CN114230454A - 没食子酸类天然活性成分的钙配合物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一系列没食子酸类天然活性成分的钙配合物及其合成方法和应用。所述的以没食子酸类天然活性成分为配体的钙配合物，为配合物GA‑Ca、配合物MG‑Ca、配合物EG‑Ca或配合物PG‑Ca，分别由没食子酸或其衍生物和钙盐或氢氧化钙在极性溶剂中反应，所得反应液经静置、冷却后而析出；所述的极性溶剂为水，或者是水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合。本发明所述的钙配合物在保持其配体抗菌活性和杀菌活性的同时具有更低的毒性和更高生物安全性。

Description

没食子酸类天然活性成分的钙配合物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及没食子酸类天然活性成分的钙配合物及其合成方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
多酚类物质由于其特殊的酚羟基结构，能够有效抑制自由基的产生并对其进行清除，且多酚类物质大多低毒或无毒，对机体没有太大损害，是良好的天然抗氧化剂。没食子酸(GA)及其衍生物(如没食子酸甲酯(MG)、没食子酸乙酯(EG)、没食子酸丙酯(PG)等)是广泛存在于自然界许多天然植物中的一类多酚类天然活性成分，也是一种天然次级代谢产物。研究表明没食子酸类成分对DPPH、ABTS、-OH·等自由基的体外清除作用非常明显(谢晓艳，刘洪涛，张吉等.重庆医科大学学报，2011，36(3)：319-322)。除了清除自由基外，研究表明没食子酸类活性成分还具有抗肿瘤活性，同时表现出广谱抗菌作用(郑曙明，黄建军，吴青，沙莎.水生生物学报，2010，34(01)：57-64.)，对不同菌株有不同的增殖抑制作用。本领域公知，没食子酸类活性成分的关键药效团是其亲水的酚羟基和羧基，在常规的配合物设计或合成中通常强调避免其与金属离子配伍，以免因为配位(络合)作用而降低其活性。
钙是生命体必需的宏量生命元素之一，生命体中的绝大多数钙以固态结晶的形式存在于牙齿和骨骼中，这些钙变成骨骼钙，而极少数钙以溶液自由离子形式存在于软组织、细胞和血液中，钙在生命体中的作用主要体现在以下几个方面：
(1)骨钙起到支持和保护的作用，并且能维持细胞外液中钙离子相对恒定的浓度，保证人体或动物组织的正常兴奋，并直接影响其健康生长；
(2)钙离子在血液中具有抗凝血剂的作用，并维持其pH值和电解质平衡；
(3)生命体的神经和肌肉的正常活动需要钙离子的介导；
(4)钙能参与并促进多种细胞代谢酶的作用活性。
但迄今为止，尚未有以没食子酸类天然活性成分作为配体的金属配合物的合成及生物活性方面的相关研究报道，而将没食子酸类天然活性成分与钙离子的配合物研究更属空白。本发明所设计的没食子酸类天然活性成分的钙配合物，却正是将没食子酸类配体的亲水基团(羟基、羧基)与钙离子配位反应而得到。通过这种配位方式，以期能够适当降低其水溶性、增加其脂溶性，从而有利于没食子酸类活性成分在体内的载运和透膜吸收，进而提高其体内的生物利用度和药用效果；同时希望进一步降低其毒性、提高其生物安全性，最终能够开发成为一类具有减毒、增效的新型钙配位型的新药或新型饲料添加剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一系列在保持没食子酸类成分抗菌活性和杀菌活性的同时毒性更低且生物利用度更高的没食子酸类天然活性成分的钙配合物及其合成方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的没食子酸类天然活性成分的钙配合物为以没食子酸类天然活性成分为配体的钙配合物，具体是配合物GA-Ca、配合物MG-Ca、配合物EG-Ca或配合物PG-Ca，其中，
所述配合物GA-Ca的化学式为：[C14H6Ca2O10]n，其结构式如下述式(I)所示，式(I)中，H2O为每一个Ca的配位溶剂分子，x＝2～4，n为大于或等于1的整数；
所述配合物MG-Ca的化学式为：[C16H12CaO10]2-，其结构式如下述式(II)所示，式(II)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4；
所述配合物EG-Ca的化学式为：[C18H16CaO10]2-，其结构式如下述式(III)所示，式(III)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4；
所述配合物PG-Ca的化学式为：[C20H20CaO10]2-，其结构式如下述式(IV)所示，式(IV)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4；
Figure BDA0003425780880000021
本发明所述没食子酸类天然活性成分的钙配合物的合成方法，包括：取没食子酸或其衍生物和钙盐或氢氧化钙置于极性溶剂中，在加热或不加热的条件下反应，反应完成后静置，有沉淀析出，收集沉淀，即得到相应的目标配合物；其中，所述的极性溶剂为水，或者是水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合。
上述钙配合物的合成方法中，所述没食子酸或其衍生物具体为没食子酸(可以是无水没食子酸或没食子酸一水化合物)、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯，当原料分别为没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯和没食子酸丙酯时，对应得到的目标配合物分别为配合物GA-Ca、配合物MG-Ca、配合物EG-Ca和配合物PG-Ca。
上述钙配合物的合成方法中，所述的钙盐优选为无机钙盐，进一步优选为选自无水氯化钙、二水氯化钙、四水硝酸钙、无水高氯酸钙、四水高氯酸钙和二水硫酸钙中的一种或两种以上的组合。所没食子酸或其衍生物与钙盐或氢氧化钙的物质的量之比可以是0.5：1～2：1，优选为1：1。
上述钙配合物的合成方法中，所述的极性溶剂优选为水。当极性溶剂为水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合时，水在极性溶剂中所占的比例为≥5v/v％，进一步优选水在极性溶剂中所占的比例为≥10v/v％，更优选水在极性溶剂中所占的比例为20～40v/v％。所述的含1～3个碳原子的低碳醇具体可以是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。对于极性溶剂的用量，以能够溶解参加反应的原料为宜，通常情况下，以10mmol的钙盐或氢氧化钙为基准计算，全部原料所用极性溶剂的总用量一般为20～200mL。
上述钙配合物的合成方法中，可以通过在常温下添加一定量的碱性物质(如氨水、碳酸氢钠、三乙胺、碳酸钠或碳酸钾等)或采用加热溶解的方式实现加速溶解没食子酸或其衍生物的目的，所述碱性物质的加入量优选是控制反应体系的pH≤9.0，更优选是控制体系的pH＝6.0～8.5。
上述钙配合物的合成方法中，反应是否完全采用薄层层析(TLC)跟踪检测。反应优选是在加热的条件下进行，这样可以进一步提高产率。具体的，优选反应在≥40℃的条件下进行，进一步优选反应在40～80℃条件下进行，更优选是在40～60℃条件下进行。对于反应时间，通常控制为≥1h，优选为1～12h。申请人的实验结果表明，当反应在40～60℃条件下进行、反应时间≥1h时，所得配合物的产率即可≥60％。
申请人发现，上述钙配合物粉末可采用溶剂重新溶解，再缓慢降温、析晶的方式来获得相应配合物的单晶，因此，本发明还提供上述钙配合物的钙配合物晶型，具体为配合物GA-Ca晶型、配合物MG-Ca晶型、配合物EG-Ca晶型或配合物PG-Ca晶型，其中，
所述配合物GA-Ca晶型属于单斜晶系，P21/n空间群，晶胞参数为
Figure BDA0003425780880000031
Figure BDA0003425780880000032
α＝90°，β＝105.419(11)°，γ＝90°；
所述配合物MG-Ca晶型属于单斜晶系，P21/n空间群，晶胞参数为
Figure BDA0003425780880000033
Figure BDA0003425780880000034
α＝90°，β＝99.695(4)°，γ＝90°；
所述配合物EG-Ca晶型属于单斜晶系，C2/c空间群，晶胞参数为
Figure BDA0003425780880000035
Figure BDA0003425780880000036
α＝90°，β＝107.476(3)°，γ＝90°；
所述配合物PG-Ca晶型属于三斜晶系，P-1空间群，晶胞参数为
Figure BDA0003425780880000037
Figure BDA0003425780880000038
α＝107.3250(10)°，β＝90.1540(10)°，γ＝115.6210(10)°。
上述钙配合物晶型的制备方法，包括：将配合物GA-Ca、配合物MG-Ca、配合物EG-Ca或配合物PG-Ca用结晶溶剂溶解，冷却析晶，收集晶体，即得相应的目标配合物晶型；其中，
在制备配合物GA-Ca晶型时使用的结晶溶剂为DMF(N,N’-二甲基甲酰胺)、水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合物，所述DMF、水和含1～3个碳原子的低碳醇的体积比为1：2～6：4～8；
在制备配合物MG-Ca晶型、配合物EG-Ca晶型和配合物PG-Ca晶型时，使用的结晶溶剂为水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合物。
在上述钙配合物晶型的制备方法中，所述的含1～3个碳原子的低碳醇具体为甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。在制备配合物MG-Ca晶型、配合物EG-Ca晶型和配合物PG-Ca晶型时，使用的结晶溶剂中水与含1～3个碳原子的低碳醇的配比可以是任意配比。
申请人通过试验发现，本发明所述的钙配合物和/或钙配合物晶型在保持没食子酸类成分抗菌活性和杀菌活性的同时，尽管配合物的水溶性有所降低，但其对实验动物的毒性并未增加；且配合物对实验动物显示出更好的抗应激和免疫能力以及促生长作用，实验动物的采食量、活力和料肉比均有提高毒性更低且生物安全性更高，因此，本发明还提供上述钙配合物和/或上述钙配合物晶型在制备动物专用抗菌药物或饲料添加剂中的应用。进一步的，本发明还包括一种动物专用抗菌药物或饲料添加剂，其含有上述钙配合物和/或上述钙配合物晶型。
与现有技术相比，本发明采用非常规的配位方式即将没食子酸类配体的亲水基团(羟基、羧基)与钙离子配位反应得到目标钙配合物，总体上保持了相应配体的体外抗菌活性，尽管所得配合物的水溶性有所降低，但其对实验动物的毒性并未增加；且通过对比，配合物对实验动物显示出更好的抗应激和免疫能力以及促生长作用，实验动物的采食量、活力和料肉比均有提高，有潜力开发成为一种优良的新的动物专用抗菌药物或新型饲料添加剂。
附图说明
图1为本发明实施例3制得的最终产物的单晶结构图。
图2为本发明实施例8制得的最终产物的单晶结构图。
图3为本发明实施例10制得的最终产物的单晶结构图。
图4为本发明实施例12制得的最终产物的单晶结构图
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
向100mL的烧瓶中准确称入1.88g(10mmol)的没食子酸，加入50mL甲醇，60℃水浴加热溶解后，溶液为无色；再准确称量1.47g(10mmol)的二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，溶于10mL水中，缓慢滴加入上述甲醇溶液中，得到澄清的透明无色液体。60℃下反应4h后停止。反应液降至室温，有大量白色沉淀析出。抽滤后，用水、乙醇分别洗涤两次，干燥，得到白色粉末(Yield:73％)。将本实施例所得产物用红外光谱和电喷雾质谱进行结构表征，波谱如下：
红外光谱：ν(C＝O)1661.91(m)；ν(C＝C)1591.22(vs),1503.79(m),1369.96(m),ν(C–C)1303.35(w)；ν(C–O)1045.83(s)。
质谱数据：ESI-MS m/z:215.02[GA-H+2Ca+Cl+2DMF]2+、255.00[GA-H+Ca+CH3CH2OH]+。
因此，确定本实施例所得产物为配合物GA-Ca，其结构式如下述式(I)所示：
Figure BDA0003425780880000051
式(I)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4，n为大于或等于1的整数。
实施例2
重复实施例3，不同的是，在溶解没食子酸时用水代替甲醇。
结果有白色沉淀析出。
对所得产物采用红外光谱和电喷雾质谱进行表征，所得谱图与实施例1中产物的谱图一致，确定所得产物为配合物GA-Ca。
实施例3
取实施例1所得的配合物0.215g溶于由水、甲醇和DMF组成的结晶溶剂5mL(所述水、甲醇和DMF的体积比为3：6：1)中。将所得混合溶液加热到60℃至配合物完全溶解，得到澄清的透明无色液体，将其装入10mL的耐热硅硼玻璃瓶，置于60℃的真空干烘箱中，72h后取出放入缓慢冷却区冷却，24h后取出，小瓶子内有无色透明长条形晶体析出(Yield:85％)。在晶体中选取大小合适的单晶，通过X射线单晶衍射进行结构测定，详细的晶体测定数据如下述表1所示，部分键长键角数据如下述表2所示，所得晶体的晶体结构如图1所示，确定所得的无色透明长条形晶体为配合物GA-Ca晶型。
表1配合物GA-Ca晶型的晶体学数据
Figure BDA0003425780880000052
Figure BDA0003425780880000061
表2配合物GA-Ca晶型的部分键长键角数据
Figure BDA0003425780880000062
Symmetry codes:(i)-x+2,-y+1,-z+1；(ii)-x+2,-y,-z；(iii)x,y-1,z；(iv)-x+1,-y+1,-z；(v)-x+1,-y+1,-z+1；(vi)x,y,z-1；(vii)x,y,z+1；(viii)x,y+1,z.
对比例3-1
重复实施例3，不同的是，结晶溶剂由水、甲醇和DMF按7：3：1的体积比组成。
结果没有无色透明长条形晶体析出。
实施例4
重复实施例3，不同的是，结晶溶剂由水、甲醇和DMF按2：7：1的体积比组成。
结果得到无色透明长条形晶体。所得晶体采用X射线单晶衍射进行结构测定，确定为配合物GA-Ca晶型。
实施例5
重复实施例3，不同的是，结晶溶剂由水、甲醇和DMF按6：4：1的体积比组成。
结果得到无色透明长条形晶体。所得晶体采用X射线单晶衍射进行结构测定，确定为配合物GA-Ca晶型。
实施例6
向100mL的烧瓶中准确称入1.84g的没食子酸甲酯，加入40mL乙醇，60℃水浴加热溶解后，溶液为无色；再准确称量1.47g的二水氯化钙，溶于20mL水中，缓慢滴加入上述乙醇溶液中，得到澄清的透明无色液体。40℃下反应12h后停止。反应液降至室温，有大量白色沉淀析出。抽滤后，用水、乙醇分别洗涤两次，得到白色粉末(Yield:81％)。将本实施例所得产物用红外光谱和电喷雾质谱进行结构表征，波谱如下：
红外光谱：ν(Ar-H)3143.62(m)；ν(-CH3)2951.75(w)；ν(C＝O)1671.31(s)；ν(C＝C)1579.64(s),1525.80(s),1463.52(vs)；ν(C–O)1042.77(m)。
质谱数据：ESI-MS m/z:477.01,[2MG-H+Ca+2CH3OH]+。
因此，确定本实施例所得产物为配合物MG-Ca，其结构式如下述式(II)所示：
Figure BDA0003425780880000071
式(II)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4。
实施例7
重复实施例6，不同的是，在溶解没食子酸甲酯时用甲醇代替乙醇。
结果有白色沉淀析出。
对所得产物采用红外光谱和电喷雾质谱进行表征，所得谱图与实施例6中产物的谱图一致，确定所得产物为配合物MG-Ca。
实施例8
将实施例6所得的配合物0.477g溶于由15mL水和15mL乙醇组成的结晶溶剂中，所得混合溶液加热到55℃至配合物完全溶解；用保鲜膜覆盖烧杯口以使溶液可以缓慢蒸发；缓慢降温至室温后，静置3天，有无色透明棒状晶体生成(Yield:71％)。在晶体中选取大小合适的单晶，通过X射线单晶衍射进行结构测定，详细的晶体测定数据如下述表3所示，部分键长键角数据如下述表4所示，所得晶体的晶体结构如图2所示，确定所得的无色透明棒状晶体为配合物MG-Ca晶型。
表3配合物MG-Ca晶型的晶体学数据
Figure BDA0003425780880000081
表4配合物MG-Ca晶型的部分键长键角数据
Figure BDA0003425780880000082
Symmetry codes:(i)-x+2,-y+1,-z+1；(ii)-x+2,-y,-z；(iii)x,y-1,z；(iv)-x+1,-y+1,-z；(v)-x+1,-y+1,-z+1；(vi)x,y,z-1；(vii)x,y,z+1；(viii)x,y+1,z.
实施例9
向100mL的烧瓶中准确称入1.98g的没食子酸乙酯，加入10mL乙醇和15mL正丙醇，80℃水浴加热溶解后，溶液为无色；再准确称量1.47g的二水氯化钙，溶于5mL水中，缓慢滴加入上述混合溶液中，得到澄清的透明无色液体。80℃下反应1h后停止。反应液降至室温，有大量白色沉淀析出。沉淀抽滤，用水、乙醇分别洗涤两次，得到白色粉末(Yield:63％)。将本实施例所得产物经红外光谱和电喷雾质谱进行结构表征，波谱如下：
红外光谱：ν(-CH3)3230.64(m)；ν(C＝O)1662.87(s)；ν(C＝C)1588.26(s),1463.17(s),1397.07(vs)；ν(-CH2)1367.99(s)；ν(C-O)1240.99(vs)。
质谱数据：ESI-MS m/z:485.03,[2EG-H+Ca+CH3OH+H2O]+。
因此，确定本实施例所得产物为配合物EG-Ca，其结构式如下述式(III)所示：
Figure BDA0003425780880000091
式(III)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4。
实施例10
将实施例9所得的配合物0.485g溶于由5mL水和30mL乙醇组成的结晶溶剂中，所得混合溶液加热到60℃至配合物完全溶解；用保鲜膜覆盖烧杯口，降温至室温后，静置并缓慢蒸发溶液48h后，有无色透明棒状晶体生成(Yield:88％)。在晶体中选取大小合适的单晶，通过X射线单晶衍射进行结构测定，详细的晶体测定数据如下述表5所示，部分键长键角数据如下述表6所示，所得晶体的晶体结构如图3所示，确定所得的无色透明棒状晶体为配合物EG-Ca晶型。
表5配合物EG-Ca晶型的晶体学数据
Figure BDA0003425780880000092
表6配合物EG-Ca晶型的部分键长键角数据
Figure BDA0003425780880000101
Symmetry codes:(i)-x+2,-y+1,-z+1；(ii)-x+2,-y,-z；(iii)x,y-1,z；(iv)-x+1,-y+1,-z；(v)-x+1,-y+1,-z+1；(vi)x,y,z-1；(vii)x,y,z+1；(viii)x,y+1,z.
实施例11
向100mL的烧瓶内先称入没食子酸丙酯2.12g和二水氯化钙2.94g，随后加入50mL水和20mL乙醇，加热至60℃，搅拌反应48h，反应产物完全溶解于反应液中。将反应液趁热过滤，滤液缓慢降温至室温，析出大量白色沉淀。所得沉淀经水、乙醇二次洗涤后，在烘箱干燥24h，得到米黄色粉末(Yield:78％)。将本实施例所得产物经红外光谱和电喷雾质谱进行结构表征，波谱如下：
红外光谱数据：ν(O-H)3319.58(s)；ν(-CH3)2971.50(w)；ν(C＝O)1668.55(s)；ν(C＝C)1594.05(s),1539.56(vs),1467.29(vs)；ν(-CH2)1369.08(s),1338.55(m)；ν(C-O)1247.24(vs)。
质谱数据：ESI-MS m/z:308.98,[PG-H+Ca+Na+Cl]+、386.99,[PG-H+Ca+Na+Cl+DMSO]+。
因此，确定本实施例所得产物为配合物PG-Ca，其结构式如下述式(IV)所示：
Figure BDA0003425780880000102
式(IV)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4。
实施例12
将实施例11所得的配合物0.499g溶于由10mL水和50mL乙醇组成的结晶溶剂中，所得混合溶液加热到60℃至配合物完全溶解；用保鲜膜覆盖烧杯口，静置于30℃的真空干燥箱中，缓慢蒸发溶液24h后，有无色透明棒状晶体生成(Yield:75％)。在晶体中选取大小合适的单晶，通过X射线单晶衍射进行结构测定，详细的晶体测定数据如下述表7所示，部分键长键角数据如下述表8所示，所得晶体的晶体结构如图4所示，确定所得的无色透明棒状晶体为配合物PG-Ca晶型。
表7配合物PG-Ca晶型的晶体学数据
Figure BDA0003425780880000111
表8配合物PG-Ca晶型的部分键长键角数据
Figure BDA0003425780880000112
Symmetry codes:(i)-x+2,-y+1,-z+1；(ii)-x+2,-y,-z；(iii)x,y-1,z；(iv)-x+1,-y+1,-z；(v)-x+1,-y+1,-z+1；(vi)x,y,z-1；(vii)x,y,z+1；(viii)x,y+1,z.
实施例13
向100mL的烧瓶内先称入没食子酸丙酯2.12g，随后加入50mL水和20mL乙醇，加热至50℃使之溶解；再将氢氧化钙(Ca(OH)2)0.74g加入到10mL水中形成悬浮液，再逐渐加到上述溶液中混合反应6h。反应停止后，将反应液进行减压蒸馏以去除掉大部分乙醇，降至室温，随即有大量的白色沉淀生成。所得沉淀经水、乙醇二次洗涤后，在烘箱干燥24h，得到米黄色粉末(Yield:88％)。所得产物的红外光谱和电喷雾质谱与实施例7中产物的谱图一致，表明用氢氧化钙替代二水氯化钙，仍然可以得到相同的产物即配合物PG-Ca。
实施例14
重复实施例11，不同的是：分别用无水氯化钙(CaCl2)、四水硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)、无水高氯酸钙(Ca(ClO4)2)、四水高氯酸钙(Ca(ClO4)2·4H2O)和二水硫酸钙(CaSO4)·4H2O)代替二水氯化钙，用正丙醇代替乙醇。
结果均有白色沉淀析出。
对所得产物采用红外光谱和电喷雾质谱进行表征，所得谱图与实施例11中产物的谱图一致，表明用无水氯化钙、四水硝酸钙、无水高氯酸钙、四水高氯酸钙或二水硫酸钙替代二水氯化钙，仍然能够得到配合物PG-Ca。
实验例1：没食子酸类活性成分和本发明实施例1、6、9、11所制得的配合物对3种典型的水产致病性细菌的体外抑菌实验。
最小抑菌浓度的测定方法：最小抑菌浓度(MIC)是指在含有一定浓度药物的培养基上，培养细菌18～24h，能够抑制细菌出现明显增长的最低药物浓度。本次实验采用倍比稀释法来测定8种化合物的最小抑菌浓度。表9和表10分别列出了各化合物对上述各致病菌的最小抑菌浓度(MIC)结果和最低杀菌浓度(MBC)结果：
表9各受测化合物对3种致病菌的MIC值(mg/mL)
Figure BDA0003425780880000121
表10各受测化合物对3种致病菌的MBC值(mg/mL)
Figure BDA0003425780880000131
由表9可知，没食子酸类活性成分及其钙配合物对以上三种典型的水产致病菌有显著的抑制效果，但抑制程度略有不同。其中，各化合物对海豚链球菌的抑制效果最好(相应MIC均在0.15625mg/mL及以下)。除GA及GA-Ca外，各化合物对韦氏气单胞菌的抑制效果次之(相应MIC均为0.3125mg/mL)，而GA及GA-Ca对韦氏气单胞菌的抑菌效果很弱，MIC均为2.5mg/mL。除PG及PG-Ca外，各化合物对费氏柠檬酸杆菌的抵制效果较弱(MIC均在1.25mg/mL)，PG及PG-Ca对费氏柠檬酸杆菌的MIC则为0.625mg/mL，略强于其它各化合物。
由表10可知，各化合物在不同程度对以上3种水产致病菌也产生杀灭效果。其中，各化合物对海豚链球菌的灭菌效果较好，且大体相同(MBC在1.25～2.5mg/mL之间)。对韦氏气单胞菌的灭菌效果也大体在此浓度范围内。对费氏柠檬酸杆菌的灭菌效果相对更弱，除PG-Ca的MBC为2.5mg/mL以外，其余化合物的MBC均大于2.5mg/mL。
另一方面，没食子酸类活性成分的抑菌活性与其各自的钙配合物大体相当；仅个别化合物略有差异。但总体来说，PG-Ca的抑菌活性和灭菌活性均相对更好。在此基础上，以PG-Ca为实验例，与PG对比，进一步通过药浴给药方式对比测试PG-Ca对实验对象-罗非鱼的急性毒性，及其对罗非鱼的体重相对增长率和料肉比的作用差异。
实验例2：化合物对罗非鱼的毒性(药浴存活率)和促生长作用的实验方法：
本实验以罗非鱼为实验对象，通过化合物的药浴实验，测试按实施例11所述方法制备的配合物PG-Ca及其配体PG在不同浓度下对鱼体的急性毒性以及对其生长状态与活力的影响。实验前，将罗非鱼随机分组，每一组鱼体重大小相近，无显著差异；每组50尾。罗非鱼分组后，均在各个实验桶中暂养1～2d以适应实验环境，期间不投饵、不换水。药浴实验开始前，称量平均体重，记录。
急性毒性实验(即安全剂量实验)的天数为19天，每一天药浴1次，每次1小时。
结果：如下表11所示，经过长达19天的急性毒性实验，可以发现：(1)与空白组和溶剂组相比，无论是PG还是其钙配合物PG-Ca，通过药浴给药方式均可以有效提高罗非鱼的存活率；且总体上呈一定的浓度依赖性，即药浴浓度越高，则存活率越高。(2)对比PG及PG-Ca，则PG-Ca的药效更佳，在同等药浴浓度下，PG-Ca组的存活率大多高于PG组的，显示出PG-Ca较PG的药效总体显著提高。(3)具体来看，罗非鱼在2.5ppm的PG-Ca浓度下存活率最高，达到最高为82％；而对于PG，则在5ppm浓度下存活率最高，也为82％。
表11不同浓度的配合物PG-Ca及其配体PG在药浴给药方式下对罗非鱼存活率的影响
Figure BDA0003425780880000141
注：浓度单位ppm指养殖水体中药物的质量浓度，g药物/吨水。
结果：如下表12所示，根据共计19天的罗非鱼相对体重增长率的对比发现，无论是PG还是其钙配合物PG-Ca对于罗非鱼的体重增长，其效果均明显高于空白组和溶剂对照组。其中，空白组的增重率只有4.80％，DMSO溶剂组更是呈负增长(-11.60％)；而PG及PG-Ca的各组增重率则在6.62％～101.38％之间，增重效率及相应的料肉比数据优势明显。对比PG和PG-Ca来看，则PG-Ca的优势更为明显，各浓度组增重率在34.47％～63.06％之间，总体上均高于同等浓度的PG组；其中2.5ppm组的增重率最高，料肉比达到最佳。只有1.25ppm的PG组比较特殊，产生了最高的增重率(101.38％)，高于所有其它各组。但分析认为该组罗非鱼的死亡率高达38％，其中的小鱼较多死亡，从而导致平均体重增加显著；而2.5ppm的PG-Ca组死亡率只有18％，在总体养殖收益效果上仍然高于PG组。
表12不同浓度的配合物PG-Ca及其配体PG在药浴给药方式下对罗非鱼的相对增重率与料肉比
Figure BDA0003425780880000151
结论：
对比没食子酸类活性成分及其钙配合物对不同水产致病菌表现出来的抗菌活性，可知各个化合物对受试菌株中的几种典型致病菌都具有良好的抗菌活性，对不同菌株类型也表现出一定的选择性和敏感性差异。总体而言，各钙配合物保持了其没食子酸类配体的抗菌活性和杀菌活性。另一方面，通过药浴实验结果可以表明，以PG-Ca为代表，其急性毒性要弱于PG配体，同等浓度下有更高的存活率；且在不同梯度浓度下，PG-Ca药浴下的罗非鱼有更高的采食量、活力和更佳的料肉比，显示出更好的养殖效益，具有开发成为新药或新型饲料添加剂的前景。
上述内容是对本发明所作的进一步详细说明，但不能认定本发明的保护内容只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (10)

1.以没食子酸类天然活性成分为配体的钙配合物，为配合物GA-Ca、配合物MG-Ca、配合物EG-Ca或配合物PG-Ca，其中，
所述配合物GA-Ca的化学式为：[C14H6Ca2O10]n，其结构式如下述式(I)所示，式(I)中，H2O为每一个Ca的配位溶剂分子，x＝2～4，n为大于或等于1的整数；
所述配合物MG-Ca的化学式为：[C16H12CaO10]2-，其结构式如下述式(II)所示，式(II)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4；
所述配合物EG-Ca的化学式为：[C18H16CaO10]2-，其结构式如下述式(III)所示，式(III)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4；
所述配合物PG-Ca的化学式为：[C20H20CaO10]2-，其结构式如下述式(IV)所示，式(IV)中，H2O为配位溶剂分子，x＝2～4；
Figure FDA0003425780870000011
2.权利要求1所述钙配合物的合成方法，其特征是，取没食子酸或其衍生物和钙盐或氢氧化钙置于极性溶剂中，在加热或不加热的条件下反应，反应完成后静置，有沉淀析出，收集沉淀，即得到相应的目标配合物；其中，所述的极性溶剂为水，或者是水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述的钙盐为无机钙盐。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征是，所述的钙盐为选自无水氯化钙、二水氯化钙、四水硝酸钙、无水高氯酸钙四水高氯酸钙和二水硫酸钙中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是，当极性溶剂为水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合时，水在极性溶剂中所占的比例为≥5v/v％。
6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述反应在≥40℃的条件下进行。
7.以没食子酸类天然活性成分为配体的钙配合物晶型，为配合物GA-Ca晶型、配合物MG-Ca晶型、配合物EG-Ca晶型或配合物PG-Ca晶型，其中，
所述配合物GA-Ca晶型属于单斜晶系，P21/n空间群，晶胞参数为
Figure FDA0003425780870000021
Figure FDA0003425780870000022
α＝90°，β＝105.419(11)°，γ＝90°；
所述配合物MG-Ca晶型属于单斜晶系，P21/n空间群，晶胞参数为
Figure FDA0003425780870000023
Figure FDA0003425780870000024
α＝90°，β＝99.695(4)°，γ＝90°；
所述配合物EG-Ca晶型属于单斜晶系，C2/c空间群，晶胞参数为
Figure FDA0003425780870000025
Figure FDA0003425780870000026
α＝90°，β＝107.476(3)°，γ＝90°；
所述配合物PG-Ca晶型属于三斜晶系，P-1空间群，晶胞参数为
Figure FDA0003425780870000027
Figure FDA0003425780870000028
α＝107.3250(10)°，β＝90.1540(10)°，γ＝115.6210(10)°。
8.权利要求7所述钙配合物晶型的制备方法，其特征是，将配合物GA-Ca、配合物MG-Ca、配合物EG-Ca或配合物PG-Ca用结晶溶剂溶解，冷却析晶，收集晶体，即得相应的目标配合物晶型；其中，
在制备配合物GA-Ca晶型时使用的结晶溶剂为DMF、水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合物，所述DMF、水和含1～3个碳原子的低碳醇的体积比为1：2～6：4～8；
在制备配合物MG-Ca晶型、配合物EG-Ca晶型和配合物PG-Ca晶型时，使用的结晶溶剂为水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合物。
9.权利要求1所述的配合物和/或权利要求7所述的配合物晶型在制备动物专用抗菌药物或饲料添加剂中的应用。
10.一种动物专用抗菌药物或饲料添加剂，其含有权利要求1所述的配合物和/或权利要求7所述的配合物晶型。
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