WO2011043629A2 - 인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법 및 배지 - Google Patents

인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법 및 배지 Download PDF

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WO2011043629A2
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김효수
강현재
이은주
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서울대학교병원
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1305—Adipocytes

Definitions

  • the present invention relates to a method and a medium for inducing high activity of human adipose stem cells, and more particularly, a method for inducing high activity of human adipose stem cells, high activity stem cells induced by the method, the high activity stem It relates to a cell therapeutic agent comprising a cell and a medium for inducing high activity of human adipose stem cells.
  • Stem cells are cells capable of differentiating organisms that make up biological tissues into various cells. Stem cells are used to differentiate undifferentiated cells from different stages of embryonic, fetal, and adult tissues. Collectively. Stem cells are differentiated into specific cells due to differentiation stimulation (environment), and unlike differentiated cells in which cell division is stopped, they can proliferate because they can produce the same cells as themselves by cell division. i ferat ion (expansion) is characterized in that it can be differentiated into other cells by different environment or differentiation stimulus, so that it has plasticity in differentiation.
  • Stem cells are largely embryonic stem cells (ES cells) that are obtained from embryos and have the potential to differentiate into all cells, and multipotents obtained from each tissue ( It is divided into adult stem cells of mult ipotency.
  • the inner cell mass of the mastocyte which is the early stage of embryonic development, is the part that will form the fetus in the future.
  • Embryonic stem cells formed from the intracellular mass can theoretically be differentiated into cells of all the tissues of an individual. It is a stem cell with potential. That is, embryonic stem cells are undifferentiated cells capable of unlimited proliferation, can differentiate into all cells, Alternatively germ cells can also be made and passed down to the next generation.
  • Human embryonic stem cells are prepared by separating and culturing only the inner cell mass when forming human blastocysts.
  • human embryonic stem cells made worldwide are obtained from the remaining embryos after infertility. This cell is characterized by its ability to differentiate into all cells, so that it can differentiate into any tissue cell, and can be cultured in immortal and undifferentiated state. And possibly inherited to the next generation (Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).
  • mesenchymal stem cells which have been reported to have an immunomodulatory function, have been proposed as an alternative to overcome these problems.
  • Mesoderm stem cells are pluripotent cells capable of differentiating into adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, neurons, and cardiomyocytes, and have been reported to have a function of regulating immune responses. It can be isolated and cultured in various tissues, but the ability of each origin is slightly different, and cell surface markers are different.
  • mesenchymal stem cells can be differentiated into osteoblasts, chondrocytes, and muscle cells. The expression level of the surface markers CD73 (+), CD105 (+), CD34 (-), and CD45 (-) is defined.
  • the minimum number of cells required is 1 ⁇ 1 ( ⁇ 9). However, if you include conditions to set conditions and baseline experiments, the amount is even higher. To supply this amount to existing mesodermal stem cells of various origins, At least 10 passages in vitro are required, and the cells are aging and deformed and no longer fit the concept of treatment, which is one of the problems to be solved with the current mesodermal stem cell culture system. Even if the conditions and criteria are established with these cells, the cells may already run out when used for treatment, and the use of other mesodermal stem cells may occur. The experiment must be reestablished. In order to use existing mesodermal stem cells as cell therapy, new methods to solve these problems are required.
  • Korean Patent Publication No. 2005-0032020 discloses adipose tissue-derived stem cells and grids
  • Korean Patent Registration No. 0821128 discloses a method and system for generating stem cells from adipose tissue.
  • many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated.
  • the disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
  • the present invention has been devised by the above-mentioned demands, and overcomes the limitation of in vitro culture of human stem cells that have been made previously, and maintains the reactivation of aging cells and the same result in stem cells having various genetic backgrounds. It is intended to suggest that the method of the present invention is a suitable invention capable of producing cells for cell therapy and regenerative medicine. Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
  • the present invention provides a method for inducing high activity of human mesoderm stem cells comprising culturing the human mesoderm stem cells in a medium containing a compound represented by the following formula (1):
  • R1, R2 and R3 are each independently H, d-Cs alkyl group, or dC 4 acyl group.
  • the present inventors earnestly researched to develop a method for stably obtaining and maintaining high activity of mesoderm stem cells, which are the most important resources of cell therapeutics.
  • the present invention was completed by discovering that the activity of stem cells is greatly improved.
  • the present inventors found that the improvement of the function of the adipocyte stem cells observed in co-culture with the adipocytes was due to the fat metabolites, and the main substance thereof was glycerol.
  • stem cell refers to a cell capable of differentiating into various cells constituting biological tissue, and refers to undifferentiated cells that can be reproduced without limitation to form specialized cells of tissues and organs. .
  • Stem cells are developable pluripotent or pluripotent cells. Stem cells can divide into two daughter cells, or one daughter cell and one derived (transit) cell, and then proliferate into mature, fully formed cells of the tissue.
  • the term "mesoderm stem cell” refers to a stem cell having a multipotency capable of differentiation into adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, neurons, and cardiomyocytes. Mesoderm stem cells are identified by their swirling morphology and expression of the basic cell surface markers CD73 (+), CD105C +), CD34 (-), and CD45 ⁇ ).
  • the term "high activity" refers to a state of excellent stem cell intrinsic differentiation and viability during in vitro culture of stem cells. Stem cells induced with high activity showed a significant improvement in angiogenesis in the angiogenesis experiment, compared with the control group, and showed that the differentiation into adipocytes was suppressed and the growth ability was improved.
  • Ri, R 2 and 3 ⁇ 4 of formula 1 of the present invention is H.
  • Formula 1 wherein both R lt R 2 and 3 ⁇ 4 are H is glycerol.
  • Glycerol is a substance produced during the lipolysis process of adipocytes, and the present inventors confirmed that the addition of glycerol can greatly improve the activity of the adipocytes.
  • the compound represented by the formula (1) of the present invention is included in the medium at a concentration of 1-100 ⁇ .
  • the medium of the present invention further comprises serum.
  • the serum contained in the medium in the present invention is added for the purpose of recognizing in the art, and plays an important role as a source of growth factors in the proliferation of mesodermal stem cells.
  • Serum that can be used is preferably fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum (BCS), horse serum or human serum, most preferably FBS.
  • FBS fetal bovine serum
  • BCS bovine calf serum
  • horse serum or human serum most preferably FBS.
  • the term "medium” as used herein refers to a medium for animal cells commonly used in the art.
  • the medium that can be used in the present invention may be any medium conventionally used for culturing animal cells, for example, Eagles' s MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)).
  • A-MEM Stock, CP. Et al., Nat. New Biol. 230: 52 (1971)
  • Iscove's MEM Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)
  • 199 medium Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73: 1 (1950)
  • CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med.
  • McCoy's 5A McCoy, TA, et al., Proc. Soc.Exp. Biol. Med. 100: 115 (1959)
  • MCDB series Ham, RG et al., In Vitro 14:11 (1978)
  • a-MEM Eagles' MEM, Iscove's MEM, 199 medium, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752 / 1
  • McCoy's 5A most preferably ⁇ - ⁇ medium.
  • the serum content of the serum of the invention is 4-30 weight>.
  • the serum content of the serum of the invention is 5-15% by weight, most preferably about 10% by weight.
  • the method of inducing high activity through the above method yielded the same result in stem cells of different genetic origins, which was confirmed by cell number, cell growth assay (BrdU assay) and cell morphology change. Stem cell resources can be secured in high yield through in vitro culture.
  • the mesoderm stem cells of the present invention are adipose stem cells.
  • the term "fat stem cell” refers to mesoderm stem cells derived from adipose tissue.
  • the mesenchymal stem cells derived from adipose are more easily differentiated into adipose than other mesenchymal stem cells, and are characterized by a lower rate of ossification (Gerard Ailhaud, Biochemi and Biophys Res Co / nun.315 (2): 255 -263 (2004); Sakaguchi Y., Arthritis Rheum. 52 (8) 2521-9 (2005)).
  • Adipose stem cells of the present invention are isolated from adipose tissue.
  • Adipose tissue can be obtained from any animal by any method. The first step of the method is the separation of adipose tissue from the source animal. As long as the fatty stromal cells in the animal are viable, the animal can be alive or dead.
  • human adipose tissue is obtained from a live donor using well recognized protocols such as surgery or liposuction. Preferred methods for obtaining human adipose tissue are resections well known in the art or Liposuction.
  • Adipose tissue-derived stem cells of the present invention are present in initially ablated or extracted adipose tissue, regardless of how adipose tissue is obtained.
  • the present invention provides a method for inducing high activity of human mesoderm stem cells comprising co-culturing human mesoderm stem cells with human adipocytes.
  • the term "co-culture” means culturing two or more different kinds of target cells in the same culture space having the same culture environment. According to the present invention, the present inventors confirmed that the function of fat stem cells is improved by fat metabolites when co-culturing fat stem cells and fat cells. Therefore, the present invention can be used as an efficient cultivation method excellent in the retention (survivability) and differentiation capacity of fat stem cells.
  • human adipocytes refers to cells derived from human adipose tissue, which refers to diffuse organs important for primary metabolism consisting of white fat, yellow fat or brown fat.
  • the adipose tissue has fat cells and stroms. Adipose tissue is found throughout the body of an animal, for example in mammals, adipose tissue is present around the retina, bone marrow, subcutaneous space and most organs.
  • Human adipocytes used in the methods of the present invention can be autologous or other adipocytes.
  • the coculture of the present invention is carried out in a medium containing serum.
  • the present invention uses the serum and medium used in the above-described high activity induction method, the description thereof is omitted to avoid excessive duplication.
  • the coculture of the invention is carried out for 1-72 hours. More preferably it is carried out for 6-48 hours, most preferably for 24-48 hours.
  • the present invention provides a highly active fat stem cell obtained by the above-described method.
  • Highly active fat-enriched cells of the present invention are cultured in a medium containing glycerol as described above or Since it can be obtained through co-culture with adipocytes, the description is omitted to avoid excessive duplication.
  • the present invention provides a composition for forming adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, neurons, or cardiomyocytes comprising the highly active fat stem cells of the present invention.
  • the induced adipose stem cells activated by the method of the present invention can be applied as a cell therapeutic agent for the purpose of regeneration of cells formed by differentiation of mesodermal stem cells.
  • the composition of the present invention can be used as a therapeutic agent for arresting the composition for forming adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, nerve cells, or cardiomyocytes.
  • the present invention also provides a cell therapeutic agent comprising stem cells induced and activated by the method of the present invention.
  • the cell therapeutic agent may be used for adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, nerve cells, cardiomyocyte formation, and the like.
  • the term "cell therapeutic agent” refers to a medicament (US FDA regulation) used for the purpose of treating, diagnosing or preventing a disease in cells or tissues prepared through isolation, culture and special manipulation from humans.
  • Cell therapy agents are largely classified into somatic cell therapy and enjoy cell therapy according to the degree of differentiation of cells, and the present invention relates in particular to stem cell therapy.
  • the composition of the present invention is prepared as a pharmaceutical composition
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, and include lactose, textose, sucrose, sorbbi, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl Cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbibuprofate, a sorbibuproliferative, and the like.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably following the parenteral mode of administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity. It may be prescribed. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention to an adult per day based on 10 2 - 10 is 10 cells.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or may be in the form of axes, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the present invention provides a medium for inducing high activity of human mesoderm stem cells comprising a compound represented by the following formula (1):
  • Rl, R2 and R3 are each independently H, C1-C3 alkyl group (alkyl group), or (: a ⁇ C 4 acyl group (acyl group).
  • R 2 and 3 ⁇ 4 in formula 1 of the present invention is H.
  • the compound represented by the formula (1) of the present invention is included in the medium, at a concentration of 1-100 ⁇ .
  • the medium of the present invention further comprises serum.
  • the present invention uses the serum and the medium used in the above-described high activity induction method and co-culture method, the description thereof is omitted to avoid excessive duplication.
  • the medium of the present invention may include any component known in the art as a conventional stem cell culture composition for efficiently culturing stem cells in addition to serum.
  • the present invention provides a method for inducing high activity of human mesoderm stem cells, a medium for inducing high activity of the highly active fat stem cells and human mesoderm stem cells obtained thereby.
  • the present invention can use existing established mesodermal stem cells as a source of mesoderm stem cells, which is the best resource for cell therapy, and can be applied to both human mesoderm stem cells of various origins and various culture conditions currently used. It can be usefully used in a wide range of standardized high activity induction methods.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of observation of the adipocytes isolated from human adipose tissue through phase contrast microscopy and DAPI staining.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of identification of each fat stem cell.
  • Figure 2a is a diagram showing the results analyzed by the cell marker.
  • Cells were isolated from human adipose tissue and adhered to cultured mesenchymal stem cells, and stained with mesodermal stem cell markers for cell identification when the same morphology was observed (Fig. 2a).
  • mesodermal stem cell markers for cell identification when the same morphology was observed (Fig. 2a).
  • FIG. 2B adipose tissue-derived mesoderm stem cells
  • FIG 3 is a diagram showing the results of observing the change of fat stem cells after co-culture of fat stem cells and fat cells.
  • Adipocytes and adipose stem cells were isolated from human adipose tissue, and after 48 hours of coculture, the cells were incubated for 48 hours and then stained with PKpropidium iodide) to analyze the cell cycle with a flow cytometer. It was observed that cell synthesis (S phase) increased more than two times by co-culture.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of the effect exclusion test for fatty droplet exposure. It was confirmed that the high activity inducing effect of adipose stem cells according to coculture of adipocytes and adipose stem cells was caused by fat.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the hypothesis established to explain the mechanism of the effect of increasing the activity of fat stem cells according to the co-culture of fat cells and fat stem cells.
  • the inventors have found that glycerol and free fatty acids, which are the products of lipolysis in adipocytes, After confirming the presence, double glycerol as a candidate of the active ingredient for increasing fat stem cell activity.
  • Figure 6 is a diagram showing the increase in the number of cells by culturing adipose enjoyed cells in a medium containing glycerol. Experimental results showed that the concentration of the added glycerol increased in the number of cells (Fig. 6a). In addition, the increase in the number of cells according to the concentration of glycerol was confirmed by observing the increase in BrdU binding according to division (FIG. 6B). In addition, the increase in the number of cells and the morphological changes according to the glycerol concentration was observed under a microscope (Fig. 6c). From the above observations, it was found that ⁇ was the most effective glycerol concentration. The bFGF group and the adipocyte culture medium (sup) are controls.
  • FIG. 7 is a result of a mechanism analysis experiment for identifying the hypothesis of FIG. Glycerol increased the AKT activity, and this increase was again reduced through the inhibition of aquaporin (AQl AQ9).
  • 8 is a diagram showing the results of confirming the increased blood vessel formation capacity of the fat stem cells obtained high activity by the mixed culture-vascular formation method with HUVEC after applying to the method of the present invention with a phase contrast fluorescence microscope to be.
  • the left panel shows the fat enjoyment cells not exposed to glycerol, and the right panel shows the results using fat stem cells exposed to glycerol.
  • Glycerol exposure increased the structure and frequency of blood vessels.
  • HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cell
  • Fig. 5 hypotheses are established (Fig. 5), which induces the inhibition of the expression of key factors by cell control before and after activation and siRNA (gene-specific expression inhibition tool at RNA level) before and after activation. It was. Then, the protein was extracted from the cells of each group by a conventional method to confirm the degree of activation of AKT labeling the activity of the cells.
  • Serine / threonine protein kinase (AKT) is a well-known factor of cell activity in cell biology, and its activity is measured by the ratio of phosphorylated AKT (pAKT) to total AKT (tAKT). Total AKT was corrected with beta actin ( ⁇ -actin), which is usually expressed and maintained in cells.
  • pAKT phosphorylated AKT
  • tAKT total AKT
  • Human adipose cells were isolated and co-cultured for up to 48 hours in ⁇ - ⁇ medium containing 10% FBS and aged human adipose stem cells by in vitro culture system. After 48 hours, cell death of adipocytes rapidly progressed, resulting in an increase in fat vesicles. Since the growth ability of the fat stem cells was confirmed by the cell shape, the number of cells, the cell cycle (Fig. 3).
  • the cell morphology of the group not co-cultured (left) and the group co-cultured (right) by the method of the present invention is aging to lose the fibroblast-like morphology and cell size Unlike the larger control group, the experimental group is fibroblast-like and fills the petri dish, creating fingerprint patterns seen in healthy stem cells. This means that with the change of cell shape, the growth capacity of fat stem cells is increased.
  • the adipocyte stem cells co-cultured with the adipocytes by the method of the present invention can be confirmed that the S group which is a synthetic group showing active proliferative force increased from 5.44% to 12.99%.
  • the number of cells may be an indicator of growth, but in order to know the trend before cell division, the growth and division capacity of the cells was evaluated by the degree of DNA synthesis through BrdU assay. It can be seen that the synthesis of DNA is actively occurring in "and" G10 "(FIG. 6B). This shows that the cell growth ability is improved through the high activity obtained by the method of the present invention. On the other hand, if the glycerol concentration was high (500 ⁇ ), rather cytotoxicity was observed.

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Abstract

본 발명은 인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 유도된 고활성 줄기세포, 상기 고활성 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 및 인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하기 위한 배지에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 이미 성숙된 인간 지방세포의 배양 조건이 용이하지 않거나, 지방세포를 확보하기 어렵거나 또는 지방세포가 병들어 있을 때 본 발명의 방법을 이용하여 고활성을 유지한 상태의 인간 지방 줄기세포의 장기 배양이 가능하며, 분화능을 유지한 상태의 줄기세포를 체외 배양을 통해 높은 수율로 확보할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법 및 배지 【기술 분야】
본 발명은 인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법 및 배지에 관한 것으로， 더욱 구체적으로 인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법， 상기 방법에 의해 유도된 고활성 줄기세포， 상기 고활성 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 및 인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하기 위한 배지에 관한 것이다.
【배경 기술】
줄기세포 (stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서， 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화 (different iat ion)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극 (환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며， 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (prol i ferat ion; expansion)하는 특성이 있으며， 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 크게 배아 (embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력 (totipotent)을 지닌 전분화능 (plur ipotency)의 배아줄기세포 (embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능 (mult ipotency)의 성체줄기세포 (adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기 (Mastocyte)의 세포내괴 (inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉， 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고， 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배 (germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.
인간 배아줄기세포는 인간 배아 (blastocyst) 형성시 세포내괴 (inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데， 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 넁동 배아로부터 얻어졌다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화 가능한 잠재력 (totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며， 또한 사멸하지 않고 (immortal) 미분화상태에서 배양가능하며 배 세포 (germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다 (Thomson et al. , Science, 282： 1145-1147, 1998； Reubinoff et al., Nat. Biotechnol . , 18： 399-404, 2000).
여러 세포로의 분화능을 가진 인간배아 줄기세포를 세포 치료제로 이용하기 위한 다양한 시도는 아직 암화 형성과 면역 거부 반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하는 상황이다.
최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역 조절 기능을 가지고 있는 것으로 보고되고 있는 중배엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중배엽 줄기세포는 지방세포， 골세포， 연골세포， 근육세포 , 신경세포 , 심근세포로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 다양한 조직에서 분리， 배양이 가능하나 각 기원에 따른 능력은 조금씩 다르며 세포표면 표식자도 달라 현재 중배엽 줄기세포의 정의는 골세포， 연골세포， 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도로 규정하고 있다.
세포 치료나 재생의학에서 최소 필요한 세포의 수는 1Χ1(Γ9 정도이다. 그러나 조건을 잡고 기준올 정하는 실험까지 포함한다면 그 양은 더욱 늘어난다. 기존의 다양한 기원의 중배엽 줄기세포로 이 정도의 양을 공급하려면 최소 in vitro에서 10번 이상의 계대가 필요하게 된다. 세포는 노화되고 변형되어 더 이상. 치료의 개념에 적합하지 않게 된다. 이는 지금의 중배엽 줄기세포의 배양시스템이 가지고 있는 풀어야 할 문제점의 하나이다. 또한 이러한 세포로 조건과 기준을 잡았다 하더라도 치료에 사용할 시에는 이미 그 세포는 바닥이 나고 다른 사람의 중배엽 줄기세포를 써야 하는 경우가 발생하고 그럴 경우 또 다른 세포이용에 따른 부가적인 실험을 다시 거처야 한다. 기존의 중배엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 이러한 문제점을 해결할 수 있는 새로운 방법 제시가 필요하다.
한국공개특허 제 2005-0032020호에는 지방조직 유래 줄기세포 및 격자가 개시되어 있으며， 한국특허등록 계 0821128호에는 지방 조직으로부터 줄기세포를 생성하는 방법 및 시스템이 개시되어 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서， 기존의 만들어진 인간 줄기세포의 체외 배양의 한정성을 극복하고, 노화된 세포의 재활성 유지 및 여러 다양한 유전적 배경을 가진 줄기세포에서도 동일한 결과를 만들어 내어 본 발명의 방법이 세포치료 및 재생의학에 필요한 세포를 만들어 낼 수 있는 적합한 발명임을 제시하고자 한다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포를 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도 방법을 제공한다: 화학식
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상기 화학식에서， Rl, R2 및 R3는 각각 독립적으로 H, d-Cs 알킬기 (alkyl group), 또는 d-C4 아실기 (acyl group)이다.
본 발명자들은 세포 치료제의 가장 중요한 자원인 중배엽 줄기세포를 안정적으로 수득하고 고활성을 유지하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 중배엽 줄기세포를 상기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 배지에서 배양할 경우 줄기세포의 활성이 크게 향상됨을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에 따르면， 본 발명자들은 지방세포와의 공배양시 관찰되는 지방 줄기세포의 기능 향상이 지방 대사산물에 의한 것임을 밝혔고， 이의 주된 물질이 글리세를임을 밝혔다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포 (stem cell)" 는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서， 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸즐기세포， 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래 (전이 (transit)) 세포로 분열될 수 있으며， 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다. 본 명세서에서 용어 "중배엽 줄기세포" 는 지방세포， 골세포, 연골세포， 근육세포， 신경세포， 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능 (multipotency)을 가진 줄기세포를 의미한다. 중배엽 줄기세포는 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105C+) , CD34(-), CD45 -)의 발현 정도를 통하여 식별된다.
본 명세서에서 용어 "고활성" 이란 줄기세포의 체외 배양시 줄기세포 고유의 분화능의 유지정도 및 생존능이 우수한 상태를 의미한다. 고활성이 유도된 줄기세포는 혈관 형성 실험에서 대조군 그룹보다 혈관 형성에 유의적 향상 결과를 보여주었으며， 지방세포로의 분화는 억제되고 생장능력은 향상됨을 보여 준다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1의 Ri, R2 및 ¾는 H이다. Rlt R2 및 ¾가 모두 H인 화학식 1은 글리세를 (Glycerol)이다. 글리세를은 지방세포의 지방분해 과정에서 생성되는 물질로서， 본 발명자들은 글리세를을 첨가함으로써 지방 줄기세포의 활성을 크게 개선시킬 수 있다는사실을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 1-100 μΜ의 농도로 배지 내에 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 배지는 혈청을 추가적으로 포함한다. 본 발명에서 배지에 포함되는 혈청은 당업계에서 인식하는 목적으로 첨가되며， 중배엽 줄기세포의 증식에 있어서 성장인자 (growth factors)의 공급원으로서 중요한 역할을 한다. 이용될 수 있는 혈청은， 바람직하게는 FBS( fetal bovine serum), BCS(bovine calf serum), 말 혈청 (horse serum) 또는 인간 혈청 (human serum)이며, 가장 바람직하게는 FBS이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "배지" 는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며， 예를 들어, Eagles ' s MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959))， a -MEM (Stanner, CP. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950))， CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al . , J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967))， F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965))， F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963))， DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al . , Virology 8:396(1959))， DMEM과 F12의 흔합물 (Barnes, D. et al. , Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A. , et al. , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100：115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al . , In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는 a-MEM, Eagles' s MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way- mouth's MB752/1 및 McCoy's 5A로 구성된 군으로부터 선택되며， 가장 바람직하게는 α-ΜΕΜ 배지이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 4—30 중량 >이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 5-15중량 %이며， 가장 바람직하게는 약 10중량 >이다. 상기 방법을 통한 고활성 유도 방법은 각기 다른 유전적 기원의 줄기세포에서도 동일한 결과를 도출하였으며， 이것은 세포 수, 세포 생장능력 분석법 (BrdU assay)과 세포 형태 변화로 확인하였다. 줄기세포 자원은 체외 배양을 통해 높은 수율로 확보가 가능하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 중배엽 줄기세포는 지방줄기세포이다. 본 명세서에서 용어 "지방줄기세포" 는 지방조직에서 유래된 중배엽 줄기세포를 의미한다. 지방에서 유래된 중배엽 줄기세포의 경우 다른 간엽줄기세포 보다 지방으로 쉽게 분화될 수 있으며， 골화될 수 있는 비율이 낮은 것이 특징이다 (Gerard Ailhaud, Biochemi and Biophys Res Co /nun. 315(2) :255-263(2004)； Sakaguchi Y.， Arthritis Rheum. 52(8)2521-9(2005)).
본 발명의 지방줄기세포는 지방 조직에서 분리된다. 지방 조직은 동물로부터 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 방법의 첫 번째 단계는 공급원 동물로부터 지방 조직의 분리이다. 동물 내의 지방 스트로마성 세포가 생존 가능한 한， 동물은 살아있거나 죽어있을 수 있다. 통상적으로는， 양호하게 인식된 프로토콜， 예컨대， 수술 또는 지방 흡인술을 사용하여, 인간 지방조직을 살아있는 제공자로부터 수득한다. 인간 지방조직을 수득하는 바람직한 방법은 당업계에 주지된 절제술 또는 지방 흡입술이다. 본 발명의 지방 조직 유래 줄기 세포는， 지방 조직이 수득되는 방법에 상관없이， 초기에 절제된 또는 추출된 지방 조직 내에 존재한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포와 인간 지방세포를 공배양하는 단계를 포함하는 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "공배양 (co-culture)" 은 동일한 배양환경을 가지는 동일한 배양 공간에서 둘 이상의 상이한 종류의 대상세포를 배양하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면， 본 발명자들은 지방 줄기세포와 지방세포를 공배양시 지방 대사산물에 의해 지방 줄기세포의 기능이 향상됨을 확인하였다. 따라서 본 발명은 지방줄기세포의 저장성 (생존성)과 분화능의 유지정도가 우수한 효율적인 배양방법으로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "인간 지방세포" 는 인간 지방 조직에서 유래된 세포를 말하며, 상기 지방 조직은 백색 지방， 황색 지방 또는 갈색 지방으로 이루어진 1차 신진 대사에 중요한 확산 기관을 의미한다. 상기 지방 조직은 지방 세포 및 스트로마를 갖는다. 지방 조직은 동물의 몸 전체에서 발견되며， 예를 들어 포유동물에서 지방 조직은 그물막， 골수， 피하 공간 및 대부분의 기관 주위에 존재한다. 본 발명의 방법에 이용되는 인간 지방 세포는 자가 또는 타가의 지방세포 모두 가능하다 .
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 공배양은 혈청을 포함하는 배지에서 실시된다.
본 발명은 상술한 고활성 유도방법에서 이용하는 혈청 및 배지를 이용하므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 이의 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 공배양은 1-72 시간 동안 수행한다. 보다 바람직하게는 6-48시간동안 수행하며， 가장 바람직하게는 24-48시간 동안 수행한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 방법에 의해 수득한 고활성 지방 줄기세포를 제공한다. 본 발명의 고활성 지방 즐기세포는 앞서 기술한 바대로 글리세를이 포함된 배지에서의 배양 또는 지방세포와의 공배양을 통하여 수득할 수 있으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 고활성 지방 줄기세포를 포함하는 지방세포， 골세포， 연골세포， 근육세포， 신경세포， 또는 심근세포 형성용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면， 본 발명의 방법에 의해 유도 활성화된 지방줄기세포는 중배엽 줄기세포가 분화됨으로써 형성되는 세포의 재생을 목적으로 하는 세포치료제로써 응용될 수 있다. 보다 구체적으로， 본 발명의 조성물은 지방세포， 골세포， 연골세포， 근육세포， 신경세포， 또는 심근세포 형성용 조성물체포치료제로 이용될 수 있다. 본 발명은 또한， 본 발명의 방법에 의해 유도 활성화된 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포 치료제는 지방세포， 골세포， 연골세포， 근육세포， 신경세포 , 심근세포 형성 등에 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포치료제" 는 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 또는 조직으로 질병의 치료， 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA 규정)으로서， 세포 흑은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가， 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식， 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료， 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제， 즐기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우， 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다 . 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 텍스트로스, 수크로스， 솔비를， 만니틀， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘, 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈, 샐를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스, 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제， 감미제, 향미제, 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceiitical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며， 바람직하게는 비경구 투여 방식을 따른다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식, 환자의 연령， 체중， 성, 병적 상태， 음식, 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 102- 1010 세포이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제， 산제， 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도용 배지를 제공한다: 화학식
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상기 화학식에서， Rl, R2 및 R3는 각각 독립적으로 H, C1-C3 알킬기 (alkyl group), 또는 (：广 C4 아실기 (acyl group)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1의 R2 및 ¾는 H이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 1-100 μΜ의 농도로 배지 내、에 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 배지는 혈청을 추가적으로 포함한다.
본 발명은 상술한 고활성 유도방법 및 공배양 방법에서 이용하는 혈청 및 배지를 이용하므로， 과도한 중복을 피하기 위하여 이의 기재를 생략한다.
본 발명의 배지에는 혈청 이외에 줄기세포를 효율적으로 배양하기 위해 통상적인 줄기세포 배양용 조성물로 당업계에 알려진 어떠한 성분도 포함될 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도 방법， 이에 의하여 수득한 고활성 지방 줄기세포 및 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도용 배지를 제공한다.
(b) 본 발명은 세포 치료제의 가장 좋은 자원인 중배엽 줄기세포의 공급원으로 기존의 확립된 중배엽 줄기세포를 이용할 수 있으며， 현재 사용되고 있는 여러 기원， 다양한 배양 조건의 인간 중배엽 줄기세포 모두에 적용될 수 있는 광범위하고 규격화된 고활성 유도 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
(C) 본 발명에 따르면， 본 발명의 방법을 이용하여 고활성을 유지한 상태의 지방줄기세포를 비롯한 인간 중배엽 줄기세포의 장기 배양이 가능하며， 체외 배양을 통해 분화능을 유지한 상태의 줄기세포를 높은 수율로 확보할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 사람의 지방조직에서 분리한 지방세포를 위상차 현미경 및 DAPI 염색을 통해서 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 도 2는 각 지방줄기세포의 동정결과를 나타낸 그림이다. 도 2a는 세포표지자로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 사람 지방조직에서 세포를 분리하여 중배엽 줄기세포 분리를 위한 고착배양을 하고， 동일한 형태를 보이는 경우 세포 동정을 위해 중배엽 줄기세포 표지자로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였다 (도 2a). 또한, 상기 표지자로 염색한 중배엽 줄기세포를 중배엽 세포로의 분화를 유도한 결과， 지방조직 유래 중배엽 줄기세포로 동정되었다 (도 2b). 도 3은 지방줄기세포와 지방세포의 공배양 후 지방줄기세포의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 사람 지방조직에서 지방세포와 지방줄기세포를 분리하고， 공배양 48시간 후 지방세포 제거한 이후에 48시간 더 배양하여 핵을 PKpropidium iodide)로 염색한 뒤 세포합성기를 유세포분석기로 세포주기를 분석한 결과 공배양에 의하여 세포합성기 (S기)가 2배 이상 증가한 것을 관찰하였다. 도 4는 지방소적 노출에 대한 효과 배제 실험결과를 나타낸 그림이다. 지방세포와 지방줄기세포의 공배양에 따른 지방줄기세포의 고활성 유도 효과가 지방에 의한 것인지를 확인하였다. 즉, 줄기세포가 저산소 환경에서 생장능력이 증가한다는 보고가 있어， 지방 노출 그룹과 지방줄기세포 단독배양을 대조군으로 하여 지방세포에 의한 부분적 저산소 영향을 관찰하였다. 그림에서 보는 바와 같이, 지방세포 노출군에서만 효과가 있음을 확인하였다. 도 5는 지방세포와 지방줄기세포의 공배양에 따른 지방줄기세포의 활성증가 효과의 기전을 설명하기 위해 수립한 가설을 나타낸 모식도이다. 본 발명자들은 지방세포 내에 지방분해의 산물인 글리세롤과 자유지방산이 존재함을 확인하고 이중 글리세를을 지방줄기세포 활성증가를 위한 유효성분의 후보물질로 하였다. 도 6은 지방즐기세포를 글리세를을 첨가한 배지에서 배양함에 따른 세포수의 증가를 나타낸 그림이다. 실험결과 첨가된 글리세를의 농도 의존적으로 세포수가 의 증가를 확인하였다 (도 6a). 또한 분열에 따른 BrdU의 결합 증가를 관찰함으로써 글리세를 농도에 따른 세포수의 증가를 확인하였다 (도 6b). 아울러 글리세롤 농도에 따른 세포수의 증가 및 형태학적 변화를 현미경으로 관찰하였다 (도 6c). 이상의 관찰 결과， ΙΟμΜ이 가장 효과적인 글리세를 농도임이 밝혀졌다. bFGF군과 지방세포배양액 (sup)은 대조군이다. 도 7은 도 5의 가설을 규명하기 위한 기전 분석 실험의 결과 이다. 글리세를에 의해서는 AKT 활성도가 증가하고， 이러한 증가는 aquaporin(AQl AQ9) 억제를 통해 다시 감소함을 확인하였다. 도 8은 본 발명의 방법에 적용한 후 고 활성을 획득한 지방 줄기세포의 증가된 혈관 형성능을 HUVEC과의 흔합 배양 -혈관 형성법 (mixed culture-tube formation)으로 확인한 결과를 위상차 형광 현미경으로 관찰한 그림이다. 왼쪽 패널은 글리세롤에 노출되지 않은 지방즐기세포를 이며， 오른쪽 패널은 글리세를에 노출된 지방줄기세포를 이용한 결과이다. 글리세롤 노출에 의해 혈관의 구조와 빈도가 높아진 결과를 얻었다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 실시예
지방줄기세포와의 공배양
사람 지방 조직을 잘게 자른 후 0.075% 콜라게네이즈 (collaganase) 타입 Ksigma-aldrich™, U.S.A.)가 포함된 완층용액에 30분 간 녹여서 단일 세포들로 만들고 원심분리기를 이용하여 지방 줄기세포와 지방세포를 이외의 조직들과 분리 후 인간 지방 줄기 세포를 10% FBS를 포함하는 α- MEM( mini urn essential medium, GIBCO® , Invitrogen Corporation™, U.S.A.; L-글루타민， 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드 함유) 배지에서 배양하였다. 인 비트로에서 계대를 지속하면， 노화되어 섬유아세포 유사 (fibroblast-like) 형태를 상실하고 크기가 커진 세포가 출현하며 이들이 증가할수록 성장이 억제되어 더 이상 세포의 유지가 어려워진다. 이러한 세포를 2 X 104씩 배양 접시에 도말하고 24시간 동안 안정화시킨 후 인간 지방세포를 500-1000개 첨가하여 48 시간이하 동안 공배양하였다. 줄기세포가 저산소 환경에서 생장능력이 증가하는 보고가 있어， 지질 첨가 그룹을 대조군으로 함께 하여 지방세포에 의한 부분적 저산소 영향을 배제하였다. 글리세를포함 배지에서의지방줄기세포의 배양
지방세포와의 공배양시 나타나는 생장능력 향상의 기전을 밝히기 위하여 실험을 진행하던 중 지방 대사 산물 중 하나인 글리세를이 주요 영향 인자임을 알았고， 지방세포 없이 글리세롤만으로 유사한 생장능력 증대 및 분화 효율 증대 결과를 얻었다. 체외에서 분리 유지되던 인간 지방 줄기세포를 10% FBS를 포함하는 α-ΜΕΜ 배지에 글리세를을 10-100 μΜ 첨가하여 배양하였다. 유도 활성화된세포의 특성 분석
L 생장능력 확인 (BrdU assay)
세포의 생장시 DNA 중합 반응을 BrdU를 이용하여 정량화하였다. 2. 형광세포분석기 (FACS)를 이용한 세포주기 분석
분리된 세포의 핵 염색을 이용하여 세포주기 (cell cycle)에 따른 변화를 확인하였다.
3. 혈관 형성 분석 (tube formation assay)
혈관 형성능을 관찰하기 위하여 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)과의 공배양을 유도한 후 혈관 형성 능력을 확인하였다.
4. 활성 기전 분석
유도 활성화된 세포의 활성 기전을 규명하기 위하여 가설을 수립하고 (도 5), 이를 활성 전후의 세포 대조군과 활성 후 siRNA (유전자 특이적으로 RNA 수준에서 발현 억제 도구)로 핵심인자의 발현 억제를 유도 하였다. 이후， 각군의 세포에서 단백질을 통상적 방법으로 추출하여 세포의 활성도를 표지하는 AKT의 활성화 정도를 확인하였다. AKT( serine/threonine protein kinase)는 세포생물학 분야에서 세포의 활성표지자로 잘 알려져 있는 인자로 전체 AKT(tAKT)에서 인산화된 AKT(pAKT)의 비율로 활성도를 평가한다. 전체 AKT는 세포에서 통상적으로 발현 유지되는 베타 액틴 (β- actin)으로 보정하였다. 인간지방세포와 공배양올 통한 인간지방줄기세포의고효율 유도
인간 지방 세포를 분리하여 체외배양시스템에 의해 노화된 인간 지방 줄기세포와 10% FBS 포함 α-ΜΕΜ 배지에서 48시간 이하로 공배양 하였다. 48시간 이후에는 지방세포의 세포사가 급격히 진행되어 지방소포가 증가하였다. 이후 지방 줄기세포의 생장능력 향상을 세포 모양과 세포 수, 세포 주기로 확인하였다 (도 3). 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이， 공배양을 하지 않은 군 (왼쪽)과 본 발명의 방법에 의해 공배양을 한 군 (오른쪽)의 세포 형태를 살펴보면 노화되어 섬유아세포 유사 형태를 상실하고 세포크기가 커진 대조군과 달리 실험군은 섬유아세포 유사 형태를 보이며 건강한 줄기세포들에서 보이는 지문형태를 만들며 배양 접시를 가득 채우고 있다. 이는 세포 모양의 변화와 함께 지방 줄기세포의 생장능력이 증대되었다는 것을 의미한다. 또한， 도 3b에서 알 수 있는 바와 같이， 본 발명의 방법에 의해 지방세포와 공배양한 지방 줄기세포는 활발한 증식력을 나타내는 합성기인 S기가 5.44%에서 12.99%로 증가되었음을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 방법을 통하여 더 많은 세포가 자가재생능을 획득하고, 활발한 증식을 하고 있음을 의미한다 . 줄기세포가 저산소 환경에서 생장능력이 증가하는 보고가 있어， 지질 첨가 그룹과 지방줄기세포 단독배양을 대조군으로 하여 지방세포에 의한 부분적 저산소 영향을 관찰하였다. 도 4에서 보는 바와 같이， 지방세포 노출군에서만 상기 효과가 있음을 확인하였다. 인간지방줄기세포를 글리세를포함 배지에서 배양하여고효율 유도
분리， 유지하던 동일 세포수 (2 X 104씩)의 인간 지방 줄기 세포를 각 배양 접시에서 글리세롤 10-100 μΜ 및 10% FBS를 포함하는 α-ΜΕΜ 배지에 첨가하여 배양하였다. 이후 지방 줄기세포의 생장능력 향상을 세포 수와 BrdU assay로 확인하였다. 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이， 본 발명의 방법을 적용한 군중 "G10 (글리세를 ΙΟμΜ)" 에서 음성대조군인 "control" 에 비해 더 많은 양성대조군인 "bFGF (4ng/ml)" 에 비해서도 더 많은 세포수를 보이며 이는 고 활성을 획득한 생장능력이 증대되었음을 의미한다. 세포수가 성장의 한 지표가 될 수 있지만 이와 더불어 세포 분열 이전의 경향을 알기 위해 BrdU assay를 통해 DNA의 합성정도를 통하여 세포의 성장과 분열 능력을 평가해본 결과， 본 발명의 방법을 적용한 군인 "G1"과 "G10"에서 DNA의 합성이 활발히 일어나고 있음을 알 수 있다 (도 6b). 이는 본 발명 방법에 의해 획득된 고활성을 통해 세포의 생장능력이 향상되었음을 보여준다. 반면 글리세롤 농도가 높을 경우 (500μΜ) 오히려 세포 독성이 일어남을 관찰 할 수 있었다.
분화능력은 마트리젤 (Matrigel)에서 인간 지방 줄기세포와 HUVEC과의 공배양을 통한 혈관 형성법 (Matrigel tube formation assay)으로 확인하였는데， 이는 in vitro에서 혈관형성을 비교하는 방법으로 널리 사용되고 있다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이， 본 발명의 방법올 적용한 후 고 활성을 획득한 세포는 그렇지 않은 군에 비해 혈관모양 구조물이 더 많이 뻗어 나오며 육각형 모양 네트워크 형성함을 관찰할 수 있다. 이는 본 발명 방법에 의해 혈관 형성능력이 증대되었음을 의미한다 (도 8). 인간지방줄기세포를 글리세를포함 배지에서의 활성화기전 도 5의 가설을 규명하기 위하여， 도 7과 같은 기전 분석을 수행 하였다. 이를 통해 글리세를이 auquaporin-> AKT를 통하여 세포를 활성화 시키는 것을 확인하였다. 도 7에서 보는 바와 같이， 글리세를에 의해서는 AKT활성도가 증가하고， 이러한 증가는 aquaporin 억제를 통해 다시 감소함을 확인 하였다. 이는 공배양의 핵심인자가 글리세를임을 보여 준바 공배양에 따른 활성 기전이 위와 동일 함을 알 수 있다. Aquaporin은 여러 종류가 있으나 이들 중 본연구와 관련하여 실험 보고된바 없는 aquaporin 1， 9 (AQl, AQ9)올 선택하여 실험을 수행 하였다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
인간 중배엽 줄기세포를 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도 방법： 화학식 1
Figure imgf000019_0001
상기 화학식에서， Rl, R2 및 R3는 각각 독립적으로 H, C1-C3 알킬기 (alkyl group), 또는 C4 아실기 (acyl group)이다.
【청구항 2]
제 1 항에 있어서， 상기 화학식 1의 ， R2 및 ¾는 H인 것을 특징으로 하는 방법ᅳ
【청구항 3]
제 1 항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 1-100 μΜ의 농도로 배지 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 배지는 혈청을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5]
제 4 항에 있어서 , 상기 혈청은 FBS(fetal bovine serum) , BCS( bovine calf serum) , 말 혈청 (horse serum) 또는 인간 혈청 (human serum)인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 6】 제 1 항에 있어서， 상기 배지는 a-MEM, Eagles 's MEM, Iscove's MEM, 199 배지， CMRL 1066, RPMI 1640， F12, FIO, DMEM, Way-mouth's MB752/1 및 McCoy's 5A로 구성된 군으로부터 선택되는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 7】
제 4 항에 있어서， 상기 혈청의 배지 내 함량은 4-30 중량 %인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 8】
제 1 항에 있어서， 상기 중배엽 줄기세포는 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9]
인간 중배엽 줄기세포와 인간 지방세포를 공배양하는 단계를 포함하는 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유£ 방법 .
【청구항 10]
제 9 항에 있어서, 상기 공배양은 혈청을 포함하는 배지에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 111
제 10 항에 있어서， 상기 혈청은 FBS(fetal bovine serum), BCS( bovine calf serum), 말 혈청 (horse serum) 또는 인간 혈청 (human serum)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 12】
제 9 항에 있어서, 상기 공배양은 a-MEM, Eagles 's MEM, Iscove's MEM, 199 배지， CMRL 1066, RPMI 1640， F12, F10, DMEM, Way-mouth's
MB752/1 및 McCoy's 5A로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 13]
제 10 항에 있어서， 상기 혈청의 배지 내 함량은 4-30 중량 %인 특징으로 하는 방법 .
【청구항 14]
제 9 항에 있어서， 상기 공배양은 2-50 시간 동안 수행하 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15]
상기 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득한 고활성 중배엽 줄기세포 .
【청구항 16]
상기 제 15 항의 고활성 중배엽 줄기세포를 포함하는 지방세포 , 골세포， 연골세포， 근육세포， 신경세포， 또는 심근세포 형성용 조성물 .
【청구항 17】
하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 인간 중배엽 줄기세포의 고활성 유도용 배지 :
1
Figure imgf000021_0001
상기 화학식에서， Rl , R2 및 R3는 각각 독립적으로 H, C1-C3 알킬기 (alkyl group) , 또는 d-C4 아실기 (acyl group)이다 .
【청구항 18】
제 17 항에 있어서 , 상기 화학식 1의 Rl , R2 및 R3는 H인 징으로 하는 방법 .
【청구항 19】 제 17 항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 1-100 μΜ의 농도로 배지 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 20]
제 17 항에 있어서， 상기 배지는 혈청을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 21】
제 20 항에 있어서， 상기 혈청은 FBS(fetal bovine serum), BCSCbovine calf serum), 말 혈청 (horse serum) 또는 인간 혈청 (human serum)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 22】
제 17 항에 있어서， 상기 배지는 α-ΜΕΜ, Eagles 's MEM, Iscove's MEM, 199 배지， CMRL 1066, RPMI 1640， F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752/1 및 McCoy's 5A로 구성된 군으로부터 선택되는 배지인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 23】
제 20 항에 있어서， 상기 혈청의 배지 내 함량은 4-30 중량 %인 것을 특징으로 하는 방법 .
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