KR20010032984A - 미국산 인삼 분획물을 만드는 방법과 이를 함유하는생산물, 및 면역 조절제로서 미국산 인삼 분획물의 이용 - Google Patents

미국산 인삼 분획물을 만드는 방법과 이를 함유하는생산물, 및 면역 조절제로서 미국산 인삼 분획물의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 북미산 인삼(Panax quinquefolium)으로부터 분획물을 얻는 화학적 방법과 이 분획물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 생성물은 항체의 생성을 촉진하는 데에 사용되거나, 일반 감기, 독감, 만성 피로 증후군, AIDS, 암 등과 같은 면역성이 떨어지는 것을 특징으로 하는 건강 상태를 치료하기 위한 치료제로 사용될 수 있다.

Description

미국산 인삼 분획물을 만드는 방법과 이를 함유하는 생산물, 및 면역 조절제로서 미국산 인삼 분획물의 이용{Processes of Making North American Ginseng Fractions, Products Containing Them, and Use as Immunomodulators}
수백년 동안, 특히 동양에서는 여러 가지 생리적인 상태를 치유하는 데에 본초 화합물과 같이 독성이 없는 약제를 널리 사용해 왔다. 파낙스 진생 C.A. 메이어(Panax ginseng C.A. Meyer)는 그 중에서도 가장 많이 알려진 정통적인 한약제이다. 단독 또는 다른 약제와 함께 복합적으로 사용되는 인삼 추출물의 중요한 약리학적 활성은 신장 손상 완화, 발암 억제 및 스트레스 예방 등이다. 그 외에도, 개인의 면역학적 반응에 미치는 인삼의 영향에 대하여 수많은 논문이 발표되었다. 보고된 바 있는 어떤 면역 조절 특성은 세포 수준에서 일부 기초 면역 기능의 조절뿐만 아니라, 숙주의 감염 내성의 향상, 염증 억제 작용, 종양 성장의 억제를 포함한다. 미국산 인삼, Panax quinquefolium은 많은 건강 효과를 내는 건강 보충제로서 많이 애용되고 있는 인삼의 또 다른 종류이다. 일단의 과학자들은 인삼에 들어 있는 다당류를 분리하여 그 구조를 규명하고자 하였다. 어떤 다당류는 면역 체계의 조절에 작용하는 것으로 밝혀졌다.
일본의 쿄리추 약학 대학의 토모다 연구팀은 인삼 다당류의 분리, 성상 확인, 및 생물학적 평가에 관한 일련의 연구를 실시하였다. 그 중 한 연구에서, 토모다 연구팀은 인삼 다당류를 그 산성에 따라 분획하였다. 한국산 인삼(Panax ginseng)의 뿌리에서 면역학적 활성을 갖는 두 가지의 산성 다당류를 분리하였다[1,2]. 뜨거운 물에서 잘게 썰은 인삼 뿌리를 우려내었다. 이 추출물을 황산 나트륨의 존재하에 세틸트리메틸암모늄 브롬화물(CTAB)로 처리하였다. 이렇게 해서 얻은 침전물을 분리하여 투석시킨 다음, 세파덱스(Sephadex) G-25 칼럼, DEAE-세파셀(파마시아; Pharmacia 제공) 칼럼으로 정제하여 두 가지 순수한 다당류를 얻었다. 이들 다당류를 각각 진세난 PA(ginsenan PA)와 진세난 PB(ginsenan PB)로 명명하였다. 토요펄(Toyopearl) HW-55F 상의 겔 크로마토그래프로 분자량을 측정하였더니, 진세난 PA와 진세난 PB의 분자량은 각각 1.6 ×105와 5.5 ×104였다. 이들을 정량 분석하였더니, 진세난 PA는 아라비노오스 21.3%, 갈락토오스 53.4%, 람노오스 2.0%, 갈락투론산 16.0%, 및 글루쿠론산 2.7%를 함유하였다. 이들 당 성분들의 몰질량비는 11:22:1:6:1이었다. 그리고, 진세난 PB는 아라비노오스 11.0%, 갈락토오스 32.2%, 람노오스 8.1%, 갈락투론산 39.9%, 및 글루쿠론산 5.0%를 함유하였다. 이들 당 성분들의 몰질량비는 3:7:2:8:1이었다. 이 두 가지 다당류는 모두 용량에 의존적으로 탄소 청소율 시험에서 뛰어난 세망내피계 기능성 작용을 나타냈으며, 두드러진 항보체 작용 및 알카리성 탈인산가수분해효소 유도 활성을 나타냈다.
그 밖의 다른 연구(3)에서, CTAB로 처리한 상기 추출물의 상청액으로부터 즉, 상청액을 에탄올에 부어서 다른 두 가지 다당류를 분리하였다. 이렇게 해서 얻은 침전물을 분리하고 DEAE-세파덱스 A-25 칼럼과 세파덱스 G-25 칼럼에 가하여 다른 두 가지의 순수한 다당류를 얻을 수 있었다. 이 두 가지 다당류를 각각 S-ⅠA와 S-ⅡA로 명명하였다. 토요펄 HW-55F 상의 겔 크로마토그래프로 분자량을 측정하였더니, S-ⅠA와 S-ⅡA의 분자량은 각각 5.6 ×104와 1.0 ×105였다. 이들을 정량 분석하여 S-ⅠA는 아라비노오스 42.3%, 갈락토오스 50.8%, 및 갈락투론산 6.9%로 구성되고 이들 당 성분들의 몰질량비가 8:8:1인 것을 알아냈다. 그리고, S-ⅡA는 L-아라비노오스 42.0%, 갈락토오스 32.6%, 글루코오스 6.2%, 및 갈락투론산 19.2%로 이루어지는 것으로 밝혀졌다. 이들 당 성분들의 몰질량비는 15:10:2:5였다.
일본의 키타사토 연구소의 한의학 연구 센터의 야마다 연구팀은 한국산 인삼(Panax ginseng)의 잎과 뿌리에서 얻은 몇 가지 다당류 분획물을 분리하였다. 이 분획물의 화학적 성질과 생물학적 활성을 조사하고 비교하였다[4].
중국산 인삼의 뿌리와 잎을 에탄올로 처리하여 진세녹사이드를 제거한 후, 물로 추출하여 얻은 잔류물을 0.5M NaOH로 추출하여 물과 알카리에 가용인 다당류 분획물을 얻었다. 이 때, 물에 가용인 분획물을 GR-2와 GL-2로 명명하고, 알카리에 가용인 다당류를 GRA-2와 GLA-2로 명명하였다. 다당류 성분의 산성에 따라, 모든 분획물을 세틸트리메틸암모늄으로 처리함으로써 다시 분별 분리하여 강산성 다당류 분획물(GR-3, GL-3, GRA-3, 및 GLA-3으로 명명함)과, 약산성 다당류 분획물(GR-4, GL-4, GRA-4, GLA-4로 명명함)과 중성 다당류 분획물(GR-5, GL-5, GRA-5, 및 GLA-5로 명명함)을 얻었다. 뿌리는 잎사귀보다 더 많은 양의 다당류를 함유하였다. 뿌리에서 추출한 강산성 다당류 분획물은 50% 이상 더 많은 우론산을 함유하고 있었다. 모든 분획물에서 이와 유사한 당들이 검출되었다. 이들 당에는 람노오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 글루코오스, 갈락투론산, 및 글루쿠론산이 포함된다. 그 중에서도 갈락투론산이 주요한 우론산 성분이었다.
뛰어난 항보체 작용을 하는 분획물인 GL-3을 DEAE-세파덱스, 세파로오스 CL-6B, DEAE 토요펄, 및 에탄올 침전물의 칼럼으로 다시 분별 분리하여 새로운 분획물을 얻었다. 이들 분획물을 GL-PⅠ 내지 GL-PⅣ로 명명하였다[5]. 분획물들은 모두 우론산을 32-44% 함유하고 있었다. 분획물 PⅠ는 분자량이 50,000으로서 가장 컸다. PⅠ와 PⅡ는 주로 Rha, Gal, 및 GalA로 이루어지고 PⅢ은 그 외에 Fuc로 이루어진 반면에, PⅣ는 Gal, Glc 및 GalA로 이루어졌다. 그리고, 이들에 대한 상세한 구조를 결정하였다.
DEAE-세파로오스 CL-6B와 세파로오스 CL-6B 상의 크로마토그래프를 이용하여 약산성 다당류 분획물 GL-4로부터 궤양 억제성 펙틴 다당류(GL-BⅢ)를 분리하였다. 이 다당류는 주성분으로 Rha, Ara, Man, Gal, Glc, GalA 및 GlcA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 성분의 몰질량비는 3:4:2:10:1:7:4였다. 그리고, 그 자세한 구조 결정을 수행하였다[6].
DEAE-세파로오스 CL-6B 상의 음이온 교환 크로마토그래프를 이용하여 약산성 다당류 분획물 GL-4로부터 다른 마크로파지 Fc 수용체 발현 촉진 다당류(GL-4Ⅱb2)를 분리하였다. 이 다당류를 화학 분석하였더니 전체 탄수화물 65%와 우론산 33.7%를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 조성 분석과 구조 결정을 실시하였다[7].
같은 연구팀은 항보체 활성을 갖는 다른 한국산 인삼(Panax ginseng) 추출물인 G-115를 연구하였다[8]. G-115는 항보체 작용과 분열 촉진 작용을 하는 활성 성분을 성상 확인하기 위하여 분별 분리하여 얻었다. 가공하지 않은 다당류 분획물인 G-115G에서 항보체 활성이 가장 크게 나타난 반면, 물에 가용인 투석 가능한 분획물인 G-115E에서 분열 촉진 활성이 가장 크게 나타났다. 세틸트리메틸암모늄 브롬화물로 처리하는 침전법과 DEAE-세파로오스 상의 음이온 교환 크로마토그래프, 및 세파로오스 GL-4B 상의 겔 여과법을 실시하여 G-115G를 더 정제하여 항보체 활성이 매우 강력한 다당류인 G-115Ⅰ1-Ⅱa-2-3을 얻었다. 이 다당류는 균질하였다. 그리고 분자량은 3.68 ×105로 추정되었다. 소량의 갈락투론산, 글루쿠론산 및 람노오스를 포함하여 아라비노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 주성분으로 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다.
일본의 토호쿠 대학 약제 연구소의 히키노 연구팀은 한국산, 중국산 및 일본산 인삼으로부터 인삼 다당류를 분리하였다. 인삼 다당류의 저혈당 효과를 시험하였다. 그리고, 조성과 구조 특성을 규명하였다[9-14].
미국산 인삼으로부터 세 가지 다당류인 퀸큐폴란 A, B, C를 분리하였다. 세파크릴 S-500 상의 겔 크로마토그래프로 측정한 이들은 분자량은 2.0 ×106이상인 것으로 추정되었다. 중성 당 성분으로는 퀸큐폴란 A에서 마노오스와 글루코오스(몰질량비 1.0:2.3)가 포함되었고, 퀸큐폴란 B에서 마노오스와 글루코오스(몰질량비 1.0:5.5)가 포함되었고, 퀸큐폴란 C에서 크실로오스가 포함되었다. 퀸큐폴란 A, B, C에 함유된 산성 당 성분은 각각 10.8%, 11.7%, 7.1%인 것으로 확인되었다. 이들 글리칸에 함유된 펩티드 부분의 함량은 퀸큐폴란 A, B, C에서 각각 2.7%, 2.9%, 2.3%였다. 이들 다당류들은 모두 정상 상태의 마우스와 알록산-감소 혈당감소증에 걸린 마우스에서 저혈당 효과를 나타내었다.
한국 서울의 한국 암센터 병원의 면역학 연구실의 연구팀은 한국산 인삼(Panax ginseng)으로부터 분자량이 150,000인 "진산"이라고 명명한 산성 다당류를 분리하였다[15]. 이 다당류는 단백질 3.7%와 헥소오스(글루코오스와 갈락토오스) 47.1%, 및 우론산(갈락투론산) 43.1%로 구성되었다. 진산은 T 세포와 B 세포의 증식을 유도하였고 내생적으로 생성된 다수의 사이토킨을 통하여 중성 킬러 세포와 T 세포로부터 림포킨 활성화 킬러 세포를 발생하였다[16].
중국의 북동 보통 대학의 미아오 연구팀은 미국산 인삼으로부터 다당류를 분리하였다. 그리고, 이들의 정제와 구조 분석을 실시하였다[17].
메디칼 사이언스의 노만 베튠 대학의 연구팀은 미국산 인삼에서 추출한 다당류의 생물학적 활성을 연구하였다[18,19]. 이들은 미국산 인삼에서 추출한 다당류(PPQ)가 림프세포의 형질 변환을 촉진하는 것을 밝혀냈다. 쥐의 지라 림프세포의 생체외 사이토킨 생성에 미치는 파낙스 퀸큐폴리움(Panax quinquefolium)으로부터 추출한 다당류(PPQ-1)의 효과를 연구하였다. 연구 데이터로부터 PPQ-1은 면역 기능을 조절하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 북미산 인삼(Panax quinquefolium)으로부터 분획물을 얻는 화학적 방법과 이 분획물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 생성물은 항체의 생성을 촉진하는 데에 사용되거나, 일반 감기, 독감, 만성 피로 증후군, AIDS, 암 등과 같은 면역성이 떨어지는 것을 특징으로 하는 건강 상태를 치료하기 위한 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생성물은 면역 체계를 크게 억제하는 것으로 알려진 화학 치료나 방사선 치료를 받고 있는 암 환자들을 위한 보충제로도 사용될 수 있다.
도 1은 크로마토그래프 칼럼 상에 용리된 표준 덱스트란 시료의 분자량 로그값에 대한 용출 부피를 나타낸 그래프이다.
도 2는 인삼 분획물 CVT-E002의 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 인삼 분획물 PQ1의 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 인삼 분획물 PQ2의 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 인삼 분획물 PQ3의 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 인삼 분획물 PQ223의 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 마우스의 지라체 B 세포의 증식에 미치는 인삼 분획물 PQ223의 효과를 보여준다.
도 8은 마우스의 지라체 T 세포의 증식에 미치는 인삼 분획물 PQ223의 효과를 보여준다.
도 9는 마우스의 지라체 T 세포와 B 세포의 증식에 미치는 인삼 분획물 PQ223효과의 특이성을 보여준다.
도 10은 마우스의 지라에 의한 생체외 항체 생성에 미치는 인삼 분획물 PQ223의 효과를 보여준다.
도 11은 인삼 분획물 PQ223을 주입시킨 마우스에서 플라크 형성 세포(PFC)의 증가를 보여준다.
본 발명의 발명자는 일부 미국산 인삼의 추출물이 면역 조절 특성을 갖는 것을 확인하였다. CVT-E002와 이로부터 얻은 정제 분획물인 PQ2와 PQ223은 특히 쥐의 지라 세포를 자극하여 B 세포의 증식을 촉진하고 다량의 항체를 생성시켰다. 이들 분획물은 또한 혈청 면역글로블린(예: 전체 IgG) 농도를 증가시키고 마크로파지를 자극하여 IL-1, IL-6 및 TNF-α생성을 유도하였다. 이들 분획물은 일반적인 감염성 질병과 면역 결핍성 질병을 예방하거나 치료하는 데에 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 미국산 인삼의 시료로부터 인삼 분획물인 PQ2, PQ223, 및 CVT-E002를 추출하는 방법을 제공한다.
이를 구체적으로 설명하면, 인삼 분획물 PQ2를 추출하는 방법은:
(a) 미국산 인삼을 알코올로 이루어진 제 1 용매와 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 제 1 인삼 용액을 얻는 단계;
(b) 제 1 인삼 용액을 분리하여 알코올/인삼 용액과 제 1 인삼 잔류물을 얻는 단계;
(c) 제 1 인삼 잔류물을 물과 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 인삼 잔류액을 얻는 단계;
(d) 인삼 잔류액을 분리하여 제 2 인삼 잔류물과, 제 1 인삼 추출물을 함유하는 제 1 수용성 추출액을 얻는 단계;
(e) 제 1 인삼 추출물의 적어도 일부분을 포함하고 제 1 인삼 추출물과 물의 비율이 약 1:18 내지 1:22인 제 2 수용성 추출액을 얻는 단계;
(f) 제 2 수용성 추출액을 알코올로 이루어진 제 2 용매와 혼합하여 제 1 침전물과 제 1 상청액을 얻고, 상기 제 2 용매와 물의 비율이 약 1:1 내지 3:5인 단계;
(g) 단계 (f)에서 얻은 제 1 상청액을 알코올로 이루어진 제 3 용매와 혼합하여 제 2 침전물과 제 2 상청액을 얻고, 상기 제 3 용매와 제 1 상청액의 비율이 약 3:2 내지 3:1인 단계; 및
(h) 제 2 침전물을 분리하여 인산 분획물 PQ2를 얻는 단계를 포함한다.
또한, 인삼 분획물 PQ223을 제조하는 방법은:
(a) 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산되는 인삼 분획물 PQ2를 얻는 단계;
(b) 인삼 분획물 PQ2를 분별 분리하여 제 1 용출 분획물과 제 2 용출 분획물을 얻고, (1) 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000인 크로마토그래프 칼럼; 및 (2) pH 7.0에서 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하는 트리스-HCl의 용리 완충액을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 탄수화물 피크를 결정하였을 때, 제 1 용출 분획물이 35 내지 50 ㎖의 용출 부피에서 나타나는 탄수화물 피크에 해당하고, 제 2 용출 분획물이 50 내지 85 ㎖의 용출 부피에서 나타나는 탄수화물 피크에 해당하는 단계; 및
(c) 제 1 용출 분획물과 제 2 용출 분획물을 분리하고 혼합하여 인삼 분획물 PQ223을 얻는 단계를 포함한다.
또한, 인삼 분획물 CVT-E002를 제조하는 방법은:
(a) 미국산 인삼과 알코올로 이루어진 제 1 용매를 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 제 1 인삼 용액을 얻는 단계;
(b) 제 1 인삼 용액을 분리하여 알코올/인삼 용액과 제 1 인삼 잔류물을 얻는 단계;
(c) 제 1 인삼 잔류물과 물을 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 인삼 잔류액을 얻는 단계;
(d) 인삼 잔류액을 분리하여 제 2 인삼 잔류물과, 인삼 추출물을 함유하는 수용성 추출액을 얻는 단계; 및
(e) 수용성 추출액을 건조시키거나 농축시켜 인삼 분획 CVT-E002를 얻는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되는 인삼 분획물 PQ2, PQ223, 및 CVT-E002를 포함한다.
그리고, 본 발명은 특정한 탄수화물 함량을 갖는 인삼 분획물을 포함한다.
제 1 인삼 분획물은 람노오스 약 2 내지 6 몰%, 갈락투론산 약 41 내지 49 몰%, 글루코오스 약 12 내지 18 몰%, 갈락토오스 약 16 내지 22 몰% 및 아라비노오스 약 12 내지 19 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는다.
제 2 인삼 분획물은 람노오스 약 3 내지 8 몰%, 갈락투론산 약 36 내지 44 몰%, 글루코오스 약 2 내지 7 몰%, 갈락토오스 약 25 내지 33 몰% 및 아라비노오스 약 17 내지 25 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는다.
제 3 인삼 분획물은 람노오스 약 0.5 내지 5 몰%, 갈락투론산 약 11 내지 22 몰%, 글루코오스 약 40 내지 60 몰%, 갈락토오스 약 10 내지 19 몰% 및 아라비노오스 약 11 내지 19 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는다.
본 발명은 또한 제약학적으로 허용되는 담체와 복합적으로 본 발명에 따른 인삼 분획물 중에서 어느 한 가지를 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다.
그리고, 본 발명은 면역성의 저하를 특징으로 하는 상태를 치료하는 데에 적합한 제약학적 조성물의 제조에서 발명에 따른 인삼 분획물의 단독 또는 다른 약제와의 복합 이용을 포함한다.
또한, 본 발명은 세포에서 IL-1, IL-6 및/또는 TNF-α의 증식을 자극하기 위한 발명에 따른 인삼 분획물의 이용을 포함한다.
또한, 본 발명은 면역 글로블린의 생체외 또는 생체내 생성을 자극하기 위한 발명에 따른 인삼 분획물의 이용을 포함한다.
또한, 본 발명은 B-림프구의 증식을 활성화하여 이로 인한 항체 생성을 자극하기 위한 발명에 따른 인삼 분획물의 이용을 포함한다.
또한, 본 발명은 발명에 따른 인삼 분획물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 면역성 저하를 특징으로 하는 환자의 상태를 치료하는 방법을 포함한다.
인삼 분획물 PQ2를 제조하는 방법은:
(a) 미국산 인삼을 알코올로 이루어진 제 1 용매와 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 제 1 인삼 용액을 얻는 단계;
(b) 제 1 인삼 용액을 분리하여 알코올/인삼 용액과 제 1 인삼 잔류물을 얻는 단계;
(c) 제 1 인삼 잔류물을 물과 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 인삼 잔류액을 얻는 단계;
(d) 인삼 잔류액을 분리하여 제 2 인삼 잔류물과, 제 1 인삼 추출물을 함유하는 제 1 수용성 추출액을 얻는 단계;
(e) 제 1 인삼 추출물의 적어도 일부분을 포함하고 제 1 인삼 추출물과 물의 비율이 약 1:18 내지 1:22인 제 2 수용성 추출액을 얻는 단계;
(f) 제 2 수용성 추출액을 알코올로 이루어진 제 2 용매와 혼합하여 제 1 침전물과 제 1 상청액을 얻고, 상기 제 2 용매와 물의 비율이 약 1:1 내지 3:5인 단계;
(g) 단계 (f)에서 얻은 제 1 상청액을 알코올로 이루어진 제 3 용매와 혼합하여 제 2 침전물과 제 2 상청액을 얻고, 상기 제 3 용매와 제 1 상청액의 비율이 약 3:2 내지 3:1인 단계; 및
(h) 제 2 침전물을 분리하여 인산 분획물 PQ2를 얻는 단계를 포함한다.
여기서, 제 1 용매, 제 2 용매 및 제 3 용매에 각각 존재하는 알코올은 인삼에 대하여 불활성이고 원하는 생성물로부터 분리하기 쉬운 알코올을 포함한다. 당해 기술의 지식을 가진 사람이면 누구나 이와 같은 요건을 만족시키는 알코올을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 제 1 용매, 제 2 용매 및 제 3 용매에 각각 존재하는 알코올은 독립적으로 포화 또는 불포화 C1-C6알코올을 포함한다. 보다 바람직하게는, 각 경우의 알코올은 독립적으로 에탄올이나 메탄올을 포함한다.
단계 (a)와 단계 (c)의 각 단계에서 결과 용액은 약 3 시간 동안 가열하는 것이 바람직하다. 또한, 단계 (a)에서 제 1 용매와 인삼은 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합되는 것이 바람직하고, 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 것이 가장 바람직하다. 단계 (c)에서, 물과 제 1 인삼 잔류물은 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합되는 것이 바람직하고, 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 것이 가장 바람직하다.
상기 방법에서 단계 (d) 다음에는, 선택적으로 제 1 인삼 추출물을 농축시킨다. 이 과정은 당해 기술의 지식을 가진 사람이면 누구나 알 수 있는 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 제 1 인삼 추출물을 함유하는 제 1 수용액을 원심 분리시킨다(예: 약 5 내지 15 분 동안 2500 내지 10,000 rpm의 속도로). 또는, 제 1 수용액을 여과시킨다. 제 1 인삼 추출물을 농축시키는 것 이외에도, 제 1 인삼 추출물을 동결 건조시켜서 다음 사용을 위해 보관할 수 있다.
단계 (e)에서, 제 2 수용성 추출액은 제 1 인삼 추출물의 적어도 일부분을 포함한다. 제 2 수용성 추출액에서 제 1 인삼 추출물과 물의 비율은 약 1:18 내지 1:22인 것이 바람직하고, 약 1:20인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 비율은 수많은 방법을 통하여 조절할 수 있다. 단계 (d) 이후에 제 1 인삼 추출물을 농축시키고 그리고/또는 동결 건조시킨 경우에는, 상기와 같이 물을 제 1 인삼 추출물에 첨가하여 원하는 비율이 되도록 조절한다. 또는, 제 1 수용성 추출액의 일부나 제 1 수용성 추출액 전부를 제 2 수용성 추출액에 사용할 수도 있다. 필요하다면, 물을 더 첨가하여 소정의 비율로 조절할 수 있다. 소정량의 제 1 인삼 추출물을 함유하는 제 1 수용성 추출액의 적어도 일부분을 이용함으로써 단계 (d)와 단계 (e) 사이에 부가적인 농축 또는 동결 건조 단계를 생략할 수 있다.
단계 (f)에서, 제 2 용매와 물의 비율은 약 3:4인 것이 바람직하다.
단계 (g)에서, 제 3 용매와 제 1 상청액의 비율은 약 2:1인 것이 바람직하다.
인삼 분획물 PQ223을 제조하는 방법은:
(a) 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 인삼 분획물 PQ2를 얻는 단계;
(b) 인삼 분획물 PQ2를 분별 분리하여 제 1 용출 분획물과 제 2 용출 분획물을 얻고, (1) 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000인 크로마토그래프 칼럼; 및 (2) pH 7.0에서 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하는 트리스-HCl의 용리 완충액을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 탄수화물 피크를 결정하였을 때, 제 1 용출 분획물이 35 내지 50 ㎖의 용출 부피에서 나타나는 탄수화물 피크에 해당하고, 제 2 용출 분획물이 50 내지 85 ㎖의 용출 부피에서 나타나는 탄수화물 피크에 해당하는 단계; 및
(c) 제 1 용출 분획물과 제 2 용출 분획물을 분리하고 혼합하여 인삼 분획물 PQ223을 얻는 단계를 포함한다.
제 1 용출 분획물은 PQ2A로도 알려져 있으며 제 2 용출 분획물은 PQ2B로도 알려져 있다. 이들 용출 분획물들을 서로 별개로 분리할 수 있다. 또한, 상기와 같은 동일한 방법을 이용하여 다른 용출 분획물 PQ2C와 PQ2D를 얻을 수 있다. 이 때, PQ2C는 용출 부피 95 내지 110 ㎖에서 관찰되는 탄수화물 피크에 해당하는 용출 분획물이고, PQ2D는 용출 부피 120 내지 250 ㎖에서 관찰되는 탄수화물 피크에 해당하는 용출 분획물이다. 이들 분획물도 서로 별개로 분리할 수 있다. 또한, PQ2A 내지 PQ2D 중에서 두 개 이상의 분획물을 포함하는 PQ223이외의 다른 조성물도 만들 수 있다.
인삼 분획물 PQ2는 겔 여과 크로마토그래프를 이용하여 분별 분리하는 것이 바람직하다. 그러나, 당해 기술을 아는 사람들에게 알려져 있는 다른 종류의 적당한 분별 분리법을 사용할 수도 있다.
겔 여과 크로마토그래프법을 실행하는 방법은 당해 기술을 아는 사람들에게는 잘 알려져 있는 대로 수행하면 되고, 유속, 시료 부피 및 실행 온도 등은 제조자의 사용 설명서를 참조하면 될 것이다. 제조자의 설명서에 나와 있는 인자들을 변화시켜도 크로마토그래프의 결과에 크게 영향을 주지 않는 것이다.
탄수화물 함량은 공지된 방법에 따라 결정할 수 있다. 분획물의 탄수화물 함량을 결정하는 데에는 미소역가 플레이트 분석법을 수행하는 것이 바람직하다. 이 분석법은 당해 기술의 지식을 아는 사람들에게는 잘 알려져 있다. 본 발명에 인용 참조된 Dubois et al., Anal, Chem. 28:350-56 (1956)을 참조하도록 한다. 미소역가 플레이트 분석법에 따라 측정되는 시료의 흡광도는 492 ㎚에서 측정하는 것이 바람직하다.
인삼 분획물 CVT-E002를 제조하는 방법은:
(a) 미국산 인삼과 알코올로 이루어진 제 1 용매를 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 제 1 인삼 용액을 얻는 단계;
(b) 제 1 인삼 용액을 분리하여 알코올/인삼 용액과 제 1 인삼 잔류물을 얻는 단계;
(c) 제 1 인삼 잔류물과 물을 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 인삼 잔류액을 얻는 단계;
(d) 인삼 잔류액을 분리하여 제 2 인삼 잔류물과, 인삼 추출물을 함유하는 수용성 추출액을 얻는 단계; 및
(e) 수용성 추출액을 건조시키거나 농축시켜 인삼 분획 CVT-E002를 얻는 단계를 포함한다.
여기서, 제 1 용매에 존재하는 알코올은 인삼에 대하여 불활성이고 원하는 생성물로부터 분리하기 쉬운 알코올을 포함한다. 당해 기술의 지식을 가진 사람이면 누구나 이와 같은 요건을 만족시키는 알코올을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 제 1 용매에 존재하는 알코올은 포화 또는 불포화 C1-C6알코올을 포함한다. 보다 바람직하게는, 알코올은 에탄올이나 메탄올을 포함한다.
단계 (a)에서, 제 1 용매와 인삼은 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 것이 바람직하다. 단계 (c)에서, 물과 제 1 인삼 잔류물은 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 것이 바람직하다.
단계 (a)와 단계 (c)에서, 제 1 인삼 용액은 약 3 시간 동안 가열하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 몇 가지 인삼 분획물을 포함한다.
제 1 인삼 분획물은 람노오스 약 2 내지 6 몰%, 갈락투론산 약 41 내지 49 몰%, 글루코오스 약 12 내지 18 몰%, 갈락토오스 약 16 내지 22 몰% 및 아라비노오스 약 12 내지 19 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는다. 바람직하게는, 탄수화물 함량은 람노오스 약 3 내지 5 몰%, 갈락투론산 약 43 내지 47 몰%, 글루코오스 약 14 내지 16 몰%, 갈락토오스 약 18 내지 20 몰% 및 아라비노오스 약 14 내지 17 몰%로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 탄수화물 함량은 람노오스 약 4 몰%, 갈락투론산 약 45 몰%, 글루코오스 약 15 몰%, 갈락토오스 약 19 몰% 및 아라비노오스 약 15 몰%로 이루어진다.
제 2 인삼 분획물은 람노오스 약 3 내지 8 몰%, 갈락투론산 약 36 내지 44 몰%, 글루코오스 약 2 내지 7 몰%, 갈락토오스 약 25 내지 33 몰% 및 아라비노오스 약 17 내지 25 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는다. 바람직하게는, 탄수화물 함량은 람노오스 약 4 내지 7 몰%, 갈락투론산 약 37 내지 42 몰%, 글루코오스 약 3 내지 6 몰%, 갈락토오스 약 27 내지 32 몰% 및 아라비노오스 약 19 내지 24 몰%로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 탄수화물 함량은 람노오스 약 5 몰%, 갈락투론산 약 39 몰%, 글루코오스 약 4 몰%, 갈락토오스 약 29 몰% 및 아라비노오스 약 21 몰%로 이루어진다.
본 발명에 따른 제 3 인삼 분획물은 람노오스 약 0.5 내지 5 몰%, 갈락투론산 약 11 내지 22 몰%, 글루코오스 약 40 내지 60 몰%, 갈락토오스 약 10 내지 19 몰% 및 아라비노오스 약 11 내지 19 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는다. 바람직하게는, 탄수화물 함량은 람노오스 약 1 내지 3 몰%, 갈락투론산 약 13 내지 20 몰%, 글루코오스 약 42 내지 57 몰%, 갈락토오스 약 12 내지 17 몰% 및 아라비노오스 약 13 내지 17 몰%로 이루어진다.
또한, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 복합적으로 본 발명에 따른 인삼 분획물 중에서 어느 한 가지를 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다. 당해 기술의 지식을 가진 사람이라면 누구나 이와 관련하여 유용한 제약학적으로 허용되는 담체에 대하여 익히 알고 있을 것이므로, 본 발명에 따른 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 대해서는 상세한 설명을 생략하기로 한다. 바람직하게는, 제약학적 조성물은 정제, 캡슐, 액체, 구중정, 로션 또는 좌약의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 일반 감기, 독감, 만성 피로증, AIDS 및 암과 같이 면역성의 저하를 특징으로 하는 상태를 치료하는 데에 적합한 제약학적 조성물의 제조에서 발명에 따른 인삼 분획물의 이용을 포함한다. 인삼 분획물은 단독으로 사용하거나 다른 약제와의 복합 사용할 수도 있다. 암환자들은 면역 체계가 심각하게 떨어지므로 본 발명의 인삼 분획물은 화학치료 약물과 함께 사용하거나 방사선 치료의 보충제로서 사용하는 데에 특히 적합하다.
또한, 본 발명은 발명에 따른 인삼 분획물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 면역성 저하를 특징으로 하는 환자의 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 바람직하게, 환자의 상태는 일반 감기, 독감, 만성 피로증, AIDS 또는 암일 수 있다. 발명에 따른 인삼 분획물의 용량은 환자의 나이, 성별 및 일반적인 건강 상태 뿐만 아니라, 치료하고자 하는 특정한 용태에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 적당한 용량은 1 일 내지 10 일에 거쳐 매일 체중 ㎏ 당 1 내지 5000 ㎎인 것이 바람직하다. 인삼 분획물은 경구 복용하거나, 국부, 비강, 눈, 음부 또는 직장을 통하여 주사하거나 주입할 수 있다.
이제부터, 다음 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1: 분획물 CVT-E002를 제조하고 정제하는 제 1 방법.
미국산 인삼 뿌리를 화학적으로 추출하고 차례로 정제하여 인삼 분획물 CVT-E001과 CVT-E002를 얻었다. CVT-E002 분량을 더 정제하여 인삼 분획물 G1, G2및 G3을 얻었다. 이 방법을 자세히 설명하면 다음과 같다.
건조시킨 인삼 뿌리 500 그램을 80 내지 85 ℃에서 물중탕으로 85% 에탄올 4 리터나 90% 메탄올 3 리터로 3 시간 동안 교반시키면서 추출하고 여과하여 알코올 용액과 잔류물을 얻었다. 알코올 용액은 농축시키고 분무 건조시켜서 사포닌 생성물(CVT-E001)을 얻었다. 잔류물은 95 내지 100 ℃에서 물중탕으로 물 4 리터로 3 시간 동안 교반시키면서 추출하였다. 추출물을 모슬린 백을 통과시켜 여과한 후, 원심 분리시켜서 CVT-E002를 함유하는 수용액을 얻었다. 나머지 잔류물은 내다 버렸다.
수용액의 일부를 더 정제하였다. 같은 부피의 95% 에탄올을 수용액에 첨가하여 침전물을 얻었다. 침전물을 원심 분리하고 동결 건조시켜서 분획물 G1을 얻었다. 상청액을 증발시켜 부피를 줄였다. 같은 부피의 95% 에탄올을 첨가하여 다시 침전물 G2를 얻었다. 남은 상청액은 에탄올로 분리해 내고 동결 건조시켜 분말 상태의 분획물 G3을 얻었다.
G2는 다음과 같이 정제하였다. G22 그램을 80 ㎖의 물에 용해시키고 분자량이 1200인 분자를 분리하는 차단 장치를 갖는 시그마 D-7884 투석관에서 3 부피의 물로 투석시켰다. 투석은 4 ℃에서 72 시간 동안 수행하고 24 시간마다 투석물을 회수하였다. 이렇게 해서 얻은 투석물을 15 ㎖로 농축시킨 후, 같은 부피의 메탄올로 침전시켰다. 침전물을 물에 녹이고 동결 건조시켜 분말상의 G22를 얻었다.
그리고 G22를 다음과 같이 정제하였다. G221.5 그램을 60 ㎖의 물에 용해시키고 4 ℃에서 분자량이 1000인 분자를 분리하는 차단 장치를 갖는 피셔 스펙트랄/Por 분자 다공성 맴브레인관에서 600 ㎖의 물로 투석시켰다. 24 시간 후에 회수한 제 1 투석물을 증발기를 사용하여 15 ㎖로 농축시키고 동결 건조시켰다. 이렇게 동결 건조시킨 제 1 투석물을 G221로 명명하였다. 이와 같은 방법으로 제 2 투석물을 48 시간 후에 회수하여 얻은 분획을 G222로 명명하였다. 투석유물을 농축하고 동결 건조시켜 G223으로 명명한 분말을 얻었다.
실시예 2: 분획물 CVT-E002를 제조하고 정제하는 제 2 방법.
본 발명에 따른 인삼 분획물 CVT-E002를 제조하는 또 다른 방법은 다음과 같다.
건조시킨 미국산 인삼 뿌리 1000 그램을 95 내지 100 ℃에서 물중탕으로 85% 에탄올 8 리터로 3 시간 동안 교반시키면서 추출하고 여과하여 알코올 용액과 잔류물을 얻었다. 3 시간 동안 교반시키면서 잔류물을 뜨거운 물중탕에서 물과 1:8의 비율로 섞었다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 여과시켰다. 여과물을 5000 rpm으로 10 분 동안 원심 분리시켰다. 상청액을 농축시키고 동결 건조시켜 추출물 CVT-E002를 얻었다. 이 방법으로 얻은 CVT-E002의 양은 실시예 1에 따라 얻은 것과 거의 비슷하다. 즉, 원래 인삼 원료의 10 중량%에 해당한다.
CVT-E002의 일부를 다음과 같이 정제하였다. 95% 에탄올 1600 ㎖를 물 1200 ㎖에 CVT-E002 분말 100 그램을 녹인 용액에 첨가하였다. 이렇게 해서 얻은 침전물을 분리하여 PQ1로 명명하였다. 그리고 상청액을 500 ㎖로 농축시켰다. 이 농축액에 95% 에탄올 1000 ㎖를 다시 첨가하여 제 2 침전물을 얻었다. 침전물을 분리하고 동결 건조시켜 분획물 PQ2를 얻었다. 상청액은 농축시키고 동결 건조시켜 PQ3을 얻었다.
실시예 3: 분열 촉진 활성 시험
정제 농도를 달리한 미국산 인삼의 여러 분획물을 생체외 림프 세포의 분열 촉진 활성에 따른 스크리닝을 이용하여 선택하였다. 분열 촉진성은 생체내 면역 체계에서 발생하는 일반적인 사건에 비하여 보다 인위적인 것으로 생각되지만, 분열 촉진은 가능한 효과기의 작용을 표시하는 것이다.
분열 촉진 활성의 시험법은 다음과 같다: Balb/C 마우스나 C57B1/6J 마우스를 시험 대상으로 하였다. Balb/C 마우스는 건강 과학 실험 동물 서비스 기관(the Health Sciences Laboratory Animal Services facility; 캐나다, 에드몬톤시, 앨버타 대학)에서 구입하였다. C57B1/6J 마우스는 잭슨 연구소(the Jackson Laboratory; 미국, 매인주, 바 하버)에서 구입하였다. 생후 7주에서 10주 사이의 마우스를 각 실험에 나이와 성별을 맞추었다. 경부를 탈구시켜 마우스를 죽인다. 그리고, 무균 기술을 이용해서 지라를 꺼내어 말단을 갈은 두 개의 유리 슬라이드 사이에 집어넣었다. 세포를 항크스 균형 염류 용액(HBSS)에 넣고 원심 분리하여 세척한 후, 10% 소 태아 혈청(Flow Labs), 50 mM 메르캅토에탄올(뉴욕, 플레인뷰, ICN Pharmaceuticals) 및 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 pH 7.4의 RPMI 1640 배지에 부유시켰다. 최종 농도가 1.25 ×106개/㎖가 되도록 96웰 넓적바닥 림브로 플레이트에서 배양체를 세 벌로 마련하였다. 실험군에는 미리 필터 멸균시키고 HBSS에 용해시킨 시험용 분획을 공급하였다. 대조군은 유사분열물질을 주입하지 않은 군과 20 ㎍/㎖ 피토헤마글루틴(PHA) 또는 25 ㎍/㎖ 지질다당류(LPS)를 주입한 군으로 이루어졌다. PHA는 T형 지라 세포를 자극하고 LPS는 B형 지라 세포를 자극하는 것으로 알려져 있다. 배양체를 가습시킨 5% CO2분위기하에 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 72 시간의 배양이 종료되기 4 시간 전에, 1 μCi의 트리튬표지아데노신(매사추세츠, 보스톤, New England Nuclear)을 각 웰에 첨가하였다. 자동 시료 하베스터(버지니아, 스카트론)를 가지고 세포를 회수한 후, 신틸레이션 카운팅으로 방사선을 측정하였다. 그 결과를 대조군의 백분율(평균 ±표준 편차, 세 벌)로 환산하였다.
물에 대한 CVT-E002의 농도나 침전 반응에 사용되는 에탄올의 부피와 같이 실시예 1과 실시예 2에서 서로 다른 추출 조건은 CVT-E002의 분별 분리에 영향을 준다. 이들 두 가지 방법으로 얻은 생성물의 분열촉진 활성을 비교하였다. 그 결과는 다음 표에 나타내었다. 각 시험은 세 집단으로 나누어 실시하였다.
표 1. 실시예 1의 방법으로 얻은 G1, G2및 G3의 분열촉진 활성.
분획물 활성도 (% 대조군)
집단 1 집단 2 집단 3
G1 4090±1644 2845±1318 4446±977
G2 3015±1284 4101±1671 3146±318
G3 1791±573 1735±96 365±26
표 2. 실시예 2의 방법으로 얻은 PQ1, PQ2및 PQ3의 분열촉진 활성.
분획물 활성도 (% 대조군)
집단 1 집단 2 집단 3
PQ1 2448±454 3169±431 2492±138
PQ2 6427±1609 6467±1593 7034±1834
PQ3 1313±288 1522±342 1622±222
표 1과 표 2에서 나타낸 바와 같이, 실시예 1과 실시예 2에서 추출 방법의 변화가 생물 활성이 G1분획물에서 PQ2분획물로 전달된 것과 관련된다.
실시예 4: PQ2의 분별 분리와 분획물 PQ223의 제조 방법
실시예 2에 따른 CVT-E002, PQ1, PQ2및 PQ3을 HiPrep 16/60 세파크릴 S-200 고분해능 칼럼(Pharmacla Blotch, Cat. No. 17-1166-01) 상에서 겔 여과 크로마토그래프법을 이용하여 분자량 분포에 따라 분별 분리하였다. 이 때, 크로마토그래프 칼럼은 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000이다. 덱스트란 시료(MW = 71.4k, 37.5k, 19.5k, 9.5k)는 시그마에서 구입하였으며 표준 시료로 사용하였다. 시료 5 ㎎씩을 물 1 ㎖에 용해시키고 칼럼에 로딩한 후, 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하고 pH 7.0이고 유속이 0.3 ㎖/min이고 주위 온도가 4 ℃인 트리스-HCl 완충액으로 용리시켰다. 소정 부피의 용출액을 각 5 ㎖ 분으로 회수하였다.
전체 탄수화물 함량을 분석하기 위한 미소역가 플레이트 분석법에 따라 각 용출액의 전체 탄수화물 함량을 검사하였다. 이 방법은 Dubois et al., Anal, Chem. 28:350-56 (1956)에 나와 있는 방법을 응용한 것이다. 용출액에 포함된 전체 탄수화물을 소정의 흡수 스펙트럼에서 검출 가능한 형태로 유도체화하였다. D-글루코오스를 표준 시료로 사용하였고, 다른 물질로는 농축 황산(98%)과 5% 페놀을 사용하였다. 폴리스티렌 미소역가 플레이트를 SARSTDT(캐나다, 퀴벡)에서 구입하였다. 미소역가 플레이트의 각 웰에 D-글루코오스 1 내지 10 ㎍을 함유하는 표준 시료 용액을 가하고 5% 페놀 40 ㎕를 첨가하여 혼합하였다. 그런 다음, 200 ㎕의 농축 황산을 조심스럽게 첨가하였다. 시료와 각 용출액을 다중채널 피펫으로 섞은 후, 플레이트를 80 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 실온으로 냉각시킨 다음, 시료의 흡광도를 멀티스캔 미소역가 플레이트 판독기로 492 ㎚에서 측정하였다. 데이터를 저장하고, 마이크로소프트 엑셀 프로그램을 이용하여 겔 여과 크로마토그래프 결과를 그래프로 계산하였다.
동일한 칼럼에서 기지의 분자량을 갖는 일련의 표준 덱스트란(시그마)에 대하여 표준 곡선을 작성하였다(도 1). CVT-E002와 PQ1, PQ2및 PQ3의 로트(21)의 크로마토그램을 도 2 내지 도 5에 나타내었다. 각 도면에서, X축의 점은 실제 부피의 5분의 1로 나타낸 용출 부피이다. 그러므로, 실제 용출 부피값은 도면에 나와 있는 결과에 5를 곱하면 된다.
CVT-E002의 겔 여과 크로마토그램(도 2)에는 세 개의 피크가 보인다. 표준 곡선(도 1)에서 첫 번째 피크(용출 분획물 7-10)의 분자량은 70,000 이상으로 추정되고 세 번째 피크(용출 분획물 18-22)의 분자량은 약 1,000으로 추정되었다. 두 번째 작은 피크(용출 분획물 10-17)도 보인다. 피크의 비율은 57.2:8.5:34.4이다.
PQ1의 크로마토그램(도 3)에는 CVT-E002의 큰 분자량에 해당하는 한 개의 큰 피크(용출 분획물 7-10)와 작은 피크(용출 분획물 18-21)가 보인다. 이 두 개의 피크의 비율은 86.8:13.2이다.
PQ2의 크로마토그램(도 4)에는 세 개의 큰 피크가 보인다. A로 지정된 피크(용출 분획물 7-10)와 C로 지정된 피크(용출 분획물 19-22)가 CVT-E002의 두 개의 큰 피크에 해당한다. B로 지정된 다른 넓은 피크(용출 분획물 10-17)는 피크 A와 피크 C 사이에 나타난다. 이 피크의 분자량은 약 2,000 내지 60,000으로 추정되었다. 이 세 개의 피크 A-C의 비율은 34.1:45.7:20.3이었다. D로 지정된 작은 피크들(용출 분획물 24-50, 일부가 도 4에 나타나 있음)의 영역도 관찰되었다.
PQ3의 크로마토그램(도 5)에는 CVT-E002의 작은 분자량에 해당하는 오직 한 개의 큰 피크(용출 분획물 18-21)가 보인다.
PQ2의 분획물 A, B, C 및 D를 회수하여 동결 건조시켰다. 건조 분말을 각각 PQ2A, PQ2B, PQ2C 및 PQ2D로 다시 명명하였다. 또한, 분획물 A와 B를 합하여 얻은 새로운 분획물을 PQ223(크로마토그램이 도 6에 나와 있음)으로 정하였다. PQ2A, PQ2B, PQ2C 및 PQ2D의 분열촉진 활성을 검사하고 PQ223, PQ2및 CVT-E002의 분열촉진 활성과 비교하였다. 그 결과는 다음 표에 나타내었다.
표 3. 미국산 인삼 분획물의 분열촉진 활성(대조군의 %로3H-티미딘 결합)
시료 용량(㎍/㎖) 활성(대조군의 %)
대조군 n/a 100
PHA 20 1334.5 ± 158*
LPS 25 3227 ± 177**
PQ2A 100 3002 ± 147**
PQ2B 100 947 ± 42**
PQ2C 100 186.5 ± 10.5*
PQ2D 100 201 ± 5**
CVT-E002 100 1395.5 ± 159.5*
PQ2 100 2321.5 ± 8.5**
PQ223 100 3237 ± 13**
주)*와**는 각각 P 〈 0.05와 P 〈 0.01을 나타낸다. n = 3.
결과에서 알 수 있는 바와 같이, 활성 세기는 PQ223〉 PQ2〉 CVT-E002의 순서대로 강력하다.
실시예 5: CVT-E002, PQ1, PQ2, PQ3및 PQ223의 전체 탄수화물 함량 및 단백질 조성의 화학적 측정
각 분획물 CVT-E002, PQ1, PQ2, PQ3및 PQ223를 세 무리씩 제조하여 각 분획물의 전체 탄수화물 및 단백질 조성을 측정하였다. 전체 탄수화물 함량은 공지된 바와 같이 페놀-황산법을 이용하여 결정했다. 단백질 조성은 공지된 바와 같이 로우리법으로 분석하고, 소혈청 알부민을 표준으로 사용하였다. 그 결과는 다음 표에 나타내었다.
표 4. 분획물의 단백질 및 탄수화물 함량의 비교
시료 단백질 함량 (%) 전체 탄수화물 함량(%)
E002-1 9.32 66.4
E002-2 7.38 66.9
E002-5 8.31 60
PQ1-24 2.6 90.3
PQ1-25 2.6 93.6
PQ1-27 2.9 96.1
PQ2-24 5.6 52.6
PQ2-25 5.4 46.8
PQ2-27 5.3 43.6
PQ3-24 7.9 52.6
PQ3-25 8.5 64.2
PQ3-27 7.1 68.0
PQ223-7 5.8 78.0
PQ223-8 2.8 81.0
PQ223-9 2.9 85.2
실시예 6 CVT-E002, PQ1, PQ2및 PQ223의 단당류 조성의 화학적 측정
전체 탄수화물 함량이 주로 다당류와 올리고당의 함량을 나타냈으므로, 특정 분획물의 단당류의 몰질량비를 측정하였다.
분획물 CVT-E002, PQ1, PQ2및 PQ223의 로트를 산촉매 가수분해시켜서 구조 단위인 단당류를 유리시켰다. 유리된 단당류를 MPP(3-메틸-1-페닐-2-피라졸린-5-온)으로 유도체화시켜 HPLC를 이용하여 정성 및 정량 분석을 수행하였다.
이에 관한 자세한 방법은 다음과 같다: 2N HCl에 용해시킨 시료 용액을 95 내지 100 ℃에서 6 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 NaOH 용액으로 중화시키고 내부 표준 용액을 첨가하였다. MeOH와 수용성 NaOH 용액(0.3N)을 이 혼합물에 첨가시켰다. 그런 다음 50 내지 60 ℃에서 8 시간 동안(또는 실온에서 일주일 동안) 교반시켰다.
이 혼합물을 물로 희석(1:10)시키고 HPLC로 분석하였다. MPP-유도체화된 시료를, 0.1M 인산 완충 용액(pH 7)에 18% 아세토니트릴을 용해시킨 용출액을 사용하고 유속이 1 ㎖/min이고 245 ㎚의 UV 검출기를 장착한 C-18 칼럼으로 분석하였다. 다음 표는 CVT-E002, PQ1, PQ2및 PQ223의 단당류의 몰질량비를 나타낸다. 일부 CVT-E002, PQ1및 PQ2시료에서 미량의 글루쿠론산이 발견되었다.
다음 표에서 나타낸 바와 같이, 글루코오스 함량은 PQ1〉 CVT-E002 〉 PQ2〉 PQ3이다.
그리고, 갈락투론산의 함량은 PQ2〉 PQ223〉 CVT-E002 〉 PQ1이다.
표 5. CVT-E002, PQ1, PQ2및 PQ223의 단당류 조성(몰%)
시료 람노오스 갈락투론산 글루코오스 갈락토오스 아라비노오스
E002-1 2.8 17.9 53 13.3 13
E002-2 1 13.1 56.7 12.7 15.2
E002-3 2.9 20.4 42.1 16.5 16.3
PQ1-21 0.67 8.27 82.6 4.57 3.72
PQ1-22 0.48 6.38 85 4.56 3.55
PQ1-23 0.48 8.24 80.7 4.68 4.72
PQ2-22 3.6 45.1 15.4 19.8 16.2
PQ2-26 3.8 44.2 15.6 19 14.4
PQ2-27 3.8 44.2 15.6 19 14.4
PQ2-28 4 45.3 13.8 20.5 16.3
PQ223-7 5.5 40.8 4.1 28.2 20.3
PQ223-8 5.4 38.1 3.9 29.5 22.1
PQ223-9 5.4 36.7 5.4 28.8 22.7
실시예 7 인삼 분획물의 면역 조절
1. 마크로파지 활성
세포 중재성 반응을 우선적으로 개시하는 C57B1/6 마우스와 항체 중재성 반응을 우선적으로 개시하는 Balb/c 마우스로부터 얻은 복강 삼출 마크로파지를 이용하여 쥐의 마크로파지에 미치는 CVT-E002, PQ2, G2및 PQ223의 영향에 대한 생체내 연구를 수행하였다. 마크로파지를 100 ㎍/㎖의 시험 시료로 자극시킨 후, IL-1, IL-6 및 TNF-α생성을 측정하였다. 그 방법은 다음과 같다.
A. 복강 삼출물로부터 마크로파지와 세포 상청액의 제조.
1) 3% 티오글리콜레이트 1 ㎖를 쥐의 복강경에 주입하고 3 일 후에 복강경으로부터 복강 삼출 마크로파지를 회수하였다.
2) 세포 서스펜션을 항크스 완충 용액으로 두 번 세척하고 1100 rpm으로 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리하였다.
3) 마크로파지를 RPMI-10% FBS 배지에 부유시켰다.
4) 세포 수를 센 다음, RPMI-10% FBC 배지로 최종 농도 106개/㎖로 희석시켰다.
5) 37 ℃에서 마크로파지를 10 ×106/10㎖ RPMI-10% FBS에서 2 시간 동안 배양시켰다. 상청액을 버리고 침전된 마크로파지를 PBS 10 ㎖로 두 번 세척하였다.
6) 얻어진 마크로파지를 RPMI-10% FBS 배지에 재부유시킨다.
6) 마크로파지(5 ×105)를 LPS 10 ㎎/㎖나 시험 시료 100 ㎎/㎖로 24 시간이나 48 시간 동안 배양시켰다. 그런 다음, 상청액을 회수하고 (IL-1, IL-6 및 TNF-α의 생성을) 생분석하기 위하여 여과 멸균시켰다. 실험은 세 벌로 나누어 실시하였다.
B. 상청액의 IL-1 측정.
NOB1 세포계는 IL-1에 반응하여 CTLL 성장 자극 활성(IL-2)을 발생하는 EL4 세포계의 TK-변형체이다. NOB1 세포는3HTdR과 결합하지 않으므로, CTLL 라인에 의한 섭취량으로 IL-1의 반응을 측정할 수 있다. 이 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 96웰 넓적바닥 미소역가 플레이트의 각 웰에 담긴 IMDM의 5% FBS 200 ㎕에서 104개의 CTLL 세포를 4 ×104개의 NOB1 세포와 합하였다. 차례로 4배, 8배, 16배 또는 32배로 희석시킨 IL-1 시험 시료나 IL-1 표준물의 희석물들을 가하였다. 각 웰의 최종 부피는 200 ㎕였다. 각 시료를 세 벌로 마련하였다.
2) 플레이트를 24 시간 동안 37 ℃의 5% CO2가습 배양기에서 배양시켰다.
3)3H-티미딘을 배양 마지막 5 시간 동안에 가하였다.
4) 세포를 회수하고 액체 신틸레이션 카운팅으로3H-티미딘 결합을 측정하였다.
5) IL-1 농도를 계산하였다. 그 결과는 다음 표에 나타내었다.
표 6. 쥐의 마크로파지에 의한 IL-1 생성에 미치는 인삼 분획물의 효과
마크로파지(1)의 자극물 IL-1(2)의 생성량 (pg/㎖)
세포 단독 15.7±1.0
LPS 27.7±1.9**
CVT-E002 18.1±1.2*
PQ2 19.5±0.9**
G2 17.7±0.7*
PQ223 19.9±1.4*
주)
(1) 복강 삼출 마크로파지 5 ×106/㎖를 100 ㎍/㎖의 시료와 10 ㎍/㎖의 LPS로 48 시간 동안 배양시켜서 배양 상청액을 회수하였다.
(2) NOB1 세포계와 CTLL 세포계를 이용하여 IL-1을 분석하였다. 그 결과는 평균 ±표준 편차로 나타내었다.
*P 〈 0.05;**P 〈 0.01
상기 표에 나와 있는 결과로부터, CVT-E002, PQ1, G2및 PQ223이 C57B1/6 마우스에서 얻은 마크로파지를 크게 자극하여 IL-1을 생성시키는 것을 알 수 있다. 모든 시험 시료에서 IL-1 생성을 자극시키는 정도가 비슷하게 나타났다.
C. IL-6의 측정.
쥐의 B 세포 잡종 세포계 B9의 증식은 IL-6에 의존적이다. B9를 여러 농도의 시험 시료를 담고 있는 일련의 마이크로웰에서 배양시켰다. 이 방법을 설명하면 다음과 같다.
1) 보존 배양 플라스크로부터 얻은 분취량에 존재하는 B9 세포의 개수를 성장 대수기에 세었다.
2) 세포를 180 x g, 4 ℃에서 테이블탑 원심분리기에 넣고 5 분 동안 원심 분리시켜서 얻은 펠렛을 완전 RPMI-10 배지 10 ㎖에 부유시켰다. 이 과정을 두 번 반복하고 세포를 2 ×103개/㎖의 농도로 완전 RPMI-10 배지에 다시 부유시켰다.
3) 세척한 세포(2 ×103개/㎖) 100 ㎕를 96웰 미소역가 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
4) 시험 시료를 두 배씩 희석한 100 ㎕를 각 웰에 가하고, IL-6 표준액이 들어 있는 플레이트의 두세 줄은 그대로 남겨 두었다.
5) 플레이트는 가습된 37 ℃, 5%CO2의 배양기에서 72시간동안 배양시켰다.
6)3H-티미딘을 첨가하고 37 ℃의 배양기에서 4시간동안 배양시켰다.
7) 세포를 회수하고 액체 신틸레이션 카운터를 이용하여3H-티미딘 결합체를 측정하였다.
7) IL-6 농도를 계산하였다. 그 결과는 다음 표에 나타내었다.
표 7. 쥐의 마크로파지에 의한 IL-6 생성에 미치는 인삼 분획물의 효과
마크로파지(1)의 자극물 IL-6의 생성량(2)(pg/㎖)
C57B1/6 마우스 Balb/c 마우스
세포 단독 71.7±7 102±1.8
LPS 14312.5±269.4** 22496.8±2381.2**
CVT-E002 181.5±2.1** 185.5±10*
PQ2 219.3±30.3** 243.4±6.4**
PQ223 2058.3±137.9** 2387.2±301.6**
주)
(1) 복강 삼출 마크로파지 5 ×106/㎖를 100 ㎍/㎖의 시료와 10 ㎍/㎖의 LPS로 24 시간 동안 배양시켜서 배양 상청액을 회수하였다.
(2) B9 세포계를 이용하여 IL-6을 분석하였다. 그 결과는 평균 ±표준 편차로 나타내었다.
*P 〈 0.05;**P 〈 0.01
상기 표에 나와 있는 결과로부터, CVT-E002, PQ2및 PQ223이 C57B1/6 마우스에서 얻은 마크로파지의 상청액에서 IL-6의 생성을 증가시켰음을 알 수 있다. IL-6 생성을 자극시키는 정도는 PQ223〉 PQ2〉 CVT-E002로 나타났다.
D. TNF-α의 측정
세포 배지에서 얻은 상청액의 TNF 활성을 측정하기 위하여 TNF에 민감하고 엑티노마이신 D로 처리한 쥐 L929 섬유아세포를 이용하였다.
이 방법을 설명하면 다음과 같다.
1) IMDM-5% FSC 50 ㎕에 있는 4 ×104L929 세포를 각 웰에 가하였다.
2) 시험 시료 50 ㎕를 각 행(2 열)의 두 번째 웰에 가하였다. 웰 2의 내용물을 천천히 혼합하고 웰 2의 내용물 50 ㎕를 웰 3에 옮겨서 차례로 2 배씩 희석하였다. 웰 3의 내용물을 천천히 혼합하고, 웰 3의 내용물 50 ㎕를 웰 4에 옮겼다. 이 방법을 웰 12에까지 계속 수행하였다. 마지막으로, 12 열의 모든 웰에 담긴 내용물을 천천히 혼합하고 각 웰에서 50 ㎕를 버렸다. 이 때, 모든 웰은 50 ㎕를 담고 있었다.
3) 엑티노마이신 D 용액 50 ㎕를 각 웰(2 ㎕ ㎖)에 가하였다.
4) 플레이트를 공기중 5% CO2에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다.
5) 뉴트럴 레드 5 ㎕를 각 웰에 가하고 플레이트를 2.5 시간 동안 배양하였다.
6) 각 웰의 모든 상청액을 빨리 조심스럽게 부시고 PBS 200 ㎕로 두 번 세척하였다.
7) PBS를 흡입기로 빨아내고 0.05M NaH2PO4에 50% 에탄올을 용해시킨 용액 100 ㎕를 각 웰에 가하고 실온에서 5 분 동안 흔들었다.
8) 흡광도가 570 ㎚일 때, 미소역가 플레이트 판독기로 즉시 각 웰의 눈금을 읽었다.
9) TNF-α농도를 계산하였다. 그 결과는 다음 표에 나타내었다.
표 8. 쥐의 마크로파지에 의한 TNF-α생성에 미치는 인삼 분획물의 효과
마크로파지(1)의 자극물 TNF-α2의 생성량(pg/㎖)
C57B1/6 마우스 Balb/c 마우스
세포 단독 6.1±1.9 4.8±0.7
LPS 55.2±1.6** 71.4±15.5**
CVT-E002 19.7±2.5** 17.9±2.8**
PQ2 3.5±0.8 3.9±0.2
G2 6.1±1.2 7.2±0.1*
PQ223 16.9±2.5** 15.2±2.2**
주)
(1) 복강 삼출 마크로파지 5 ×106/㎖를 100 ㎍/㎖의 시료와 10 ㎍/㎖의 LPS로 48 시간 동안 배양시켜서 배양 상청액을 회수하였다.
(2) L929-8 세포계를 이용하여 TNF-α를 분석하였다. 그 결과는 평균 ±표준 편차로 나타내었다.
*P 〈 0.05;**P 〈 0.01
Balb/c 또는 C57B1/6 세포계에서 얻은 마크로파지의 상청액에 포함된 CVT-E002와 PQ223에 의해 TNF-α생성이 유도되었다. Balb/c 마우스에서 얻은 마크로파지의 상청액에 포함된 TNF-α는 G2에 의해 크게 자극받았다. PQ2는 마크로파지에 의한 TNF-α생성을 자극하지 않는 것 같았다.
2. 혈청 면역글로블린 생성
물만 섭취한 마우스와 비교할 때, 혈청 면역글로블린 생성량(전체 IgG)이 CVT-E002를 섭취한 마우스에서는 21% 증가하고, PQ2를 섭취한 마우스에서는 26% 증가하고, PQ223을 섭취한 마우스에서는 31% 증가하였다. 혈청 면역글로블린 생성은 PQ223〉 PQ2〉 CVT-E002의 순서대로 증가하였다. 결과는 표 9에 나타내었다.
표 9. 마우스에 의한 생체내 면역글로블린 생성 (n=15)
마우스 섭취물 IgG (㎍/㎖)±SD
물 275.16±32.34
CVT-E002 333.01±50.88**
PQ2 346.81±31.39**
PQ223 400.46±54.48**
3. PQ223의 분열촉진 활성의 특이성
PHA나 LPS와 같이 잘 알려진 분열촉진물질은 대상 세포의 종류에 대하여 특이성을 갖는다. 인삼 분획물이 어떤 종류의 지라 세포를 자극하는지를 알아내는 것이 중요하다. 그러므로, 친화성 크로마토그래프 칼럼을 이용하여 T 세포를 분리하고 T 세포를 결핍시켜서 B 세포를 농축시켰다.
A. T 세포 농축
지라 세포의 단일 세포 서스펜션을 림프구-M(Cedarlane Labs)에 붓고 적혈구 세포를 제거하였다. 그런 다음, 림프구를 마우스 면역글로블린으로 코팅한 비이드에 대한 결합 성질을 이용하여 B 세포를 제거하는 친화성 크로마토그래프 칼럼(앨버타, 에드먼턴, Biotex Co., Ltd.)을 통과시켰다. 용출액은 농축시킨 T 세포를 포함하였다. 항-티 1,2-모노클론 항체를 이용하는 생육성 시험에 따라 다른 종류의 세포에 대한 T 세포의 백분율을 측정하였다.
B. B 세포 농축
지라 세포군에서 적혈구 세포를 제거한 후, 림프구를 모노클론 항-티 1,2-항체로 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 그런 다음, 저독소 토끼 보체를 첨가하고 4 ℃에서 반 시간 동안 배양시켰다. 이와 같은 과정으로 T 세포의 세포 서스펜션을 결핍시켜 B 세포군이 농축되었다.
C. PQ223을 이용한 배양
PQ223의 용량을 달리하면서 B 세포나 T 세포를 배양시키고 반응을 트리튬표지아데노신의 결합으로 측정하였다. 도 7과 도 8은 각각 상대적으로 정제된 B 세포와 T 세포에 대한 PQ223의 증식 효과를 보여 준다. 대조군은 B 세포 특이적 분열촉진 물질인 LPS와 T 세포 특이적 분열촉진 물질인 PHA로 처리한 세포들을 포함한다. PQ223은 B 세포에 특이적인 것으로 나타났다(도 9 참조).
4. 생체외 항체 생성에 대한 PQ223의 효과
PQ223의 용량을 달리하면서 지라 세포를 72 시간 동안 배양시켰다. 대조 배양체는 25 ㎍의 LPS를 첨가한 군과 분열촉진 물질을 첨가하지 않은 군으로 이루어졌다. 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)을 이용하여 상청액에 가용 면역글로블린이 있는지를 시험하였다. 가용 면역글로블린을 함유하는 상청액을 0.1M 트리스 완충 용액(pH 9)에서 순차적으로 희석시켰다. 미소역가 플레이트를 이 상청액으로 코팅시키고 4 ℃에서 밤새도록 배양시켰다. 플레이트를 PBS Tween으로 세 번 세척한 후, 항체-효소 컨쥬게이트 염소 F(ab')2 항-마우스 Ig 서양고추냉이 과산화효소 100 ㎕를 1:1000 희석 비율로 첨가하였다. 이 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양시켰다. 그리고, 플레이트를 다시 PBS로 세척한 후, ABTS 과산화효소 기질(Kirkegaard and Perry Lab Inc.) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 한 시간 후, 플로우 멀티스캔 ELISA 판독기로 405 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 10은 50 ㎍/㎖의 PQ223이 25 ㎍의 LPS에 필적할 정도로 면역글로블린의 생성을 촉진하였음을 보여 주고 있다. PQ223을 더 높은 농도인 500 ㎍/㎖로 한 경우에도 항체 생성 효과는 더 증가되지 않았다. 이와 같은 용량 반응 곡선은 이성분 지라 세포군과 정제 B 세포의 증식 반응과도 일치한다. 이들 결과는 네 가지 실험에 근거한 것이다.
5. 세포내 항체 플라크 형성 세포
세 가지 농도의 PQ223을 각각 세 마리의 마우스로 이루어진 세 집단에 주입하였다. 대조군은 균형 염류 용액을 주입하였다. PQ223정맥 주사 처리 기간 7일의 마지막 날에, 마우스를 HBSSDP 10% SRBC를 넣은 서스펜션 0.2 ㎖로 접종시켰다. 접종 5 일 후에, 마우스를 죽이고 자라에서 단일 세포 서스펜션을 제조하여 세포가 4 ×106개/㎖가 되도록 조절하였다. 이 세포 서스펜션의 분취량 0.1 ㎖를 10% SRBC 용액 기니아피그 보체 0.3 ㎖ 및 RPMI 배지 0.5 ㎖와 섞었다. 이 혼합물 70 ㎕를 커닝햄 챔버로 옮겼다. 이 챔버를 파라플라스트 왁스로 밀봉하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시킨 후, 플라크 형성 세포의 개수를 세었다. 모든 PFC 농도를 지라 세포 개수의 백만분의 일에 대하여 나타내었다. 도 11은 세 가지 농도의 PQ223이 모두 마우스의 항체 생성을 향상시킨 것을 보여 준다.
요약하면, 본 연구의 결과는 발명에 따른 인삼 분획물이 마크로파지를 활성화시켜 IL-1, IL-6 및 TNF-α와 같은 사이토킨을 생성시킨다는 사실을 시사한다. 또한, 인산 분획물은 림프 세포, 특히 B 림프구 증식과 항체 생성을 활성화시킨다. 전반적인 호르몬 중재성 면역 체계가 자극되어 감염에 대한 예방 효과를 나타내었다. TNF-α생성 작용은 바이러스 억제 효과와 항암 효과를 포함한다. 또한, TNF-α는 각종 기생충 감염의 치료에도 효과적인 것으로 보고되었다.
본 발명의 배경 기술로 언급된 다음 문헌들은 발명에 인용 참조되었다.
1. Tomoda et al., Biol, Pharm. Bull., 16, 22-5 (1993).
2. Tomoda et al., Biol, Pharm. Bull., 17, 1287-91 (1994).
3. Tomoda et al., Biol, Pharm. Bull., 16, 1087-90 (1993).
4. Gao et al., Planta Medica, 55, 9-12 (1989).
5. Gao et al., Carbohydr. Res., 181, 175-87 (1988).
6. Kiyohara et al., Carbohydr. Res., 263, 89-101 (1994).
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6. Kiyohara et al., Carbohydr. Res., 263, 89-101 (1994).
7. Shin et al., Carbohydr. Res., 300, 239-49 (1997).
8. Yamada et al., Phytotherapy Res., 9, 264-9 (1995).
9. Konno et al., Planta Medica, 50, 434-6 (1984).
10. Hikino et al., 비공개.
11. Oshima et al., J. Ethnopharmacology, 14, 255-9 (1985).
12. Konno et al., Int. J. Crude Drug Res., 25, 53-6 (1987).
13. Konno et al., J. Ethonopharmacology, 14, 69-74 (1985).
14. Oshima., J. Natural Products, 50, 188-90 (1987).
15. Lee et al., Anticancer Res., 17, 323-32 (1997).
16. Kim et al., Planta Medica, 64, 110-5 (1998).
17. Miao et al., Shengwu Huaxue ZaZhi, 9, 610-4 (1993).
18. Ma et al., Baiquiuen Yike Daxue Xuebao, 23, 236-8 (1997).
19. Zhu et al., Zhongguo Yaolixue Tongbao, 13, 76-8 (1997).

Claims (50)

  1. (a) 미국산 인삼을 알코올로 이루어진 제 1 용매와 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 제 1 인삼 용액을 얻는 단계;
    (b) 제 1 인삼 용액을 분리하여 알코올/인삼 용액과 제 1 인삼 잔류물을 얻는 단계;
    (c) 제 1 인삼 잔류물을 물과 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 인삼 잔류액을 얻는 단계;
    (d) 인삼 잔류액을 분리하여 제 2 인삼 잔류물과, 제 1 인삼 추출물을 함유하는 제 1 수용성 추출액을 얻는 단계;
    (e) 제 1 인삼 추출물의 적어도 일부분을 포함하고 제 1 인삼 추출물과 물의 비율이 약 1:18 내지 1:22인 제 2 수용성 추출액을 얻는 단계;
    (f) 제 2 수용성 추출액을 알코올로 이루어진 제 2 용매와 혼합하여 제 1 침전물과 제 1 상청액을 얻고, 상기 제 2 용매와 물의 비율이 약 1:1 내지 3:5인 단계;
    (g) 단계 (f)에서 얻은 제 1 상청액을 알코올로 이루어진 제 3 용매와 혼합하여 제 2 침전물과 제 2 상청액을 얻고, 상기 제 3 용매와 제 1 상청액의 비율이 약 3:2 내지 3:1인 단계; 및
    (h) 제 2 침전물을 분리하여 인산 분획물 PQ2를 얻는 단계를 포함하는 인삼 분획물 PQ2를 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 용매, 제 2 용매 및 제 3 용매에 각각 존재하는 알코올이 독립적으로 포화 또는 불포화 C1-C6알코올을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 제 1 용매, 제 2 용매 및 제 3 용매에 각각 존재하는 알코올이 독립적으로 에탄올이나 메탄올을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 단계 (e)에서 제 2 수용성 추출액이 제 1 수용성 추출액의 적어도 일부분을 포함하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)에서 결과 용액이 약 3 시간 동안 가열되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 단계 (c)에서 결과 용액이 약 3 시간 동안 가열되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 단계 (e)에서 제 1 인삼 추출물과 물의 비율이 약 1:20인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 단계 (f)에서 제 2 용매와 물의 비율이 약 3:4인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 단계 (g)에서 제 3 용매와 제 1 상청액의 비율이 약 2:1인 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)에서 제 1 용매와 인삼이 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합되는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)에서 제 1 용매와 인삼이 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 단계 (c)에서 물과 제 1 인삼 잔류물이 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합되는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 단계 (c)에서 물과 제 1 인삼 잔류물이 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성되는 인삼 분획물 PQ2.
  15. (a) 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산되는 인삼 분획물 PQ2를 얻는 단계;
    (b) 인삼 분획물 PQ2를 분별 분리하여 제 1 용출 분획물과 제 2 용출 분획물을 얻고, (1) 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000인 크로마토그래프 칼럼; 및 (2) pH 7.0에서 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하는 트리스-HCl의 용리 완충액을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 탄수화물 피크를 결정하였을 때, 제 1 용출 분획물이 35 내지 50 ㎖의 용출 부피에서 나타나는 탄수화물 피크에 해당하고, 제 2 용출 분획물이 50 내지 85 ㎖의 용출 부피에서 나타나는 탄수화물 피크에 해당하는 단계; 및
    (c) 제 1 용출 분획물과 제 2 용출 분획물을 분리하고 혼합하여 인삼 분획물 PQ223을 얻는 단계를 포함하는 인삼 분획물 PQ223을 제조하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 인삼 분획물 PQ2를 겔 여과 크로마토그래프를 이용하여 분별 분리하는 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 따른 방법에 의하여 생성되는 인삼 분획물 PQ223.
  18. (a) 미국산 인삼과 알코올로 이루어진 제 1 용매를 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 제 1 인삼 용액을 얻는 단계;
    (b) 제 1 인삼 용액을 분리하여 알코올/인삼 용액과 제 1 인삼 잔류물을 얻는 단계;
    (c) 제 1 인삼 잔류물과 물을 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 7 내지 9 ㎖인 비율로 혼합하여 얻은 용액을 약 80 내지 100 ℃의 온도에서 약 2 내지 4 시간 동안 가열하여 인삼 잔류액을 얻는 단계;
    (d) 인삼 잔류액을 분리하여 제 2 인삼 잔류물과, 인삼 추출물을 함유하는 수용성 추출액을 얻는 단계; 및
    (e) 수용성 추출액을 건조시키거나 농축시켜 인삼 분획 CVT-E002를 얻는 단계를 포함하는 인삼 분획물 CVT-E002를 제조하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 단계 (a)에서 제 1 용매와 인삼이 인삼의 단위 그램 당 제 1 용매가 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 단계 (c)에서 물과 제 1 인삼 잔류물이 인삼 잔류물의 단위 그램 당 물이 약 8 ㎖인 비율로 혼합되는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 단계 (a)에서 제 1 인삼 용액이 약 3 시간 동안 가열되는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 단계 (c)에서 인삼 잔류액이 약 3 시간 동안 가열되는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 제 1 용매에 존재하는 알코올이 포화 또는 불포화 C1-C6알코올을 포함하는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 제 1 용매에 존재하는 알코올이 에탄올이나 메탄올을 포함하는 방법.
  25. 제 18 항 내지 제 24 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성되는 인삼 분획물 CVT-E002.
  26. 람노오스 약 2 내지 6 몰%, 갈락투론산 약 41 내지 49 몰%, 글루코오스 약 12 내지 18 몰%, 갈락토오스 약 16 내지 22 몰% 및 아라비노오스 약 12 내지 19 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는 인삼 분획물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 탄수화물 함량이 람노오스 약 3 내지 5 몰%, 갈락투론산 약 43 내지 47 몰%, 글루코오스 약 14 내지 16 몰%, 갈락토오스 약 18 내지 20 몰% 및 아라비노오스 약 14 내지 17 몰%로 이루어지는 인삼 분획물.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 탄수화물 함량이 람노오스 약 4 몰%, 갈락투론산 약 45 몰%, 글루코오스 약 15 몰%, 갈락토오스 약 19 몰% 및 아라비노오스 약 15 몰%로 이루어지는 인삼 분획물.
  29. 람노오스 약 3 내지 8 몰%, 갈락투론산 약 36 내지 44 몰%, 글루코오스 약 2 내지 7 몰%, 갈락토오스 약 25 내지 33 몰% 및 아라비노오스 약 17 내지 25 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는 인삼 분획물.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 탄수화물 함량이 람노오스 약 4 내지 7 몰%, 갈락투론산 약 37 내지 42 몰%, 글루코오스 약 3 내지 6 몰%, 갈락토오스 약 27 내지 32 몰% 및 아라비노오스 약 19 내지 24 몰%로 이루어지는 인삼 분획물.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 탄수화물 함량이 람노오스 약 5 몰%, 갈락투론산 약 39 몰%, 글루코오스 약 4 몰%, 갈락토오스 약 29 몰% 및 아라비노오스 약 21 몰%로 이루어지는 인삼 분획물.
  32. 람노오스 약 0.5 내지 5 몰%, 갈락투론산 약 11 내지 22 몰%, 글루코오스 약 40 내지 60 몰%, 갈락토오스 약 10 내지 19 몰% 및 아라비노오스 약 11 내지 19 몰%로 이루어진 탄수화물 함량을 갖는 인삼 분획물.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 탄수화물 함량이 람노오스 약 1 내지 3 몰%, 갈락투론산 약 13 내지 20 몰%, 글루코오스 약 42 내지 57 몰%, 갈락토오스 약 12 내지 17 몰% 및 아라비노오스 약 13 내지 17 몰%로 이루어지는 인삼 분획물.
  34. 제약학적으로 허용되는 담체와 복합적으로 제 14 항, 제 17 항 및 제 25 항 내지 제 33 항 중에서 어느 한 항에 따른 인삼 분획물을 포함하는 제약학적 조성물.
  35. 면역성의 저하를 특징으로 하는 상태를 치료하는 데에 적합한 제약학적 조성물의 제조에서 제 14 항, 제 17 항 및 제 25 항 내지 제 33 항 중에서 어느 한 항에 따른 인삼 분획물의 단독 또는 다른 약제와의 복합 이용.
  36. 일반 감기, 독감, 만성 피로증, AIDS 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 상태를 치료하기 위한 제 35 항에 따른 이용.
  37. 세포에서 IL-1, IL-6 및/또는 TNF-α의 증식을 자극하기 위한 제 14 항, 제 17 항 및 제 25 항 내지 제 33 항 중에서 어느 한 항에 따른 인삼 분획물의 이용.
  38. 면역 글로블린의 생체외 또는 생체내 생성을 자극하기 위한 제 14 항, 제 17 항 및 제 25 항 내지 제 33 항 중에서 어느 한 항에 따른 인삼 분획물의 이용.
  39. B-림프구의 증식을 활성화하여 이로 인한 항체 생성을 자극하기 위한 제 14 항, 제 17 항 및 제 25 항 내지 제 33 항 중에서 어느 한 항에 따른 인삼 분획물의 이용.
  40. 제 14 항, 제 17 항 및 제 25 항 내지 제 33 항 중에서 어느 한 항에 따른 인삼 분획물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 면역성 저하를 특징으로 하는 환자의 상태를 치료하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 상태가 일반 감기, 독감, 만성 피로증, AIDS 및 암을 포함하는 군에서 선택되는 방법.
  42. (a) 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산되는 인삼 분획물 PQ2를 얻는 단계;
    (b) 인삼 분획물 PQ2를 분별 분리하여 용출 분획물을 얻고, (1) 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000인 크로마토그래프 칼럼; 및 (2) pH 7.0에서 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하는 트리스-HCl의 용리 완충액을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 탄수화물 피크를 결정하였을 때, 상기 용출 분획물이 35 내지 50 ㎖의 용출 부피에서 탄수화물 피크를 나타내는 단계; 및
    (c) 용출 분획물을 분리하여 인삼 분획물 PQ2A를 얻는 단계를 포함하는 인삼 분획물 PQ2A를 제조하는 방법.
  43. 제 42 항의 방법에 따라 생성되는 인삼 분획물 PQ2A.
  44. (a) 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산되는 인삼 분획물 PQ2를 얻는 단계;
    (b) 인삼 분획물 PQ2를 분별 분리하여 용출 분획물을 얻고, (1) 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000인 크로마토그래프 칼럼; 및 (2) pH 7.0에서 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하는 트리스-HCl의 용리 완충액을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 탄수화물 피크를 결정하였을 때, 상기 용출 분획물이 50 내지 85 ㎖의 용출 부피에서 탄수화물 피크를 나타내는 단계; 및
    (c) 용출 분획물을 분리하여 인삼 분획물 PQ2B를 얻는 단계를 포함하는 인삼 분획물 PQ2B를 제조하는 방법.
  45. 제 44 항의 방법에 따라 생성되는 인삼 분획물 PQ2B.
  46. (a) 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산되는 인삼 분획물 PQ2를 얻는 단계;
    (b) 인삼 분획물 PQ2를 분별 분리하여 용출 분획물을 얻고, (1) 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000인 크로마토그래프 칼럼; 및 (2) pH 7.0에서 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하는 트리스-HCl의 용리 완충액을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 탄수화물 피크를 결정하였을 때, 상기 용출 분획물이 95 내지 110 ㎖의 용출 부피에서 탄수화물 피크를 나타내는 단계; 및
    (c) 용출 분획물을 분리하여 인삼 분획물 PQ2C를 얻는 단계를 포함하는 인삼 분획물 PQ2C를 제조하는 방법.
  47. 제 46 항의 방법에 따라 생성되는 인삼 분획물 PQ2C.
  48. (a) 제 1 항 내지 제 13 항 중에서 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산되는 인삼 분획물 PQ2를 얻는 단계;
    (b) 인삼 분획물 PQ2를 분별 분리하여 용출 분획물을 얻고, (1) 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 구형 가교 중합체의 기질을 담고 있고, 층체적이 16 ×600 ㎜이고 층부피가 120 ㎖이고 분획 범위(MW)가 구상 단백질이 5000 내지 250,000이고 덱스트란이 1000 내지 80,000인 크로마토그래프 칼럼; 및 (2) pH 7.0에서 0.1N HCl과 0.3M NaCl을 함유하는 트리스-HCl의 용리 완충액을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 탄수화물 피크를 결정하였을 때, 상기 용출 분획물이 120 내지 250 ㎖의 용출 부피에서 탄수화물 피크를 나타내는 단계; 및
    (c) 용출 분획물을 분리하여 인삼 분획물 PQ2D를 얻는 단계를 포함하는 인삼 분획물 PQ2D를 제조하는 방법.
  49. 제 48 항의 방법에 따라 생성되는 인삼 분획물 PQ2D.
  50. (a) 제 43 항에 따른 인삼 분획물 PQ2A;
    (b) 제 45 항에 따른 인삼 분획물 PQ2B;
    (c) 제 47 항에 따른 인삼 분획물 PQ2C; 및
    (d) 제 49 항에 따른 인삼 분획물 PQ2D 중에서 적어도 두 가지 인삼 분획물을 포함하는 조성물.
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