CN101284002A - 一种防治肝脏损伤的药物 - Google Patents

Abstract

一种以淫羊藿素作为有效成分的防治肝脏损伤的药物。药理试验效果证明淫羊藿素对肝脏损伤具有抗凋亡、抗氧化、抗炎活性及保护作用，淫羊藿素对急、慢性肝损伤、缺氧肝损伤及缺血再灌注肝损伤所致活性氧簇、细胞凋亡、炎性细胞因子的释放具有明显的抑制作用。且淫羊藿素对小鼠的急性毒性试验显示无毒性。因此淫羊藿素是一种具有很大开发前景的防治急、慢性肝损伤、缺氧肝损伤及缺血再灌注肝损伤的新药。

Description

一种防治肝脏损伤的药物

技术领域

本发明涉及一种防治肝脏损伤的药物。

背景技术

淫羊藿(Epimedii Herba)是我国传统中药，系小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)植物，具有补肾壮阳、祛风除湿的功效。淫羊藿中黄酮醇类化合物具有治疗心脑血管疾病、防治骨质疏松等药理活性(裴利宽等，中国中药杂志，2007，32(6)：466-471)。淫羊藿素(icaritin)是淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷的苷元，属黄酮醇类化合物，它既是淫羊藿苷经化学处理转化后的产物，同时也是淫羊藿苷在机体内重要的代谢产物(Liu J et al，J Pharm Biomed Anal，2004，36(2)：365-370)。

淫羊藿素作为一个化学分子单体，有关其药理作用的报道目前主要有：1、通过拟雌激素样作用促进细胞增殖，保护脑细胞的毒性损伤(Wang Z et al，Neuroscience，2007，145(3)：911-922)；2、诱导胚胎干细胞分化；3、通过拟雌激素作用抑制雄性激素依赖的前列腺癌细胞的增殖分化，从而具有治疗前列腺癌的应用前景(Huang X et al，Eur JPharmacol，2007，564(1-3)：26-36)。

目前有关淫羊藿素的前体物质淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷保护器官急、慢性损伤及缺血再灌注损伤的文献较为多见，靶器官主要集中在脑、心脏、肾脏等，但研究均不够深入。在体外实验模拟急、慢性损伤及缺血再灌注损伤条件下，淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷对上述器官细胞具有保护作用；在体内实验，无论是经缺血干预前的胃饲还是静脉注射，对上述损伤器官也都表现出保护作用。其可能的机理主要包括下列四个方面：1、扩张器官血管，降低血流阻力，增加器官血流量(Liu W J et al，Asian J Androl，2005，7(4)：381-388)；2、能调控多种内脏器官的钙通道，维持细胞内Ca²⁺离子浓度稳定和细胞正常生理功能，在缺氧条件下可阻止缺血再灌注细胞内Ca²⁺离子浓度升高(Li L etal，Chin Med J，2005，118(19)：1637-1643)；3、可提高组织内超氧化物歧化酶(SOD)活性，增加对活性氧簇(ROS)的清除，降低脂质过氧化反应程度，减少血清脂质过氧化产物MDA的产生，具有较强的抗脂质过氧化作用(Liu ZQ，J Phys Chem A，2006，110(19)：6372-6378)；4、淫羊藿总黄酮对肾上腺素能受体具有阻断作用(Pan Y et al，BiolPharm Bull，2006，29(12)：2399-2403)。

但直至目前，还未见有关淫羊藿素作为防治肝脏损伤的药物的报道。

发明内容

本发明提供一种以淫羊藿素作为有效成分的防治肝脏损伤的药物。防治肝脏损伤的药物中也可含有治疗有效量的淫羊藿素及可药用载体和/或赋形剂。所述肝脏损伤包括急、慢性肝损伤，缺氧肝损伤和缺血再灌注肝损伤。

本发明在体外细胞和小鼠或大鼠体内药理试验的基础上，对淫羊藿素降低急、慢性肝损伤，缺氧肝损伤及缺血再灌注肝损伤的防治药效机制进行了论证，提出淫羊藿素可作为防治肝脏损伤药物的有效成分，提出淫羊藿素可在制备防治急、慢性肝损伤，缺氧肝损伤及缺血再灌注肝损伤药物中的应用。

淫羊藿素的制备

参考文献报道(叶海涌等，浙江大学学报(医学版)，2005，34(2)：131-136)。简述如下：将箭叶淫羊藿磨成粉末，用溶剂萃取，萃取物通过硅胶柱层析，用溶剂洗脱，可制得淫羊藿素前体淫羊藿苷。再按照下列示意的反应路线，将淫羊藿苷通过水解反应制得淫羊藿素。

淫羊藿苷    淫羊藿素

淫羊藿素的药理试验

1.体外肝细胞损伤模型试验

a)淫羊藿素对H₂O₂损伤肝细胞的保护作用

为了证实淫羊藿素对H₂O₂损伤肝细胞的保护作用，用不同浓度的淫羊藿素处理H₂O₂损伤的大鼠原代肝细胞6小时，用MTT法测定细胞活力(OD值表示)。试验结果如图1所示，淫羊藿素处理后，各组较对照组的细胞活力有明显提高，淫羊藿素8μmol/L组显示最佳的保护作用。

b)淫羊藿素对四氯化碳(CCl₄)损伤肝细胞的保护作用

为了证实淫羊藿素对CCl₄损伤肝细胞的保护作用，用不同浓度的淫羊藿素处理CCl₄损伤的大鼠原代肝细胞6小时，然后用自动生化分析仪测定培养上清液中肝脏损伤的特异性酶学指标丙氨酸转氨酶(ALT)及门冬氨酸转氨酶(AST)活力。试验结果如图2所示，随着淫羊藿素浓度升高，细胞培养上清液中ALT和AST活力逐渐降低，在淫羊藿素8μmol/L时二酶活力最低，约为对照组的1/3。

c)淫羊藿素能抑制缺氧后复氧肝细胞内活性氧簇生成，具有确定的抗氧化活性

为了证实淫羊藿素对缺氧损伤肝细胞的保护作用，用淫羊藿素处理后，检测缺氧后复氧2小时大鼠原代肝细胞内活性氧簇，检测图像结果见图3。由图像可以看出，淫羊藿素可抑制缺氧后复氧肝细胞内活性氧簇的产生，淫羊藿素8μmol/L组的效果较为明显。该试验证实淫羊藿素是细胞活性氧的清除剂，通过抗氧化活性起到保护细胞免受缺氧复氧所致的活性氧损伤。

d)淫羊藿素能增强H₂O₂损伤肝细胞的抗凋亡作用

用浓度为8μmol/L的淫羊藿素处理大鼠原代肝细胞24小时，收集后用AnnexinV/FITC荧光标记的流式细胞术测定细胞凋亡率，试验结果图像见图4。应用淫羊藿素处理后，肝细胞凋亡细胞的比率由74％下降到5％，证明淫羊藿素具有增强损伤肝细胞抗凋亡的活性。

e)淫羊藿素能提高损伤肝细胞的抗炎能力

培养的肝细胞经10ng/ml TNF-α作用16小时后用不同浓度淫羊藿素处理，采用ELISA测定培养上清液中的炎性细胞因子含量，结果显示，TNF-α可诱导大鼠原代肝窦内皮细胞表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和E-选择素(E-selection)，而淫羊藿素能降低其表达，表明淫羊藿素具有增强损伤肝细胞抗炎的活性。

2.淫羊藿素能降低小鼠缺血再灌注肝损伤

用昆明种小鼠做试验，手术后缺血90分钟再灌注6小时作为抽取血样的时间点，测定ALT活性。实验结果显示，随着淫羊藿素剂量增加，治疗组肝细胞释放ALT减少，而ALT越低说明肝细胞损伤越轻。图5显示最大保护浓度为10mg/kg体重，血清ALT活性为1820U/L，与缺血再灌注损伤组相比有明显降低。

此外还进行了下列试验：

淫羊藿素在小鼠体内的药代动力学试验

口饲给药的淫羊藿素在4个昆明种小鼠体内的药代动力学参数见表4，这些实验数据说明淫羊藿素能在体内保持一定的药物浓度，有利于防治肝脏损伤的效果。

给药后淫羊藿素对小鼠的急性毒性试验

受试小鼠处死后进行病理分析，结果显示，以单次剂量1000mg/kg体重和多次剂量200mg/kg体重(Q2天×15)给予淫羊藿素，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。

由以上药理试验的效果证明，来源于天然物质中草药箭叶淫羊藿的淫羊藿素对受损伤的肝细胞具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的活性及保护作用，淫羊藿素对急、慢性肝损伤，缺氧肝损伤及肝脏缺血再灌注损伤所产生的活性氧簇、细胞凋亡、炎性细胞因子释放具有明显的抑制作用。淫羊藿素是一个有效的抗氧化剂，能通过抑制活性氧簇生成降低对肝细胞的损伤；淫羊藿素通过拟雌激素样作用降低肝细胞的凋亡；应用淫羊藿素处理肝脏缺血再灌注损伤的昆明小鼠，试验结果显示，治疗组血清ALT水平较对照组明显降低。此外，淫羊藿素对小鼠的急性毒性试验结果也未显示毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。因此淫羊藿素是一种有效的具有很大开发前景的防治急、慢性肝损伤，缺氧肝损伤及缺血再灌注肝损伤的新药，在临床应用淫羊藿素保护肝脏损伤的范畴：主要包括甲、乙、丙型肝炎病毒对肝脏的炎症损伤，抗肿瘤化疗药物对肝脏的毒性损伤，药物过量及误服毒性物质所引起的肝脏急性损伤，肝叶切除术中肝血流阻断对残肝的缺血再灌注损伤，以及在肝移植供体保存所致冷缺血损伤及热缺血灌注损伤。防治药物中也可含有有效量的淫羊藿素及通常已知常规的可药用载体和/或赋形剂，例如Captisol，玉米油，羧甲基纤维素钠。

口服的有效剂量推荐为每天250-50mg/体表面积M²，持续两周为一疗程。具体病例可由医师根据病情调整。

附图说明

图1是淫羊藿素作用于H₂O₂损伤大鼠原代肝细胞后肝细胞活力的变化示图。

图2是淫羊藿素作用于CCl₄损伤大鼠原代肝细胞后培养上清的肝酶变化示图。

图3是淫羊藿素对缺氧后复氧2小时大鼠原代肝细胞内活性氧簇生成影响的检测图像，

图中：A：空白对照组

      B：损伤组

      C：淫羊藿素4μmol/L处理组

      D：淫羊藿素8μmol/L处理组。

图4是淫羊藿素降低H₂O₂所致大鼠原代肝细胞凋亡的AnnexinV/FITC荧光标记流式细胞术检测图像，

图中：A：空白对照组

      B：H₂O₂损伤组

      C：淫羊藿素8μmol/L处理组

      D：淫羊藿素8μmol/L+ICI 182780(0.1μmol/L)处理组

图5是淫羊藿素对缺血再灌注肝损伤小鼠血清ALT影响的示图。

图6是淫羊藿素对CCl₄所致急性肝损伤小鼠血清肝酶影响的示图。

具体实施方式

实施例1

淫羊藿素的制备(参见叶海涌等，浙江大学学报(医学版)，2005，34(2)：131-136)

取在中国南部山区采集获得的箭叶淫羊藿2kg磨成粉末，然后用95％乙醇(10L)萃取。获得250g浓缩原料，然后用2.5L氯仿、乙酸乙酯和n-丁醇进一步萃取。将8g乙酸乙酯萃取物和10g n-丁醇萃取物装入硅胶层析柱，用CHCl₃-MeOH-HCOOH(15∶1∶0.5)和CHCl₃-MeOH(8∶2)分别洗脱。通过这一过程，可制得300mg淫羊藿素和去甲淫羊藿素前体淫羊藿苷。然后按照以下简要描述的方法将前体水解，即可制得淫羊藿素。溶液A：将80mg前体超声溶解于18ml甲醇溶液中；溶液B：500U(0.433g)纤维素酶溶于180ml(0.1mol/L)，pH 5.0乙酸缓冲液中。一边搅拌一边将溶液A缓慢加入溶液B中，然后将所得混合物在37℃的振荡水浴中孵育过夜，以充分水解连接在前体上的葡萄糖和鼠李糖。第二天用三份等体积(约200ml)的乙酸乙酯萃取，并将有机物层在旋转蒸发仪上真空干燥得淫羊藿素(150mg)。

实施例2

淫羊藿素减轻大鼠原代肝细胞H₂O₂损伤模型试验

1.大鼠原代肝细胞的获取与培养

参考Seglen的两步胶原酶灌注法并作改进(徐哲等，医学研究生学报，2003，16(5)：342-344)。取SD大鼠(购自第二军医大学实验动物中心)麻醉后，尾静脉注射肝素1000U，无菌条件打开腹腔，分离并结扎门静脉和下腔静脉的远心端及上腔静脉，从门静脉近心端插管，剪开下腔静脉近心端，用4℃ D-Hanks液(含0.5mol/L EDTA)以流速为40ml/分钟恒流泵开放灌注，待肝脏变为土黄色后，把肝脏置于消毒的平皿中，改用37℃、0.03％胶原酶300ml，以20ml/分钟速度进行循环灌注，约10分钟后可见包膜下的肝组织呈龟背状裂开，继续灌注5分钟后停止灌注。去除肝包膜及血管等纤维结缔组织，收集肝细胞悬液，洗涤液清洗肝细胞3次去除胶原酶及非肝脏实质来源的细胞。台盼蓝染色检测细胞活力大于90％，将肝细胞悬液的密度调整为1×10⁶/ml，按2×10⁵/cm²接种于铺有0.1mg/ml鼠尾胶的培养板中，37℃、5％CO₂条件下培养。12小时后换用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，20mg/L促肝细胞生长因子，0.5mg/L胰岛素，1.0×10^-3mol/L地塞米松)，以后每24小时换培养液一次。

2、贴壁大鼠原代肝细胞随机分为H₂O₂损伤组、溶剂DMSO组、淫羊藿苷阳性对照组、淫羊藿素2μmol/L处理组、淫羊藿素4μmol/L处理组、淫羊藿素8μmol/L处理组、淫羊藿素16μmol/L处理组。大鼠原代肝细胞培养于96孔板，各组加入不同浓度药物的培养液，24小时后置换含H₂O₂的培养液(浓度为800μmol/L)，作用6小时后用MTT法测定各孔的细胞活力。淫羊藿苷已被证实具有明确的保肝效果，其保肝作用是常用保肝药物水飞蓟素的20倍(Mi-kyeong Lee，Planta Med.1995，61(6)：523-526)。MTT测定的OD值大小代表细胞存活数目的多少，OD值越大，存活细胞越多，细胞活力越强。实验结果显示，不同浓度的淫羊藿素处理组细胞活力较H₂O₂损伤组有明显提高，淫羊藿素8μmol/L处理组显示最佳的保护作用，OD值是H₂O₂损伤组的25倍，并且优于淫羊藿苷阳性对照组。不同浓度淫羊藿素作用于H₂O₂损伤大鼠原代肝细胞后肝细胞活力的变化情况见图1。

实施例3

淫羊藿素减轻大鼠原代肝细胞CCl₄损伤模型试验

1、大鼠原代肝细胞的获取与培养见实施例2。

2、大鼠原代肝细胞培养于24孔板，随机分为CCl₄损伤组、溶剂DMSO组、淫羊藿苷及还原型谷胱甘肽对照组、淫羊藿素2μmol/L处理组、淫羊藿素4μmol/L处理组、淫羊藿素8μmol/L处理组、淫羊藿素16μmol/L处理组。每组设6个复孔。还原型谷胱甘肽是临床常用的保肝药品，在本试验中与淫羊藿苷共同设为阳性对照组。大鼠原代肝细胞培养两天后，各组分别加入不同浓度药物的培养液，24小时后置换含CCl₄的培养液(浓度为8mmol/L)，作用6小时后，离心细胞培养上清，用自动生化分析仪测定ALT及AST水平。在正常条件下，ALT和AST存在于肝细胞的胞浆与线粒体内，肝细胞受到损伤时可释放到细胞外。其数值的高低可以判断肝细胞损伤的程度。试验结果显示，随着淫羊藿浓度升高，细胞培养上清液中ALT和AST逐渐降低，在淫羊藿素8μmol/L时数值最低，减少至CCl₄损伤组的约1/3，效果优于阳性对照药物淫羊藿苷及还原型谷胱甘肽，充分说明淫羊藿素可以保肝降酶。详细情况见图2。

实施例4

淫羊藿素减轻大鼠原代肝细胞缺氧损伤模型试验

1、大鼠原代肝细胞的获取与培养见实施例2。

2、本试验将6孔板培养的大鼠原代肝细胞分为空白对照组、损伤组、淫羊藿素4μmol/L处理组、淫羊藿素8μmol/L处理组。淫羊藿素处理组的大鼠原代肝细胞经淫羊藿素处理24小时后与损伤组肝细胞共同放入缺氧培养箱(SANYO)，调整培养箱条件为O₂ 1％，CO₂4％，N₂ 95％，共培养4小时，改换正常条件培养2小时后用荧光法(试剂盒购自GENMED公司)检测肝细胞内活性氧簇的数量，结果见图3。由图像可以看出，淫羊藿素可减少缺氧复氧后肝细胞内活性氧簇的产生，淫羊藿素8μmol/L组的效果较为明显。该试验证实淫羊藿素是细胞活性氧的清除剂，有明确的抗氧化活性，能起到保护细胞免受缺氧复氧所致的活性氧损伤。

实施例5

淫羊藿素降低H₂O₂所致大鼠原代肝细胞凋亡的试验

1、大鼠原代肝细胞的获取与培养见实施例2。

2、大鼠原代肝细胞培养于6孔板，培养两天充分贴壁后分为空白对照组(A)、H₂O₂损伤组(B)、淫羊藿素8μmol/L处理组(C)、淫羊藿素8μmol/L+ICI 182780(0.1μmol/L)处理组(D)。ICI 182780是非选择性雌激素受体(ER)拮抗剂。各相应药物处理组作用24小时后置换含H₂0₂浓度800μmol/L的培养液。作用24小时后收集细胞，用AnnexinV/FITC荧光标记流式细胞术测定细胞凋亡率。试验结果图像见图4，(A)凋亡率为0％，(B)凋亡率为47％，(C)凋亡率为5％，(D)凋亡率为20％。可见，应用淫羊藿素处理后，肝细胞凋亡细胞率由47％下降至5％，证明淫羊藿素有降低肝细胞损伤后凋亡的作用。如果用ICI 182780阻断肝细胞激素受体，淫羊藿素减轻凋亡的作用则减弱至20％。因此，淫羊藿素减轻肝细胞凋亡的机理与拟雌激素作用有关。

实施例6

淫羊藿素影响损伤肝细胞抗炎的试验

1、大鼠原代肝窦内皮细胞的获取和培养

Wistar雄性大鼠购自第二军医大学动物实验中心，按Braet方法并加以改进分离肝窦内皮细胞。以胶原酶A(购自BoehringerMannheim公司)原位灌注和Percoll分离液(25％和50％)梯度离心法获取肝窦内皮细胞。相差显微镜下观察肝窦内皮细胞形态，确定其纯度大于90％，台盼蓝染色可见肝窦内皮细胞活力大于95％。在胶原包被的培养皿中培养3天，肝窦内皮细胞铺满培养板后用于实验。

2、培养的肝细胞经10ng/ml TNF-α作用16小时后用不同浓度淫羊藿素处理(淫羊藿素0μmol/L组、淫羊藿素2μmol/L组、淫羊藿素4μmol/L组、淫羊藿素8μmol/L组、淫羊藿素16μmol/L组)，采用ELISA测定培养上清液中的炎性细胞因子ICAM-1和E-selectinde的含量。ICAM-1和E-selectin是肝脏损伤重要的炎症介质，可以介导巨嗜细胞、中性粒细胞向肝窦内皮细胞及受损肝细胞移动，进而通过分泌各种炎症因子、释放活性氧簇损伤靶细胞，造成肝脏功能损害。检测结果显示，TNF-α可诱导大鼠原代肝窦内皮细胞表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和E-选择素(E-selection)，而淫羊藿素能降低其表达，表明淫羊藿素具有增强损伤肝细胞抗炎的活性。

实施例7

淫羊藿素减轻小鼠缺血再灌注肝损伤的试验

昆明种小鼠随机分为5组(每组8只)：假手术组、缺血再灌注损伤组、淫羊藿素5mg/kg治疗组、淫羊藿素10mg/kg治疗组和淫羊藿15mg/kg治疗组。小鼠经戊巴比妥钠(60mg/kg，腹腔注射)麻醉后，沿腹部中线切开，小心游离肝脏左叶，剪除韧带或系膜，用小血管夹钳夹肝左叶底部，造成左叶肝脏缺血，钳夹90分钟后松开血管夹，使血液复流进行再灌注，松开血管夹后观察1分钟，观察肝脏颜色是否发生变化，若复流不畅则终止实验。假手术组按同样步骤操作，只是不阻断肝叶。治疗组从术前三天开始按设计剂量经尾静脉注射。手术后每只鼠腹腔内补充生理盐水0.8ml，用4-0丝线分两层缝合腹部切口。缺血90分钟再灌注6小时作为抽取血样肝脏损伤指标的时间点。正常条件下丙氨酸转氨酶存在于肝细胞的胞浆，在肝细胞受到损伤时可释放到细胞外，是肝脏损伤的特异性酶学指标。根据其数值的高低可以判断肝细胞损伤的程度。实验结果显示，随淫羊藿素剂量增加，肝细胞释放ALT减少，ALT越低说明损伤越轻。试验结果见图5，最大保护浓度为10mg/kg体重治疗组，血清中ALT活力为1820U/L，相对于缺血再灌注损伤组有明显降低。

实施例8

淫羊藿素减轻小鼠CCl₄急性肝损伤的试验

昆明种小鼠4O只，体重20±2g，雌雄兼用，随机分为对照组、损伤组、淫羊藿素5mg/kg治疗组、淫羊藿素10mg/kg治疗组和淫羊藿15mg/kg治疗组。治疗组经尾静脉注射给予不同剂量的淫羊藿素，对照组和损伤组均注射等体积生理盐水，各组每天给药一次，连续7天。各组小鼠处死前禁食，自由饮水。除对照组和损伤组外，其余各组分别于第7天给药后2小时，腹腔注射0.1％CCl₄食用油溶液10ml/kg一次。16小时后断头取血，以16000r/min离心5分钟，分离血清，全自动生化分析仪测定ALT和AST活性。取出肝脏组织用生理盐水制成10％肝匀浆，分别测定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。实验结果显示，淫羊藿素可减少CCl₄所致急性肝损伤的肝酶释放，有较明确的保肝作用。由图6看出，淫羊藿素10mg/kg治疗组呈现最大的保肝效应，ALT及AST由损伤组的210U/L、250U/L下降为141U/L、170U/L，其机理与淫羊藿素减轻氧自由基的释放有关。SOD活性和MDA含量是组织自由基损伤的重要指标，其中MDA标志组织脂质过氧化的程度，而SOD是清除活性氧自由基重要生物酶。MDA越多说明组织损害越重，而SOD越高说明保护作用越强。由表1可以看出，SOD活性和MDA含量与淫羊藿素呈剂量依赖性，淫羊藿素可以减少MDA含量，升高SOD活性。

表1淫羊藿素对CCl₄急性肝损伤小鼠血清MDA、SOD的影响

注：*与对照组比较(P＜0.05)；**与模型组比较(P＜0.05)

实施例9

淫羊藿素减轻大鼠CCl₄慢性肝损伤的试验

大鼠慢性肝损伤模型采用皮下注射10％CCl₄橄榄油的方法。雄性SD大鼠50只，体重150-170g，随机分为对照组、损伤组、淫羊藿素5mg/kg治疗组、淫羊藿素10mg/kg治疗组和淫羊藿15mg/kg治疗组。治疗组经尾静脉注射和腹腔注射方法交替给与不同剂量的淫羊藿素共10次，对照组和损伤组按治疗组给药时间和次数注射等体积生理盐水。每周2次注射10％CCl₄橄榄油，持续3个月后处死大鼠，下腔静脉取血，分离血清，全自动生化分析仪测定ALT和AST及白蛋白/球蛋白比值(A/G)。取肝脏组织用生理盐水制成10％肝匀浆，测定羟脯氨酸含量。取相同肝左叶相同部位肝组织，常规固定、脱水、包埋并行HE染色。肝组织纤维化程度评分标准为：正常肝组织为0级；增生的纤维组织细窄而短为1级；较粗而长、延伸入肝小叶内形成不全分隔为2级；正常肝小叶结构消失，形成假小叶为3级；纤维组织过度沉积、有瘢痕形成为4级。以上各级分别计0、1、2、3、4分，累加所有分数，并计算出每组每只动物肝纤维化的平均分，分值越高提示肝纤维化程度越严重。

由表2看出，淫羊藿素能明显降低CCl₄致慢性肝损伤大鼠的血清ALT、AST值及升高血清A/G(白/球)比值，表明淫羊藿素对受损及处于受损的肝细胞有保护和修复作用；羟脯氨酸为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行。表3说明淫羊藿素能降低肝组织羟脯氨酸含量，表明淫羊藿素有抗肝纤维化的作用；病理检验结果表明，淫羊藿素可改善大鼠肝纤维化评分，能在不同程度上减轻CCl₄造成的慢性肝组织纤维化。以上证实淫羊藿素对CCl₄所致的慢性肝损伤具有明显的保肝降酶作用和抗肝纤维化的作用。

表2淫羊藿素对CCl₄慢性肝损伤大鼠血清ALT、AST、A/G比值的影响

注：*与对照组比较(P＜0.05)；△与损伤组比较(P＜0.05)，△△与损伤组比较(P＜0.01)。

表3淫羊藿素治疗后各组大鼠肝组织羟脯氨酸及肝纤维化评分比较

注：*与对照组比较(P＜0.05)；△与损伤组比较(P＜0.05)，△△与损伤组比较(P＜0.01)，△△△与损伤组比较(P＜0.001)。

实施例10淫羊藿素在小鼠体内的药代动力学试验

口饲给药的淫羊藿素在4个小鼠体内的药代动力学参数见表4，这些实验数据说明淫羊藿素能在体内保持一定的药物浓度，有利于防治肝脏损伤的效果。

表4淫羊藿素在小鼠体内的药代动力学参数

药代动力学参数	均数+/-标准差
		T1/2(min)	360+/-45
Tmax(min)	60+/-8
		Cmax(μM)	50+/-6

实施例11给药后淫羊藿素对小鼠的急性毒性试验

取两组8周龄的BALB/c小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量1000mg/kg和多次剂量200mg/kg(Q2D×15)给予淫羊藿素(用玉米油或载体配制)，然后分别观察1周和4周。每两天称体重。试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。结果显示，以单次剂量1000mg/kg和多次剂量200mg/kg(Q2D×15)给予淫羊藿素，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。

Claims (5)

1.一种防治肝脏损伤的药物，其特征在于该药物是以淫羊藿素作为有效成分。

2.如权利要求1所述的防治肝脏损伤的药物，其特征在于该药物中含有防治肝脏损伤的有效量的淫羊藿素及可药用载体和/或赋形剂。

3.如权利要求1或2所述防治肝脏损伤的药物，其特征在于所述肝脏损伤是急、慢性肝损伤，缺氧肝损伤和缺血再灌注肝损伤。

4.淫羊藿素在制备防治急、慢性肝损药和缺氧损伤药物中的应用。

5.淫羊藿素在制备防治缺血再灌注肝损伤药物中的应用。

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