CN1961650B - 新疆雪莲细胞组织培养物及其大规模继代培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大规模培养新疆雪莲细胞组织的方法，该方法为：以MS基本培养基附加一定量的NAA(萘乙酸)、6-BA(6-卞氨基嘌呤)为雪莲愈伤组织的培养基质；新疆雪莲种子经过培养诱导出雪莲植株；该植株作为外植体，在特定条件下进行脱分化处理，诱导愈伤组织；按工艺要求选取愈伤组织进行周期性的继代培养，使愈伤组织增殖，该愈伤组织一部分作用种子，其它收集干燥即为雪莲培养物；按质量要求收集雪莲培养物并进行干燥处理，即得本发明新疆雪莲细胞组织培养物。该方法不仅能明显提高新疆雪莲细胞培养物中有效成份的含量，而且有利于达到产业化水平。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物的组织培养物及其培养方法，特别是涉及一种新疆雪莲组织培养物及其培养的方法，属植物生物技术工程领域。
背景技术
雪莲是高山地区的民间药用植物，用于散寒除湿、活血通经、抗炎镇痛等，民间多用于风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、阳痿、高山不适应症等症的治疗。近年来，雪莲作为民族药在抗炎镇痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用倍受关注。但我国雪莲主要分布在4000m以上的高原寒带地区，如新疆、甘肃、四川、云南和西藏。这些地区气候多变，冷热无常，最高月平均气温3～10℃，最低月平均气温则在零下十几度到几十度，生长环境十分恶劣，只有耐寒的苔草属、蒿草属以及少数高山多年生草本植物与之伴生，一般在此环境下的雪莲植物大多为多年生，生长缓慢，人工栽培困难，长期以来掠夺性采挖已使雪莲资源严重匮乏，已使得雪莲成为濒危物种，自然资源难以满足临床日益增长的需要。因此应用细胞培养的方法进行雪莲的开发即可以满足临床对雪莲药物的需求，也可以保护自然资源，维护生态环境。但在有关雪莲组织培养的研究报道中，因存在许多问题极大地限制了其在实际生产中的应用，存在的问题有：在放大过程中不稳定，当放大培养到一定规模后有效成分的含量会降低；没有找到有效的筛选高产细胞系的手段等。
发明内容
本发明目的是提供一种新疆雪莲细胞组织培养物及其大规模继代培养的方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
本发明新疆雪莲细胞组织大规模继代培养的方法包括以下步骤：
I、植株诱导：
分别称取硝酸钾190重量份、硝酸铵165重量份、硫酸镁37重量份、磷酸二氢钾17重量份、氯化钙44重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，加水至5000体积份，混合均匀，得MS培养基母液A，4℃保存备用；
分别称取硫酸锰6.76重量份、硫酸锌3.44重量份、硼酸2.48重量份、碘化钾0.332重量份、钼酸钠0.1重量份、硫酸铜0.00005重量份、氯化钴0.00005重量份，分别加水200体积份，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，加水至2000体积份，混合均匀，得MS培养基母液B，4℃保存备用；
分别称取EDTA-2Na7.45重量份、硫酸亚铁5.57重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将2种溶液混匀，加热，加水至2000体积份，得MS培养基母液C，4℃保存备用；
称取甘氨酸0.4重量份、盐酸硫胺素0.08重量份、盐酸吡哆素0.1重量份、烟酸0.1重量份、肌醇20重量份，加水1000体积份，并加热至完全溶解，加水至1000体积份，混合均匀，得MS培养基母液D，4℃保存备用；
取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入MS培养基母液A100体积份、MS培养基母液B10体积份、MS培养基母液C20体积份、MS培养基母液D10体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份搅拌后，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得植株诱导MS培养基；分装；灭菌；备用；
将保藏的新疆雪莲种子用70～75％酒精浸泡25～30分钟，再用0.1～0.15％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗4～6次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下接种在植株诱导MS培养基上，每25ml培养基中接种8～15粒种子；在25℃，连续光照的条件下培养10天，出芽后，培养成雪莲植株；
II、诱导愈伤组织：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000体积份、MS培养基母液B2000体积份、MS培养基母液C2000体积份、MS培养基母液D1000体积份，4℃保存备用；取0.15～0.25重量份2，4-D，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至1000体积份，摇匀，得2，4-D母液，4℃保存备用；取0.05～0.15重量份6-BA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至500体积份，摇匀，得6-BA母液，4℃保存备用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入上述MS培养基母液A200体积份、MS培养基母液B20体积份、MS培养基母液C40体积份、MS培养基母液D20体积份、2，4-D母液20体积份、6-BA母液4体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份，搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得诱导愈伤组织MS培养基；分装；灭菌；备用；
雪莲植株继续培养至5～8cm，选取生长良好的雪莲植株作为外植体；将外植体接种于诱导愈伤组织MS培养基上，每25ml培养基中接种6～10块直径为0.5cm的外植体，暗培养5～10天；诱导产生愈伤组织，愈伤组织在光照条件下培养，光照条件为8～12小时/天，白光，温度为22℃～28℃；
III、培养物继代培养：
按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4℃保存备用；取1.5～2.5重量份NAA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入加水至10000体积份，摇匀，备用，得NAA母液，4℃保存备用；取0.5～1.5重量份6-BA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至5000体积份，摇匀，备用，得6-BA母液，4℃保存备用；称取蔗糖1200重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A2000体积份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、NAA母液600体积份、6-BA母液40体积份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；分装；灭菌；备用；
选取生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色等特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，筛选高产细胞系，使愈伤组织增殖，愈伤组织的培养条件为15重量份的愈伤组织种子需要在1000体积份的继代培养MS培养基培养，培养周期为15～20天，培养温度为20～30℃；至培养期，选取生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色特征的愈伤组织作为种子，种子量为生产量的15％，其他收集并低温真空干燥即为雪莲细胞组织培养物。
所收集的雪莲培养物最佳应符合如下质量标准：水分不得过12.0％，总灰分不得过12.0％，酸不溶性灰分不得过3.0％，浸出物不得少于15％；总黄酮不得少于10.0％，绿原酸不得少于0.15％。
上述II步骤中所选外植体优选为雪莲植株的茎尖；培养基MS培养基添加2，4-D为0.2重量份，6-BA为0.1重量份。
上述III步骤中愈伤组织的培养条件为培养基MS培养基添加NAA为2重量份，6-BA为1重量份；愈伤组织的培养温度最适为25℃，培养周期优选为20天。
上述III步骤中低温真空干燥条件为真空回旋干燥，干燥温度为40℃。
所述NAA指萘乙酸，6-BA指6-卞氨基嘌呤，2，4-D是指2，4-二氯苯氧乙酸，EDTA-2Na是指乙二胺四乙酸二钠。
所述重量份与体积份的对应关系为g与ml或kg与L的对应关系。
本发明新疆雪莲细胞组织的培养方法具有以下的优点：
1、由于采用合理的筛选方法使雪莲细胞培养物的有效成分含量比野生雪莲高3～5倍。野生雪莲有效成分含量(以总黄酮计)约1.2％～2％，见附图1和2。
2、采用此方法培养雪莲细胞组织生长周期短，生长周期为20天，野生雪莲的生长周期为3～5年。
3、采用此方法不需占用耕地；
4、采用此方法不需采摘野生雪莲，保护了生态环境；
5、本发明在实际生产中具有较强的可行性，对于解决新疆雪莲资源短缺的现状具有重要的实际意义。
本发明与采用气升式生物反应器大规模培养新疆雪莲比较，优点在于：设备简单，投入成本低，易于实现产业化；采用固体培养基，培养产物易于干燥，降低了后处理的难度；缩短了工艺流程，染菌机率降低，提高产成品率；采用气升式生物反应器在放大过程中黄酮含量明显下降，继代培养的方法黄酮含量稳定，产品质量易于控制。
药效学试验表明：本发明新疆雪莲组织培养物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀，二甲苯诱发小鼠耳肿胀，乙酸引起小鼠腹腔毛细血管透性增加，小鼠棉球肉芽肿均有显著的抑制作用。治疗性给予新疆雪莲组织细胞培养物第5、8天对佐剂关节炎大鼠致炎足肿胀率有一定抑制作用；而对另侧后肢(非致炎足)因迟发超敏反应引起的足肿胀有显著的抑制作用。在整个实验期间，新疆雪莲组织细胞培养物各剂量组对大鼠体重、脾脏，胸腺，肾上腺与髂淋巴结的重量的影响与溶媒组比较均无明差别。新疆雪莲组织细胞培养物对乙酸引起的小鼠扭体反应，小鼠热板反应均呈明显的抑制作用。能升高角叉菜胶引起的足跖炎性疼痛痛阈值降低。免疫反应实验发现，新疆雪莲组织细胞培养物(150mg/kg)对非特异性免疫功能有一定的抑制作用；300mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物对小鼠迟发超敏反应有抑制作用。本实验结果提示，新疆雪莲组织细胞培养物有显著的抗炎和镇痛作用。
本发明新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲提取物抗炎镇痛药效学试验结果显示：新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲提取物对乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高有明显降低作用，对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀有明显抑制作用，对乙酸致小鼠扭体反应有明显抑制作用，对角叉菜胶致大鼠炎性肿胀足痛阈降低有明显升高作用。说明薪疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲提取物均有良好的抗炎镇痛作用，新疆雪莲组织培养物是野生新疆雪莲提取物的优良替代品，以解决野生新疆雪莲资源短缺的问题，具有进一步开发生产的价值。
附图说明：
图1为野生雪莲含量检测图谱。
图2为雪莲培养物含量检测图谱。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
下述实验材料用于实验例1-4：
1.动物 wistar种大鼠 体重120～220g，昆明种小鼠，体重18～22g，均由沈阳药科大学动物实验中心提供。合格证号：辽实动字第047号。
2.饲料 颗粒料，由沈阳市实验动物颗粒饲料厂提供。
3.样品 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)，由沈阳联美植物细胞工程有限公司提供，深褐色粉末，雪莲总黄酮含量8.5％。临用前用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混悬。
4.试药 吲哚美辛肠溶片，赤峰制药厂，批号010403-1。尪痹颗粒，大连长白山制药有限公司，批号000102，临用前用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混悬。二甲苯，沈阳化学试剂厂，批号9706011。36％乙酸，沈阳化学试剂厂，批号960401。
实验例1 本发明新疆雪莲组织细胞培养物的抗炎作用
1、本发明新疆雪莲组织细胞培养物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
取体重18～22g的小鼠，雌雄各半，随机分成五组，每组10只，溶媒组灌服同容积0.5％羧甲基纤维素纳，新疆雪莲组织细胞培物(saul)组分别灌服100mg/kg，150mg/kg，200mg/kg，300mg/kg(相当于雪莲总黄酮量)。容积均为20ml/kg。连续给药3天，末次给药1小时后，在小鼠右耳两面均匀涂二甲苯25μl/只致炎，左耳不涂为正常对照耳。2小时后脱颈椎处死小鼠，用直径7μm的打孔器冲下左右耳同一部位的圆耳片，于扭力天平上称重，求出小鼠右耳肿胀率。
结果表明，与溶媒组比较，新疆雪莲组织细胞培养物150，200，300mg/kg对二甲苯致小鼠耳肿胀均有显著地抑制作用，且呈一定的量效关系(表1)
表1 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day) | 样本数(只) | 耳肿胀率(％)(X±SD) |
| 溶媒组saul组 | 100150200300 | 1010101010 | 109.16±49.7495.67±43.2285.49±49.76*78.75±39.3477.15±38.58 |
注：与溶媒组比较，*P＜0.05 student’st-检验
2、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
取体重18～22g的小鼠，随机分成五组，雌雄各半。溶媒组灌服同容积0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物组分别灌服75，150，300mg/kg(相当于雪莲总黄酮量)，阳性对照组尪痹颗粒，剂量为4g/kg，吲哚美辛组灌服10mg/kg的吲哚美辛。给药容积均为20ml/kg。连续给药7天，末次给药1小时后，尾静脉注射0.5％伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/只。立即腹腔注射0.6％乙酸0.2ml/只，20分钟后脱臼处死小鼠，剪开腹腔，用4ml生理盐水冲洗腹腔数次，收集洗涤液，离心(1000rpm)5分钟，在721型分光光度计590nm处测定吸收度(OD值)，计算出小鼠腹腔洗出液的伊文思蓝含量(表2)
结果表明，与溶媒组比较，150，300mg/kg的新疆雪莲细胞培养物对小鼠腹腔毛细血管通透性增加有抑制作用。
表2 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 样本数(只) | 吸光度(X±SD) | 抑制率(％) |
| 溶媒组saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ---751503004g/kg10 | 121111111010 | 0.538±0.1750.415±0.1040.401±0.125*0.415±0.093*0.487±0.1380.218±0.116** | ---22.8625.4722.869.4859.48 |
注：与溶媒组比较，*P＜0.05 **P＜0.01 student’ st-检验
3、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对角叉菜胶致大鼠跖肿胀的影响
取体重120～150g的大鼠，随机分成六组，每组10只，雌雄各半。用足容积测定仪(型号MTC-9702，沈阳药科大学生产)分别测定大鼠右后足给药前后容积，溶媒组灌胃给予同容积0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物组分别灌服35mg/kg，70mg/kg，140mg/kg，(相当于雪莲总黄酮量)：阳性对照组尪痹颗粒，剂量为2g/kg，吲哚美辛组灌服4.5mg/kg的吲哚美辛，给药容积均为20ml/kg，连续给药7天，末次给药1小时后，每只大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎。每小时测定大鼠右后足容积一次，连续4小时，计算出各组浮肿率均值。
结果表明：新疆雪莲组织细胞培养物(saul)35mg/kg致炎后3小时大鼠足跖肿胀有抑制作用。140mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物对致炎后3-4小时大鼠足跖肿胀均表现明显的抑制作用(表3)
表3 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day) | 样本数(只) | 足跖肿胀率(％) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4(小时) | |||
| 溶媒组saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ---35701402g/kg4.5 | 101010101012 | 27.8±16.817.0±19.221.6±19.217.5±17.523.4±20.48.77±10.0** | 46.4±12.346.3±12.241.3±26.139.5±24.037.6±25.34.63±7.19** | 74.8±20.054.2±17.4*55.4±24.750.3±20.7*47.1±23.9*4.92±6.36** | 55.5±29.237.5±13.040.30±25.321.2±24.3*40.7±19.71.88±3.23** |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 **P＜0.01 student’st-检验
1、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对小鼠棉球肉芽肿的影响
取体重18～22g的小鼠，雌雄各半，乙醚麻醉，在各鼠的背部正中央，去毛，用75％酒精消毒后，开0.5cm长之小口，用眼科镊子将已称重为10mg的灭菌棉球(不加青霉素)，从小切口植入皮下，随即缝合皮肤。从手术当天开始，上述小鼠随机分成五组，每组12～15只，溶媒组灌服同容积0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物(saul)组分别灌服75，150，300mg/kg(相当于雪莲总黄酮量)阳性对照组尪痹颗粒，剂量为4g/kg。给药容积均为20ml/kg。连续给药7天，末次给药1小时后，处死小鼠，打开原切口，将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，放入烘箱中60℃12小时烘干称重。将称得的重量减去棉球原重量即得肉芽肿的重量。计算肉芽肿胀系数。
结果表明，三个剂量的新疆雪莲组织细胞培养物(75，150，300mg/kg)对小鼠棉球肉芽肿均有显著的抑制作用。(表4)
表4 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对小鼠棉球肉芽肿的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day) | 样本数(只) | 肉芽肿胀系数(％)(X±SD) | 抑制率(％) |
| 溶媒组saul组尪痹颗粒 | ---751503004g/kg | 1515121514 | 10.47±4.167.59±1.97*6.51±1.84**7.71±1.53**6.63±2.13** | ---27.5137.8226.3636.68 |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 **P＜0.01 student’ st-检验
2、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对大鼠佐剂关节炎的治疗作用
取体重160～200g的大鼠，雌雄各半。用足容积测定仪分别测定大鼠两侧后肢足容积，右后足跖皮下注射弗氏完全佐剂(含灭活结核杆菌0.5毫克)0.1ml，注射后第15天测定动物体重，两侧后肢足容积，以左侧(非致炎足)后肢肿胀率和体重分组，分为六组，每组10只，各组分别灌胃给予同容积0.5羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物35mg/kg，70mg/kg，140mg/kg(相当于雪莲总黄酮量)，尪痹颗粒2g/kg，吲哚美辛10mg/kg，给药容积均为20mL/kg。每日一次，给予七天，分别在给药后的第2，5，8天测定每只动物的体重，两侧后肢足容积，计算出左右足跖肿胀率。第9天测定大鼠体重后，处死动物，测定大鼠脾脏，胸腺，肾上腺及髂淋巴结的重量，算出体重与脏器的相对重量。
结果表明，治疗性给予新疆雪莲组织细胞培养物后，第5、8天新疆雪莲组织细胞培养物对致炎足足跖肿胀可见一定的抑制作用，(见表5)。
表5 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对佐剂关节炎大鼠致炎足足跖肿胀的影响
| 组别 | 剂量mg/kg/day | 样本数(只) | 肿胀率(％)(X±SD) | ||
| 1 | 5 | 8(天) | |||
| 溶媒组saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ---35701402g/kg10 | 101010101010 | 54.07±32.1951.74±39.8862.97±30.7052.07±20.0950.92±21.5858.69±30.31 | 63.44±29.6341.69±26.2752.50±25.4959.05±33.3551.51±28.9339.93±20.84* | 61.14±34.5967.89±28.0155.26±23.6342.31±24.6261.55±19.7331.95±21.84 |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 student’s-t检验
另外，70mg/kg、140mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物，给药后第5、8天对非致炎足因迟发型超敏反应引起的足肿胀有显著的抑制作用，(见表6)。
表6 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)
对佐剂关节炎大鼠非致炎足足跖肿胀的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day) | 样本数(只) | 肿胀率(％)(X±SD) | ||
| 1 | 5 | 8(天) | |||
| 溶媒组saul组尪痹颗粒吲哚美 | ---35701402g/kg4.5 | 101010101010 | 23.01±10.2022.88±17.7319.24±7.9920.09±12.0422.60±10.9721.75±7.89 | 24.28±8.1915.95±17.558.65±11.15**7.46±8.81**20.23±17.17*11.90±8.99 | 22.51±10.9217.04±10.6911.47±8.679.76±9.1819.59±11.1610.44±8.27 |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 **P＜0.01 student’s-t检验
在整体实验观察期间，动物摄食末见明显变化，新疆雪莲组织细胞培养物各剂量组对脾脏，胸腺，肾上腺及髂淋巴结重量与溶媒组比较无明显差别(表7)。
表7 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对佐剂关节炎大鼠脏器系数的影响
| 组别 | 剂量mg/kg/day | 样本数(只) | 脾脏(mg/kg) | 胸腺(mg/kg) | 肾上腺(mg/kg) | 髂淋巴结(mg/kg) |
| 溶媒组saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ---35701402g/kg4.5 | 101010101010 | 6.545±3.6986.820±3.1265.360±1.8845.354±18785.735±1.9365.175±0.936 | 1.312±0.4851.082±0.3251.240±0.4561.293±0.3291.155±0.3760.701±0.215* | 0.225±0.0660.298±0.0660.258±0.0850.238±0.0430.234±0.0990.344±0.088* | 0.106±0.0360.142±0.1200.086±0.0260.103±0.0380.162±0.1310.338±0.099* |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 student’s-t检验
实验例2 本发明新疆雪莲组织细胞培养物的镇痛作用
1、本发明新疆雪莲组织细胞培养物对醋酸致小鼠扭体反应的影响。
取体重18～22g的小鼠雌雄各半，随机分成六组，每组10～12只，溶媒组灌服同容积0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物(saul)组分别灌服75，150，300mg/kg(相当于雪莲总黄酮量)；阳性对照组吲哚美辛肠溶片，剂量为10mg/kg，尪痹颗粒，剂量为4g/kg.给药容积均为20ml/kg。连续给药3天，末次给药1小时后，腹腔注射0.8％醋酸0.3ml/只，观察注射醋酸后5～20分钟内小鼠的扭体次数。
结果表明，与溶媒组比较，新疆雪莲组织细胞培养物75mg/kg，150mg/kg，300mg/kg，对醋酸所致小鼠扭体反应增加有显著的抑制作用(表8)。
表8 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对醋酸致小鼠扭体所应的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day) | 样本数(只) | 扭体次数(X±SD) | 抑制率(％) |
| 溶媒组saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ---751503004g/kg10 | 121212111210 | 26.333±10.2516.00±6.81*17.50±18.58*13.27±6.99**19.42±7.693.00±6.86*** | ---39.2333.5449.6026.2488.61 |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，student’st-检验
2、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对小鼠热板反应的影响
调节恒温水浴，水温恒定在55±0.5℃，将2000ml烧杯放入其中，使烧杯底部接触水面，每次取小鼠一只，放入烧杯中，记录自放入烧杯至出现舔后足所需时间(s)，作为该鼠的痛阈值。依次测量各小鼠的痛阈值，凡舔后足时间小于5s或大于30s或跳跃者弃之不用。取筛选合格的小鼠72只，随机分为6组，每组12只，再重测痛阈1次，将两次痛阈的平均值作为该鼠给药前的痛阈值，溶媒组灌服同容积的0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物(saul)组分别灌服75，150，300mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物，尪痹颗粒组灌服4g/kg的尪痹颗粒，吲哚美辛组灌服10mg/kg的吲哚美辛，给药容积均为20ml/kg。连续给药8天，末次给药1小时后，测量各鼠的痛阈值，如60s仍无痛觉反应，应取出，其痛阈按60s计。将结果计入表内，计算用药后痛阈提高的百分率。
结果显示，新疆雪莲组织细胞培养物(saul)75、150、300mg/kg.三个剂量均可显著提高小鼠的痛阈值(表9)。
表9 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对小鼠热板反应的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day) | 样本(只) | 痛阈提高百分率(X±SD) |
| 溶媒组Saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ---751503004g/kg10 | 121212121210 | 9.80±20.1839.51±52.68**57.40±51.15***26.14±27.23**28.62±38.35**29.13±45.45* |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，student’st-检验
3、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(saul)对角叉菜胶致大鼠炎性肿胀足痛阈的影响
取体重120～150g大鼠，雌雄各半，用压痛测定装置测定药物的镇痛效果。首先测得每只正常大鼠足压痛痛阈(每次测定固定的部位)，根据体重和足痛阈随机分为六组，每组10只，溶媒组灌胃给予同容积0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物组分别灌服35mg/kg，70mg/kg，140mg/kg(相当于雪莲总黄酮量)阳性对照组尪痹颗粒，剂量为2g/kg，吲哚美辛组灌服10mg/kg的吲哚美辛，给药容积均为20mL/kg，连续给药7天，末次给药1小时后，每只大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎，分别测定致炎后4小时内足痛阈变化，测定时间间隔为1小时(表10)。
结果表明，新疆雪莲组织细胞培养物35mg/kg，70mg/kg，140mg/kg对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀痛阈有明显的提高作用。
表10新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)对角叉菜胶致足跖炎性疼痛的影响
| 组别 | 剂量mg/kg/day | 样本数(只) | 给药前痛阈(g) | 给药后痛阈(x±SD) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4(小时) | ||||
| 溶媒组Saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ----35701402g/kg10 | 101010101010 | 497.59±110.82416.17±56.41415.53±64.59472.18±115.77412.98±94.04400.53±42.18 | 464.19±58.72449.81±69.15452.35±79.88430.89±70.98411.62±114.9497.47±72.38 | 362.33±80.47415.53±98.43463.09±69.86*416.83±64.50453.24±92.17*494.66±103.8** | 346.84±52.16470.91±91.66**464.76±48.45**460.39±81.62*417.69±68.72*562.66±98.07** | 332.03±56.87497.03±72.64**497.52±93.32**495.94±66.62**414.73±89.76*585.46±89.35** |
注：与溶媒组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，Student’s-t检验
实验例3 本发明新疆雪莲组织细胞培养物对免疫作用的影响
1、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)对小鼠碳粒廓清的影响
取小鼠60只，雌雄各半，体重18～22克，随机分为六组，每组10只，溶媒组灌服同容积的0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)组分别灌服75、150、300mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物；尪痹颗粒组灌服4g/kg的尪痹颗粒；吲哚美辛组灌服10mg/kg的吲哚美辛，容积均为20ml/kg。连续给药7天；末次给药后24h，静脉注射印度墨汁(临用前稀释4倍)10ml/kg，分别于2min和10min从眼眶静脉取血20μl，放入2ml0.1％Na2CO3溶液中，静置4h后，于721分光光度计(λ＝680nm)测光度OD值，同时剪开腹腔，称取胸腺重量和脾重量，计算胸腺指数和脾指数，称取肝重量和脾重量，计算K和α (表11)
k＝(1ogOD2-logOD10)/8
α＝k4/3×体重/(肝重+脾重)
脾指数＝脾重(mg)/体重(g)
胸腺指数＝胸腺重(mg)/体重(g)
结果表明，新疆雪莲组织细胞培养物(150mg/kg)对特异性免疫功能有抑制作用(表11)
表11新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)对小鼠碳粒廓清的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day) | K | α | 脾指数(mg/10g) | 胸腺指数(mg/10g) |
| 溶媒组Saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ----75mg/kg150mg/kg300mg/kg4g/kg10mg/kg | 0.0467±0.01490.0342±0.01230.0306+0.0109*0.0364±0.00830.0307±0.0147*0.0329±0.0125* | 4.98±1.495.14±0.771.64±0.775.03±0.404.77±0.804.544±0.68 | 89.64±45.4864.49±19.8071.22±15.9973.48±20.0260.98±14.278.81±27.64 | 40.54±10.0134.23±11.2736.00±9.5432.54±8.9937.2±8.9116.87±7.96* |
注：与溶媒组比较，P＜0.05，**P＜0.001，Student’s-t检验
2、本发明新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)对DNCB致小鼠迟发型超敏反应的影响
取小鼠60只，雌雄各半，体重18～22克，随机分为六组，每组10只。熔媒组灌服同容积的0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)组分别灌服75、150、300mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物；尪痹颗粒组灌服4g/kg的尪痹颗粒；吲哚美辛组灌服10mg/kg的吲哚美辛，容积均为20ml/kg，连续给药7天，第一天用8％Na2S于小鼠腹部脱毛，并将1％的DNCB丙酮溶液50μl，涂于小鼠腹部脱毛区，第7天给药后1h，于小鼠右耳涂DNCB丙酮溶液40μl进行攻击，36h后，处死小鼠，剪下左右耳称重，计算耳肿胀率。
耳肿胀率(％)=(右耳重-左耳重)/左耳重×100％
结果表明，三个剂量的新疆雪莲组织细胞培养对迟发型超敏反应均有一定程度的抑制作用，300mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用具有统计学意义(表12)。
表12新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)对DNCB小鼠迟发型超敏反应的影响
| 组别 | 剂量 | 样本数 | 耳肿胀率(％) |
| 熔媒组Saul组Saul组Saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ----75mg/kg150mg/kg300mg/kg4g/kg10mg/kg | 101010101010 | 4.80±1.813.25±1.843.95±1.773.10±1.79*2.00±0.97***4.60±2.46 |
注：与溶媒组比较，P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，Student’s-t检验
实验例4 本发明新疆雪莲组织细胞培养物(Saul)对大鼠炎性渗出物PGE、MDA含量的影响
取体重120～150的大鼠，随机分成六组，每组10只，雌雄各半。溶媒组灌胃给予同容积0.5％羧甲基纤维素钠，新疆雪莲组织细胞培养物分别灌服35mg/kg、70mg/kg、140mg/kg(相当于雪莲总黄酮量)；阳性对照组尪痹颗粒，剂量为2g/kg，吲哚美辛组灌服10mg/kg的吲哚美辛，给药容积均为20ml/kg。连续给药7天，末次给药1h后，每只大鼠右后肢足跖皮下注射0.1％角叉菜胶0.1ml致炎，4小时后处死大鼠，于踝关节上1厘米处剪下右足，称重，剥开皮浸泡于2ml生理盐水中，4℃冷藏，2小时后低温离心浸泡液20min(3000r.p.m)。取上清液待用。
取上清液0.2ml依次加入无水乙醇0.6ml、0.5NKOH-CH3OH1ml溶液混匀，50℃水浴异构化20min，冷却后加入3.2ml甲醇，离心10min(3000r.p.m)，于UV-9100型分光光度计278nm测吸光度A值，检测炎性渗出物中PGE含量(表13)。
取上清液0.2ml，加20％三氯醋酸1ml，混匀并加入0.67％TBA0.6ml，再次混匀加盖，沸水浴30min，冷却后加入2ml正丁醇，强力震荡，离心10min(3000r.p.m)。取正丁醇层于7230型分光光度计532nm测吸光度A值，检测炎性渗出物中MDA含量(表13)。
结果表明，70mg/kg的新疆雪莲组织细胞培养物对炎性渗出物中MDA含量有抑制作用。各剂量的新疆雪莲组织培养物对炎性渗出物中PGE含量没有明显影响。
表13 新疆雪莲组织细胞培养物(saul)
对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀足重、PGE、MDA的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/day ) | 样本(只) | 足重(g) | PGE(A值) | MDA(A值) |
| 溶媒组Saul组尪痹颗粒吲哚美辛 | ---35701402g/kg10 | 101010101012 | 2.72±0.180.27±0.432.32±0.392.15±0.182.24±0.091.53±0.21*** | 0.092±0.0320.085±0.0290.100±0.0330.108±0.0230.104±0.0510.038±0.018*** | 0.11±0.0020.014±0.0050.007±0.004*0.008±0.0050.013±0.0070.008±0.004*** |
注：与溶媒组比较*P＜0.05 ***P＜0.001student’s-t检验下述实验材料用于实验例5～8
1.动物
昆明种小白鼠，体重18～22g，wistar大鼠，体重150～200g，均由沈阳药科大学实验动物中心提供。合格证号：辽实动字第047号。
2.药品与试剂
本发明新疆雪莲组织培养物(CSI)，给药前以0.5％CMC-Na混悬，由沈阳联美植物细胞工程有限公司提供，总黄酮含量8.5％.野生新疆雪莲浸膏(S1)给药前以0.5％CMC-Na混悬。由沈阳联美植物细胞工程有限公司提供。吲哚美辛肠溶片，赤峰制药厂 批号 010403-1。36％乙酸，沈阳化学试剂厂批号 9706011，角叉菜胶，辽宁省医药工业研究所提供。二甲苯沈阳化学试剂厂 批号 9706011。
实验例5 本发明新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲提取物对乙醇致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
取昆明小鼠，18～22g，雌雄各半，随机分为8组，分别为对照组，CSI300mg/kg组，150mg/kg组，75mg/kg组，SI 300mg/kg组，150mg/kg组，75mg/kg组，吲哚美辛组。对照组灌胃给予同等体积0.5％CMC-Na，其余各组分别灌胃给予相应药物。连续7天，第7天给药1小时后，尾静脉注射1％伊文思蓝NS的溶液0.1ml/10g，立即腹腔注射0.8％乙酸0.3ml/只，20min后脱颈椎处死小鼠，剪开腹腔，用2mlNS溶液冲洗腹腔数次，收集洗涤液定容为10ml，离心1000r×5min，在721分光光度计590nm处测定吸光度值。
结果表明，SI各剂量组及CSI 150mg/kg，300mg/kg对乙酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增高有明显抑制作用。(表14)
表14 新疆雪莲培养物和野生雪莲
提取物对乙醇至小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(X±SD)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 样本数(n) | A吸光度值(OD) |
| 对照组SI组CSI组吲哚美辛 | ----751503007515030010 | 101010101010108 | 0.341±0.1370.143±0.053***0.163±0.086**0.160±0.069**0.262±0.0840.219±0.108*0.222±0.085*0.117±0.047*** |
与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
实验例6 本发明新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响
取wistar大鼠150～200g，雌雄各半，随机分为8组，分别为对照组，CSl300mg/kg组，150mg/kg组，75mg/kg组；SI 300mg/kg组，150mg/kg组，75mg/kg组，吲哚美辛组。对照组灌胃给予同等体积0.5％CMC-Na，其余各组分别灌胃给予相应药物，连续7天。第7天给药后1h，每鼠右后肢足趾皮下注射1％角叉菜胶0.1ml/只，其后每小时分别测定大鼠右后足趾容积，连续4小时，计算肿胀率。
结果表明，300mg/kg SI与CSI给药后3-4小时对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀均有显著的抑制作用，SI300 mg/kg组，CSI75mg/kg组给药后3小时也表现有明显的抑制作用。(表15)
表15 新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲
提取物对于角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响(X±SD)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 样本数(只) | 足跖肿胀率(％) | |||
| 1h | 2h | 3h | 4h | |||
| 对照组SI组CSI组吲哚美辛 | ---751503007515030010 | 1011111110101012 | 23.03±18.7519.33±10.9227.18±11.9417.72±13.4416.67±11.0122.43±13.3820.36±13.269.83±11.18 | 29.76±23.2625.04±16.2130.10±6.8325.90±15.818.40±19.1028.17±21.0420.31±13.2212.23±12.48* | 54.05±17.7636.21±17.7551.71±24.9723.99±12.33***22.18±15.68***40.22±18.5629.16±12.92**24.34±13.59*** | 39.50±11.8232.91±22.2442.41±25.5620.14±18.44*25.20±23.8834.29±23.2327.58±10.10*23.95±18.50* |
与对照组比较 **P＜0.01 ***P＜0.001
实验例7 本发明新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲提取物对乙酸致小鼠扭体反应的影响
取昆明种小鼠18～22g，雌雄各半，随机分为3组，分别为对照组，CSI300mg/kg组，150mg/kg组，75mg/kg组；SI 300mg/kg组，150mg/kg组，75mg/kg组，吲哚美辛组。对照组灌胃给予同等体积0.5％CMC-Na其余各组分别灌胃给予相应药物，连续7天：末次给药30min后腹腔注射0.8％乙酸0.3ml/只，记录5-20min内扭体次数.
结果表明，75，150mg/kg的SI与CSI对乙酸所致小鼠扭体反应均有明显抑制作用。(表16)
表16 新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲
提取物对乙酸致小鼠扭体反应的影响(X±SD)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 样本数(只) | 扭体次数(n) |
| 对照组SI组CSI组吲哚美辛 | ---751503007515030010 | 1010101010101012 | 23.1±11.1511.8±9.1112.2±6.6614.0±8.7011.4±10.1212.3±9.16*19.2±11.164.9±3.21*** |
与对照组比较*P＜0.05 ***P＜0.001
实验例8 本发明新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲提取物对角叉菜胶致大鼠炎性肿胀足痛阈降低的影响
取Wistar大鼠150～300g，雌雄各半，于每只大鼠一侧足趾固定部位测定其足压痛痛阈.根据体重和痛阈随机分为8组，分别为对照组，CSI 300mg/kg组；150mg/kg组，75mg/kg组；SI 300mg/kg组，150mg/kg组，75mg/kg组，吲哚美辛组。对照组灌胃给予同等体积0.5％CMC-Na，其余各组分别灌胃给予相应药物，连续7天.第7天给药1小时后，每只大鼠右后肢足跖皮下注射1％角又菜胶0.1ml/只，其后每小时分别测定足痛阈值，连续4小时。
结果表明，CSI各剂量组，SI75，300mg/kg组均能显著提高角叉菜胶致大鼠炎性肿胀足痛阈的降低。(表17)
表17 新疆雪莲组织培养物和野生新疆雪莲
提取物对大鼠的镇痛作用(压痛法)(X±SD)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 样本数(只) | 压痛值(g) | ||||
| 0h | 1h | 2h | 3h | 4h | |||
| 对照组SI组CSI组吲哚美辛 | ---751503007515030010 | 1011101110101012 | 703.76±212.58622.21±97.48609.76±155.48533.73±103.43571.36±173.81782.11±223.73709.77±313.06644.38±101.02 | 579.50±77.51540.60±118.72503.06±83.08490.28±136.20475.65±91.64474.06±94.63470.48±107.05624.22±102.45 | 465.14±129.43540.94±96.56520.16±114.90497.89±100.66483.87±83.37627.36±97.32**506.40±114.99501.89±119.10 | 441.20±98.85567.59±64.92**519.66±151.37561.43±69.43**569.45±126.87*611.71±68.63***665.70±302.70*564.64±78.50** | 456.1±6107.16575.78±188.47564.62±54.10*515.01±82.70544.20±129.55525.68±64.34562.14±89.67*512.22±122.76 |
与对照组比较 *P＜0.05**P＜0.01 ***P＜0.001
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果：
实施例1： 本发明新疆雪莲组织培养物的培养
I、植株诱导：
培养基母液的配制：
分别称取硝酸钾190克、硝酸铵165克、硫酸镁37克、磷酸二氢钾17克、氯化钙44克，分别置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，置5000ml的烧杯中，加水定容至5000ml，混合均匀，得MS培养基母液A，置试剂瓶中4℃保存备用；
分别称取硫酸锰6.76克、硫酸锌3.44克、硼酸2.48克、碘化钾0.332克、钼酸钠0.1克、硫酸铜0.05毫克、氯化钴0.05毫克，分别置于500ml烧杯中，加水约200ml，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，置2000ml的烧杯中，加水定容至2000ml，混合均匀，得MS培养基母液B，置试剂瓶中4℃保存备用；
分别称取EDTA-2Na 7.45克、硫酸亚铁5.57克，分别置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解后；将2种溶液混匀，加热约10分钟，用水定容至2000ml，得MS培养基母液C，置试剂瓶中4℃保存备用；
称取甘氨酸0.4克、盐酸硫胺素0.08克、盐酸吡哆素0.1克、烟酸0.1克、肌醇20克，置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解，加水定容至1000ml，混合均匀，得MS培养基母液D，置试剂瓶中4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶160瓶摆放于工作台上；用电子秤称取蔗糖120克，放入不锈钢桶中，加纯水2升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A100毫升、B10毫升、C20毫升、D10毫升，加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂24克，放入2000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至4升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得植株诱导MS培养基；
分装：将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，分装成160瓶，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
将保藏的新疆雪莲种子，约千粒，用75％酒精浸泡25分钟，再用0.15％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗4次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下接种植株诱导MS培养基上，每25ml培养基中接种12粒种子；在25℃，连续光照的条件下培养10天，出芽后，培养成雪莲植株。
II、诱导愈伤组织：
植株继续培养至5～8cm，选取生长良好的雪莲植株作为外植体，约百株；将外植体接种于诱导愈伤组织MS培养基上，每25mlMS培养基中接种8块直径为0.5cm的外植体，暗培养8天；诱导产生愈伤组织，愈伤组织在光照条件下培养，光照条件为10h/d，白光，温度为25℃；
所述诱导愈伤组织MS培养基的配制方法为：
母液的配制：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000ml、MS培养基母液B2000ml、MS培养基母液C2000ml、MS培养基母液D1000ml，置试剂瓶中4℃保存备用；
激素的配制：
2，4-D的配制：用天平精密称取0.2克2，4-D，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入1000ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂瓶中4℃保存备用；
6-BA的配制：用天平精密称取0.1克6-BA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入500ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂瓶中4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶160瓶摆放于工作台上；用电子秤称取蔗糖120克，放入不锈钢桶中，加纯水2升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A200毫升、B20毫升、C40毫升、D20毫升、2，4-D20毫升、6-BA4毫升加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂24克放入2000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至4升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8；
分装：将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，分装成160瓶，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：
将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
III、继代培养：
选取生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色等特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，筛选高产细胞系，愈伤组织种子用量150克；使愈伤组织增殖，愈伤组织的培养条件为在约10L继代培养MS培养基培养，培养周期为20天，培养温度为25℃；至培养期，选取上述特征的愈伤组织150克作为种子，其他收集培养物并进行低温真空干燥即得雪莲细胞组织培养物850克。
所述继代培养MS培养基的配制方法为：
母液的配制：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000ml、MS培养基母液B2000ml、MS培养基母液C2000ml、MS培养基母液D1000ml，置试剂瓶中4℃保存备用；
激素的配制：
NAA的配制：用天平精密称取2克NAA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入10000ml试剂瓶中，加水至刻度，摇匀，置4℃保存备用；
6-BA的配制：用天平精密称取1克6-BA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入5000ml试剂瓶中，加水至刻度，摇匀，置4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶1600瓶于工作台上；用电子秤称取蔗糖1200克，放入不锈钢桶中，加纯水20升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A2000毫升、B200毫升、C400毫升、D200毫升、NAA600毫升、6-BA40毫升加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂240克放入20000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至40升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8；
分装：
将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：
将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
实施例2：本发明新疆雪莲组织培养物的培养
I、植株诱导：
培养基母液的配制：
分别称取硝酸钾190克、硝酸铵165克、硫酸镁37克、磷酸二氢钾17克、氯化钙44克，分别置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，置5000ml的烧杯中，加水定容至5000ml，混合均匀，得MS培养基母液A，置试剂瓶中4℃保存备用；
分别称取硫酸锰6.76克、硫酸锌3.44克、硼酸2.48克、碘化钾0.332克、钼酸钠0.1克、硫酸铜0.05毫克、氯化钴0.05毫克，分别置于500ml烧杯中，加水约200ml，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，置2000ml的烧杯中，加水定容至2000ml，混合均匀，得MS培养基母液B，置试剂瓶中4℃保存备用；
分别称取EDTA-2Na 7.45克、硫酸亚铁5.57克，分别置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解后；将2种溶液混匀，加热约10分钟，用水定容至2000ml，得MS培养基母液C，置试剂瓶中4℃保存备用；
称取甘氨酸0.4克、盐酸硫胺素0.08克、盐酸吡哆素0.1克、烟酸0.1克、肌醇20克，置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解，加水定容至1000ml，混合均匀，得MS培养基母液D，置试剂瓶中4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶160瓶摆放于工作台上；用电子秤称取蔗糖120克，放入不锈钢桶中，加纯水2升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A100毫升、B10毫升、C20毫升、D10毫升，加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂24克，放入2000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至4升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得植株诱导MS培养基；
分装：将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，分装成160瓶，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
将保藏的新疆雪莲种子，约千粒，用70％酒精浸泡30分钟，再用0.1％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗6次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下接种植株诱导MS培养基上，每25ml培养基中接种12粒种子；在25℃，连续光照的条件下培养10天，出芽后，培养成雪莲植株。
II、诱导愈伤组织：
植株继续培养至5～8cm，选取生长良好的雪莲植株的茎尖作为外植体，约百株；将外植体接种于诱导愈伤组织MS培养基上，每25mlMS培养基中接种8块直径为0.5cm的外植体，暗培养5天；诱导产生愈伤组织，愈伤组织在光照条件下培养，光照条件为12h/d，白光，温度为22℃；
所述诱导愈伤组织MS培养基的配制方法为：
母液的配制：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000ml、MS培养基母液B2000ml、MS培养基母液C2000ml、MS培养基母液D1000ml，置试剂瓶中4℃保存备用；
激素的配制：
2，4-D的配制：用天平精密称取0.2克2，4-D，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入1000ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂瓶中4℃保存备用；
6-BA的配制：用天平精密称取0.1克6-BA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入500ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂瓶中4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶160瓶摆放于工作台上；用电子秤称取蔗糖120克，放入不锈钢桶中，加纯水2升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A200毫升、B20毫升、C40毫升、D20毫升、2，4-D20毫升、6-BA4毫升加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂24克放入2000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至4升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8；
分装：将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，分装成160瓶，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：
将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
III、继代培养：
筛选高产细胞系，选取生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色等特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，愈伤组织种子用量150克；使愈伤组织增殖，愈伤组织的培养条件为在约10L继代培养MS培养基中培养，培养周期为20天，培养温度为25℃；至培养期，选取上述特征的愈伤组织150克作为种子，其他收集培养物并进行真空回旋干燥，干燥温度为40℃，即得雪莲细胞组织培养物850克。
所述继代培养MS培养基的配制方法为：
母液的配制：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000ml、MS培养基母液B2000ml、MS培养基母液C2000ml、MS培养基母液D1000ml，置试剂瓶中4℃保存备用；
激素的配制：
NAA的配制：用天平精密称取2克NAA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入10000ml试剂瓶中，加水至刻度，摇匀，置4℃保存备用；
6-BA的配制：用天平精密称取1克6-BA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入5000ml试剂瓶中，加水至刻度，摇匀，置4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶1600瓶于工作台上；用电子秤称取蔗糖1200克，放入不锈钢桶中，加纯水20升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A2000毫升、B200毫升、C400毫升、D200毫升、NAA600毫升、6-BA40毫升加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂240克放入20000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至40升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；
分装：
将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：
将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
所收集的雪莲培养物最佳应符合如下质量标准：水分不得过12.0％，总灰分不得过12.0％，酸不溶性灰分不得过3.0％，浸出物不得少于15％；总黄酮不得少于10.0％，绿原酸不得少于0.15％。
实施例3：本发明新疆雪莲组织培养物的培养
I、植株诱导：
培养基母液的配制：
分别称取硝酸钾190克、硝酸铵165克、硫酸镁37克、磷酸二氢钾17克、氯化钙44克，分别置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，置5000ml的烧杯中，加水定容至5000ml，混合均匀，得MS培养基母液A，置试剂瓶中4℃保存备用；
分别称取硫酸锰6.76克、硫酸锌3.44克、硼酸2.48克、碘化钾0.332克、钼酸钠0.1克、硫酸铜0.05毫克、氯化钴0.05毫克，分别置于500ml烧杯中，加水约200ml，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，置2000ml的烧杯中，加水定容至2000ml，混合均匀，得MS培养基母液B，置试剂瓶中4℃保存备用；
分别称取EDTA-2Na 7.45克、硫酸亚铁5.57克，分别置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解后；将2种溶液混匀，加热约10分钟，用水定容至2000ml，得MS培养基母液C，置试剂瓶中4℃保存备用；
称取甘氨酸0.4克、盐酸硫胺素0.08克、盐酸吡哆素0.1克、烟酸0.1克、肌醇20克，置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解，加水定容至1000ml，混合均匀，得MS培养基母液D，置试剂瓶中4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶160瓶摆放于工作台上；用电子秤称取蔗糖120克，放入不锈钢桶中，加纯水2升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A100毫升、B10毫升、C20毫升、D10毫升，加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂24克，放入2000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至4升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得植株诱导MS培养基；
分装：将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，分装成160瓶，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
将保藏的新疆雪莲种子，约千粒，用75％酒精浸泡25分钟，再用0.15％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗4次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下接种植株诱导MS培养基上，每25ml培养基中接种10粒种子；在25℃，连续光照的条件下培养10天，出芽后，培养成雪莲植株。
II、诱导愈伤组织：
植株继续培养至5-8cm，选取生长良好的雪莲植株的茎尖作为外植体，约百株；将外植体接种于诱导愈伤组织MS培养基上，每25mlMS培养基中接种6块直径为0.5cm的外植体，暗培养10天；诱导产生愈伤组织，愈伤组织在光照条件下培养，光照条件为12h/d，白光，温度为28℃；
所述诱导愈伤组织MS培养基的配制方法为：
母液的配制：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000ml、MS培养基母液B2000ml、MS培养基母液C2000ml、MS培养基母液D1000ml，置试剂瓶中4℃保存备用；
激素的配制：
2，4-D的配制：用天平精密称取0.25克2，4-D，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入1000ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂瓶中4℃保存备用；
6-BA的配制：用天平精密称取0.07克6-BA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入500ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂瓶中4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶160瓶摆放于工作台上；用电子秤称取蔗糖120克，放入不锈钢桶中，加纯水2升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A200毫升、B20毫升、C40毫升、D20毫升、2，4-D20毫升、6-BA4毫升加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂24克放入2000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至4升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8；
分装：将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，分装成160瓶，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：
将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
III、继代培养：
筛选高产细胞系，选取生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色等特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，愈伤组织种子用量150克；使愈伤组织增殖，愈伤组织的培养条件为在约10L继代培养MS培养基中培养，培养周期为18天，培养温度为22℃；至培养期，选取上述特征的愈伤组织150克作为种子，其他收集培养物并进行真空回旋干燥，干燥温度为40℃，即得雪莲细胞组织培养物850克。
所述继代培养MS培养基的配制方法为：
母液的配制：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000ml、MS培养基母液B2000ml、MS培养基母液C2000ml、MS培养基母液D1000ml，置试剂瓶中4℃保存备用；
激素的配制：
NAA的配制：用天平精密称取1.8克NAA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入10000ml试剂瓶中，加水至刻度，摇匀，置4℃保存备用；
6-BA的配制：用天平精密称取1.4克6-BA，置50ml小烧杯中，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入5000ml试剂瓶中，加水至刻度，摇匀，置4℃保存备用；
培养基的配制：
将洗净控干的培养瓶1600瓶于工作台上；用电子秤称取蔗糖1200克，放入不锈钢桶中，加纯水20升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A2000毫升、B200毫升、C400毫升、D200毫升、NAA600毫升、6-BA40毫升加入不锈钢桶中，得混合培养基母液；称量琼脂240克放入20000ml烧杯中，加水2000ml搅拌，加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至40升；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；
分装：
将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上；
灭菌：
将分装好的培养基码放于灭菌锅内，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备用。
所收集的雪莲培养物最佳应符合如下质量标准：水分不得过12.0％，总灰分不得过12.0％，酸不溶性灰分不得过3.0％，浸出物不得少于15％；总黄酮不得少于10.0％，绿原酸不得少于0.15％。
Claims (4)
1.一种新疆雪莲细胞组织培养物的培养方法，其特征在于该培养物是经如下步骤得到的：
I、植株诱导：
分别称取硝酸钾190重量份、硝酸铵165重量份、硫酸镁37重量份、磷酸二氢钾17重量份、氯化钙44重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，加水至5000体积份，混合均匀，得MS培养基母液A，4℃保存备用；
分别称取硫酸锰6.76重量份、硫酸锌3.44重量份、硼酸2.48重量份、碘化钾0.332重量份、钼酸钠0.1重量份、硫酸铜0.00005重量份、氯化钴0.00005重量份，分别加水200体积份，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，加水至2000体积份，混合均匀，得MS培养基母液B，4℃保存备用；
分别称取EDTA-2Na7.45重量份、硫酸亚铁5.57重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将2种溶液混匀，加热，加水至2000体积份，得MS培养基母液C，4℃保存备用；
称取甘氨酸0.4重量份、盐酸硫胺素0.08重量份、盐酸吡哆素0.1重量份、烟酸0.1重量份和肌醇20重量份，加水1000体积份，并加热至完全溶解，加水至1000体积份，混合均匀，得MS培养基母液D，4℃保存备用；
取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾，加入MS培养基母液A100体积份、MS培养基母液B10体积份、MS培养基母液C20体积份和MS培养基母液D10体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份搅拌后，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得植株诱导MS培养基；分装；灭菌；备用；
将保藏的新疆雪莲种子用70～75％酒精浸泡25～30分钟，再用0.1～0.15％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗4～6次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下接种在配好的植株诱导MS培养基上，每25ml培养基中接种8～15粒种子；在25℃，连续光照的条件下培养10天，出芽后，培养成雪莲植株；
II、诱导愈伤组织：
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000体积份、MS培养基母液B2000体积份、MS培养基母液C2000体积份和MS培养基母液D1000体积份，4℃保存备用；取0.15～0.25重量份2，4-D，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至1000体积份，摇匀，得2，4-D母液，4℃保存备用；取0.05～0.15重量份6-BA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至500体积份，摇匀，得6-BA母液，4℃保存备用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾，加入上述MS培养基母液A200体积份、MS培养基母液B20体积份、MS培养基母液C40体积份、MS培养基母液D20体积份、2，4-D母液20体积份和6-BA母液4体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份，搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得诱导愈伤组织MS培养基；分装；灭菌；备用；
雪莲植株继续培养至5～8cm，选取生长良好的雪莲植株作为外植体；将外植体接种于诱导愈伤组织MS培养基上，每25ml培养基中接种6～10块直径为0.5cm的外植体，暗培养5～10天；诱导产生愈伤组织，愈伤组织在光照条件下培养，光照条件为8-12小时/天，白光，温度为22℃～28℃；
III、培养物继代培养：
按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS母液C2000体积份和MS母液D1000体积份，4℃保存备用；取1.5～2.5重量份NAA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至10000体积份，摇匀，备用，得NAA母液，4℃保存备用；取0.5～1.5重量份6-BA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至5000体积份，摇匀，备用，得6-BA母液，4℃保存备用；称取蔗糖1200重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾，加入培养基母液A2000体积份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、NAA母液600体积份和6-BA母液40体积份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；分装；灭菌；备用；
筛选高产细胞系，选取生长旺盛、颜色鲜艳和紫红色特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，愈伤组织的培养条件为：15重量份的愈伤组织种子需要在1000体积份的继代培养MS培养基培养，培养周期为15～20天，培养温度为20～30℃；至培养期，选取生长旺盛、颜色鲜艳和紫红色特征的愈伤组织作为种子，其他愈伤组织收集并于40℃真空干燥即为雪莲细胞组织培养物；其中，所述重量份与体积份的对应关系为g与ml或kg与L的对应关系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述II步骤中外植体为雪莲植株的茎尖；其中所述的2，4-D为0.2重量份，6-BA为0.1重量份。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述III步骤中的NAA为2重量份，6-BA为1重量份；愈伤组织的培养温度为25℃，培养周期为20天。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述III步骤中真空干燥条件为真空回旋干燥，干燥温度为40℃。
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