JPS60120819A - 新規な免疫刺激物質とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な免疫刺激性誘導体とその製造方法、並
びに、医薬としてのその使用に関する。

周知のように、多く□のマイコバクテリウム抽出物、例
えば壁の可溶性フラクション（ＷＳＡ）及び合成による
その同等物、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、
７０インドの完全アジュバントにおけるマイコバクテリ
ウム自身のものと比較可能なアジ−バント画性を有して
いる。特にＭＤＰは、合成（Ｃ，Ｍｅｒｓｅｒほか、／
　５ｉＰ７３　ｓ　Ｂｌｏｃｈｅｍ。

ＢＩｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、ｌｒ　ｌ
ｙ　＊　／３／ｉｓ−／３２．２）によって得られるた
め、供給に制限がない点で、非常に有用であるうえに、
分子量が低く（弘２２）毒性ももたない。ＭＤＰ及びそ
の多くの誘導体の生物学的特性は、アジュバント活性、
免疫機構の一般的な刺激及び耐感染性に関係している（
　Ａ。

Ａｄａｍほかの論説、１５ＰＩ／、Ｍｏ１ＡＣｅｌｌ。

８１ｏｃｈｅｎｎ　、　ＩＩ　／　ｅ　、２７−１ｌｔ
７　；　Ｃ，Ｌｅｃｌｅｒｃ及び　Ｌ、　Ｃｈｅｄｌｄ
　の論説、ｌり♂２゜ＬｙｒｎｐｈｏｋＩｎａｓ　Ｅ−
Ｐｉｃｋ　ｅｄ−ｅ　Ａｃａｄｅｒｎｌｃ　Ｐｒｅｓｓ
ｓｖｏｌ、　７　ｅ　ｐ、２’参照）。

ムラミルイプチドは、周知のように、細網内皮糸の細胞
（マクロファージ）に試験管内で作用し、その食細胞活
性を増大させる（　Ｔａｎａｋａ　はか、ｌターフ　７
　ｍ　Ｂｌｏｃｈｅｒｎ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ＋
Ｃｏｍｍｕｎ。

７７、ｌｓ２／−６，２７）。

ＭＤＰ及び池のいろいろのミコバクテリウム抽出物は、
試験管内において、マウスの腹腔マクロファージの細胞
障害性及び細胞崩壊性の活動も増大させる（　Ｃ，Ｊｕ
ｙ及びり、　Ｃｈｅｄｌｄ　、／り７３、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．７２　＊　ＩＩ／θｊ
−４１，１０り）。

ＭＯＰが比較的低濃度（／　ＯｐＨ／　ａｄ　）におい
て試験管内で腫よう細胞に対するマクロファージの細胞
壊死効果（サイトスタテイシティ）を誘起したとしても
、生体においてのその使用は直接には可能ではない。そ
れはＭＯＰが非常にすみやかに尿中に排せつされるから
である。生物体内においてのＭＯＰの使用寿命を長くす
るために、標的細胞に対し非特異性の種々のオリゴマー
及びｙｔ？９マーがこれまでに調製されている。特に、
Ｌ、Ｃｂｅｄｌｄはか（／９７り、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７　Ａ１．３３７−６！；
乙／〕は、マルチポリマー（マルチポ！−Ｄ−Ｌ−アラ
ニンー４リーし一リジン）に結合されたＭＤＰが、改善
された耐感染性を誘起させ名が、強い発熱効果も示すこ
とを実証した。

本発明は、ムラミルベノチド及び類縁物の高分子量の新
規な共役化合物を提供することを目的としている。これ
らの誘導体は、免疫刺激ないしは免疫機構刺激物質であ
り、その成るものは、試験管内のマクロファージの腫よ
う殺をひき起こすうえに、遊離形の免疫機構刺激物ｆｆ
（Ｍ［）Ｐ％誘導体及び類縁物）よりもすぐれた活性を
示すだけでなく、遊離形の免疫刺激物質が全く示さない
生体内のマウス肺癌種の自然の転移を根絶する作用も示
す。

本発明は、より具体的には、次の一般式％式％（） （上式においてＲは、Ｎ−アセチルムラミルーペグチド
型の免疫刺激物質もしくはその類縁物の残基を表わし、 （ＬＡＭ　）は、マクロファージもしくは単核白血球の
親和性配位子の前駆物質を表わし、ＸはＲと（ＬＡＭ　
）との間の共有結合を表わすか、又は、配位子（ＬＡＭ
）にＲを結合させることを可能にする結合剤の残基を表
わし、ｍは７以上の故を表わす） によって示さＡ７）新規な誘導体を提供する。

数ｍの上限は可変であり、以下に説明するように、各々
の場合において、単に経験的に定められる。

式（１）の化合物の例として、特に次のものが挙げられ
る。

囚　ＲがＮ−アセチルムラミル−Ｌ　−Ａｔａ連ＩＩＩ
潜にＮ−アセチルムラミル−Ｌ　−ＡＬａ　−旦−イソ
−Ｇｔｎ−又はＮ−アセチルムラミル−Ｌ’　−Ａｌａ
　−９−Ｇｔｕ−を有する化合物の残基を表わすもの。

Ｒが例えばＡ、Ａｄａｍ　４２かのｗｋｌＩｉ！、／り
ざ／、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　ＩＡ
　／　、　２４ｔ　−ＩＡ　７に示されたＭｏ　Ｐ　誘
導体のうち１つのものの残基であり、特にＲが、例えば −ＭＤＰ（Ｎ−アセチルムラミル−μｍＡｔａ−見−イ
ンａｔｎ　） −ＭＯＰ（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ　−Ａｌａ−７−
インＧ１ｎ−メン−Ａ２ｐｍ　）−ＭＤＰ（Ｎ−アセチ
Ａ／　ムラミル−Ｌ　−Ａｔａ−ｐ−インＧ１ｎ−メン
−Ａ２９ｍ−ｐ−Ａｔａ）−ＭＤＰ（Ｎ−アセチルムラ
ミル−Ｌ　−Ａｔ！！！−且−インＧ１ｎ−メン−Ａ２
ｐｒｎ　−Ｄ　−Ａｌａ　−Ｄ−Ａｔａ　） の残基を表わすか、又は、アミノ＃（例えばペゾチド）
、二官能基、グルタルアルデヒドもしくはｐ−チオカル
バミル安息香酸によって置換されたムラミルペグチド残
基を表わすもの。

以上の説明において、Ａｔａ−はｔアラニル基を示す記
号であり、メン−Ａ２　ｐｒｎは、メンジアミノビメリ
ル基、インＧｔｒ１−は、イングルタミエル基をそれぞ
れ表わす。

（Ｂ）（ＬＡＭ）が次を表わすもの。

１）マクロファージもしくは単核白血球の膜状レクチン
より選択的に認識される糖共役化合物、特に次のもの。

ａ）例えば残基α−０−マンノース、６−ホスホリル、
α−Ｄ−マンノースもシくはβ−Ｎ−アセチルグルコサ
インを有するグルシド構造を備えた、自然の、もしくは
変更された糖蛋白質。自然の糖蛋白質は例えばＪ、　Ｍ
ＯＮＴＲＥＵＩＬ　著、’　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ　’　＃Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｌｓｔｒｙ　ｌ　ｖｏｌ　／　タ。

Ｂ　−２＊　Ａｌｂｅｒｔ　Ｎｅ１３ｂｅｒｇｅｒ　Ｅ
ｄ−（Ｅｌｓｅｖｌａｒ）／りｇ、２に記載されている
。

ｂ）　残基α−Ｄ−グルコピラノシド、α−Ｄ−マンノ
ピラノシド、α−Ｌ−７コピラノシド、（αもしくはβ
）一旦−ガラクトピラノシド、β一旦一ガラクトピラノ
シド、コーアセトアミドーコーデオキシー（αもしくは
β）一旦一グルプピラノシド、！−ア七ドア２ドーλ−
デオキシーα−Ｄ−ガラクトピラノシド、λ−アセトア
ミドー２−デオキシーーー９−ガラクトピラノシド、６
−ホスホリル−α−０−マンノピラノシド、もしくはα
一旦−ラムノピラノシドのうち少くとも７つを有する少
糖類又は糖（グチド。本発明に従って用いられる少糖類
は、特に、自然の糖蛋白質からエンドグリコシダーゼに
よって遊離された少糖類、又はこれらの少糖類の合成に
よる類縁物である。

周知のように、多糖類は、膜レセプターにより認識され
得るためには、少くともｊ個のオシド単位を有している
べきである。

この理由から、本発明によれば、少くともｊ個のオシド
単位を有する少糖類及びオリゴにプチド、例えば５〜７
ｇ個のオシド単位を有する少糖類及びオリデペゾチドが
用いられる。本発明に従って用いられる糖ペプチドは、
特に、自然の糖蛋白質に由来する糖ペプチドである。こ
れらの糖ペプチドは特に前出のＭＯＮＴＲＥＵＩＬほか
の著作に記載されている。これらはＭＯＮＳＩＧＮＹは
か、Ｂｕｌｌ、　Ｓｏｃ、　Ｃ旧ｍ、　８１ｏ１．　Ｖ
ｏｌ、　Ｊ’　０＊ｐｐ、Ｉｆｊ７−、ｒ♂６に記載さ
れた方法に従って、自然の糖蛋白質の酵素処理によって
製造する。しかし自然の糖蛋白質の前記酵素処理によっ
て得られるものと同様の合成もしくは半合成の糖ペプチ
ドを用いてもよい。ここでは、約束として、「糖ペプチ
ド」とは、少くとも１種のアミノａ！（後に明らかにさ
れる理由により、特にアスパラギン、セリン又はトレオ
ニンである）に結合されたグリシド連鎖により形成され
た誘導体を表わすものとする。

本発明に従って用いられる少糖類及び／又は糖ペプチド
の糖単位は、必要ならば、例えばホスフェートの形に、
部分的にエステル化されていてもよい−０ Ｃ）ネオ糖蛋白質、即ちグリシド結合によって置換され
た蛋白質。

ネオ糖蛋白質は、特にＹ、　Ｃ，ＬＥＥ及びＲ，Ｔ、　
ＬＥＥ　、　／り１ｒ　−２１ＧＩｙＣＯＣＯｎｊｕｇ
ａｔｅＧａＭ、　１．　ＨＯＲＯＷＩＴＺ　Ｅｄ、　Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　、　Ｖｏｌ、　４／−ｔ　
ｊ　７’−１３頁に示されたようにして製造する。

出発蛋白質は、好ましくは、遺伝子組成を同一とする蛋
白質、例えば血清アルブミン、リゾチーム、フェリチン
、免疫グロブリンその他である。

周知のように、自然のｍｉ白質において、グリシド連鎖
は、ｎｆ白質のアミノ酸に、例えばアス・ぐラギンに、
アミド結合を介して、マタアミノ酸アルコール（七リン
、トレオニン、ヒドロキシプロリン）にオシド粘合を介
して、それぞれ結合されている。これらの結合は、次の
部分粘合によって略記される。

アメ／４ラインとの結合 アミノ酸アルコールどの結合（セリンの場合） もちろんネオ糖ペプチドの場合には、グリシド連鎖はペ
プチド連鎖に、同一のアミノ酸を介し結合されていても
よい。これらのネオ糖ペプチドの場合、各々の導入され
たグリシド連鎖は、好ましくは、少くともｊ個のオシド
単位を有している。

蛋白質に固定されるグリシド結合の最小数は、各々の場
合に、マクロファージ又は単核白血球に対するネオ糖蛋
白質の親和性が現れる閾値によって実験的に定められる
。

この親和性は（例えばネオ糖蛋白質がｌμモル／ｌより
も低い濃度において使用される場合に）有効なエンドサ
イト−シスを可能にする十分な値とすべきである。

この数は一般にｊよりも大きい。

当業者によって理解さ□れるように、固定グリシド結合
の最大数について言うと、蛋白質上の反応性の固定ない
し定着部位の飽和に対応するもの以外に、最大の閾値は
、一般に存在しない。

グルシド結合は特に、α−Ｄ−グルコース、α一旦−マ
ンノース、α−上−７コース、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、α−Ｌ−グルコース、β−Ｌ　−ｉｆ　５クトース
、β−Ｏ−ガ２クトース、α一旦一ガラクトサミン、β
−９−ガラクトサミン、α−ふ−ラＡ／−スもＬ＜４１
６−ホスホリル−α−Ｄ−マンノースの各オシドの中か
ら選択され、蛋白質との共有結合の形成を可能とする基
、例えばインチオシアネート基、ジアゾフェニル基、チ
オエタノイル基その他から成っている。

ネオ糖蛋白質を調製するには、糖のニドｏ７ｘニル化ｍ
導体を調ｍし、二トロフェ二ＪＬＪｌフェニルー第一ア
ミンに還元することから成る。ＭＣＢＲＯＯＭ　ほか、
Ｍｅｔ。

Ｅｎｚｙｍ、、２１　、．２／Ｊ−２／　タ（ｌり７）
）に記載された方法と同様の方法を用いることができる
。この場合、第一７２ノ基をインチオシアネート基に変
換し、得られた生成物を選定された蛋白質上に固定させ
ることができ、この固定は、フェニルインチオシアネー
トを蛋白質δアミノ基と反応させてフェニルチオカルバ
ミル基を生成すせることによって行表われる。このよう
にして、フェニル第一アミノ基を対応のジアゾニウム塩
に変換することができる。次に、得られた生成物を、選
定された蛋白質に固定させることができる。この固定は
、活性芳香基を有する蛋白質の成る種のアミノ酸（特に
チロシンもしくはトリプト７アｙ）と共に、アゾ誘導体
を生成させることによって、又はリジンの場合のように
、アミノ基、アルギニンの場合のようにグアニジン基又
はヒスチジンの場合のようにイミダゾール基を含む反応
によって行なわれる。

ネオ糖蛋白質の例としては、 一チオカルバミルフェニルーα−Ｄ−１’ルコピラノシ
ド残基 一チオカルパミルフェニルーα−ｏ−ガラクトピラノシ
ド残基 −ｆオカルパミルフェニルーα−０−マンノピラノシド
残基 一チオカルバミルフェニルー２−アセトアミド−２−デ
オキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド残基 一テオカルパミルフェニルーα−Ｌ−７コビラノシド残
基 一？、ｔカルバミルフェニルーα−Ｄ−ガラクトピラノ
シド残基 一チオカルノクミルフェニルーα−Ｌ−５ムノピ２ノシ
ド残基 一チオカルパミルフェニルー６−ホスホリルα一旦一マ
ンノビラノシド残基 −チオカルパミルフェニルー２−アセトアミド−コープ
オキシ−α−Ｄ−ゲルコピ２ノシド残基 −チオカルＪ々ミルフェニル−２−アセトアミド−２−
デオキシ−α−Ｄ−がラクトビラノクド残基 一チオカルパミルフエ二ルーλ−アセトアミド−２−デ
オキシ−β一旦−カラクトビラノシド残基 一テオカルパミルフェニルーβ一旦一カラクトピラノシ
ル−≠−β一旦−グルーグルコピラノシ ド残基フェニルーβ一旦−ガラクトピラノシル−≠−β
−Ｄ−グルコピラノシド残基 一アゾフェニルーα−０−グルコヒラノシド残基 一７ゾフエニルーα−９−マンノピラノシド残基 一アゾフェニルーα−Ｌ−７コビラノシド残基 一アゾフェニルーβ−９−ガラクトピラノシド残基 一アゾフェニルーーーアセトア電トー２−デオキシーβ
一旦−グルコピラノシド残基 の中から選ばれたオシドを有し、 一少糖類又は糖ペプチドの残基が、残基α一旦−グルコ
ピラノシ、ド、α−に一グルコピラノシド、α−ｐ−マ
ンノピラノシド、α−Ｌ−７コピラノシド、β−Ｌ−ガ
２クトビラノシド、β一旦一ガラクトピラノシドもしく
はλ−７セトアミドーコーデオキシーβ−Ｄ−グルコピ
ラノシド、２−アセトアミド−２−デオキシ−α−ガラ
クトピラノシド、２−アセトアミド−２−デオキシ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−ホスホリル−α−Ｄ−
マンノビ２ノシド１又はα−Ｌ−２ムノピラノシドのう
ち少くとも１つを有するものが挙げられる。

ｄ）α一旦−クルコース、α−９−マンノース、α−ふ
一７コース又はＮ−アセチルグルコサミンを有する自然
の、又は変更された多糖類。

これらの多糖類の例としては、酵母多動ＩＩ（特にマン
ノース）、細菌多糖類（特に大腸菌、チフス菌、キープ
シエルス菌など）又は他の多糖ｔｌＡ（フコイジン、レ
ンチナンなど）がある。

＋Ｄ遊１１１［アミノ基の停止、カルがキシル基の導入
、又は、−の方法又は他の方法による等電点降下置換基
によって変更された蛋白質（例えば５ｃｉｅｎｃｅ　、
　ｖｏｌ　、２　／♂、／９１２゜５７≠−５７６頁参
照）。

変更された蛋白質としては、Ｎ−アシル化蛋白質（例え
ばスクシニル化、マレイル化、シトラコニル化、アコニ
チル化もしくはアセチル化蛋白質）が挙げられる。

蛋白質のこれらの変更については、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　ｖ
ｏｌ　ＸＩ及びｖｏｌ。

ＸＸｖを参照されたい。

出発蛋白質は、好ましくは、遺伝子組成が同一の蛋白質
とする。

■）α２−マクログロブリンもしくは、α、−アンチト
リゾ／ンのようなアンチプロプアーゼ、より一般的には
、例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
＊　ｖｏｌ、　Ｉ　Ｏ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
）に記載された、遺伝子組成が同一のセリツクアンチノ
ロテアーゼ。

これらのアンチプロプアーゼは、多くのプロプアーゼ（
特に、腫よう細胞が分泌するプロプアーゼ）と共に複合
体を自然に形成するので、マクロファージの親和性結合
の前駆物質とみることができる。これらのグロテアーゼ
ーアンチデロテアーゼ複合体がフタロファージ及び−核
内血球に対して親和性をもつことは知られている（例え
ばＪｅｒｒｙ　ＫＡＰＬＡＮほかＩＩＴｈｅ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　ＢｌｏｌｏｇｌｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　＃　ＶＯＩ　、２３≠、％／３゜７３．２ターフ３
３３　（／り７９）参照）。

ｉｖ）　腫よう細胞の膜状もしくは可溶性抗原と共に生
物体内に複合体を形成する、抗腫よう細胞性抗体（特に
モノクロナール抗体）。

これらの複合体がマクロファージにより選択的に認識さ
れることはよく知られている。

（Ｃ）　ＸがＲのペグチド部分の官能基と（ＬＡＭ）の
官能基との間の共有結合を表わすか、又は、共有結合の
形成によりＲを（ＬＡＭ）と結合させる通常の結合剤（
２官能性分子）の残基を表わすもの。

本発明は、式（１）によって示される化合物の製造方法
も提供するっ 本発明による製造方法は〜残基Ｒに対応する誘導体（Ｒ
）を、場合によっては結合剤の存在下に、結合部分（Ｌ
ＡＭ）と１既知の方法によって反応させることを特徴と
する。

変形例によれば、（Ｒ）又は（Ｌ　ＡＭ　）を結合剤の
反応性官能基の１つと反応させ（他の官能基は必要なら
ば一時的に停止させ）、次に、ＲＸもしくは（Ｘ）　−
（ＬＡＭ）型の得られた生成物を（ＬＡＭ）又は（Ｒ）
とそれぞれ反応させる。

分子（１−Ａ　Ｍ　）と反応させるための分子（Ｒ）の
数ｍについては、この数は、前述したように、少くとも
ｌとする。

数ｍの上限は次のようにして宇める。ａ）（ｗ換基ＲＸ
−による分子ＬＡＭの認識部位の飽和による）マクロフ
ァージのレセプターに対する置換ＬＡＭの選択認識現象
の喪失の観測。ｂ）同様に、ＬＡＭが抗体である場合１
置換ＬＡＭが対応の抗原上に定着する能力の喪失。Ｃ）
同様に、ＬＡＭがアンチグロテアーゼである場合、置換
ＬＡＭがｆロチアーゼを定着させる能力の喪失。従って
、ｍのこの上限は、どの場合にも、試験管内の日常的な
簡単な実験によって容易に定めることができる。

一般に、ＭＤＰの誘導体のアミノ基（これらが存在して
いれば）を配位子（ＬＡＭ）の（活性型の）カルボキシ
ル基と反応させることができる。

配位子（ＬＡＭ）にカルボキシル基を現出させ、又はそ
の数を増大させることは、もちろん可能である。例えば
、配位子（ＬＡＭ）が蛋白質、糖蛋白質又はネオ糖蛋白
質の場合、カルＭン酸誘導体の作用によって、例えばス
クシニル化により、カルがキシル基を現出させることが
できる。得られた誘導体の遊離カルボキシル基は、この
時に、ＭＤＰ誘導体のＮＨ２基と反応するように、適切
に活性化され、ＭＤｐ＠導体はこれにより定着され、ア
ミド基を形成する。

その逆に、配位子（ＬＡＭ）のアミノ基をＭＤｐ誘導体
のカルがキシル基（例えばイｙ　−Ｇｌｎ　（Ｄ　＊ル
がキシル基）と反応させることができる。この場合にも
、配位子上に、補助的なアミノ基を現出させることがで
きる。例えば、結合部分が蛋白質、糖蛋白質又はネオ糖
蛋白質であれば、これをスクシニル化し、次にこのスク
シニル化誘導体を、前述した方法と同様の方法によって
シアミンと反応させることができる。このようにして、
ヒドラジンの作用により、結合部分のアミノ酸のヒドラ
ジドが形成される。

配位子（ＬＡＭ）がＮ−アシル化蛋白質であれば、蛋白
質のアシル化の前に、ＭＤｐ誘導体に蛋白質を定着させ
ることができるっＭＤｐ誘導体上に配位子（ＬＡＭ）を
固定させるいくつかの例を以下に説明するが、これらは
本発明を限定するものではない。−例として、少糖類又
は多糖類をＭＤＰ（又はその誘導体の１つ）に定着させ
る場合、糖をアミノ硫酸エチルと反応させることにより
、第一アミノ基を糖類に導入することができる。

また糖をブロム酢酸塩と反応させ、得られた酢酸エステ
ルをシアミン（例えばエチレンシアミン）と反応させて
、対応のアミノエチルーモノアミドトスル。多糖類のア
ルコール基をカルボニルソイミダゾールでエステル化し
て、多糖類上にアミノ基を導入し、得られた生成物をジ
アミンと反応させて、前述した場合と同様に、多糖類の
対応する一ｒ　７ノ誘導体とする。例えば、エチレンジ
アミンを用いて、５ａｃｃｈ、−０−Ｃｏ　−ＮＨ−（
ＣＨ２）　−ＮＨ２（ここに５ａｃｃｈ、は多糖類の残
基を表わす）型の誘導体が取得される。このアミノ化誘
導体は、ＭＤｐ誘導体のカルボキシル基（例えハイソー
Ｇｌｎのカルボキシル基）と、アミド結合を形成するよ
うに反応させることができる。前記カルがキシル基カ、
（例えげヒドロキシスクシンイミＰの形に）常法に従っ
て活性化されることは言うまでもない。別の方法として
１ブロム酢酸塩を用いる技術によってカルがキシル基を
糖類上に現出させ、この基を誘導体のアミノ基と反応さ
せ、アミド結合の形成によりＭＯＰ誘導体上に糖類を定
着させることができる、。

少糖類について前述した方法は、糖ペプチドにももちろ
ん適用される。／−デオキシ　／−カル？キシアルキル
テオビ２ノシド形に、ｌｆａｍＣＡ）糖類でも多糖類で
もよい）上にカルボキシル基を導入することもできる。

一例として、（ヒドロキシル基が安息香酸塩の形に適宜
保護されている）対応の／−りａロビラノシドを出発物
質として、これにチオ尿素を作用させることにより、対
応のｌ−インチオ尿素の塩化物が得られる。亜ニチオン
酸ナトリウムの存在下にブロム酢酸メチルを作用させる
ことにより、（脱ベンゾイル化可能な）対応する／−チ
オエチアノエートメチル誘導体が得られる。このエチル
エステルは次にけん化して、対応のカルがン酸誘導体と
し、カルボキシル基は次に（例えばヒドロｄＰ？スクシ
ンイミドエステルの形成により）活性化する。得られた
活性チオエタノイル誘導体は例えばＭＤＰ誘導体のアミ
ノ基（もし存在すれば）と反応させることができる。

１ｆＩｉ誘導体の同様のチオエタノイル化方法は、−例
として、フランス特許願１３−／Ｉｔ／７り号［新規な
７ラン島導体と製造方法並びにその使用」（出願日、／
りｇ３年り８５日）に記載されている０ 同様に、（Ｎ−アセチルグルコサミンのよウナ）Ｎ−ア
セチルグサミン単位を有する糖ペプチド及び少糖類に、
ヒビ２フフ分解によって、−ＮＨ２基を現出させること
ができる。

ＭＤｐ島導島全体体上に定着させるために、例えばコ官
能性結合剤を使用したり、ＭＤＰ誘導体の活性化エステ
ルと抗体とを反応させることができる（抗体のＮＨ，基
とのアミド結合形成による定着）。

式（１）を有する化合物は、前述したように、有用な薬
理学的特性を備えている。これらの特性と低毒性とのた
め、式（１）の化合物を医薬として使用することが可能
になる。

本発明は、式（１）による化合物の誘導体の医薬として
の使用も提供する。

本発明による医薬は、免疫細胞組織の活性化剤であり、
特に細菌による感染と腫よう細胞特に自然の転移細胞の
広がりに対する治療作用及び保護作用を誘起する。

本発明は、式（１）によって示される少くとも７種の薬
剤を含有した医薬製剤にも向けられている。これらの医
薬製剤は常法に従って調製される。

この医薬製剤は、特に静脈注射、腫よう内注射又は空中
噴霧などの方法によって投与することができる。

この目的のために、注射可能な溶液もしくは懸濁体又は
ニーａゾル用の溶液もしくは懸濁体の形に医薬製剤を調
製することができる。

用量は、投与形態、体重、疾患の種類などによって相違
するが、例えば静脈注射の場合、ＭＤＰ又は類縁物の重
」として、ｊθ〜ｊ００　ｐｇ／ｋｃｌｌである。

次に本発明を具体的な実施例について説明するが、これ
らの例は、本発明の範題を制限するものでは永い。

実施例　／ （ｃｌ−Ｍａｎ−ＰＴＣ）　２５−血清アルブミン−Ｍ
ＯＰ）２゜型ネオ糖蛋白質 ａ）クシの血清アルブミン（分子量る７θＯＯ；ｓｏ〜
）を８、＜ｚｃで、０．　／　ＯＭの炭酸ナトリウム緩
衝液Ｃｒ、９．３　＞に溶解させた。この溶液に、（Ｍ
ｃ　Ｂｒｏｏｍほか、／り７．２、Ｍｅｔ、　Ｅｎｚｙ
ｍ。

ツユ、、２／２−．２／タ　に従って調製した）０−フ
ェニルインチオシアネートα−Ｑ　−７７ノピラノシド
ｌＡＯＩＩＪｇを添加した。弘℃で１０時間攪拌した後
、ネオ糖蛋白質を、ウルトログルＧＦＯ，ｆ、力？Ａ　
（３Ｘ４ｔＯｃｍ）上のモレキュラーシープによって精
製し、ネオ糖蛋白質含有フラクシ日ンを蒸留水に対して
透析し、次に凍結乾燥した。

ｂ）　ムラミルジペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−上
一アラニル一旦−イングルタミン）（３０■、６０μモ
ル）を、フルオロジニトロベンゼン上で蒸留したばかり
のＮ−ジメチルホルムアミド０．６−中に湊解させた。

弘℃に保った溶液ニ１．ソシクロへキシルカル？ジイミ
ド！、２当量（１５即、７２μモル）と、Ｎ−ヒドロキ
シ−スクシンイミド７．２当ｔ（Ａ、３即；７．ｚμモ
ル）とを添加した。溶液を２≠時間攪拌した。反応の進
行に続いて、シリカダルによる薄層クロマトグラフィを
行なった（溶剤混合物、クロロホルム／メタノール／酢
酸／水の容量比１．２：２：／：／、ＭＯＰのＲＦ：Ｏ
，，５’７、Ｍ　Ｄ　Ｐ　−Ｑ　−ＳｕのＲＦ：０．６
７）。フクロヘキシル尿素の沈澱物を遠心法（１０分間
、２０００Ｆ！　）又はアリットガラスを用いたｐ過法
によって除去した。

注）ｖＤＰ−０−９ｕはＭＤＰのヒドロキシスクシンイ
ミドエステルを表ワす。

Ｃ）活性仕ムラミルジイプチド溶液”（ＭＤＰ−０−５
ｕ　）（ＭＤＰＪＩＩＩり含有、ｂ　Ｏｐｌ　）を、ネ
オ糖蛋白質溶液（Ｍａｎ）２３−　ＳＡＢ　（酢酸ナト
リウム１ｊＯｐｌ中ｊｗ９．７Ｍ、ｐＨｆ、ｊ）Ｋ添加
した。反応混合物を、２≠時間２ｊ℃で反応させた。免
疫刺激物質（Ｍａｎ）２５−３ＡＢ−（ＭＤＰ　）１゜
を、緩衝液（生理的食塩水）中においてウルトロダルＧ
ＰＯｊカツム上のモレキュラークープにより精製した。

免疫刺激物質 （Ｍａｎ　）２５−　Ｓ　ＡＢ　−（ＭＤ　Ｐ　）１（
）を含有した７ラクシヨンを集め、ミリポア（θ、、２
ｐｍ）を用い九濾過によって溶液を滅菌し、−２０℃で
保存した。別の方法としては、溶液を透析した後に凍結
乾燥することもできる。

注）ＰＴＣはフェニルテオカルパミルヲ表ワす。記号（
α−Ｍａｎ　）２５は結合部分ＰＴＣの残基を示すこと
々く、即ちこの基を省略して用いられている。ＳＡＢは
ウシの血清７　ルｆ　ｉ　７　（５ｅｒｕ　ｍ　ａｌｂ
ｕｍｉｎｓ　ｂｏｖＩｎｅ　）を表わす。

実施例　２ （α−Ｍａ　ｎ　）２５−血清アルプミン−（ＭＯＰ）
２゜型ネオ糖蛋白質 この免疫刺激物質は、工程／　ｃ）において添加ｊ、た
ＭＤＰ−Ω−３ｕの量をジメチルホルムアミドｌ、Ｏｐ
ｌ　中ＭＤＰ６Ｎとしたことを除いて、実施例／と同様
の方法により調製した。

注）（α−Ｍａｎ　）　はこの場合実際には（α−Ｍａ
ｎ　−ＰＴＣ）を当然表わしている。

実施例　３ （α−ＧｔＣ）２Ｂ−血清アルブミン−（ＭｏＰ）２゜
型ネオ糖蛋白質 この免疫刺激物質は、α一旦−マンノピラノシどの代り
にα−ｐ−グルコピラノシド　Ｏ−７二ニルインチオシ
アネートを用いたことを除いては実施例１と同様の方法
によって調製した。

注）（α−Ｇｌｃ　）は、この場合、より正確には、（
α−Ｇｔｃ−ＰＴＣ）を表わす。

実施例　≠ （α−ＦｕＣ）３ｇ−血清アルプミｙ（ＭＤＰ）１゜型
ネオ糖蛋白質 α−Ｌ−７コビラノシド　Ｑ−フェニルインチオシアネ
ートを用いたことを除いては、実施例３と同様の反応を
行なった（この場合も（α−Ｆｕｃ　）は（α−Ｆｕｃ
−ＰＴＣ）を表わしている）。

実施例　ｊ （β−，ＧｌｃＮＡＣ）、２５−血清アルブミン−（ｖ
ｏｐ）□。

型ネオ糖蛋白質 ！−アセトアミドーーーデオキシーρ−Ｄ−グリコピラ
ノシド　０−フェニルインチオシアネートを用いたこと
を除いては、実施例３と同様の反応を行なった。

注）　（／ｉ　−ａｔｃＮＡｃ　）は、より正確には、
（／ｌ　−ＧｔｃＮＡｃ　−ＰＴＣ）を表わしている。

実施例　６ （β−ｃａｌ　）３□−血清アルブミン−（ＭＯＰ）、
。

型ネオ糖蛋白質 β−ガラクトピラノシドＱ−フェニルイノｆオシアネー
トを用いたことを除いては、実施例３と同様の反応を行
なった。記号については、前記各側の注）と同様である
。

実施例　７ （β−Ｌａｃ　：’２８−血清アルプミンー（ＭＤＰ）
１゜型ネオ糖蛋白質 β−ラクトピラノシドΩ−フェニルインチオシアネート
を用いたことを除いて、実施例３と同様に反応を行なっ
た。記号については、前記各側の注）と同様である。

実施例　ｇ （ジ−Ｎ−アセチルキトビオシト）２（、−血清アルプ
ミン−（ＭＯＰ）、。型ネオ糖蛋白質コーアセトアミド
ー！−デオキシ−４Ａ（／−アセトアミド−λ−デオキ
シーβ一旦−グリコピラノシル）−β一旦−グリコピラ
ノシド　Ｑ−フェニルインチオシアネートを用いたこと
を除いては、実施例３と同様に反応を行なった。（ジ−
Ｎ−アセチルキトビオシト）はもちろん（−／−Ｎ−ア
セチルキトビオシト−ＰＴＣ）の略号である。

実施例　タ （α−Ｍａｎ　）２０−血清アルプミン−（ＭＤＰ）、
。

型ネオ糖蛋白質 ａ）文献（Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、　／り
７７．７１．。

、２！７−２乙／）に記載の条件下に９−ジアゾフェニ
ル−α−マンノピラノシド塩酸塩を作用させることによ
り、ネオ糖蛋白質を調製した。

工程ｂ〕、Ｃ）は工程／　ｂ）、／　ｃ）と同様に行な
った。

注）（α−Ｍａｎ）はこの場合もちろん（アゾフェニル
−α−Ｍａｎ）の略号である。

実施例　ｌθ （α−Ｍａｎ　）２５−血清７　ルフＺ　ン−（ＭＤＰ
）、。

型ネオ糖蛋白質 ａ）工程／　ａ）　に従ってネオ糖蛋白質を調製した。

（α−Ｍａｎ）はこの場合（α−Ｍａｎ　−ＰＴＣ）を
表わす。次にネオ糖蛋白質２０８９を飽和酢酸ナトリウ
ムｊ−に溶解させた。次に無水コハク酸ｌＯ〜をこの溶
液に添加した。／Ｊ待時間攪拌後スクシニル化ネオ糖蛋
白質を蒸留水に対し透析した後、凍結乾燥した。

ｂ）スクシニル化ネオ糖蛋白質を無水さ一ジメチルホル
ムアミドＩＯ−に溶解させた。この溶液にジシクロへキ
シルカルボジイミド（Ｊ’Ｑ、２１１μモル）ヲ、次に
ビトロキシスクシンイミド（２，Ｉ　ｌ／１．２≠μモ
ル）を、弘℃で添加した。２１Ｉ一時間周囲温度で攪拌
した後０、　／　Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｊＩＫ／中Ｎ
−アセチルムラミルベンタペグチドｊ■を添加シタ。

反応混合物を／ｇ時間＋℃で攪拌した。緩衝液ＰＢＳ（
ｐ）ＩＪ”、ｔ）中において安定化したウルトロｒルＡ
ＣＡ、２０２カラム中にｔおいてモレ千ニラーシーブク
ロマトグラフィーにより、免疫刺激物質（α−Ｍａｎ　
）ａｓ−血清アルブンｙ−（ＭＰＰ）１゜を精製した。

次に免疫刺激物質をν過により滅菌し、凍結乾燥した。

実施例　／／ Ｌ　Ｌ　ＣｍＪａに特異性のモノクロナール抗体−（Ｍ
ＤＰ）４゜ ルイスの肺癌腫細胞に特異性のマウスのモノクローナル
抗体（抗体　１．Ｍ　６Ｂ＆）を、酢酸トリウムの緩衝
モル溶液（ＰＩ′ｌざｌ）に溶解させた（　＋”４　／
　＊ｔ　）。次に工程／　ｂ）に配賦したＭＤＰ−０−
５ｕを、この溶液に添加し、工程／　ｃ）　のように反
応を実施した。ウルトログルＡＣＡ２０２カラム上でモ
レキュラーシーブによりモノクローナル抗体−（ＩｖＩ
ＤＰ）４ｏを精製した。

モノクロナール抗体−（Ｎ４ｏＰ）４０含有フラクシヨ
ンを、ミリポアＣ０，２２μ）上のｐ過によって滅菌し
、７℃で保存した。

モノクロナール抗体ｊＢｊについても同様に反応を行な
った。

実施例　１２ 細路Ｌ／２１０特興性モノクロナール抗体−（Ｍ　Ｄ　
Ｐ　）２゜ 白血病細ＭＬ／；２１０　Ｋ％異性のマウスのモノクロ
ナール抗体（Ｉｇ　Ｍ　Ｆ　、２−１Ｏ−２３）を、実
ＩＭ剥／ｌと同様に処理した。

実施例　／３ マンナン−（ＭＤＰ）２゜ サツカロミセス・セルビセー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｖｌｓａｅ　）の’＋Ｆ７す７Ｃ！ｒＯｙｒ
ｙ）ｔ（ジ、ｘチルスルホキシド１０−に溶解させた。

この溶液にカルｙ）Ｐ＝ニルジイミダゾール１０ｔｎを
添加した。７時間、＋℃の後にエチレンジアミン０．　
／　ｇｔｔを添加した。

弘℃で２弘時間攪拌した後に、置換マンナンを、モレキ
ュラーシーブによって精製した。次に、工程／Ｃに記載
したグロトコールに従って、Ｍ−Ｄ　Ｐ　−０−Ｓｕに
より置換マンナンを処理シタ。

もちろん、この例において、（ＭＯＰ）は、結合剤Ｘ（
この場合−Ｇ　Ｏ−Ｎ　Ｈ−Ｃ２Ｈ４−ＮＨを表わす）
を示すことなく省略した略記法である。

実施例　／≠ （α−Ｍａｎ　）２５−　ＳＡＢ”（ＭｏＰ　）ＩＢ型
ネオ糖蛋白質 実施例／に記載した方法と同様の方法によって、（α−
Ｍａｎ）２５−　ＳＡＢ−（ＭＯＰ）、８　型共役化合
物であるネオ糖蛋白質を調製した。この場合、（α−Ｍ
ａｎ　）、は、（α−Ｍａｎ　−Ｐ　ＴＣ）２５の略号
である。

実施例　／ｊ （６−Ｐ−α−Ｍａｎ　）２ｏ−ＳＡＢ−（ＭＤＰ　）
□５型ネオ糖蛋白質 実施例／と同様の方法によって、このネオ糖蛋白質を調
製した。（６−ホスホリル−α−Ｍａｎ）を表わす（６
−Ｐ−α−Ｍａｎ）は、 （６−Ｐ−α−Ｍａｎ　−ｐ　Ｔ　Ｃ）の略号である。

薬理学的性質の研究 Ａ）試験管内のマクロファージの腫よう殺滅ノ活性化 ｌ）標的細胞 −Ｌ／、２／θ ウマ薄情１０チ含有ＭＥＭ媒養基において懸濁体として
培養保持したマウスＤ　Ｂ　Ａ／、！の白血病細胞。こ
れは指数成長相（よ７　Ｘ　／　０５　細胞／−）にお
いて使用した。

一ル１スの肺癌種細側ＬＬに れは、マウスＣｊ７ａｌｌに自然に発生した腫ように由
来する。腫ようは多数の肺転移を生ずる。この細胞は、
ウシの胎児血清２０ｑｂ含有ＭＥＭ培養基において、３
７℃の温度で、ＣＯｇｊチ含有雰囲気内において（，２
Ｘ１０’ｃ／−の割合で）単層培養した。これらの細胞
は、（３日後に）１つにし、グルコース０．／％含有Ｐ
ＢＳ緩衝液内のＥＤＴＡｏ、０，２％溶液により簡単に
処理した後に完全な媒質中に取入れることにより回収し
た。生存率＞９６チ。

、２）マクロファージ マウスＢＤＦｉ腔マクロファージを、チオグリコラート
媒質／ｍによって呼出した（バストクール協会）。注射
後を日経ってから、マウスの首を切除し、ＳＶＦ　（仔
クンの胎児血清）Ｊ［含有ＲＦＭＩ＠養液１ｔｔｉｏに
て洗浄した後、腹腔細胞を回収した。抗生物質及び０．
／＊グルタミンを含有するＲＰＭＩ／４＋０Ｘ１０％Ｓ
ＶＦ媒質内に細胞を２回の洗浄後に懸濁させた。７匹の
マウスについてｌ〜／、　ｊ　Ｘ　／　０　個の細胞を
回収し、そのうちざＯ〜りｏａｔｈは、淡赤色の発色に
より、マクロファージであることが確められた。

３）サイトスタティック効果の測定 マイクロ滴定板（Ｆｌａｃｏｎ　Ｍｌｃｒｏｔｅｓｔ　
Ｉ　）４４　Ｘ　／　０５　マクロファージ、μ時間３
７℃（ｊチＣ０２）培養。付着していない細胞を３回洗
浄して除いた後、マクロファージを、刺激物質Ｃ１００
μｔ）（ＭＤＰ％ネオ糖蛋白質、多糖類又はポリクロナ
ールもしくはモノクロナール抗体に結合したＭＤｐ、或
いは対応の比較溶液（ＰＢＳ支持蛋白質））と共に、Ｒ
ＰＭＩ１０％ＳＶＦ、抗生物質、グルタミン、及びヘイ
ズ。２０％緩衝液１．２≠時間３７℃（ｊチＣ０２）に
おいて培養した。３回洗浄後に、可変（７〜ざＯ）のマ
クロファージ／標的細胞比を得るために、いろいろの濃
度において、標的細胞を添加した。２０時間培養後にチ
ミ？ント９ｆｘ−ＣＯ，／　ｐｃｔ、　３．７ＫＢ　３
Ｈ−−ｙ−ミ）ン、ＣＣＥＡ）０．７１１〜／、／、Ｔ
Ｂｑ／ミリモル）を添加した。

標的細胞と同時にチミジンを添加することもできる。ｍ
胞はガラスファイバー上にフィルターにより回収し、マ
ツシュ証型の装置により洗浄した。

螢光液中に溶解させた後にβカウンターにより細胞中の
放射線を側窓した（　Ｔｅｎｕ　ほか、／りざ０１Ｅｖ
ｒ、Ｊ、１ｍｍｕｎａ１．　／　０　＊６’Ａ７　１ｙ
ｊ３）。

禁止率＝　、　Ｘ　／　００ （ここにＲ＝ｍ的細胞＋非刺激マクロファージＳ−標的
細胞＋刺激マクロファージ） ＭＤＰ（又はその誘導体）に結合した抗腫よう細胞抗体
によってマクロファージを活性化する研究を、マクロフ
ァージ、標的細胞及び刺激物質の同時存在下に行なった
。細胞壊死効果ないしはサイトスタティック効果を２≠
〜≠ｒ時間後に測定し、た。

≠）サイトトククツク効果の測定 マクロファージを存在させる前に予めマークした標的細
胞の放射能の分析によって測定した（　Ｒａｚ　ほか、
ｌり７り、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕ　ｎｏ　Ｉ　。

１ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　７＋　／　ｊ　７　）。（”
ｌ　）　１ＵｄＲ％即ちｊ　−（１２５１）　（ｌ０ｄ
Ｏ−２’−デオΦシウリジｙ　Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｊ　
Ｃ１／　Ｑ　、　／　ｒ　ｊ　Ｇｅｅ／ＷＩＩＩ／−当
り０．２μＣＩ（７，グＫＢ９）含有媒質中に２時間培
養することにより、指数成長相にある標的細胞をマーク
し九〇マークした標的細胞は単に参照用として＠養した
。

、２１１Ｌ−４，ｒ時間後に、培養物を洗浄し、付着細
胞を溶解させ（０，３Ｎ　ＮａＣ１０，／　ｍｔ　）洗
浄した〇溶解させ洗浄して得た生成物を７つにし、λシ
ンチレーションカウンターで放＃Ｊ線を測定シタ。活性
化マクロファージによって媒介された細胞毒ないし細胞
障害ないしサイトドクシシティの百分比を計算した。

ｐｍＭｎ 式中Ｃｐｍ（Ｍｎ）は、正常なマクロファージと共に培
養された標的細胞に対する７分間の切片（ｃｏｕｐ）数 Ｃｐｍ（Ｍｓ）は、刺激されたマクロファージと共に培
養された標的細胞に対する７分間の切片（ｃｏｕｐ　）
教、をそれぞれ表わす。

結果：３６時間後において、遊＃Ｍ　ｏ　ｐは、いがな
る効果も示さなかった。その反対に、検討している生成
物（Ｍａｎ）２５−５ＡＢ−（ＭＯＰ　）１Ｂは、／　
ｐｇ　／　Ｗｎｌで、Ｌ　Ｌ　Ｃ（１２１ｓＩＵｄＲ）
　細胞の３０％を殺した。

注）ＬＬＣ細胞は、”３　Ｌ　Ｌ’とも称される。

ｊｓｉ）　Ｍａｎ　−ＳＡＢ−ＭＯＰ　により刺激され
た一ｒｐ口７アージのサイトスタティック効果の測定へ
の応用 （Ｍａｎ　）２５−　ＳＡＢ　／分子当りＭＤＰ、２０
残基でＭａｎ　−５ＡＢ−藺ＤＰを使用した。２種類の
標的細胞即ち白血病細胞Ｌ／２ＩＯ（第１図）と、ルイ
ス肺癌種細胞ＬＬＣ（第２図）とを使用した。

マンノクルーＳＡ８に共役結合されたＭＯＰは、使用し
た２＋ｍ類の腫よう細胞に対して１り口７アーソをサイ
トスタティックにする。共役結合ＭＤＰは、遊＃Ｍ　Ｄ
　Ｐよりも試験管内で一層活性であり、／／′ＩＯの濃
度で作用し、マクロファージのサイトスタティック効果
を著しく増大させる。

表　１ 細胞Ｌ／２１０及びＬＬＣに対するマクロファージのサ
イトスタティック活性 ＭＤＰ　２０　１０　／ｊ ≠θ　／２　．２０ Ｍａｎ−３ＡＢ−ＭＤＰ　２０　３３　７ｊ１１−Ｘ１
０５マクロ７アージは、遊離ＭＤＰ又は共役結合ＭＤＰ
／−当り／ｐｇにより刺激された。

標的細胞は、マクロ７アーゾ／＊的細胞比、２０及びｌ
Ｏを得るように、異なる濃度で１．２を時間後に添加し
１．２≠時間−緒に培養した。培養終了の弘時間前にチ
ミジントリチェ３．７　ＫＢｑｌｏ、　／　ＣＩを加え
た。非処理マクロ７アージの存在下に培養した標的細胞
により合体された放射能に対して、サイトスタテイシテ
ィの百分比を＝ｉｓｔ、た。

第１図は、遊離ＭＤＰ又はネオ糖蛋白質（Ｍａｎ　−５
ＡＢ）に共役結合し九ＭＤＰの異なる用量においての、
標的細胞Ｌ／、２１０に対する被処置マウスの腹腔マク
ロファージのサイトスタティック効果を示す。マクロフ
ァージ／Ｌ／２１０比は、２０である。

サイトスタテイシティ百分比は、３回の秒立した培養の
平均値である。

第２図は、遊離ＭＤＰ又はネオ糖蛋白質（Ｍａｎ　−Ｓ
ＡＢ　）に共役結合したＭＤＰの異なる用量において処
置されたマウスの腹腔マクロファージの、ＬＬＣ！Ｉｌ
胞に対するサイトスタティック効果を示す（フクロファ
ージ／Ｌ　Ｌ　Ｃ比＝、２０　）。

第３図は、遊＠ＭＯＰ又は伸的細胞り、／２１０に向け
られたモノクロナール抗体（，１，Ｍ゛）に共役結合さ
れだＭＤＰのいろいろの用量において処置すれたマウス
の腹腔マクロファージのブイトスタテイック効果を示す
。

サイトスタテイシティ百分比は３回の培養の平均値であ
る。

ｊｂ）同様にして、実施例／ｊの共役化合物（６−Ｐ−
α−Ｍａｎ　）２０−５ＡＢ−（ＭＯＰ　）１５につい
て研究した。

この仕合物は単核白血球に強い親和力を示Ｌ７、単核白
血球はそれにより強く活性化される。

ヒトの循環血液から新しく調製した中核白血球は、マン
ノースに対するレセプターをもたず、（α−Ｍａｎ）−
ＳＡＢ−（ＭＤＰ）−型の共役化合物により活性化され
表いことを、ここで述べることが適切である。

その反対に、ヒトの単核白血球は、６−ホスホリルマン
ノースを認識し、（ａｐ−α−Ｍａｎ　）　−３ＡＢ−
（ＭＤＰ　）型の共役化合物の存在下に、細胞Ｌ／、２
１０及びＬＬＣに対して強いサイトスタテイシティ及び
サイ））クシティを示す。

乙）モノクロナール抗体に共役結合したＭＤＰＫより刺
激されたマクロファージのサイトスタテ−璽Ｓ　アンチ
Ｌ／２１０−ＭＤＰ −菖？Ｍ　アンチＬＬＣ−ＭＯＰ 細胞は、白血病細胞Ｌ／、２１０及びルイスの肺癌種細
胞ＬＬＣとし、これらはマクロファージ（マクロファー
ジ／標的細胞比＝／ｊ）及びＭＤＰに結合したモノクロ
ナール抗体と共存させた。３６時間培養した後に、　Ｈ
−チミジンを培養液に添加した。細胞をｔ時間後に回収
しカウントした。

７）原種ようの存在している足を切断した後のＣｊ７Ｂ
／Ａマウスのルイス肺癌種自然転移の根絶 次の原則に従って実験を行なった。

遺伝子組成が同一のマウスのももにルイス肺癌橿原よう
細胞を注射し、腫ようを発生させる。転移の広がりは、
腫ようを外科処置により局所的に賦活した場合に増大す
る（　Ｅ、　Ｇｏｒｅｌｋ　４ｊか、２／、／りざ０１
６／７−６．２５）。転移の゛体積は腫よう細胞の注射
量と切断の日付とに依存する（　Ｅ。

Ｇｏｒｅｌｋ　ほか、（／りｆｏ）Ｊ、Ｎ、Ｃ１，ｉｔ
　。

／２３；７〜／、２６１７．）。

腫ようのトリプシン処理によって調製した６×ＩＯ個の
ＬＬＣｉｌｆｌ胞を、同じＣＪ７Ｆ３／Ａロットのマウ
スのももに注射する。

７日後に腫よう（直径／　ｃｍ　）を麻酔下にもものと
ころで足を大きく切断することにより除去する。

／、２日目に処置を開始する。３日又はｔ日ごとに遊離
又は共役結合ＭＤｐ（≠μｇ）を静脈注射する。処置終
了後に、ｊ−１ｏｄｏｓ　デオキシクリジン合体（又は
合体１２５１ＵｄＲ；　Ｅ、　Ｂｏｎｍｅｓｓｅｒはか
〜ｌり７　Ｋ　、　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　２　／
　＃　３２　／−３，２２）をカウントすることにより
、肺転移の広がりを測定する。

”１ＵｄＲの合体と腫ようの広がりとの同には、成る関
係が存在する。チはジ−メートシン七ターゼ（ｔｈｙｍ
ｌｄｌｌａｔｅ　５ｙｎｔｈＪｔａｓｅ　）が禁止され
、細胞がＩＵｄＲを優先的に合体することを目的として
、１２５１ＵｄＲ／　ＰＣＩ（３７ｋＢｑ）　注射後３
０分してから、各々の動物に、腹腔注射によってフルオ
ロデオキシクリジンを、各々、２５μＩ　づつ注射する
。

２を時間後にマウスを殺し、肺を秤量し、ｌ−シンチグ
ラフ（ＬＫＢ）によってその放射能を測定する。

一７匹のマウスから成るｌロットは、共役化合物（Ｍａ
ｎ　）２５−　Ｓ　Ａ　Ｂ　−（Ｍ　Ｄ　Ｐ　）１８を
注射することによって処置する（ロツ）Ａ）。

−参照群としての７匹のマウスから成るｌロットは、等
量づつのＭＤＰとＭａｎ−３Ａ８　の混合物を注射する
ことによって処置する（ａツ）Ｂ）。

−別の７匹の健康なマウスから成るｌロットについては
、処置を打力わない（ロツ）Ｃ）。

参照、ロツ）Ｂの全マウスには、直径λ〜３ｍｍの大き
な肺転移が見られ、壊死が開始されている。

Ｍａｎ−３ＡＢ　−ＭＤＰ型共役化合物によって処置し
たマウスのうち７匹は、比較群と同じ程度の転移の存在
を示し・別の１匹はいくつかの小さい肺転移（直径／　
ｍｍ以下）を示し、他のｊ匹のマウスの肺は健全であっ
た。

形態学的観察は、１２５１　１ＵｄＲＣ表Ｈ）の合体の
測定によって確認された。平均値は次の通りである。

一健康な外観の肺をもったｊ匹のマウスについて、乙２
　ｊ　ｃｐｍ／肺１ｏｏｖｒｙ、０７トＡ。

−参照群、ロットＢ、３１００　ｃｐｍ／肺１００ｍ９
゜肺は転移で覆われる。これらの同じ条件下に、健康な
マウス、ロットＣ１はｒθＯＣｐｍ／肺１００■（平均
）を合体している。

結論として、Ｍａｎ−８ＳＡ−ＭＤＰ　複合体の注射に
より、７匹中ｊ匹が治癒したのに反し、参照ロットの７
匹は、全く処置しなかったものと同様に、７匹とも、転
移が大きく広がっている。

腫よう（直径１０ｍｍ）の切断を７２日目に行なった。

切断後に３日おきに遊離ＭＤＰ又は共役ＭＤＰをｔｐｇ
づつ３回静脈注射することから成る治療を行々つた。マ
ウスを殺した後、肺転移を観察し、又は　ｌ　ＵｄＲの
合体によって評価した。

ａ）　ｃｐｒｎ　：健康な外観のマウス（！；／７　）
ｂ）　ｃｐｍ　：転移のあったマウス（，２／７）この
結果は次表野に示されている。

表　■

【図面の簡単な説明】

第１図は、遊離ＭＯＰ又はネオ糖蛋白質（Ｍａｎ−３Ａ
Ｂ　）に共役結合したＭＤＰの異なる用量において処置
された一リスの腹腔−クロファージの、標的細胞Ｌ／、
２１０に対する″Ｉｔイトスタティック効果を示す線図
、第」図は、遊離ＭＤＰ又はネオ糖蛋白質（Ｍａｎ−９
ＡＢ　）に共役結合したＭＤＰの興なる用量において処
置された一ウスの腹腔マクロファージの標的細胞ＬＬＣ
に対するサイトスタティック効果を示す線図、第３図は
、遊１１ｉＭＤＰ又番ゴモノクロナニル抗体（１，ｖ　
）Ｋ共役結合されたＭＯＰのいろいろの用９によって処
置されたマウスの腹腔マクロファージの、標的細胞Ｌ／
、２／（７に向けられたサイトスタティック効果を示す
線図である。 ！マエ妖も斃で会す条− 憧は１ｋ） ￥マ＾プ墾竪ヤント条憾 （ｅ収讐の 特許庁長官　殿 １．事件の表示　昭和５９年特許願第１１４３６５号２
、発明の名称　新規な免疫刺激物質とその製造方法３、
補正をする者 事件との関係　出願人 ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／）次の一般式 ％式％（１） （上式においてＲは、Ｎ−７セチルム２ミルベグチド型
   の免疫刺激物質もしくはその誘導体もしくはその類縁物
   の残基を表わし、 （ＬＡｒｌｌｌｌ）は、マクロファージもしくは単核白
   血球の親和性配位子、又はかかる配位子の前躯物賀を表
   わし、 ＸはＲと（ＬＡＭ）との間の共有結合を表わずか、又は
   −配位子（ＬＡＭ　）にＲを結合させることを可能にす
   る結合剤の残基を表わし、ｍは７以上の数を表わす）に
   よって示される新規な誘導体。 、２）ＲがＮ−アセチルムラミル−Ｌ　−Ａ１ｍ連鎖及
   び特にＮ−アセチルムラミル−Ｌ　−Ａｔａ　−Ｄ　−
   インＧｔｎ　−又はＮ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ
   　−Ｄ　−Ｇｌｕ連鎖を有ｒる残基を表わすことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の誘導体。 ３）　ＲがＭＯＰ（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｊａ
   一旦一インＧｉｎ　）　、Ｖ　Ｉ　Ｐ　（Ｎ−アセチル
   ムラミル−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｄ−インＧ１ｎ−メン−Ａ
   ２ｐｍ　）、ＭＱＰ（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａ１
   ．ａ　−Ｄ−インａｔｉ−メン−Ａ２ｐｍ　−Ｄ　−Ａ
   ｔａ）及ヒＭＰｐ　（Ｎ−７＊ｆルｈ５ミル−Ｌ　−Ａ
   ｌａ一旦一イ７　Ｇｔｎ−メン−Ａ２ｐｒｎ　−Ｄ　−
   Ａｔａ　−Ｄ−Ａｔａ　）の各残基、並びに、アミノｉ
   ！２（例えばへ７’チド）、コ官能基、グルタルアルデ
   ヒド又はＰ−チオカルバミル安息香酸により置換され九
   ムラミルベグチドの中から選択されることを特徴とする
   特許請求の範囲第２項記載の誘導体。 ｌＡ）マクロ７アージ又は単ａ１白血球の親和性配位子
   がマクロファージ又は単核白血球の膜状レクチンによっ
   て選択的にｇ織される糖共役化合物であることをｌ！＃
   徴とする特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項記載
   の誘導体。 夕）糖共役化合物が、残基α一旦−グリコピラノシド、
   α−２−マンノピラノシド、α−（−フコピラノシド、
   （αもしくはβ）−Ｌ−ガラクトピラノシド、β−且−
   ガラクトピ２ノシド、−一アセトアミドー２−７″オキ
   シ（αもシくはβ）−！−グルコピラノシド、コーアセ
   トアぐビーｌ−アセトアミド−２−デオキシ−α−り一
   ガラクトピラノシド、２−アセトアミド−コープオキシ
   −β一旦−ガラクトビ２ノシド、乙−ホスホリルーα一
   旦−マンノピラノシドもしくはα−Ｌ−ラムノビラシト
   のうち少くとも１つの中から選ばれた少くとも５個のオ
   シド単位を有する自然もしくは変更ｔ１１蛋白質、ネオ
   糖蛋白質１少糖類、又は糖ペグチド或いは残基α−Ｄ−
   グルコース、α−Ｄ−マンノース、α−Ｌ−ｙｗ−スモ
   シ＜はＮ−アセチルグルコサミンを有する自然もしくは
   変更多糖類の中から選ばれたものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第ｊ項記載の誘導体。 ６）少糖類及び／又は糖ペプチドの糖単位が部分的にエ
   ステル化されたことを特徴とする特許請求の範囲第ｊ項
   記載の誘導体。 ７）前記ネオ糖蛋白質が、α一旦−グルコース、α一旦
   −マンノース、α一旦−７コース、Ｎ−７セチルグルプ
   サミン、α−Ｌ−／”ルコース、β一旦−がラクトース
   、β一旦−ガラクトース、α一旦−ガラクトサミン、β
   一旦一ガラクトサミン、α−Ｌ−ラムノースもしくは乙
   −ホスホリル−α−０−マンノースの各オシドの中から
   選ばれたグリシド結合により置換された蛋白質であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第ｊ項記載の誘導体・ に）前記ネオ糖蛋白質が、 チオカルバミルフェニル−α−Ｄ−／’ルコビ２ノシド
   残基、 チオカルバミルフェニル−β一旦−Ｉラクトピラノシド
   残基、 チオカルバミルフェニル−α−９−マンノピラノシド残
   基、 チオカルバきルフエエルーコーアセトアミドーノ−デオ
   キシーβ−ｑ−ダルコピ２ノシド残基１ チオカルバミルフェニル−α−に一７コビラノシドＩＡ
   基、 チオカルバミルフェニル−α−に一フコｔラノシド残基
   、 チオカルバミルフェニル−α−０−ガラクトピラノシド
   残基、 チオカルバミルフェニル−α−に一ラムノビ２ノシド残
   基１ チオカルバミルフェニル−６−ホスホリルα−〇−マン
   ノピラノシＰ残基、 ｆオカルバミルフェニルー！−アセトアミド−Ｊ−デオ
   キシ−α一旦−グルコピラノシド残基、 チオカルパミルフェニルーコーアセトアミドー２−デオ
   キシ−α一旦−ガラクトピ２ノシド残基、 チオカルノぐミルフェニルーコーアセトアミドー２−デ
   オキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド残基、 チオカルバミルフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
   ー１Ａ−β−Ｄ−グルコピラノシド残基＼ アゾフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルー≠−β一
   旦−グルコピラノシド残基、アゾフェニル−α一旦−グ
   ルコピラノシド残基１ アゾフェニル−α一旦−マン、ノピラノシド残基、アゾ
   フェニル−α−基−７コビラノシド残基、アゾフェニル
   −β一旦一がラクトＩＪラノ７ド残基、 アソフェニルー、２−アセトアミドーーーデオキシーβ
   一旦一グリコビラノシ！゛残基、の中から選ばれたオシ
   ドを有し、多糖類又は糖ペプチド残基は、残基α−見−
   グルコＥ！ラノシド、α−ムーグルコビラノシド、α一
   旦−マ〉′ノビラノシド、α−Ｌ−７コビラノシド、β
   −Ｌ−ガラクトピラノシド、β−Ｄ−ガラクトピラノシ
   ドもしくはコーアセトアミド−一一デオキシーβ一旦一
   グルコビラノシド、コーアセトアミドーコーデオキシー
   α−７−がラフトビ２ノシド、λ−アセトアミドー！−
   デオキシーβ一旦−ガジクトビラノシド、乙−ホスホリ
   ルーα−且一マンノビラノシド及びα−Ｌ−ラムノピン
   ノシドのうち少くとも７つを有することを特徴とする特
   ：ｆ請求の＠’ａ第７項記載の誘導体。 り）前記多動類が、酵母多糖類、特にマンナン、細菌多
   糖類、又は他の多糖類、例えば７コイソンもしくはレン
   チナンの中から選ばれたものであることを特徴とする特
   許請求の範１ｆｌ第ｊ項記載の誘導体。 ＩＯ）マクロファージ又は単核白血球の親和性配位子が
   、等１点降下Ｎ侠基により変更された置換基により変更
   された蛋白質により形成されたことを特徴とする特許請
   求の範囲第１〜３項のいずれか７項記載の誘導体。 ／／）変更された前記蛋白質がＮ−アシル化もしくはｇ
   −カルがキシメチル化蛋白質であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１Ｏ項記載の誘導体Ｏ ／２）マクロファージもしくは単核白血球の親和性配位
   子の前駆物質がアンチプロテアーゼであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１〜３項のいずれか７項記載の誘
   導体。 ／３）アンチプロテアーゼが、遺伝子組成が同一のセリ
   ツクアンチプロテアーゼ例えばα２−マクログロフ゛す
   ；し′−９α、−アンチトリプシ／もしく番１α、−ア
   ンチキモトリプシンの中から選ばれたものであることを
   特徴とする特１ｙＦＮ求の範囲第１ノ項記載の肘１体。 ／４ｔ）マクロファージの親和性配位子の前記前駆物質
   が抗腫よう性抗体であることを特徴とする特ａｌＦ請求
   の範囲第１〜３項のいずれが７項記載の誘導体。 ｌｊ）前記抗体がモノクロナール抗体であるこトラ特徴
   とする特許請求の範囲第１≠項記載の誘導体。 ／６）残基Ｒに対応する誘導体（Ｒ）を、必要ならば結
   合剤の存在下に、（ＬＡＭ）配位子と既知の方法に従っ
   て反応させることを特徴とする特許請求の範囲第１〜ｌ
   ｊ項のいずれか７項記載の誘導体の製造方法。 １７）医薬特に免疫刺激性医薬としての特許請求の範囲
   第１〜ｌｊ項のいずれか１項記載の新規な誘導体の使用
   。 ＩＩ）特許請求の範囲第１〜ＩＪ項のいずれか１項記載
   の式（１）の少くとも−の医薬を含有したことを特徴と
   する医薬製剤。