CN108593397B - 一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种2,4‑二硝基甲苯毒性的检测方法，包括以下步骤：配制含有不同2,4‑二硝基甲苯浓度的培养液；用含有不同2,4‑二硝基甲苯浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼96h，进行多组急性暴露试验，记录各组斑马鱼的死亡率，判断2,4‑二硝基甲苯对斑马鱼的急性毒性作用；用含有不同2,4‑二硝基甲苯浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼5d，进行多组亚致死暴露试验，取各组斑马鱼的肝脏和卵巢样品进行病理观察，以及测定各组斑马鱼的脂类代谢相关基因表达和氧气呼吸调节相关基因表达的变化，判断2,4‑二硝基甲苯对斑马鱼的慢性毒性作用。本发明提高了2,4‑二硝基甲苯毒性检测的直观性和准确性。

Description

一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法

技术领域

本发明涉及毒理学检测技术领域，特别涉及一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法。

背景技术

2,4-二硝基甲苯(2,4-dinitrotoluene，2,4-DNT)属于硝基苯类化合物家族，是聚氨酯泡沫、农药、橡胶和染料等生产过程的中间体，易经皮肤吸收引起中毒。急性中毒时会出现紫绀、头痛头晕、恶心呕吐、气短、倦睡，甚至神志丧失，如不及时治疗或引起死亡。长期作用下引起的慢性中毒会出现头痛头晕、疲倦、心悸、苍白、唇发绀、白细胞增多、贫血和黄疸等症状。2,4-DNT因其具有急性毒性和致癌致畸性已被列入我国及世界环境优先监测污染物名单中。我国松花江水体和鱼体中已多次检出此类污染物。因此，开展2,4-DNT毒理学研究，对于防范2,4-DNT公害具有十分重要的理论和实践意义。当前关于毒物的毒性研究，科研人员多以大鼠、仓鼠、小白鼠等为试验对象，试验存在研究成本高，动物繁殖周期长、单次产仔数低而不易获得同质试验个体，而且不能直观展示活体组织器官病理变化，因此不利于应用为2,4-DNT毒性研究的毒理模型。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，旨在提高2,4-二硝基甲苯毒性检测的效率、直观性和准确性。

为实现上述目的，本发明提出一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，包括以下步骤：

S10、配制含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；

S20、用含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼96h，进行多组急性暴露试验，记录各组斑马鱼的死亡率，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼的急性毒性作用；

S30、用含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼5d，进行多组亚致死暴露试验，取各组斑马鱼的肝脏和卵巢样品进行病理观察，以及测定各组斑马鱼的脂类代谢相关基因表达和氧气呼吸调节相关基因表达的变化，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼的慢性毒性作用。

优选地，步骤S10包括：

将丙酮与养殖用水混合，制成丙酮储备液；

将2,4-二硝基甲苯加入丙酮储备液中，通过超声波破碎获得2,4-二硝基甲苯母液；

取2,4-二硝基甲苯母液与养殖用水混合，制成含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；

其中，所述养殖用水为曝气加热的自来水。

优选地，所述超声波破碎的超声波频率为20～25kHz，超声波破碎的时间为5～8min。

优选地，在步骤S20中所述的急性暴露试验和步骤S30中所述的亚致死暴露试验的过程中，斑马鱼的饲养管理方法为：

将斑马鱼置于具有恒温循环水系统的培养缸中饲养，所述饲养缸中盛装有含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液，饲养过程中每天投喂饲养饵料，培养缸中的水温为27～29℃，水中溶氧大于5.0mg/L，pH为6.8～7.2，保持光照14h/黑暗10h的光照周期。

优选地，在步骤S30中，取各组斑马鱼的肝脏和卵巢样品进行病理观察的步骤，包括：

解剖斑马鱼后，取斑马鱼的肝脏和卵巢样品，经过切片、染色后，通过显微镜观察肝脏样品中的肝脏组织损伤情况和卵巢样品中的卵巢组织损伤情况。

优选地，步骤S30中：

所述斑马鱼的脂类代谢相关基因包括过氧化物酶体增殖激活受体-γ、过氧化物酶体增物激活受体-α和酯酰辅酶A氧化酶。

优选地，步骤S30中：

所述斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因包括低氧诱导因子1α、转铁蛋白a和血红素加氧酶。

本发明提供的技术方案中，以斑马鱼为试验对象进行2,4-二硝基甲苯的检测，饲养方便、养殖成本低且繁殖周期短，能够快速获得大量的同质个体，而且鱼体透明，易于观察中毒症状，可实时直观地观测鱼体各组织的病理变化，提高了2,4-二硝基甲苯毒性检测的效率、直观性和准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例3中各组斑马鱼的死亡率计算结果图；

图2为实施例4中各组斑马鱼的肝脏组织病理变化的观察结果图；

图3为实施例4中各组斑马鱼的卵巢组织病理变化的观察结果图；

图4为实施例4中各组斑马鱼的脂类运输相关基因apo表达的测定结果图；

图5为实施例4中各组斑马鱼的脂类运输相关基因fabp表达的测定结果图；

图6为实施例4中各组斑马鱼的脂类运输相关基因mtp表达的测定结果图；

图7为实施例4中各组斑马鱼的脂类代谢相关基因ppar-γ表达的测定结果图；

图8为实施例4中各组斑马鱼的脂类代谢相关基因ppar-α表达的测定结果图；

图9为实施例4中各组斑马鱼的脂类代谢相关基因acox表达的测定结果图；

图10为实施例4中各组斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因hif1α表达的测定结果图；

图11为实施例4中各组斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因tfa表达的测定结果图；

图12为实施例4中各组斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因ho表达的测定结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

2,4-二硝基甲苯(2,4-dinitrotoluene，2,4-DNT)属于硝基苯类化合物家族，是聚氨酯泡沫、农药、橡胶和染料等生产过程的中间体，易经皮肤吸收引起中毒。急性中毒时会出现紫绀、头痛头晕、恶心呕吐、气短、倦睡，甚至神志丧失，如不及时治疗或引起死亡。长期作用下引起的慢性中毒会出现头痛头晕、疲倦、心悸、苍白、唇发绀、白细胞增多、贫血和黄疸等症状。当前关于毒物的毒性研究，科研人员多以大鼠、仓鼠、小白鼠等为试验对象，试验存在研究成本高，动物繁殖周期长、单次产仔数低而不易获得同质试验个体，而且不能直观展示活体组织器官病理变化。

本发明针对2,4-DNT的急性中毒和慢性中毒现象，提出一种2,4-DNT毒性的检测方法，包括利用斑马鱼成鱼分别进行急性毒性试验和慢性毒性试验。在本发明提供的2,4-DNT毒性的检测方法的一实施例中，所述2,4-DNT毒性的检测方法包括以下步骤：

步骤S10、配制含有不同2,4-DNT浓度的培养液；

本实施例中，以纯度≥98％的2,4-DNT作为原料，配制含有不同2,4-DNT浓度的培养液，具体实施方法如下：以丙酮为溶剂，根据2,4-DNT的浓度梯度的设定，将适量2,4-DNT溶解于丙酮和曝气加热的养殖用水的混合液中，配制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液，作为检测2,4-DNT毒性过程中用于饲养斑马鱼的培养液。

步骤S20、用含有不同2,4-DNT浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼96h，进行多组急性暴露试验，记录各组斑马鱼的死亡率，判断2,4-DNT对斑马鱼的急性毒性作用；

斑马鱼是具有养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明等特点，是生命科学研究中一种重要的模式生物，有利于提高毒性检测的效率、直观性和准确性。本发明中选取健康的斑马鱼成鱼作为试验对象，雌雄各半，作为试验组，用含有不同2,4-DNT浓度对斑马鱼进行96h急性暴露试验，每天早晚各投食饵料一次，投食后清除粪便及残饵，每天定时更换2/3新鲜配制的培养液，观察不同时间段和不同浓度的2,4-DNT作用下斑马鱼的中毒症状，用针刺鱼体仍无反应即视为死亡，记录各组斑马鱼的死亡个体数，计算其死亡率，分析斑马鱼的中毒症状和死亡率与斑马鱼的暴露时间、2,4-DNT浓度的关系，判断2,4-DNT对斑马鱼的急性毒性作用。

步骤S30、用含有不同2,4-DNT浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼5d，进行多组亚致死暴露试验，取各组斑马鱼的肝脏和卵巢样品进行病理观察，以及测定各组斑马鱼的脂类代谢相关基因表达和氧气呼吸调节相关基因表达的变化，判断2,4-DNT对斑马鱼的慢性毒性作用。

选取与急性暴露试验同批次的健康斑马鱼雌鱼(成鱼)，作为试验组，用含有不同2,4-DNT浓度对斑马鱼进行为期5d的持续暴露试验，采用半静态法，每天早晚各投食饵料一次，投食后清除粪便及残饵，每天观察并记录斑马鱼的中毒症状及死亡个体数，用针刺鱼体仍无反应即视为死亡。暴露试验结束后，取斑马鱼的肝脏和卵巢样品，进行病理分析，同时，提取斑马鱼肝脏样品中的RNA并测定斑马鱼的脂类运输相关基因表达、脂类代谢基因表达和氧气呼吸调节相关基因表达，分析斑马鱼的病理变化和相关基因表达与斑马鱼的暴露时间、2,4-DNT浓度的关系，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼的慢性毒性作用。

需要说明的是，在步骤S30进行时，可以根据步骤S20中的2,4-DNT对斑马鱼的急性毒性试验结果，选取其中斑马鱼死亡率较低的几个2,4-DNT浓度梯度作为试验组，进行斑马鱼的亚致死暴露试验，这样，可以减小工作量，使得2,4-DNT对斑马鱼的慢性毒性作用的试验结果更为准确。

在步骤S30中，取各组斑马鱼的肝脏和卵巢样品进行病理观察的步骤，包括：解剖斑马鱼后，取斑马鱼的肝脏和卵巢样品，经过切片、染色后，通过显微镜观察肝脏样品中的肝脏组织损伤情况和卵巢样品中的卵巢组织损伤情况，肝脏组织的损伤情况可根据肝脏样品中肝细胞的排列分布、肝细胞的形态和分布等具体表征现象进行分析比对，卵巢组织的损伤情况可根据卵巢样品中卵母细胞的细胞结构和排列分布等具体表征现象进行对比分析。

现有对于硝基化合物的毒性研究主要集中于硝基化合物对哺乳动物生理生化的影响，在哺乳动物上的研究发现，暴露于高浓度的硝基化合物会导致溶血、贫血等症状，而2,4-DNT主要的中毒症状是高铁血红蛋白血症以及与之相关的效应。例如，有学者进行了不同的硝基甲苯类化合物对大鼠的毒性研究，结果表明硝基甲苯类物质影响了大鼠肝脏中脂肪代谢，而且一步比较了不同的硝基甲苯类化合物对大鼠的毒性，发现了它们的共同特点是影响脂类代谢的过程，同时发现2,4-DNT在此类物质中毒性相对较强。因此，在本实施例中，通过测定2,4-DNT对斑马鱼的脂类代谢相关基因和氧气呼吸调节相关基因表达的影响，进一步提高了2,4-DNT毒性检测的准确性。

其中，所述斑马鱼的脂类运输相关基因包括载脂蛋白(apoliporotein，apo)、脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，fabp)和微粒体转运蛋白(microsomaltriglyceride transfer protein，mtp)。

所述斑马鱼的脂类代谢相关基因包括过氧化物酶体增殖激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，ppar-γ)、过氧化物酶体增物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，ppar-α)和酯酰辅酶A氧化酶(acyl-coenzyme A oxidase，acox)。

所述斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因包括低氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor-1α，hif1α)、转铁蛋白a(transferrin a，tfa)和血红素加氧酶(heme oxygenase，ho)。

本发明提供的技术方案中，以斑马鱼为试验对象进行2,4-DNT的检测，饲养方便、养殖成本低且繁殖周期短，能够快速获得大量的同质个体，而且鱼体透明，易于观察中毒症状，可实时直观地观测鱼体各组织的病理变化，通过观测毒性试验过程中，斑马鱼的肝脏和卵巢的组织病理变化、以及脂类代谢相关基因表达和呼吸氧气调节相关基因表达的变化，判定2,4-DNT对斑马鱼的毒性作用，提高了2,4-DNT检测的效率、直观性和准确性。

可选地，步骤S10包括：

S11、将丙酮与养殖用水混合，制成丙酮储备液；

以丙酮作为溶解2,4-DNT的溶媒剂，提高2,4-DNT在所述培养液中的溶解性，首先需要将丙酮制备成丙酮储备液，具体做法如下：将丙酮与养殖用水混合，制备成丙酮的体积浓度为10％的丙酮溶液，作为丙酮储备液，放置于4℃、避光条件下保存备用。

S12、将2,4-DNT加入丙酮储备液中，通过超声波破碎获得2,4-DNT母液；

向丙酮储备液中加入2,4-DNT，通过超声波破碎后摇匀，制成2,4-DNT浓度为200mg/mL的2,4-DNT母液，放置于4℃、避光条件下保存备用。其中，所述超声波破碎的超声波频率为20～25kHz，超声波破碎的时间为5～8min。

S13、取2,4-DNT母液与养殖用水混合，制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液。

按照预设的2,4-DNT浓度梯度，将适量的2,4-DNT母液与养殖用水混合，，配制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液，用于检测2,4-DNT毒性试验过程中饲养斑马鱼的培养液，使斑马鱼暴露在含有不同浓度2,4-DNT的环境中，其中，在步骤S11和S13中，所述养殖用水为曝气加热的自来水。通过上述方法配制含有不同2,4-DNT浓度的培养液，制备方法简单，且2,4-DNT的溶解效果好，浓度控制准备，其浓度误差可控制在0.03％以内。

可选地，在步骤S20中所述的急性暴露试验和步骤S30中所述的亚致死暴露试验的过程中，斑马鱼成鱼的饲养管理方法为：将斑马鱼成鱼置于具有恒温循环水系统的培养缸中饲养，所述饲养缸中盛装有含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液，饲养过程中每天早晚各投喂饲养饵料一次，投食后清除粪便及残饵，培养缸中的水温为27～29℃，水中溶氧大于5.0mg/L，pH为6.8～7.2，保持光照14h/黑暗10h的光照周期。

所述饲养饵料包括热带小鱼饲料和红虫，所述热带小鱼饲料为市售的用于饲养热带小鱼的普通饲料；所述红虫通过以下方式饲养：将琼脂、奶粉和水按照0.5:2.5:7的质量比混合均匀，倒入锥形瓶中，在121℃的高压灭菌锅中灭菌20min，冷却后倒入深色的陶瓷盆(或陶瓷碗)中，再将小红虫放入其中进行饲养即可，需要投食时，可使用胶头滴管从陶瓷盆中吸取红虫向斑马鱼投食。通过同时投喂热带小鱼饲料和红虫，使得斑马鱼在试验过程的饮食习惯更贴近于在自然环境中生活时的状态，进而避免由于饲喂饵料营养成分不足等因素而导致影响毒性试验结果的准确性。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1斑马鱼饲养管理

(1)将斑马鱼(野生型AB系斑马鱼成鱼，购自国家斑马鱼资源中心)饲养在具有恒温循环水的水族缸(20cm×12cm×12cm)中，采用过滤并充分曝气的自来水，水族缸中盛有1.5L的含有不同2,4-DNT浓度的培养液，斑马鱼在水族缸中进行为期7天的驯养(期间无鱼体死亡)，驯养结束的斑马鱼作为进行2,4-DNT毒性检测的试验用斑马鱼，且饲养过程中每天早晚各投喂饲养饵料一次，投食后清除粪便及残饵，水族缸中使用加热棒加热使水温维持在28±1℃，溶氧大于5.0mg/L，pH为7.0±0.2，光照交替进行(光照14h/黑暗10h)，其中，饲养饵料为热带小鱼饲料(购自北京疯狂水草公司)和红虫。

(2)红虫的饲养方法：将琼脂、奶粉和水按照0.5:2.5:7的质量比混合均匀，倒入锥形瓶中，在121℃的高压灭菌锅中灭菌20min，冷却后倒入深色的陶瓷盆中，再将小红虫放入其中进行饲养，需要投食时，使用胶头滴管从陶瓷盆中吸取红虫向斑马鱼投食。

实施例2不同2,4-DNT浓度的培养液的配制

(1)丙酮储备液的配置：将丙酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)与曝气加热的自来水混合，配制成丙酮的体积浓度为10％的丙酮溶液，作为丙酮储备液，放置于4℃、避光条件下保存备用；

(2)2,4-DNT母液的配置：取丙酮储备液，向其中加入2,4-DNT(纯度≥98％，Sigma公司)，使用超声波破碎仪，在20～25kHz频率下破碎处理8min后，充分摇匀，配成2,4-DNT浓度为200mg/mL的2,4-DNT母液，放置于4℃、避光条件下保存备用；

(3)按照预设浓度梯度，将适量2,4-DNT母液与养殖用水混合，配制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液，其浓度梯度分别为2mg/L、4mg/L、8mg/L、12mg/L和16mg/L。

实施例3 2,4-DNT对斑马鱼的急性暴露试验

(1)选取丙酮作为2,4-DNT的溶媒剂，首先通过丙酮暴露试验确定了丙酮对斑马鱼的安全浓度为0.1mL/L，作为溶媒剂对照组；

(2)按照实施例1提供的斑马鱼饲养管理方法，将斑马鱼放置在水族缸中饲养，试验分为三组进行，分别为空白组、丙酮溶媒剂组和2,4-DNT处理组，空白组的培养液为养殖用水(不含有丙酮和2,4-DNT)，丙酮溶媒剂组的培养液为丙酮浓度为0.1mL/L的养殖用水，2,4-DNT处理组中的培养液为含有不同2,4-DNT浓度的培养液，设有5个浓度梯度，分别为2mg/L、4mg/L、8mg/L、12mg/L和16mg/L。每组投放6条斑马鱼成鱼，体重为3.87±0.28g，体长为28±2mm，雌雄各半，每组设置3个平行，进行试验时长为96h的急性暴露试验，每天早晚各投食饵料一次，投食后清除粪便及残饵，每天定时更换2/3新鲜配制的培养液，观察斑马鱼的中毒症状，用针刺鱼体仍无反应即视为死亡，记录各组死亡个体数，并及时清除死鱼，计算死亡率，计算公式如下：

死亡率＝每个重复组死亡个体数/每个重复组供试个体数×100％

死亡率计算结果如图1(图1中，不同字母表示差异显著(P＜0.05)，误差棒表示标准误差)所示，结合图1的计算结果和试验过程中的斑马鱼中毒症状的观察结果，得出以下结论：在2,4-DNT对斑马鱼的急性毒性试验中，空白组和丙酮溶媒剂组均未出现异常症状。但是暴露于2,4-DNT各浓度组的斑马鱼在24h后摄食减少；48h后处理组斑马鱼浮于水体中上层，表现出缺氧症状，游动迟缓，而且具有剂量效应，2,4-DNT浓度越高斑马鱼越浮于表面，16mg/L处理组开始出现死亡现象；72h后高浓度组斑马鱼鱼体失去平衡，8mg/L、12mg/L、16mg/L处理组均有个体死亡，如图1所示，16mg/L处理组死亡率达61.1％，显著高于其他组(P<0.05)；暴露96h后，16mg/L处理组的斑马鱼已全部死亡，12mg/L处理组和8mg/L处理组的死亡率均显著高于低浓度处理和对照组(P<0.05)，死亡率分别为72.2％和33.3％。死亡的斑马鱼鳃部充血，胸鳍根部呈暗红色，解剖后发现肝脏组织呈淡黄绿色，略有肿大；雌鱼的卵巢组织变得较松散，组织发白。

通过统计急性毒性实验中斑马鱼的死亡率，采用线性回归法得到浓度与死亡率的回归方程y＝6.961x5.142(R2＝0.987)，经计算2,4-DNT对斑马鱼成鱼96h-LC₅₀(半数致死浓度LC₅₀为引起一半斑马鱼死亡的AFB1浓度)为9.36mg/L，95％置信区间为8.09～10.27mg/L。

实施例4 2,4-DNT对斑马鱼的亚致死暴露试验

(1)根据实施例3的试验结果，确定斑马鱼的亚致死暴露试验中选用的2,4-DNT的浓度分别设置为2mg/L、4mg/L和8mg/L；

(2)按照实施例1提供的斑马鱼饲养管理方法，随机挑选与实施例3中所使用的斑马鱼同批次的健康雌鱼，放置在水族缸中饲养，试验分为三组进行，分别为空白组、丙酮溶媒剂组和2,4-DNT处理组，空白组的培养液为养殖用水(不含有丙酮和2,4-DNT)，丙酮溶媒剂组的培养液为丙酮浓度为0.1mL/L的养殖用水，2,4-DNT处理组中的培养液为含有不同2,4-DNT浓度的培养液，设有3个浓度梯度，分别为2mg/L、4mg/L和8mg/L。每组投放6条斑马鱼，每组设置3个平行，进行为期5d的持续暴露试验，每天早晚各投食一次，投食后清除粪便及残饵，每天观察斑马鱼的中毒症状，用针刺鱼体仍无反应即视为死亡，及时清除死鱼。暴露试验结束后，取各组存活的斑马鱼，解剖并取其肝脏和卵巢样本，进行分析检测，分析检测的方法和结果如下：

①2,4-DNT对斑马鱼的肝脏组织和卵巢组织的病理变化影响

取各组斑马鱼的肝脏组织和卵巢组织样本，用新鲜配制的4％的多聚甲醛固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸透包埋，进行常规石蜡连续切片，切片厚度5～6μm。切片结束后，进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精-伊红染色，脱水，封片。在OlympusBX53正置显微镜下观察拍照，进行组织病理学分析。

不同2,4-DNT浓度对斑马鱼肝脏组织的影响如图2所示，图2中，图A至图E分别为空白组、丙酮溶媒剂组、2mg/L的2,4-DNT处理组、4mg/L的2,4-DNT处理组和8mg/L的2,4-DNT处理组的斑马鱼肝脏组织样品的拍摄结果，其中，黑色星号“*”表示白细胞，黑色三角形“▲”表示内皮细胞，双箭头表示肝细胞，单箭头表示红细胞。结合图2中拍摄的照片和肝脏组织病理学分析可知，空白组斑马鱼的肝实质组织分布清晰，肝细胞索排列紧密，肝细胞核大而圆，染色质着色深紫色，肝细胞包围着胆小管排列，肝细胞索排列紧密，浸润在血液充沛的血窦中。丙酮溶媒剂组的肝脏组织结构基本类似于空白对照组。但是与空白组相比，处理组的斑马鱼肝脏组织出现了不同程度的损伤，且呈现剂量效应。2mg/L处理组斑马鱼的肝实质组织疏松，肝细胞膨大，胞质中出现空泡，细胞核中的染色质皱缩，胆小管膨大，血窦内皮细胞不再清晰，血窦中血细胞数量减少，仅有的红细胞呈现降解的特点，白细胞的数量增加。4mg/L处理组斑马鱼肝实质损伤进一步加剧，整个组织嗜酸性，没有清晰的血窦组织，很少能找到结构完整的红细胞，值得注意的是细胞中出现了很多细胞核固缩的白细胞。8mg/L处理组斑马鱼肝组织排列疏松，嗜酸性更强，大多数肝细胞胞质已经空泡状，细胞核降解，很难看到血窦和胆小管的结构，也很难找到血细胞。

不同2,4-DNT浓度对斑马鱼卵巢组织的影响如图3所示，图3中，图A至图E分别为空白组、丙酮溶媒剂组、2mg/L的2,4-DNT处理组、4mg/L的2,4-DNT处理组和8mg/L的2,4-DNT处理组的斑马鱼肝脏组织样品的拍摄结果，其中，单箭头表示滤泡细胞，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ表示不同时相卵泡细胞。

脂类物质是鱼类卵黄的重要组成部分，在硬骨鱼中，在雌激素作用下肝细胞合成的卵黄原蛋白，通过血液循环，输送至卵巢，被卵母细胞通过胞饮作用摄入并进一步转化为卵黄蛋白。结合图3中拍摄的照片和卵巢组织病理学分析可知，在2,4-DNT环境下，斑马鱼卵巢组织受到了一定损伤。如图3所示，空白组斑马鱼的卵巢组织中各级卵母细胞排列紧密，外围被滤泡上皮细胞包围，卵母细胞卵黄膜紧贴滤泡膜，Ⅳ期卵母细胞内充满大量的卵黄颗粒，结缔组织中的血管分布丰富。与空白组相比，丙酮溶媒剂对照组和2mg/L处理组，各级卵母细胞卵黄膜紧贴滤泡膜，卵母细胞结构并没有明显变化。但是4mg/L处理组，卵巢的组织结构变得疏松，Ⅳ期卵母细胞卵黄膜和滤泡膜剥离，出现闭锁卵泡。8mg/L处理组，卵巢的组织结构损伤严重，各级卵母细胞之间的结缔组织降解，卵母细胞外围的滤泡上皮细胞排列疏松，滤泡膜溶解，呈败育趋势。总之，卵巢组织的损伤程度和2,4-DNT的处理浓度呈正相关。

②2,4-DNT对斑马鱼的脂类代谢、氧气呼吸调节相关基因表达的影响

斑马鱼的脂类运输相关基因包括载脂蛋白apo、fabp和mtp；斑马鱼的脂类代谢相关基因包括ppar-γ、ppar-α和acox；斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因包括hif1α、tfa和ho。其中，ppar-α是配体激活核转录调节因子，能过调节脂肪酸的摄取、活化以及转运；ppar-γ能通过够诱导载脂蛋白、氧化酶系与脂蛋白脂酶等，从而促进脂质的氧化分解；acox是脂肪酸β-氧化的第一限速酶。

用TRIzol试剂(Invitrogen)提取各组肝脏样品总RNA，NanoDrop2000(ThermoScientific)测定总RNA浓度，且60/80比值在1.8～2.0之间；同时采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，28S、18S和5SRNA条带清晰可见，且28S核糖体RNA的条带亮度是18S核糖体RNA的2倍。各样品分别取1μg总RNA用1st Stand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反转录合成第一链cDNA。实时荧光定量PCR(qPCR)采用Fast Start Universal SYBR GreenMaster(ROX)试剂盒(Roche)，扩增体系为10.0μL，其中SYBR Premix Ex Taq 5μL，正反向引物(10μmol/L)各0.2μL，ROX reference Dye II 0.2μL，nuclease-free water 3.4μL，cDNA模板1μL。各个基因的引物序列见下表1所示。反应在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行。qPCR反应程序95℃预变性10min，95℃变性15s，退火温度反应30s，72℃延伸30s并检测荧光信号，共40个循环；反应结束后进入溶解曲线阶段，溶解曲线温度设置为60～95℃，每隔5s升温0.5℃，检测引物特异性。每个样品做三个平行对照，内参基因为β-actin，用2^-ΔΔCт法比较目的基因表达量的相对变化。

表1实时荧光定量PCR引物序列

斑马鱼的脂类运输相关基因表达的测定结果如图4至图6所示，图4至图6依次为apo、fabp和mtp表达的测定结果；斑马鱼的脂类代谢相关基因表达的测定结果如图7至9所示，图7至图9依次为ppar-γ、ppar-α和acox表达的测定结果。图4至图9中，上标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，上标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

分析图4至图6可知，在参与脂类运输的基因中，丙酮处理组与空白组相比较无明显变化，apo和fabp的表达量随着2,4-DNT浓度升高明显下调，而mtp表达量呈上升趋势。就apo而言，4mg/L处理组和8mg/L处理组极显著低于空白组(P<0.01)，分别下调了49.7％和66.4％；就fabp而言，4mg/L处理组和8mg/L处理组均极显著低于空白对照组(P<0.01)，分别下调了39.3％和63.3％；但是mtp基因的表达量呈上升趋势，8mg/L处理组较空白组极显著上调了34.7％(P<0.01)。

如图7至图9所示，进一步分析脂类代谢调节的相关基因发现，ppar-γ的表达量略有上调，而ppar-α和acox的表达随着2,4-DNT浓度升高明显下调。就ppar-γ的表达而言，4mg/L处理组和8mg/L处理组均极显著高于空白组(P<0.01)，分别上调了21.3％和35.0％；而就ppar-α的表达量而言，4mg/L和8mg/L处理组较空白组极显著下调(P<0.01)，分别下调了71.7％和67.7％；acox表达量随着2,4-DNT处理浓度的增高呈下降趋势，2mg/L、4mg/L和8mg/L均极显著低于空白组(P<0.01)，分别下调了24.3％、62.0％和65.3％。

ppar-α作为脂类代谢的首要调节因子，ppar-α缺乏或表达受抑制，可引起一系列与肝内脂肪酸代谢有关的蛋白质、酶基因转录水平降低。当ppar-α缺失时，2,4-DNT的暴露导致ppar-γ表达量上调。ppar-γ表达量上调可能作为机体的补偿反应来缓解由于ppar-α缺失导致的脂肪酸代谢产能的减少，从而维持机体的能量需求。此外，活化的ppar-γ可抑制炎症因子TNF-α、IL-1、IL-2和IL-6的产生，产生抗炎症作用，而细胞炎症因子IL-1可通过抑制mtp一个增强子的表达显著下调mtp mRNA水平。当TNF-α、IL-1生成受到抑制，其对mtp增强子的抑制作用相应减弱，因此2,4-DNT暴露后mtp表达量有所上升。

斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因表达的测定结果如图10至图12所示，图10至图12依次为hif1α、tfa和ho表达的测定结果，图10至图12中，平均数上标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

hif1α蛋白是一种非常重要的氧调节因子，在机体缺氧时可以被诱导，hif1α是hif1的活性和调节基团；tfa是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载组织和细胞中游离的铁，对红细胞氧气的转运十分重要；ho是血红素降解的关键酶，在氧化应激过程中，ho可抗氧化损伤，具有细胞保护功能。

结合图10至图12可知，低氧诱导因子hif1α在2mg/L和4mg/L的2,4-DNT处理的斑马鱼肝脏中表达量与空白组相比无明显变化，但是8mg/L处理组中hif1α的表达量较空白组极显著上调了41.8％(P<0.01)；就转铁蛋白tfa而言，4mg/L处理组tfa的相对表达量较空白对照组差异显著(P<0.05)，上调了13.8％，8mg/L处理组较空白对照组出现极显著差异(P<0.01)，上调了54.0％；2,4-DNT处理组的血红素加氧酶ho表达量与空白对照组相比均极显著上调(P<0.01)，分别上调了4.37倍、4.59倍、4.61倍。

2,4-DNT属于氧化性毒物，可以诱导高铁血红蛋白血症，此外2,4-DNT还可以使红细胞膜表面脂质过氧化进而导致溶血，而2,4-DNT的这些作用都会影响机体氧气运输，造成机体功能型缺氧，而低氧可诱导hif1α水平的增高，任何能使机体产生氧化应激的因素都能诱导ho和tfa的表达。2,4-DNT可能通过以上因素导致hif1α、tfa、ho的表达量上调。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10、将2,4-二硝基甲苯溶解于丙酮与曝气加热的自来水的混合液中，配制成含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；

S20、用含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼96h，进行多组急性暴露试验，记录各组斑马鱼的死亡率，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼的急性毒性作用；

S30、用含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液分别饲养斑马鱼成鱼5d，进行多组亚致死暴露试验，取各组斑马鱼的肝脏和卵巢样品进行病理观察，以及测定各组斑马鱼的脂类运输相关基因表达、脂类代谢相关基因表达和氧气呼吸调节相关基因表达的变化，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼的慢性毒性作用；

其中，在步骤S20中所述的急性暴露试验和步骤S30中所述的亚致死暴露试验的过程中，斑马鱼的饲养管理方法为：将斑马鱼置于具有恒温循环水系统的培养缸中饲养，所述培养缸中盛装有含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液，饲养过程中每天投喂饲养饵料，培养缸中的水温为27～29℃，水中溶氧大于5.0mg/L，pH为6.8～7.2，保持光照14h/黑暗10h的光照周期，所述饲养饵料包括热带小鱼饲料和红虫；

所述斑马鱼的脂类运输相关基因包括载脂蛋白、脂肪酸结合蛋白和微粒体转运蛋白，所述斑马鱼的脂类代谢相关基因包括过氧化物酶体增殖激活受体-γ、过氧化物酶体增物激活受体-α和酯酰辅酶A氧化酶，所述斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因包括低氧诱导因子1α、转铁蛋白a和血红素加氧酶。

2.如权利要求1所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，步骤S10包括：

将丙酮与养殖用水混合，制成丙酮储备液；

将2,4-二硝基甲苯加入丙酮储备液中，通过超声波破碎获得2,4-二硝基甲苯母液；

取2,4-二硝基甲苯母液与养殖用水混合，制成含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；

其中，所述养殖用水为曝气加热的自来水。

3.如权利要求2所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，所述超声波破碎的超声波频率为20～25kHz，超声波破碎的时间为5～8min。

4.如权利要求1所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，在步骤S30中，取各组斑马鱼的肝脏和卵巢样品进行病理观察的步骤，包括：

解剖斑马鱼后，取斑马鱼的肝脏和卵巢样品，经过切片、染色后，通过显微镜观察肝脏样品中的肝脏组织损伤情况和卵巢样品中的卵巢组织损伤情况。