JPH10500393A

JPH10500393A - リピドａの構造およびその使用方法

Info

Publication number: JPH10500393A
Application number: JP7522526A
Authority: JP
Inventors: ラッセルダブリュー．カールソン，
Original assignee: ユニバーシティオブジョージアリサーチファウンデーション，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 1998-01-13
Also published as: US5648343A; WO1995023156A1; AU1972995A; US5952313A; EP0748327A1; CA2184283A1; EP0748327A4

Abstract

(57)【要約】 Rhizobium legumjnosarum 次亜種 phaseoli CE3由来の精製リピドＡ、ならびに精製リピドＡのアナログおよび誘導体を提供する。R．leguminosarum bv.phaseoli CE3のリピドＡ不均一混合物を含有する組成物も提供する。本明細書中で提供されるリピドＡは、薬学的に受容可能なキャリアと結合し得る。被験体の免疫系を刺激し、被験体の毒物ショックを治療または防ぐ方法、および新規リピドＡを用いて、被験体のリポ多糖仲介疾患を治療または予防する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】リピドＡの構造およびその使用方法発明の背景本発明は、米国国立衛生研究所から承認番号R01 GM39583号によって、一部資金提供された。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。発明の分野本発明は、新規のリピドＡおよびそのリピドＡを用いる方法を包含する。さらに詳細には、本願は、Rhizobium leguminosarum 次亜種（biovar）phaseoli CE3 のリピドＡの構造、および免疫系を刺激し、敗血症患者の毒物ショックを治療しまたは防ぎ、そして患者のリポ多糖仲介疾患を治療しまたは防ぐこの特有のリピドＡの使用方法を初めて開示する。関連技術の説明 Rhizobiaceae科の細菌はグラム陰性であり、マメ科植物と窒素固定の関係を形成し得る。表面の多糖(リポ多糖(LPS)を含む)は、共生的感染プロセスにおいて重要な役割を有することが示されている。 Rhizobium属のLPSおよびBradyrhizobium属のLPSは、他の属のLPSと同様に、３つの構造部分を有する：リピドＡ、コアオリゴ糖、およびＯ-鎖(またはＯ側鎖) 多糖。Rhizobium属のＯ-鎖多糖は、非常に変異性(variable)であり、そして多くのメチル化およびデオキシ化された(deoxy)グリコシル残基を含有する。Stryer 、Biochemistry、第２版、W.H.Freeman and Co.、New York、74頁、(1981)を参照のこと。 LPSのリピドＡ成分の発見前は、用語「エンドトキシン」は、一般にLPSの効果を記載するために用いられた。グラム陰性細菌由来のエンドトキシンは、熱安定性、細胞性(cell-associated)、発熱性、および潜在的に致死性である。リピドＡは、敗血症または毒物ショックのような疾患の原因因子であり、そしてライム病のような他の疾患に関連する。腸内細菌由来のリピドＡは、若干変異性である。しかし、そのようなリピドＡは、4'位および１位がホスホモノエステル基により置換されたβ-1,6-結合D-グルコサミン二糖を含有することが一般に認められている。脂肪酸は、その二糖ヒドロキシル基およびアミノ基に結合し、リピドＡに疎水性を与える。腸内細菌には、アミド結合およびエステル結合した14個の炭素からなるD-3-ヒドロキシ脂肪酸(例えば、β-ヒドロキシミリスチン酸)が存在する。これらの脂肪酸のC3-OH位は、飽和脂肪酸でさらにエステル化され得る。これらの一般的な特性にもかかわらず、ある程度の微変異性が、異なる属および種の間で生じる。従って、Neisseria種は、12個の炭素の3-ヒドロキシ脂肪酸を産生し、飽和脂肪酸の置換は変化し、そしてE.ColiおよびShigellaとは異なり、SalmonellaeおよびP.aeruginosaでは、C'4-ホスホグルコサミン二糖は4-アミノ-L-アラビノースを含有し得る。非常に強力で、かつ毒性のリピドＡは、ヘキサアシル-1,4'-ジホスホリピドＡである。構造的には、１個少ないかまたは１個多い脂肪酸を有するリピドＡは、生物学的に活性であるが、毒性の少ない部分を生じる。しかし、全ての脂肪酸を除去すると、特定のリピドＡから生物学的活性が奪われる。さらに、いずれかのリン酸基を除去すると、アジュバント活性を失うことなく毒性の顕著な消失をもたらす。Zinnser、Microbiology、第20版、App leton & Lange、Norwalk CT、84-86頁(1992)を参照のこと。上記で論議されるように、グラム陰性細菌の細胞性熱安定性毒素は、リポ多糖 (LPS)である。Ｏ-抗原およびコア領域の両方がLPSの毒性活性を調節するが、エンドトキシンの生物学活性を有するのはリピドＡである(26、31)。腸内細菌(例えば、E.coli)由来のリピドＡの構造は、図１に示される。この構造は、多くのグラム陰性細菌の中に見い出され、そして毒性活性のために必要とされる最小限の構造である。置換基のいずれか1つを欠く(例えば、リン酸または脂肪アシル置換基を欠く)この分子の構造変異体は、低毒性または非毒性である(26、31)。さらに、細菌の生存能力のための最小限の構造は、２つのKdo残基を末端グルコサミン残基のC-6に付加することを必要とする(26)。近年、エンドトキシン誘導性ショックは、LPSが宿主細胞(例えば、マクロファージ)を刺激し、過剰レベルのサイトカインを産生する能力によって引き起こされれることを研究者らは見出している(３、12、23)。毒物ショックを生じるのは、これらのサイトカイン(例えば、腫瘍壊死因子(TNF)およびインターロイキンＩ (IL-1))の過剰産生である。現在、マクロファージは、２通りの考えられる機構によってリピドＡに応答するようである。第１の機構は、リピドＡとマクロファージ細胞表面上のレセプターとの相互作用を伴い、サイトカインの合成を刺激するシグナルの放出を生じる。この機構は、比較的高濃度(nM)のリピドＡによって生じる(20、25)。第２の機構は、LPS結合タンパク質(LBP)と呼ばれる血清タンパク質とリピドＡ(またはLPS)との結合を伴う。次いで、このLPS-LBP複合体は、マクロファージの表面でレセプター(CD14)と相互作用し、さらにサイトカインの合成を刺激するシグナルの産生を生じる(20、30、34、35、42)。この第２の機構は、低濃度のリピドＡ(pM)で活性である(20)。リピドＡのこの強力な生物学的活性のため、この活性の有用な用途を開発するために鋭意検討が重ねられた。第１に、細菌が生存するためには最小限の構造が必要性であるため、研究者らは、この構造の合成を阻害し、そしてそれにより抗生物質の新規クラスとして作用する化合物を合成しようとした(15、16)。これらのインヒビターは、Kdoシンターゼの活性を阻害する能力に基づく。第２に、免疫系を刺激するリピドＡの能力により、治療用抗腫瘍剤として、リピドＡおよびリピドＡ改変構造ならびにそのアナログの使用について検討され、そしてより最近では、ワクチン発生のアジュバントとしての使用が検討されている(１)。第３に、リピドＡとマクロファージとの相互作用を阻害する治療剤が、敗血症の治療法として検討されている(13)。これらの薬剤は、リピドＡの通常構造領域(コアオリゴ糖またはリピドＡ)に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり(６、７、11、13、18、28、38、41、44、45)、LBPまたはCD14タンパク質に対するモノクローナル抗体であり(２、11)、およびリピドＡとLBPまたはCD14との結合を阻害するリピドＡアナログである(17、32)。動物実験における抗体の使用は、ヒトにおけるそれらの試験を保証している。３つの異なる試験により、相反する結果が得られている。しかし、グラム陰性の敗血症を患う患者のサブセットにおいては、結果は有益かつ安全であるようであった(13)。このタイプの治療の全般的な欠点は、このような抗体を得るには高コストがかかる上に、(最近の臨床治験において得られるように)僅かな利点しか得られないことである。他の有用なアプローチは、リピドＡの毒性活性に対するアンタゴニストとしてのリピドＡアナログの使用である。いくつかの合成化合物が試験されたが(14、21、26 、27、31、37)、最も強い効力を有する化合物は、Rhodobacter sphaeroides由来のリピドＡ(17、32)およびRhodobacter capsulatus由来のリピドＡ(図２)に基づく(19)。このリピドＡは、不飽和かつ3-オキソ脂肪アシル残基を含有する点において独特であるが、非毒性であり、そしてリピドＡがインビトロアッセイにおいてサイトカインの産生を刺激する能力に対する強力なインヒビターである(17、2 2、32)。最近、この化合物の合成アナログがEisaiによって開発され(10)(図３) 、このアナログはさらにより強力なリピドＡアンタゴニストである。 LPS/リピドＡチャレンジに対する生物学的応答は変化する。エンドトキシンは効力の強い多面作用性生物学的修飾物質(biomodifer)である。エンドトキシンチャレンジに対する応答は、種、用量、部位、および経路に依存する。リピドＡの少ない用量であっても、被験体の体温の過剰な変化、血液学的、免疫学的、および内分泌学的な過剰な変化を引き起こす。致死量では、低血圧、汎発性血管内凝固症候群、不可逆性ショック、および究極的には死を引き起こす。ほとんどの動物は、グラム陰性細菌由来のリピドＡをチャレンジされた場合、好中球減少症、および熱および低血圧の急速な誘導を示す。エンドトキシンの大脳内投薬は、類似の破壊的結果のために、投与量をかなり減少することを必要とする。エンドトキシンに対する最も感受性の高い動物はヒトである。例えば、Sa lmonella abortus equi由来のわずか約２ng/kgのLPSにより、顆粒球増加症、約２℃の最高温度が上昇する７時間の発熱、および血漿コルチゾールレベルの上昇が引き起こされる。他の動物における二相性熱曲線とは反対に、ヒトの熱応答は一相性である。約100μgのLPSの用量は、ヒトの致死量である。 LPSの注射に対する公知の血液学的応答は、サイトカイン(例えば、インターロイキン１(IL-1)、インターロイキン６(IL-6)および腫瘍壊死因子(TNF))の産生を包含する。循環系へのエンドトキシンの有意な放出により、汎発性血管内凝固症候群が引き起こされる。Schwartzman反応は、エンドトキシン誘導性凝固応答の古典的な例である。Zinnser、上記、86頁を参照のこと。リピドＡは、ヒト末梢血単核細胞および好中球が、β-ヒドロキシミリスチン酸エステルにエステル化した脂肪酸を除去するアシロキシアシルヒドロラーゼによりリピドＡを脱アシル化し始めた時に、宿主から消失する。この脱アシル化により、生じた改変リピドＡの毒性が顕著に減少する。しかし、脱アシル化されたリピドＡは、LPSへのさらなる応答を調節又は中和するいくらかのアジュバント活性およびアジュバント能力を保持する。リピドＡチャレンジのための現在の治療は、ポリミキシンＢの使用を包含する。ポリミキシンＢは、LPSと複合体を形成し、そしてそれによって毒素が作用するのを防ぐと考えられている。さらに、腫瘍壊死因子に対するモノクローナル抗体が役に立ち得る。このような治療はリピドＡ中毒の破壊的効果をいくらか緩和するために役立つが、これらは完全な安全性および効果的な治療を構築しない。従って、リピドＡ関連疾患のための新規で効果的な治療の必要性が現在でも存在する。さらに、関連する毒性のない強力なアジュバントであるリピドＡの必要性が存在する。最後に、LPS関連疾患を治療または防ぐために用いられ得るリピドＡの必要性も存在する。本発明は、Rhizobium leguminosarum 次亜種 phaseoli CE3由来のリピドＡが、これらの必要性を満たすという発見を提供する。 R.leguminosarum bv.trifoliiの２つの異なる株由来のリピドＡ構造を記載している２つの報告がある(52、53)。これらの報告で提供されているリピドＡ構造は正しくない。これらの報告は両方とも、互いに異なり、そして本明細書中に記載される構造とは非常に異なる構造を記載している。さらに、本発明のリピドＡの有益な活性(例えば、本発明の新規のリピドＡおよびそのアナログを、免疫系を刺激する治療剤として、ワクチンのアジュバントとして、および敗血症を防ぎまたは治療するリピドＡアンタゴニストとして用いること)は、記載されていなかった。発明の要旨本発明は、Rhizobium leguminosarum由来の新規リピドＡ構造を提供する。さらに、本発明は、この新規リピドＡを使用して、免疫系を刺激し、被験体の毒物ショックを防ぎ、そして被験体のリポ多糖仲介疾患を治療または防ぐ方法を提供する。本発明は、Rhizobium leguminosarum 次亜種 phaseoli CE3およびアナログ由来の精製リピドＡならびにそのリピドＡの誘導体を提供する。代表的には、図13 を参照のこと。本発明のリピドＡについての一般構造式(Ａ)は以下の通りである：上記の構造について、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)_m-ＣＯＲ₄Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-であり、Ｒ₄ はＨ、Ｈ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＯ-またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-のいずれかであり、そしてｍは10、12、または14である。さらに、Ｒ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₅-(ＣＨ₂)₂₅ -ＣＯ-、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)_nＣＯＲ₆Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-(ここで、Ｒ₅はＨまたはＨ₃Ｃ-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である)のいずれかである。また、Ｒ₆はＨ、Ｈ₃Ｃ- (ＣＨ₂)₁₀-ＣＯ-またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-のいずれかであり、そしてｎは10 、12、または14のいずれかであり、そしてＲ₃はＨ、-ＰＯ₄またはであり、ここで、波線はαまたはβアルキル結合のいずれかを示す。さらに好ましい実施態様においては、上記一般構造式(Ａ)について、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀ -ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。さらにＲ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₄-(ＣＨ₂)₂₅-ＣＯ- 、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-(ここで、Ｒ₄はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＨ- ＣＨ₂-ＣＯ-である)のいずれかである。Ｒ₃はであり、ここで、波線はαアルキル結合を表し、そしてＲ₅はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂- ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。さらに、本発明は以下の一般構造式(Ｂ)を有するリピドＡのアナログを提供する：上記の構造について、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)_m-ＣＯＲ₄Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-であり、Ｒ₄ はＨ、Ｈ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＯ-またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-のいずれかであり、そしてｍは10、12、または14である。さらに、Ｒ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₅-(ＣＨ₂)₂₅ -ＣＯ-、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)_nＣＯＲ₆Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-(ここで、Ｒ₅はＨまたはＨ₃Ｃ-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である)のいずれかである。また、Ｒ₆はＨ、Ｈ₃Ｃ- (ＣＨ₂)₁₀-ＣＯ-またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-のいずれかであり、そしてｎは10 、12、または14のいずれかであり、そしてＲ₃はＨ、-ＰＯ₄またはであり、ここで、波線はαまたはβアルキル結合のいずれかを表す。より好ましい実施態様では、上記一般構造式(Ｂ)について、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。さらに、Ｒ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₄-(ＣＨ₂)₂₅-ＣＯ-、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-(ここで、Ｒ₄はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂- ＣＯ-である)のいずれかである。Ｒ₃はであり、ここで、波線はαアルキル結合を示し、そしてＲ₅はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂- ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。本発明はまた、上で示される一般構造式(Ａ)および(Ｂ)ならびにこれらのアナログにおいて示されるようなR.leguminosarum bv.phaseoli CE3由来のコアリピドＡの変異体の不均一混合物を含有する組成物を提供する。さらに、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせたリピドＡの上記のアナログ(一般構造式(Ａ)および(Ｂ))を提供する。上記組成物に加え、被験体の免疫系を刺激する方法であって、R.leguminosaru m由来の精製リピドＡ(一般構造式(Ａ)および(Ｂ)に関して上記のような)の免疫系を刺激する量を被験体に投与する工程を包含する方法もまた提供される。被験体の毒物ショックを治療または防ぐ方法であって、リピドＡ(一般構造式(Ａ)および(Ｂ)として上記で開示され、そして記載されたような)の有効量を被験体に投与する工程を包含する方法もまた開示される。最後に、被験体のリポ多糖仲介疾患を治療または予防する方法であつて、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3(一般構造式(Ａ)および(Ｂ)、およびそれに付記された文として開示され、そして記載されたような)由来のリピドＡの阻害量を、リポ多糖仲介疾患を患う被験体に投与する工程を包含する方法が提供される。図面の簡単な説明図１は、E.coliのリピドＡの構造を示す。図２は、Rhodobacter sphaeroidesおよびRhodobacter capsulatus由来のリピドＡの構造を示す。図３は、EisaiでChrisらによって合成されたリピドＡアンタゴニストの構造を示す。図４は、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3リピドＡ由来のメチル2-アミノグルコネートのTMS誘導体のe.i.-m.s(パネルＡ)およびc.i.m.s.(パネルＢ)スペクトルを示す。図５は、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3リピドＡ由来のメチル2-アミノグルコネートのN-アセチル化TMS誘導体のe.i.-m.s(パネルＡ)およびc.i.-m.s.(パネルＢ)スペクトルを示す。図６は、Kraskaメチル化によるR.leguminosarum bv.phaseoli CE3リピドＡから放出されたアシロキシアシルメチルエステルのe.i.-m.s(上)およびc.i.-m.s.( 下)スペクトルを示す。図７は、R.leguminosarum由来のリピドＡのN-アセチル化された加ヒドラジン分解生成物のNMRスペクトル(アノマー領域を示す)を示す。GalA H1(ガラクツロン酸のアノマープロトン)；GlcN H1(グルコサミンのアノマープロトン)。図８は、R.leguminosarum bv.phaseoli由来の脱-Ｏ-アシル化リピドＡのFAB-M Sスペクトル(上)を示す。下のパネルはFAB-MSスペクトルで観測される分子イオンを生じさせるアミド結合脂肪アシル置換基の可能な組み合わせを示す。2-アミノグルコネートの酸およびラクトン形態は両方とも、FAB-MSスペクトルにおそらく存在する。図９は、酸およびラクトンR.leguminosarum bv.phaseoli CE3リピドＡ構造の概要を示す。Ｒ₁およびＲ₂は、任意の示された脂肪アシル置換基であり得るが、Ｒ１は、図８に示される脂肪アシルの組み合わせを有さねばならない。図10は、さまざまなリピドＡ分子による、IL-1を産生するMNCの誘導を示す。L PS-OHサンプルは、示された生物由来の脱-Ｏ-アシル化リピドＡであり、ネガティブコントロールとして用いられる。S.friedenau LPSは、ポジティブコントロールである。図11は、さまざまなリピドＡ分子によるIL-6を産生するMNCの誘導を示す。このリピドＡサンプルは、図10について記載された通りである。図12は、さまざまなリピドＡ分子によるIL-6を産生するMNCの誘導を示す。さまざまなリピドＡサンプルの濃度範囲は、図11の濃度範囲とは異なる。リピドＡサンプルは、図10において定義された通りである。図13は、本出願の請求の範囲に記載のリピドＡの構造を示す。これらの構造は、図10に示される構造に基づく。しかし、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3リピドＡの構造に加え、図10に示される構造以外の異なる脂肪アシル基およびアシロキシアシル基を有する他の構造変異体もまた、請求の範囲に記載されている。さらに、４'位にGalＡを有する構造および有しない構造、ならびに４'位にホスフェートを有する構造および有しない構造も示される。これらの構造変異体は、脂肪アシル置換基のタイプの重要性、および生物学的活性のためのリン酸の存在 (本明細書中に記載される)に基づく強力な治療剤である。図14は、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3のパーメチル化されたリピドＡ(Ａ )またはCE309株由来のLPS(Ｂ)のからのガラクツロノシル残基のβ脱離後、およびCE309株由来のパーメチル化LPS(Ｃ)の穏やかな酸加水分解後のリピドＡグルコサミン残基の部分的にメチル化／エチル化されたアルジトールアセテートのマススペクトルを示す。図15は、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3リピドＡ由来のN-アシルTMSメチルグリコシドのCIおよびEIマススペクトルを示す(Ａ、GN-3-OH_14:O；Ｂ、GN-3-OH₁ _6:O ；Ｃ、GN-3-OH_18:O)。図16は、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3リピドＡの脱-Ｏ-アシル化において回収される脂肪酸のGLCプロファイルを示す。図17は、R.leguminosarum bv.phaseoli CE3由来の脱-Ｏ-アシル化リピドＡのグリコシル組成物および脂肪酸組成物を示すGLCプロファイルを示す。好適な実施態様の詳細な説明請求の範囲で用いられるように、そして用いられる文脈に応じて、"a"は、１またはそれ以上を意味し得る。さらに、「Rhizobium leguminosarum 次亜種 pha seoli CE3」細菌は、最近再分類され、そして「Rhizobium etli」株と改名された(54)。従って、名称「Rhizobium leguminosarum」は、「Rhizobium etli」と名付けられた細菌の株を示すことを意味し、そしてこの用語は、本明細書で交換可能に用いられることを意味する。本発明により提供される新規リピドＡ構造は、以下に開示される。詳細には、本発明は、以下の式(以後、一般構造式(Ａ)という)を含有する精製化合物を提供する：この構造式において、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＲ₄Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。さらに、Ｒ₁、Ｒ₄は、以下の部分のうちの１つである：Ｈ、Ｈ₃Ｃ-(ＣＨ₂)10-ＣＯ-またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-。また、Ｒ₁においてｍは10、12、または14のいずれかである。Ｒ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₅-(ＣＨ₂)₂₅-ＣＯ-、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂ )_nＣＯＲ₆Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-のいずれかである。さらに、Ｒ₅はＨまたはＨ₃Ｃ-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-のいずれかである。Ｒ₆はＨ、Ｈ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＯ-またはＨ₃ Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-のいずれかである。Ｒ₂において、ｎは10、12、または14である。Ｒ₃はＨ、-ＰＯ₄およびからなる群より選択され、ここで、波線はαまたはβアルキル結合のいずれかを示す。好ましい実施態様においては、本発明は以下の式を有する精製化合物を提供する：この式において、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。さらにＲ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₄-(ＣＨ₂)₂₅-ＣＯ-、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-のいずれかである。Ｒ₄はＨ₃Ｃ-ＣＨ(ＯＨ)-ＣＨ₂-ＣＯ-である。Ｒ₃ はであり、ここで、波線はαアルキル結合を示す。最後に、Ｒ₅はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂ -ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。他の実施態様では、本発明のリピドＡは以下の式(以下、一般構造式(Ｂ)という)を有する精製化合物である：この式において、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)_m-ＣＯＲ₄Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-(ここで、Ｒ₄はＨ)Ｈ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＯ-またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-のいずれかである)であり、そしてｍは10、12、または14である。次に、Ｒ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₅-(ＣＨ₂)₂₅ -ＣＯ-、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)_nＣＯＲ₆Ｈ-ＣＨ₂-ＣＯ-のいずれかである(ここで、Ｒ₅はＨまたはＨ₃Ｃ-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-であり、そしてＲ₆はＨ) Ｈ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＯ-またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₂-ＣＯ-であり、そしてｎは10、12 、または14である)。最後に、Ｒ₃はＨ、-ＰＯ₄またはであり、ここで、波線はαまたはβアルキル結合のいずれかを示す。好ましい実施態様では、本発明はさらに、以下の式を有する精製リピドＡ化合物を提供する：この実施態様においては、Ｒ₁はＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀-ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。さらに、Ｒ₂はＨ₃Ｃ-ＣＨＯＲ₄-(ＣＨ₂)₂₅-ＣＯ-、またはＨ₃Ｃ-(ＣＨ₂)₁₀ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-のいずれかである(ここで、Ｒ₄はＨ₃Ｃ-ＣＨ(ＯＨ)-ＣＨ₂- ＣＯ-である)。また、Ｒ₃はであり、ここで、波線はαアルキル結合を示す。最後に、Ｒ₅はＨ。Ｃ-(ＣＨ₂)₁ ₂ -ＣＨＯＨ-ＣＨ₂-ＣＯ-である。本発明はまた、上記で同定された(一般構造式(Ａ)および(Ｂ)ならびに付記文) 化合物の不均一混合物を含有する組成物を提供する。「不均一混合物」とは、本明細書中に開示されたR.leguminosarumの精製リピドＡアナログの１種より多くが、同じ組成物内で見いだされ得ることをいう。異なるリピドＡアナログの特定の量、比率、または数は、不均一混合物を形成するためには必要ではない。このような混合物は、本明細書中で論議される構造により記載されるように、単純に２またはそれ以上の異なるリピドＡ分子を含有する。実施例１ Rhizobium leguminosarum 次亜種 phaseoli CE3 の精製および解析バクテリアの生育。 Rhizobium leguminosarum 次亜種 phaseoli CE3は、Dale Noel博士(Marquette University，Milwaukee，WI)から入手した。バクテリアは、既述（8,24）のように、Ca²⁺を補足したトリプトン/イーストエキストラクト培地で培養した。対数期後期/静止期初期まで生育させた後、バクテリアを遠心分離して集めた。リポ多糖およびリピドＡの精製。 LPSを熱フェノール/水を用いて抽出し(39)、 RNAseで処理し、超遠心、あるいはゲル濾過により精製した(9)。ゲル濾過では、純度は、タンパク質、核酸、リン脂質および夾膜多糖ならびに細胞外多糖が存在しないことにより示される(9)。超遠心では、リピドＡは、１％酢酸水溶液(29) 中での100℃、２時間の加水分解により、LPSから遊離された。この遊離されたリピドＡを沈澱させ、遠心分離により精製した。水層を塩化メチレンで抽出し、有機層中のリピドＡを沈澱と併せた。このように、上記プロセスで精製されたリピドＡは類似のリピドＡアナログの不均一な混合物を含んでいる(以下にさらに議論する)。さらに、この特徴付け/ 精製の手順によって、また、Rhizobium leguminosarum 中には天然には存在しないような新規リピドＡアナログ（ラクトンアナログ）も提供される。グリコシル組成分析。二つの方法；アルジトールアセテートの調製とGLC-MS分析ならびにトリメチルシリル(TMS)メチルグリコシドの調製とGLC-MS分析(43)；を用いてリピドＡのグリコシル組成を決定した。アルジトールアセテートの場合には、酸性グリコシル残基のカルボキシル基を、メタノール性１Ｍ塩酸中、80℃、 2時間のメタノリシスにより還元した（メチルエステルに変換された）。溶媒を窒素気流下でエバポレートして、サンプルを10mg/mlのNaBD₄水溶液で還元した。過剰のNaBD₄を氷酢酸を数滴滴下して分解し、ホウ酸(Borate)を、メタノール：酢酸(9:1)から、エバポレーションを繰り返す（4回から5回）ことにより除去した。ついでサンプルを加水分解し、還元し、そしてアセチル化した(43)。TMSメチルグリコシドをメタノール性１Ｍ塩酸、80℃、18時間のメタノリシスにより調製し、N-アセチル化し、そしてトリメチルシリル化した(43)。分析は、15mのDB １カラム(J&W Scientific，Illinois)あるいは50mのメチルシリコーンカラム(Qu adrex Corporation)のいずれかと、アルジトールアセテートについては30mのSP2 330カラム(Supelco)を用いるGLC-MSで行った。いくつかのGLC-MS分析では、化学イオン化(CI)が必要であったが、それは、Hewlett-Packard 5985GLC-MSシステムを用い、アンモニアを反応ガスとして用いて、イオン源温度150℃で行った。脂肪酸分析。 TMSメチルグリコシドの調製のために、上記のように全脂肪酸を完全にメタノリシスして遊離させた。生じた脂肪酸メチルエステルを、上記のカラムを用いてGLC-MSで分析した。エステル結合およびアミド結合した脂肪酸は、 WollenweberおよびRietschel(40)に記載のように、無水ナトリウムメトキシドを用いてエステル結合した脂肪酸が優先的に遊離されることにより、識別された。 Kraskaメチル化を行って、アミド結合したアシロキシアシル脂肪酸を特徴づけた (40)。アミド結合した脂肪酸を、TMS N-アシルグルコサミンメチルグリコシドの調製による穏和なメタノリシス(4)により決定した。全脂肪酸を加ヒドラジン分解によりリピドＡから除去した(40)。リピドＡの脱-O-アシル化。リピドＡ調製物の一部を、ナトリウムメトキシド( 0.25M)中で、35℃、16時間、脱-O-アシル化した。リピドＡ(2〜8mg)をCHCl₃に懸濁し、無水ナトリウムメトキシド（メタノール中0.5M）を加えて、最終リピドＡ濃度を2mg/mlとした。インキュベーション後、混合物を遠心分離し（3000×g）、上清を取り出して、遊離の脂肪酸を分析した。沈澱物を再びナトリウムメトキシド(0.5M、CHCl₃なし)で処理した。二つのメトキシド処理から得られた上清を併せて、残った沈澱画分を水に溶解し、希酢酸でpH4.0の酸性にし、ヘキサン：クロロホルム(1:1,v:v)で２回洗い、残りの脂肪酸を除いた。沈澱した脱-O-アシル化リピドＡの一部をDowex 50-(H⁺)カラムを通して酸(COOH)の形に変換し、水で、ついで水:メタノール(1:1)で溶出した。グリコシル結合分析。パーメチル化アルジトールアセテートを、Yorkら(43)に記載のHakomori手順の変法を用いて調製し、Supelcoの30m SP2330カラムを用いるGLC-MSで分析した。（酸加水分解前に）パーメチル化リピドＡのβ-脱離を、ジメチルスルホキシド中の2M ジメチルスルホキシドアニオン（カリウム塩）中で一晩攪拌して、行った。β-脱離生成物は、ヨウ化エチルあるいはトリジュウテロメチルヨウ化物を用いて、それぞれ、エチル化（ヨウ化エチルを用いて）するかトリジュウテロメチル化した。アルジトールアセテートを上記のように調製し、分析した(43)。必要に応じて、パーメチル化サンプルのカルボキシメチル基を、リチウムトリエチルボロジュウテライド("Superdeuteride")(Aldrich Chemi cal Co.，Milwaukee，WI)を用いて還元した(43)。脂肪酸残基の位置を、中性条件下、シリカゲルを触媒として(46)リピドＡをジアゾメタンメチル化し、ついで、部分メチル化されたアルジトールアセテートの調製とGLC-MS分析により決定した。NMR 分光分析。サンプルを数回、D₂Oで交換し、D₂Oに溶解し、Bruker AM500 分光光度計を用いて295°Kで分析した。ケミカルシフトをHOD共鳴に対して測定し、次に、3-トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム-2,2,3,3,d₄(TSP)に対して測定した。高分解能質量分析。 VG ZAB-SE装置(VG Analytical，Manchester，UK)を用い、ポジティブモードあるいはネガティブイオンモードで8kVおよび１Maで操作するi on-Tech キセノンガンを用いて、高速原子衝突質量分析(FAB-MS)を行った。サンプル2〜10μgを、チオグリセロールをマトリックスとして用いて分析した。JEOL HX110/HX110質量分析器を用いて、ポジティブイオンモードで、ヨウ化セシウム源を用いて10kVの加速電圧で操作して、液体二次イオン質量分析(LSIMS)を行った。サンプルを、チオグリセロールマトリックスで測定した。得られたスペクトルは、JEOL補足(complement)データシステムによって記録された平均化されたプロファイルデータである。これらのスペクトルは、1分間にm/z 1から6000にスキャンし得る速度で、m/z 0-3000から得られたものであった。これらのスペクトルを得るには、フィルター速度が300Hzでほぼ1500の分解能が用いられた。電子スプレー(electrospray)質量分析(ES-MS)は、オリフィスの電位が50Vのポジティブイオンモードて操作されたSCIEX API-III質量分析器で行った。スペクトルは、1 .0 a.m.u.ステップで上昇させながら、200〜1200a.m.u.で測定された10〜15回のスキャンを集積したものである。サンプルは、1%の酢酸を含む、20%アセトニトリル水溶液に溶解し、質量分析器に3ml/分の速度で送り込まれた。組成分析。 R．leguminosarum bv phaseoli CE3のリピドＡをリン酸の存在について測定したが、検出できなかった。腸内細菌からのリピドＡとは異なって、このRhizobiumのリピドＡは、リン酸を含んでいない。TMSメチルグリコシドの分析の結果、ガラクツロン酸(GalA)、グルコサミン(GlcN)、およびグルコサミンの２分前にカラムから溶出する（当初）未同定の成分が存在することが示された。ガラクツロン酸およびグルコサミンは、補正していない全イオン流(TIC)ピークの面積で測定して、1.00:0.79の比率で存在した。ガラクツロン酸の存在は、穏和なメタノリシス、NaBD₄を用いるカルボキシメチルエステルの還元、アルジトールアセテートの調製、およびGLC-MSによる分析で確認された。このGLC-MS分析の結果、２個の重水素原子をC-6位に有するガラクトースのアルジトールアセテート(フラグメントイオン m/z 219,291,および 3 63)の存在が認められ、それによって、リピドＡサンプル中にガラクツロン酸が存在することが証明された。上記のように、TMSメチルグリコシド分析の結果、グルコサミンの２分前に溶出する未同定の成分が示された。このTMSおよびN-アセチル化TMS誘導体のGLC-MS (CI)分析のマススペクトルは、それぞれ、図４および５に示すものとなった。N- アセチル化したTMS誘導体およびN-アセチル化していないTMS誘導体の電子衝撃(e .i.)マススペクトルおよび化学イオン化(c.i.)マススペクトルは、この成分が2- アミノグルコン酸(GlcN-onic 酸)のTMSメチルエステルであることと一致する。これらのデータは、2-アミノグルコン酸の標品(Sigma Chemical Co.，St．Louis ，MO)と同一であった。さらに、サンプルに、穏和なメタノリシス(メタノール性 0.5M HCl、80℃、2時間)、NaBD₄を用いるカルボキシメチル基の還元、加水分解( 2Mトリフルオロ酢酸(TFA)、100℃、1時間)およびアルジトールアセテートの調製を行ったときに、グルコサミンのアルジトールアセテートの存在が予想通り見出された。生じたグルコサミニトールアルジトールアセテートのマススペクトルは、m/z 145および85、146および86にイオンを与えた。前者のイオン、（すなわち、m/z 145および85）は、C-1の一つの重水素原子から生じ、これらのイオンを与える分子がグルコサミンから生じることを示している。後者のm/z 146および86 イオンは、C-1の二つの重水素イオンから生じ、この第二の分子が2-アミノグルコン酸から生じることを示している。m/z 145と146イオンの相対的な強度は、グルコサミン：２−アミノグルコン酸の比が1:1であることを示唆していた。その後、この比率は、標品のグルコサミンと2-アミノグルコン酸を用いるGLC-MS分析により、正確な応答係数を得て、証明された。リピドＡの脂肪酸分析の結果、β-ヒドロキシミリスチン酸、β-ヒドロキシパルミチン酸、β-ヒドロキシステアリン酸、β-ヒドロキシペンタデカン酸、および27-ドロキシオクタコサン酸(それぞれ、3-OH-C_14:O、3-OH-C_15:O3-OH-C_16:O3- OH-C_18:Oおよび27-OH-C_28:O)が存在することがわかった。これらの脂肪酸はこのリピドＡにあることが個々に報告されている(5,8)が、他のR.leguminosarum株からのリピドＡも同様であった。リピドＡの組成を表１に示す。モルに基づくと、１モルのグルコサミンあたり、合計で５つの脂肪酸鎖が存在した。しかし、この脂肪アシル残基の数は少し少ないが、それは、用いたメタノリシス手法ではN-結合脂肪酸を定量的に遊離しないからである。全脂肪酸を、エステル結合した脂肪酸を除いた後に見られる脂肪酸と比較すると、β-ヒドロキシパルミチン酸とβ-ヒドロキシステアリン酸はアミド結合だけであるのに対し、β-ヒドロキシミリスチン酸はアミド結合およびエステル結合の両方であり、27-ヒドロキシオクタコサン酸基は2-アミノグルコン酸残基のO-5 位に位置することが強く考えられるが、β-ヒドロキシペンタデカン酸と27-ヒドロキシオクタコサン酸は、エステル結合だけであった。しかし、27-ヒドロキシオクタコサン酸基はまた、2-アミノグルコン酸残基のO-3またO-4位に、あるいはグルコサミン残基のO-3位にも位置し得る。それにもかかわらず、本願発明のどの単一のリピドＡアナログにも27-ヒドロキシオクタコサン酸基はたった一つしかない。エステル結合した脂肪酸の除去に加えて、β-ヒドロキシアシロキシルアシル置換基のメトキシド処理の結果、β-脱離による不飽和脂肪酸が生産される(40) 。これは、SalmonellaからのリピドＡ(ポジティブコントロールとして分析)で観察されたのに対して、このRhizobiumのリピドＡからはこのような不飽和脂肪酸は生産されなかった。従って、RhizobiumのリピドＡは、エステル化されてβ-ヒドロキシ脂肪酸となるアシロキシ置換基を含んでいない。アミド結合した脂肪酸は、また、穏和なメタノリシス、トリメチルシリル化およびGC-MSによる分析により同定された。この方法では、すべてのエステル結合した脂肪酸が遊離され、グリコシド結合が切断されるが、アミド結合した脂肪酸残基は遊離されない(4) 。この方法は、N-アシルグルコサミン残基の３つの型：β-ヒドロキシミリスチルグルコサミン、β-ヒドロキシパルミチルグルコサミン、およびβ-ヒドロキシステアリルグルコサミン、のTMS-メチルグリコシドを生じた。この結果は、この RhizobiumのリピドＡは(現在は精製されたが)、アミド結合した脂肪酸残基に関して、不均一（あるいはわずかに不均一）であることを示している。これは、β -ヒドロキシミリスチン酸が唯一のアミド結合した脂肪酸である腸内細菌からのリピドＡとは異なっている。 Kraskaメチル化方法を用いて、アミド結合したアシロキシアシル残基を同定した。この方法は、たった一つのアシロキシアシル残基；27-(β-ヒドロキシブトキシ)-オクタコサン酸の結果を示した。この残基のメチルエステルの電子衝撃マススペクトルを図６に示す。以前の結果が27-ヒドロキシオクタコサン酸がエステル結合していることを示唆したので、この結果は、この長鎖脂肪酸がKraskaメチル化により切断されることを示唆している。グリコシル結合分析。プレメチル化、ガラクツロン酸のカルボキシメチル基の還元、ならびにアルジトールアセテートの調製により、末端結合したガラクツロン酸と4-O-置換グルコサミンが1:1の比で生じた。2-アミノグルクロン酸の部分的にメチル化されたアルジトールアセテート誘導体は観察されなかった。この残基は不安定で、メチル化の過程で分解されることが考えられる。ガラクツロン酸がグルコサミンのO-4位に結合していたことは、パーメチル化、β-脱離、およびエチル化でアルジトールアセテートに変換することよって証明された。部分的にメチル化されたエチル化アルジトールアセテートを調製し、GC-MSで分析した。エチル基がC-4位に位置した、グルコサミンの部分的にメチル化されたエチル化アルジトールアセテートが観察され、そのマススペクトルは、m/z 217、203、175 および159の主フラグメントを示した。このように、末端ガラクツロノシル残基は、リピドＡの炭水化物骨格のグルコサミノシル残基のO-4位に結合していた。リピドＡ骨格に対するコアオリゴ糖の付着部位は、CE3の変異体CE309株由来のインタクトなLPSのメチル化分析により決定された。この変異体は、O鎖多糖を欠き、そして改変されたコアオリゴ糖を有するLPSを産生する(47)。このLPSのメチル化は、グルコサミンが4,6-ジ-O-置換残基として存在することを示した(データは示さず)。パーメチル化、次いでβ脱離、エチル化およびアルジトールアセテート誘導体化の結果、N-アセチル-N-メチル-1,5,6-トリ-O-アセチル-3-O-メチル -4-O-エチルグルコサミニトールを生じた。この誘導体のO-4位の単一のエチル基の存在は、再び、ガラクツロノシル残基が4,6-結合グルコサミンのO-4位から「 β-脱離」したことを示し、コアオリゴ糖がこのグルコサミノシル残基のO-6位に結合したに違いないことを示唆する。コアオリゴ糖のこの位置でのリピドＡへの結合は、Kdoグリコシド結合を選択的に切断する条件での穏和な酸加水分解(0.2M TFA、70℃で30分間)後のパーメチル化されたカルボキシメチル還元LPSのエチル化により確認された。この手順の間、リピドＡ骨格上で(穏和な酸加水分解に起因して)新たに露出した水酸基はエチル化される。部分的にメチル化されたエチル化アルジトールアセテートの調製および分析は、N-アセチル-N-メチル-1,4, 5-トリ-O-アセチル-3-O-メチル-6-O-エチルグルコサミニトールを生じた(図14B) 。O-6位におけるエチル基の存在は、この位置が、インタクトのLPS中では、穏和な酸に不安定な基、おそらくコアオリゴ糖のKdo残基で占められていたことを示した。リピドＡ糖骨格の脂肪酸置換は、中性条件下のシリカで触媒されるメチル化(4 6)、次いでカルボキシル基還元、およびアルジトールアセテートへの転化により決定された。この手順は、脂肪アシルまたはグリコシル残基によりブロックされていないすべての水酸基をメチル化する。得られるグルコサミン誘導体は、O-6 位だけがメチル化され、この残基が、O-3位で脂肪酸エステルにより置換されたことを示す。多くのガラクツロノシル残基のメチル化誘導体もまた、おそらくはメチル化に起因して(undermethylation)観察された。すべての可能な位置(即ち、O-2、O-3、および/またはO-4)でメチル基を有する誘導体が存在し、ガラクツロノシル残基がアシル化されていないことを示した。リピドＡ中のアミド結合脂肪酸を、穏和なメタノリシス、トリメチルシリル化、およびGLC-MSによる分析により調査した。この手順は、すべてのエステル結合脂肪酸を遊離させ、そしてグリコシド結合を切断するが、アミド結合脂肪アシル残基は遊離させない(４)。３つの型のN-アシルグルコサミン残基のTMSメチルグリコシド観察された：TICピーク領域から測定したとき1.00：0.28:0.07の比で存在する、N-β-ヒドロキシミリスチルグルコサミン(GlcN-[3-OH-C_14:O])、N-β- ヒドロキシパルミチルグルコサミン(GlcN-[3-OH-C_16:O])、およびN-β-ヒドロキシステアリルグルコサミン(GlcN-[3-OH-C_18:O])。これらのN-アシルグルコサミンメチルグリコシドを、EIおよびCI質量分析法により特徴付け、そしてTMSメチルグリコシドのスペクトルを図15に示す。GlcN-[3-OH-C_14:O]、GlcN-[3-OH-C_16: _O ]、およびGlcN-[3-OH-C_18:O]に対して観察される分子イオン(M+H)⁺は、それぞれm/z 708、736および764であった。EIスペクトルでは、特徴的なフラグメントイオンは、C-1、C-2およびC-3を含む。これらフラグメントイオンの構造および起源は、他のTMS NアシルGlcNメチルグリコシドについて報告された構造および起源(48)に一致する。C-2およびC-3を含むフラグメントイオン(即ち、GlcN-[3-O H-C_14:O]、GlcN-[3-OH-C_16:O]、およびGlcN-[3-OH-C_18:O]それぞれに対するm/z 429、457および485)は、C-2における脂肪酸置換の性質を示す。アシルケテンイオンの反発は、m/z131の形成を生じる。これらの結果は、R.leguminosarum bv.p haseoliリピドＡは、アミド結合脂肪酸が3-OH-C_14:Oのみある腸内細菌由来のリピドＡとは異なり、グルコサミンN-アシル置換基に関して不均一であることを示す。アミド結合アシロキシアシル残基を同定するために、Kraskaメチル化を実施した。この手順の結果、唯一のアシロキシアシル残基を生じた；そのマススペクトルである図６は、27-O-(β-ヒドロキシブトキシ)-C_28:Oに一致する。GLC-MS(CI) による分析は、m/z 572の(M+NH₄)⁺イオンを与えた。EIスペクトルは、m/z 59および101のイオンを示し、それは、長鎖脂肪酸の27-ヒドロキシ位置におけるβ- ヒドロキシブチレート置換基に一致する。トリジュウテリオメチルヨウ化物の存在下でKraskaメチル化を実施したとき、これらイオンは、それぞれm/z 62および 104にシフトし、β-ヒドロキシ酪酸置換基のトリジュウテリオメチル化とまた一致した。このアシロキシアシル残基を完全メタノリシスに供し、次いで脂肪酸メチルエステルのトリメチルシリル化を行った。27-O-TMS-C_28:Oのみが検出され、 27-水酸基が、おそらくはβ-ヒドロキシ酪酸によるその置換のためKraskaメチル化によりメチル化されなかったことを示した。β-ヒドロキシ酪酸のTMSメチルエステルは揮発性が高く、そしておそらくは試料調製の間のその損失により観察されなかった。以下に述べるO-エステル結合のアルカリ切断は、27-OH-C_28:OがリピドＡ骨格にアミド結合ではなくエステル結合していることを示し、他のエステル結合脂肪酸ではなくこの長鎖脂肪酸エステルがKraskaメチル化により切断されることを示唆した。リピドＡの脱-O-アシル化。リピドＡの脱-O-アシル化は、遊離脂肪酸を含むメタノール性上清、および脱-O-エステル化リピドＡからなる沈澱を生じた。トリメチルシリル化およびGLC-MSによる上清の分析は、それは炭水化物を含まず、遊離の脂肪酸：3-OH-C_14:O、3-OH-C_15:O、3-OH-C_16:O、3-OH-C_18:O、および27-OH -C_28:Oを含むことを示した。沈澱脱-O-アシルリピドＡの全脂肪酸分析(4M TFA、４時間、100℃)は、それが３つの脂肪酸、3-OH-C_14:O、3-OH-C_16:O、および3-OH -C_18:O、のみからなることを示し、これらがリピドＡ分子中のアミド結合脂肪酸であることを示した。さらに結果は、3-OH-C_14:O、3-OH-C_16:O、および3-OH-C₁₈ _:O の一部がまたO-エステルにも付着していることを示し、他方、実質的にすべての27-OH-C_28:Oおよび3-OH-C_15:Oがナトリウムメトキシドにより遊離され、従って、専らエステル結合であることを示す。エステル結合脂肪酸およびアミド結合脂肪酸の相対量を表IIにまとめ、そして脱-O-アシル化の間に回収された脂肪酸のGLCプロファイルを図16に示す。β-ヒドロキシ脂肪酸を含むアシロキシアシル置換基が存在する場合、メトキシド処理により、β脱離に起因して不飽和脂肪酸が生成した(40)。これはSalmonellaからのリピドＡについて(ポジティブコントロールとして分析された)観察されたが、そのような不飽和脂肪酸はこのRhizobi umリピドＡからは生成されなかった。このように、RhizobiumリピドＡは、β-ヒドロキシ脂肪酸を含むアシロキシアシル残基を含んでいない。別の分析では、脱-O-アシル化リピドＡの部分について、総メタノリシス、N- アセチル化、およびトリメチルシリル化を行い、得られる誘導体のGLC-MS分析を行った(図17)。上記の脂肪酸に加えて、炭水化物成分は、ガラクツロン酸および N-アセチルグルコサミンのTMS-メチルグリコシド、およびN-アセチル-2-アミノグルコン酸のメチルエステルとして同定された。確実な標品について測定された応答係数を用いて計算されたモル比は、それぞれ1.00：0.82：0.72であった。脱-O-アシルリピドＡの穏和なメタノリシス、次いでトリメチルシリル化およびGLC-MS分析により、インタクトのリピドＡで観察された比に一致する比で３つのN-アシルグルコサミン誘導体が存在することを確認した：(GlcN-[3-OH-C_14:O] 、GlcN-[3-OH-C_16:O]、およびGlcN-[3-OH-C_18:O]、1.00:0.26:0.13)。結果は、上記で述べたデータ、すなわち3-ヒドロキシ14、16、および18炭素鎖脂肪酸がアミド結合し、そしてRhizobiumリピドＡのアミド結合脂肪酸は不均一であることを裏づけた。 2-アミノグルコン酸のN-アシルTMS誘導体は、観察されなかった。これは、おそらく、この化合物上のN-アシル置換基が比較的高い程度で酸に不安定であることによると思われる。標品のN-アセチルグルコサミンおよびN-アセチル-2-アミノグルコネートに対するメタノリシス速度の比較は、80℃で１時間後、10%のN- アセチル基がGlcNAcから切断され、その一方、実質的に100％のN-アセチル基が、N-アセチルグルコネートから除去されることを示す。FAB-MS およびNMRによる加ヒドラジン分解産物の分析。無水ヒドラジン中のR.l eguminosarumリピドＡの加ヒドラジン分解の後N-アセチル化を行い、得られる産物をポジティブFAB-MSおよびNMRの両方により分析した。ポジティブFAB-MSは、m /z 436に主要フラグメントイオンを有するm/z 655の分子イオン((M+H)⁺)を示す。この開裂パターンは、ガラクツロン酸のN-アセチル化ヒドラジド、N-アセチル化グルコサミン残基、およびN-アセチル化2-アミノグルコノラクトン残基からなる三糖に一致する。フラグメントイオンm/z 436は、この三糖のN-アセチル化Gal A(ヒドラジド)-GlcNAc二糖成分に起因する。このデータは、ガラクツロノシル残基がこのリピドＡではグルコサミンに末端で結合し、そしてグルコサミン残基が、順番に、2-アミノグルコン酸に結合することを示す上記のメチル化の結果と一致する。2-アミノグルコン酸の結合は調査中である。この残基は、メチル化手順に特に不安定である。しかし、このリピドＡに対する前駆体がこの位置で2-アミノグルコネートよりむしろ6-結合グルコサミンを含み、しかもこのグルコサミン残基が後に2-アミノグルコネートに転化されることはかなり確実である。従って、この2-アミノグルコネート残基は、C-6で結合され得る。さらに、この結合はまた、2-アミノグルコン酸のC-3またはC-4位置で生じ得、そしてこれらの例は、本明細書で特に予期される。加ヒドラジン分解産物のNMR分析(図７)は、２つのアノマー共鳴を示す。d 5.5 5(J₁₂=3.4 Hz)での共鳴は、a-結合ガラクツロノシル残基のH-1に一致する。d 4. 51(J₁₂=8.6 Hz)での共鳴は、β-結合グルコサミン残基のH-1に一致する。小さなカップリング定数を有する約d 4.59での共鳴は、ガラクツロノシル残基のH-4に帰属され得る。これらの結果は、この三糖におけるGalAおよびGlcN残基がそれぞれα-およびβ-結合であることを示す。脱-O-アシル化リピドＡのFAB-MS分析。リピドＡの一部分をメトキシドを用いて脱-O-アシル化した(40)。得られる産物の組成分析は、ガラクツロン酸、グルコサミン、2-アミノグルコン酸、β-ヒドロキシミリスチン酸、β-ヒドロキシパルミチン酸、およびβ-ヒドロキシステアリン酸の存在を示す。FAB-MSスペクトルは図８に示される。分子イオンは、図８に示される構造と一致する。分子の酸型およびラクトン型の両方が存在する。データはまた、N-脂肪アシル残基で起こる不均一性を確証する。２つの組み合わせ：すなわちβ-ヒドロキシミリスチルとβ-ヒドロキシパルミチル置換基、およびβ-ヒドロキシミリスチルとβ-ヒドロキシステアリル置換基が可能である。グルコサミン残基上に３つすべての脂肪酸が存在し得ることが知られているので(４)、この結果は、2-アミノグルコン酸残基のアシル化は等しく不均一であることを示唆する。構造分析の要約。上記のすべてのデータは、R.leguminosarum由来のリピドＡについて図９で示される構造を支持する。比較のために、E.coliリピドＡの構造を図１に示す。RhizobiumリピドＡは、いくつかの局面でE.coliリピドＡと異なる：１．リン酸がなく、そしてリン酸ではなく、GalA残基がグルコサミン残基の4' 位置に存在する。２．還元末端は、グルコサミンに代わって2-アミノグルコネート残基からなる。３．N-脂肪アシル化パターンには不均一性がある。４．β-ヒドロキシ脂肪酸上に位置するエステルーまたはアミド-結合アシロキシアシル置換基は存在しない。５．非常に長鎖である脂肪酸27-ヒドロキシオクタコサノエートがRhizobiumで見い出されるが、E.coliリピドＡでは見い出されず、そしてアシロキシ置換基としてβ-ヒドロキシブトキシ基を含み得る。図９Ｂはまた、このリピドＡのβ-2-アミノグルコネート残基のラクトン型(GlcN -オノ-ラクトン)に起因して存在する構造を示す。これらのラクトン型は、このリピドＡの単離の間に形成されるようである。しかし、これらの新規ラクトン型は、当業者によれば、天然リピドＡに対するそれらの類似性に基づいて、被験体において類似の全身応答を起こすことが予期され得る。Rhizobium 種の比較。いくつかの他のR.leguminosarum bv．viciac、trifolii およびphaseoli株由来のリピドＡの組成分析は、それらが同じ構造であり得ることを示唆する。３つすべての次亜種を代表する株由来のリピドＡは、本明細書で記載されるR.leguminosarum bv．phaseoliリピドＡに存在するのと同じ脂肪アシル残基を含む；しかし、幾分量的な変動が認められる(５)。さらにこれらのリピドＡのすべてはリン酸を欠き、そしてガラクツロン酸、グルコサミン(５)および 2-アミノグルコネートを含む。これら３つの次亜種の種々の株からのLPSの穏和な酸加水分解により遊離されるコアオリゴ糖は同一の構造を有することもまた示されている(47、49-51)。従って、他のR.leguminosarum LPSのコアオリゴ糖-リピドＡ領域は共通構造を有するらしい。 R.leguminosarum bv．trifolii ANU843由来のリピドＡは、グルコサミンまたはリン酸を含まないが、N-アシル化27-OH-C_28:Oであり、そしてβ-ヒドロキシミリスチン酸で3-O-アシル化されている2-アミノグルクロン酸からなることが報告されている(53)。しかし、R.leguminosarum bv．trifolii ANU843由来のリピドＡの組成分析はこの構造に対する証拠を示さなかった。しかし、この株由来のリピドＡは、本明細書で述べたR.leguminosarum bv.phaseoli CE3についてのリビドＡと構造が同じであることが測定された。これらのデータの不一致に対して部分的な説明がある。第１に、グリコシル組成を測定するための先行する報告(53)で記載された手順は、グルコサミン残基由来のN-アシル基を遊離しない可能性があり、そしてそれ故、グルコサミンの見かけ上の欠如を説明し得る。第２に、穏和なメタノリシスおよびNaBH₄還元後のグルコサミン量の報告された(53)増加は、2-アミノグルクロン酸の存在のためではなく、2-アミノグルコノシル残基の減少の結果であり得る。これらの研究者(53) が彼らのリピドＡ調製物中にガラクツロン酸を観察しなかったこと、または27-O H-C_28:Oがエステル結合ではなくアミド結合であるという彼らの観察は驚きである。第２の報告は、ポーランドで単離されたR.trifolii株由来のリピドＡの構造が、１位および４'位でビス-ホスホリル化されたより一般的なβ-1,6-グルコサミン二糖骨格からなると記載する(52)。調査したいかなるR.leguminosarum株でもそのような構造の証拠はない。しかし、ポーランドから単離された株はまだ調べていない。最近、R.leguminosarum bv.phaseoli株は、(16S RNAホモロジー研究に基づいて)R.etliとして再分類された(54)。従って、ポーランドで単離されたR .trifolii株は、本明細書で開示されるR.leguminosarum株とは異なるRhizobium 種である可能性がある。16S RNAを用いるホモロジー研究は、これらR.leguminos arum株のポーランドR.trifolii株に対する関係を明瞭にする助力となり得る。腸内細菌由来のリピドＡの場合、1,4'-ビスホスホリル化β-1,6-結合グルコサミン二糖のリン酸置換基が、細菌の生存率に対して決定的であり、そして、脂肪アシル化パターンの型とともに、リピドＡ分子の免疫刺激および毒性の性質を決定する(31、55)。2-アミノグルコン酸およびガラクツロン酸残基のカルボキシ基は、これらのリン酸基を機能的に置換し得る。リン酸の欠如に加えて、本発明の RhizobiumリピドＡは、腸内細菌由来のリピドＡと比較したとき、異なる脂肪アシル化パターンを有する。実施例２ Rhizobium leguminosarum リピドＡによるIL-1およびIL-6の刺激インターロイキン(IL)1および6の精製。本明細書中で考察する新規リピドＡが、免疫システム(すなわち、IL-1およびIL-6の産生)を刺激する能力をインビトロアッセイで、単核細胞(MNC)を用いて測定した。手順を、先述された手順(21、22 )を利用して、Dr.Ernst Rietschelの研究室、Forschungsinstitut fur Medizin ，Borstel，Germanyにおいて実施した。図10は、R．leguminosarumリピドＡによる、IL-1を放出するMNCの刺激を示す。上のパネルは、リピドＡ(完全なLPSではない)が、ポジティブコントロール(S. friedenau由来のLPS)と同じ濃度の範囲においてIL-1の放出を刺激し得たが、低濃度ではS.friedenauのLPSよりも活性が低いことを示す。図11は、R．leguminos arumリピドＡおよびLPSによるIL-6産生の刺激を示す。結果は、IL-6刺激のレベルがIL-1刺激のレベルよりもかなり低く見える以外は、IL-1で見られた結果(図1 0)と同様である。図12は、IL-6の刺激を試験する第２の実験の結果を示す。この実験において、RhizobiumリピドＡは、高濃度の範囲中で、ポジティブコントロール(S.friedenauのLPS)と同様に効果的であるように見えた。しかし、ポジティブコントロールとは異なり、RhizobiumリピドＡによる刺激は、S.friedenauに由来する刺激よりもかなり濃度依存性であり、１mg/mL未満の希釈では活性が急速に低下するのに対してS.friedenauのLPSは、0.1ng/mLの低濃度でも活性が残存した。上記の実験は、RhizobiumリピドＡ(LPSではない)が、MNCからのIL-1およびIL- 6の両方の放出を刺激し得ることを示す。リピドＡは、IL-6よりもIL-1を放出する刺激がより活性であり、そしてRhizobiumリピドＡの活性濃度は、S.friedenau 由来のLPSと比較してより高い濃度範囲にある。図９は、RhizobiumリピドＡが、E.coliのリピドＡとは構造が非常に異なることを示す。これらの構造変異体は、エンドトキシンの免疫刺激特性および毒性に必須であるそれらの成分(すなわち、リン酸および脂肪アシル置換基)を含む。修飾リピドＡおよび合成分子の分析によって、１位および４'位の両方におけるリン酸基(26、31)、アシロキシアシル脂肪酸の存在(26、31)、および脂肪酸の鎖長(26、31)が、これらの分子の生物学的活性の決定に重要な役割を担うことが、十分に確立されている。本明細書中において記載する本発明の新規の精製リピドＡアナログ、および不均一混合物はまた、ワクチン調製物の抗原性を増強する方法においても使用され得、この方法は、ワクチン調製物に、適切な量の新規リピドＡのアナログまたはその脂質自身のいすれかを添加することを包含する。さらに、被験体の免疫システムを刺激する方法においてリピドＡ由来のLPSを使用する方法を提供し、この方法は被験体に免疫システムを刺激する量のR．leg uminosarum由来の精製LPSを投与することを包含する。特に、この細菌のリピドＡは、IL-1の産生量を増加することが示されている。さらに、本発明のリピドＡは、IL-1およびIL-6の産生量の増加を刺激するために使用され得る。アンタゴニズムの機構。エンドトキシンがCD14細胞表面レセプターとの直接的な相互作用を介して作用し、および／または最初に血清タンパク質、LPS結合タンパク質(LBP)と結合し、次いでLPS-LPB複合体がCD14レセプターにより認識されることを示す証拠がある。これらの相互作用は、シグナル伝達カスケードを誘発し、このシグナル伝達のカスケードは最終的にサイトカインの産生を生じる。伝達工程の生化学的根拠は完全には定義されていない。LPSアンタゴニストが、表面レセプター、LBPに対するLPSの結合を阻害することにより、またはLPS-LBP複合体のCD14に対する結合を阻害することにより作用すると考えられている。しかし、リピドＡ上のリン酸部分が、最大の毒性に必要とされ、そしてまた、表面レセプターまたはLBPに結合するために最適な３次元構造および／またはCD14に対するリピドＡ-LBP複合体が生じる。他のLPS仲介疾患の処置。他のLPS仲介疾患は、本発明の精製アナログを用いて処置され得る。例えば、ライム病(Borrelia burgdorferi)は、罹患体の自己免疫様応答の原であるLPS(またはエンドトキシン)を有すると考えられている。他のL PS仲介疾患は、治療可能であると当業者に容易に認識される。処置方法本発明の組成物を用いて被験体の敗血症ショックを処置する方法を提供する。例えば、このような方法の１つにおいて、ある量のRhizobium leguminosarumの精製リピドＡを被験体に投与し、この精製リピドＡは敗血症に関連するグラム陰性細菌の脂質結合タンパク質と特異的に競合する。この阻害が生じ得る１つの様式では、この精製リピドＡがタンパク質またはレセプターに関連する適切な免疫系に結合し、それゆえLPS結合タンパク質と毒性リピドＡとの間の結合の形成を阻止する。別の可能な阻害の機構は、このリピドＡがレセプター(例えば、マクロファージ上のCD14レセプター)に結合することに起因し、毒性の低い(および潜在的に非毒性な)リピドＡが利用可能なレセプター部位を塞ぎ、それゆえ低い重篤度の全身応答を引き起こす。本発明の精製リピドＡアナログは、経口的、非経口的(例えば、静脈内)、筋肉内注射、腹腔内注射、局所的、経皮的などによって投与され得るが、特に急性のエンドトキシン中毒症(endotoxicosis)の場合においては、非経口的な静脈内投与が代表的に好ましい。必要とされるこのようなリピドＡアナログの正確な量は、被験体間で変化し、人種、年齢、体重および被験体の全身症状、処置される疾患の重篤度、使用される特定の化合物、その投与の様式などに依存する。従って、正確な量を特定することは不可能である。しかし、およその量は、本明細書中の教示により与えられ、そして通常の実験および当該分野において公知の最適化手順のみを用いて、当業者により決定され得る。一般的に、投薬量は、代表的には標的細胞のLPSまたはリピドＡの活性化に適切であるような量に近く(一般的にはng/kg範囲中で)、好ましくは約0.0001mg／患者〜600mg／患者の範囲に近い。より好ましい範囲は、約0.001mg／患者〜350mg／患者である。最も好ましい範囲は、0.01mg／患者〜100mg／患者である。しかし、当業者は容易に他の投薬量の範囲および処方を解明し得、上記が限定されないことを明らかに意図する。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(最新版)を参照のこと。意図される投与様式に依存して、本発明のリピドＡアナログは、好ましくは、正確な用量の単回投与に適切な単位剤型て、固体、半固体または液体の剤型(例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁液、ローション、クリーム、ジェルなど)における薬学的組成物中に存在する。組成物は上述したように、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた効果量の選択化合物を含有し、そしてさらに、他の医薬品、製薬、キャリア、アジュバント、希釈物などを包含する。「薬学的に受容可能」とは、生物学的に（または他の意味でも）望ましくない物質ではないことを意味する。すなわちこの物質は、選択化合物とともに、所望でない生物学的効果を引き起こすことなく、または含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく投与され得る。固体組成物について、従来の非毒性固体キャリアは、例えば、製薬用のマンニトール、ラクロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、カルボン酸マグネシウムなどを包含する。薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書中に記載される活性な化合物および必要に応じて薬学的アジュバントを賦形剤(例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど)中に溶解し、分散することなどによって溶液または懸濁液を形成することにより調製され得る。所望であれば、投与しようとする薬学的組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化剤(例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレイン酸など )などのような非毒性の補助基質も包含し得る。このような剤型を調剤する実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかである；例えば、Remington's Ph armaceutical Sciences(最新版)を参照のこと。経口投与のために、微散剤または顆粒剤（希釈剤、分散剤、および／または表面活性剤を含み得る）が、水またはシロップ中に存在し得、乾燥状態でカプセルまたは小容器中にで存在し得、あるいは非水性溶液または懸濁液(懸濁剤が含まれ得る)中に存在し得、錠剤(結合剤および潤滑剤が含まれ得る)中に存在し得、または水またはシロップの懸濁液中に存在し得る。所望または必要とされる場合、香料、保存剤、懸濁剤、増粘剤、または乳化剤が含まれ得る。錠剤および顆粒剤が経口投与形態に好ましく、そしてこれらはコートされ得る。非経口投与が使用される場合、これは一般的に注射により特徴づけられる。注入物質(injectable)は、従来の剤型(注射前に液体中に溶液または懸濁液に適した液体溶液または懸濁液、固体形態として、または乳化液のいずれかとして)で調製され得る。極最近改訂された非経口投与のアプローチは、遅延放出システムまたは除放システムの使用を包含し、これにより一定レベルの用量が維持される。例えば、米国特許第3,710,795号を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される。ワクチン本発明のリピドＡアナログは、免疫原性量のリピドＡアナログ(単数または複数)および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンの構築に使用され得る。ワクチンは、リピドＡ全体(またはその不均一混合物)またはその免疫原性部分であり得る。ワクチンはまた、他のリピドＡアナログに対する抗体と潜在的に交差反応性でもあり得る。次いで、ワクチンは、敗血症ショックまたは他のグラム陰性細菌感染症の合併症(ライム病および潜伏性活性ウイルス感染症(例えば、 HIV-1、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびインフルエンザウイルス)のLPS仲介増悪のようなLPS仲介疾患を含む)を防止する方法において使用され得る。リピドＡアナログの免疫原性量は、標準的な手順を使用して決定され得る。簡単に述べると、種々の濃度の推定の特異的免疫反応性のリピドＡアナログが調製され、動物に投与され、そして各濃度に対する動物の免疫学的応答(例えば、抗体の産生)が測定される。本発明のワクチンにおける薬学的に受容可能なキャリアは、生理食塩水または他の適切なキャリア(Arnon,R.(編)Synthetic Vaccines I:83-92，CRC Press，IN C.，Boca Raton，Florida，1987)を含有し得る。アジュバントもまたワクチンのキャリアの一部であり得、この場合、アジュバントは使用されるリピドＡ、投与様式および被験体に基づいた標準的な基準により選択され得る(Arnon，R．(編) ，1987)。投与の方法は、経口手段または舌下手段によって、または注射によってであり得、使用される特定のワクチンまたはワクチンを投与される被験体に依存する。ワクチンが予防的モダリティまたは治療的モダリティとして使用され得ることが、上記から理解され得る。従って、本発明は、グラム陰性細菌関連性敗血症ショックおよびグラム陰性細菌関連性疾患を、被験体にワクチンを投与することにより防止または処置する方法を提供する。アジュバント本発明の新規の精製リピドＡの構造物は、ワクチン調製物においてアジュバントとして使用され得る。アジュバントとしてリピドＡは、ワクチン調製物の免疫原性に対する免疫応答を、付随する有害な反応を伴わずに増強する。全体的にまたは部分的に殺傷されたグラム陰性細菌とともにリピドＡをアジュバントとして含有するワクチン調製物は、その後の他のグラム陰性細菌由来のチャレンジに対してワクチン注射をするために使用され得る。同様に、ウイルスの免疫原に対する免疫応答が、本明細書において記載されるリピドＡの免疫刺激効果を利用して増強され得る。免疫刺激さらに、新規の精製リピドＡの構造は、免疫システムを直接刺激するために使用され得る。このような手順において、リピドＡが、免疫力の弱い(immune-comp romised)患者または被験体に対して上記のように投与される。作用機構が上述のアジュバントおよびワクチンと必ずしも同一でないことに注意することが重要である。代わりに、精製リピドＡはサイトカイン産生を直接刺激するために使用され、ここでは次いで、これらの増加されるサイトカインが免疫力が弱い患者の症状を改善する。抗体抗体は、HarlowおよびLane，Antibodies;A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Sring Harbor，New York，1988において記載されるように作製され得る。簡単に述べると、R.leguminosarum由来の精製リピドＡは、動物または他の被験体に免疫応答を導き出すに十分な量および間隔で注射され得る。抗体が直接精製され得るか、または脾臓細胞が動物から得られ得るかのいずれかである。次いで細胞は不死細胞株に融合され、そして抗体の分泌についてスクリーニングされる。抗体は、抗原を含む細胞についてサンプルをスクリーニングするために使用され得る。次いで、Rhizobium leguminosarumの存在を、抗体を使用してサンプル中で検出し得る。本発明は、その特定の実施態様の特定の詳述を参考として記載されているが、添付の請求項に含まれる本発明の範囲を除いては、このような詳述が本発明の範囲の限定であるとみなされるべきてはないことを意図する。さらに、本明細書の本文において、または以下に列挙される番号に相当する参考文献の番号を引用することにより本明細書中で引用される全ての参考文献は、その全体が本明細書において参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:41） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の式を有する精製された化合物：；ここで、R₁=H₃C=(CH₂)_m-COR₄H-CH₂-CO-であり、ここでR₄はH、H₃C-(CH₂)₁₀-CO -およびH₃C-(CH₂)₁₂-CO-からなる群から選択され、そしてmは10、12または14であり； R₂は、H₃C-CHOR₅-(CH₂)₂₅-CO-およびH₃C-(CH₂)_nCOR₆H-CH₂-CO-からなる群から選択され、ここでR₅はHおよびH₃C-CHOH-CH₂-CO-からなる群から選択され、R₆はH、 H₃C-(CH₂)₁₀-CO-およびH₃C-(CH₂)₁₂-CO-からなる群から選択され、そしてnは10 、12または14であり；そして R₃は、H、-PO₄およびからなる群から選択され、ここで波線はαまたはβアルキル結合を示す。２．以下の式を有する精製された化合物：；ここで、R₁=H₃C-(CH₂)₁₀-CHOH-CH₂-CO-であり； R₂は、H₃C-CHOR₄-(CH₂)₂₅-CO-およびH₃C-(CH₂)₁₀CHOH-CH₂-CO-からなる群から選択され、ここでR₄=H₃C-CH(OH)-CH₂-CO-であり；であり、ここで波線はαアルキル結合であり；そして R₅=H₃C-(CH₂)₁₂-CHOH-CH₂-CO-である。３．以下の式を有する精製された化合物：；ここで、R₁=H₃C-(CH₂)_m-COR₄H-CH₂-CO-であり、ここでR₄はH、H₃C-(CH₂)₁₀-CO -およびH₃C-(CH₂)₁₂-CO-からなる群から選択され、そしてmは10、12または14であり； R₂は、H₃C-CHOR₅-(CH₂)₂₅-CO-およびH₃C-(CH₂)_nCOR₆H-CH₂-CO-からなる群から選択され、ここでR₅はHおよびH₃C-CHOH-CH₂-CO-からなる群から選択され、R₆はH、 H₃C-(CH₂)₁₀-CO-およびH₃C-(CH₂)₁₂-CO-からなる群から選択され、そしてnは10 、12または14であり；そして R₃は、H、-PO₄およびからなる群から選択され、ここで波線はαまたはβアルキル結合を示す。４．以下の式を有する精製された化合物：；ここで、R₁=H₃C-(CH₂)₁₀-CHOH-CH₂-CO-であり； R₂は、H₃C-CHOR₄-(CH₂)₂₅-CO-およびH₃C-(CH₂)₁₀CHOH-CH₂-CO-からなる群から選択され、ここでR₄はH₃C-CH(OH)-CH₂-CO-であり；であり、ここで波線はαアルキル結合であり；そして R₅=H₃C-(CH₂)₁₂-CHOH-CH₂-CO-である。５．請求項１に記載の化合物の不均一混合物を含む組成物。６．請求項２に記載の化合物の不均一混合物を含む組成物。７．請求項３に記載の化合物の不均一混合物を含む組成物。８．請求項４に記載の化合物の不均一混合物を含む組成物。９．請求項１に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。 10．請求項２に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。 11．請求項３に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。 12．請求項４に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。 13．被験体の免疫系を刺激する方法であって、該被験体に免疫系刺激量の請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 14．被験体の免疫系を刺激する方法であって、該被験体に免疫系刺激量の請求項２に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 15．被験体の免疫系を刺激する方法であって、該被験体に免疫系刺激量の請求項３に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 16．被験体の免疫系を刺激する方法であって、該被験体に免疫系刺激量の請求項４に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 17．被験体の毒性ショックを処置する方法であって、該被験体に有効量の請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 18．被験体の毒性ショックを処置する方法であって、該被験体に有効量の請求項２に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 19．被験体の毒性ショックを処置する方法であって、該被験体に有効量の請求項３に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 20．被験体の毒性ショックを処置する方法であって、該被験体に有効量の請求項４に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 21．被験体の毒性ショックを防ぐ方法であって、該被験体に有効量の請求項９に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 22．被験体の毒性ショックを防ぐ方法であって、該被験体に有効量の請求項10に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 23．被験体の毒性ショックを防ぐ方法であって、該被験体に有効量の請求項11に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 24．被験体の毒性ショックを防ぐ方法であって、該被験体に有効量の請求項12に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 25．被験体のリポ多糖仲介疾患を処置するまたは防ぐ方法であって、該被験体にリポポリ糖仲介疾患阻害量の請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 26．被験体のリポポリ糖仲介疾患を処置するまたは防ぐ方法であって、該被験体にリポポリ糖仲介疾患阻害量の請求項２に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 27．被験体のリポポリ糖仲介疾患を処置するまたは防ぐ方法であって、該被験体にリポポリ糖仲介疾患阻害量の請求項３に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。 28．被験体のリポポリ糖仲介疾患を処置するまたは防ぐ方法であって、該被験体にリポポリ糖仲介疾患阻害量の請求項４に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。