CN104977399B - 一种检测美白成分安全性和有效性的方法 - Google Patents

一种检测美白成分安全性和有效性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测美白成分安全性和有效性的方法，该方法先用Franz扩散池对检测对象进行透皮操作，并将透皮操作所得到的透皮液进行斑马鱼培养，通过统计斑马鱼幼鱼的死亡率，以及斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积来判断检测对象的安全性以及美白效果。本发明大大提高了美白成分检测的准确性和安全性。

Description

一种检测美白成分安全性和有效性的方法
技术领域
本发明涉及一种检测美白分成安全性和有效性的方法。
背景技术
在现有技术中，检测一款美白产品的美白效果的主要方法额：酪氨酸酶抑制法、哺乳动物模型试验法和黑素细胞实验法，并且在2011年刚出现一种新的检测美白产品的美白效果的方法，该方法为：将产品与胚胎培养液混合，并直接将混合液用于胚胎或幼体培养，通过判断胚胎或幼体表面黑色素的数量来评价产品的美白效果，体表的黑色素越少，则说明该产品的美白活性越好。可见，现有的检测方法存在以下几方面不足：
1、在上述检测方法中直接采用配制的美白成分溶液进行试验，没有考虑到美白成分在实际使用时必需要先经过皮肤层的吸收后才能起作用，而现有的检测方法所得出的美白成分的美白效果要高于实际的效果，使检测得到的结论不具备参照性，可能出现检测时效果明显，而实际使用效果却很差，原因在于美白成分可能不分透过皮肤层；
2、现有的检测方法中只提供对美白成分有效性的检测，而没有对美白成分的安全性进行评价；
3、现有的检测方法中只对单一美白成分进行测试，并没有考虑到复配的美白成分对美白效果的影响。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测美白分成安全性和有效性的方法，用于提高现有美白成分检测方法的检测结果的可靠性。
本发明是这样实现的：一种检测美白成分安全性和有效性的方法，该检测方法包括以下步骤：
步骤一、称取熊果苷，用蒸馏水配制成熊果苷水溶液；
步骤二、配制含0.2PPM亚甲基蓝和60μg/ml海盐的胚胎培养液作为阴性对照液，配制含0.25mmol/L苯硫脲的胚胎培养液作为阳性对照液；
步骤三、用马蹄夹将皮肤模型夹在Franz透皮扩散池的给药池与接收池之间，在接收池内注入斑马鱼胚胎培养液，并向给药池中加入200μl所述熊果苷水溶液，将Franz透皮扩散池置于透皮扩散仪中，以37℃的温度扩散8小时后得到扩散后的透皮液；
步骤四、获取斑马鱼受精卵，将斑马鱼受精卵置于胚胎培养液中预孵化得到斑马鱼胚胎，将斑马鱼胚胎随机分配到24孔板中的3个孔内，将所述3个装有斑马鱼的孔依次记为一号孔、二号孔和三号孔，在一号孔内加入所述透皮液，在二号孔内加入所述阳性对照液，在三号孔内加入所述阴性对照液，将所述24孔板置于温度为28.5℃的培养箱中培养，得到斑马鱼幼鱼；
步骤五、统计一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼胚胎的死亡率，以及将一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼幼鱼置于显微镜下拍摄图像，根据所拍摄的图像统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
进一步的，为提高获取到的斑马鱼受精卵的质量，在一实施方式中，在步骤四中所述“获取斑马鱼受精卵”的具体方法为：
在获取斑马鱼受精卵的前1日将雌雄亲鱼分开，在第2天光照开始前将雌雄亲鱼按雌鱼与雄鱼1：2的比例并池，在光照后获得受精卵。
进一步的，为提高黑色素总面积统计的精度和效率，在一实施方式中，在步骤五中是通过图像处理软件统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
为解决上述技术问题，本发明还可以这样实现：一种检测美白成分安全性和有效性的方法，该检测方法包括以下步骤：
步骤一、称取熊果苷和抗坏血酸，用蒸馏水配制成熊果苷与抗坏血酸的复配溶液；
步骤二、配制含0.2PPM亚甲基蓝和60μg/ml海盐的胚胎培养液作为阴性对照液，配制含0.25mmol/L苯硫脲的胚胎培养液作为阳性对照液；
步骤三、用马蹄夹将皮肤模型夹在Franz透皮扩散池的给药池与接收池之间，在接收池内注入斑马鱼胚胎培养液，并向给药池中加入200μl所述复配溶液，将Franz透皮扩散池置于透皮扩散仪中，以37℃的温度扩散8小时后得到扩散后的透皮液；
步骤四、获取斑马鱼受精卵，将斑马鱼受精卵置于胚胎培养液中预孵化得到斑马鱼胚胎，将斑马鱼胚胎随机分配到24孔板中的3个孔内，将所述3个装有斑马鱼的孔依次记为一号孔、二号孔和三号孔，在一号孔内加入所述透皮液，在二号孔内加入所述阳性对照液，在三号孔内加入所述阴性对照液，将所述24孔板置于温度为28.5℃的培养箱中培养，得到斑马鱼幼鱼；
步骤五、统计一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼胚胎的死亡率，以及将一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼幼鱼置于显微镜下拍摄图像，根据所拍摄的图像统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
进一步的，为提高获取到的斑马鱼受精卵的质量，在一实施方式中，在步骤四中所述“获取斑马鱼受精卵”的具体方法为：
在获取斑马鱼受精卵的前1日将雌雄亲鱼分开，在第2天光照开始前将雌雄亲鱼按雌鱼与雄鱼1：2的比例并池，在光照后获得受精卵。
进一步的，为提高黑色素总面积统计的精度和效率，在一实施方式中，在步骤五中是通过图像处理软件统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
为解决上述技术问题，本发明还可以这样实现：一种检测美白成分安全性和有效性的方法，该检测方法包括以下步骤：
步骤一、称取熊果苷和烟酰胺，用蒸馏水配制成熊果苷和烟酰胺的复配溶液；
步骤二、配制含0.2PPM亚甲基蓝和60μg/ml海盐的胚胎培养液作为阴性对照液，配制含0.25mmol/L苯硫脲的胚胎培养液作为阳性对照液；
步骤三、用马蹄夹将皮肤模型夹在Franz透皮扩散池的给药池与接收池之间，在接收池内注入斑马鱼胚胎培养液，并向给药池中加入200μl所述复配溶液，将Franz透皮扩散池置于透皮扩散仪中，以37℃的温度扩散8小时后得到扩散后的透皮液；
步骤四、获取斑马鱼受精卵，将斑马鱼受精卵置于胚胎培养液中预孵化得到斑马鱼胚胎，将斑马鱼胚胎随机分配到24孔板中的3个孔内，将所述3个装有斑马鱼的孔依次记为一号孔、二号孔和三号孔，在一号孔内加入所述透皮液，在二号孔内加入所述阳性对照液，在三号孔内加入所述阴性对照液，将所述24孔板置于温度为28.5℃的培养箱中培养，得到斑马鱼幼鱼；
步骤五、统计一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼胚胎的死亡率，以及将一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼幼鱼置于显微镜下拍摄图像，根据所拍摄的图像统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
进一步的，为提高获取到的斑马鱼受精卵的质量，在一实施方式中，在步骤四中所述“获取斑马鱼受精卵”的具体方法为：
在获取斑马鱼受精卵的前1日将雌雄亲鱼分开，在第2天光照开始前将雌雄亲鱼按雌鱼与雄鱼1：2的比例并池，在光照后获得受精卵。
进一步的，为提高黑色素总面积统计的精度和效率，在一实施方式中，在步骤五中是通过图像处理软件统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
本发明的有益效果为：本发明先使用Franz透皮扩散池对检测对象(美白成分)进行皮透，再将得到的透皮液用于斑马鱼胚胎培养，因此真实的模拟实际使用过程中美白成分透过皮肤产生美白反应的过程，避免了美白成分无法透过皮肤而导致的检测结果不准确的问题，大大提高了检测结果的可靠性，同时本发明还评价美白分成的安全性；并且，本发明还对两种以上的美白成分的复配溶液进行检测，从而能够测试复配美白分成的效果。
附图说明
图1为改良的Franz透皮扩散池的结构示意图；
图2为本发明实施方式中熊果苷水溶液与阴性对照注液、阳对照液所培养出来的斑马鱼幼鱼的图像；
图3为本发明实施方式一中熊果苷水溶液与阴性对照注液、阳对照液所培养出来的斑马鱼幼鱼的体表黑色素总面积比；
图4为本发明实施方式二所得到的斑马鱼幼鱼的图像；
图5为本发明实施方式二所得到的斑马鱼幼鱼的体表黑色素总面积比；
图6为本发明实施方式三所得到的斑马鱼幼鱼的图像；
图7为本发明实施方式三所得到的斑马鱼幼鱼的体表黑色素总面积比。
标号说明：
1、给药池； 2、皮肤模型； 3、取样口； 4、接收池；
5、磁子； 6、马蹄夹。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
实施方式一
检测熊果苷水溶液的安全性和有效性的方法，包括步骤：
(1)称取一定量的熊果苷，用蒸馏水配制成100mmol/L的溶液；
(2)参考附图1，采用改良的Franz透皮扩散池，所述改良的Franz透皮扩散池包括：给药池1、皮肤模型2、取样口3、接收池4、磁子5；和马蹄夹6，用马蹄夹6将皮肤模型2夹在给药池1与接收池4之间，在接收池4内注满接收液(斑马鱼胚胎培养液)，向给药池1中加入200μl步骤(1)中的溶液，置于透皮扩散仪中，控制温度为37℃，8小时后，从取样口3取出接收池内的全部溶液即透皮液；
(3)配制含0.2PPM亚甲基蓝和60μg/ml海盐的胚胎培养液作为阴性对照；用胚胎培养液配制0.25mmol/L苯硫脲作为阳性对照；
(4)斑马鱼胚胎为野生型AB系斑马鱼所产的胚胎，在获取胚胎的前一日，雌雄亲鱼分开，第2天光照开始前将雌雄亲鱼(1:2)并池，光照后获得受精卵，加入胚胎培养液预孵化9小时得到斑马鱼胚胎，斑马鱼胚胎随机分配到24孔板中的3孔，每孔10个，加入1ml阴性对照液(占1孔)、1ml步骤(2)中获取的透皮液(占1孔)或1ml苯硫脲阳性对照液(占1孔)，放入28.5℃的培养箱培养，统计实验组胚胎的死亡率均和胚胎畸形率，在本试验中胚胎的死亡个数为0，并且每个胚胎都发育正常，说明该美白透皮液是安全的；
(5)步骤(4)作用45小时后，胚胎完全孵化出幼鱼，用吸管吸取幼鱼于显微镜下拍摄图像，直接比较图像中黑色素的数量如图2所示，或用图像处理软件进行统计处理，比较不同实验组之间斑马鱼体表黑色素的总面积如图3所示，本试验证明熊果苷透皮液是有美白效果的。
通过图2和图3可以得到，经过透皮后得到的熊果苷透皮液具有良好的美白效果和安全性，即可以证明在实际使用过程中熊果苷具有良好的美白特性和安全性。
实施方式二和实施方式三
实施方式二和实施方式三与实施方式一的步骤大致相同，与实施方式一不同之处在于，在实施方式二中，是以一定量的熊果苷和抗坏血酸配制的复配溶液为检测的对象进行试验，而在实施方式三中，则是以一定量的熊果苷和烟酰胺的复配溶液为检测的对象进行试验，在这两个实施方式中同样按实施方式一中的(1)至(5)五个步骤进行检测。而不同的是，在实施方式二中的步骤(4)中是将斑马鱼胚胎分到24孔板中的5个孔中，并相应孔内增加阴性对照液、阳性对照液、熊果苷溶液、抗坏血酸溶液或熊果苷与抗坏血酸的透皮液进行对照培养，图4为实施方式二所知得到的斑马鱼幼鱼的图像，图5为斑马鱼幼鱼的体表黑色素总面积比。在实施方式三中的步骤(4)中也是将斑马鱼胚胎分到24孔板中的5个孔中，并相应孔内增加阴性对照液、阳性对照液、熊果苷溶液、烟酰胺溶液或熊果苷和烟酰胺的透皮液进行对照培养，图6为实施方式二所知得到的斑马鱼幼鱼的图像，图7为斑马鱼幼鱼的体表黑色素总面积比。
从实施方式二和实施方式三的检测结果可以得出，熊果苷和抗坏血酸复配溶液以及熊果苷和烟酰胺的复配溶液相对于单一溶液美白效果更佳。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、称取熊果苷，用蒸馏水配制成熊果苷水溶液；
步骤二、配制含0.2PPM亚甲基蓝和60μg/ml海盐的胚胎培养液作为阴性对照液，配制含0.25mmol/L苯硫脲的胚胎培养液作为阳性对照液；
步骤三、用马蹄夹将皮肤模型夹在Franz透皮扩散池的给药池与接收池之间，在接收池内注入斑马鱼胚胎培养液，并向给药池中加入200μl所述熊果苷水溶液，将Franz透皮扩散池置于透皮扩散仪中，以37℃的温度扩散8小时后得到扩散后的透皮液；
步骤四、获取斑马鱼受精卵，将斑马鱼受精卵置于胚胎培养液中预孵化得到斑马鱼胚胎，将斑马鱼胚胎随机分配到24孔板中的3个孔内，将3个装有斑马鱼胚胎的孔依次记为一号孔、二号孔和三号孔，在一号孔内加入所述透皮液，在二号孔内加入所述阳性对照液，在三号孔内加入所述阴性对照液，将所述24孔板置于温度为28.5℃的培养箱中培养，得到斑马鱼幼鱼；
步骤五、统计一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼胚胎的死亡率，以及将一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼幼鱼置于显微镜下拍摄图像，根据所拍摄的图像统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
2.根据权利要求1所述的检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，在步骤四中所述“获取斑马鱼受精卵”的具体方法为：
在获取斑马鱼受精卵的前1日将雌雄亲鱼分开，在第2天光照开始前将雌雄亲鱼按雌鱼与雄鱼1：2的比例并池，在光照后获得受精卵。
3.根据权利要求1所述的检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，在步骤五中是通过图像处理软件统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
4.一种检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、称取熊果苷和抗坏血酸，用蒸馏水配制成熊果苷与抗坏血酸的复配溶液；
步骤二、配制含0.2PPM亚甲基蓝和60μg/ml海盐的胚胎培养液作为阴性对照液，配制含0.25mmol/L苯硫脲的胚胎培养液作为阳性对照液；
步骤三、用马蹄夹将皮肤模型夹在Franz透皮扩散池的给药池与接收池之间，在接收池内注入斑马鱼胚胎培养液，并向给药池中加入200μl所述复配溶液，将Franz透皮扩散池置于透皮扩散仪中，以37℃的温度扩散8小时后得到扩散后的透皮液；
步骤四、获取斑马鱼受精卵，将斑马鱼受精卵置于胚胎培养液中预孵化得到斑马鱼胚胎，将斑马鱼胚胎随机分配到24孔板中的3个孔内，将3个装有斑马鱼胚胎的孔依次记为一号孔、二号孔和三号孔，在一号孔内加入所述透皮液，在二号孔内加入所述阳性对照液，在三号孔内加入所述阴性对照液，将所述24孔板置于温度为28.5℃的培养箱中培养，得到斑马鱼幼鱼；
步骤五、统计一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼胚胎的死亡率，以及将一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼幼鱼置于显微镜下拍摄图像，根据所拍摄的图像统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
5.根据权利要求4所述的检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，在步骤四中所述“获取斑马鱼受精卵”的具体方法为：
在获取斑马鱼受精卵的前1日将雌雄亲鱼分开，在第2天光照开始前将雌雄亲鱼按雌鱼与雄鱼1：2的比例并池，在光照后获得受精卵。
6.根据权利要求4所述的检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，在步骤五中是通过图像处理软件统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
7.一种检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、称取熊果苷和烟酰胺，用蒸馏水配制成熊果苷和烟酰胺的复配溶液；
步骤二、配制含0.2PPM亚甲基蓝和60μg/ml海盐的胚胎培养液作为阴性对照液，配制含0.25mmol/L苯硫脲的胚胎培养液作为阳性对照液；
步骤三、用马蹄夹将皮肤模型夹在Franz透皮扩散池的给药池与接收池之间，在接收池内注入斑马鱼胚胎培养液，并向给药池中加入200μl所述复配溶液，将Franz透皮扩散池置于透皮扩散仪中，以37℃的温度扩散8小时后得到扩散后的透皮液；
步骤四、获取斑马鱼受精卵，将斑马鱼受精卵置于胚胎培养液中预孵化得到斑马鱼胚胎，将斑马鱼胚胎随机分配到24孔板中的3个孔内，将3个装有斑马鱼胚胎的孔依次记为一号孔、二号孔和三号孔，在一号孔内加入所述透皮液，在二号孔内加入所述阳性对照液，在三号孔内加入所述阴性对照液，将所述24孔板置于温度为28.5℃的培养箱中培养，得到斑马鱼幼鱼；
步骤五、统计一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼胚胎的死亡率，以及将一号孔、二号孔和三号孔内斑马鱼幼鱼置于显微镜下拍摄图像，根据所拍摄的图像统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
8.根据权利要求7所述的检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，在步骤四中所述“获取斑马鱼受精卵”的具体方法为：
在获取斑马鱼受精卵的前1日将雌雄亲鱼分开，在第2天光照开始前将雌雄亲鱼按雌鱼与雄鱼1：2的比例并池，在光照后获得受精卵。
9.根据权利要求7所述的检测美白成分安全性和有效性的方法，其特征在于，在步骤五中是通过图像处理软件统计出不同孔内斑马鱼幼鱼体表黑色素的总面积。
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