JP5841168B2 - 抗腫瘍剤 - Google Patents
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Description
(2)上記(1)に記載の抗腫瘍剤を含有する医薬品。
(3)上記(1)に記載の抗腫瘍剤を含有する食品。
本発明に係る抗腫瘍剤は、セロビオースを有効成分とすることを特徴とする。セロビオースは、2つのグルコース分子がβ1、4結合でつながった二糖であり、化学式はC12H22O11である。このようなセロビオースは、セルロース系物質をセルラーゼで分解する方法、グルコース糖の単糖類又はその誘導体を縮合もしくは糖転移させる方法、スクロースから合成する方法等により適宜製造することができる。
1.試験目的
ラットDMBA誘発乳癌モデルを用いて、セロビオースの抗腫瘍作用を検討した。
本試験は、以下の法律、基準及び指針を準用した。
・動物の愛護及び管理に関する法律〔法律第105号、昭和48年10月1日(平成23年8月30日最終改正:法律第105号)〕
・実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準(環境省告示第88号、平成18年4月28日)
・動物の殺処分方法に関する指針〔総理府告示第40号、平成7年7月4日(平成19年11月12日一部改正:環境省告示第105号)〕
なお、本試験は、試験実施施設内動物実験委員会が規定する動物実験計画書の審議・承認を得た後に実施した。
ラットDMBA誘発乳癌モデルを用いて、セロビオースの抗腫瘍作用を検討した。具体的には、7週齢の雌性ラットを体重を指標にして群分け後、7,12−ジメチルベンゾ[a]アントラセン(DMBA)を20mg/mL/匹で強制経口投与した。そして、被験物質を4及び40mg/kg/日の2用量で、群分け日の翌日より1日1回12週間連続で強制経口投与した。
その結果、低用量及び高用量群では、ともに腫瘍の発生時期が対照群と比較して遅く、高用量群は腫瘍重量についても対照群と比較して有意ではないが、低い値を示した。このことから、被験物質であるセロビオースは、発癌性物質であるDMBAにより誘発される乳がんに対して、その発生を抑制することが示唆された。
(1)被験物質及び媒体
イ)被験物質
名称 :セロビオース
性状 :粉末
保存条件 :低温保存
取扱い上の注意 :吸湿性が高いので、使用後は密閉し、湿気に注意した。
名称 :注射用水
保存条件 :室温
製造元 :大塚製薬工場(株)
取扱い上の注意 :特になし。
名称 :カルボキシメチルセルロースナトリウム
保存条件 :室温
製造元 :関東化学(株)
取扱い上の注意 :特になし。
発癌剤として、以下の試薬を使用した。
イ)DMBA
名称 :7,12−ジメチルベンゾ[a]アントラセン
保存条件 :室温
製造元 :SIGMA
取扱い上の注意 :吸入及び皮膚への付着を避けるために、マスク、安全メガネ及び手袋を着用した。
名称 :ごま油
保存条件 :室温
製造元 :SIGMA
取扱い上の注意 :特になし。
6週齢のラット、Crl:CD(SD)(SPF)、雌性を日本チャールス・リバー(株)より2012年3月28日に52匹購入した(発注数:50匹)。
動物は入荷日に耳パンチ法により個体識別し、入荷から群分け日まで馴化した。一般状態観察を毎日行い、一般状態及び体重推移に異常が見られなかった動物を選択し使用した。各ケージには、群分け前は試験番号、性別及び個体識別番号(耳パンチ番号)を記入したカードを付し、群分け後は群及び動物番号を追記した。
馴化飼育及び実験期間を通じ、温度22±3℃、湿度50±20%、照明12時間(8:00〜20:00)、換気回数13〜17回/時間の環境下で、ステンレス製可動ラック(1790W×470D×1650H、mm)に設置したステンレス製金網2連ケージの1区画(255W×185D×200H、mm)に個別で収容した。飼料は、固型飼料CRF−1(オリエンタル酵母工業(株))を、ステンレス製固型飼料給餌器を用いて自由に与えた。水は、ポリサルフォン製給水器(先管ステンレス製)により、水道水を自由に与えた。
(1)群分け
検疫・馴化期間中の一般状態観察において異常が認められない動物を選択し、体重を指標として、層別連続無作為化法により下記群構成表(表1)に基づき群分けを行った。残余動物については、群分け実施日に試験群から除外し、エーテルの過剰麻酔により安楽死させ処分した。
飼育環境のモニタリングをするために、群分け後の残余動物のうち検疫・馴化期間に異常の見られなかった3匹の動物を、個体識別番号の若い順に選定して、モニタリング動物を設定した。モニタリング動物は、試験群と同一の動物室で、試験群の最終剖検日まで飼育した。
イ)発癌剤の調製
DMBAを、電子上皿天秤Sartorius Laboratory(ザルトリウス(株))を用いて必要量秤量した。秤量したDMBAは、ごま油の入ったビーカーに入れ、マイティーマグネチックスターラー(小池精密機器製作所)を用いて完全に溶解するまで攪拌した。溶解後、メスシリンダーに移して20 mg/mLの濃度になるようにメスアップした。調製時には、吸入及び皮膚への付着を避けるためにマスク、安全メガネ及び手袋を着用し、ケミカルハザード対策を行った。用時調製とした。投与後の残余発癌剤は、医療廃棄物として処理した。
群分け後のそれぞれの動物に発癌剤を投与した。すなわち、経口ゾンデ(ディスポーザブル経口ゾンデ、(有)フチガミ器械)と注射筒(ディスポーザブルシリンジ、テルモ(株))を用いて、1mL/匹の投与量で強制経口投与した。投与時には、吸入及び皮膚への付着を避けるために、マスク、安全メガネ及び手袋を着用した。
イ)被験物質投与液の調製
媒体の調製は、CMCを電子上皿天秤Sartorius Laboratory(ザルトリウス(株))を用いて必要量秤量した。秤量したCMCは、ビーカーに入れた蒸留水をマイティーマグネチックスターラー(小池精密機器製作所)を用いて撹拌しながら、少しずつ加えた。メスシリンダーに移して0.5%(W/V)にメスアップした。調製した媒体は、調製日を含めて9日間を限度に冷蔵下で保存し使用した。
群分け日の翌日から投与を開始した(1日目とした)。1日1回12週間連続で強制経口投与した。
投与の際には、経口ゾンデ(ディスポーザブル経口ゾンデ、(有)フチガミ器械)と注射筒(ディスポーザブルシリンジ、テルモ(株))を用いて、群構成表に従って5mL/kg/dayで強制経口投与した。投与液量は、投与時に最も近い日に測定した体重値から算出した。
発癌剤の投与後、一般状態観察を毎日行った。体重測定を週1回の割合で行った。
腫瘍の発生が確認される場合は、発生している腫瘍の個数を測定し、各腫瘍の推定腫瘍体積(mm3)を週1回の割合で算出した。なお、各腫瘍の推定腫瘍体積(mm3)は、腫瘍付近の剃毛を行いノギスを用いて腫瘍径(長径a及び短径b、mm)を測定後、下記式に従って算出し、各腫瘍における推定腫瘍体積の総和を求めた。
各腫瘍の推定腫瘍体積(mm3)=0.5×a×b2
投与期間終了日に糞便採取を行った。採取日の午前中に、2連ケージから繁殖ケージに個体別に動物を移した。1時間放置し、繁殖ケージに排泄された糞便を動物ごとに回収し、−80℃に設定したディープフリーザーで保存した。
投与期間終了日の翌日に解剖を行った。エーテルによる麻酔下で開腹し、腹大動脈から放血して安楽死させた。その後、各個体の腫瘍を全て摘出し、電子天秤TX323L((株)島津製作所)を用いて湿重量を測定した。湿重量測定後の腫瘍は廃棄した。
得られた数値(体重、推定腫瘍体積及び解剖時摘出腫瘍重量)は、各群で平均値及び標準誤差を算出した。
各群間の有意差は、Bartlett法により等分散性の検定を行い、等分散の場合はさらに一元配置分散分析を行い、有意である場合はTukey法により平均値の比較を行った。不等分散の場合はKruskal−WallisのH検定を行い、有意である場合はTukey法により平均順位の比較を行った。Bartlett法、一元配置分散分析及びKruskal−WallisのH検定については、有意水準を危険率5%、Tukey法については有意水準を危険率5%及び1%とした。
(1)一般状態及び体重推移
各群の体重推移を図1に示す。対照群は、試験期間を通じて増加した。低用量群と高用量群は、対照群とほぼ同様の推移を示した。各群間に有意差は認められなかった。
また、一般状態については、対照群で8日目に1匹死亡が認められた(動物番号:007)。低用量群で4日目に1匹死亡が認められた(動物番号:106)。高用量群で76日目に1匹死亡が認められた(動物番号:209)。
各群の腫瘍発生個体数推移を図2に示す。対照群は35日目に腫瘍の発生が認められた個体数は1匹であった。その後、発生個体は増加し84日目では10匹であった。低用量群は42日目まで腫瘍の発生は認められなかった。49日目に腫瘍の発生が認められた個体数は4匹であった。その後、発生個体は増加し84日目では11匹であった。高用量群は42日目まで腫瘍の発生は認められなかった。49日目に腫瘍の発生が認められた個体数は2匹であった。その後、発生個体は増加し84日目では11匹であった。
各群の推定腫瘍体積推移を図3に示す。対照群は、35日目(5週後)から腫瘍の発生が確認された。その後、新たな腫瘍発生が確認され、それぞれの腫瘍体積も増加を示した。低用量群は、49日目(7週後)から腫瘍の発生が確認された。その後、新たな腫瘍発生が確認され、それぞれの腫瘍体積は増加を示した。42日目の時点では、対照群と比較して有意に低い値であった。高用量群は、49日目(7週後)から腫瘍の発生が確認された。その後、新たな腫瘍発生が確認され、それぞれの腫瘍体積は増加を示した。42及び49日目に、対照群と比較して有意に低い値であった。
各群の腫瘍湿重量を図4に示す。低用量群は、対照群とほぼ同様の湿重量であった。高用量群は、対照群と比較して有意ではないが、低い値を示した。
低用量及び高用量群では、ともに腫瘍の発生時期が対照群と比較して遅く、高用量群は腫瘍重量についても対照群と比較して有意ではないが低い値を示した。このことから、被験物質であるセロビオースは、発癌性物質であるDMBAにより誘発される乳がんに対して、その発生を抑制することが示唆された。
セロビオースについての13C NMR、1H NMR及びIR測定を行った。得られたNMRスペクトル及び赤外吸収スペクトルを図5〜7に示す。
図6と上記(特許文献4)のFIGURE 4のNMRチャートとの比較から明らかなように、セロビオース特有のピークが両チャートに確認されたが、FIGURE 4のNMRチャートにおいては、さらに別の位置にピークが確認された。この結果から、図5〜7で示されているものは高純度のセロビオースであるのに対して、(特許文献4)に記載されているものはセロビオースの不純物であることが明らかとなった。
セロビオースを用いて細胞生存率に関する試験を次の方法で行った。
各種株化細胞に対する被験物質(セロビオース)の選択的殺細胞活性の有無を検討した。
(1)被験物質
名称 :セロビオース
保管方法 :冷蔵、暗所、除湿
(2)使用細胞
細胞種 :HeLa(ヒト子宮頸ガン由来細胞株)、HaCaT(ヒト由来不死化角化細胞)及びHep−G2(ヒト肝ガン由来細胞株)
(3)使用培地
培地名 :HeLa専用培地、HaCaT専用培地及びHep−G2専用培地
(4)使用試薬(XTTアッセイ用)
試薬名 :Cell Proliferation Kit(XTT)
メーカー名 :コスモ・バイオ(株)
カタログNo. :20−300−1000
(細胞の解凍・継代)
(1)HeLa、HaCaT及びHep−G2を解凍し、各種専用培地で培養した。
(2)2〜3回細胞継代を行った。
(3)増殖性が回復した細胞を試験に使用した。
(1)HeLa、HaCaT及びHep−G2を96ウェルプレート2枚のそれぞれに1×104細胞/100μL/ウェルで24ウェル分播種した。
(2)24時間、CO2インキュベーター内で培養した。
(3)被験物質を0(対照)、0.001、0.01、0.1、1及び10mg/mLの6段階の濃度で添加した(N=4)。
(4)添加後、3時間CO2インキュベーターで培養した。
(5)培養後、細胞の写真撮影を行った。
(6)写真撮影後、各種細胞を培養した96ウェルプレート1枚の被験物質が含まれる培地を除去し、通常の培地に交換した。
(7)XTT reagentを50μL添加した。
(8)添加後、3時間CO2インキュベーターで培養した。
(9)450〜500nmの吸光度を測定した(ref.:630〜690nm)。
(1)HeLaを96ウェルプレート1枚に1×104細胞/100μL/ウェルで16ウェル分播種した。
(2)24時間、CO2インキュベーター内で培養した。
(3)デキサメタゾンを、0(対照)、10、100及び500μMの3段階の濃度で添加した(N=4)。
(4)添加後、3時間CO2インキュベーターで培養した。
(5)XTT reagentを50μL添加した。
(6)添加後、3時間CO2インキュベーターで培養した。
(7)450〜500nmの吸光度を測定した(ref.:630〜690nm)。
HeLa、HaCaT及びHep−G2についてのXTTアッセイの結果を図8〜10に示す。図8〜10から明らかなように、HeLa及びHaCaTは被験物質10mg/mLの濃度においても、生存率はコントロールと比較して、ほとんど変化は認められなかった。また、Hep−G2では被験物質の高濃度群において最大約15%の生存率の減少が認められた。また、使用キットの性能確認として、HeLaを用いて、アポトーシス誘導剤であるデキサメタゾンを使用してアッセイを行った。その結果を図11に示す。デキサメタゾン500μMにおいて約40%の生存率の低下が認められたことから、キットの性能には問題ないことが確認された。
Claims (4)
- セロビオースを有効成分とする乳癌の腫瘍の発生又は成長を抑制するための医薬。
- 殺細胞作用を有しない請求項1に記載の医薬。
- セロビオースが、綿花の酵素分解物である請求項1又は2に記載の医薬。
- 乳癌が、7,12−ジメチルベンゾ[a]アントラセンにより誘発されたものである請求項1〜3のいずれかに記載の医薬。
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