의해 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 글리칸 프로파일. 피크 #2 및 #3은 시알릴화된 글리칸을 나타낸다.
도 5a 3개월 동안 액체 버퍼에서 5℃에서 저장 후 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 Fab 이동 SEC-LC 결과. 실시예 3(F)을 참조한다. 왼쪽에서 오른쪽으로 피크가 이동된다: 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("이동됨"); 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 단독 (주요 피크, "Ds") 및 이동되지 않은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (부차 피크, "이동되지 않음"); 부위 Ø 결합 Fab (주요 피크, 표지되지 않음), 및 부위 Ø 결합 Ab Fab (부차 피크, "Fab"). 삽입된 패널은 시간 0, 1-개월, 3-개월 및 7-개월에 이동된 (부위 Ø 결합을 유지함) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 퍼센트를 보고한다 (도 5a에서, 3-개월 물질에 대한 크로마토그램만이 제시됨).
도 5b 동결건조된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 2주 동안 40℃에서 저장한 후 적절한 버퍼로 재구성한 후 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 Fab 이동 SEC-LC 결과, 도 5a에 표지되고 기재된 바와 같은 피크.
도 5c 동결건조된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 5℃에서 6개월 동안 저장한 후 적절한 버퍼로 재구성한 후 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 Fab 이동 SEC-LC 결과, 도 5a에 표지되고 기재된 바와 같은 피크.
도 6a 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 신선한 참조 물질 (제1 레인) 및 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 3-개월 안정성 물질 (제2 레인)의 SDS-PAGE 겔 (3-개월 안정성 물질의 일부가 부위 Ø 결합을 상실함). 그러나, 겔 밴드 패턴은 신선한 참조 및 3-개월 안정성 물질 간에 매우 유사하였으며, 이는 3-개월 물질에서 부위 Ø 결합 항체-결합 손실이 단백질 클리핑 사건으로 인한 것이 아님을 시사한다.
도 6b 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 신선한 참조 물질 (상단) 및 3-개월 안정성 물질 (하단)의 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (LC-MS) 버터플라이 펩티드 지도. 신선한 참조 및 3-개월 물질은 비교가능한 펩티드 핑거프린트를 가졌으며, 이는 화학적 변형, 예컨대 산화, 탈아민화, 및 디술피드 결합 스크램블링이 또한 부위 Ø 결합 항체-결합의 손실의 원인이 아님을 시사하였다.
도 7 LC-MS에 의한 탈-N-글리코실화된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 무손상 질량의 결정.
도 8 F' 프로토머의 용리 (부차 피크), 이어서 F 프로토머의 용리 (주요 피크)를 제시하는, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 역상 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 크로마토그램. 샘플을 2벌로 실행하였다.
도 9. RP HPLC에 의한 원료 의약품 (항원 조성물)의 통합 (p27 = F'; RSV preF = F).
도 10. RP-UPLC에 의한 원료 의약품 (항원 조성물) 표준 로드 10 μL의 통합 (p27 = F'; RSV preF = F).
도 11. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 전형적인 약한 양이온 교환 프로파일. 피크 1은 FFF이고 피크 2는 F'-함유 삼량체이다.
도 12. 추가 분석을 위해 분획을 수집하였다 (회색-음영).
도 13. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 역상 액체 크로마토그래피 프로파일 (표지된 RSVPreF3 {원래 용어 "DS-Cav1"을 사용하여 확인됨, 본원에서 RSVPreF3으로 다시 명명되어 문헌 [McLellan et al. Science (2013) vol. 342 p. 592], WO2014160463, 및 ClinicalTrials.gov 식별자: NCT03049488에 개시된 바와 같이 생산된 물질과 구별됨}, 하단 그래프 라인), 약한 양이온 교환 크로마토그래피로부터 피크 1 (두 번째 그래프 라인) 및 피크 2 (아래에서 세 번째 그래프 라인).
도 14. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 +R295, 및 R295의 약한 양이온 교환 크로마토그래피 프로파일. 가장 왼쪽에 있는 피크 (수직 점선으로 표시됨)는 FFF 삼량체에 대한 체류 시간을 나타낸다. 왼쪽에서 두 번째 피크 (왼쪽 수직 굵은 점선으로 표시됨)는 FFF' 삼량체 (Δ+5 전하)에 대한 체류 시간을 나타낸다. 가장 오른쪽에 있는 피크는 R295 F'F'F' (오른쪽 수직 점선으로 표시됨) 삼량체 (Δ+6 전하)에 대한 체류 시간을 나타낸다. FF'F' (Δ+10 전하)에 대한 예측된 체류 시간에 피크가 없음을 주목한다 (굵은 점선 원 내의 회색 점선 곡선).
도 15 RSVPreF3 및 DS-Cav1에서 고분자량 종 (HMWS)을 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 사용하여 조사하였다. 도 15의 크로마토그램은 왼쪽에서 오른쪽으로 RSVPreF3 (왼쪽, 더 높음) 및 DS-Cav1 (오른쪽, 더 짧음)에 대한 피크를 도시한다. RSVPreF3은 대칭적인 것으로 관찰된 반면, DS-Cav1은 이질성으로 인해 대칭적이지 않은 것으로 보인다 (분해된 피크가 없는 큰 숄더).
도 16 하기 샘플에 대한 분석용 초원심분리 (AUC)에 의해 결정된 침강: RSVPreF3 동결건조 샘플 1 (피크 표지 4.05s); RSVPreF3 동결건조 샘플 2 (피크 표지 3.99s); RSVPreF3 액체 샘플 (피크 표지 4.09s); DS-Cav1 액체 샘플 (피크 표지 4.17s).
도 17a 비-환원된 및 환원된 SDS-PAGE에 의해 조사된 숙주 세포 단백질 (HCP)-함량. 왼쪽에서 오른쪽으로, 레인은 하기와 같다: 크기 마커; 비-환원된 RSVPreF3; 비-환원된 DS-Cav1; 환원된 RSVPreF3; 환원된 DS-Cav1; 및 크기 마커. 비-환원된 및 환원된 RSVPreF3에서 주요 밴드 바로 위에 FFF' (F1+p27)를 나타내는 부차 밴드의 존재를 주목한다.
도 17b 1차 Ab: GRP78/BiP 항체 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 카탈로그 #: PA1-014A, 숙주/이소타입: 토끼/IgG, 폴리클로날); 2차 Ab: 알렉사(Alexa) 플루오르 647 닭 항-토끼 IgG (H+L), (인비트로젠(Invitrogen), A21443)에 의해 검출되는 GRP78을 사용한 웨스턴 블롯 (겔로부터).
도 18 RSVPreF3 및 DS-Cav1 조성물의 함량 및 순도를 조사하기 위해 RP-HPLC를 사용하였다. DS-Cav1 크로마토그래프 트레이스에 p27 피크가 없음을 주목한다.
도 19 RSVPreF3 및 DS-Cav1의 FFF 및 FFF' 집단을 조사하기 위해 약한 양이온 교환 (WCX)을 사용하였다. RSVPreF3 조성물은 2개의 별개의 대칭적인 잘 분해된 피크 (FFF 및 FFF')를 나타내는 반면, DS-Cav1은 FFF 및 FFF' 사이에 체류 시간이 있는 상대적으로 넓은 단일 피크이다.
도 20 염수 그룹과 비교하여 DS-Cav1 또는 RSVPreF3 제형을 투여받은 그룹에서 RSV A 중화 항체 (Nab) 역가의 부스팅을 측정함으로써 소에서 RSVPreF3 (동결건조됨)의 면역-특징화. D -7 = 면역화 7일 전; dPI = 면역화 후 일수.
도 21 면역화 14일 후 미감염 CB6F1 마우스에서 FFF- 또는 FFF'-제형에 의해 유도된 hRSV A 중화 항체 역가를 관찰함으로써 미감염 CB6F1 마우스에서 면역원성에 대한 p27의 영향을 평가하였다. FFF'는 FFF에 의해 유도된 NAb 반응보다 열등하지 않은 RSV A 중화 Ab 반응을 유도하였다.
도 22a 생산-규모 생물반응기에서 생산 시간의 증가에 대한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드-생산 CHO 세포 클론의 생존가능한 세포 밀도 및 생존율.
도 22b. 생산-규모 생물반응기에서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 역가 축적.
본 출원인은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 특정 저장 조건 하에서 불안정하고, 자발적인 형태 변화를 겪으며, 이로 인해 부위 Ø 및 부위 V에서 항체 결합의 측정가능한 감소 (Fab 항체 이동 검정에 의해)를 초래하며, 이러한 형태 변화는 액체 버퍼에서 저장 동안 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 비율 증가에 영향을 미친다는 것을 관찰하였다. 이러한 형태 변화를 겪는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 분획을 저지하거나 최소화하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 본 출원인은 S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 이전에 공개된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드보다 더 큰 순도, 더 낮은 응집, 더 낮은 양의 부분 글리코실화 및 더 낮은 pI를 나타내는 것으로 관찰된 S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물을 본원에서 추가로 제공한다. 본원에 개시된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 및 그의 제조 방법은 WO2014160463에 개시된 바와 같이 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드보다 더 큰 순도, 더 낮은 숙주-세포 단백질 함량 및 더 낮은 응집, 더 낮은 양의 부분 글리코실화, 및 더 낮은 pI를 나타내는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생성하는 것으로 예상된다.
정의
용어 "재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드" 또는 "가용성 F 단백질 폴리펩티드"는 S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하고 삼량체화 폴돈 도메인을 포함하는 RSV F 단백질을 의미한다. 이러한 치환된 RSV F 단백질의 예는 WO2014160463에 개시되어 있으며, 치환된 아미노산 위치는 그 안에 서열 식별자 124로서 기재된 야생형 RSV F 단백질 서열을 참조하여 기재되어 있다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 푸린에 의해 결국 내부적으로 절단되는 단일 폴리펩티드 (F0)로서 발현된다. 예시적인 F0 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 도 1b에 도시되고, 예시적인 F0 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 1에 기재되어 있다. 푸린 단백질분해는 단백질을 2개의 쇄로 분리하며, 하나는 F1 아미노산 서열을 포함하고 다른 하나는 F2 아미노산 서열을 포함하며, 그러므로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 적어도 F1 쇄 및 F2 쇄를 포함할 것이다. 2개의 푸린 절단 부위의 존재 때문에, 단백질분해는 2개의 쇄, F1 및 F2, 뿐만 아니라 p27 펩티드의 방출을 초래할 수 있지만, 본 출원인은 성숙한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 분획이 오직 1개의 푸린 절단 부위에서 절단될 수 있고 p27 펩티드가 방출되지 않음을 관찰하였다. 이는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
"F1 쇄"는 절단된 F0 분자의 C-말단 부분을 의미한다. 예시적인 F1 쇄는 도 1b에 표시되고 예시적인 F1 쇄 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 8에 기재되어 있다.
"F2 쇄"는 신호 단백질이 제거된 절단된 F0 분자의 N-말단 부분을 의미한다. 예시적인 F2 쇄는 도 1b에 표시되고 예시적인 F2 쇄 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 3에 기재되어 있다.
"F 프로토머" 또는 "preF"는 S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖지만 p27 펩티드 아미노산 서열이 결여된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 의미한다.
"F' 프로토머" 또는 "preF'"는 S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖지만 p27 펩티드의 적어도 10개의 인접 아미노산에서 최대 p27 펩티드의 전체를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 의미한다.
"p27 펩티드"는 2개의 푸린 부위 둘 다에서 완전한 단백질분해를 통해 방출될 폴리펩티드 (F0)의 아미노산 전장에 상응하는 아미노산 서열을 의미한다. 일부 실시양태에서, 푸린 단백질분해는 RSV 균주마다 다양할 수 있는 27개 아미노산 p27 펩티드를 방출한다. 일부 실시양태에서, p27 펩티드는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는다.
"삼량체" 또는 "재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체"는 3개의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 단백질 복합체를 의미하며, 여기서 각 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 F1 쇄 및 F2 쇄를 포함하고, 추가로 여기서 복합체의 각 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 F' 및 F 프로토머로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되어; 삼량체의 구조는 하기 화학식으로 기재된다:
nF + (3-n)F' (화학식 I)
여기서 n은 0-3의 정수이고, F는 F 프로토머이고, F'는 F' 프로토머이다.
"비절단된 푸린 절단 부위"는 최소 아미노산 서열 …RXRRX1… (서열식별번호: 9)을 의미하며, 여기서 X 및 X1은 임의의 아미노산이다 (예를 들어, 문헌 [Moehring et al. (1993) "Strains of CHO-K1 cells resistant to Pseudomonas exotoxin A and cross-resistant to diphtheria toxin and viruses," Infect. Immun. 41:998-1009] 참조).
"항원"은 동물에 주입, 흡수 또는 달리 도입되는 조성물을 포함하여 동물에서 항체의 생성 및/또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 의미한다. 따라서, 용어 "항원성 폴리펩티드"는 동물에서 항체의 생성 및/또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "항원"은 모든 관련된 항원성 에피토프를 포함한다. 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. "우성 항원성 에피토프" 또는 "우성 에피토프"는 기능적으로 유의한 숙주 면역 반응, 예를 들어, 항체 반응 또는 T-세포 반응이 이루어지는 에피토프이다. 그러므로, 병원체에 대한 보호 면역 반응과 관련하여, 우성 항원성 에피토프는 숙주 면역계에 의해 인식될 때 병원체에 의해 야기되는 질환으로부터의 보호를 생성하는 항원성 에피토프이다. 용어 "T-세포 에피토프"는 적절한 MHC 분자에 결합될 때 T 세포에 의해 (T 세포 수용체를 통해) 특이적으로 결합되는 에피토프를 지칭한다. "B-세포 에피토프"는 항체 (또는 B 세포 수용체 분자)에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프이다.
"항원 조성물"은 항원성 폴리펩티드 (고차 형태의 폴리펩티드, 예컨대 삼량체 등 포함) 또는 2개 이상의 상이한 항원성 폴리펩티드 (그의 고차 형태 포함)를 포함하는 조성물을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, 항원 조성물은 숙주-세포, 다른 오염 분자 등에서 항원성 폴리펩티드의 발현으로부터 항원성 조성물이 생성되는 경우, 원치않는 분자, 예컨대 숙주-세포 단백질을 제거하기 위해 정제될 수 있다.
"정제"는 조성물로부터 그 존재가 바람직하지 않은 성분을 제거하는 공정을 의미한다. 정제는 상대적인 용어이며, 바람직하지 않은 성분의 모든 트레이스를 조성물로부터 제거하는 것을 요구하지 않는다. 백신 생산과 관련하여, 정제는 원심분리, 투석, 이온-교환 크로마토그래피, 및 크기-배제 크로마토그래피, 친화성-정제 또는 침전과 같은 공정을 포함한다. 그러므로, 용어 "정제된"은 절대적인 순도를 요구하지 않으며; 오히려, 상대적인 용어로서 의도된다. 그러므로, 예를 들어, 정제된 항원 조성물은 특정된 항원이 그의 생성 환경, 예를 들어 세포 내 또는 생화학적 반응 챔버에 있는 것보다 더 농축된 것이다. 실질적으로 순수한 항원의 제제는 원하는 항원이 시그너스(Cygnus) CHO hcp ELISA와 같은 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% w/w 이상의 전체 항원 플러스 제제의 원치않는 단백질 함량을 나타내도록 정제될 수 있다.
"숙주-세포"는 본원에서 재조합 폴리펩티드, 예컨대 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 의미한다. 예시적인 숙주-세포는 원핵생물 (즉, 박테리아) 숙주-세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 뿐만 아니라 수많은 진핵생물 숙주-세포, 예를 들어 진균 (예를 들어, 효모) 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포 (예컨대 CHO, VERO 및 HEK293 세포)를 포함한다.
"숙주-세포 단백질" 또는 "HCP"는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터의 부재 하에 숙주-세포에 의해 생성되는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 숙주-세포 단백질로 간주되지 않는 반면, GRP78 단백질은 숙주-세포 단백질로 간주된다.
"GRP78"은 CHO에 대한 수탁 번호 NP_001233668인 78 kD 글루코스-조절 또는 열 충격 70 단백질 5 (HSPA5) 숙주-세포 단백질을 의미한다.
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 삼량체의 맥락에서 "비응집된"은 3개의 프로토머의 삼량체에 대해 예측되는 분자량, 즉 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 결정된 바와 같은 150 kDa 초과 200 kDa 미만을 갖는 삼량체를 의미한다 (본원의 다른 곳에 기재되어 있음). 대조적으로, 응집된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 삼량체는 삼량체의 이량체 또는 더 높은 고차로서 존재할 수 있다.
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 맥락에서 "시알릴화된" 또는 "% 시알릴화"는 하기와 같이 수행되는 글리칸 프로파일링에 의해 결정된 바와 같은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 상의 총 N-글리칸 중 시알릴화된 글리칸의 비율을 의미한다: 먼저 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로부터 N-글리칸을 절단한 다음, 환원성 아민화를 통해 절단된 N-글리칸을 2-AB로 표지한 다음, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 (HILIC)에 의해 절단된 N-글리칸을 분해하고, FLR 및 MS 검출기에 의해 각 피크에서 N-글리칸의 동일성을 검출 및 정량화한다.
"면역원성 조성물"은 예를 들어, 병원체, 예컨대 RSV에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는, (예를 들어, 실험 설정에서) 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기에 적합한 물질의 조성물을 의미한다. 이와 같이, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 항원) 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 면역원성 조성물은 또한 면역 반응을 유도하거나 증강시킬 수 있는 하나 이상의 추가 성분, 예컨대 부형제, 담체 및/또는 아주반트를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 면역원성 조성물은 병원체에 의해 유도되는 증상 또는 상태로부터 대상체를 전체적으로 또는 부분적으로 보호하는 면역 반응을 유도하기 위해 투여된다. 일부 경우에, 병원체에 의해 유발되는 증상 또는 질환은 병원체에 대상체가 노출된 후 병원체 (예를 들어, RSV)의 복제를 억제함으로써 예방 (또는 감소 또는 호전)된다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 면역원성 조성물은 RSV에 대한 보호적 노출전 면역 반응 또는 RSV에 대한 완화적 노출후 면역 반응을 유도할 목적으로 대상체 또는 대상체 집단에게 투여하는 것으로 의도된 조성물 (즉, 백신 조성물 또는 백신)을 포괄하는 것으로 이해될 것이다.
"제약상 허용되는"은 지시대상이 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물 대상체)에게 투여하기에 적합하다는 것을 나타낸다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]에는 면역원성 조성물을 포함하는 치료용 및/또는 예방용 조성물의 제약 전달에 적합한 조성물 및 제형 (희석제 포함)이 기재되어 있다.
"아주반트"는 비특이적 방식으로 면역 반응의 생성을 증강시키는 작용제를 의미한다. 일반적인 아주반트는 항원이 흡착된 미네랄 (백반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄)의 현탁액; 유중수 및 수중유를 포함하는 에멀젼 (및 이중 에멀젼 및 가역성 에멀젼을 포함하는 그의 변형), 리포사카라이드, 리포폴리사카라이드, 면역자극성 핵산 (예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드), 리포솜, Toll-유사 수용체 효능제 (특히, TLR2, TLR4, TLR7/8 및 TLR9 효능제), 및 이러한 성분의 다양한 조합을 포함한다.
"코스모트로픽제"는 일반적으로 단백질을 안정화시키는 극성 물-구조 생성 분자 또는 이온을 의미한다. 일부 실시양태에서 코스모트로픽제는 극성 또는 하전된 분자이다. 일부 실시양태에서 코스모트로픽제는 염으로부터의 하전된 이온이다.
"카오트로픽제"는 일반적으로 단백질을 불안정화시키는 물-구조 파괴 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서 카오트로픽제는 극성 또는 하전된 분자이다. 일부 실시양태에서 카오트로픽제는 염으로부터의 하전된 이온이다.
항원 조성물
일부 실시양태에서, S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 숙주-세포 단백질 대비 96% 초과, 예컨대 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 99.1% 초과, 99.2% 초과, 99.3% 초과, 99.4% 초과, 99.5% 초과, 99.6% 초과, 99.7% 초과, 99.8% 초과 또는 99.9% 초과의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 w/w를 포함한다. 이 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질의 중량은 RSV 가용성 F 단백질의 중량에 첨가된 숙주-세포 단백질의 조합된 총 중량과 비교된다. 그러므로, 이 실시양태에서 항원성 조성물은 실질적인 양의 다른 비-숙주-세포 단백질, 예컨대 추가 재조합 항원, 폴리펩티드 면역-자극제 또는 아주반트 등을 포함할 수 있지만, 예를 들어 숙주-세포 단백질 대비 적어도 99.9% RSV 가용성 F 단백질 w/w를 여전히 포함할 수 있다.
숙주-세포 단백질의 동일성은 질량 분광분석법에 의해 결정될 수 있으며, 동위원소 희석 질량 분광분석법에 의해 존재하는 양은 하기와 같다. 항원 조성물은 결정된 농도를 기준으로 1,4-디티오트레이톨 (DTT)에 의해 환원되고, 이소아세트아미드에 의해 알킬화되고, 밤새 37℃에서 트립신에 의해 소화된다. 소화물은 데이터-의존적 획득 모드에서 작동되는 써모 퓨전 오비트랩(Thermo Fusion Orbitrap)과 같은 장치를 사용하여 LC-MS/MS에 의해 산성화되고 분석된다. 원시 데이터로부터의 피크 목록은 검색 엔진, 예컨대 마르스코트(Marscot) 검색 엔진을 사용하여 모든 공지되고 예측된 숙주-세포 단백질의 서열 및 항원 서열을 함유하는 단백질 데이터베이스에 대해 검색된다. 임의의 오염 또는 원치않는 단백질의 양을 정량화하기 위해, 동위원소 희석 질량 분광분석법 방법을 수행할 수 있다.
전체 HCP의 양을 결정하기 위해, ELISA 검정을 사용할 수 있다. 적합한 ELISA 키트는 관련 기술분야에서 입수가능하고 제조업체의 지침에 따른다. 예를 들어, CHO 세포로부터의 HCP의 경우, 적합한 키트는 시그너스 테크놀로지스, 엘엘씨 (Cygnus Technologies, LLC; 미국 28461 노쓰 캐롤라이나주 사우스포트 사우스포트 서플라이 로드 사우스이스트 4332)로부터 입수가능하다. www-dot- cygnustechnologies.com에서 이용가능한 CHO HCP ELISA 제품 인서트, 800-F015, Rev. 3, 10Jan2018을 참조한다.
일부 실시양태에서, S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 총 단백질 대비 96% 초과, 예컨대 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 99.1% 초과, 99.2% 초과, 99.3% 초과, 99.4% 초과, 99.5% 초과, 99.6% 초과, 99.7% 초과, 99.8% 초과 또는 99.9% 초과의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 w/w를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원성 조성물은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 대비 0.19% 미만, 예컨대 0.18% 미만, 예컨대 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.10%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02, 0.019%, 0.018%, 0.017%, 0.016%, 0.015%, 0.014% 또는 0.013% 미만의 숙주-세포 단백질 w/w를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원성 조성물은 총 단백질 대비 0.18% 미만, 예컨대 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.10%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02, 0.019%, 0.018%, 0.017%, 0.016%, 0.015%, 0.014% 또는 0.013% 미만의 숙주-세포 단백질 w/w를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법에 의해 검출가능한 항원 조성물 중 유일한 숙주-세포 단백질은 GRP78 숙주-세포 단백질이다. 일부 실시양태에서 항원성 조성물은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 대비 0.18% 미만, 예컨대 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.10%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02, 0.019%, 0.018%, 0.017%, 0.016%, 0.015%, 0.014% 또는 0.013% 미만의 GRP78 숙주-세포 단백질 w/w를 포함한다. 일부 실시양태에서 항원성 조성물은 총 단백질 대비 0.18% 미만, 예컨대 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.10%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02, 0.019%, 0.018%, 0.017%, 0.016%, 0.015%, 0.014% 또는 0.013% 미만의 GRP78 숙주-세포 단백질 w/w를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법에 의해 검출가능한 항원 조성물 중 유일한 숙주-세포 단백질은 GRP78 숙주-세포 단백질이고, 항원성 조성물은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 대비 0.18% 미만, 예컨대 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.10%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02, 0.019%, 0.018%, 0.017%, 0.016%, 0.015%, 0.014% 또는 0.013% 미만의 GRP78 숙주-세포 단백질 w/w를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법에 의해 검출가능한 항원 조성물 중 유일한 숙주-세포 단백질은 GRP78 숙주-세포 단백질이고, 항원성 조성물은 총 단백질 대비 0.18% 미만, 예컨대 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.10%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02, 0.019%, 0.018%, 0.017%, 0.016%, 0.015%, 0.014% 또는 0.013% 미만의 GRP78 숙주-세포 단백질 w/w를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 조성물은 응집된 삼량체 대비 80% 초과, 예컨대 81% 초과, 82% 초과, 83% 초과, 84% 초과, 85% 초과, 86% 초과, 87% 초과, 88% 초과, 89% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과 또는 97% 초과의 비응집된 삼량체 w/w를 포함한다.
비응집된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 삼량체의 백분율을 결정하기 위해 SE-HPLC를 사용할 수 있다. 이러한 실험은 상업적으로 입수가능한 HPLC 장치, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 TOSOH, TSKgel UltraSW 응집체 칼럼, 3 μm, 300 Å, 7.8 x 300 mm, cat. #228556 및 TOSOH, TSKgel UltraSW 응집체 가드 칼럼, 3 μm, 6 x 40 mm, cat. #A00027을 사용하는 PDA 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스(Waters Alliance)로 수행될 수 있다. 허용되는 이동상 버퍼는 100 mM 인산나트륨, 300 mM 염화나트륨, pH 7.05이다. 샘플을 이동상으로 220 μg/mL로 희석하고, SE-HPLC에 주입하고, 0.5 mL/분에서 30분 동안 실행한다. 그 후, 샘플 크로마토그램을 9-23.5분의 시간 창 내에 통합한다. 시간설정 그룹은 각 샘플에 존재하는 저분자량 (LMW) 및 고분자량 (HMW) 종의 퍼센트의 결정을 단순화하는데 사용된다. 예시적인 시간설정 그룹 체류 시간 창은 하기와 같다:
· 9.0 내지 17.3분의 HMW 시간설정 그룹.
· 주요 피크 정점은 약 17.6 내지 17.8분에 존재한다.
· 19.1 내지 23.5분의 LMW 시간설정 그룹.
각 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 샘플 크로마토그램에 존재하는 LMW, 주요 피크 및 HMW 종의 백분율은 시간설정 그룹을 사용하여 계산되며; 모든 통합 면적은 합하여 100%가 되어야 한다.
일부 실시양태에서, 글리코실화된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 글리코실화를 포함하여 59.5 kDa 초과, 예컨대 60.0 kDa 초과, 60.5 kDa 초과, 또는 61.0 kDa 초과의 분자 질량을 갖는다. LC-MS는 분자 질량을 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 등전 초점화 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같은 7.8 미만, 예컨대 7.7 미만, 7.6, 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7 미만, 또는 5.4 미만의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 7.8-5.3, 7.4-5.3, 7.0-5.3, 6.8-5.3, 6.6-5.3, 6.4-5.3, 6.2-5.3, 또는 6.0-5.3 범위의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 6.0-5.3 범위의 pI를 갖는다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 글리칸 기를 포함하며, 여기서 상기 글리칸 기의 적어도 40%, 예컨대 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75%는 HILIC-FLR/MS를 사용하는 글리칸 프로파일링에 의해 결정된 바와 같이 시알릴화된다.
본원의 항원 조성물은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 집단을 포함하며, 여기서 상기 집단의 각 삼량체는 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 3개의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로 구성된다: (a) S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F 프로토머"); 및 (b) p27 펩티드의 적어도 10개의 아미노산을 추가로 포함하는, S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F' 프로토머"). 이러한 실시양태에서 삼량체는 하기 화학식으로 기재된다:
nF + (3-n)F' (화학식 I)
여기서 n은 0-3의 정수이고, F는 F 프로토머이고, F'는 F' 프로토머이다. 일부 실시양태에서, n은 1-3의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 2-3의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 3이다. 일부 실시양태에서, 삼량체의 집단 중 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 적어도 1%, 예컨대 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8% 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 20%, 또는 적어도 25%는 F' 프로토머이다. RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 F' 프로토머 및 F 프로토머로의 분리 및 그의 정량화의 결정은 변성 조건 하에 역상 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 수행될 수 있다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, RP-HPLC를 사용함으로써, 삼량체를 F 및 F' 프로토머로 변성시킨 후, 프로토머를 소수성의 차이를 기준으로 분해한다.
일부 실시양태에서, 상기 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 적어도 1%, 예컨대 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8% 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%는 적어도 하나의 F' 프로토머를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서 프로토머의 대략 20%가 F'인 경우, 집단 중 삼량체의 대략 40%가 적어도 하나의 F' 프로토머를 포함한다는 것이 관찰되었다. 삼량체를 적어도 하나의 F' 프로토머를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 및 제로 F'1 프로토머를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체로 분리하는 것 (및 이들의 정량화)은 천연 조건 하에 약한 양이온 교환 액체 크로마토그래피 (WCX-LC)에 의해 수행될 수 있다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, WCX-LC를 사용함으로써, 삼량체 형태를 유지한 후, 이들의 고유 전하 차이를 기준으로 분해한다.
일부 실시양태에서, F' 프로토머는 비절단된 푸린 절단 부위를 포함하는 F1 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, F' 프로토머는 F 프로토머의 분자 질량보다 적어도 1.0 kDa, 예컨대 적어도 1.5 kDa, 적어도 2.0 kDa, 적어도 2.5 kDa, 적어도 3.0 kDa 더 큰 분자 질량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 F' 프로토머를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체 대 제로 F' 프로토머를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 비율은 적어도 1:1.2; 예컨대 적어도 1:1.3; 적어도 1:1.4; 적어도 1:1.5; 적어도 1:1.6; 적어도 1:1.7; 적어도 1:1.8; 적어도 1:1.9; 적어도 1:2.0; 적어도 1:2.1; 적어도 1:2.2; 적어도 1:2.3; 적어도 1:2.4; 적어도 1:2.5; 적어도 1:2.6; 적어도 1:2.7; 적어도 1:2.8; 적어도 1:2.9; 적어도 1:3.0; 적어도 1:3.5; 적어도 1:4; 적어도 1:9; 적어도 1:19; 또는 적어도 1:29이다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 집단은 침강에 의해 검출가능한 제1 및 제2 피크로 크로마토그래피에 의해 분리가능하며, 상기 제1 피크는 약 3.96S의 침강 계수를 갖고, 상기 제2 피크는 약 4.13S의 침강 계수를 갖는다. 침강 계수는 실시예 3(H)에 기재된 바와 같이 결정된다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 F1 쇄 및 F2 쇄를 포함하며, 여기서 F1 쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는 F1 쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. F 및 F' 프로토머 둘 다는 이 실시양태에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, F1 쇄는 예를 들어 F 프로토머의 경우에 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, F' 프로토머는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, F' 프로토머는 N-말단 p27 펩티드를 갖는 F1 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, F' 프로토머는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 F1 쇄 및 F2 쇄를 포함하며, 여기서 F2 쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는 F2 쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하며, 예컨대 이로 이루어진다. F 및 F' 프로토머 둘 다는 이 실시양태에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 F1 쇄 및 F2 쇄를 포함하며, 여기서 F1 쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, F2 쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는 F1 쇄는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고, F2 쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하며, 예컨대 이로 이루어진다. F 및 F' 프로토머 둘 다는 이 실시양태에 기재되어 있다. 이러한 실시양태에서 F1 쇄는 적합하게는 예를 들어 F 프로토머의 경우에 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 예를 들어 F' 프로토머의 경우에 서열식별번호: 8과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄 및 서열식별번호: 3과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F2 쇄를 포함한다. 적합하게는 F1 쇄는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하며, 예컨대 이로 이루어지고, F2 쇄는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하며, 예컨대 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 예컨대 발현 동안 프로세싱 전에 F0 분자 전체를 포함한다. 일부 실시양태에서, F0 분자는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는 F0 쇄는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하며, 예컨대 이로 이루어진다.
상기 언급된 서열과 서열 유사성을 공유하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 조작된 변이체는 또한 상기 기재된 실시양태의 맥락에서 사용될 수 있다. 일반적으로 폴리펩티드 (및 뉴클레오티드) 서열과 관련하여 하기 기재된 바와 같은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (및 폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 유사성은 서열 사이의 유사성 (달리 서열 동일성이라고 함)의 면에서 표현될 수 있음을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 서열 동일성은 동일성 (또는 유사성) 백분율의 면에서 빈번하게 측정되며; 백분율이 높을수록, 두 서열의 1차 구조가 더 유사하다. 일반적으로, 두 아미노산 (또는 폴리뉴클레오티드) 서열의 1차 구조가 더 유사할수록 폴딩 및 어셈블리로 인한 고차 구조가 더 유사하다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (및 폴리뉴클레오티드) 서열의 변이체는 전형적으로 하나 또는 적은 수의 아미노산 결실, 첨가 또는 치환을 갖지만, 그럼에도 불구하고 매우 높은 백분율의 이들의 아미노산, 및 일반적으로 이들의 폴리뉴클레오티드 서열을 공유할 것이다. 더 중요하게는, 변이체는 본원에 개시된 참조 서열의 구조적 및 그러므로 형태적 속성을 보유한다.
서열 동일성을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같음)에 적용가능하다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 하기 문헌에 기재되어 있다: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; 및 Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988. 문헌 [Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994]은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항을 제공한다. NCBI 기본 로컬 정렬 검색 도구 (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990)는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위한, 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI, 미국 메릴랜드주 베데스다) 및 인터넷을 포함하는 여러 출처로부터 이용가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 대한 설명은 인터넷에서 NCBI 웹사이트에서 이용가능하다.
일부 예에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 그것이 유래된 자연 발생 균주의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는다 (예를 들어, 상기 언급된 안정화 변형에 추가하여). 이러한 차이는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환일 수 있다. 변이체는 전형적으로 아미노산 잔기의 20% 이하, 예컨대 15%, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 이하만큼 상이하다. 예를 들어, 생성된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 형태 또는 면역원성 에피토프를 변경하지 않는 서열식별번호: 1, 2, 3, 6, 7 및 8의 예시적인 F1 쇄, F2 쇄, F0 분자 및 p27 펩티드 서열과 비교하여 0-5 위치 (예컨대 0, 1 또는 2)에서 최대 5 (예컨대 1 또는 2)개의 잔기의 결실, 0-5 5개의 위치 (예컨대 0, 1 또는 2)에서 최대 5 (예컨대 1 또는 2)개의 잔기의 삽입 및 최대 20개의 잔기 (예컨대 최대 10개의 잔기, 특히 최대 5개의 잔기)의 치환을 갖는 것. 그러므로, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 맥락에서 변이체는 전형적으로 참조 단백질, 예를 들어, 서열식별번호: 1, 2, 3, 6, 7 및 8의 예시적인 F1 쇄, F2 쇄, F0 분자, 및 p27 펩티드 서열에 예시된 참조 서열 또는 본원에 개시된 임의의 예시적인 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드와 적어도 80%, 또는 85%, 더 일반적으로, 적어도 90% 이상, 예컨대 95%, 또는 심지어 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 본 개시내용의 특징으로서 포함된 추가 변이체는 WO2014160463에 개시된 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 조성물은 상기 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체를 포함한다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 항원 조성물은 3개의 동일한 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 삼량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 조성물은 삼량체의 또 다른 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 구성원과 서열 수준에서 상이한 적어도 하나의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 삼량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 조성물은 2개의 동일한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드, 및 다른 2개의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드와 서열 수준에서 상이한 하나의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 조성물은 3개의 상이한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함한다 (여기서 각 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 아미노산 서열 수준에서 상이함).
RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 이를 포함하는 숙주-세포; RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생산하는 방법
본 개시내용의 또 다른 측면은 상기 기재된 바와 같은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 재조합 핵산은 선택된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주-세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 복제 및 발현을 용이하게 하기 위해, 핵산은 벡터, 예컨대 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드-코딩 핵산을 포함하는 숙주-세포가 또한 본 개시내용의 특징이다. 유리한 숙주-세포는 원핵생물 (즉, 박테리아) 숙주-세포, 예컨대 이. 콜라이, 뿐만 아니라 진균 (예를 들어, 효모) 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포 (예컨대 CHO, VERO 및 HEK293 세포)를 포함하는 수많은 진핵생물 숙주-세포를 포함한다.
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드-코딩 핵산의 생산을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자를 안내하기에 충분한 예시적인 절차는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]; [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (및 2003년 증보판)]; 및 [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999]에서 찾을 수 있다
본원에 개시된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위해 잘 확립된 절차를 사용하여 생산된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자를 안내하기에 충분한 절차는 하기 참고문헌에서 찾을 수 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200; 및 Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 999. 추가적 및 구체적 세부사항은 하기 본원에 제공된다. 이전에 개시된 핵산은 적합하게는 숙주-세포에 도입되고, 본원에 기재된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다.
그러므로, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드-코딩 핵산을 포함하는 숙주-세포가 또한 본 개시내용의 특징이다. 유리한 숙주-세포는 원핵생물 (즉, 박테리아) 숙주-세포, 예컨대 이. 콜라이, 뿐만 아니라 진균 (예를 들어, 효모, 예컨대 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)) 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 포유류 세포 (예컨대 CHO 및 HEK293 세포)를 포함하는 수많은 진핵생물 숙주-세포를 포함한다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 핵산은 예를 들어, 벡터, 예컨대 발현 벡터를 통해 숙주-세포로 도입된다 (예를 들어, 형질도입, 형질전환 또는 형질감염). 상기 기재된 바와 같이, 벡터는 가장 전형적으로 플라스미드이지만, 이러한 벡터는 또한 예를 들어, 바이러스 입자, 파지 등일 수 있다. 적절한 발현 숙주의 예는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 스트렙토미세스(Streptomyces), 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 진균 세포, 예컨대 사카로미세스 세레비시아에, 피키아 파스토리스, 및 뉴스포라 크라사(Neurospora crassa); 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) 및 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 포유류 세포, 예컨대 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 또는 보우스(Bowes) 흑색종; 조류 세포 등을 포함하는 식물 세포를 포함한다.
숙주-세포는 프로모터를 활성화시키거나 형질전환체를 선택하거나 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 전형적으로 발현을 위해 선택된 숙주-세포와 함께 이전에 사용된 것들이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌 [Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York] 및 여기에 인용된 참고문헌을 포함하는 본원에 인용된 참고문헌에서 명백할 것이다. 본 발명의 핵산에 상응하는 발현 산물은 또한 비-동물 세포, 예컨대 식물, 효모, 진균, 박테리아 등에서 생산될 수 있다. 문헌 [Sambrook, Berger and Ausubel] 외에도, 세포 배양에 대한 세부사항은 문헌 [Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY]; [Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture]; [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)] 및 [Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]에서 찾을 수 있다.
박테리아 시스템에서, 발현된 산물을 위해 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 생산을 위해 다량의 폴리펩티드 또는 그의 단편이 필요한 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준 발현을 지시하는 벡터가 유리하게 사용된다. 이러한 벡터는 다중기능성 이. 콜라이 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 BLUESCRIPT (스트라타젠(Stratagene))를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 관심 코딩 서열, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 아미노-말단 번역 개시 메티오닌 및 촉매적으로 활성인 베타 갈락토시다제 융합 단백질을 생성하는 베타-갈락토시다제의 후속 7개 잔기를 위한 서열과 인-프레임 벡터; pIN 벡터 (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); pET 벡터 (노바젠(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨)에 라이게이션될 수 있다.
유사하게, 효모, 예컨대 사카로미세스 세레비시아에에서, 구성적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 함유하는 다수의 벡터가 원하는 발현 산물의 생산에 사용될 수 있다. 검토를 위해, 문헌 [Berger, Ausubel], 및 예를 들어 [Grant et al. (1987; Methods in Enzymology 153:516-544)]을 참조한다. 포유류 숙주-세포에서, 플라스미드 및 바이러스-기반 시스템 둘 다를 포함하는 다수의 발현 시스템이 사용될 수 있다.
숙주-세포는 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 원하는 방식으로 발현된 단백질을 프로세싱하는 그의 능력에 대해 임의로 선택된다. 이러한 단백질 변형은 글리코실화 (뿐만 아니라, 예를 들어, 아세틸화, 카르복실화, 인산화, 지질화 및 아실화)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 전구체 형태를 단백질의 성숙한 형태로 절단하는 번역후 프로세싱 (예를 들어, 푸린 프로테아제에 의해)는 숙주-세포의 맥락에서 임의로 수행된다. 다양한 숙주-세포, 예컨대 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38 등은 이러한 번역후 활성에 대한 특이적 세포 기계 및 특징 메카니즘을 갖고, 도입된 외래 단백질의 올바른 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다.
본원에 개시된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정적 발현 시스템이 전형적으로 사용된다. 예를 들어, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 숙주-세포에 도입된다. 벡터의 도입 후, 세포는 선택적 배지로 전환되기 전에 농축 배지에서 1-2일 동안 성장하도록 허용된다. 선택가능한 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이며, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 예를 들어, 안정적으로 형질전환된 세포의 저항성 그룹 또는 콜로니는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주-세포는 임의로 세포 배양으로부터 코딩된 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에 배양된다.
적합한 숙주-세포주의 형질도입 및 숙주-세포의 적절한 세포 밀도로의 성장 후, 선택된 프로모터는 적절한 수단 (예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 유도되고, 세포는 추가 기간 동안 배양된다. 임의로, 배지는 프로테이나제에 의한 발현된 단백질의 분해를 감소시키는 성분 및/또는 첨가제를 포함한다. 예를 들어, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생산하기 위해 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 세포 또는 세포외 (예를 들어, 매트릭스) 프로테이나제에 의한 원치않는 절단을 감소시키거나 제거하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 킬레이트제 또는 소분자 억제제 (예를 들어, AZ11557272, AS111793 등)를 포함할 수 있다.
그 후, 분비된 폴리펩티드 산물을 배양 배지로부터 회수한다. 대안적으로, 세포를 1차 및 2차 필터를 사용한 심층 여과, 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 수단 등에 의해 파괴하고, 추가 정제를 위해 보유된 조 추출물을 생성할 수 있다. 단백질의 발현에 사용되는 진핵생물 또는 미생물 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 방법에 의해 파괴될 수 있다.
RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 정제를 위한 공정
일부 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하기 위해 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양한 후, 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 리간드는 정전기적 상호작용, 수소 결합 또는 소수성 상호작용을 통해, 또는 이들의 조합에 의해 단백질과 상호작용할 수 있다.
다중모드 크로마토그래피를 위한 매질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 다중모드 이온 교환 리간드는 이온성 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 포함하는 여러 유형의 상호작용을 통해 표적 분자와 상호작용하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공정은 로딩 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질 상에 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하는 제1 단계, 및 용리 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질로부터 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 제2 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리간드 연결된 기질은 다중모드 음이온 교환 수지이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함한다. N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 다중모드 음이온 교환 수지는 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터 상업적으로 입수가능하다. 인터넷 주소 www-dot-gehealthcare.com에서 이용가능한 캅토 어드히어(Capto adhere) 다중모드 매질 지침서, 28-9064-05 AA를 참조한다.
일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 코스모트로픽제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 카오트로픽제를 포함한다. 코스모트로픽제는 HPO4, 시트레이트, SO4, F, OAc, CO2, SO2, SCN, HPO2, Mg, Li, Zn, Al, tert-부탄올, 트레할로스, 글루코스, 프롤린 및 글루타메이트를 포함한다. 카오트로픽제는 K, Cs, NH4, (CH3)4N, n-부탄올, 에탄올, 구아니디늄 클로라이드, 과염소산염, 아세테이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 페놀, 2-프로판올, 나트륨 도데실 술페이트, 티오우레아, 우레아, 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Kgwu et al., (2004) "The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability" Pharmaceutical Technology, 28:86-108]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 코스모트로픽제 및 카오트로픽제 둘 다를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 코스모트로픽제 및 카오트로픽제의 역작용 효과가 결합된 기질에 적용된다. 이 방법론은 원치않는 숙주-세포 단백질을 최소한으로 동반하여 원하는 폴리펩티드를 용리시키는 것으로 관찰되었다. 다중모드 음이온 교환이 적용, 예컨대 모노클로날 항체의 정제에서 사용되는 동안, 이것은 유도-통과 모드로 및/또는 역작용 코스모트로픽제 및 카오트로픽제를 포함하는 버퍼가 사용되는 본 실시양태와는 대조적으로 pH 구배 버퍼를 사용하여 항체를 용리시키는 경우 수행된다.
일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 시트레이트 이온 및 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 150 - 350 mM 시트르산나트륨, 200 - 300 mM 시트르산나트륨, 225 - 275 mM 시트르산나트륨, 230 - 270 mM 시트르산나트륨, 235 -265 mM 시트르산나트륨, 240 - 260 mM 시트르산나트륨, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; 및 200 - 400 mM 아르기닌, 250 - 350 mM 아르기닌, 275 - 325 mM 아르기닌, 280 - 320 mM 아르기닌, 285 - 315 mM 아르기닌, 290 - 310 mM 아르기닌, 또는 295 - 305 mM 아르기닌을 포함한다. 한 실시양태에서, 용리 버퍼는 250 mM 시트르산나트륨 및 300 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 10-30 mM 인산나트륨, 15-25 mM 인산나트륨, 16-24 mM 인산나트륨, 17-23 mM 인산나트륨, 18-22 mM 인산나트륨, 19-21 mM 인산나트륨을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 20 mM 인산나트륨을 포함한다.
전해질 용액의 전도도는 전기를 전도하는 그의 능력의 측정이다. 전도도의 SI 단위는 미터당 지멘스 (S/m)이다. 센티미터당 밀리지멘스 (mS/cm)는 미터당 전기 전도도 지멘스의 SI 단위의 소수이다. 1 mS/cm = 0.1 S/m. 전도도 측정은 용액에서 이온 함량을 측정하기 위해 많은 산업 응용분야에서 일상적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼의 전도도는 로딩 버퍼가 20 - 34 mS/cm, 21 - 33 mS/cm, 22 - 32 mS/cm, 23 - 31 mS/cm, 24 - 30 mS/cm, 또는 25 - 29 mS/cm의 전도도를 갖도록 관심 표적 폴리펩티드로 리간드의 로딩을 증강시키기 위해 유리하게 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 25 - 29 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼의 전도도는 로딩 버퍼가 11 - 34 mS/cm, 13 - 31 mS/cm, 15 - 27 mS/cm, 17 - 25 mS/cm, 19 - 23 mS/cm, 또는 20 - 22 mS/cm의 전도도를 갖도록 관심 표적 폴리펩티드로 리간드의 로딩을 증강시키기 위해 유리하게 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 19-23 mS/cm의 전도도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 150 - 300 mM, 예컨대 175 - 275 mM, 200 - 250 mM, 210 - 240 mM, 220 - 230 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 225 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 100 - 300 mM, 예컨대 120 - 250 mM, 140 - 225 mM, 160 - 200 mM, 170 - 190 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 180 mM 염화나트륨을 포함한다.
일부 실시양태에서, 로딩 버퍼 및 용리 버퍼는 독립적으로 6.5 - 7.9, 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼 및 용리 버퍼는 독립적으로 7.0-7.4의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 7.0 - 8.0, 7.1 - 7.9, 7.2 - 7.8, 또는 7.3 - 7.7의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 로딩 버퍼는 7.3 - 7.7의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 6.9 - 7.9, 7.0 - 7.8, 7.1 - 7.7, 또는 7.2 - 7.6의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 버퍼는 7.2 - 7.6의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 액체 크로마토그래피 정제는 (a) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 150 - 300 mM, 예컨대 175 - 275 mM, 200 - 250 mM, 210 - 240 mM, 220 - 230 mM 염화나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 기질 상에 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 함유하는 액체 매질을 로딩하는 단계; 및 (b) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 액체 크로마토그래피 정제는 (a) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 100 - 300 mM, 예컨대 120 - 250 mM, 140 - 225 mM, 160 - 200 mM, 170 - 190 mM 염화나트륨; pH 7.0 - 8.0, 예컨대 7.1 - 7.9, 7.2 - 7.8, 또는 7.3 - 7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 기질 상에 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 함유하는 액체 매질을 로딩하는 단계; 및 (b) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.9 - 7.9, 예컨대 7.0 - 7.8, 7.1 - 7.7, 또는 7.2 - 7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 액체 크로마토그래피 정제는 (a) 20 mM 인산나트륨; 235 mM 염화나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 함유하는 액체 매질을 로딩하는 단계; 및 (b) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 액체 크로마토그래피 정제는 (a) 20 mM 인산나트륨; 225 mM 염화나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 함유하는 액체 매질을 로딩하는 단계; 및 (b) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공되며, 여기서 액체 크로마토그래피 정제는 (a) 20 mM 인산나트륨; 180 mM 염화나트륨; pH 7.3 - 7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 함유하는 액체 매질을 로딩하는 단계; 및 (b) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.2 - 7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 음이온 교환 크로마토그래피로 처리된다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 100-130 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-250 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함한다. 4차 아민 기를 보유하는 음이온 교환 크로마토그래피용 수지는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 인터넷 주소 www-dot-gelifesciences.com/bioprocess에서 이용가능한 캅토(Capto) Q ImpRes 이온 교환 크로마토그래피 데이터 파일 28-9837-63AC를 참조한다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 115 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 20 mM 인산나트륨, 225 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 음이온 교환 크로마토그래피로 처리된다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 40-120 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 10-30 mM 인산나트륨, 130-230 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함한다. 4차 아민 기를 보유하는 음이온 교환 크로마토그래피용 수지는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 인터넷 주소 www-dot-gelifesciences.com/bioprocess에서 이용가능한 캅토 Q ImpRes 이온 교환 크로마토그래피 데이터 파일 28-9837-63AC를 참조한다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 80 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 20 mM 인산나트륨, 180 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 함유하는 액체 매질을 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 100-130 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-250 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 150 - 300 mM, 예컨대 175 - 275 mM, 200 - 250 mM, 210 - 240 mM, 220 - 230 mM 염화나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 7.0 - 7.4, 또는 7.1 - 7.3을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (d) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 함유하는 액체 매질을 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 40-120 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 10-30 mM 인산나트륨, 130-230 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 100 - 300 mM, 예컨대 120 - 250 mM, 140 - 225 mM, 160 - 200 mM, 170 - 190 mM 염화나트륨; pH 7.0 - 8.0, 예컨대 7.1 - 7.9, 7.2 - 7.8, 또는 7.3 - 7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (d) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.9 - 7.9, 예컨대 7.0 - 7.8, 7.1 - 7.7, 또는 7.2 - 7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 115 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (b) 20 mM 인산나트륨, 225 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 20 mM 인산나트륨; 225 mM 염화나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (d) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 80 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (b) 20 mM 인산나트륨, 180 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 20 mM 인산나트륨; 180 mM 염화나트륨; pH 7.3-7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (d) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.2-7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 정제 공정은 (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 115 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (b) 20 mM 인산나트륨, 225 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 20 mM 인산나트륨; 225 mM 염화나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (d) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 정제 공정은 (a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 80 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (b) 20 mM 인산나트륨, 180 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 20 mM 인산나트륨; 180 mM 염화나트륨; pH 7.3-7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (d) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.2-7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 40-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0)으로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-270 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함하는 친화성-유사 크로마토그래피 단계로 처리된다.
일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 30-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0)으로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-270 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함하는 친화성-유사 크로마토그래피 단계로 처리된다.
덱스트란 술페이트를 포함하는 친화성-유사 크로마토그래피용 매질은 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 인터넷 주소 www-dot- gelifesciences.com/bioprocess에서 이용가능한 캅토 DeVirS 친화성 크로마토그래피 데이터 파일 28-9616-49 AA를 참조한다. 일부 실시양태에서, 친화성-유사 크로마토그래피는 (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 캅토 DeVirS 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 47 mM 인산나트륨, pH 7.0-7.4로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 20 mM 인산나트륨, 235 mM 염화나트륨 (pH 7.0-7.4)을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 친화성-유사 크로마토그래피는 (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 캅토 DeVirS 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 40 mM 인산나트륨, pH 7.1-7.5로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 20 mM 인산나트륨, 240 mM 염화나트륨 (pH 7.2-7.6)을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 40-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0)으로 평형화되는 것인 단계; (b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-270 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 100-130 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (d) 10-30 mM 인산나트륨, 200-250 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (e) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 150 - 300 mM, 예컨대 175 - 275 mM, 200 - 250 mM, 210 - 240 mM, 220 - 230 mM 염화나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (f) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 30-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0)으로 평형화되는 것인 단계; (b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-270 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 40-120 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (d) 10-30 mM 인산나트륨, 130-230 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (e) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 100 - 300 mM, 예컨대 120 - 250 mM, 140 - 225 mM, 160 - 200 mM, 170 - 190 mM 염화나트륨; pH 7.0 - 8.0, 예컨대 7.1 - 7.9, 7.2 - 7.8, 또는 7.3 - 7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (f) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.9 - 7.9, 예컨대 7.0 - 7.8, 7.1 - 7.7, 또는 7.2 - 7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 캅토 DeVirS 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 47 mM 인산나트륨, pH 7.0-7.4로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 20 mM 인산나트륨, 235 mM 염화나트륨 (pH 7.0-7.4)을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 115 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (d) 20 mM 인산나트륨, 225 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (e) 20 mM 인산나트륨; 225 mM 염화나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (f) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 캅토 DeVirS 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 40 mM 인산나트륨, pH 7.1-7.5로 평형화되는 것인 단계; 및 (b) 20 mM 인산나트륨, 240 mM 염화나트륨 (pH 7.2-7.6)을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 80 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (d) 20 mM 인산나트륨, 180 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (e) 20 mM 인산나트륨; 180 mM 염화나트륨; pH 7.3-7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (f) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.2-7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 친화성-유사 크로마토그래피 단계 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 바이러스 불활성화 단계에 적용된다. 일부 실시양태에서, 친화성-유사 크로마토그래피 단계 후에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 바이러스 불활성화 단계에 적용된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 불활성화 단계는 세제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 불활성화 단계는 0.5-2.5% (예를 들어, 0.5-1.5%)의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 10-25시간 동안 15-25℃의 온도에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 불활성화 단계는 0.5-1.5%의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 10-25시간 동안 15-25℃의 온도에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 불활성화 단계는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 농도를 1.0%로 조절하고, 상기 액체 배지를 15-20시간 동안 제어된 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 불활성화 단계는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 농도를 2.0%로 조절하고, 상기 액체 배지를 18-24시간 동안 제어된 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 0.5-1.5%의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 10-25시간 동안 15-25℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계; (b) 덱스트란 술페이트를 포함하는 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 40-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0)으로 평형화되는 것인 단계; (c) 10-30 mM 인산나트륨, 200-270 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (d) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 100-130 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (e) 10-30 mM 인산나트륨, 200-250 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (f) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 150 - 300 mM, 예컨대 175 - 275 mM, 200 - 250 mM, 210 - 240 mM, 220 - 230 mM 염화나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (g) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 또는 7.0 - 7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 후에 바이러스 여과가 이어진다. 일부 실시양태에서, 바이러스 여과 후에 한외여과/투석여과 단계가 이어진다.
일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 30-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0)으로 평형화되는 것인 단계; (b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-270 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 0.5-2.5%의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 10-25시간 동안 15-25℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계; (d) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 10-30 mM 포스페이트 및 40-120 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; 및 (e) 10-30 mM 인산나트륨, 130-230 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (f) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; 100 - 300 mM, 예컨대 120 - 250 mM, 140 - 225 mM, 160 - 200 mM, 170 - 190 mM 염화나트륨; pH 7.0 - 8.0, 예컨대 7.1 - 7.9, 7.2 - 7.8, 또는 7.3 - 7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (g) (i) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨; (ii) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌; 및 (iii) 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 19-21 mM 인산나트륨; pH 6.9 - 7.9, 예컨대 7.0 - 7.8, 7.1 - 7.7, 또는 7.2 - 7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 후에 바이러스 여과가 이어진다. 일부 실시양태에서, 바이러스 여과 후에 한외여과/투석여과 단계가 이어진다.
일부 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 농도를 1.0%로 조절하고, 상기 액체 배지를 15-20시간 동안 제어된 실온에서 인큐베이션하는 단계; (b) 덱스트란 술페이트를 포함하는 캅토 DeVirS 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 47 mM 인산나트륨, pH 7.0-7.4로 평형화되는 것인 단계; (c) 20 mM 인산나트륨, 235 mM 염화나트륨 (pH 7.0-7.4)을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (d) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 115 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (e) 20 mM 인산나트륨, 225 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (f) 20 mM 인산나트륨; 225 mM 염화나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (g) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.0-7.4를 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 후에, 0.1 μm 막을 사용하는 사전여과 및 19 nm 막을 사용하는 여과의 추가 단계를 포함하는 바이러스 여과가 이어진다. 일부 실시양태에서, 바이러스 여과 후에, 50 kDa 분자량 컷오프 막 및 10 mM 인산칼륨, 5% 트레할로스를 포함하는 투석여과 버퍼를 사용하는 한외여과/투석여과 단계가 이어진다. 일부 실시양태에서, 한외여과/투석여과 단계 후에, 0.05%의 농도로 폴리소르베이트 80을 첨가하는 단계가 이어진다. 일부 실시양태에서, 폴리소르베이트 80을 첨가하는 단계 후에, 약 0.2 μm 이하의 컷오프를 갖는 필터를 사용하는 여과 단계가 이어진다.
일부 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, (a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 캅토 DeVirS 매질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 40 mM 인산나트륨, pH 7.1-7.5로 평형화되는 것인 단계; (b) 20 mM 인산나트륨, 240 mM 염화나트륨 (pH 7.2-7.6)을 포함하는 버퍼를 사용하여 매질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (c) 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 농도를 2.0%로 조절하고, 상기 액체 배지를 18-24시간 동안 제어된 실온에서 인큐베이션하는 단계; (d) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 캅토 Q ImpRes 기질을 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 20 mM 포스페이트, 80 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계; (e) 20 mM 인산나트륨, 180 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계; (f) 20 mM 인산나트륨; 180 mM 염화나트륨; pH 7.3-7.7을 포함하는 로딩 버퍼에서 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 캅토 어드히어 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 로딩하는 단계; 및 (g) (i) 250 mM 시트르산나트륨; (ii) 300 mM 아르기닌; 및 (iii) 20 mM 인산나트륨; pH 7.2-7.6을 포함하는 용리 버퍼를 사용하여 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 본원의 다른 곳에 기재된 항원 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 후에, 0.1 μm 막을 사용하는 사전여과 및 19 nm 막을 사용하는 여과의 추가 단계를 포함하는 바이러스 여과가 이어진다. 일부 실시양태에서, N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 후에, 0.1 μm 막을 사용하는 사전여과 및 20 nm 막을 사용하는 여과의 추가 단계를 포함하는 바이러스 여과가 이어진다. 일부 실시양태에서, 바이러스 여과 후에, 50 kDa 분자량 컷오프 막 및 10 mM 인산칼륨, 4% 트레할로스를 포함하는 투석여과 버퍼를 사용하는 한외여과/투석여과 단계가 이어진다. 일부 실시양태에서, 한외여과/투석여과 단계 후에, 0.05%의 농도로 폴리소르베이트 80을 첨가하는 단계가 이어진다. 일부 실시양태에서, 폴리소르베이트 80을 첨가하는 단계 후에, 약 0.2 μm 이하의 컷오프를 갖는 필터를 사용하는 여과 단계가 이어진다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 공정 후에, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 동결건조시키는 단계가 이어진다. 재조합 단백질의 동결건조 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Hsu et al. (1992) "Determining the optimum residual moisture in lyophilized protein pharmaceuticals," Developments in Biological Standardization 74:255-70; Costantine et al. (1998) "Effect of excipients on the stability and structure of lyophilized recombinant human growth hormone," J. Pharm. Sci. 87:1412-1420]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 삼량체의 집단을 삼량체의 집단으로 분리하는 방법이 제공되며, 여기서 대부분의 삼량체는 적어도 하나의 F' 프로토머 및 삼량체의 집단을 포함하며, 여기서 대부분의 삼량체는 3개의 F 프로토머를 포함하며, 상기 방법은 캅토 MMC ImpRes 크로마토그래피 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캅토 MMC ImpRes 크로마토그래피 단계는 0 내지 250 mM의 NaCl 구배, 20 mM 인산나트륨, 1M Na시트레이트를 사용한다. 일부 실시양태에서, 염화나트륨 구배는 20 칼럼 부피에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 F' 프로토머를 포함하는 삼량체의 집단 및 3개의 F 프로토머를 포함하는 삼량체의 집단으로 상기 기재된 바와 같은 삼량체의 집단을 분리하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 약한 양이온 교환 액체 크로마토그래피 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약한 양이온 교환 액체 크로마토그래피 단계는 삼량체 집단을 용리시키기 위해 0 mM NaCl 내지 400 mM NaCl의 염화나트륨 구배를 사용한다. 일부 실시양태에서, 염화나트륨 구배는 1 mL/분의 유량으로 25분에 걸쳐 수행된다. 일부 실시양태에서, 약한 양이온 교환은 100 mM 일염기성 인산나트륨을 포함하는 제1 이동상, 100 mM 이염기성 인산나트륨을 포함하는 제2 이동상, 1 M 염화나트륨을 포함하는 제3 이동상, 및 물의 제4 이동상을 사용하여 수행된다. 이들 방법은 제조업체의 지침서에 따라 워터스(Waters) 액퀴티(Acquity) UPLC 기기를 사용하여 상업적으로 입수가능한 매질 및 기기, 예컨대 써모피셔(ThermoFisher)로부터의 ProPac WCX-10 칼럼 (assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/manuals/br-21689-propac-wcx-tips-tricks-br21689-en.pdf에서 인터넷에서 이용가능함)에서 적합하게 수행될 수 있다.
면역원성 조성물 및 방법
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이 또한 제공된다. 제약상 허용되는 담체 및 부형제는 널리 공지되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 담체 또는 부형제는 유리하게는 버퍼를 포함할 수 있다. 임의로, 담체 또는 부형제는 또한 용해도 및/또는 안정성을 안정화시키는 적어도 하나의 구성성분을 함유한다. 가용화제/안정화제의 예는 세제, 예를 들어, 로렐 사르코신 및/또는 트윈을 포함한다. 대안적인 가용화제/안정화제는 아르기닌, 및 유리 형성 폴리올 (예컨대, 수크로스, 트레할로스 등)을 포함한다. 수많은 제약상 허용가능한 담체 및/또는 제약상 허용가능한 부형제는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975)]에 기재되어 있다.
따라서, 적합한 부형제 및 담체는 선택된 투여 경로에 의해 대상체에게 전달하기에 적합한 제형을 제조하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 적합한 부형제는 제한 없이 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 소르비톨, 트레할로스, N-라우로일사르코신 나트륨 염, L-프롤린, 비세제 술포베타인, 구아니딘 히드로클로라이드, 우레아, 트리메틸아민 옥사이드, KCl, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ 및 다른 2가 양이온 관련 염, 디티오트레이톨, 디티오에리트롤, 및 ß-머캅토에탄올을 포함한다. 다른 부형제는 세제 (트윈(Tween)80, 트윈20, 트리톤(Triton) X-00, NP-40, 엠피겐(Empigen) BB, 옥틸글루코시드, 라우로일 말토시드, 양극성이온제(Zwittergent) 3-08, 양극성이온제 3-0, 양극성이온제 3-2, 양극성이온제 3-4, 양극성이온제 3-6, CHAPS, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실 술페이트, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 포함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드, 10 mM 인산칼륨, 5% 트레할로스, 0.05% 폴리소르베이트 80 (pH 7.0)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드, 10 mM 인산칼륨, 4% 트레할로스, 0.05% 폴리소르베이트 80 (pH 6.8)을 포함한다.
본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 동결건조 단계는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 동결건조된 면역원성 조성물이 제공된다.
임의로, 면역원성 조성물은 또한 아주반트를 포함한다. RSV에 대한 보호적 면역 반응을 유도할 목적으로 대상체에게 투여하기에 적합한 면역원성 조성물의 맥락에서, 아주반트는 Th1 편향된 면역 반응을 유도하도록 선택된다.
아주반트는 전형적으로 조성물이 투여되는 대상체 또는 대상체 집단에서 Th1 편향된 면역 반응을 증강시키기 위해 선택된다. 예를 들어, 면역원성 조성물이 RSV 감염에 걸리기 쉬운 (또는 위험이 증가된) 특정 연령 그룹의 대상체에게 투여되는 경우, 아주반트는 대상체 또는 대상체 집단에서 안전하고 효과적인 것으로 선택된다. 그러므로, 고령자 대상체 (예컨대 적어도 50세의 대상체)에 투여하기 위한 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 조성물을 함유하는 면역원성 조성물을 제형화하는 경우, 아주반트는 고령자 대상체에서 안전하고 효과적인 것으로 선택된다. 유사하게, 면역원성 조성물이 신생아 또는 유아 대상체 (예컨대 출생 내지 2세의 대상체)에 투여되도록 의도된 경우, 아주반트는 신생아 및 유아에서 안전하고 효과적인 것으로 선택된다.
또한, 면역원성 조성물이 투여되는 투여 경로를 통해 투여되는 경우, 아주반트는 전형적으로 Th1 면역 반응을 증강시키기 위해 선택된다. 예를 들어, 비강 투여를 위해 면역원성을 제형화하는 경우, 프로테아솜 및 프로톨린이 유리한 Th1-편향 아주반트이다. 대조적으로, 면역원성 조성물이 근육내 투여용으로 제형화되는 경우, 하나 이상의 TLR 4 효능제 (예를 들어, 3D-MPL), 사포닌 (예를 들어, QS21), 리포솜, 및/또는 오일 및 물 에멀젼을 포함하는 아주반트가 유리하게 선택된다. 아주반트는 면역원성 조성물과는 별도로 제형화될 수 있지만, 편의상 전형적으로 공동제형화된다.
아주반트가 액체로서 면역원성 조성물과는 별도로 제형화되고 면역원성 조성물이 동결건조되는 경우, 액체 아주반트가 동결건조된 면역원성 조성물을 재구성하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 액체 아주반트에서 재구성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
관심 아주반트는 리포솜 제형에서 TLR4 효능제 및 사포닌을 포함한다.
TLR4 효능제의 적합한 예는 리포폴리사카라이드, 적합하게는 지질 A의 무독성 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A 및 보다 특히 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)이다.
3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이올로지칼스 엔.에이.(GlaxoSmithKline Biologicals N.A.)에 의해 명칭 'MPL'으로 판매되고, 문서 전반에 걸쳐 3D-MPL로서 언급된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 및 4,912,094를 참조한다. 3D-MPL은 GB 2 220 211 A에 기재된 방법에 따라 생산될 수 있다. 화학적으로 이는 4, 5 또는 6 아실화된 쇄와 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A의 혼합물이다. 본 발명의 맥락에서 작은 입자 3D-MPL은 수성 아주반트 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 작은 입자 3D-MPL은 0.22 um 필터를 통해 멸균성-여과될 수 있게 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 WO94/21292에 기재되어 있다.
사용될 수 있는 다른 TLR4 효능제는 알킬 글루코사미니드 포스페이트 (AGP), 예컨대 WO98/50399 또는 미국 특허 번호 6,303,347에 기재된 것이다 (AGP의 제조 방법이 또한 기재됨). 일부 AGP는 TLR4 효능제이고, 일부는 TLR4 길항제이다.
본원에 기재된 면역원성 조성물에 사용될 수 있는 다른 TLR4 효능제는 글루코피라노실 지질 아주반트 (GLA), 예컨대 WO2008/153541 또는 WO2009/143457 또는 문헌 논문 [Coler RN et al. (2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333] 및 [Arias MA et al. (2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144]에 기재된 것을 포함한다. WO2008/153541 또는 WO2009/143457은 본 발명에서 사용될 수 있는 TLR4 효능제를 정의할 목적으로 본원에 참조로 포함된다.
전형적으로 TLR4 효능제, 예컨대 리포폴리사카라이드 및 특히 3D-MPL은 적어도 90% 순수한, 예컨대 적어도 95% 순수한, 특히 적어도 98% 순수한, 특히 99% 순수하다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 사포닌은 Quil A 및 그의 유도체이다. Quil A는 남미 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)로부터 단리된 사포닌 제제이고, 아주반트 활성을 갖는 것으로 문헌 [Dalsgaard et al. in 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)]에 최초로 기재되었다. Quil A와 연관된 독성 없이 아주반트 활성을 보유하는 Quil A의 정제된 분획이 HPLC에 의해 단리되었다 (예를 들어, EP0362278 참조). 일반적인 관심 분획은 QS7, QS17, QS18 및 QS-21, 예를 들어 QS7 및 QS-21 (또한 QA7 및 QA21로서 공지됨)을 포함한다. QS-21은 특히 관심있는 사포닌이다.
전형적으로 사포닌, 예컨대 Quil A 및 특히 QS-21은 적어도 90% 순수한, 예컨대 적어도 95% 순수한, 특히 적어도 98% 순수한, 특히 99% 순수하다.
유익한 특징은 사포닌이 외인성 스테롤, 예컨대 콜레스테롤로 켄칭되는 반응유발성이 적은 조성물로 제공된다는 것이다. 적합하게는 사포닌:스테롤 (예를 들어, QS21:콜레스테롤)의 비율은 1:100 내지 1:1 w/w, 예컨대 1:10 내지 1:1 w/w, 예를 들어, 1:5 내지 1:1 w/w이다.
리포솜 크기는 인지질 조성 및 이들의 제조에 사용되는 방법에 따라 30 nm에서 수 um까지 다양할 수 있다.
리포솜은 바람직하게는 DOPC를 함유하거나 DOPC 및 스테롤 (적절하게는 사포닌 및 LTR4 효능제 포함)로 본질적으로 이루어지나, 많은 다양한 지질로부터 형성될 수 있다.
본 발명에서, 리포솜 크기는 50 nm 내지 200 nm, 특히 60 nm 내지 180 nm, 예컨대 70-165 nm의 범위일 것이다. 최적으로, 리포솜은 안정적이고 ~100 nm의 직경을 가져서 여과에 의한 편리한 멸균화를 허용해야 한다.
리포솜의 구조적 무결성은 리포솜의 크기 (Z-평균 직경, Zav) 및 다분산성을 측정하는 방법, 예컨대 동적 광 산란 (DLS)에 의해 또는 리포솜의 구조의 분석을 위한 전자 현미경법에 의해 평가될 수 있다. 한 실시양태에서 평균 입자 크기는 95 내지 120 nm이고/거나, 다분산성 (PdI) 지수는 0.35 이하, 특히 0.3 이하, 예컨대 0.2 이하이다.
임의로, 아주반트는 또한 미네랄 염, 예컨대 알루미늄 또는 칼슘 염, 특히 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 인산칼슘을 포함할 수 있다. 예를 들어, 알루미늄 염 (예를 들어, 수산화알루미늄 또는 "백반")과 조합하여 3D-MPL을 함유하는 아주반트는 인간 대상체에게 투여하기 위한 면역원성 조성물로 제형화하기에 적합하다.
상이한 아주반트, 예컨대 상기 본원에 언급된 것의 조합은 또한 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 조성물과 함께 조성물로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이미 언급된 바와 같이, QS21은 3D-MPL과 함께 제형화될 수 있다. QS21 : 3D-MPL의 비율은 전형적으로 대략 1 : 10 내지 10 : 1; 예컨대 1:5 내지 5 : 1, 및 종종 실질적으로 1 : 1일 것이다. 전형적으로, 비율은 2.5 : 1 내지 1 : 1 3D-MPL: QS21의 범위이다. 또 다른 조합 아주반트 제형은 3D-MPL 및 알루미늄 염, 예컨대 수산화알루미늄을 포함한다. 조합하여 제형화되는 경우, 이 조합은 항원-특이적 Th1 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
일부 예에서, 아주반트 제형은 수중유 에멀젼, 또는 미네랄 염, 예컨대 칼슘 또는 알루미늄 염, 예를 들어 인산칼슘, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄을 포함한다.
수중유 에멀젼의 한 예는 수성 담체에 대사가능한 오일, 예컨대 스쿠알렌, 토콜, 예컨대 토코페롤, 예를 들어, 알파-토코페롤, 및 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80 또는 트윈 80을 포함한다. 수성 담체는 예를 들어, 포스페이트 완충 염수일 수 있다. 추가로, 수중유 에멀젼은 스팬 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다.
백반이 존재하는 경우, 예를 들어, 3D-MPL과 조합하여, 양은 전형적으로 용량당 약 100 μg 내지 1 mg, 예컨대 약 100 μg, 또는 약 200 μg 내지 약 750 μg, 예컨대 약 500 μg이다.
액체 제제의 pH는 조성물의 성분 및 대상체에게 투여하는데 필요한 적합성을 고려하여 조절된다. 적합하게는, 액체 혼합물의 pH는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 5.5, 적어도 5.8, 적어도 6이다. 액체 혼합물의 pH는 9 미만, 8 미만, 7.5 미만 또는 7 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 액체 혼합물의 pH는 4 내지 9, 5 내지 8, 예컨대 5.5 내지 8이다. 결과적으로, pH는 적합하게는 6-9, 예컨대 6.5-8.5일 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, pH는 5.8 내지 6.4이다.
적절한 버퍼는 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 말레에이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트 및 트리스로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 버퍼는 포스페이트 버퍼, 예컨대 Na/Na2PO4, Na/K2PO4 or K/K2PO4이다.
버퍼는 적어도 6 mM, 적어도 10 mM 또는 적어도 40 mM의 양으로 액체 혼합물에 존재할 수 있다. 버퍼는 100 mM 미만, 60 mM 미만 또는 40 mM 미만의 양으로 액체 혼합물에 존재할 수 있다.
비경구 투여용 용액이 세포 왜곡 또는 용해를 방지하기 위해 제약상 허용되는 오스몰 농도를 가져야 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 제약상 허용되는 오스몰 농도는 일반적으로 용액이 대략 등장성 또는 약간 고장성인 오스몰 농도를 가질 것임을 의미할 것이다. 적합하게 재구성될 때 본 발명의 조성물은 250 내지 750 mOsm/kg 범위의 오스몰 농도를 가질 것이며, 예를 들어, 오스몰 농도는 250 내지 550 mOsm/kg의 범위, 예컨대 280 내지 500 mOsm/kg의 범위일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서 오스몰 농도는 280 내지 310 mOsm/kg의 범위일 수 있다.
오스몰 농도는 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라, 예컨대 상업적으로 입수가능한 삼투압계, 예를 들어 어드밴스드 인스트루먼츠 인크.(Advanced Instruments Inc.) (USA)로부터 이용가능한 어드밴스드(Advanced)® 모델 2020의 사용에 의해 측정될 수 있다.
"등장화제"는 생리학적으로 허용되고 제형과 접촉하는 세포막을 가로지르는 물의 순 유동을 방지하기 위해 제형에 적합한 장성을 부여하는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 조성물에 사용되는 등장화제는 염 (또는 염의 혼합물)이고, 편리하게는 염은 적합하게는 대략 150 mM의 농도의 염화나트륨이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 조성물은 비이온성 등장화제를 포함하고, 조성물 중 염화나트륨의 농도는 100 mM 미만, 예컨대 80 mM 미만, 예를 들어 50 mM 미만, 예컨대 40 mM 미만, 30 mM 미만 및 특히 20 mM 미만이다. 조성물 중 이온 강도는 100 mM 미만, 예컨대 80 mM 미만, 예를 들어 50 mM 미만, 예컨대 40 mM 미만 또는 30 mM 미만일 수 있다.
특정 실시양태에서, 비이온성 등장화제는 폴리올, 예컨대 수크로스 및/또는 소르비톨이다. 소르비톨의 농도는 예를 들어, 약 3% 내지 약 15% (w/v), 예컨대 약 4% 내지 약 10% (w/v)일 수 있다. 면역학적으로 활성인 사포닌 분획 및 등장화제가 염 또는 폴리올인 TLR4 효능제를 포함하는 아주반트는 WO2012/080369에 기재되어 있다.
적합하게는, 0.05 ml 내지 1 ml, 예컨대 0.1 내지 0.5 ml의 인간 용량 부피, 특히 약 0.5 ml 또는 0.7 ml의 용량 부피. 사용되는 조성물의 부피는 전달 경로 및 위치에 따라 달라질 수 있으며, 더 작은 용량이 피내 경로에 의해 제공된다. 단위 용량 용기는 단위 용량의 투여 동안 물질의 적절한 조작을 허용하도록 초과분을 함유할 수 있다.
사포닌, 예컨대 QS-21은 인간 용량당 1 내지 100 ug의 양으로 사용될 수 있다. QS-21은 약 50 ug의 수준으로 사용될 수 있다. 적합한 범위의 예는 40-60 ug, 적합하게는 45-55 ug 또는 49-51 ug, 예컨대 50 ug이다. 추가 실시양태에서, 인간 용량은 QS-21을 약 25 ug의 수준으로 포함한다. 더 낮은 범위의 예는 20-30 ug, 적합하게는 22-28 ug 또는 24-26 ug, 예컨대 25 ug을 포함한다. 아동 또는 유아에 대해 의도되는 인간 용량은 성인에 대해 의도되는 용량과 비교하여 감소될 수 있다 (예를 들어, 50%만큼 감소).
TLR4 효능제, 예컨대 리포폴리사카라이드, 예컨대 3D-MPL은 인간 용량당 1 내지 100 ug의 양으로 사용될 수 있다. 3D-MPL은 약 50 ug의 수준으로 사용될 수 있다. 적합한 범위의 예는 40-60 ug, 적합하게는 45-55 ug 또는 49-51 ug, 예컨대 50 ug이다. 추가 실시양태에서, 인간 용량은 3D-MPL을 약 25 ug의 수준으로 포함한다. 더 낮은 범위의 예는 20-30 ug, 적합하게는 22-28 ug 또는 24-26 ug, 예컨대 25 ug을 포함한다. 아동 또는 유아에 대해 의도되는 인간 용량은 성인에 대해 의도되는 용량과 비교하여 감소될 수 있다 (예를 들어, 50%만큼 감소).
TLR4 효능제 및 사포닌 둘 다가 아주반트에 존재하면, TLR4 효능제 대 사포닌의 중량비는 적합하게는 1:5 내지 5:1, 적합하게는 1:1이다. 예를 들어, 3D-MPL이 50 ug 또는 25 ug의 양으로 존재하면, 적합하게는 QS-21은 또한 인간 용량당 50 ug 또는 25 ug의 양으로 존재할 수 있다.
사포닌:DOPC의 비율은 전형적으로 대략 1:50 내지 1:10 (w/w), 적합하게는 1:25 내지 1:15 (w/w), 및 바람직하게는 1:22 내지 1:18 (w/w), 예컨대 1:20 (w/w)일 것이다.
면역원성 조성물은 전형적으로 면역보호량 (또는 그의 분획 용량)의 항원을 함유하고, 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 대상체에게 투여하기 위한 것을 포함하는 면역원성 조성물의 제조는 일반적으로 문헌 [Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 기재되어 있다. 리포솜 내의 캡슐화는 예를 들어, 미국 특허 4,235,877 (Fullerton)에 기재되어 있다. 단백질의 거대분자에 대한 접합은 예를 들어, 미국 특허 4,372,945 (Likhite) 및 미국 특허 4,474,757 (Armor et al.)에 개시되어 있다.
전형적으로, 면역원성 조성물의 각 용량 중 단백질의 양은 전형적인 대상체에서 유의한 유해 부작용 없이 면역보호적 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이 맥락에서 면역보호는 반드시 감염에 대한 완전한 보호를 의미하지는 않으며; 이는 증상 또는 질환, 특히 바이러스와 연관된 중증 질환에 대한 보호를 의미한다. 항원의 양은 사용되는 특이적 면역원에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각 인간 용량은 1-1000μg, 예컨대 약 1μg 내지 약 100μg, 예를 들어, 약 1μg 내지 약 50μg, 예컨대 약 1μg, 약 2μg, 약 5μg, 약 10μg, 약 15μg, 약 20μg, 약 25μg, 약 30μg, 약 40μg, 또는 약 50μg의 단백질을 포함할 것으로 예상된다. 면역원성 조성물에 사용되는 양은 대상체 집단, 예를 들어, 유아, 모계 (아직 출산하지 않은 산모), 또는 고령자를 기준으로 선택된다. 특정 조성물에 대한 최적의 양은 항체 역가 및 대상체에서 다른 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 예방접종 후, 대상체는 약 4주 내에 부스트를 받을 수 있다.
선택된 아주반트에 관계없이 최종 제형 중 농도는 표적 집단에서 안전하고 효과적인 것으로 계산된다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 인간에서 RSV에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물은 유리하게는 유아 (예를 들어, 초기 용량의 연령에서 출생 내지 1세, 예컨대 0 내지 6개월의 유아) 또는 모계 집단으로부터의 개체에게 투여된다. RSV에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물은 또한 유리하게는 고령자 인간에게 투여된다. 아주반트의 선택은 이들 상이한 적용에서 상이할 수 있고, 각 상황에 대한 최적의 아주반트 및 농도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 경험적으로 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 RSV에 의한 감염을 감소시키거나 또는 예방하는 백신이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 RSV에 의한 감염 후 병리학적 반응을 감소시키거나 또는 예방하는 백신이다. 임의로, RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 함유하는 면역원성 조성물은 RSV 이외의 병원성 유기체의 적어도 하나의 추가 항원과 함께 제형화된다. 예를 들어, 병원성 유기체는 기도의 병원체 (예컨대 호흡기 감염을 야기하는 바이러스 또는 박테리아)일 수 있다. 특정 경우에, 면역원성 조성물은 RSV 이외의 병원체 바이러스, 예컨대 기도 감염을 야기하는 바이러스, 예컨대 인플루엔자 또는 파라인플루엔자로부터 유래된 항원을 함유한다. 다른 실시양태에서, 추가 항원은 투여를 용이하게 하거나 복수의 감염성 유기체로부터 대상체를 보호하는데 필요한 접종 횟수를 감소시키기 위해 선택된다. 예를 들어, 항원은 특히 인플루엔자, B형 간염, 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자, 폴리오바이러스, 연쇄상구균 또는 폐렴구균 중 임의의 하나 이상으로부터 유래될 수 있다.
따라서, RSV에 의한 노출 또는 감염을 (그 후에 치료적으로 또는 그 전에 예방적으로) 치료하기 위한 약제의 제조에서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 용도는 또한 본 개시내용의 특징이다. 마찬가지로, 대상체에서 RSV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 본 개시내용의 특징이다. 이러한 방법은 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체, 예컨대 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 조성물은 Th1 편향된 면역 반응을 유도하는 아주반트를 포함한다. 조성물은 RSV와의 접촉 후 바이러스 질환을 증강시키지 않으면서 RSV에 대해 특이적인 면역 반응을 유도하도록 제형화된다. 즉, 조성물은 제형화되고, RSV에 의한 감염을 감소시키거나 또는 예방하고/거나 RSV에 의한 감염 후 병리학적 반응을 감소시키거나 또는 예방하는 Th1 편향된 면역 반응을 생성한다. 조성물은 다양한 상이한 경로에 의해 투여될 수 있지만, 가장 일반적으로, 면역원성 조성물은 근육내 또는 비강내 투여 경로에 의해 전달된다.
면역원성 조성물은 전형적으로 면역보호량 (또는 그의 분획 용량)의 항원을 함유하고, 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 대상체에게 투여하기 위한 것을 포함하는 면역원성 조성물의 제조는 일반적으로 문헌 [Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 기재되어 있다. 리포솜 내의 캡슐화는 예를 들어, 미국 특허 4,235,877 (Fullerton)에 기재되어 있다. 단백질의 거대분자에 대한 접합은 예를 들어, 미국 특허 4,372,945 (Likhite) 및 미국 특허 4,474,757 (Armor et al.)에 개시되어 있다.
전형적으로, 면역원성 조성물의 각 용량 중 단백질의 양은 전형적인 대상체에서 유의한 유해 부작용 없이 면역보호적 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이 맥락에서 면역보호는 반드시 감염에 대한 완전한 보호를 의미하지는 않으며; 이는 증상 또는 질환, 특히 바이러스와 연관된 중증 질환에 대한 보호를 의미한다. 항원의 양은 사용되는 특이적 면역원에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각 인간 용량은 1 - 1000μg, 예컨대 약 1μg 내지 약 100μg, 예를 들어, 약 1μg 내지 약 50μg, 예컨대 약 1μg, 약 2μg, 약 5μg, 약 10μg, 약 15μg, 약 20μg, 약 25μg, 약 30μg, 약 40μg, 또는 약 50μg의 단백질을 포함할 것으로 예상된다. 면역원성 조성물에 사용되는 양은 대상체 집단 (예를 들어, 유아, 모계 또는 고령자)을 기준으로 선택된다. 특정 조성물에 대한 최적의 양은 항체 역가 및 대상체에서 다른 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 예방접종 후, 대상체는 약 4-12주 내에 부스트를 받을 수 있다. 예를 들어, RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 함유하는 면역원성 조성물을 유아 대상체에게 투여할 때, 초기 및 후속 접종은 이 기간 동안 투여되는 다른 백신과 일치하도록 투여될 수 있다.
실시양태, 파트 A
1. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 숙주-세포 단백질 대비 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 초과의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 w/w를 포함하는 것인 항원 조성물.
2. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 대비 0.19%, 0.18%, 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.10%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02, 0.019%, 0.018%, 0.017%, 0.016%, 0.015%, 0.014% 또는 0.013% 미만의 GRP78 숙주-세포 단백질 w/w를 포함하는 것인 항원 조성물.
3. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 응집된 삼량체 대비 75% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 초과의 비응집된 삼량체 w/w를 포함하는 것인 항원 조성물.
4. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 글리코실화된 가용성 F 단백질 폴리펩티드이고, 여기서 상기 글리코실화된 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 글리코실화를 포함하여 59.5 kDa 초과, 예컨대 60.0 kDa 초과, 60.5 kDa 초과, 또는 61.0 kDa 초과의 분자 질량을 갖는 것인 항원 조성물.
5. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 하기 pI를 갖는 것인 항원 조성물:
(a) 7.8, 7.7, 7.6, 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.4 미만의 pI; 또는
(b) 7.8-5.3, 7.4-5.3, 7.0-5.3, 6.8-5.3, 6.6-5.3, 6.4-5.3, 6.2-5.3, 6.0-5.3의 범위의 pI.
6. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 글리칸 기를 포함하며, 여기서 상기 글리칸 기의 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75%는 HILIC-FLR/MS를 사용하는 글리칸 프로파일링에 의해 결정된 바와 같이 시알릴화되는 것인 항원 조성물.
7. 파트 A 실시양태 1-2 및 4-6에 있어서, 상기 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체를 추가로 포함하는 항원 조성물.
8. 파트 A 실시양태 1-7에 있어서, 상기 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 F1 쇄 및 F2 쇄를 포함하는 것인 항원 조성물.
9. 파트 A 실시양태 1-8에 있어서, 상기 F1 쇄가 서열식별번호: 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 조성물.
10. 파트 A 실시양태 1-9에 있어서, 상기 F2 쇄가 서열식별번호: 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 조성물.
11. 파트 A 실시양태 1-10에 있어서, 상기 F1 쇄가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 F2 쇄가 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 조성물.
실시양태, 파트 B
1. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 집단을 포함하는 항원 조성물로서,
여기서 상기 집단의 각 삼량체는
(a) S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F 프로토머"); 및
(b) p27 펩티드의 적어도 10개의 아미노산을 추가로 포함하는, S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F' 프로토머")
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 3개의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로 구성되고;
하기 화학식으로 기재되는 것인 항원 조성물:
nF + (3-n)F' (화학식 I)
여기서 n은 0-3의 정수이고, F는 F 프로토머이고, F'는 F' 프로토머이다.
2A. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 집단을 포함하는 항원 조성물로서,
여기서 상기 집단의 각 삼량체는
(a) S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F 프로토머"); 및
(b) p27 펩티드의 적어도 10개의 아미노산을 추가로 포함하는, S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F' 프로토머")
로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 3개의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로 구성되고;
하기 화학식으로 기재되며;
nF + (3-n)F' (화학식 I)
여기서 n은 0-3의 정수이고, F는 F 프로토머이고, F'는 F' 프로토머임;
여기서 삼량체의 집단 중 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%는 F' 프로토머인 항원 조성물.
2B. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, F' 프로토머가 비절단된 푸린 절단 부위를 포함하는 F1 쇄를 포함하는 것인 항원 조성물.
3. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, F' 프로토머가 F 프로토머의 분자 질량보다 적어도 1.0 kDa, 예컨대 적어도 1.5 kDa, 적어도 2.0 kDa, 적어도 2.5 kDa, 적어도 3.0 kDa 더 큰 분자 질량을 갖는 것인 항원 조성물.
4. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 F' 프로토머를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체 대 제로 F'1 프로토머를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 비율이 적어도 1:1.2; 예컨대 적어도 1:1.3; 적어도 1:1.4; 적어도 1:1.5; 적어도 1:1.6; 적어도 1:1.7; 적어도 1:1.8; 적어도 1:1.9; 적어도 1:2.0; 적어도 1:2.1; 적어도 1:2.2; 적어도 1:2.3; 적어도 1:2.4; 적어도 1:2.5; 적어도 1:2.6; 적어도 1:2.7; 적어도 1:2.8; 적어도 1:2.9; 적어도 1:3.0; 적어도 1:3.5; 적어도 1:4; 적어도 1:9; 적어도 1:19; 또는 적어도 1:29인 항원 조성물.
5. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 집단이 침강에 의해 검출가능한 제1 및 제2 피크로 크로마토그래피에 의해 분리가능하며, 상기 제1 피크는 약 3.96S의 침강 계수를 갖고, 상기 제2 피크는 약 4.13S의 침강 계수를 갖는 것인 항원 조성물.
6. 임의의 상기 파트 A 또는 파트 B 실시양태에 있어서, F1 쇄가 서열식별번호: 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, F2 쇄가 서열식별번호: 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 조성물.
7. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, F' 프로토머가 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 조성물.
8. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, F' 프로토머가 N-말단 p27 펩티드를 갖는 F1 쇄를 포함하는 것인 항원 조성물.
9. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, F' 프로토머가 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄를 포함하는 것인 항원 조성물.
10. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서, F' 프로토머가 서열식별번호: 8과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄 및 서열식별번호: 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F2 쇄를 포함하는 것인 항원 조성물.
11. 임의의 상기 파트 B 실시양태에 있어서,
(a) F' 프로토머가 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄 및 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 F2 쇄를 포함하고;
(b) F 프로토머가 서열식별번호: 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄 및 서열식별번호: 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F2 쇄를 포함하는 것인
항원 조성물.
12. 임의의 상기 파트 A 또는 파트 B 실시양태에 있어서, 상기 항원 조성물이 동결건조되는 것인 항원 조성물.
13. 임의의 상기 파트 A 또는 파트 B 실시양태의 항원 조성물 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
14. 파트 B 실시양태 13에 있어서, 담체 또는 부형제가 버퍼를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
15. 파트 B 실시양태 13-14에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
16. 파트 B 실시양태 15에 있어서, 아주반트가 Th1 편향된 면역 반응을 유도하는 것인 면역원성 조성물.
17. 파트 B 실시양태 16에 있어서, 아주반트가 리포솜을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
18. 파트 B 실시양태 16에 있어서, 아주반트가 수중유 에멀젼을 포함하는 것인 면역원성 조성물
19. 파트 B 실시양태 16에 있어서, 아주반트가 알루미늄 염을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
20. 파트 B 실시양태 16-19 중 어느 하나에 있어서, 아주반트가 TLR4 효능제를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
21. 파트 B 실시양태 20에 있어서, 아주반트가 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
22. 파트 B 실시양태 20 - 21에 있어서, 3D-MPL을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
23. 파트 B 실시양태 16 - 22에 있어서, 사포닌을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
24. 파트 B 실시양태 23에 있어서, 사포닌이 QS21인 면역원성 조성물.
25. 파트 B 실시양태 17 또는 18에 있어서, 아주반트가 고령자에게 투여하기에 적합한 것인 면역원성 조성물.
26. 파트 B 실시양태 13-25 중 어느 하나에 있어서, 면역원성 조성물이 RSV에 의한 감염을 감소시키거나 또는 예방하는 것인 면역원성 조성물.
27. 파트 B 실시양태 13-26 중 어느 하나에 있어서, 면역원성 조성물이 RSV에 의한 감염 후 병리학적 반응을 감소시키거나 또는 예방하는 것인 면역원성 조성물.
28. 파트 B 실시양태 13-27 중 어느 하나에 있어서, RSV 이외의 병원성 유기체의 적어도 하나의 추가 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
29. 파트 B 실시양태 28에 있어서, 적어도 하나의 추가 항원이 RSV 이외의 바이러스의 것인 면역원성 조성물.
30. 파트 B 실시양태 29에 있어서, 바이러스가 B형 간염 바이러스 (HBV), 파라인플루엔자 바이러스 (PIV), 폴리오바이러스 및 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
31. 파트 B 실시양태 28에 있어서, 적어도 하나의 추가 항원이 디프테리아, 파상풍, 백일해, 헤모필루스 인플루엔자에 및 폐렴구균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
32. 파트 A 실시양태 1-11 또는 파트 B 실시양태 1-12 중 어느 하나의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산.
33. 파트 B 실시양태 32에 있어서, RSV 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 선택된 숙주-세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 재조합 핵산.
34. 파트 B 실시양태 32 또는 33의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
35. 파트 B 실시양태 34에 있어서, 벡터가 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터를 포함하는 것인 벡터.
36. 파트 B 실시양태 32 또는 33의 핵산 또는 파트 B 실시양태 34 또는 35의 벡터를 포함하는 숙주-세포.
37. 파트 B 실시양태 36에 있어서, 숙주-세포가 CHO 세포인 숙주-세포.
38. 파트 B 실시양태 37에 있어서, CHO 세포가 클론 집단의 구성원인 숙주-세포.
39. RSV 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서 파트 A 실시양태 1-11 또는 파트 B 실시양태 1-12 중 어느 하나의 조성물 또는 파트 B 실시양태 13-31 중 어느 하나의 면역원성 조성물의 용도.
40. RSV 감염 예방용 약제의 제조에서 파트 A 실시양태 1-11 또는 파트 B 실시양태 1-12 중 어느 하나의 조성물 또는 파트 B 실시양태 13-31 중 어느 하나의 면역원성 조성물의 용도.
41. 파트 A 실시양태 1-11, 파트 B 실시양태 1-12 중 어느 하나의 조성물 또는 파트 B 실시양태 13-31 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RSV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
42. 파트 B 실시양태 41에 있어서, 면역원성 조성물을 투여하는 것이 RSV와의 접촉 후 바이러스 질환을 증강시키지 않으면서 RSV에 대해 특이적인 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
43. 파트 B 실시양태 41 또는 42에 있어서, 면역 반응이 Th1 편향된 면역 반응을 포함하는 것인 방법.
44. 파트 B 실시양태 41-43 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응이 RSV에 의한 감염을 감소시키거나 또는 예방하는 보호 면역 반응을 포함하고/거나 RSV에 의한 감염 후 병리학적 반응을 감소시키거나 또는 예방하는 것인 방법.
45. 파트 B 실시양태 41-44 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
46. 파트 B 실시양태 41-45 중 어느 하나에 있어서, 비강내 경로를 통해 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
47. 파트 B 실시양태 41-45 중 어느 하나에 있어서, 근육내 경로를 통해 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
48. 의학에서 사용하기 위한 파트 A 실시양태 1-11, 파트 B 실시양태 1-12 중 어느 하나의 조성물, 또는 파트 B 실시양태 13-31 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
49. RSV-감염의 예방 또는 치료를 위한 파트 A 실시양태 1-11, 파트 B 실시양태 1-12 중 어느 하나의 조성물, 또는 파트 B 실시양태 13-31 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
50. 파트 B 실시양태 36-38의 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, 리간드 연결된 기질을 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하며, 여기서 리간드는 정전기적 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용 중 하나 이상을 통해 단백질과 상호작용할 수 있는 것인, 파트 A 실시양태 1-11 또는 파트 B 실시양태 1-12 중 어느 하나의 항원 조성물의 제조 방법.
51. 파트 B 실시양태 50에 있어서, 다중모드 정제 액체 크로마토그래피 정제 단계가 로딩 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하는 제1 단계, 및 용리 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 제2 단계를 포함하는 것인 방법.
52. 파트 B 실시양태 50-51에 있어서, 리간드 연결된 기질이 다중모드 음이온 교환 수지인 방법.
53. 파트 B 실시양태 52에 있어서, 상기 용리 버퍼가 코스모트로픽제 및 카오트로픽제를 포함하는 것인 방법.
54. 파트 B 실시양태 50-53에 있어서, 리간드가 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하는 것인 방법.
55. 파트 B 실시양태 52-54에 있어서, 코스모트로픽제가 HPO4, 시트레이트, SO4, F, OAc, CO2, SO2, SCN, HPO2, Mg, Li, Zn, Al, tert-부탄올, 트레할로스, 글루코스, 프롤린 및 글루타메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
56. 파트 B 실시양태 52-55에 있어서, 카오트로픽제가 K, Cs, NH4, (CH3)4N, n-부탄올, 에탄올, 구아니디늄 클로라이드, 과염소산염, 아세테이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 페놀, 2-프로판올, 나트륨 도데실 술페이트, 티오우레아, 우레아, 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
57. 파트 B 실시양태 51-56에 있어서, 용리 버퍼가 시트레이트 이온 및 아르기닌을 포함하는 것인 방법.
58. 파트 B 실시양태 51-57에 있어서, 용리 버퍼가 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨;
(b) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌.
59. 파트 B 실시양태 58에 있어서, 용리 버퍼가 약 250 mM 시트르산나트륨 및 약 300 mM 아르기닌을 포함하는 것인 방법.
60. 파트 B 실시양태 51-59에 있어서, 용리 버퍼가 10-30 mM, 예컨대 15-25 mM, 16-24 mM, 17-23 mM, 18-22 mM, 또는 19-21 mM 인산나트륨을 포함하는 것인 방법.
61. 파트 B 실시양태 60에 있어서, 용리 버퍼가 약 20 mM 인산나트륨을 포함하는 것인 방법.
62. 파트 B 실시양태 51-61에 있어서, 로딩 버퍼가 하기로부터 선택된 전도도를 갖는 것인 방법:
(a) 20 - 34 mS/cm, 예컨대 21 - 33 mS/cm, 22 - 32 mS/cm, 23 - 31 mS/cm, 24 - 30 mS/cm, 25 - 29 mS/cm, 또는 26 - 28 mS/cm; 또는
(b) 11 - 34 mS/cm, 13 - 31 mS/cm, 15 - 27 mS/cm, 17 - 25 mS/cm, 19 - 23 mS/cm, 또는 20 - 22 mS/cm.
63. 파트 B 실시양태 62에 있어서, 로딩 버퍼가 하기의 전도도를 갖는 것인 방법:
(a) 약 26-28 mS/cm; 또는
(b) 약 20-22 mS/cm.
64. 파트 B 실시양태 51-63에 있어서, 로딩 버퍼가 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) 100 - 300 mM, 예컨대 175 - 275 mM, 200 - 250 mM, 210 - 240 mM, 220 - 230 mM 염화나트륨; 또는
(b) 100 - 300 mM, 예컨대 120 - 250 mM, 140 - 225 mM, 160 - 200 mM, 170 - 190 mM 염화나트륨.
65. 파트 B 실시양태 64에 있어서, 로딩 버퍼가 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) 약 225 mM 염화나트륨; 또는
(b) 약 180 mM 염화나트륨.
66. 파트 B 실시양태 51-65에 있어서, 로딩 버퍼 및 용리 버퍼가 독립적으로 하기의 pH를 갖는 것인 방법:
(a) 6.5 - 7.9, 예컨대 6.6 - 7.8, 6.7 - 7.7, 6.8 - 7.6, 6.9 - 7.5, 7.0 - 7.4; 또는
(b) 6.5 - 8.0, 예컨대 7.0 - 7.9, 7.1 - 7.8, 7.2 - 7.7.
67. 파트 B 실시양태 66에 있어서, 로딩 버퍼 및 용리 버퍼가
(a) 각각 약 7.0 - 7.4의 pH를 갖거나; 또는
(b) 로딩 버퍼가 약 7.3 - 7.7의 pH를 갖고, 용리 버퍼가 약 7.2 - 7.6의 pH를 갖는 것인
방법.
68. 파트 B 실시양태 50-67에 있어서, 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 단계 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 적용되는 것인 방법.
69. 파트 B 실시양태 68에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
(a) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 포함하는 리간드 보유 기질을 포함하며, 여기서 수지는 하기를 포함하는 버퍼로 평형화되는 것인 단계:
(i) 10-30 mM 포스페이트 및 100-130 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0 또는
(ii) 10-30 mM 포스페이트 및 40-130 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0; 및
(b) 하기를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계:
(i) 10-30 mM 인산나트륨, 200-250 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0 또는
(ii) 10-30 mM 포스페이트 및 130-250 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0.
70. 파트 B 실시양태 69에 있어서, 수지가
(a) 약 20 mM 포스페이트, 약 115 mM 염화나트륨, pH 약 7.0-7.4를 포함하는 버퍼로 평형화되고; 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 약 20 mM 인산나트륨, 약 225 mM 염화나트륨, 및 약 pH 7.0-7.4를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 용리되는 것이거나, 또는
(b) 약 20 mM 포스페이트, 약 80 mM 염화나트륨, pH 약 7.3-7.7을 포함하는 버퍼로 평형화되고; 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 약 20 mM 인산나트륨, 약 180 mM 염화나트륨, 및 약 pH 7.3-7.7을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 용리되는 것인
방법.
71. 파트 B 실시양태 68-70에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 친화성-유사 크로마토그래피 단계로 처리되는 것인 방법.
72. 파트 B 실시양태 71에 있어서, 친화성-유사 크로마토그래피 단계가 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
(a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 하기로 평형화되는 것인 단계:
(i) 40-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0); 또는
(ii) 30-60 mM 인산나트륨 (pH 6.0-8.0); 및
(b) 10-30 mM 인산나트륨, 200-270 mM 염화나트륨, pH 6.0-8.0을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 단계.
73. 파트 B 실시양태 72에 있어서,
(a) 수지가 하기를 포함하는 버퍼로 평형화되고:
(i) 약 47 mM 인산나트륨, 약 pH 7.0-7.4 또는
(ii) 약 40 mM 인산나트륨, 약 pH 7.1-7.5;
(b) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 하기를 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 용리되는 것인 방법:
(i) 약 20 mM 인산나트륨, 약 235 mM 염화나트륨 (약 pH 7.0-7.4) 또는
(ii) 약 20 mM 인산나트륨, 약 240 mM 염화나트륨 (약 pH 7.2-7.6).
74. 파트 B 실시양태 71-73에 있어서,
(a) 친화성-유사 크로마토그래피 단계 전에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 바이러스 불활성화 단계에 적용되거나,
(b) 친화성-유사 크로마토그래피 단계 후에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 바이러스 불활성화 단계에 적용되는 것인
방법.
75. 파트 B 실시양태 71에 있어서, 바이러스 불활성화 단계가 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) 0.5-1.5%의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 10-25시간 동안 15-25℃의 온도에서 인큐베이션하는 것, 또는
(b) 0.5-2.5%의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 10-25시간 동안 15-25℃의 온도에서 인큐베이션하는 것.
76. 파트 B 실시양태 75에 있어서,
(a) 액체 배지가 약 1.0%의 농도로 조절되고, 상기 액체 배지를 인큐베이션하는 것이 약 15-20시간 동안 제어된 실온에서 수행되거나,
(b) 액체 배지가 약 2.0%의 농도로 조절되고, 상기 액체 배지를 인큐베이션하는 것이 약 18-24시간 동안 제어된 실온에서 수행되는 것인
방법.
77. 파트 B 실시양태 50-76에 있어서, 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 단계 후에 바이러스 여과 단계가 이어지는 것인 방법.
78. 파트 B 실시양태 77에 있어서, 바이러스 여과 단계가 약 0.1 μm 컷오프를 갖는 막을 사용하는 사전여과 및 약 19 nm 컷오프를 갖는 막을 사용하는 여과를 포함하는 것인 방법.
79. 파트 B 실시양태 77-78에 있어서, 바이러스 여과 단계 후에 한외여과/투석여과 단계가 이어지는 것인 방법.
80. 파트 B 실시양태 79에 있어서, 50 kDa 분자량 컷오프 막 및 약 10 mM 인산칼륨 및 약 5% 트레할로스를 포함하는 투석여과 버퍼를 사용하는 방법.
81. 파트 B 실시양태 50-80에 있어서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
82A. 파트 B 실시양태 35-37의 숙주-세포를 액체 배지에서 배양함으로써 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생성하고, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지를 하기 단계에 적용하는 것을 포함하는, 파트 A 실시양태 1-11 또는 파트 B 실시양태 1-11 중 어느 하나의 조성물의 제조 방법:
(a) 약 1.0%의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 약 18-22 시간 동안 약 제어된 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 바이러스 불활성화 단계;
(b) 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 약 50 mM 인산나트륨 (약 pH 7.0-7.4)으로 평형화되고, 약 20 mM 인산나트륨, 약 235 mM 염화나트륨 (약 pH 7.0-7.4)을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 것을 포함하는 친화성-유사 크로마토그래피 단계;
(c) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 약 20 mM 포스페이트 및 약 115 mM 염화나트륨 (약 pH 7.0-7.4)을 포함하는 버퍼로 평형화되고, 약 20 mM 인산나트륨, 약 225 mM 염화나트륨 (약 pH 7.0-7.4)을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 음이온 교환 크로마토그래피 단계;
(d) 리간드 연결된 기질을 사용하며, 여기서 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하고, 여기서 상기 다중모드 액체 크로마토그래피 정제는 로딩 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 로딩 버퍼는 약 225 mM 염화나트륨 (약 pH7.0-7.4)을 포함하는 것인 제1 단계, 및 용리 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키며, 여기서 용리 버퍼는 약 250 mM 시트르산나트륨, 약 300 Mm 아르기닌, 약 20 Mm 인산나트륨, 약 pH 7.0-7.4를 포함하는 것인 제2 단계를 포함하는 것인 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 단계;
(e) 약 0.1 μm의 컷오프를 갖는 막을 사용하는 사전여과 및 약 19 nm의 컷오프를 갖는 막을 사용하는 여과를 포함하며, 여기서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 막을 통해 통과하는 것인 바이러스 여과 단계;
(f) 약 50 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막 및 약 10 mM 인산칼륨, 약 5% 트레할로스를 포함하는 투석여과 버퍼를 사용하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 체류물을 생성하는 한외여과/투석여과 단계;
(g) 약 0.2 μm 이하의 컷오프를 갖는 필터를 사용하는 여과 단계.
82B. 파트 B 실시양태 35-37의 숙주-세포를 액체 배지에서 배양함으로써 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생성하고, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지를 하기 단계에 적용하는 것을 포함하는, 파트 A 실시양태 1-11 또는 파트 B 실시양태 1-11 중 어느 하나의 조성물의 제조 방법:
(a) 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 수지는 약 40 mM 인산나트륨 (약 pH 7.1-7.5)으로 평형화되고, 약 20 mM 인산나트륨, 약 240 mM 염화나트륨 (약 pH 7.2-7.6)을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 것을 포함하는 친화성-유사 크로마토그래피 단계;
(b) 약 2.0%의 농도로 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 액체 배지에 폴리소르베이트-80을 첨가하고, 상기 액체 배지를 약 18-24시간 동안 약 제어된 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 바이러스 불활성화 단계;
(c) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 수지 상에 로딩하며, 여기서 수지는 4차 아민 기를 보유하는 리간드를 포함하며, 여기서 수지는 약 20 mM 포스페이트 및 약 80 mM 염화나트륨 (약 pH 7.3-7.7)을 포함하는 버퍼로 평형화되고, 약 20 mM 인산나트륨, 약 180 mM 염화나트륨 (약 pH 7.3-7.7)을 포함하는 버퍼를 사용하여 수지로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키는 음이온 교환 크로마토그래피 단계;
(d) 리간드 연결된 기질을 사용하며, 여기서 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 포함하고, 여기서 상기 다중모드 액체 크로마토그래피 정제는 로딩 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질 상에 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 로딩하며, 여기서 로딩 버퍼는 약 180 mM 염화나트륨 (약 pH 7.3-7.7)을 포함하는 것인 제1 단계, 및 용리 버퍼의 존재 하에 상기 리간드 연결된 기질로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 용리시키며, 여기서 용리 버퍼는 약 250 mM 시트르산나트륨, 약 300 Mm 아르기닌, 약 20 Mm 인산나트륨 (약 pH 7.2-7.6)을 포함하는 것인 제2 단계를 포함하는 것인 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 단계;
(e) 약 0.1 μm의 컷오프를 갖는 막을 사용하는 사전여과 및 약 20 nm의 컷오프를 갖는 막을 사용하는 여과를 포함하며, 여기서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 막을 통해 통과하는 것인 바이러스 여과 단계;
(f) 약 50 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막 및 약 10 mM 인산칼륨, 약 4% 트레할로스를 포함하는 투석여과 버퍼를 사용하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 체류물을 생성하는 한외여과/투석여과 단계;
(g) 약 0.2 μm 이하의 컷오프를 갖는 필터를 사용하는 여과 단계.
83. 파트 B 실시양태 82A-B 중 어느 하나에 있어서, 동결건조 단계를 추가로 포함하는 방법.
84. 파트 B 실시양태 1-11 중 어느 하나의 삼량체의 집단을 삼량체의 집단으로 분리하는 방법으로서, 여기서 대부분의 삼량체는 적어도 하나의 F' 프로토머 및 삼량체의 집단을 포함하며, 여기서 대부분의 삼량체는 3개의 F 프로토머를 포함하며, 상기 방법은 캅토 MMC ImpRes 크로마토그래피 단계를 포함하는 것인 방법.
85. 파트 B 실시양태 84에 있어서, 캅토 MMC ImpRes 크로마토그래피 단계가 0에서 250 mM까지의 NaCl 구배, 20 mM 인산나트륨, 1M Na시트레이트를 사용하는 것인 방법.
86. 파트 B 실시양태 85에 있어서, 염화나트륨 구배가 20 칼럼 부피에서 수행되는 것인 방법.
일반사항
달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어는 문맥상 명확하게 달리 표시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥상 명확하게 달리 언급되지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "복수"는 둘 이상을 지칭한다. 또한, 물질의 농도 또는 수준, 예컨대 용액 구성성분 농도 또는 그의 비율, 및 반응 조건, 예컨대 온도, 압력 및 사이클 시간과 관련하여 주어진 수치적 제한은 대략적인 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "약"은 양 ±10%를 의미하는 것으로 의도된다. 수치 범위와 관련하여 용어 "사이"는 범위가 종점을 제외하도록 명시적으로 언급되지 않는 한 범위의 종점을 포함하도록 의도된다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1 - CHO 세포에서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 생산
A. 생산 방법론
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 항원 생산을 위해 CHO 숙주 세포에 통합시켰다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생산하기 위해, 작업 세포 은행 바이알을 해동하고, 이산화탄소 인큐베이터에서, 대략 37℃에서, 제어된 CO2 조건 하에 수일 동안 세포 배양 배지를 사용하여 3개의 연속 쉐이크 플라스크 단계에서 0.2 × 106개 세포/mL의 접종 생존가능한 세포 밀도로 확장시킨 다음, 대략 37℃, 생리학적 pH, 및 제어된 CO2 조건에서 수일 동안 2개의 연속 시드 생물반응기 확장을 수행하였다. 확장된 배양물을 사용하여 대략 37℃의 온도, 생리학적 pH, 및 제어된 CO2 조건에서 생존가능한 세포 밀도로 생산 생물반응기를 접종하였다. 생물반응기는 2개의 상이한 공급물을 사용하여 작업 부피 (WV)의 90% 미만에서 시작하였다. 배양물이 약 5 x 106개 세포/mL에 도달할 때 매일 WV의 1%에서 제1 공급을 수행하고, 2일 후 매일 WV의 0.2%에서 제2 공급을 수행하였다. 배양 밀도가 두 배가 될 때 35℃ 미만으로 온도를 낮추고, pH를 CO2 및 NaOH로 제어하고, 용존 산소를 순수한 산소로 제어하였다. 완료될 때 배양물을 수확하였다. 생존가능한 세포 밀도, 생존율 및 산물 축적 프로파일은 도 3a 및 도 3b에 제시되어 있다.
여과를 통해 배양물을 수확하여 정화된 발효 브로쓰를 생성하였으며, 이는 병렬로 연결된 1차 및 2차 여과를 포함하였다. 1차 필터는 배양물 1 리터당 0.022㎡의 여과 면적을 갖는 D0HC이고; 2차 필터는 배양물 1 리터당 0.011㎡의 여과 면적을 갖는 X0HC였다. 여과액을 0.2 μM 필터로 추가로 여과하여, 하류 정제를 위해 바이오버든을 감소시켰다. 수확 수율은 약 75%이며, 총 CHO 숙주 세포 단백질은 40%이고, CHO 숙주 DNA 수준 감소는 4 log였다.
B. 생산 방법론 보충
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 항원 생산을 위해 CHO 숙주 세포에 통합시켰다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 생산하기 위해, 작업 세포 은행 바이알을 해동하고, 이산화탄소 인큐베이터에서, 대략 37℃에서, 제어된 CO2 조건 하에 수일 동안 세포 배양 배지를 사용하여 3개의 연속 쉐이크 플라스크 단계에서 0.2 × 106개 세포/mL의 접종 생존가능한 세포 밀도로 확장시킨 다음, 대략 37℃, 생리학적 pH, 및 제어된 CO2 조건에서 수일 동안 2개의 연속 시드 생물반응기 확장을 수행하였다. 변형된 DM133 공급물의 1회 5% 생물반응기 부피 첨가는 제2 시드 생물반응기에 대한 접종 후 70-74시간에 수행될 필요가 있었다. 확장된 배양물을 사용하여 대략 37℃의 온도, 생리학적 pH, 및 제어된 CO2 조건에서 1.0 x 106개 세포/mL 생존가능한 세포 밀도로 생산 생물반응기를 접종하였다. 생물반응기는 작업 부피 (WV)의 90% 미만에서 시작하였으며, 변형된 DM133 공급물의 양의 2.5% (V/V)를 접종 직전에 생물반응기에 첨가하였다. 변형된 공급물의 양의 2.5% (V/V)를 접종 직전에 생물반응기에 첨가하였다. 제2일에 시작하여 매일 WV의 1.25%에서 제1 공급을 수행하고, 2일 후 매일 WV의 0.5%에서 제2 공급을 수행하였다. 배양 밀도가 10-14 x 106개 세포/mL에 도달할 때 온도를 낮추고 33℃로 낮추며, pH를 CO2 및 NaOH로 제어하고, 용존 산소를 순수한 산소로 제어하였다. 완료될 때 배양물을 수확하였다. 생존가능한 세포 밀도, 생존율 및 산물 축적 프로파일은 도 23a 및 도 23b에 제시되어 있다.
여과를 통해 배양물을 수확하여 정화된 발효 브로쓰를 생성하였으며, 이는 병렬로 연결된 1차 및 2차 여과를 포함하였다. 1차 정화를 위해, 배양물을 0.66㎡의 필터 면적의 D0SP 필터를 통해 펌핑시켰다. 그 후, 부분적으로 정화된 수확물을 병렬로 연결된 0.33 ㎡의 필터 면적을 갖는 X0SP 필터를 통해 펌핑시켰다. 여과액을 0.2 μM 필터로 추가로 여과하여, 하류 정제를 위해 바이오버든을 감소시켰다. 수확 수율은 약 75%이며, 총 CHO 숙주 세포 단백질은 40%이고, CHO 숙주 DNA 수준 감소는 4 log였다.
실시예 2 - CHO 세포로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 정제
A. 방법
(1) 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 원료 의약품/벌크 중간 용액의 제조는 하나의 유가식 세포 배양 생산 배치를 기반으로 한다.
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 회수하기 위해, 세포 배양물을 심층 여과에 의해 수확하였다. 여과된 수확물을 세제 첨가에 의해 바이러스 불활성화에 적용하였다. 바이러스 불활성화된 중간체를 결합/용리 모드에서 캅토 DeVirS 크로마토그래피에 의해 캡처하였다. 그 후, 캅토 DeVirs 용리액을 결합/용리 모드에서 캅토 Q ImpRes 크로마토그래피에서 추가로 정제하였다. 캅토 Q ImPres 용리액을 결합/용리 모드에서 캅토 어드히어 크로마토그래피에 의해 추가로 연마하였다. 캅토 어드히어 용리액을 바이러스 여과 단계에 의해 프로세싱하였다. 그 후, 바이러스 여과액을 농축시키고, 버퍼를 최종 부형제로 교환한 다음 농도 조절 및 0.2 μm 여과를 수행하였다. 이 정제에서 사용된 모든 크로마토그래피 겔은 지이-헬스케어(GE-Healthcare)에 의해 제조되었다.
바이러스 불활성화 단계의 목적은 외피보유 바이러스와 같은 세제 불내성 바이러스를 제거하는 것이다. 폴리소르베이트-80을 지속적으로 교반하면서 수확 물질에 첨가하여 1.0%의 표적 농도를 달성하였다. 15 내지 20시간 동안의 인큐베이션을 제어된 실온에서 광 보호 하에 수행하였다. 바이러스 불활성화의 종결을 공정 단계 캅토 DeVirs에서 캡처 크로마토그래피를 통해 수행하였으며; 인큐베이션 시간은 캅토 DeVirs 단계에서 로드가 끝날 때 끝났다.
제1 정제 단계는 결합/용리 모드에서 수지 캅토 DeVirS를 사용하는 친화성-유사 크로마토그래피이다. 캅토 DeVirS 칼럼의 목적은 바이러스 불활성화된 중간체로부터의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 캡처, 추가 하류 프로세싱을 위한 일반적인 불순물의 부피 감소 및 저하이다. 이 단계의 경우, 바이러스 불활성화된 풀을 물로 희석하여 6 mS/cm의 표적 전도도를 달성하였다. 전도도 조절 후, 물질을 이전에 47 mM 인산나트륨 pH 7.0-7.4로 평형화된 캅토 DeVirs 상에 로딩하였다. 칼럼을 평형화 버퍼로 세척한 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 풀을 200 cm/h에서 20 mM 인산나트륨, 235 mM 염화나트륨 pH 7.0-7.4로 용리시켰다.
제2 정제 단계는 결합/용리 모드에서 수지 캅토 Q ImpRes를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 캅토 Q ImpRes 칼럼의 목적은 산물 순도를 증가시키고 (RP-HPLC를 통해 확인됨), HCP 및 DNA를 감소시키는 것이다. 캅토 Q ImPres 크로마토그래피는 또한 바이러스 제거 단계로서 정의된다. 이 단계의 경우, 물로 희석하여 캅토 DeVirs 용리 풀의 전도도를 15.0 mS/cm로 조절하였다. 전도도 조절 후, 물질을 이전에 20 mM 인산나트륨, 115 mM 염화나트륨 pH 7.0-7.4로 평형화된 캅토 Q ImpRes 상에 로딩하였다. 칼럼을 평형화 버퍼로 세척한 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 풀을 200 cm/h에서 20 mM 인산나트륨, 225 mM 염화나트륨 pH 7.0-7.4로 용리시켰다.
제3 정제 단계는 결합/용리 모드에서 수지 캅토 어드히어를 사용하는 혼합 모드 크로마토그래피이다. 캅토 어드히어 칼럼의 목적은 고분자량 종, 저분자량 종 및 HCP를 감소시키는 것이다. 캅토 어드히어 크로마토그래피는 또한 바이러스 제거 단계로서 정의된다. 이 단계의 경우, 캅토 Q ImpRes 풀을 200 cm/h에서 캅토 어드히어 칼럼 상에 직접 적용하였으며; 칼럼을 이전에 20 mM 인산나트륨, 225 mM 염화나트륨, pH 7.0-7.4로 평형화시켰다. 칼럼을 평형화 버퍼로 세척한 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 풀을 200 cm/h에서 20 mM 인산나트륨, 250 mM 시트르산나트륨, 300 mM 아르기닌, pH 7.0-7.4로 용리시켰다.
캅토 어드히어는 응집체 제거, 숙주-세포 단백질 제거 및 바이러스 클리어런스에 최적화된 다중모드 음이온 교환 수지이다. 캅토 어드히어 크로마토그래피 수지의 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올아민이며; 이 리간드는 정전기적 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 단백질과 상호작용할 수 있다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 공정의 경우, 단백질을 27 mS/cm pH 7.0-7.4에서 로딩하였으며; 로딩 버퍼는 대략 225 mM 염화나트륨을 함유한다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 캅토 어드히어에 결합하는 조건은 샘플의 소수성 성분 및 캅토 어드히어 수지의 소수성 성분 간의 상호작용에 유리하다. 용리 버퍼는 20 mM 인산나트륨, 250 mM 시트르산나트륨, 300 mM 아르기닌, pH 7.0-7.4로 이루어진다. 버퍼 적용 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 캅토 어드히어 칼럼으로부터 용리하였다. 이 공정에서 사용된 조건은 ≥ 4.28 log의 MuLV 클리어런스 및 3.2 log의 MVM 클리어런스를 허용하였다.
Figure pct00001
표 1.
크로마토그래피 단계 후에 플라노바(Planova) 20N 필터 (아사히 카세이(Asahi Kasei))를 사용하는 바이러스 여과 단계가 이어졌다. 0.1 μm 막을 갖는 옵티캅(Opticap) XL5 PVDF 필터를 프리필터로서 사용하였다. 이 공정 단계의 목적은 공정 중간체 풀에 존재하는 잠재적 바이러스를 제거하는 것이다.
다음 정제 단계는 밀리포어(Millipore)에 의해 제조된 펠리콘(Pellicon) 3 PES 바이오맥스(Biomax) (MWCO 50 kDa)로 수행되는 한외여과/투석여과 단계이다. 이 단계의 목적은 산물을 농축시키고, 10 mM 인산칼륨 및 5% 트레할로스로 이루어진 투석여과 버퍼에 대해 매트릭스를 교환하는 것이다. 투석여과된 체류물은 시스템 린스가 수행되기 전에 시스템으로부터 배출되었다. 시스템 린스를 투석여과된 체류물에 첨가하여 1.2 mg/mL 내지 1.5 mg/mL 범위의 농도를 달성하였다.
원료 의약품 제형화 단계의 목적은 최종 원료 의약품 부형제 조성물을 0.05% PS-80의 최종 함량으로 및 농도를 1 mg/mL의 표적으로 조절하는 것이다. 그 후, 원료 의약품을 최종적으로 0.2 μm 여과하고, 분취하고, 냉동고 시스템에서 동결하였다. 원료 의약품을 추가 프로세싱까지 - 70℃에서 저장하였다.
(2) 하나의 유가식 세포 배양 생산 배치를 기반으로 하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 원료 의약품/벌크 중간 용액의 제조를 또한 하기와 같이 성취할 수 있다.
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 회수하기 위해, 세포 배양물을 심층 여과에 의해 수확하였다. 여과된 수확물을 결합/용리 모드에서 캅토 DeVirS 크로마토그래피에 의해 캡처하였다. 그 후, 캅토 DeVirs 용리액을 세제 첨가에 의한 바이러스 불활성화에 적용하였다. 바이러스 불활성화된 중간체를 결합/용리 모드에서 캅토 Q ImpRes 크로마토그래피에서 추가로 정제하였다. 캅토 Q ImPres 용리액을 결합/용리 모드에서 캅토 어드히어 크로마토그래피에 의해 추가로 연마하였다. 캅토 어드히어 용리액을 바이러스 여과 단계에 의해 프로세싱하였다. 그 후, 바이러스 여과액을 농축시키고, 버퍼를 최종 부형제로 교환한 다음 농도 조절 및 0.2 μm 여과를 수행하였다. 이 정제에서 사용된 모든 크로마토그래피 겔은 지이-헬스케어에 의해 제조되었다.
제1 정제 단계는 결합/용리 모드에서 수지 캅토 DeVirS를 사용하는 친화성-유사 크로마토그래피이다. 캅토 DeVirS 칼럼의 목적은 수확물로부터의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 캡처, 추가 하류 프로세싱을 위한 일반적인 불순물의 부피 감소 및 저하이다. 이 단계의 경우, 수확물을 물로 희석하여 5.25 mS/cm의 표적 전도도를 달성하였다. 전도도 조절 후, 물질을 이전에 40 mM 인산나트륨 pH 7.1 - 7.5로 평형화된 캅토 DeVirs 상에 로딩하였다. 칼럼을 평형화 버퍼로 세척한 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 풀을 275 cm/h에서 20 mM 인산나트륨, 240 mM 염화나트륨 pH 7.2 - 7.6으로 용리시켰다.
캡처 단계 후에 바이러스 불활성화가 이어진다. 바이러스 불활성화 단계의 목적은 외피보유 바이러스와 같은 세제 불내성 바이러스를 제거하는 것이다. 폴리소르베이트-80을 지속적으로 교반하면서 수확 물질에 첨가하여 2.0%의 표적 농도를 달성하였다. 18 내지 24시간 동안의 인큐베이션을 제어된 실온 (22-24C)에서 광 보호 하에 수행하였다. 바이러스 불활성화의 종결을 다음 크로마토그래피 단계 전에 바이러스 불활성화된 풀의 희석을 통해 수행하였다.
바이러스 불활성화 후에 결합/용리 모드에서 수지 캅토 Q ImpRes를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피가 이어진다. 캅토 Q ImpRes 칼럼의 목적은 산물 순도를 증가시키고 (RP-HPLC를 통해 확인됨), HCP 및 DNA를 감소시키는 것이다. 캅토 Q ImPres 크로마토그래피는 또한 바이러스 제거 단계로서 정의된다. 이 단계의 경우, 물로 희석하여 캅토 DeVirs 용리 풀의 전도도를 10.9 mS/cm로 조절하였다. 전도도 조절 후, 물질을 이전에 20 mM 인산나트륨, 80 mM 염화나트륨 pH 7.3-7.7로 평형화된 캅토 Q ImpRes 상에 로딩하였다. 칼럼을 평형화 버퍼로 세척한 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 풀을 200 cm/h에서 20 mM 인산나트륨, 180 mM 염화나트륨 pH 7.3-7.7로 용리시켰다.
제3 정제 단계는 결합/용리 모드에서 수지 캅토 어드히어를 사용하는 혼합 모드 크로마토그래피이다. 캅토 어드히어 칼럼의 목적은 고분자량 종, 저분자량 종 및 HCP를 감소시키는 것이다. 캅토 어드히어 크로마토그래피는 또한 바이러스 제거 단계로서 정의된다. 이 단계의 경우, 캅토 Q ImpRes 풀을 200 cm/h에서 캅토 어드히어 칼럼 상에 직접 적용하였으며; 칼럼을 이전에 20 mM 인산나트륨, 180 mM 염화나트륨, pH 7.3-7.7로 평형화시켰다. 칼럼을 평형화 버퍼로 세척한 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 풀을 150 cm/h에서 20 mM 인산나트륨, 250 mM 시트르산나트륨, 300 mM 아르기닌, pH 7.2-7.6으로 용리시켰다.
캅토 어드히어는 응집체 제거, 숙주-세포 단백질 제거 및 바이러스 클리어런스에 최적화된 다중모드 음이온 교환 수지이다. 캅토 어드히어 크로마토그래피 수지의 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올아민이며; 이 리간드는 정전기적 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 단백질과 상호작용할 수 있다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 공정의 경우, 단백질을 21 mS/cm pH 7.3-7.7에서 로딩하였으며; 로딩 버퍼는 대략 180 mM 염화나트륨을 함유한다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 캅토 어드히어에 결합하는 조건은 샘플의 소수성 성분 및 캅토 어드히어 수지의 소수성 성분 간의 상호작용에 유리하다. 용리 버퍼는 20 mM 인산나트륨, 250 mM 시트르산나트륨, 300 mM 아르기닌, pH 7.2-7.6으로 이루어진다. 버퍼 적용 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 캅토 어드히어 칼럼으로부터 용리하였다. 이 공정에서 사용된 조건은 > 4.81 log의 MuLV 클리어런스 및 >3.15 log의 MVM 클리어런스를 허용하였다.
크로마토그래피 단계 후에 비로사르트(Virosart) HF (사토리우스 스테딤(Sartorius Stedim))를 사용하는 바이러스 여과 단계가 이어졌다. 0.1 μm 막을 갖는 비로사르트 Max 필터를 프리필터로서 사용하였다. 이 공정 단계의 목적은 공정 중간체 풀에 존재하는 잠재적 바이러스를 제거하는 것이다.
다음 정제 단계는 밀리포어에 의해 제조된 펠리콘 3 PES 바이오맥스 (MWCO 50 kDa)로 수행되는 한외여과/투석여과 단계이다. 이 단계의 목적은 산물을 농축시키고, 10 mM 인산칼륨 및 4 % 트레할로스로 이루어진 투석여과 버퍼에 대해 매트릭스를 교환하는 것이다. 투석여과된 체류물은 시스템 린스가 수행되기 전에 시스템으로부터 배출되었다. 시스템 린스를 투석여과된 체류물에 첨가하고 제형 버퍼를 첨가하여 0.9 mg/mL 내지 1.3 mg/mL 범위의 농도를 달성하였다.
원료 의약품 제형화 단계의 목적은 최종 원료 의약품 부형제 조성물을 0.05% PS-80의 최종 함량으로 조절하는 것이다. 그 후, 원료 의약품을 최종적으로 0.2 μm 여과하고, 분취하고, 냉동고 시스템에서 동결하였다. 원료 의약품을 추가 프로세싱까지 - 70℃에서 저장하였다.
Figure pct00002
표 1A. 상기 기재된 공정은 순도 (선택된 로트에 대해 SE-HPLC에 의해 결정된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 %)를 갖는 산물을 일관되게 생산한다.
B. 생성된 원료 의약품 중 p27의 함량
본 출원인은 발현 동안 생성된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 프로토머의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 프로토머의 비율에서 p27 펩티드의 서열이 검출되었음을 관찰하였으며; 이는 p27 펩티드의 서열이 검출되지 않은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 프로토머 (" F ")의 비율과 구별하기 위해 " F' "라고 지칭하였다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 숙주 세포로부터 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 발현 동안 일부 푸린 절단 부위가 비절단된 채로 남아있다고 생각된다.
상기 기재된 절차에 따라 표 2에 제시된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 결정된 F (또한 preF 피크라고 함) 및 F' (또한 preF' 또는 p27이라고 함)의 하기 비율을 갖는 원료 의약품을 생산하였다.
Figure pct00003
표 2. 상기 기재된 공정은 표에 기재된 바와 같은 순도 (RP-HPLC에 의해 결정된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 %)를 갖는 산물을 일관되게 생산한다.
C. F' 프로토머를 함유하는 삼량체로부터 F 프로토머가 풍부한 삼량체의 분리
이전에 기재된 공정을 사용하여 정제된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 캅토 MMC ImpRes 크로마토그래피 (지이 헬스케어)를 사용하여 추가로 정제하였다. 로드 물질 (pH 7.1, 전도도 1.5 mS/cm)을 캅토 MMC ImpRes 칼럼 (9.4 mL 하이스크린(HiScreen))에 적용하였다. 칼럼을 이전에 20 mM 인산나트륨, pH 7.2로 평형화하였다. 칼럼을 평형화 버퍼로 세척한 후, 용리를 20 칼럼 부피 (분획 크기 3 mL)에서 0에서 250 mM까지의 NaCl 구배, 20 mM 인산나트륨, 1M Na시트레이트로 수행하였다. 분획을 쿠마시 염색 및 RP-HPLC에 의해 SDS PAGE 겔 상에서 분석하였다. 분획을 이들의 RP-HPLC 순도 및 p27 펩티드 함량을 기준으로 2개의 풀에서 풀링하였다. 풀 1은 RP-UPLC에 의해 ~100% 주요 피크를 갖는 분획으로 이루어졌다. 풀 2는 ~ 33% p27 (F' 프로토머) 및 67% 주요 피크를 갖는 분획으로 이루어졌다. 따라서, 2개의 집단이 확인되고 단리되었다: ~100% 주요 피크 (F 프로토머)를 함유하는 삼량체 및 ~33% p27 펩티드 (F' 프로토머) 및 67% 주요 피크 (F 프로토머)를 갖는 또 다른 삼량체.
실시예 3
A. 숙주 세포 단백질 프로파일링 및 GRP78 정량화
상기 공정에 의해 생산된 바와 같은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 표지된 농도를 기준으로 DTT에 의해 환원시키고, 이소아세트아미드에 의해 알킬화시키고, 밤새 37℃에서 트립신에 의해 소화시켰다. 그 후, 소화물을 산성화하고, 데이터-의존적 획득 모드 하에 작동되는 써모 퓨전 오비트랩을 사용하여 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 마스코트(Mascot) 검색 엔진을 사용하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 서열 및 모든 공지되고 예측되는 CHO 단백질의 서열을 함유하는 단백질 데이터베이스에 대해 원시 데이터로부터의 피크 목록을 검색하였다. 공지된 HCP인 GRP78 (78 kDa 글루코스-조절 단백질)인 하나의 숙주 세포 단백질 (HCP)만이 검출되었다.
동위원소 희석 질량 분광분석법 방법에 의해 GRP78의 표적화된 정량화를 또한 수행하였다. ELISA, 예컨대 시그너스 CHO hcp ELISA에 의해 제제의 숙주-세포 단백질 함량을 또한 결정하였다. 결과는 본원의 공정에 따라 생산된 물질 중 GRP78 함량이 0.013%임을 제시하였다.
B. 응집
사내 개발된 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 검정을 사용하여, 상기 기재된 공정에 의해 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 응집 수준을 평가하였다. SEC는 단백질을 이들의 크기별로 분해한다. 저분자량, 주요 피크 및 고분자량 종의 % 분포는 표 3에 제시되어 있다.
Figure pct00004
표 3. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 물질 중 고분자량, 주요 피크 및 저분자량 종의 백분율 분포.
C. N500 부위 점유
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 3개의 Asn 잔기 (N27, N70, 및 N500. 아미노산 넘버링은 전장 RSV F 전구체를 기준으로 함)에서 N-글리칸에 의해 변형된다. N500 부위는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 집단의 분획에서 비-글리코실화될 수 있다. 비-글리코실화된 N500의 수준을 결정하기 위해, 상기 기재된 공정에 의해 생산된 바와 같은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 트립신 펩티드를 PNGase F 처리 전후에 LC-MS/MS에 의해 분석하였으며, 이로부터 K.I500NQSLAFIR.K (서열식별번호: 4) (비-글리코실화된 N500을 나타냄) 및 K.I500DQSLAFIR.K (서열식별번호: 5) (PNGase F에 의해 글리칸 제거된 N500을 나타냄)의 세기를 비교하였다. 결과는 이것이 ~7.2% 불완전한 글리코실화를 함유함을 제시한다.
D.
1. 1차 서열 무결성 및 번역후 변형
상기 기재된 공정에 의해 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 무손상 분자량을 워터스 제보(Xevo) G2-S QTOF 질량 분광계에서 LC-MS에 의해 분석하였다. 스펙트럼 데콘볼루션 후, 주요 종의 분자량은 61,226 Da인 것으로 결정되었다. 동일한 물질을 PNGase F에 의해 탈-N-글리코실화한 후, 유사하게 분석하였다. 분자량은 54,162 Da인 것으로 결정되었으며, 이는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 1차 서열로부터 계산된 이론적 질량과 매우 일치하였다. 이들 결과는 1) 1차 서열이 예상된 바와 같음; 및 2) 예상치 못한 번역후 변형 (글리코실화 제외)이 없음이라는 결론을 뒷받침한다.
2. FFF' 삼량체 및 F' 프로토머 함량
그 후, RP-HPLC 분석을 수행하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, F'는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 물질에서 쉽게 검출가능하였다. FFF 삼량체 및 F'-함유 삼량체를 분해하는 WCX-LC를 또한 사용하였다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 2개의 피크 (F 프로토머만을 포함하는 삼량체 및 적어도 하나의 F' 프로토머를 포함하는 삼량체)로 기준선 분해되었다.
E. 글리칸 프로파일
글리칸 프로파일링을 수행하였다. N-글리칸을 먼저 상기 기재된 공정에 의해 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로부터 절단한 다음, 환원성 아민화를 통해 2-AB로 표시하고, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 (HILIC)에 의해 분해하고, FLR 및 MS 검출기에 의해 검출/정량화하였다. 글리칸 구조 (개략적 형태) 및 글리칸 종의 상대적 풍부도는 도 4에 제시되어 있다. 예상되는 바와 같이, 글리칸 분자의 75% 초과는 상기 기재된 공정에 의해 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에서 관찰된 3개의 주요 글리칸 종으로 대표되며, 이는 디-시알릴화된/푸코실화된 바이안테나리, 모노-시알릴화된/푸코실화된 바이안테나리, 및 비-시알릴화된/푸코실화된 바이안테나리 글리칸이다. 이 물질 중 대부분의 글리칸은 시알릴화된 글리칸이다.
F. 부위 Ø 및 부위 V 에피토프 무결성
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 특정 저장 조건 하에 불안정하고 자발적인 형태 변화를 겪으며, 이는 부위 Ø 및 부위 V에서 항체 결합의 측정가능한 감소 (Fab 항체 이동 검정에 의해)를 초래하는 것으로 관찰되었으며, 이러한 형태 변화는 액체 버퍼에서 저장 동안 시간 경과에 따른 RSVPreF3 {원래 용어 "DS-Cav1"을 사용하여 확인됨, 본원에서는 문헌 [McLellan et al. Science (2013) vol. 342 p. 592], WO2014160463, 및 ClinicalTrials.gov 식별자: NCT03049488에 개시된 바와 같이 생산된 물질과 구별하기 위해 RSVPreF3이라고 다시 명명함}의 증가하는 비율에 영향을 미친다.
부위 Ø 및 부위 V의 무결성을 평가하기 위해 Fab-이동 검정을 개발하였다. 검정은 부위 Ø 및 부위 V에 각각 특이적으로 결합하는 Fab와 함께 이전에 인큐베이션된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 분해하기 위해 크기 배제 크로마토그래피 - 액체 크로마토그래피 (SEC-LC)를 사용한다. Fab-결합 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 더 큰 분자 크기를 가지므로, SEC 칼럼으로부터 더 일찍 용리되며, 따라서 결합되지 않은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로부터 분해될 것이다. 결과는 표 4에 제시되어 있다 (검정에서 이동되지 않은 백분율).
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표 4. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 Fab-이동 SEC 크로마토그램.
G. 등전점 (pI)
상기 기재된 공정에 따라 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 시알릴화된 N-글리칸을 함유한다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에서 상이한 전하 종을 분해하기 위해 등전 초점화 겔 전기영동을 사용하였다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 pI는 ~5.3-6.0이었다.
H. 침강 속도
침강 속도 분석용 초원심분리 (SV-AUC) 실험을 스캐닝 UV-가시광 광학 시스템이 장착된 옵티마(Optima) XL-A (벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 풀러턴) 분석용 초원심분리기로 수행하였다. 모든 실험을 AUC가 온도에 도달한 후 1시간 평형화 후 10℃에서 280 nm에서 검출로 30,000 RPM의 회전자 속도로 수행하였다. 샘플 및 참조를 12 mm 센터피스 및 석영 창을 갖는 벡크만 차콜-에폰 2 섹터 셀에 로딩하였다. Sedfit (NIH의 피터 셕(Peter Schuck) 제공)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 아미노산 서열을 기준으로 Sednterp를 사용하여 상기 기재된 공정을 사용하여 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 대해 0.74 mL/g의 부분 특정 부피를 계산하고 분석에 사용하였다. 버퍼 조성물을 기준으로 Sednterp 소프트웨어를 사용하여 분석에 사용된 버퍼 밀도 및 점도를 또한 계산하였다. 연속 c(들) 분포를 300 스캔과 함께 사용하였다. 이 범위를 벗어나는 신호 침강이 없음을 확인한 후 0 내지 15 스베드버그 범위를 사용하였으며, 분포당 300 포인트의 해상도 및 0.95의 신뢰 수준을 사용하였다. 메니스커스 및 하단 위치를 수동으로 설정하는 동안 기준선, 방사형 독립 노이즈, 및 시간 독립 노이즈를 적합화하였다. 최적합 마찰 비를 분석에 사용하였다.
주요 피크는 ~178 kDa의 분자량을 갖는 중간 내지 고도로 신장된 종과 일치한다. 주목할 점은 높은 정도의 비대칭성이 관찰되었다는 것이다. 결정 구조에서, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 장축 및 단축 사이에 약간의 차이만 있는 대략적으로 편장 타원체로 보인다. ~2의 마찰 비를 갖는 종은 69.1 및 2.5 nm의 장축 및 단축을 갖는 편장 타원체 또는 26.6 nm 및 0.6 nm의 장축 및 단축을 갖는 편원 타원체로서 모델링될 수 있다.
I. 요약
상기 기재된 공정에 따라 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 물리화학적 연구는 적어도 99.9% 순수한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (w/w)를 생산하는 것으로 관찰되었다. 또한, 상기 기재된 공정에 따라 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 글리코실화 프로파일은 표준 방법에 따라 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에서 7개 이상과 비교하여 3개의 주요 글리칸 피크로 표시되는 시알릴화된 글리칸의 75% 이상을 나타낸다. 그리고, 상기 기재된 공정에 따라 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 pI는 7.8 미만의 pI를 가지며, 이는 최적의 CHO 세포 조건을 나타낸다 (pI 차이는 글리코실화 프로파일의 반영일 가능성이 높다). 상기 기재된 공정에 따라 생성된 응집 수준은 표준 방법에 따라 제조된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드보다 낮다. Fab 이동 검정에 의해 측정된 바와 같은 부위 Ø 및 부위 V 결합 둘 다는 액체에서 저장 동안 시간 경과에 따라 감소한다. 또한, 상기 언급된 공정은 공개된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 조성물에 대한 것보다 낮은 HCP 함량을 초래한다.
실시예 4 - 부위 Ø 및 부위 V 결합 연구
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 중화 항체에 의해 표적화된 준안정적 항원성 부위 Ø를 보유한다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 5℃에서 액체 제형에서 저장하였을 때 부위 Ø 항체 결합의 점진적인 손실이 관찰되었다. McLellan et al. (2013) "Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein for Respiratory Syncytial Virus," Science, 342: 592-598. 저자들은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 헵타드 반복부 A (HRA) 영역에서 유의한 움직임 및 장애가 손상된 부위 Ø를 갖는 제2 융합전 형태를 초래할 수 있다는 것을 중첩된 결정 구조로부터 가설을 세웠으며, HRA 영역의 2차 구조 부분을 연결하는 루프를 안정화시키는 돌연변이가 5℃에서 장기간 저장 동안 부위 Ø를 유지할 수 있었음이 제안되었다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 N67I 및 S215P 변형은 5℃에서 저장된 60일 기간에 걸쳐 부위 Ø 결합 항체-결합의 손실을 나타내지 않았다. Krarup et al (2015), "A highly stable prefusion RSVF vaccine derived from structural analysis of the fusion mechanism," Nat Commun, 6:8143. 또 다른 연구는 4℃에서 저장된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 안정성 물질에서 동일한 현상을 관찰하였으며, 또한, 부위 Ø의 손상이 더 나은 노출된 부위 I 에피토프와 평행함을 제시하였다. Flynn (2016) "Stability Characterization of a Vaccine Antigen Based on the Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein," Plos One, 10:1-18. 본 출원인은 부위 Ø 결합의 손실에 연루된 도메인이 부위 V와 중첩되고, 후속적으로 또한 부위 V 항체 결합에 영향을 미쳤다는 것을 관찰하였다.
분석적 및 생물물리적 기술의 조합을 사용하여 부위 Ø 항체-결합 손실의 원인을 추가로 조사하였다. 단백질 1차 서열 변형 및 응집은 부위 Ø 항체-결합 손실에 기여하는 것으로 관찰되지 않았다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 액체 용액에서 연장된 저장 후 2개의 별개의 형태로 존재하는 것으로 보였다. 데이터 관점에서 부위 Ø 에피토프 자체가 아니라 부위 Ø 근처의 도메인에서 국부적 형태 변화가 있을 가능성이 있는 것으로 간주되었다. 데이터는 단백질 안정화 시약이 액체 제형에서 부위 Ø 항체-결합 효율을 상실하지 않도록 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 보호하지 않았음을 제시하였지만, 동결건조된 제형은 보호되었다.
A. 재료 및 방법
이 연구에서 사용되는 태그없는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 및 융합후 RSV-F 물질을 CHO 세포에서 발현하고, 광범위한 칼럼 분획화에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 중성 pH에서 낮은 수준의 계면활성제 및 디사카라이드와 함께 포스페이트 버퍼에서 ~ 1 mg/mL로 제형화하였다. 다른 모든 시약은 달리 언급되지 않는 한 피셔 사이언티픽에서 구입하였다.
1. 크기 배제 크로마토그래피 및 Fab이동 검정
100 mM 인산나트륨, 50 mM 염화나트륨 버퍼 (pH 7)를 사용하여 등용매 모드로 실행되는 워터스 액퀴티 UPLC 시스템에서 액퀴티 BEH SEC 칼럼 (4.6 mm X 150 mm, 1.7 μm)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 액체 크로마토그래피 (SEC-LC)를 수행하였다. 유량은 0.2 ml/분이었고, 검출을 215 nm 및 280 nm에서 UV에 의해 수행하였다. Fab이동 검정을 위해, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 먼저 혼합하고, 대략 1시간 동안 37℃에서 부위 Ø 결합 항체 또는 부위 V 결합 항체 Fab와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드, 각각의 Fab, 및 반응 혼합물을 SEC-LC에 의해 각각 실행하여 유리 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (이동불가능한 분획), 유리 Fab 및 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드/Fab 복합체 (이동된 분획)의 체류 시간을 각각 확립하였다. 엠파워(Empower) 3 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 통합하고, 상대적 정량화를 위해 피크 면적을 사용하였다.
2. SDS-PAGE
4-12% 비스-트리스 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 겔 전기영동을 수행하였다. DTT를 함유하는 SDS-PAGE 샘플 버퍼와 혼합된 대략 10ug의 샘플을 먼저 70℃에서 가열하고, 각 웰에 로딩한 후, 45분 동안 200 V에 적용하였다. 실행 후, 겔을 쿠마시 블루에 의해 염색하고, 메탄올/물/아세트산 용액으로 탈색한 후, 바이오래드(BioRad) ChemiDoc 영상화 시스템에서 시각화하였다.
3. 펩티드 맵핑
구아니디늄 클로라이드로 변성된 상기 개시된 공정에 따라 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 50 mM 중탄산암모늄으로 버퍼 교환하고, 56℃에서 DTT에 의해 환원시키고, 암실에서 실온에서 아이오도아세트아미드에 의해 알킬화시켰다. 트립신을 10:1 효소-대-기질 비율로 첨가하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 소화물을 포름산에 의해 산성화하고, 액퀴티 BEH C18 칼럼 (2.1 mm X 150 mm, 1.7 μm)에 주입하고, 0.1% 포름산 중 아세토니트릴의 증가하는 구배에 의해 분해하고, 검출을 위해 워터스 제보 G2-S QTOF 질량 분광계에 전기분무하였다.
4. 시차 주사 형광측정법 (DSF)
프로메테우스(Prometheus) 나노-DSF 기기 (나노템퍼 테크놀로지스, 인크.(NanoTemper Technologies, Inc.), 독일 뮌헨)를 사용하여 DSF를 수행하였다. 1 mg/mL (~5.5 μM)의 각 시험 샘플 10 μL를 얇은 모세관에 첨가하고, 기기에 로딩하였다. 온도 램프를 분당 1℃에서 20℃ 내지 110℃에서 실행하였다. 나노-DSF 기기는 고유 형광 기술을 사용하여 온도 함수로서 330nm 및 350nm 파장에서 티로신 및 트립토판 형광의 변화를 모니터링하였다. 단백질 언폴딩의 시작 및 전반적인 용융 온도를 더 정확하게 결정하기 위해 원시 데이터로부터 1차 도함수 트레이스가 또한 파생되었다.
5. 원편광 이색성 (CD)
실온에서 키라스캔(ChiraScan) Q100 분광계 (어플라이드 포토피직스, 인크.(Applied Photophysics, Inc.) 미국 매사추세츠주 비버리)에서 CD 실험을 수행하였다. 석영 큐벳 (1cm 경로 길이)에서 1 nm의 대역폭으로 60 nm/분에서 1 mg/mL 샘플에서 근-UV CD (250-340nm) 데이터를 수집하였다. 수집된 스펙트럼을 버퍼로 기준선 수정하고, 절대 곡선하면적을 사용하여 정규화하였다. 모든 데이터를 3벌로 수집하고, 각 저장 시점의 평균을 통계적 분석을 사용하여 유사성에 대해 비교하였다 (데이터는 제시되지 않음).
6. 수소-중수소 교환 질량 분광분석법 (HDX-MS)
제보 G2-S QTOF 질량 분광계에 커플링된 LEAP 시스템을 갖는 워터스 HDX 매니저에서 HDX-MS 분석을 수행하였다. 모든 시험 물질을 3벌로 분석하였다. 각 시험 물질을 H2O 또는 D2O 중 10 mM 인산칼륨에 의해 20배 희석하고, 0, 0.5, 5, 10, 30 및 240분의 시간 경과로 인큐베이션하였다. pH 2.5에서 1 M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.25 M 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)의 동일한 부피 첨가로 0℃에서 교환을 켄칭하였다. 20℃에서 펩신 칼럼 (워터스)에서 샘플을 즉시 소화시켰다. 펩티드를 농축시키고, 워터스 뱅가드(Vanguard) 프리-칼럼 (2.1x50 mm)을 사용하여 버퍼 교환하고, 액퀴티 BEH C18 칼럼 (1.7 μm, 1.0 X 100 mm, 워터스)에서 0℃에서 분리한 후, MS에서 분석하였다. 프로틴링크스 글로벌 서버(ProteinLynx Global Server)(PLGS) 및 DynamX 소프트웨어 (버전 3.0.0)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
7. 상동성 모델
몰레큘라 오퍼레이팅 인바이런먼트(Molecular Operating Environment) 모델링 프로그램과 함께 2개의 상이한 결정 구조 주형 (pdbs: 4mmv 및 4jhw)을 사용하여, 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 결합된 부위 Ø 결합 항체의 상동성 모델을 생산하였다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 서열을 주형 서열로서 사용하였다. 4mmu 영역에서 폴돈 영역이 무질서하고 부위 Ø 결합 항체 Fab가 임의의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 구조에 존재하지 않기 때문에 2개의 결정 구조를 구현하였다. 부위 V 결합 항체 결합된 / 에피토프 부위 II 결합 항체 결합된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (부위 II 항체는 융합전 및 융합후 RSV-F에 결합한다)와 관련하여, 4mmv 및 4zyk 결정 구조를 갖는 MOE에 의해 상동성 모델을 또한 생성하였다. 2개의 최종 상동성 모델 각각에 대해, 10개의 개별 모델을 생성하고, 각 개별 시스템에 대한 상동성 모델의 최종 표시로서 최저 에너지 모델을 선택하였다. 테더링된 제약조건이 있는 AMBER10:EHT 포스필드(Forcefield)로 최종 상동성 모델을 최소화하였다.
B. 결과
1. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 동결건조된 제형이 아닌 액체에서 부위 Ø 결합 항체-결합을 상실한다
면역검정 실험, 예컨대 ELISA 및 SPR을 보완하는 Fab이동 검정은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 및 그의 상응하는 항체 사이의 결합을 평가하기 위한 직교 방법으로서 구현되었다. Fab 및 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 37℃에서 1시간 동안 함께 인큐베이션한 후, 비-변성 조건 하에 크기 배제 크로마토그래피 실행에 의해 혼합된 샘플을 분해하였다. Fab-결합 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 삼량체는 더 일찍 용리되므로, 증가되는 분자량 및 유체역학적 크기 (3개의 Fab가 결합된 경우 ~330 kDa vs. 결합되지 않은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 삼량체의 경우 ~183 kDa)로 인해 크로마토그램에서 그의 체류 시간이 왼쪽으로 이동한다. 이동된 종 및 이동되지 않은 종의 피크 면적을 비교함으로써, 부위 Ø 결합 항체-결합을 상실한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 백분율을 추정할 수 있다. 3-개월 안정성 샘플의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 + 부위 Ø 결합 항체 Fab이동 크로마토그램은 도 5에 제시되어 있다. 유리 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 삼량체는 대략 9.2분에 용리되는 반면, 부위 Ø 결합 항체-결합 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 8.2분의 더 짧은 체류 시간으로 이동하였다. 이러한 이동된 피크의 비대칭성은 아마도 Fab의 이질성으로 인한 것일 수 있으며, 11.2분에서의 그의 용리 피크는 또한 비대칭성을 나타내었다. 도 5a의 표 삽입물에 제시된 바와 같이, 이러한 특정 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 물질은 86% 이동가능한 분획을 가졌고, 백분율은 모두 5℃에서 액체 제형에서 저장된 1-개월, 3-개월, 및 7-개월 안정성 물질에서 76%, 69% 및 58%로 점진적으로 감소하였다. 이 관찰은 이전에 보고된 다수의 결과와 일치하였다. 단백질-안정화 부형제를 사용하라는 이전 제안과는 달리, 현재 연구에 관여된 액체 제형은 일정 수준의 디사카라이드 및 비이온성 계면활성제를 함유하였으나, 부위 Ø 결합 항체-결합의 손실을 방지하지 못하였다. 액체 제형과는 대조적으로, 동일한 제형 부형제를 갖는 동결건조된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 대해 40℃에서 2주 동안 (도 5b) 및 5℃에서 최대 6개월 동안 (도 5c) 유지된 샘플의 경우 부위 Ø 결합 항체-결합 손실이 관찰되지 않았다. 이는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 동결건조에 적합하다는 것을 확인하고, 개시된 공정에 따라 생산된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 및 다른 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 RSV 백신의 저장 수명을 연장하기 위해 동결건조된 제형이 바람직할 수 있음을 시사하였다.
2. 1차 서열 무결성 및 응집은 부위 Ø 결합 항체-결합 손실의 원인이 아니다
단백질 클리핑이 발생했는지 결정하기 위해, 환원된 SDS-PAGE 겔을 실행하여 신선한 참조 및 3-개월 5℃ 안정성 물질을 비교하였다. 성숙한 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 분자내 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 F1 및 F2 폴리펩티드를 포함하는 2-쇄 분자이다. 도 6a에 제시된 바와 같이, 환원된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 2개의 주요 밴드로서 겔 상에서 이동하였다. ~ 45 kDa의 더 높은 분자량 밴드는 F1 폴리펩티드였고; ~ 10 kDa의 더 낮은 분자량 밴드는 F2 폴리펩티드였고; F1 위의 부차 밴드는 상이한 F1 당형태였다. 전반적으로, 겔 밴드 패턴은 신선한 참조 및 3-개월 안정성 물질 간에 매우 유사하였으며, 이는 3-개월 물질 (도 5a)에서 부위 Ø 결합 항체-결합 손실이 단백질 클리핑 사건으로 인한 것이 아님을 시사한다.
단백질 응집이 인자인지 조사하기 위해, 신선한, 1-개월, 3-개월, 및 7-개월 물질을 SEC-LC에 의해 비교하였으며, 결과는 모든 물질 중에서 고분자량 종의 매우 유사하게 낮은 수준을 제시하였으며 (데이터는 제시되지 않음), 이는 단백질 응집이 부위 Ø 결합 항체-결합의 손실의 인자가 아님을 나타낸다 (삽입된 패널, 도 5a).
또한, LC-MS/MS에 의한 펩티드 맵핑을 또한 96% 초과의 서열 범위로 수행하였다. 도 6b에 제시된 바와 같이, 신선한 참조 및 3-개월 물질은 정확하게 동일한 펩티드 핑거프린트를 가졌고, 이는 화학적 변형, 예컨대 산화, 탈아민화 및 디술피드 결합 스크램블링이 또한 부위 Ø 결합 항체-결합의 손실의 원인이 아님을 시사하였다.
3. 고차 구조 변화는 부위 Ø 결합 항체-결합의 손실과 관련이 있다
3.1. 원편광 이색성
3차 구조를 250-340 nm 파장의 근-UV CD에 의해 조사하였다. 양성 대조군으로서 융합후 RSV-F는 융합전 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (제시되지 않음)와 크게 상이한 스펙트럼을 나타내었다. 신선한 참조 및 1, 3, 7-개월 안정성 물질은 시각적으로 유사한 스펙트럼을 나타내었고, 보다 정교한 통계적 접근법을 사용한 분석 후 차이를 나타내었다. 고차 구조 비교 방법의 현재 추세는 가중치 스펙트럼 차이 (WSD) 분석을 사용하는 것이다. 티어(Tier) 2 통계적 분석에 따라, 상이한 스펙트럼으로부터의 모든 WSD 값이 기본 비교 샘플의 평균의 -2σ/+2σ를 초과하면, 두 스펙트럼은 통계적으로 상이한 것으로 간주된다. 신선한 참조 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 물질의 평균 WSD 및 -2σ/+2σ 값은 각각 0.000222 및 0.000148/0.000297이었다. 1, 3, 및 7-개월 안정성 물질 모두에 대한 모든 WSD 측정은 신선한 참조 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 -2σ/+2σ 범위를 벗어났다 (제시되지 않음). 또한, WSD 값의 차이는 시간 경과에 따라 증가하였으며, 이는 무작위 이동이 아니라 고차 구조의 이동이 융합후 형태를 향해 한 방향에 있음을 시사한다 (제시되지 않음).
3.2. 시차 주사 형광측정법
신선한 참조 물질 및 안정성 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 물질 사이의 고차 구조의 검출된 차이는 시각적으로 작게 보였으며, 이는 국소화된 작은 형태 변화에 대한 근-UV CD의 무감각 때문일 수 있다. 형태 변화를 추가로 특징화하고 확인하기 위해, 그의 시작 용융 온도 (Tonset) 및 용융 온도 (Tm)를 결정함으로써 단백질의 열 안정성을 측정하는 나노-시차 주사 형광측정법 (DSF) 기기를 사용하여 물질의 분석 및 비교를 수행하였다. Tonset은 단백질이 언폴딩하기 시작하는 온도이며, Tm은 단백질이 50% 언폴딩되는 포인트이다. 더 높은 구조적 안정성은 Tm 증가와 상관관계가 있다. 나노-DSF는 온도가 증가함에 따라 단백질이 언폴딩함에 따라 발생하는 고유 티로신 및 트립토판 형광의 변화를 검출하고 기록한다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 4개의 트립토판 및 20개의 티로신을 함유하며, 이는 1차 서열 상의 상이한 영역 및 3차원 구조 상의 별개의 도메인에 잘 퍼져있다. 단백질이 언폴딩함에 따라, 매립 트립토판 및 티로신 잔기는 수성 환경에 대한 더 많은 노출을 획득한다. 이에 따라, 티로신 및 트립토판 고유 형광이 감소하고, 그의 방출 피크가 330 nm (매립 환경에 있을 때)에서 350 nm (수성 환경에 있을 때)로 이동한다. 그러므로, 350nm 및 330nm에서 기록된 비율 형광 신호는 단백질 언폴딩 사건의 시작에 증가하기 시작할 것이다. 용융 온도는 350/330nm 곡선의 중간점이기 때문에, 기록된 데이터의 1차 도함수를 계산하여 언폴딩 사건의 시작 및 용융 온도를 결정하였다.
신선한 참조, 1-개월, 3-개월, 7-개월 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 및 ~ 5.5 μM 농도의 융합후 RSV-F를 나노-DSF에 의해 분석하였다. 신선한 참조 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 낮은 Tonset 및 다중 피크를 갖는 넓은 용융 곡선을 나타내었으며, 이는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 '가요성' 구조를 갖고, 다중 언폴딩 사건이 수반되었음을 시사한다. 가장 강렬한 전이의 정점으로 기록된 Tm은 72.2℃였다. 대조적으로, 융합후 RSV-F는 92.5℃에서 Tm을 사용하여 높은 Tonset 및 별개의 단일-사건 언폴딩 곡선을 나타내었으며, 이는 융합후 RSV-F가 '단단'하고 더 안정적인 구조를 가졌음을 시사하였다. 흥미롭게도, 안정성 물질의 경우, Tonset은 거의 변하지 않았지만, 용융 곡선은 시간 경과에 따라 더 높은 온도로 이동하였다. ~79.1℃에서 더 높은 Tm을 갖는 새로운 전이가 나타나기 시작하였다. 이 전이의 크기는 5℃에서 더 오랜 시간 동안 강화되었다. 동시에, 72.2℃에서 주요 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 전이의 크기가 감소하였다. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 안정성 물질의 용융 곡선이 융합후를 향해 이동하였지만, 79.1℃보다 높은 전이는 수득되지 않았다. 92.5℃에서 융합후 RSV-F의 특징적인 첨예한 전이는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 안정성 샘플에서 부재한 상태로 유지되었다. (데이터는 제시되지 않음.) 함께, 이들 데이터는 5℃에서 액체 제형에서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드가 융합전 형태보다 상대적으로 더 안정적이지만 융합후 형태와는 상이하고 덜 안정적인 새로운 형태를 채택하였음을 시사하였다. 새로운 형태는 융합후 상태로 추가로 전이할 수 없었다.
새로운 형태의 획득이 Fab이동 검정에서 부위 Ø 결합 항체-결합 손실 및 이동불가능한 분획의 증가의 원인인지에 대한 조사를 수행하였다. SEC-LC 상의 부위 Ø 결합 항체 Fab 이동불가능한 분획 피크를 수집하고, 버퍼를 신선한 참조 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드와 동일한 제형으로 교환하고, 동일한 농도로 희석하고, 나노-DSF에 의해 유사하게 분석하였다. 이동불가능한 분획은 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 안정성 물질에 의해 획득된 새로운 형태와 동일한 Tonset 및 Tm을 나타내었고, 신선한 참조 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에서 관찰된 72.2℃ 전이를 완전히 누락하였다. 또한, 부위 Ø 결합 항체 이동된 분획을 또한 수집하고 분석하였으며, 이는 79.1℃ 전이의 완전한 결여를 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 함께, DSF 데이터는 융합전 및 융합후 형태 둘 다와 별도로 상이한, 시간 경과에 따라 액체 형태에서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 의해 획득된 새로운 형태가 부위 Ø 결합 항체-결합 손실의 근본 원인임을 시사하였고, 액체 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 안정성 물질에는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 2개의 집단이 있었으며, 하나는 새로운 형태를 채택하고 다른 하나는 초기 융합전 형태를 유지하였다.
3.3. HDX-MS
근-UV CD 및 나노-DSF 기술은 오직 전반적인 형태 변화를 검출할 수 있었다. 3D-구조의 형태 변화의 정확한 위치(들)를 더 정확히 파악하기 위해, HDX-MS에 의해 신선한 참조 및 1-개월, 7-개월 안정성 물질에 대해 비교를 수행하였다. 용액에서 아미드 백본의 수소와 중수소의 교환율을 측정함으로써 단백질 구조에서 특정 도메인의 용매 접근성 및/또는 수소 결합에 대한 HDX-MS 프로브. 이 연구에서, 각 샘플로부터의 총 249개의 펩신-소화 펩티드는 96.9%의 서열 범위를 나타낸다. 유의한 역 교환은 관찰되지 않았다. 유의성 역치를 각 시점에서 0.2 Da로 설정하였다. 그러므로, 펩티드당 1.2 Da보다 큰 Δ질량만이 실제 차이로 간주되었다. 대부분의 펩티드는 시험된 3개의 물질 사이에서 중수소화 흡수의 차이가 없거나 상당한 수준보다 적었다. 유일한 검출된 차이는 아미노산 잔기 147-163에 있으며, 5℃에서 액체에서 더 오랜 시간 동안 신선한 참조 및 안정성 물질 사이의 이러한 차이의 크기가 증가하였다. 아미노산 잔기 147-163은 부위 Ø 에피토프에 바로 근접한 β3-β4 헤어핀 β 루프 모티프 내에 존재한다. 더 흥미롭게도, 대부분의 부위 Ø 에피토프 자체를 구성하는 5개의 펩신-소화 펩티드는 중수소 흡수의 어떠한 차이도 보이지 않았다. 함께, HDX-MS 결과는 부위 Ø 결합 항체-결합의 손실 뒤에 있는 형태 변화가 부위 Ø 자체에서 용매 접근성 또는 수소 결합 패턴에 영향을 미치지 않았음을 시사하였으며; 대신에 입체 장애가 생성되었을 수 있으며, 부위 Ø로 이어지는 아미노산 잔기 142-163이 더 많은 용매에 노출되거나 더 많은 수소 결합 잠재력을 상실할 때 부위 Ø 결합 항체 Fab의 부위 Ø에 대한 도킹을 방해할 수 있다. 이 결과는 이 헤어핀 도메인을 안정화하기 위해 이 짧은 서열 내에 돌연변이(들)를 도입하는 것이 백신 항원으로서 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 효력을 유지하는데 도움이 될 수 있음을 암시하였다.
3.4. 형태 변화가 국소화됨
중수소 흡수 차이를 보이는 펩티드의 작은 스트레치만이 발견된 HDX-MS 실험은 부위 Ø 결합 항체-결합 손실 뒤에 있는 형태 변화가 전체적인 구조적 변화가 아니라 국소적인 변화였음을 추가로 시사하였다. 5℃에서 액체 제형에서 장기간 저장이 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 및 2개의 다른 RSV-F 항체, 부위 V 결합 항체 및 부위 II 결합 항체 사이의 결합에 영향을 미치는지 여부에 대한 조사를 수행하였다. 부위 V 결합 항체는 융합전 RSV-F의 삼량체 형태에만 존재하는 4차 에피토프 부위 V를 인식하는 강력한 중화 항체이다. 부위 II 결합 항체는 융합전 및 융합후 RSV-F 둘 다에 존재하는 에피토프 부위 II를 인식한다. 부위 V 및 부위 II는 부위 Ø 에피토프로부터 유사하게 이격되지만, 부위 V 에피토프는 β3-β4 모티프와 유의하게 중첩되는 반면 (제시되지 않음), 부위 II 에피토프는 그렇지 않았다 (제시되지 않음). 부위 V 결합 항체 및 부위 II 결합 항체 Fab를 사용하는 Fab이동 검정은 5℃에서 액체에서 장기간 저장이 부위 Ø 결합 항체의 경우와 유사한 비율의 부위 V 결합 항체-결합 손실을 초래하였지만, 부위 II 결합 항체 결합은 영향을 받지 않았음을 명확하게 나타내었다 (제시되지 않음). 이들 데이터는 형태 변화가 β3-β4 영역 주변에서 발생하였다는 추가 증거를 제공하였다. 더욱이, 이들 데이터는 액체 제형에서 저장을 통해 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드에 의해 채택된 새로운 형태가 전체적인 구조적 변화보다는 미묘한 국소화의 결과임을 뒷받침하였다.
실시예 6 - 액체 크로마토그래피에 의한 preF' 및 preF의 분석적 분리
F' 및 F 프로토머의 분석적 분리의 두 가지 접근법이 있다. 첫 번째는 변성 조건 하에 역상 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의한 것이며, 그 동안 삼량체는 F 및 F' 프로토머로 변성되고, 그 후 프로토머는 이들의 소수성의 차이를 기준으로 분해되며; 두 번째는 천연 조건 하에 약한 양이온 교환 액체 크로마토그래피 (WCX-LC)에 의한 것이며, 그 동안 삼량체 형태 (FFF 또는 FFF')가 유지된 후, 이들의 고유 전하 차이를 기준으로 분해된다.
RP-HPLC에 의한 F' 및 F 프로토머의 분석적 분리
역상 (RP) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 방법을 사용하여 부분적으로 정제된 및 정제된 원료 의약품 및 동결건조된 의약품 (재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체)을 분석하였으며, 추가로 초-고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 방법으로 최적화하였다. RP HPLC 및 RP UPLC의 목적은 원료 의약품의 농도 및 순도를 정량적으로 결정하는 것이다. F' 및 F의 2개의 피크는 RP 칼럼의 이들의 소수성의 차이를 기준으로 분리되었다. p27 펩티드는 친수성 N-연결된 글리칸에 의해 광범위하게 글리코실화되어, F'에 더 적은 소수성을 부여한다. 그러므로, F'는 C18-기반 역상 칼럼에서 더 일찍 용리될 수 있다. 도 9에 제시된 바와 같이 2개의 피크 (피크 #4 및 5로 지정됨)를 수집하고, 트립신에 의해 소화시키고, LC-MS/MS에 의해 분석하였으며, 이는 피크# 5에서가 아니라 피크 #4에서 p27 펩티드 서열에서 유래하는 트립신 펩티드의 존재를 나타내었다. 결과는 피크 #4를 F'로 확인하고 피크 #5를 F로 분명하게 확인하였다. 이들 피크의 정량화에 사용된 RP-HPLC 및 RP-UPLC 방법은 표 5에 요약되어 있다.
Figure pct00006
표 5. RP HPLC 및 RP UPLC 방법의 요약.
방법 둘 다를 특이성, 선형성, 반복성, 정확성, 정량 한계 및 검출 한계에 대해 철저히 평가하였다. 여러 로트의 원료 의약품을 분석하였으며, 12% 내지 16% 범위의 F'를 나타내었다. HPLC 및 UPLC 방법으로부터 원료 의약품의 대표적인 크로마토그램은 도 9 및 도 10에 제시되어 있다.
WCX-LC에 의한 FFF 및 FFF' 삼량체의 분석적 분리
기존 분석 방법, 예컨대 역상 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 및 SDS-PAGE는 F' 및 F의 양을 정량화할 수 있지만, 이들 방법이 변성 조건에서 수행되고 삼량체가 공유결합으로 연결되지 않기 때문에 F'를 함유한 삼량체의 집단은 정량화할 수 없다. 갭이 확인되었고, 천연 상태의 분자를 이해하고 삼량체 형태를 유지하면서 삼량체에서 F'의 존재를 정확하게 정량화하기 위해 새로운 분석 방법이 필요하였다.
새로운 분석 방법, 약한 양이온 교환 액체 크로마토그래피 (WCX-LC)는 삼량체를 특징화하기 위해 개발되었다. 이 방법은 상이한 형태의 삼량체 (FFF 또는 FFF')를 분리할 수 있다. p27 펩티드는 F' 프로토머의 F1 프로토머의 N-말단 상의 27-아미노산 잔기 펩티드이며, 이는 세포 배양 공정 동안 푸린에 의해 절단되지 않는다. WCX-LC 방법은 적어도 하나의 F', 즉 FFF'를 포함하는 삼량체로부터 FFF 삼량체를 기준선 분리할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 분리는 비-변성 조건에서 분석물질의 전반적인 표면 전하를 기준으로 한다. 약한 양이온 교환 방법은 p27 펩티드의 존재 또는 부재를 기준으로 삼량체를 분리하는 것이 가능하며, 이는 이 길이의 펩티드가 2개의 글리코실화 부위에 9개의 양으로 하전된 아미노산 및 4개의 시알산을 가지며, 이는 p27 펩티드가 결여된 프로토머와 비교하여 순 5개의 양전하를 첨가하는 p27 펩티드의 존재를 초래하기 때문이다.
Figure pct00007
표 6 (계속). RSVPreF3 {원래 용어 "DS-Cav1"을 사용하여 확인됨, 본원에서 RSVPreF3으로 다시 명명되어 문헌 [McLellan et al. Science (2013) vol. 342 p. 592], WO2014160463, 및 ClinicalTrials.gov 식별자: NCT03049488에 개시된 바와 같이 생산된 물질과 구별됨}에 대한 WCX-LC 방법의 요약.
삼량체가 C-말단 폴돈 도메인에 의해 함께 삼량체 형태를 유지하는 온화한 비-변성 조건을 사용하여 WCX-LC를 수행하였다. 상기 언급된 실험 조건에 따라 약한 양이온 교환 크로마토그래피에 적용할 때 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체는 피크 1 및 피크 2로 표시된 2개의 별개의 기준선 분리된 피크로 분리된다 (도 11). 피크 1 아래의 면적은 총 피크 면적의 대략 2/3이고, 피크 2 아래의 면적은 대략 1/3이다. 2개의 피크의 조성을 특징화하기 위해, 도 12에 제시된 바와 같이 자동화된 분획 수집기를 사용하여 시간설정 분획을 수집하였다. 이들 분획을 농축시키고, 이전 섹션에 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 추가로 분리하였다. RP-HPLC로부터의 결과는 약한 양이온 교환으로부터의 피크 1이 순수한 FFF 삼량체인 반면, 피크 2가 F'-함유 삼량체임을 입증하였다 (도 13). 피크 2 상의 F'의 조성은 대략 1/3이고 F는 2/3이며, 이는 피크 2에서 삼량체가 1개의 F' 및 2개의 F 프로토머로 이루어져 있음을 시사한다. 추가 증거는 이후 섹션에서 논의된다.
재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 상동성 모델링은 변형되지 않은 p27 펩티드가 삼량체의 공동 내부에 정확히 적합화됨을 시사하고, 모델링은 글리코실화 모티프에 부착된 글리칸을 갖는 경우 내부에 적합화되지 않을 것임을 시사한다 (제시되지 않음). 이전의 글리코실화 프로파일링 실험은 p27 펩티드의 글리코실화 부위 둘 다가 시알릴화된 바이안테나리 글리칸으로 완전히 장식됨을 나타낸다. 또한, 푸린을 사용한 시험관내 처리는 p27 펩티드를 절단한다 (데이터는 제시되지 않음). 또한, 이전에 기재된 바와 같이, p27 펩티드는 그의 측쇄 상에 5개의 양전하를 갖는다. 상동성 모델링은 동일한 전하 반발이 바람직한 위치가 표면에 있게 함을 나타낸다. 또한, 표면 전하에 의해 분자를 분리하는 크로마토그래피 방법인 WCX-LC에서 F'가 없는 삼량체로부터 F'-함유 삼량체를 분리한다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 이들 표시는 p27 펩티드가 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 표면에 돌출되어 있다는 결론을 뒷받침한다.
WCX-LC 피크 2가 ~2의 비율로 F 및 F' 프로토머를 함유한다는 관찰 외에도, 하기 관찰은 본원에서 시험된 삼량체가 하나의 F' 프로토머를 갖는다는 결론을 뒷받침한다. 첫째, 3D 구조적 모델링으로부터 FFF, FFF', 및 FF'F'의 예측된 pI는 각각 8.46, 8.66, 및 8.84이다. WCX-LC는 용리를 위해 선형 염 구배를 사용한다. 그러므로 FFF/FFF' 및 FFF'/FF'F' 사이의 체류 시간의 차이는 거의 동일해야 한다. FF'F'의 예측된 체류 시간에서, WCX 칼럼으로부터 용리되는 검출가능한 피크가 없다. FF'F' 피크에 대한 추정 체류 시간을 도시하는 도 14를 참조한다 (점선 원 안의 점선 곡선).
추가로 조사하기 위해, F1 폴리펩티드에 안정적으로 부착된 p27 펩티드를 갖는 RSVPreF3 {원래 용어 "DS-Cav1"을 사용하여 확인됨, 본원에서 RSVPreF3으로 다시 명명되어 문헌 [McLellan et al. Science (2013) vol. 342 p. 592], WO2014160463, 및 ClinicalTrials.gov 식별자: NCT03049488에 개시된 바와 같이 생산된 물질과 구별됨}의 돌연변이된 형태 (본원에서 "R295"라고 함)를 약한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 조사하였다. R295에서, F1 쇄의 N-말단에 있는 푸린 절단 부위는 3개의 양으로 하전된 아미노산이 비하전된 아미노산, 구체적으로 제2 아미노산에서 Lys->Ser, 제3 아미노산에서 Arg->Gly, 및 제4 아미노산에서 Arg->Ser에 의해 대체되도록 돌연변이된다. 이들 돌연변이는 푸린 절단을 방지하고, R295는 F'F'F' 삼량체의 형태로 존재한다. R295에서 하나의 F'는 p27 펩티드에서 2개의 순 양전하 (5-3=2)를 갖는다. 그러므로, 일반 FFF 및 R295 F'F'F' 사이의 전하 차이는 6개의 양전하이다 (2 X 3=6). WCX-LC에서, R295 F'F'F'는 상기 기재된 예측된 FFF' 삼량체보다 ~1/2분 늦게 용리된다. 도 14를 참조한다. R295 F'F'F' 및 일반 FFF' 사이의 전하 차이는 오직 1 (6-5=1)에 불과하므로, 이는 WCX-LC 방법이 오직 1의 전하 차이를 구별할 수 있음을 입증한다. 또한, 공유 결합에 의해 삼량체 형태를 안정화시키기 위해 삼량체를 포함하는 프로토머의 화학적 가교를 사용하였다. 가교 삼량체의 LC-MS 분석은 FF'F' 또는 F'F'F'에 상응하는 질량을 검출하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 결론적으로, 본원에서 삼량체의 집단을 시험함으로써 오직 FFF 및 FFF'만이 관찰되었으며, 한 예에서 전체의 ~36%를 나타내는 FFF' 삼량체가 관찰되었다.
실시예 7 - DS-Cav1과 비교된 RSVPreF3
실시예 1-4에 기재된 것을 포함하는 기술을 사용하여 예시적인 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 (이하 "RSVPreF3")를 문헌 [McLellan et al. Science (2013) vol. 342 p. 592], WO2014160463 및 ClinicalTrials.gov 식별자: NCT03049488에 기재된 DS-Cav1 조성물과 비교하였다. 하기 요약은 연구에서 사용된 RSVPreF3 및 DS-Cav1의 개요를 제공한다.
1. 제형:
a. RSVPreF3
i. 10 mM 인산칼륨, 5% 트레할로스, 0.05% 폴리소르베이트 80 (pH 7.0)
ii. 표시 - 동결건조됨
b. DS-Cav1
i. 20 mM 히스티딘, 100 mM 염화칼륨, 100 mM 아르기닌, 2.5% 수크로스 (pH6.5)
ii. 표시는 동결된 액체임
2. 생산:
a. RSVPreF3은 DS-Cav1 생산에 사용되는 CHO 세포주와 상이한 CHO 세포주를 사용하여 생산된다.
b. RSVPreF3은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 생산되는 반면, DS-Cav1은 상이한 방법을 사용하여 생산된다.
물리화학적 시험
SE-HPLC. 두 가지 조성물에 대한 삼량체 함량을 연구하기 위해 SE-HPLC를 사용하여 고분자량 종 (HMWS)을 조사하였으며, 결과는 하기와 같다:
Figure pct00008
*1.0 mg/mL
**0.5 mg/mL
크로마토그램은 도 15에 제시되어 있다. DS-Cav1은 더 이질적인 것으로 보이고, 상대적으로 높은 수준의 응집체를 갖고, RSVPreF3보다 크기가 더 작은 것으로 보인다.
함량 및 순도. RP-HPLC를 사용하여 RSVPreF3 및 DS-Cav1 조성물의 함량 및 순도를 조사하였다. 도 18을 참조한다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
삼량체 프로파일. 약한 양이온 교환 (WCX)을 사용하여 RSVPreF3 및 DS-Cav1의 FFF 및 FFF' 집단을 조사하였다. 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
Figure pct00011
특히, DS-Cav1은 FFF 및 FFF' 사이에 체류 시간 (RT)이 있는 상대적으로 넓은 피크로서 나타낸다. RT의 이동은 DS-Cav1이 더 염기성임을 시사한다. DS-Cav1 물질에 존재하는 FFF'가 없다. DS-Cav1의 꼬리는 아마도 HCP 불순물 및 물질의 이질적 성질 때문일 것이다. 도 19를 참조한다.
AUC. 침강 속도를 사용하여 RSVPreF3의 분자량 및 DS-Cav1 조성물을 조사하였다. 도 16을 참조한다. 2개의 RSVPreF3 동결건조 샘플이 실행되었으며; 하나의 RSVPreF3 액체 샘플이 실행되고; 하나의 DS-Cav1 액체 샘플이 실행되었다. RSVPreF3은 실행마다 상대적으로 일관되게 실행되었으며, 단일 종이 크로마토그램 피크에 숄더 없이 관찰되었다. DS-Cav1 주요 피크는 RSVPreF3보다 더 낮은 분자량에 적합하며, ~3 s에 추가 피크가 있다.
HCP. 비-환원된 및 환원된 SDS-PAGE, HCP 키트 (시그너스 F550 키트, 시그너스 테크놀로지스 (미국 28461 노쓰 캐롤라이나주 사우스이스트 사우스포트 사우스포트 서플라이 로드 4332)로부터 입수가능함)에 의해 및 질량 분광분석법을 사용하여 HCP-함량을 조사하였다. SDS-PAGE 결과는 하기 표 및 도 17a에 요약되어 있다.
Figure pct00012
HCP 키트 및 MS 결과는 하기 표에 요약되어 있다.
Figure pct00013
DS-Cav1은 하기를 포함하여 추가로 확인된 HCP를 함유한다 (풍부도 감소):
· GRP78
· 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제
· 폴리스타틴-관련 단백질 1
· 포스포글리세레이트 키나제
· 신장 인자 2
· 프룩토스-비스포스페이트 알도라제 A
· 피루베이트 키나제 PKM
· 페록시레독신-1
· 알콜 데히드로게나제
· 펩티딜-피롤릴 시스-트랜스 이소머라제 A
· 콜라겐 알파-1
· 레구마인
· 리소솜 보호 단백질
· 클루스테린
· 프로스타글란딘 리덕타제
2개의 프로테아제 (이탤릭체)가 검출되었다. 프로테아제는 재조합 조성물에서 클리핑을 유도하는 것으로 공지되어 있다.
불순물. 가장 우세한 HCP는 GRP78이다. GRP78을 표적화된 동위원소 희석 질량 분광분석법 방법 (IDMS) 방법에 의해 측정하였다. IDMS는 다양한 기지의 양의 안정적-동위원소 표지된 표준 펩티드를 시험 샘플에 첨가함으로써 작동한다. 내부 표준 (GRP78로부터의 3개의 펩티드)의 농도 대비 피크 면적 비율을 플로팅함으로써 표준 곡선을 구축하였다. 공지되지 않은 GRP78 농도는 분석물질의 상대적 신호 세기를 내부 표준과 비교함으로써 보간 방식으로 계산할 수 있다:
Figure pct00014
DS-Cav1 물질은 RSVPreF3과 비교하여 적어도 10배 더 높은 GRP78 함량을 갖는다 (하기 표 및 도 17b 참조).
Figure pct00015
글리코프로파일 및 무손상 분자량 (MW). 무손상 MW를 LC-MS 및 스펙트럼 데콘볼루션에 의해 결정하였으며, 이는 RSVPreF3이 61,226 Da의 무손상 MW를 갖고 (F임, F'가 아님), DS-Cav1이 59,461 Da의 무손상 MW를 갖음을 나타낸다. 탈-글리코실화 후, 분자 둘 다는 54,162.3 Da의 동일한 MW를 갖는다 (계산된 이론적 MW는 54,163 Da임). 이는 분자의 1차 서열 무결성 및 동일성에 대한 결론을 뒷받침한다. DS-Cav1 조성물에서 더 작은 MW는 RSVPreF3으로부터의 글리칸 차이로 인한 것으로 여겨진다.
Figure pct00016
면역학적 시험.
부위-특이적 항체 및 폴리클로날 혈청으로 구성된 검정을 사용하여 시험관내 상대적 효력 (IVRP)을 조사하였으며, 결과는 하기와 같다:
Figure pct00017
Fab 이동 (본원의 다른 곳에 기재된 검정)을 사용하여 부위 0 또는 부위 V 결합의 손실을 조사하였으며, 결과는 하기와 같다:
Figure pct00018
RSVPreF3 및 DS-Cav1의 분석적 비교가능성 연구의 요약
비교가능한 속성:
· 1차 서열 무결성 (무손상 및 펩티드 지도)
· 예상치 못한 번역후 변형의 부재
· DSF에 의해 측정된 바와 같은 고차 구조 (열안정성)
· 원자외선 CD에 의해 측정된 바와 같은 2차 구조
· N500에서 불완전한 글리칸 점유
· 비교가능한 결합 (Fab이동)
상이한 속성:
· DS-CAV1 물질은 더 낮은 전반적인 순도 수준 (응집, HCP) 및 더 높은 GRP78 함량을 갖는다
· DS-Cav1은 더 낮은 p27 함량을 갖는다
· DS-Cav1은 유의하게 더 낮은 p27 함량을 갖는다
· DS-CAV1 물질은 더 높은 응집 수준을 갖는다
· DS-CAV1은 매우 상이한 글리칸 프로파일, 주로 중성 및 더 작은 글리칸을 함유한다.
· 글리칸 프로파일의 차이 때문에, DS-CAV1 물질은 MW가 더 작고 pI에서 더 염기성이다.
· DS-CAV1 물질은 ~8의 pI를 갖지만, RSVPreF3 물질은 ~5-6의 pI를 갖는다.
전임상 소 연구
RSVPreF3 조성물 및 DS-Cav1 조성물의 면역원성을 하기 면역화 및 샘플 수집 스케쥴에 따라 RSV A NAb (도 20)의 면에서 비교하였다:
Figure pct00019
Al(OH)3 또는 아주반트-무함유로 제형화된 RSVPreF3 로트는 염수 그룹과 비교하여 더 높은 RSV A NAb 역가를 유도한다 (14dPI에서 p 값 <0.0001). 그러므로, 프라이밍된 소에서 RSVPreF3 로트의 면역원성이 입증되었다. RSVA Nab 역가를 기준으로 RSVPreF3-Al(OH)3 및 DS-Cav1-Al(OH)3 사이에 통계적 차이가 관찰되었으며 (GMR=2.7 ,95% CI: 1.24-5.82), RSVPreF3-Al(OH)3에 대해 관찰된 RSV A NAb 역가 (기하평균 비율 14PI/제-7일)의 더 높은 부스팅으로 이들의 각각의 배수 증가의 차이가 또한 관찰되었다 (2,7배 더 높음, 95% CI : 1.03-7.12).
미감염 CB6F1 마우스에서 p27 면역원성 영향
RSVPreF3-유도 RSV A 중화 항체 반응에 의해 FFF 삼량체와 FFF' 삼량체를 비교하였다. RSVA 중화 항체 반응 (14dpIII)에 대한 FFF 삼량체와 비교하여 FFF' 삼량체에 대해 비열등성이 입증되었다 (GMR = 0.80, 90%CI [0.48,1.32]).
Figure pct00020
Figure pct00021
SEQUENCE LISTING <110> GSK Biologicals SA <120> Antigen Purification Method <130> VU66634FF <150> 62712280 <151> 2018-07-31 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 544 <212> PRT <213> RSV <400> 1 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540 <210> 2 <211> 408 <212> PRT <213> RSV <400> 2 Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val 1 5 10 15 Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys 20 25 30 Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly 35 40 45 Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp 50 55 60 Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu 85 90 95 Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser 100 105 110 Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met 115 120 125 Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile 130 135 140 Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val 145 150 155 160 Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro 165 170 175 Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu 180 185 190 Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp 195 200 205 Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val 210 215 220 Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro 225 230 235 240 Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp 245 250 255 Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr 260 265 270 Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala 275 280 285 Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp 290 295 300 Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu 305 310 315 320 Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu 325 330 335 Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe 340 345 350 Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala 355 360 365 Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile 370 375 380 Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu 385 390 395 400 Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 405 <210> 3 <211> 84 <212> PRT <213> RSV <400> 3 Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser 1 5 10 15 Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile 20 25 30 Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp 35 40 45 Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala 50 55 60 Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn 65 70 75 80 Arg Ala Arg Arg <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> RSV <400> 4 Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> RSV <400> 5 Lys Ile Asp Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> RSV <400> 6 Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> RSV <400> 7 Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr 1 5 10 15 Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg 20 25 <210> 8 <211> 435 <212> PRT <213> RSV <400> 8 Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr 1 5 10 15 Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu 20 25 30 Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Cys Lys Val 35 40 45 Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser 50 55 60 Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro 85 90 95 Ile Leu Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile 100 105 110 Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe 115 120 125 Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr 130 135 140 Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp 145 150 155 160 Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser 165 170 175 Tyr Ser Ile Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val 180 185 190 Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His 195 200 205 Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys 210 215 220 Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val 225 230 235 240 Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val 245 250 255 Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu 260 265 270 Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr 275 280 285 Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile 290 295 300 Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg 305 310 315 320 Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys 325 330 335 Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys 340 345 350 Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe 355 360 365 Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser 370 375 380 Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser 385 390 395 400 Asp Glu Leu Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg 405 410 415 Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser 420 425 430 Thr Phe Leu 435 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> RSV <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 9 Arg Xaa Arg Arg Xaa 1 5

Claims (20)

  1. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 숙주-세포 단백질 대비 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 초과의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 w/w를 포함하는 것인 항원 조성물.
  2. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 응집된 삼량체 대비 75% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 또는 96% 초과의 비응집된 삼량체 w/w를 포함하는 것인 항원 조성물.
  3. S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 포함하는 항원 조성물로서, 여기서 상기 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 글리코실화된 가용성 F 단백질 폴리펩티드이고, 여기서 상기 글리코실화된 가용성 F 단백질 폴리펩티드는 글리코실화를 포함하여 59.5 kDa 초과, 예컨대 60.0 kDa 초과, 60.5 kDa 초과, 또는 61.0 kDa 초과의 분자 질량을 갖는 것인 항원 조성물.
  4. 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 삼량체의 집단을 포함하는 항원 조성물로서,
    여기서 상기 집단의 각 삼량체는
    (a) S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F 프로토머"); 및
    (b) p27 펩티드의 적어도 10개의 아미노산을 추가로 포함하는, S155C, S290C, S190F 및 V207L 치환을 갖는 F1 쇄를 포함하는 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드 ("F' 프로토머")
    로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 3개의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드로 구성되고;
    하기 화학식으로 기재되며;
    nF + (3-n)F' (화학식 I)
    여기서 n은 0-3의 정수이고, F는 F 프로토머이고, F'는 F' 프로토머임;
    여기서 삼량체의 집단 중 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%는 F' 프로토머인 항원 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, F' 프로토머를 포함하며, 여기서 F' 프로토머가 비절단된 푸린 절단 부위를 포함하는 F1 쇄를 포함하는 것인 항원 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) F' 프로토머가 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄 및 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 F2 쇄를 포함하고;
    (b) F 프로토머가 서열식별번호: 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F1 쇄 및 서열식별번호: 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 F2 쇄를 포함하는 것인
    항원 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 조성물이 동결건조된 것인 항원 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항원 조성물 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 면역원성 조성물이 RSV에 의한 감염을 감소시키거나 또는 예방하는 것인 면역원성 조성물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산.
  12. 제11항의 핵산을 포함하는 숙주-세포.
  13. RSV 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 용도.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RSV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 의학에서 사용하기 위한 조성물 또는 면역원성 조성물.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RSV-감염의 예방 또는 치료를 위한 조성물 또는 면역원성 조성물.
  18. 제12항의 숙주-세포를 배양하여 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 발현하고, 다중모드 음이온 교환 수지 및 코스모트로픽제 및 카오트로픽제를 포함하는 용리 버퍼를 사용하는 다중모드 액체 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는 정제 공정에 발현된 재조합 RSV 가용성 F 단백질 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항원 조성물의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 용리 버퍼가 하기를 포함하는 것인 방법:
    (a) 150 - 350 mM, 예컨대 200 - 300 mM, 225 - 275 mM, 230 - 270 mM, 235 -265 mM, 240 - 260 mM, 또는 245 - 255 mM 시트르산나트륨;
    (b) 200 - 400 mM, 예컨대 250 - 350 mM, 275 - 325 mM, 280 - 320 mM, 285 - 315 mM, 290 - 310 mM, 또는 295 - 305 mM 아르기닌.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 동결건조 단계를 추가로 포함하는 방법.
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