BRPI0721682A2 - uso de fraÇÕes de ginseng norte-americano para o tratamento de leucemia - Google Patents

Abstract

USO DE FRAÇÕES DE GINSENG NORTE- AMERICANO PARA O TRATAMENTO DE LEUCEMIA. Esta invenção é direcionada a um método de tratamento de doenças malignas hematológicas mediante a administração ao indivíduo de frações de ginseng do ginseng Norte-Americano (Panax quinquefotius). A presente invenção pode ser usada para ativar a proliferação de células hematopoiéticas em um paciente com necessidade de tratamento, ou como um alvo terapêutico em condições caracterizadas por malignidades hematológi- cas, tais como uma proliferação anormal de células sanguíneas, linfócitos, múltiplos mielomas, etc. A invenção também inclui um método de tratamento da leucemia mediante a ativação da proliferação de células exterminadoras naturais (NK) e monócitos na medula óssea e no baço do paciente através da administração de pelo menos uma fração de ginseng selecionada do gru- po consistindo de CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT- E002, PQ2 e PQ223. A presente invenção pode ser usada para tratar a malig- nidade hematológica ou como um suplemento para os pacientes submetidos à quimioterapia ou radioterapia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE FRAÇÕES DE GINSENG NORTE-AMERICANO PARA O TRATAMENTO DE LEUCEMIA".

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a um método de tratamento de uma do-

ença maligna hematológica em um paciente através da administração ao paciente de quantidades eficazes de frações produzidas a partir do ginseng Norte-americano (Panax quinquefolius). A presente invenção pode ser usada para ativar a proliferação de células hematopoiéticas em um paciente com necessidade de tratamento, ou como um alvo terapêutico em condições ca- racterizadas por malignidades hematológicas, tais como uma proliferação anormal de células sangüíneas, linfócitos, múltiplos mielomas, etc. A presen- te invenção pode ser usada para tratar a malignidade hematológica ou como

um suplemento para os pacientes submetidos à quimioterapia ou radiotera- pia.

Antecedentes da Invenção

Durante centenas de anos, a utilização de certos agentes não- tóxicos tais como compostos de ervas tem sido amplamente aceita para uma variedade de condições fisiológicas, especialmente no Oriente. Panax gin- seng C. A. Meyer é o mais conhecido da medicina tradicional Chinesa. As importantes atividades farmacológicas de extratos de ginseng, isoladamente ou em combinação com outros medicamentos, incluem alívio de insuficiência renal, prevenção do estresse, modulação da resposta imunológica e inibição da carcinogênese. American ginseng, Panax quinquefolius, é outra espécie !5 de ginseng que ganhou popularidade como um suplemento de saúde tendo muitos efeitos benéficos para a saúde. Vários grupos de cientistas têm ten- tado isolar e elucidar a estrutura dos vários componentes presentes no gin- seng para testar a eficácia destes compostos no tratamento de malignidades hematológicas. Estas investigações, infelizmente, têm sido limitadas a estu- 0 dos in vitro, ao contrário dos estudos in vivo, em que os compostos deriva- dos de ginseng foram testados com relação à sua capacidade de diminuir o crescimento das linhagens celulares leucêmicas do tecido. Fujimoto et al. in Chem Pharm Bull (Tokyo), 39(2):521-3 (1991), isolaram três poliacetilenos citotóxicos, PQ-1 (1), PQ-2 (2) e PQ-3 (3), a par- tir da Panax quinquefolius. As estruturas destes acetilenos foram determina- das por análises de seus espectros 1H-1H e 1H-13C COSY. De acordo com Fujimoto et al., estes compostos apresentaram fortes atividades citotóxicas contra as células de leucemia (L 1210) em cultura de tecidos.

Yi et al. in Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 13(12):722-4, 708 (1993), demonstraram que os ginsenosídeos extraídos do caule e folha de Panax ginseng (GSL) tiveram um efeito indutor de diferenciação em todos os tipos de células de leucemia não linfocíticas agudas em cultura primária. O efeito sobre o M5, M4 foi mais potente, seguido pelo M1, M2 e o menos, sobre M3. Estes investigadores concluíram que o efeito indutivo de diferen- ciação dos ginsenosídeos pode ser devido ao efeito completo de aumentar o AMPc intracelular e induzir o interferon.

Hasegawa et al., in Planta Med., 61(5):409-13 (1995), analisa- ram os efeitos de alguns triterpenoides de Panax (AraIiaceae) e Glycyrrhiza (Leguminosae) spp. sobre a sensibilidade à daunomicina (DAU) e vimblasti- na (VBL) das células de leucemia P388 resistentes à adriamicina (ADM) (P388/ADM), que eram resistentes a múltiplos medicamentos anticânceres. Quasipanaxatriol, 20(S)-protopanaxatriol, ginsenosídeo Rh2 e composto K grandemente intensificaram a citotoxicidade dos medicamentos anticânceres nas células P388/ADM. O aumento máximo na citotoxicidade foi observado com 50 μΜ de quasipanaxatriol; os índices de resistência definidos de serem as relações dos valores de IC50 para células parentais P388/ADM e P388 diminuíram significativamente tanto para DAU quanto para VBL. Hasegawa et al. admitiram a hipótese de que a reversão da resistência de DAU em P388/ADM por quasipanaxatriol foi devida ao acúmulo eficaz dos medica- mentos mediado pelo bloqueio de efluxo de DAU.

Gao et al. in Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 19(1):17-9 (1999), investigaram os efeitos potencializados de saponinas totais de Panax Ginseng (TSPG) sobre a inibição de células progenitoras leucêmicas por medicamentos citotóxicos na leucemia mielocítica aguda. Os investigadores 10

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utilizaram culturas de medula óssea das células de 18 pacientes que sofrem de leucemia mielocítica aguda para avaliar a sensibilidade das células Ieu- cêmicas à homoharringtonina (HHR), citarabina (ARA), adriamicina (ADR) e etoposídeo (VP-16). Na presença de TSPG, eles observaram que as taxas de inibição das células leucêmicas tratadas com HHr1 Ara, Adr e VP-16 fo- ram significativamente mais elevadas do que o controle não TSPG (todos P < 0,01). A partir destes dados, Gao et al. Concluíram que o TSPG pode mo- ver os progenitores leucêmicos não cíclicos para entrar no ciclo celular, e desse modo reforçar a sua suscetibilidade aos fármacos citotóxicos.

Keum et al. In Câncer Lett., 13;150(1):41-8 (2000), demonstra- ram que um extrato de metanol de Panax ginseng C.A. Meyer processado por calor pode ser usado para limpar o superóxido gerado por 12-0- tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) nas células de leucemia promielocíticas humanas diferenciadas (HL-60). Keum et al. também apresentaram, em Mu- tat. Res., 523-24:75-85 (2003), que Rg(3), um ginsenosídeo principal deriva- do de ginseng processado por calor, inibiu a ativação induzida por TPA do fator de transcrição eucariótica, NF-kappaB, em células HL-60.

Wang et al. In Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 14(6): 1089- 95 (2006), testaram os efeitos de modulação da saponina de ginseng, e ou- tros compostos, isoladamente ou em combinação com ciclofosfamida (CTX), quando estes compostos foram utilizados para tratar as células K562 da li- nhagem celular eritroleucêmica humana. Os efeitos foram avaliados medin- do as mudanças na atividade de telomerase das células tratadas. Os resul- tados mostraram que a saponina de ginseng ou CTX pode inibir completa- mente a atividade de telomerase das células K562 em concentrações e tem- po de exposição apropriados. Os efeitos de inibição foram intensificados quando a saponina de ginseng foi usada com CTX. A atividade de telomera- se diminuiu proporcionalmente com as concentrações de cada composto e da duração do tempo de exposição. Adicionalmente, a viabilidade das célu- las K562 foi diminuída após a co-cultura com ginseng e CTX, com níveis aumentados de inibição observados com concentrações e tempo de exposi- ção crescentes. 10

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Chui et al, em Oncol Rep. 16(6):1313-6 (2006), testaram o po- tencial antileucemia de um regime de combinação incluindo extrato de ovo de crocodilo, ginseng de origem silvestre e Ganoderma Iucidum natural (ex- trato de CGG) em leucemia mieloide aguda (AML) in vitro. Os pesquisadores testaram a atividade antiproliferativa do extrato de CGG sobre a linhagem celular KG 1a AML e duas amostras aspiradas de medula óssea recentemen- te preparadas isoladas de pacientes com AML novamente. Os ratos foram testados in vivo com uma dose excessiva de extrato de CGG unicamente para determinar qualquer desenvolvimento de toxicidade aguda. Chui et al. concluíram que o extrato de CGG tem o potencial inibidor do crescimento sobre as células KG1a e amostras de medula óssea AML in vitro. Adicional- mente, seu teste de toxicidade in vivo revelou que nenhuma toxicidade agu- da foi observada após a alimentação dos ratos com uma alta dose do extrato de CGG.

Todos os estudos anteriormente mencionados foram limitados pelo fato de que cada estudo testou a eficácia da fração de saponina (ginse- nosídeo) da planta ginseng sob condições in vitro. Quando as condições in vivo forem implementadas, foram apenas para testar a toxicidade, não a efi- cácia do composto derivado de ginseng contra uma malignidade hematológi- ca. Em um dos poucos estudos que testaram a eficácia dos componentes derivados de ginseng in vivo, Kim et al. In Immunopharmacol Immunotoxicol. 12(2):257-76 (1990) examinaram Panax ginseng com relação a suas propri- edades imunomoduladoras em camundongos. O objetivo principal deste es- tudo, no entanto, foi avaliar a eficácia dos componentes derivados de gin- seng na inibição da carcinogênese, não para tratar uma doença maligna hematológica.

Kim et al. trataram camundongos com ciclofosfamida para su- primir seu sistema imunológico ou com ácido poliinossínico:ácido policitidíli- co (Poly l:C), um indutor de interferon. Adicionalmente, os camundongos foram expostos a níveis subcrónicos de Panax ginseng e desafiados com células tumorais singênicas transplantadas. Após o tratamento, os pesquisa- dores analisaram os níveis de múltiplos componentes do sistema imune de 10

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murino e determinaram que a exposição ao Panax ginseng estimulou a ativi- dade da célula exterminadora natural basal (NK) em camundongos imunos- suprimidos com ciclofosfamida, mas não estimulou a atividade NK em ca- mundongos tratados com Poly l:C. Os pesquisadores, adicionalmente, des- cobriram que outros parâmetros imunológicos não foram afetados, incluindo as respostas das células T e B. Embora o Panax ginseng tenha estimulado aumentos na atividade das células NK1 este estímulo não inibiu o desenvol- vimento das células tumorais singenéicas transplantadas. Kim et al. não re- velaram se o estímulo das células NK seriam eficazes contra as doenças malignas hematológicas, tais como o desenvolvimento de Ieucemias e Iinfo-

mas.

Embora os estudos acima mencionados ofereçam avanços pro- missores, um tratamento eficaz para malignidades hematológicas é atual- mente desejado. Por exemplo, um número estimado de 35.070 novos casos de leucemia será diagnosticado nos Estados Unidos em 2006. Os tratamen- tos atuais para a leucemia são limitados à quimioterapia, radioterapia, trans- plante de células tronco, transplante de medula óssea alogênica, Ieucafere- se, etc. A quimioterapia é usada principalmente como uma primeira linha de defesa para provocar a eliminação de células leucêmicas das amostras de medula óssea, desse modo causando a remissão. Estes medicamentos de- vem freqüentemente ser combinados para impedir a resistência ao medica- mento nas células leucêmicas e para interromper o câncer de se espalhar pelo sistema nervoso central. No entanto, os efeitos colaterais da quimiote- rapia são tão devastadores que muitos pacientes não podem e não resistem a todo o regime prescrito. Apesar da variedade de tratamentos disponíveis para combater a doença, aproximadamente 22.280 mortes serão atribuídas à leucemia em 2006 apenas nos Estados Unidos.

Assim, métodos para o tratamento de doenças malignas hema- tológicas, tais como leucemia e Iinfoma são necessários. Um tal método de- ve ser capaz de efetivamente curar a malignidade hematológica, mas ainda ser tolerável para o paciente, ou seja, administrado em doses elevadas du- rante longos períodos de tempo, ou mesmo diariamente ao longo da vida, 10

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livre de efeitos colaterais debilitantes. Portanto, existe uma necessidade na técnica de métodos que são capazes de desencadear as defesas imunológi- cas do paciente em uma maneira que efetivamente elimine as células malig- nas do paciente, deixando o paciente capaz de completar um regime de tra- tamento inteiro sem sofrimento concomitante de seus efeitos colaterais. Sumário da Invenção

Os presentes inventores observaram que certos extratos de gin- seng Americano possuem propriedades imunorreguladoras. CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223, especificamente es- timulam a proliferação de células NK e monócitos na medula óssea e no ba- ço, que subseqüentemente produzem uma redução no número de células de eritroleucemia encontradas na medula óssea e sangue. Estas frações po- dem ser utilizadas para a prevenção ou tratamento de doenças malignas hematológicas.

Portanto, a presente invenção é direcionada a um método de tratamento de uma condição caracterizada por uma malignidade hematológi- ca compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de tratamento da condição de pelo menos uma fração de ginseng seleciona- da do grupo consistindo em CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223.

A invenção ainda inclui um método de tratamento da leucemia em um paciente com sua necessidade, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de tratamento da leucemia de pelo me- nos uma fração de ginseng selecionada do grupo consistindo de CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223.

A invenção também inclui um método de ativar a proliferação de células hematopoiéticas em um paciente com sua necessidade, compreen- dendo a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de proliferação de células hematopoiéticas de pelo menos uma fração de ginseng selecio- nada do grupo consistindo de CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223.

A invenção ainda inclui um método de ativação, na medula ós- 15

sea e no baço, da proliferação de células exterminadoras naturais (NK) e monócitos em um paciente com sua necessidade, compreendendo a admi- nistração ao paciente de uma quantidade eficaz de proliferação de células exterminadoras naturais (NK) e monócitos de pelo menos uma fração de ginseng selecionada do grupo consistindo em CVT-E002, PQ2, PQ223 e fra- ções purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223. Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra o efeito da fração de ginseng CVT-E002 sobre as populações de células hematopoiéticas e imunológicas na medula óssea de camundongos administrados com 2 mg/dia de CVT-E002.

A figura 2 mostra o efeito da fração de ginseng CVT-E002 sobre as populações de células hematopoiéticas e imunológicas no baço de ca- mundongos administrados com 2 mg/dia de CVT-E002.

A figura 3 mostra o efeito da fração de ginseng CVT-E002 sobre as populações de células hematopoiéticas e imunológicas no sangue de ca- mundongos administrados com 2 mg/dia de CVT-E002.

A figura 4 mostra a sobrevivência de camundongos administra- dos com 2 mg/dia de CVT-E002. Controle: 10 camundongos; tratados com CVT-E002: 15 camundongos.

A figura 5 mostra a sobrevivência de camundongos administra- dos com 40 mg/dia de CVT-E002. Controle: 10 camundongos; tratados com CVT-E002: 4 grupos idênticos de 10 a 11 camundongos cada.

A figura 6 mostra o efeito da fração de ginseng CVT-E002 sobre as populações de células hematopoiéticas e imunológicas na medula óssea de camundongos administrados com 40 mg/dia de CVT-E002.

A figura 7 mostra o efeito da fração de ginseng CVT-E002 sobre populações de células hematopoiéticas e imunológicas no baço de camun- dongos administrados com 40 mg/dia de CVT-E002.

A figura 8 mostra o efeito da fração de ginseng CVT-E002 sobre populações de células hematopoiéticas e imunológicas no sangue de ca- mundongos administrados com 40 mg/dia de CVT-E002.

A figura 9 mostra a sobrevivência dos camundongos administra-

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dos com 120 mg/dia de CVT-E002. Controle: 10 camundongos; tratados com CVT-E002: 4 grupos idênticos de 10 a 11 ratos cada. Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção é direcionada a um método de tratamento de uma condição caracterizada por uma malignidade hematológica compre- endendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de trata- mento de uma condição de pelo menos uma fração de ginseng selecionada do grupo consistindo em CVT-E002, PQ2l PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223. Preferivelmente, a condição caracterizada por uma malignidade hematológica é selecionada do grupo consistindo em prolifera- ção anormal de células do sangue, uma doença dos Iinfonodos e múltiplos mielomas. Ainda mais preferivelmente, a proliferação anormal de células sangüíneas é selecionada do grupo consistindo em leucemia Iinfoide aguda,

leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica e leucemia mieloide crônica.

A presente invenção inclui ainda um método de tratamento da leucemia em um paciente com sua necessidade, compreendendo a adminis- tração ao paciente de uma quantidade eficaz de tratamento de leucemia de pelo menos uma fração de ginseng selecionada do grupo consistindo em CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223. Processos para a produção destas frações de ginseng a partir de um extrato solúvel em água da parte da raiz de Panax quinquefolium foram anterior- mente descritos nas Patentes US N0S 6.432.454, 7.067.160 e 7.186.423 e Pedido de Patente U.S. N° 11/114.089 e 10/186.733 e são por meio desta incorporadas por referência. Ao contrário das investigações descritas nos Fundamentos da Invenção, que focalizaram sobre a toxicidade e eficácia das frações de ginsenosídeo, a presente invenção emprega um extrato de polis- sacarídeo da planta ginseng não contendo ginsenosídeo. Os processos para a produção das frações de ginseng da presente invenção removem as fra- ções de ginsenosídeo durante o processo de extração. Sem ser limitado a qualquer teoria particular, os inventores acreditam que o extrato de polissa- carídeo efetua a vigilância imunológica tanto contra tumores em desenvolvi-

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30 mento quanto contra células infectadas com vírus que podem causar leuce-

mia.

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A presente invenção também inclui um método de ativar a proli- feração de células hematopoiéticas em um paciente com sua necessidade, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de proliferação de células hematopoiéticas de pelo menos uma fração de gin- seng selecionada do grupo consistindo de CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223. Preferivelmente1 as células hemato- poiéticas ativadas são células exterminadoras naturais (NK)1 células granu- Ioides precursoras, granulócitos maduros, eritrócitos e monócitos. Ainda

mais preferivelmente, a proliferação destas células ocorre na medula óssea, sangue e/ou no baço.

Sem ser limitado a qualquer teoria particular, os inventores acre- ditam que o estimulo fitocêutico da proliferação de células NK e monócitos na medula óssea facilita vigilância imunológica tanto contra o desenvolvi- mento de tumores quanto contra as células infectadas com vírus que podem causar leucemia. Por exemplo, vírus da leucemia de amigos íntimos, ca- mundongos e felinos são conhecidos por aqueles de habilidade na técnica de serem agentes etiológicos nos animais em que eles infectam. Em seres humanos, casos de Leucemia Mieloide Aguda podem estar associados com infecções virais por vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou vírus Iinfo- trópico T humano (HTLV-1 e -2, que causa leucemia/limfoma da célula T do adulto). No que diz respeito à tumorogênese leucêmica não viral, os fatores citados incluem a predisposição genética e certas condições ambientais, por exemplo, a exposição crônica ao benzeno, exposição extraordinária à irradi- ação ionizante, etc. Outros fatores e causas ainda estão por ser descober- tos. Independente da causa de leucemia, entretanto, os métodos de estímulo fitocêutico da presente invenção são eficazes no tratamento da aflição medi- ante o estímulo da proliferação de células NK e monócitos na medula óssea para subsequentes funções de vigilância imunológica contra as células neo- plásicas na medula óssea, sangue e baço.

A presente invenção também é eficaz contra o câncer induzido por vírus. Sem ser limitado a qualquer teoria particular, os inventores acredi- tam que o estímulo fitocêutico também é eficaz tanto contra o desenvolvi- mento de tumores quanto contra as células infectadas com os vírus que po- dem causar câncer. Nos seres humanos, é atualmente estimado que de 20 a 25 % dos cânceres humanos são causados por vírus. Por exemplo, casos de câncer gástrico, Iinfoma de Burkitt e Iinfoma de Hodgkin estão estritamente associados com infecções virais de Epstein-Barr. Células de câncer de prós- tata foram observadas de serem infectadas com retrovírus XMRV. Tipos de papilomavírus humano (HPV) 16 e 18 causam 70 % dos casos de câncer D cervical. Dos pacientes que sofrem com carcinoma hepatocelular (HCC), 20 % também sofrem com hepatites virais crônicas (hepatite B ou hepatite C). O vírus da herpes associado com o sarcoma de Kaposi é responsável por to- das as formas de sarcoma de Kaposi. Independentemente do vírus que in- duz ao câncer, os métodos de estímulo fitocêutico da presente invenção são eficazes no tratamento da aflição mediante o estímulo da proliferação de células NK e monócitos na medula óssea para subsequentes funções de vigilância imunológica contra células neoplásicas infectadas por vírus.

As doses de frações de ginseng de acordo com a invenção de- pendem da condição particular a ser tratada, assim como a idade, sexo e condição de saúde geral do paciente. No entanto, doses adequadas podem ser observadas na faixa de 0,5 a 5000 mg/kg de peso corporal. Uma faixa preferível para uma dosagem adequada de frações de ginseng está dentro da faixa de 1 a 4800 mg/kg de peso corporal. Ainda mais preferivelmente, a dosagem de fração de ginseng adequada está dentro da faixa de cerca de 3 a 1600 mg/kg de peso corporal. A dose adequada deve ser administrada na faixa de 1 a 10 doses diárias. Preferivelmente, a dose adequada deve ser de 1 a 5 doses diárias. Ainda mais preferivelmente, a dose diária deve ser de 2 a 4 doses diárias. As frações de ginseng podem ser administradas por via oral, através de injeção ou infusão, topicamente, por via nasal, por via ocu- lar, por via vaginal ou por via retal.

A presente invenção abrange usos de pelo menos uma fração de ginseng isoladamente ou em combinação com um outro medicamento. A presente invenção também abrange usos de pelo menos uma fração de gin- seng isoladamente ou em combinação com um portador farmaceuticamente aceitável. Os portadores farmaceuticamente aceitável para uso na invenção foram anteriormente descritos nas Patentes US N0S 6.432.454, 7.067.160 e 7.186.423 e Pedidos de Patente N0S 11/114.089 e 10/186.733 e são por meio desta incorporadas por referência. As frações de ginseng são especi- almente adequadas para a coadministração com um agente quimioterápico ou como um suplemento de radioterapia ou transplante da célula tronco, transplante de medula óssea alogênico, leucaferese, etc.

A invenção será agora esclarecida pelos seguintes exemplos.

Exemplo 1

Efeito de CVT-E002 sobre as populações de células hematopoi- éticas e imunológicas na medula óssea, baço e sangue de camundongos administrados com 2 mg/dia de CVT-E002. Animais:

Camundongos de cepa DBA/2 machos de oito a 9 semanas de idade (Charles River Laboratories, St. Constant, QC1 Canadá) foram aloja- dos na chegada, um por gaiola e mantidos em condições livres de patóge- nos (gaiolas micro-isoladoras) em uma instalação com temperatura/umidade regulada, com um ciclo de dia/noite de 12 horas, na Animal Care Facility of McGiII University. A instalação está sob vigilância veterinária contínua e rigo- rosamente adere aos regulamentos do CCAC (Canadian Committee on Ani- mal Care). Os animais foram providos com água e alimento ad libidum, e permaneceram imperturbáveis até a idade de 10 semanas, a idade do início !5 da experiência. A avaliação regular dos camundongos sentinelas contidos na Instalação consistentemente demonstrou a ausência de patógenos comuns de camundongo.

Células tumorais - manutenção e administração:

Células de eritroleucemia induzidas por vírus amigável (Ameri- 0 can Type Culture Collection, Manassas1 VA, USA), foram mantidas in vitro a 37°C, 100 % de umidade e 5 % de CO2, em meio basal de Eagle suplemen- tado com 15 % Cellect Gold™ Serum (MP Biomedicals, Solon, OH, USA), 4% de aminoácidos essenciais e 2 % de aminoácidos não essenciais, 1 % de L-glutamina (GIBCO, Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 3 % de bicar- bonato de sódio (solução a 7,5 %) e 1 % de HEPES (Sigma Aldrich, Oakville, ON1 Canada), em uma concentração de 2M. O pH foi ajustado para 7,2 e o meio do estoque de células tumorais foi reabastecido 3 vezes por semana. A partir deste estoque células tumorais in vitro, as células foram extraídas para iniciar hospedeiros que carregam o tumor. Células tumorais foram utilizadas durante o crescimento de fase Iog quando elas apresentaram uma rentabili- dade média de 89,4 ± 0,64 %. Cada camundongo foi assepticamente injeta- do com 3 χ 106 células tumorais viáveis em 0,1 ml de Salina Tamponada de Fosfato (PBS) em pH 7,2 através da veia caudal lateral. Administração in vivo de CVT-E002:

CVT-E002, um extrato proprietário de ginseng Norte Americano (Panax quinquefolius) compreendido de polissacarídeos únicos (poli- furanosil-topiranosil-sacarídeos), da CV Technologies Inc., Edmonton, AB, Canada, foi administrado através da dieta. Extrato em pó de CVT-E002 foi homogeneizado na ração de camundongo da Purina Laboratory padrão fi- namente triturada, ("Labchow", Agribrands, Canada), a dieta padrão para todos os camundongos na Instalação. Todas as alimentações descritas a- baixo, começariam imediatamente após a injeção de células de leucemia. Todos os camundongos portadores de leucemia foram abastecidos a cada manhã (8:00 a 10:00) com ração triturada fresca com/sem (controle) o extra- to de Ginseng. Outros camundongos (normais, não leucêmicos) consumiram alimento granulado não tratado regular. Cada camundongo experimental leucêmico foi abastecido com 2 mg, 40 mg ou 120 mg de CVT-E002 em 6 g de ração triturada/dia, enquanto os camundongos de controle leucêmicos consumiram apenas ração triturada não tratada. Estudos anteriores exausti- vos em nosso laboratório revelaram que os camundongos machos desta raça e idade consomem regularmente 6 g de ração/dia, praticamente tudo o que é consumido durante a fase escura do ciclo de 24 horas.

Preparação de suspensões celulares livres de medula óssea, baco e san- gue: Os camundongos foram mortos por asfixia de CO2 em 10 dias ou 6 semanas após o início de CVT-E002 na dieta, assim como os camundon- gos de controle correspondentes que receberam ração não tratada. Os ca- mundongos normais (acima mencionados), da mesma raça, idade e sexo, também foram analisados como descrito em anexo. Suspensões celulares únicas da medula óssea e do baço foram preparadas por métodos laborato- riais padrão. Resumidamente, ambos os fêmures (fonte de medula óssea) e o baço foram assepticamente removidos de cada camundongo e transferidos para o Meio Essencial Mínimo gelado (MEM) (GIBCO Invitrogen, Burlington, ON, Canada), contendo 10 % de Soro Fetal Bovino filtrado por miliporo inati- vado por calor (56°C, 30 min) (FBS) (GIBCO, Invitrogen Burlington, ON, Ca- nada). Os baços foram pressionados através de uma malha de tela de aço inoxidável no meio, e a medula óssea foi removida dos fêmures mediante a lavagem com jato repetida das células contidas com o meio. Suspensões celulares livres de ambos os órgãos foram obtidas por pipetagem repetida suave. As suspensões resultantes foram depois dispostas em camadas du- rante 7 min em 1,5 ml de Newborn Calf Serum (NCS) (GIBCO Invitrogen, Burlington, ON, Canada), para permitir a sedimentação de qualquer agrega- do (restos não celulares) no NCS puro. Os sobrenadantes livres de agrega- do resultantes foram removidos e centrifugados durante 7 min (1100 rpm, 4 0C) e os grânulos resultantes foram novamente colocados em suspensão em um volume fixo de meio novo. O número total de células nucleadas foi obtido por meio de um hemocitômetro (American Optical Co., Buffalo, NY, USA), e a viabilidade das células foi simultaneamente determinada através do méto- do de exclusão de tintura Trypan Blue (0,04 % de tintura em PBS de pH 7,2) (GIBCO Invitrogen, Burlington, ON, Canada). As suspensões celulares de medula óssea e baço foram ajustadas para uma concentração final de 40 χ 106 células/ml.

O sangue de cada camundongo (experimental, controle e nor- mal) foi transferido para lâminas de microscópio Superfrost Plus® (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada), a partir de um corte (através de uma agulha estéril) na veia caudal lateral enquanto o camundongo estava vivo, e imedia- tamente antes da eutanásia para a colheita da medula óssea e do baço (a- cima). Nódoas de sangue foram depois manchadas com mancha hematoló- gica de tetracromo de MacNeaI (Sigma Aldrich, Oakville1 ON1 Canada) que permite a pronta identificação de vários tipos de células/linhagens celulares morfologicamente distintas. Após o manchamento, as nódoas foram cober- tas e subseqüentemente analisadas por 5 tipos celulares distintos através de microscopia luminosa (x100). A partir da contagem de 1000 células sobre cada nódoa de sangue, as proporções de cada tipo de célula (granulócitos maduros, precursores granulocíticos, células eritroides nucleadas, linfócitos e monócitos) foram obtidas.

Imunorrotulaaem de células NK:

ASGM-1 (asialogangliotetrassiliramida) é uma molécula superfi- cial que está presente em todas as células NK maduras e amadurecendo. Ver Kasai et al. Eur. Jour. Immunol., 10:175-180 (1980) e Beck et al. Trans- plantation, 33: 118-122 (1982). Embora as células de blasto linfócito T tam- bém possam possuir, estas células não são apenas raras, mas são facilmen- te distinguíveis das células NK tanto morfologicamente, pelo tamanho quanto pelos nossos métodos de manchamento de tetracromo (acima).

O método de imunorrotulagem da célula NK descrito no momen- to está bem estabelecido em nosso laboratório. Ver Currier et al., Jour. Al- tern. Comp. Med., 7(3): 241-251(2001), Currier, et al., Jour. Alter. Comp. Med., 8(1): 49-58(2002), Brousseau, et al., Biogeron, 6:157-163, (2005), Mil- ler, et al., Nat. Immun., 11:78-91 (1992), Dussault, et al., Nat. Immun., 12: 55-78 (1993), Dussault, et al.,. Nat. Immun., 14: 35-43 (1995) e Currier, et al., Exp. Geront., 35: 627-639 (2000). Usando placas de 96 multi- reservatórios (Sarstedt, Montreal, QC, Canada), 100 μΙ das suspensões ce- lulares de medula óssea e de baço (acima) foram incubados com 100 μΙ de anticorpo primário, anti-ASGM-l de coelho (Wako Pure Chemicals, Dallas, TX, USA) em uma diluição de 1:40 em meio durante 30 min no gelo. Após a incubação, as células foram centrifugadas durante 7 min (1100 rpm, 4°C), seguido de duas lavagens consecutivas em 100 μΙ de meio e centrifugação como acima. Após a lavagem final, os grânulos foram colocados novamente em suspensão e incubados com 100 μΙ do anticorpo submetido a biotina se- cundário, IgG anti-coelho (Sigma Aldrich, Oakville, ON1 Canada) em uma concentração de 1:100 em meio durante 30 min no gelo. As suspensões ce- lulares foram novamente centrifugadas e lavadas duas vezes como acima antes de serem colocadas novamente em suspensão em 4,5 ml de meio ci- tomarcado (0,009 % de NaCI, 0,001 % EDTA e 0,05 % albumina de soro bovino (BSA) em água destilada (pH 7,4) (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Ca- nada). As células foram depois citocentrifugadas (5 min, 1000 χ g) nas lâmi- nas de microscópio Superfrost Plus® (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Cana- da), e rapidamente secadas com ar para evitar a contração celular. As lâmi- nas foram depois fixadas em metanol puro durante 30 minutos em gelo e re- hidratadas progressivamente (25 %, 50 %, 75 % e 100 %) durante 5 minutos com PBS pH 7,2, banhadas durante 10 minutos em uma solução de peróxi- do de hidrogênio a 3 % para bloquear a atividade de peroxidase endógena (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada). As lâminas foram lavadas por 10 minutos em PBS e incubadas com 100 μΙ de solução de complexo peroxida- se de avidina-biotina de rábano silvestre (ABC) (Dako Diagnostics, Missis- sauga, ON, Canada) durante 45 min em uma câmara totalmente umidificada. Em seguida, as lâminas foram lavadas como acima em PBS para remover qualquer solução de ABC residual antes de serem imersas em uma solução de 3-3'diaminobenzidina (DAB) (0,125 g de DAB, 66,6 μΙ de H2O2 a 30 % em 250 ml de PBS em pH 7,6) durante 13 min seguido por duas lavagens con- secutivas em PBS. As lâminas contendo as citomarcas foram manchadas secas e subseqüentemente manchadas com mancha hematológica de tetra- cromo de MacNeaI e cobertas. Assim, o método de manchamento duplo (i- munorrotulagem e manchamento de tetracromo) permite a pronta identifica- ção dos 5 tipos de célula mencionados acima, incluindo as células NK, estas facilmente separadas e diferenciadas por meio de seu marcador superficial ASGM-1 de todos os outros linfócitos, isto é, linfócitos TeB maduros e a- madurecendo, dos quais eles são de outra maneira morfologicamente indis- tinguíveis.

Análise diferencial de células hematopoiéticas e imunolóqicas na medula óssea e baço:

Tanto na medula óssea quanto no baço, os granulócitos madu- ros, precursores granulocíticos (células granuloides imaturas), células eri- troides nucleadas, linfócitos NK1 linfócitos não NK (isto é, T e B e monócitos), foram identificados, utilizando microscopia luminosa em x100. As contagens diferenciais foram obtidas através deste método, a partir de 1000 células do baço e sangue/citomarca/camundongos, e 2000 células de medula ós- sea/citomarca/camundongo para cada experiência (ração contendo CVT- E002), controle (ração sem tratamento), e camundongo normal. Para cada órgão, e para cada camundongo, os percentuais para cada grupo de células (acima) foram registrados. Os números absolutos de células NK e suas célu- las acessórias, os monócitos, foram obtidos mediante a conversão destes valores percentuais por órgão, através da celularidade total conhecida deste

órgão, registrados a partir do hemocitômetro no momento da morte dos ani- mais.

Análise estatística:

O teste de duas caudas Student foi utilizado para comparar as diferenças entre os meios da experiência (tratados com CVT-E002) e grupos de controle correspondentes. Valores de ρ < 0,05 foram considerados esta- tisticamente significativos. Todos os valores de ρ específicos são registrados nos histogramas e dentro das tabelas. Resultados:

Para as figuras de 1 a 3 e de 6 a 9, as seguintes abreviações são usadas: LYMPHO = linfócitos, incluindo as células T e B; NK = células exterminadoras naturais; RBC = precursores da proliferação de glóbulos vermelhos; GRAN = granulócitos maduros (funcionais); IMGRAN = granuló- citos imaturos, isto é, precursores da proliferação; MONO = monócitos. N = 8 amostras (camundongos)/tipo de célula; * = valores ρ estatisticamente signi- ficativos vs controle avaliado por meio do teste de duas caudas "t" Student. Níveis de significância são indicados.

A figura 1 demonstra o efeito de 2 mg/dia de CVT-E002 no sítio de geração central de todas as células hematopoiéticas e imunológicas, isto é, a medula óssea. Os dados indicam que houve uma profunda influência do

CVT-E002 sobre várias linhagens celulares naquele órgão. Particularmente

importante é a observação de que as células NK dobraram seus níveis no

grupo de consumo de CVT-E002 de camundongos leucêmicos vs. camun-

dongos leucêmicos na dieta não tratada. Um aumento significativo também

foi observado com as células NK nos baços destes animais (figura 2). Estes

valores relativos, isto é, percentuais (figuras 1, 2), quando convertidos em

números absolutos, indicam que o CVT-E002 de fato produziu aumento no

tamanho da população destas células antitumorais vitais (ver a Tabela 1 a- baixo).

Tabela 1. Números absolutos de células NK e Monócitos na medula óssea e

baço.

dias após a injeção de leucemia de camundongos tratados com dieta diá- ria de CVT-E002 em 2 mg/dia. _

CÉLULAS NK Controle (χ 106) CÉLULAS NK CVT-E002 (χ 106) MONÓCITOS Controle (χ 106) MONÓCI- TOS CVT-E 002 (χ 106) MEDULA ÓSSEA 0,11 ±0,02 N=8 0,20 ± 0,06 N=8 0,20 ± 0,04 N=8 0,42 ± 0,09 N=8 BAÇO 11,46 ± 1,49 N=9 21,79 ±2,83 N=8 2,82 ± 1,04 N=8 5,38 ± 1,05 N=8

As células acessórias necessárias para as células NK são os

monócitos, e na presença de 2 mg/dia de CVT-E002, precisamente o mesmo fenômeno ocorreu, como observado para as células NK, tanto na medula óssea quanto no baço destes animais leucêmicos. Isto é, as proporções e números absolutos de monócitos são elevados na presença do CVT-E002 (figuras 1, 2; Tabela 1). Assim, nestes camundongos leucêmicos, tanto para as células NK citolíticas tumorais quanto para seus auxiliares monócitos, o CVT-E002 teve um efeito muito positivo.

A população próxima de células que surge sob a influência de CVT-E002 é aquela das células nucleadas de glóbulos vermelhos. A leuce- mia sob análise neste estudo é uma eritroleucemia e, consequentemente, temos observado que a grande maioria destas células nucleadas de glóbulos

15

20

25 vermelhos eram blastos pertencentes ao tumor. O CVT-E002 significativa- mente reduziu o número de blastos eritroides na medula óssea em relação ao controle (figura 1) e o mesmo fenômeno é observado no sangue, a única saída para todas as células nascidas na medula óssea (figura 3).

Os dinâmicos de população interórgãos (medula ós- sea—»sangue—>baço) de linfócitos (células Τ, B) nestes camundongos Ieu- cêmicos, com e sem a 2 mg/dia de CVT-E002, são mostrados nas figuras de 1 a 3. A medula óssea é o único sítio de geração de todos os linfócitos vir- gens primários da linhagem "B", a descendência madura dos quais é depois disseminada através do sangue para o baço e os numerosos Iinfonodos em todo o corpo. Na presença de CVT-E002, os níveis de linfócito B na medula óssea têm diminuído significativamente (figura 1). Os níveis totais de linfócito no baço (figura 2) são ligeiramente reduzidos na presença de CVT-E002. No entanto, como o baço também contém números muito grandes de linfócitos T (não de origem da medula óssea), a ligeira redução nos níveis totais de linfócito é mais provavelmente mediada pela redução nos linfócitos B deriva- dos da medula óssea. Não houve, correspondentemente, nenhuma mudan- ça nas proporções de linfócitos observados no sangue (figura 3). Como de costume, qualquer observação sobre os níveis de linfócito no sangue será confundido pelo fato de que o sangue é a estrada ao longo da qual todos os linfócitos (Τ, Β, NK) devem viajar para, entre e no meio, dos principais sítios hematopoiéticos e imunológicos, isto é, a medula óssea, baço e várias cen- tenas de Iinfonodos periféricos.

Com relação às células da linhagem de granulócitos, a figura 1 demonstra que na medula óssea, as células granuloides precursoras de pro- liferação imaturas são aproximadamente um terço mais proeminente na me- dula óssea sob a influência da dieta diária de CVT-E002 vs. controle, dieta sem tratamento, o que contrasta com a redução de um terço (vs. controle, dieta sem tratamento) nos níveis de seus descendentes maduros nesse ór- gão (figura 1). No baço, no entanto, o CVT-E002 tem instigado uma eleva- ção nos níveis de granulócitos maduros (figura 2), vs. controles leucêmicos não tratados. A figura 3 indica uma redução significativa na proporção de gra- nulócitos imaturos no sangue de camundongos consumidores de CVT-E002, vs. controle, embora, como acima, isto possa não ser significativo em qual- quer sentido funcional visto que o sangue é apenas uma via de ligação no

meio e entre muitos órgãos contendo células hematopoiéticas e imunológi- cas.

Exemplo 2

O procedimento do Exemplo 1 é repetido, mas no lugar de CVT- E002, uma quantidade igual de PQ2 é usada. Resultados similares aos en- contrados no Exemplo 1 são obtidos. Exemplo 3

O procedimento do Exemplo 1 é repetido, mas no lugar de CVT- E002, uma quantidade igual de PQ223 é usada. Resultados similares aos en- contrados no Exemplo 1 são obtidos. Exemplo 4

Efeito do CVT-E002 em Populações de Células Hematopoiéticas e Imunológicas na Medula Óssea, Baço e Sangue de Camundongos admi- nistrados com 40 mg/dia de CVT-E002.

A administração de células tumorais e CVT-E002 em camun- dongos, a preparação de suspensões celulares livres de medula óssea, baço e sangue, imunorrotulagem de células NK, análise diferencial de células he- matopoiéticas e imunológicas na medula óssea e baço, e análise estatística estavam de acordo com os materiais e métodos descritos no Exemplo 1. Resultados:

Os dados de células hematopoiéticas e imunológicas registrados para camundongos leucêmicos que recebem 40 mg/dia de CVT-E002 reve- laram que houve elevações significativas nas proporções de células NK e monócitos na medula óssea (figura 6) e no baço (figura 7) em camundongos leucêmicos tratados com CVT-E002 em 6 semanas a partir do início do tu- mor, vs. Camundongos normais saudáveis de raça, sexo e idade correspon- dentes. Para as figuras de 6 a 8, pela razão de nenhum camundongo de "controle" (leucemia sem tratamento) sobreviveu até 6 semanas, os valores experimentais são comparados aos camuridongos normais de mesma raça, idade e sexo. Essas proporções que refletem aumentos absolutos no núme- ro dessas células nesses órgãos são mostradas na Tabela 2. Ver abaixo. Tabela 2. Números absolutos de células NK e Monócitos na Medula Óssea e Baço

Camundongos não tratados normais e camundongos leucêmicos tratados durante 6 semanas com dieta de CVT-E002 em 40 mg/dia.

MEDULA ÓSSEA

CÉLULAS NK Controle

(χ 106) Média ± SEM

0,32 ±0,13

BAÇO

6,44 ± 0,61

CÉLULAS

NK CVT-E002 (χ 106) Média ± SEM

1,46 ±0,07 (1)

24,79 ± 1,82 (3)

MONÓCITOS Controle (χ 106) Média ± SEM

0,19 ±0,02

0,70 ± 0,96

MONÓCITOS CVT-E002 (χ 106) Média ± SEM

0,36 ± 0,04 (2)

1,23 ±0,20

(4)

(1) p < 0,0001,(2) ρ < 0,005,(3) ρ < 0,0001,(4) ρ < 0,04

As proporções de todas as outras células hematopoiéticas e i- munológicas na medula óssea e baço foram nos níveis normais ou próximos deles para camundongos da mesma idade e sexo (figuras 6, 7). Os aminoá- cidos normais foram utilizados como um barômetro para avaliar se e quando as várias linhagens celulares hematopoiéticas e imunológicas voltam ao normal em camundongos leucêmicos tratados com 40 mg/dia de CVT-E002. Além disso, os camundongos normais foram utilizados para comparação porque todos os camundongos leucêmicos de controle, isto é, aqueles que não recebem dieta de CVT-E002, tinham morrido entre 15 a 19 dias do perí- odo de teste.

Uma observação fundamental tanto no baço quanto na medula óssea destes camundongos originalmente leucêmicos, em 6 semanas após o recebimento de 40 mg/dia de CVT-E002, é o fato de que o número de cé- lulas eritroides nucleadas retornou aos níveis comparáveis aos dos camun- dongos normais (figuras 6, 7), sugerindo a presença de poucas, se houver, células eritroleucêmicas remanescentes, estas sendo indistinguíveis das cé- lulas eritroides nucleadas endógenas.

No intervalo de 6 semanas, as proporções relativas das várias linhagens celulares também foram registradas para o de camundongos tanto tratados com CVT-E002 quanto normais de raça, idade e sexo correspon- dentes (figura 8). As proporções mais baixas de linfócitos no sangue de ca- mundongos tratados com CVT-E002, podem simplesmente refletir o fato de que dentro deste grupo estão as células NK e as proporções e números ab- solutos destas células são significativamente mais elevados tanto na medula óssea quanto no baço (Tabela 2) de camundongos leucêmicos tratados com CVT-E002 vs. aqueles dos camundongos não tratados normais, resultando em menos células NK em trânsito no sangue. As proporções mais elevadas de granulócitos imaturos e maduros no sangue devem refletir seus números mais elevados em seu local de geração de medula óssea, uma vez que a circulação do sangue é o único caminho para fora da medula óssea. Final- mente, as proporções de células eritroides nucleadas vistas neste órgão, em 6 semanas de idade, em camundongos leucêmicos tratados com CVT-E002, embora estatisticamente elevadas (figura 8), são muito baixas (0,57 ± 0,09%), e muito mais próximas do níveis em camundongos normais (0,17 ± 0,07%) do que elas são para os camundongos leucêmicos de controle não tratados (4,27 ± 0,54 %: figura 3). Assim, as figuras 6, 7, 8 todas revelam um retomo dos valores de células hematopoiéticas e imunológicas aos níveis normais, com a exceção das células NK antitumorais e monócitos, cujos números permanecem beneficamente elevados com a administração susten- tada de CVT-E002. Exemplo 4

O procedimento do Exemplo 4 é repetido, mas no lugar de CVT- E002, uma quantidade igual de PQ2 é usada. Resultados similares aos en- contrados no Exemplo 4 são obtidos. Exemplo 5

O procedimento do Exemplo 4 é repetido, mas no lugar de CVT- E002, uma quantidade igual de PQ223 é usada. Resultados similares aos en- contrados no Exemplo 4 são obtidos. Exemplo 6

Efeito do CVT-E002 sobre a Sobrevivência de Camundongos quando administrados com 2, 40 e 120 mg/dia de CVT-E002. Avaliação da Sobrevivência Mediada por CVT-E002:

Grupos de camundongos leucêmicos, alimentados diariamente com 2 mg, 40 mg ou 120 mg de CVT-E002, assim como um grupo de ca- mundongos leucêmicos de controle que consomem ração não tratada, foram deixados não manipulados, para avaliar a influência do tratamento de CVT- E002 sobre a expectativa de vida. O software Kaplan-Meier Survival Analysis foi aplicado para avaliar a importância do CVT-E002, vs. nenhum tratamento, sobre a expectativa de vida dos camundongos leucêmicos. Resultados:

Quando se aumenta a dose diária de CVT-E002 em camundon- gos leucêmicos para 120 mg/dia, uma melhora na sobrevivência foi obser- vada em todos os grupos testados (figura 9), no entanto, o aumento da so- brevivência foi consideravelmente menos impressionante do que o observa- do com 40 mg/dia (figura 5). De fato, nenhum camundongo leucêmico trata- do com 120 mg/dia sobreviveu até 6 semanas após o início da leucemia (fi- gura 9), indicando a importância da dosagem no estabelecimento dos níveis terapêuticos de CVT-E002.

Em resumo, os resultados do presente estudo mostram que as frações de ginseng da invenção significativamente estimularam a imunidade não específica em camundongos leucêmicos, e significativamente prolonga- ram a expectativa de vida de hospedeiros atormentados com leucemia. Além disso, mudanças específicas imbuídas pelo CVT-E002 em outras células hematopoiéticas e imunológicas nos 3 sítios chaves que contêm tais elemen- tos, isto é, a medula óssea (que gera o sítio de todas as células hematopoié- ticas e imunológicas), o caminho do sangue, e o baço, o sítio em que todas estas células finalmente transitam, ou dentro do qual elas se tornam residen- tes funcionais. Níveis significativamente elevados foram observados nos números absolutos de células NK e monócitos, mediadores da primeira linha de defesa na luta contra a leucemia, tanto na medula óssea quanto no baço de camundongos leucêmicos tratados com CVT-E002. Concomitante com estas observações está a constatação de uma redução significativa de célu- Ias de eritroleucemia na medula óssea de camundongos leucêmicos alimen- tados com CVT-E002. Este estudo mostrou (i) que aproximadamente um terço à metade dos camundongos leucêmicos administrados com este agen- te passaram a atingir uma expectativa de vida potencialmente normal, e (ii) que a dosagem é crítica na produção destes efeitos benéficos. Este estudo pré-clínico possui aplicabilidade tanto direta quanto imediata à condição hu- mana visto que a botânica utilizada já está disponível comercialmente, em uso difundido, baixo custo e sem efeitos colaterais debilitantes. Assim, o CVT-E002 é uma nova ferramenta poderosa que pode ser adicionada, ou até mesmo substituída, aos arsenais existentes para o combate de doenças malignas hematológicas tais como leucemia e linfomas, e outros tipos de tumores, incluindo tumores causados por vírus, igualmente. Exemplo 7

O procedimento do Exemplo 6 é epetido, mas no lugar de CVT- E002, uma quantidade igual de PQ2 é usada. Resultados similares aos en- contrados no Exemplo 6 são obtidos. Exemplo 8

O procedimento do Exemplo 6 é repetido, mas no lugar de CVT- E002, uma quantidade igual de PQ22S é usada. Resultados similares aos en- contrados no Exemplo 6 são obtidos.

Claims (15)

1. Método de tratamento da leucemia em um paciente com sua necessidade, em que dito método compreende a administração a dito paci- ente de uma quantidade eficaz de pelo menos uma fração de ginseng sele- cionada do grupo consistindo de CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purifica- das de CVT-E002, PQ2 e PQ223.

2. Método de ativar a proliferação de células hematopoiéticas em um paciente com necessidade de tal proliferação, em que dito método com- preende a administração a dito paciente de uma quantidade eficaz de pelo menos uma fração de ginseng selecionada do grupo consistindo em CVT- E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que as células hematopoiéticas são selecionados do grupo composto de células extermina- doras naturais (NK), células granuloides precursoras, granulócitos maduros, eritrócitos e monócitos.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que dita prolife- ração ocorre na medula óssea, sangue e/ou baço.

5. Método de tratar uma condição caracterizada por uma malig- nidade hematológica, em que dito método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos uma fração de ginseng selecionada do grupo consistindo em CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações puri- ficadas de CVT-E002, PQ2 e PQ223.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a maligni- dade hematológica é selecionada do grupo consistindo de uma proliferação anormal de células do sangue, uma doença dos Iinfonodos e múltiplos mie- lomas.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que as células do sangue são leucócitos e/ou precursores de eritrócito.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a prolifera- ção anormal de células sangüíneas é selecionada do grupo consistindo de leucemia Iinfoide aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crôni- ca, leucemia mieloide crônica e leucemia de células pilosas.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que dita leuce- mia mieloide aguda é eritroleucemia.

10. Método de tratar um câncer induzido por vírus, em que dito método compreende a administração ao indivíduo de qualquer quantidade eficaz anticâncer de pelo menos uma fração de ginseng selecionada do gru- po consistindo de CVT-E002, PQ2, PQ223 e frações purificadas de CVT- E002, PQ2 e PQ223.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que dito cân- cer induzido por vírus é selecionado do grupo consistindo de carcinoma gás- trico, próstata, cervical, hepatocelular, sarcoma de Kaposi1 Iinfoma de Burkitt e Iinfoma de Hodgkin.

12. CVT-E002, PQ2, PQ223 ou frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e/ou PQ223 para uso no tratamento de leucemia.

13. CVT-E002, PQ2, PQ223 ou frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e/ou PQ223 para uso na ativação da proliferação de células hematopoié- ticas em um paciente.

14. CVT-E002, PQ2, PQ223 ou frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e/ou PQ223 para uso no tratamento de uma condição em um paciente caracterizada por uma malignidade hematológica.

15. CVT-E002, PQ2, PQ223 ou frações purificadas de CVT-E002, PQ2 e/ou PQ223 para uso no tratamento de um câncer induzido por vírus.