NO840419L - Cellekulturapparat og fremgangsmaate for et immobilisert cellekomposittprodukt - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører celledyrking. Nærmere

bestemt vedrører oppfinnelsen en apparatur/fremgangsmåte for en massedyrking av vevceller og en immobilisert cellesammensetning som er særlig anvendelig ved dyrkingen av festbare dyre- og planteceller.

Slik det her brukes, henviser vevdyrking til fremgangsmåten hvorved vevceller dyrkes in vitro, d.v.s. i kunstige media og under forholdsvis kontrollerte betingelser.

Vanligvis dyrkes vevceller enten oppslemmet eller festet til

en fast bærer. Noen celler behøver ikke en fast bærer og kan også dyrkes i en oppslemmet tilstand. Andre celler vokser imidlertid bare når de er festet til en overflate, d.v.s. forankringsavhengige celler. Uttrykket festbare celler er her brukt for å omfatte begge celletypene.

For tiden omfatter den kanskje mest vanlige fremgangsmåte for vevdyrking i stor skala anvendelsen av flere rulleflasker.

Som angitt av Jensen,Biotechnol. Biong., 23, 2703 (1981), x er. rulleflaskedyrking svært kostbart, det krever mye arbeid og betydelig kapitalutlegg til inkuberingsutstyr. En annen ulempe er en forøket risiko for forurensning etter som rulle-flaskefremgangsmåten i det vesentlige er en satsvis fremgangsmåte som omfatter hundrevis av enkelthåndteringer.

Mange nyere innovasjoner har vært rettet mot å overvinne disse ulempene. Eksempler på slike innovasjoner omfatter, kun som illustrasjoner, microbærerkuler, kunstige kapillarrør (hulfibrer), og rørbunter. Mange anstrengelser har vært rettet mot å for-bedre selve rulleflaskene.

U.S. Patent nr. 4.317.886 åpenbarer en rulleflaske som omfatter en ytre hylse som avgrensning for et hulrom, med i det minste et ringformet element plassert inne i kammeret anbragt i en kort radiell avstand inne i den ytre hylsen. Den åpenbarte rulleflaske er i virkeligheten ekvivalent med en serie med stadig mindre rulleflasker lokalisert innenfor en enkelt hylse. En annen måte å øke overflatearealet i en konvensjonell rulleflaske er åpenbart i U.S. Patent nr. 3.853.712. Her vikles eller formes på annen måte ved hjelp av suksessive endringer av retning en fleksibel strimmel til en kompakt cellebærer som kan passe innenfor en rulleflaske. Som et eksempel ble en lengde av et riflet strimmelmateriale og en lengde av et bløtt, slett strimmelmateriale viklet sammen til en spiral.

Mens anvendelsen av microbærere for dyrking av festeavhengige pattedyrceller i suspensjon er blitt viet økende oppmerksomhet i de senere år, er ikke slik anvendelse direkte beslektet med den foreliggende oppfinnelse. Dyrkingssystemer med microbærere er basert på oppslemming av bokstavlig talt millioner av individuelle, ørsmå kuler, ikke bærere som utgjøres av et stykke.

Mer interessant er bruken av mange rør for å dyrke festbare celler. Som en illustrasjon åpenbarer U.S. Patent nr. 3.732.

149 en apparatur som omfatter flere innbyrdes parallelle kolonner med en enhetlig lengde. Disse kolonnene er klemt sammen i endene med hjelp av grenerør som er festet på et skaft som er parallelt med kolonnene. Ved bruk vokser cellene på den indre overflaten av kolonnene, hvor igjennom media pumpes. Hele innretningen roteres rundt skaftet. I virkeligheten er den beskrevne apparaturen en variasjon av rulleflasketeknikken.

En noe lignende innretning er åpenbart i U.S. Patent nr. 3.827.943. Her har individuelle rør med en indre diameter på fra 1 til 10 cm et enkelt innløps/utløpsrør. Dette trekket reduserer angivelig risikoen for infeksjon.

En annen variasjon av konseptet med sammenbundtete rør er "Gyrogen". Mens den har en lignende konfigurasjon som de to innretningene som er omtalt ovenfor, adskiller den seg ved at mediene sirkuleres både gjennom og rundt rørene. Følge-

lig er celler i stand til å feste seg til både den indre og den ytre overflaten av rørene. Som ved de tidligere nevnte innretningene med sammenbundtete rør, roteres hele apparaturen rundt en sentral akse. Se f.eks. H.C. Girard et al., Biotechnol.

Bioeng., 22, 477 (1980).

Det bør legges merke til at fremgangsmåten med sammenbundtete rør og variasjoner derav ikke må forveksles med konseptets med kunstig kapillarrør eller hulfiber. De er forskjellige fra hverandre. I fremgangsmåten med kunstige kapillarrør blandes ikke cellene og mediet. F.eks. fester cellen seg til den ytre overflaten av kapillarrørene, mens næringsmediet strømmer gjennom kapillarrørene. Næringsstoffer diffunderer gjennom kapillarveggene og inn i cellene, mens celleproduktet eller.metabolitter diffunderer fra cellene gjennom kapillar-veggen og ut i mediet. Se U.S. Patent nr. 3.883.393; J.K.

Kan et al., Biotechnol. Bioeng., 20, 217 (1978), og U.S. Patent nr. 4.075.092.

En annen måte å øke overflatearealet i forhold til volumet i et dyrkingskar er å pakke dyrkingskaret med biter av inert materiale. En teknikk fastslår at et dobbelvegget sylindrisk glasskår kan fylles med segmenter av glassrør av cirka 6 mm i lengde for å øke overflatearealet. Reaksjonskaret var del av et instrument eller en apparatur med automatisk gass og mediumkontroll. Se E. Harms et al., Cytobiologie, 18, 67

(1978).

Når det gjelder nyere oppsummeringer av vevdyrkinger generellt, se T. Cartwright et al., Process Biochemistry, 13, 3 (1978); L. Keay et al., Process Biochemistry, 14, 17 (1979) og M.D. Jensen, supra.

Endelig har en utførelsesform av bærerne som er nyttige ved fremstillingen av den foreliggende immobiliserte dyre- eller plantecellesammensetningen, blitt beskrevet som en bærer for enzymer og microber. Særlig beskriver M.R. Benoit et al., Biotechnol. Bioeng., 27 1617 (1975), immobiliseringen av kata-laser på katalysatorbærere- i.et stykke som er tilgjengelig i handelen. Enzymet ble bundet kovalent til bæreren ved hjelp av et mellomliggende silanbindingsmiddel aktivert med glutar-aldehyd.

Som en microbiell bærer, ble et substrat i et stykke brukt

i en undersøkelse en av eddiksyrefremstilling ved hjelp av immobiliserte celler av acetobacter aceti. Disse cellene fikk feste seg til en keramisk bærer, kordierit, ved hjelp av adsorpsjon. Se C. Ghommidh et al., Biotechnol. Bioeng.,

24, 605 (1982), en henvisning som i det minst delvis synes å være basert på en tese av C. Ghommidh, som ble publisert i 1980.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er en immobilisert cellesammensetning kjennetegnet ved en bærer med stort overflateareal som har en populasjon av dyre- eller planteceller festet til overflaten. Bæreren er mediumuoppløslig og ikke giftig for cellene. Bærerstrukturen består i hovedsak av et stykke som er gjennomhullet. Innløps- og utløpsflater lar væske strømme gjennom kanaler i bærerstykket for å føre næringsstoffer til de festete cellene. Kanalene er i det vesentlige parallelle med strømningsretningen.

En foretrukket utførelsesform åpenbarer en immobilisert cellesammensetning kjennetegnet ved en bærer med stort overflateareal i forhold til volumet som har en populasjon av dyre-eller planteceller festet til overflaten hvor den ensartete strukturen omfatter en matrise av tynne porøse vegger,

i Disse veggene avgrenser et stort antall passasjer. De strekker seg longitudinelt og innbyrdes parallellt gjennom monolitten og mellom innløps- og utløpsflåtene i denne strukturen. Dimensjonene til disse passasjene er minst ca. 3 passasjer pr. cm<2>av tverrsnittet i strukturen.

)

Det er et formål ved den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en apparatur/fremgangsmåte for massedyrking av celler som anvender en immobilisert cellesammensetning enten for å dyrke celler kun for høsting eller p.g.a. nyttige produkter 5 som lar seg erholde fra cellekulturer, f.eks. metabolitter, enzymer.

Det er også et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveie bringe en immobilisert cellesammensetning som omfatter en bærer med stort overflateareal som har en populasjon av dyre-eller planteceller bundet til overflaten.

Disse og andre formål vil lett være åpenbar for en gjennom-snittsfagmann innen teknikken ut fra en betraktning av be-skrivelsen og kravene nedenunder.

Foreliggende oppfinnelse åpenbarer også en spesielt effektiv fremgangsmåte for å dyrke festbare plante- eller dyrevev-

celler under anvendelse av en ny immobilisert cellesammensetning. En tett populasjon av celler festet til bærerover-flater med et høyt overflateareal i forhold til reaktorvolum dyrkes ved hjelp av et strømmende næringsmedium. Næringsmediet tilpasses kontinuerlig, for å gi et kontrollert miljø for cellene. Strømningsretningen er i det vesentlige parallell med bærer-overflatene i reaktoren.

Den immobiliserte cellesammensetningen er kjennetegnet ved en gjennomhullet struktur som danner en fast enhet og har en mangfoldighet av innbyrdes parallelle kanaler. Kanalveggene er dannet av en mediumuoppløslig, ikke giftig porøs uorganisk blanding som kan variere betydelig. Hele denne montasjen er omgitt av et middel som tillater en laminær, ikke turbulent strøm å passere forbi kanaloverflåtene.

En typisk bærer er en keramisk gjennomhullet struktur dannet

av kordierit. Den omfatter en stor mengde rette, parallelle kanaler med kvadratisk tverrsnitt, med en tverrsnittstetthet av kanaler i området fra ca. 15 til 150 kanaler pr. cm2 .

Denne bæreren er omgitt eller innkapslet på en slik måte at

en laminær strøm med væsker kan passere gjennom kanalene.

Festet til kanalveggene i bæreren er en populasjon med festbare celler avleddet fra plante- eller dyrevev, fortrinnsvis valgt fra, men ikke begrenset til, gruppen som omfatter dyre-lymfosyt-, epitel- eller fibroblastceller.

Ved en fremgangsmåte for å dyrke cellene i henhold til oppfinnelsen, får en kjent væskemengde egnet for celledyrking strømme over de utsådde festete cellene. Strømningshastig-heten er minst tilstrekkelig til å forsyne cellene med mengdene av oksygen og næringsstoffer som er nødvendig for cellefor-sørgelse og, om ønsket, for cellevekst. Laminær strømning av kulturmediet gjennom kanalene letter en kontinuerlig, rikelig tilførsel av næringsstoffer som .er vesentlig for veksten og en kontinuerlig fjerning av metabolske produkter. Følgelig kan forholdsvis høye populasjonstettheter etableres på de porøse veggoverflåtene i bæreren.

Fortrinnsvis gjenvinnes mediet etter å ha passert over over-flatene til den faste enheten. Det resirkuleres etter å ha fått en komplettering av nødvendige næringsstoffer og gasser for optimale vekstnivåer. Overvåkingen og justeringen av disse nivåene kan gjøres automatisk og kontinuerlig.

Høyere og mer effektive utbytter av dyrkete celler fås når bæreren har celler som vokser ensartet på alle eksponerte over-flater. For å oppnå denne veksten må man begynne med å fordele cellene jevnt når den faste enheten podes. Podingsfrem-gangsmåtene ifølge foreliggende teknikk er i stand til ikke bare å gi jevn poding, men gjør det på en forholdsvis enkel, arbeidssparende måte.

Poding begynner med å oversvømme sammensetningen med et dyrkingsmedium. Etter å være blitt plassert slik at en orientering av kanalveggene er horisontal, oversvømmes den faste enheten

j i den ene tilførselsfremgangsmåten med et celledyrkingsmedium som inneholder dyreserum, fortrinnsvis ca. 5%, og en ensartet cellesuspensjon fremstilt ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

En periode med bunnfelling etterfølger oversvømmingen. Gravi-- tasjonen forårsaker at cellene bunnfelles jevnt over de horisontale kanaloverflåtene. Etter en hvileperiode som er tilstrekkelig lang til å la de bunnfelte cellene festes, vanligvis 15 minutter, returneres sammensetningen utgjør en fast enhet til en vertikal posisjon. Her resirkuleres den enhetlige cellesuspensjonen over den faste enheten i 5 minutter ved hurtige strømningshastigheter. Vanligvis en lineær strømning på ca. 0,1 til 2,5 cm/sek.

Bunnfellings/resirkulerings-syklusen utføres for hver anbringelse i en bestemt stilling av kanaloverflåtene. Med andre ord må en fast enhet som., har kanaler med kvadratisk tverrsnitt gjennomgå fire anbringelser i bestemte stillinger for å bli ensartet podet. Hver gang roteres den faste enheten 90°. om sin horisontale akse.... Resultatet er at sammensetningen podes enhetlig uten at det kreves ytterligere cellesuspensjons-konsentrat for hver anbringelse i en bestemt stilling.

Det bør legges.merke til at alternative podingsfremgangsmåter, fremgangsmåten med flere påfyllinger, kan brukes slik at bruken av 5% dyreserum i inokkuleringsoppløsningene unngås. Forskjellen ved denne fremgangsmåten er at nye tilførsler

av cellekonsentrat må tilsettes til systemet før hver anbringelse i en bestemt stilling. Om ønsket kan fremgangsmåten med flere gangers poding gjøres med medier inneholdende dyreserum.

Så snart cellene er podet, må de stilles overfor et miljø som er optimalt med hensyn enten til cellevekst eller -forsørgelse, d.v.s. opprettholde en bærer mettet med friske adsorberte celler. Næringsstoffer, temperatur og gasser bør være tilstede i mengder som er tilstrekkelige enten for vekst eller for opp-rettholdelse gjennom hele bæreren. Dertil vil cellemetabolitter bli frigitt til mediet og bør fjernes eller nøytraliseres når de sinker cellulær vekst.

Selvfølgelig må man kjenne den tilstedeværende kvantitative status til disse kvalitative vekstparametre for å vite hvilke betingelser som trengs og endres hvor mye. Midler for å måle disse parametrene, bør derfor være tilført i det foreliggende dyrkingssystem. Fortrinnsvis bør sonder og følere lese ut nivåer for pH, glukose, oppløst oksygen og oppløst karbondioksyd i mediet både før det kommer inn i og etter at det forlater

bæreren.

Det kan oppstå en fordel av disse målemidlene. Etter som nivåer for næringsstofforbruk og metabolittavgivelse varierer i et direkte forhold til antallet celler over en tilstrekkelig lang tid, kan vekstmønsteret eller utformingen av en bærer bestemmes. Dette er særlig tilfelle når en rekke tidligere utførelsesprofiler når det således nås en bestemt hastighet i endring av parametre, kan man med rimelig grad av sikkerhet forutsi hvor mange celler som er blitt dyrket og hvor lang tid i forveien bæreren er blitt mettet.

Mens cellevekst kan overvåkes ved hjelp av visuell inspeksjon og microskopi, gir også endringshastighetene i vekstparametrene nevnt nedenunder et middel for å overvåke cellevekst: 1) differensialet av pH i mediet over bæreren (ApH), d.v.s. innløps-pH kontra utløps-pH, 2) hastigheten for glukoseforbruk (GCR), d.v.s. hastigheten hvorved glukose må tilsettes for å oppretthelde enten et optimalt eller et gitt nivå, 3) differensialet for oppløst oksygen (DO) over bæreren (ADO), d.v.s. innløps-DO kontra utløps-pH, 4) karbondioksyd (C^^kravet (CDD), d.v.s. tilførselshastig-heten for CO2som trengs for å opprettholde enten en optimal eller en gitt pH, og

)

5) oksygen (O2)_forbrukshastigheten (OCR), d.v.s. hastigheten

hvorved O2må innføres i mediet for å opprettholde enten et optimalt eller et gitt nivå.

Dess flere parametre som overvåkes med hensyn til endringshastighet og dess større målingsfrekvens, dess bedre kan man selvølgelig kvantifisere celleveksten som foreligger på bæreren.

Evnen til den foreliggende oppfinnelse når det gjelder å

dyrke celler er sikkert viktig, men dette er ikke alt. Effektiviteten hos en hver dyrkingsfremgangsmåte/apparatur

er også baserte på evnen til å høste inn de dyrkete cellene. Innhøstingen bør bedømmes etter kvantitet, prosentutbytte og kvalitet, prosent ikke-skadde celler som opprettholder sin reproduksj onsevne.

Den foreliggende - fremgangsmåte for innhøsting av celler er

i det vesentlige en tretrinns fremgangsmåte:

1) fjerning av oppløslige faktorer i dyrkingsmediet som kan inhibere evnen til disassosieringsmidler, 2) behandling av cellene som skal innhøstes med disassosieringsmidler, d.v.s. reagenser som er i stand til å bryte gjen-sidige celle-celle- og celle-overflate-påvirkninger i en tilstrekkelig lang tid til å bevirke den ønskete grad av av-brudd, og 3) utøvelse av en skjærkraft på de behandlete cellene ved sirkulering av væskemediet.

Et eventuelt fjerde trinn kan være adskillelse av de behandlete cellene fra mediet.

I det første trinnet må de oppløslige inhiberende faktorene fjernes fra mediet. En foretrukket måte er å tilsette en mengde av et gelateringsmiddel slik som kalsium/magnesium-fritt fosfat-bufferet saltvannsoppløsning (CMF-PBS). Selv-følgelig må den tilsatte mengden være tilstrekkelig til å binde alle de inhiberende faktorene.

Deretter behandles cellene med kjente disassosieringsmidler. Disse midlene tjener til å bryte tiltreknings- eller bindings-kreftene som er utviklet både mellom celler og mellom celler og- bæreroverflaten. Egnete midler omfatter proteolytiske enzymer og gelateringskjemikalier. Det foretrekkes en ca. 0,1% oppløsning av trypsin blandet med en ca. 0,5 millimolar (mM) oppløsning av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).

Disassosieringsbehandlingen varer i et tidsrom som er tilstrekkelig til å bryte hovedsaklig alle ensidige celle-celle-og celle-overflate-påvirkninger. Følgelig krever en større celletetthet mer tid enn lavere tettheter. Et eksempel på

en foretrukket tid for en git.t. tetthet ville være ca. 30 minutter for en celletetthet på ca. 2,2x10 5/cm2 . Under denne tiden er det selvfølgelig foretrukket at mediet ikke sirkulerer over monolittbæreren.

I det tredje trinnet er cellene klare til å bli adskilt fra bæreroverflåtene. En skjærkraft påsettes cellene ved å sirkulere mediet over de behandlete cellene med en hastighet tilstrekkelig til å forflytte dem. Foretrukkete strømningshastig-heter for mediet er fra ca. 0,75 til ca. 6 cm/sekund avhengig av celletetthet og -type. Spesiell utvelgelse kan også baseres på hvorvidt man ønsker en mest mulig fullstendig fjerning,

en kvantitativ fjerning eller bare en delvis fjerning, kanskje for prøveformål. I alle tilfeller varer dette trinnet inntil den ønskete grad av adskillelse er oppnådd.

En av de viktige egenskapene til de immobiliserte cellesammen-setningene brukt i en apparatur/fremgangsmåte for massedyrking av celler, er evnen til å gi celler med en tilfredsstillende eksponering overfor vitale næringsstoffer gjennom alle kanalene i hele lengden. Dette oppnås til tross for den høye celle-tettheten, høye sideforhold og små tverrsnittsåpninger i kana-

) lene som kjennetegner foreliggende sammensetning. Det viktige for dette er midlene for tilveiebringelse av ikke-turbulent strømning som er plassert rundt bæreren.

Hjelpemidlet som omgir bæreren er konstruert og utformet for

å sikre en laminær, ikke turbulent strøm av medium over hele tverrsnittet og lengden av den faste enheten. Ved en vanlig utforming er det en tett hylse som omslutter den faste enheten, og bare lar kanalendene være åpne. I enkelte tilfeller er

kappen segmentert.

Ved de åpne delene er hjelpmidlet tilpasset og utformet for lett å føre det flytende mediet inn i og ut av den faste enheten. Det innsnevres fra diameteren til den faste enheten til diameteren til midlet for tilførsel av medium til bæreren. Fortrinnsvis er et fordelingshjelpemiddel plassert i overgangsområdet i selve strømmen. De.tte midlet fordeler mediet jevnt inn i alle bærerkanalene. Hovedbetydningen er i det vesentlige å elliminere turbulent strømning og gi en adekvat mediumstrøm over tverrsnittet av den faste enheten.

Forskjellige materialer er egnet for det ikke-turbulente strøm-ningsmidlet hvorav alle er uoppløslige i mediet og er ikke-giftige for cellene som dyrkes. Egnete sammensetninger er glass, keramikk, plast, metaller og andre materialer kjent innen teknikken. Selvfølgelig muliggjør allsidigheten når det gjelder materialer.forskjellige konstruksjonsfremgangsmåter.

Et foretrukket eksempel på å utforme en sammensetning gir an-ledning til hurtig montering eller demontering. Hjelpemidlet for å sikre ikke-turbulent strømning er delt i minst to stykker slik at segmentene lett kan adskilles, monolitten hurtig in-stalleres eller erstattes og segmentene på nytt knyttes sammen på en fastlåst måte.

Den følgende utforming vil være typisk. Monolittkappen er i to sylindriske stykker med identisk utforming. Hver har en indre diameter som er konstruert og utformet for å muliggjøre

i innføringen av den sylindriske bæreren. I en ende er segmentet utformet for å danne en kantflenset tettning med et annet segment. I den andre enden er det tilpasset og dimensjonert for å sikre en innført monolitt med passende lengde fra og skli rundt innenfor den monterte sammensetning, og også for å gi et -jevnt overgangshjelpemiddel mellom strømtil-førselsmidlet og den faste enheten.

Sammensetningen monteres ved å innføre den faste enheten i en av de hensiktsmessig utformete segmentene. Det komplimentære segmentet føres så inn over den frie enden av den faste en-

heten inntil segmentendene med flenser møtes. Til slutt plasseres en klemme som vanligvis brukes for å sikre og låse sammenstøtende glassrør rundt endene med flenser og strammes til. Enheten er klar for sterilisering og tilførsel av celler.

Akkurat som det ikke-turbulente strømningsmidlet i sammensetningen kan være oppdelt for lettere konstruering og montering,

kan også bæreren være det. Bæreren kan være i form av segmenter med innskjæringer som er komplementære. Hvert segment er konstruert for på en korrekt måte å innrettes etter og orienteres til sitt nabosegment. Hovedsaken er at kanalene faller sammen for å muliggjøre en ikke-turbulent strømning i det indre av bæreren så vel som å minimalisere antallet orien-teringstrinn i utsåingsfasen. Mens denne montasjen ikke behøver å være monolittisk forsåvidt gjelder en ettstykkekonstruksjon,

er den monolittisk på den måten at innrettingen og orienteringen av dyrkingsoverflåtene på bæreren opprettholdes gjennom de sammenførte delene.

Den her åpenbarte dyrkingsapparatur for celler byr på betydelige fordeler overfor kjente dyrkingsinnretninger for celler.

I Bærerstrukturen gir et forholdsvis høyt overflateareal for festing av celler i en reaktor med håndterbart volum, og tillater likevel hovedsaklig ikke-innskrenket laminær strømning av det flytende dyrkingsmedium. Dette sikrer ikke bare effektiv tilførsel av mediet til alle cellene, men tillater også hurtig

)ekvilibrering av næringsmediet til optimale betingelser før resirkulering.

I tillegg kan det oppnås økninger i kulturproduktivitet i et direkte forhold til økninger i bærervolum (ved et konstant overflateareal:bolum-forhold). Med andre ord er oppskalering

av produksjon ganske enkel og likefrem. Dette er ikke mulig med kjente dyrkingssystemer for celler basert f.eks. på rulle-flaskebærere. Forholdsvis store celledyrkingsapparater med

høy ytelse kan lagres ifølge foreliggende teknikk uten de for-økete arbeidskostnadene, håndteringstrinn og risiko for forurensning som ville oppstå ved oppskalering av en rulleflaske-og microbærer-celledyrkingsprosess.

Ytterligere innsparinger i arbeid og materialer kan gjennom-føres ved å tilveiebringe automatisk, kontinuerlig overvåking og justering av oppløste næringsstoffer og gasser som trengs til celleforsørgelse og/eller vekst. I stedet for at mediet fullstendig erstattes minst en gang, som i vanlige rulleflaske-prosesser, kan den foreliggende apparatur dyrke like store antall celler på mindre mengder medier enn kjente dyrkingssystemer. Dette oppnås ved en kombinasjon av: et middel for å gjenvinne og/eller lagre det anvendte medium, et middel for å overvåke behovet for komplettering, et medium for å justere mediet til korrekte nivåer, og et middel for å resirkulere det optimaliserte medium. Fortrinnsvis gjøres alt dette automatisk.

Ytterligere fordeler i fremgangsmåtekostnader kan oppnås i gjenvinningen av celleprodukter. Med den foreliggende sammensetning adskilles alltid festete celler fra næringsstoffreservo-aret. Dersom et ønsket produkt overføres fra cellene til mediet, utvinnes det lett ved å bli adskilt fra mediet i næringsstoff reservoaret ved hjelp av vanlig kjente fremgangsmåter. Ved å endre reservoarmengden endres produktkonsentrasjonen

i samme forhold. F.eks. gir et minsket mediumvolum i reservoaret høye produktkonsentrasjoner. Verken microbærer- eller suspenderte dyrkingssystemer kan by på denne evnen.

Oppfinnelsen kan forstås bedre under henvisning til tegningene, hvor: Figur 1 er et projisert riss i delvis tverrsnitt av en bærer som danner en fast enhet. Figur 2 er et tverrsnitt-riss av en bærer som danner en fast enhet. Figur 3 er et skjematisk diagram av en dyrkingsapparatur for celler hvor det anvendes en sammensetning av en bærer som danner en fast enhet. Figur 4 er et projeksjonsriss av en oppdelt bærer som danner en fast enhet. Figur 5 er et riss av bæreren i figur 4 men hvor de to viste delene er rykket vekk fra hvexandre for tydlighets skyld. Figur 6 er et profilprojeksjonsriss i delvis tverrsnitt av en immobilisert cellesammensetning som har et oppdelt hjelpemiddel for ikke-turbulent strømning. Figur 7 er et skjematisk diagram av det automatiske og kontinuerlige fremgangsmåtekontrollsystemet slik det brukes i en dyrkingsapparatur for celler. Figur 8 er et billedlig diagram som viser den innbyrdes forbindelse mellom kontrollparametre og cellevekst. Figur 9 er et profilprojeksjonsriss av en glassinnkapslet bærer som danner en fast enhet. Figur 10 er et profilprojeksjonsriss i delvis tverrsnitt av en bærer som danner en fast enhet og overføringskapsler i endene innført i en krympbar plasthylse. Figur 11 er et profilprojeksjonsriss av enheten i figur 10 etter at hylsen er blitt krympet. Figur 12 er et projeksjonsriss av en glassinnkapslet bærer som danner en fast enhet, hvor de enkelte deler for tydlighets skyld er rykket fra hverandre.

Før den beste utførelsesmåten av oppfinnelsen beskrives vil

det være nyttig for leseren å fremlegge en deffinisjon:

For det foreliggende formål er profilforholdet forholdet mellom lengden av den massive bæreren (målt parallellt med kanalene) og dens største tverrsnittutstrekning.

Ved en foretrukket utførelsesform er den immobiliserte cellesammensetningen en montasje av en bærer og et hjelpemiddel som tilveiebringer strømning. Bæreren for den immobiliserte cellesammensetningen er en fast enhet, vist i figurene 1 og 2, bestående av parallelle ka,naler (12) med hovedsakelig like store dimensjoner adskilt ved hjelp av felles vegger (14). Denne bæreren utgjør en enkelt enhet med variabel lengde og tverrsnittsareal, og er innesluttet i en tettsittende hylse (16) hvorved det kan fås laminær, ikke-turbulent strømning

av næringsstoffmedium for celler gjennom alle kanalene i bærer-enheten. Dette sørger for den utpregete fordel av enhetlig eksponering av cellene festet til kanalveggene mot næringsstoffene i mediet, noe som har vært et problem i den tidligere teknikk.

Som vist i figur 6 omfatter en foretrukket bærermontasje et sylinderformet bærerstykke (10) og et oppdelt hjelpemiddel (16) for tilveiebringelse av ikke-turbulent strømning av dyrkingsmedium inn i, gjennom og ut av bæreren. I den illustrerte montasje omfatter det oppdelte midlet (16) symmetriske glass-hylsedeler (18, 20) med et middel (20) for å feste dem sammen. Når man starter fra innløpet i sammensetningsmontasjen (24)

og fortsetter langs strømningsmidlet (16) mot utløpet (38), har innløpsdelen av glasshylsen (18) en åpning (24) for inn-føring av medium i montasjen. I umiddelbar nærhet av inn-løpet er det et strømningsovergangsområde (26). Etter som , dette området har form av et kjeglebruddstykke, tilpasses tverrsnittsarealet i innløpet til bærerens. Plassert ved bærerenden i dette området er en sintret plate (28). Den er dimensjonert og utformet for å fordele strømmen av medium inn i alle bærerkanalene (12).

Fra overgangsområdet (26) har hylsedelen (18) en sylindrisk form som omhyller bæreren. Mansjettenden (30) til innløpshylse-delen (18) er tilpasset for å støte sammen med den komplimen tære enden (32) til en identisk utløps-glasshylsedel (20) omtrent ved midten av den innhyllete bæreren. Utløpsdelen er identisk med innløpet ved også å ha en plate (34), et strømningsovergangsområde (36) og en utløpsåpning (38). Disse hylsedelene er festet sammen ved hjelp av et vanlig kjent middel slik som en glassrørklemme (22).

Det kan lages alternative montasjer. F.eks. som vist i figur 10, i tilfelle med varmekrympbare materialer som er kjent innen teknikken, kan den massive bæreren (10) innføres innenfor et utvalgt stykke som er komplementært i form (i det minste når det er krympet). Det på forhånd krympete stykke (16) er litt større enn bæreren for å muliggjøre innføring. Overgangs-delene (26, 36) i hjelpemidlet for ikke-turbulent strømning har strømningsfordelere (28, 34) og er adskilt fra hoveddelen som omgir bæreren. De er laget av materialer som ikke lar seg krympe av varme slik at når hoveddelen krymper rundt både bæreren og endene, dannes det et hjelpemiddel for ikke-turbulent strøm-ning.

For å montere sammensetningen innføres bæreren i den på forhånd krympete plastformen. Deretter innføres endene på linje med kanalåpningene. Det tilføres varme og, som vist i figur 11, krymper materialet rundt bæreren (10) og endene (26) og danner midlet som gjøre at en ikke-turbulent strøm skyller gjennom kanalen i bæreren og passerer de festete cellene.

En annen måte å fremstille sammensetningen på er vist i figur 12. Det utvendige av bærerstykket (10) er belagt med kjente glasurer (16) som bare etterlater kanalendene åpne. Bærerstykket kan enten sprøytes med eller dyppes i det utvalgte glaseringsmaterialet. Etter å være tilført, utsettes bærerstykket for kjente, egnete teknikker for å feste glasuren, f.eks. varmebehandling. Som i tilfellet med sammensetningen av krympbart plast, kan det være behov for overgangsendedeler (26, 36) med strømningsfordelere (28, 34). De kan knyttes til bærerstykket ved kanalendene ved hjelp av vanlig kjente måter for å danne montasjen.

F.eks. kan en keramisk gjennomhullet utforming av alluminium eller zirkonium ekstruderes inn i en massiv bærer som gir 63,9 vekt-% mullit + 36,1 vekt-% zirkonium etter oppvarming ved 1 600°C. Dette materialet har en varmeutvidelseskoeffisi-ent på 58x10 (-7)/C i området værelsestemperatur til 1 000°C. Det innkapsles med en glasur som passet godt i utvidet form

og fortrinnsvis noe mindre slik at glasuren settes under trykk. En egnet sammensetning vil vær.e.4 5,2% silisumdioksyd, 29,6%

PbO, 8,0% boroksyd, 7,1% CaO, 5,7% alluminumoksyd, 2,3% soda, 0,9% kaliumhydroksyd, 0,7% zirkoniumoksyd, 0,2% CdO.

Etter smelting reduseres sammensetningen til et fint pulver,

ca. 325 mesh. Det tilføres den gjennomhullete overflaten i form av en suspensjon i vann med en liten mengde organisk binde-middel. Etter tørking ved 100°C brennes den belagte bæreren ved 1 090°C i 1 time i en luftatmosfære. Resultatet er et godt tilpasset glasert gjennomhullet produkt hvis overflate er ugjennomtrengelig for væsker.

Ved en tredje fremgangsmåte for å montere sammensetningen brukes en glassinnfatning. Bærerstykket plasseres i et glassmateriale som er komplementært i form, men noe større enn bæreren. Kanalendene tilpasses åpninger i innfatningen.

F.eks. anbringes et sylindrisk massivt stykke i et glassrør

hvis indre diameter er noe større enn den ytre diameteren til bæreren. Ved utvelgelse av glasset bør det vises omtanke med å få varmeutvidelseskoeffisientene til bæreren og glasset enten til å falle sammen eller tilnærmes. Dette vil redusere spenningene både i glasset og i bæreren under det neste trinnet.

Som vist i figur 9 varmekrympes så glasset rundt bærerstykket (10) ved hjelp av vanlig kjente midler. F.eks. roteres glasset (16) aksielt mens det varmes opp over hele sin lengde. For å unngå bruken av adskilte overgangsendedeler (26, 36), kan de oppvarmet glassendene enten forlenges eller reduseres til en ønsket diameter mens de er i en bearbeidbar tilstand. Strøm-ningsf ordelere (28, 34) kan plasseres innenfor overgangsområdene.

Sammensetningene ovenfor er forskjellige i sammensetning,

deler og fremgangsmåter for montering. De har imidlertid alle den nye, tidligere beskrevne bæreren som danner en fast enhet, og et middel rundt bæreren som overfører strømning inn i, gjennom og ut av den på en slik måte at cellene som er festet til bæreren stilles over for en laminær, ikke-turbulent strøm av medium.

Det bør legges merke til at bæreren som danner en fast enhet også kan være oppdelt (40-48), se figurene 4 og 5. Hver del er utformet for korrekt å rettes inn med og orienteres til sin nabodel. Det viktige hensynet er at kanalene passer sammen for å muliggjøre en ikke-turbulent strøm i det indre av bæreren så vel som å minimalisere antallet innstillingstrinn på utsåings-stadiet. Figur 5 viser en tegning av to deler som er rykket fra hverandre og hvordan de passer sammen. Mens denne montasjen ikke behøver å være ensartet i betydningen av konstruksjon i et stykke, er den ensartet på den måten at innrettingen og orienteringen av dyrkingsoverflåtene i bæreren opprettholdes over de forenete delene.

Formen av kanalene (12) som utgjør bærerstrukturen er ikke kritisk. Kvadratiske, runde, triangulære og andre former er hovedsakelig likeverdige for formåle å dyrke celler i henhold til foreliggende oppfinnelse. Størrelsen på kanalene er imidlertid en viktig variabel som påvirker velegnetheten til bæreren. Usedvanlig store kanaler reduserer forholdet mellom overflateareal og volum hos bæreren og utnytter følgelig ikke effektivt volumet av tilgjengelig dyrkingsmedium. På den andre side begrenser usedvanlig små kanaler mediumstrømmen slik at det er vanskelig å opprettholde optimal pH og nivåer med opp-løst gass når mediet er i nærheten av cellene.

Profilforholdet til bæreren er ikke en kritisk faktor for cellevekst forutsatt at den maksimale strømningshastigheten av medium gjennom kanalene kan gi adekvate næringsstoffnivåer til celler i det vesentlige gjennom hele kanallengden, samt fjerne avfallsprodukter slik at maksimale avfallsnivåer unngås. Profilforhold i området ca. 1:100 er passende for det området av strømningshastigheter som er mulig med de foreliggende bærere for celledyrking.

Sammensetningen av kanalveggene i bæreren, enten den er organisk eller uorganisk, bør ha de følgende kjennetegn: 1) være i det vesentlige mediumuoppløslig og ikke-giftig for cellepopulasjonen som dyrkes, 2) være en overflate hvor-til de interessante dyre- eller plantevevcelletypene vil feste seg, og 3) være en som kan bindes i et materiale av tilstrekkelig styrke til å danne en kanalvegg.

Eksempler på forenlige materialer omfatter silisiumdioksyd, sintret borsilikatglass, mullit ( 3A1203 " 2SiC>2 ) , cordierit ( 2MgO ' 2A1203 ' 5Si02 ) , magnesiumcordierit ( B-a] MgO " aMnO" 2A12C>3 " 5Si02), zirkonium ( Zr02 ' Si02 ) , glimmer og spodumen (Li20* A12C>3' 4Si02). Alluminumoksyd (A^O^) og titaniumoksyd (Ti02) ble også funnet å være egnet forutsatt at de var grundig vasket før bruk. Selvfølgelig vil også kombinasjoner av to eller flere av de forenlige materialene åpenbart ovenfor også være egnet.

Utvelgelsen av et materiale til bæreren vil delvis avhenge av vevcellene som skal dyrkes. Noen vev/bærermateriale-kombinasjoner gir resultater som er sammenlignbare med eller bedre enn de som fås med plast-rulleflasker, mens andre kan være noe mindre effektive. Tabell 1 nedenunder gir eksempler på noen bestemte celletyper som kan dyrkes ved å bruke sammensetninger tilveiebragt ifølge oppfinnelsen. Inkludert er en identifikasjon av: anvendt celletype, den karakteristiske eller vanlige bruken av cellene i vevkultur, og noen foretrukne bærermaterialer som oppviser dyrkingsforenlighet med cellene. Optimal bruk av den foreliggende massive bærer oppnås i et system utformet for å fremme enten maksimal cellevekst eller celleopprettholdelse med minimale tilførsler. Et adekvat nærvær av næringsstoffer må gjøres tilgjengelige for de voksende cellene kontinuerlig. Avfallsprodukter som virker inn på veksten bør også fjernes.

Figur 3 er en skjematisk fremstilling av et foretrukket dyrkingssystem hvor det brukes en massiv bærer. Et medium som inneholder næringsstoffene egnet for enten cellevekst eller opprett-holdelse skyldes over dyrkingsoverflåtene hos den massive bæreren (10) ved hjelp av en pumpe (50). Som pumper væsken fra et reservoar (52) og inn i, deretter gjennom bæreren. Eventuelt kan flere bærere brukes samtidig dersom de er forbundet på en parallell måte. Mediet og bæreren holdes ved en optimal temperatur ved hjelp av vanlig brukte midler.

Når mediet resirkuleres inn i og ut av bæreren støter det på kontinuerlige, automatiske,J:ølere (54 , 56) for måling av pH-nivå, glukosenivå, nivå av oppløst CG^og nivå av oppløst C>2 • Disse følerne rapporterer hele tiden tilbake til en sentral, prosesskontroll-datamaskin (58) som igjen kontroll-erer mediumstrøm (pumpe 50) såvel som mediets komplettering. Nærmere bestemt betjener kontrollenheten mekanismer, slik

som en gasspermeator (60) og buffer- og glukosoppløsnings-reservoarer (62) med pumper (80) som kan gjenopprette uttømminger i det brukte mediet. Det tas prøver av mediumfraksjoner og tilsetninger gjøres i samleventiler (64).

En mer detaljert illustrasjon av den automatiske systemkon-trollen kan ses i figur 7. Her registrerer sonder (54 og 56) pH-nivå, glukosenivå, nivå av oppløst CC^og . Eventuelt kan aminosyre- og cellemetabolitkonsentrasjoner måles. Den informasjonen omdannes til elektriske signaler som først forsterkes ved hjelp av forsterkere (66) og deretter over-

føres til et kombinert automatisk/manuelt panel (68). Panel-metere (70) mates av panelet for øyeblikkelig utløsning.

Dersom det ønskes manuell manøvrering, kan en teknikker overvåke panelutlesningen og justere manuelle kontroller (72) for glukose, pH, oppløst CC^, O ? og oppløst nitrogen (N2).

Dersom det ønskes automatisk kontroll, overføres følerdataene til en sentral regnemaskin (74) med tilstrekkelig stort minne og beregningskraft til hurtig å styre systemkontrollene.

En Hewlett-Packard HP9915 vil være egnet. Når den mottar tilstanden til mediet som kommer inn i og forlater bæreren, beregner regnemaskinen den nødvendige endring som må gjøres med mediet for å gjenopprette det før det resirkuleres inn i bæreren. Disse beregningene oppdateres hele tiden og er basert på et datamaskinprogram som vil være alminnelig kjent for fagfolk.

Nesten samtidig med beregningene viser datamaskinen dataene fra følerene, behovet til systemet og de nødvendige tiltak for å rette opp disse behovene på en skriver (76) og/eller videoterminal (78). Samtidig sender den signaler tilbake til panelet hvor de sendes videre til den formålstjenelige servomekanisme. F.eks. kan pumper aktiveres for å tilføre buffer- og glukoseoppløsninger (80) i fastsatte tidsrom basert på systembehov, pumpekapasitet og oppløsningskonsentrasjoner.

I tillegg kan kontrollinstrumenter for gasstrøm (82) aktiveres for å øke eller minke mengde C^, CG^ og N 2 som føres inn i gasspermeatoren (60), eller eventuelt føres direkte inn i reservoaret (52) med en hastighet som er tilstrekkelig til å unngå skumming (ikke vist).

Nettovirkningen av denne kontrolloppstillingen er et middel hvorved mediumbehovene kan overvåkes automatisk og de passende kompletteringstrinn utføres automatisk og kontinuerlig. Arbeids- og materialbesparelsene er betydelige.

Det bør legges merke til at det i praksis ble det åpenbart

en fremgangsmåte for å avtegne en cellevekstkurve eller

-profil som hjalp systemoperatøren. Det er blitt oppdaget at endringshastigheten for OCR og GCR står i forbindelse med metning av bæreren med celler, d.v.s. et celleantallplatå. Dette er vist i figur 8. Følgelig vil en overvåking av OCR

og GCR avsløre cellemetning.

Eksempel 1

De følgende detaljerte eksempler viser fremstillingen og bruken av en sammensetning for celledyrking i henhold til oppfinnelsen.

Bæreren

En keramisk bærer i et stykke i form av en gjennomhullet struktur bestående av en rekke parallelle kanaler med kvadratisk tverrsnitt velges for bruk som bærer for dyrkingen.

Denne bæreren består av cordierit ( 2Mf 0" 2A±20^ ' 5SiC>2 ) og er

i form av en sylinder med ca. 2 cm i diameter og 6 cm lang. Den har ca. 46 kanaler pr. cm<2>tverrsnittsareal som strekker seg gjennom hele lengden av strukturen.

En egnet montering for effektiv utnyttelse av bæreren er å omgi bæreren med en tettsittende sylindrisk hylse som vil føre mediet inn i, gjennom og bort fra bæreren på en ikke-turbulent måte. Den er fremstilt for bruk ved kjente vaske- og sterili-seringsteknikker.

Cellene

Cellene som skal dyrkes på bærerstykket tas fra en underkultur av humane forhudsfibroblaster (HFF). Cellene adskilles fra underkulturen ved anvendelse av en buffret proteolytisk enzym-oppløsning (0,25% trypsin i kalsium/magnesium-fritt fosfat-buffret saltvannsoppløsning (CMF-PBS) ved pH 7,4) etter grundig skylling av underkulturen med CMF-PBS for å fjerne alt serum-holdig vekstmedium. Enzymoppløsningen tilføres under kulturen i et volum på ca. 0,5 ml pr. 25 cm<2>overflateareal på kulturen, inkuberes ved 37°C i 10 minutter og de fraskilte cellene og oppløsningen fortynnes til minst det doble volumet ved hjelp av tilsetning av kaldt (4°C) dyrkingsmedium som inneholder 10% serum fra oksefoster (FBS).

Cellene separeres så ved sentrifugering fra suspensjonen og resuspenderes i friskt kaldt (4°C) dyrkingsmedium før bruk. Dette mediet brukes til all cellefremstilling og dyrking og henvises til som Hanks minimumessensielt medium (MEM-Hanks) som inneholder L-glutamin og NEAA, supplert medHepes-buffer (20 mM) , 0,035 g/l NaHCC>3, 100 yg/ml Garamycin og 10% FBS.

Poding av bæreren

Det steriliserte bærerstykke podes med HFF-celler fra en celle suspensjon som inneholder 1,25x10^ celler celler pr. ml av suspensjonsmedium. Mediet trenger ikke serum etter som det ganske enkelt er et redskap for å transportere cellene inn i bærerstykket for festing til celleveggene.

For å oppnå enhetlig poding, plasseres bærerstykket som tidligere er blitt gjennomskylt med sirkulerende serumfritt dyrkingsmedium, horisontalt o.g. forbindes med en flaske som inneholder podesuspensjonen ved å bruke en lengde med silikon-rør, i det bærerstykket er orientert slik at en av de fire settene med kanal-sidevegger er anbragt horisontalt. Det serumfrie medium som er til stede i bærerstykket fjernes så ved å pumpe inn i bærerstykket en like stor mengde av celle-suspens j onsme diet .

Etter en 15 minutters periode hvorunder tyngdekraftsutfelling av cellene på de horisontale kanalveggene får skje, roteres bærerstykket 90° rundt sylinderaksen og podingsfremgangsmåten gjentas for et annet sett med kanalvegger. Denne fremgangsmåte gjentas inntil alle fire sidene i de kvadratiske kanalene er blitt podet.

Dyrking av de podete cellene

Etter at poding er fullført, erstattes det serumfrie mediet i bærersykket med MEM-Hanks vekstmediet som inneholder 10% FBS og bærerstykket hensettes i flere timer. Deretter igangsettes sakte resirkulering av dyrkingsmediet gjennom bærerstykket som under den tidlige lag-fasen for cellevekst på bærerstykket har en hastighet på 0,25 cm pr. time. Denne strømningshastigheten kan økes til mellom 0,5 og 40 cm pr. minutt under den hurtige vekstfasen for cellekulturen. Kontinuerlig overvåking av vekstmedium-pH og erstatning av resirkulerende dyrkingsmedium på en periodisk basis opprettholder optimale vekstbetingelser for cellene.

Sammenligning

Effektiviteten av bærerstykket som en bærer for vevcelledyrking kan fastslås ved sammenlignende prøving med plastbærermedier slik som rulleflaske eller microbærer-bærere. Indikatorer på bærerytelse er: varigheten av lag-fasen før igangsettingen av hurtig cellevekst, celleveksthastigheten under den hurtige vekstfasen til kulturen og maksimal celletetthet som kan oppnås på bæreren.

Kvantifisering av disse variable størrelsene utføres bekvemt ved analyser av cellulært protein som er tilstede på hver bærertype ved forskjellige tidspunkter etter innokulering.

Det er kjent og akseptert av fagfolk innen teknikken å omregne celleprotein pr. cm<2>bæreroverflateareal til celler pr. cm<2>bæreroverflateareal. Det kan brukes en omregningsfaktor på 2,6x10 celler pr. mg protein som er tilstede.

Teknikker for proteinanalyse er velkjente, en egnet teknikk omfatter elueringen av celleprotein fra bæreren ved å bruke NaOH og den kvantitative bestemmelse av protein som er tilstede i eluenten via infrarød absorbsjon ved 750 nm under anvendelse av et folinfenolreagens. Denne bestemmelsen er nærmere be-

i skrevet av O.H. Lowry et al. i "Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent", J. Biol. Chem., 193, sidene 265-275

(1951) og det kan henvises dit for detaljert informasjon ved-rørende fremgangsmåten.

En sammenligning av karakteristika for kulturbærere mellom en rekke tidligere beskrevne cordierit-bærerstykker, rulleflaske-bærer av plast og microkulebærere av den type som vanligvis brukes i den tidligere kjente teknikk er utførte. Alle bærerene ble først innokulert med en suspensjon av HFF-celler i en 4 ,

i konsentrasjon pa ca. 1,25x10 pr. cm . Rulleflaskene og microbærerene ble anvendt ifølge kjent og akseptert praksis.

De maksimale celleutbyttene man oppnådde med de tre bærerene er ført opp i tabellen nedenunder.

Mens etterpodings- og hurtigvekstfåsene for de tre forskjellige kulturbærerne er ganske like, var tettheten av cellepopulasjon som lot seg oppnå på bærerstykkene minst 2 ganger høyere i alle tilfellene enn det som lot seg oppnå på plastbærerne. Dette illustrerer tydelig evnen hos bærerstykket til å dyrke opp svært tette populasjoner av celler.

EKSEMPEL 2

Dette eksemplet viser den overlegne ytelsen til sammensetningen i forbindelse med apparaturen og fremgangsmåten for celledyrking ifølge oppfinnelsen.

Det ble utført to dyrkinger med en apparatur som vist i

TM

figurene 6 og 7. Vero -celler, en epitel-apenyrecellelmje som er tilgjengelig i handelen fra American Type Culture Collection of Rockville, Maryland, ble podet i rulleflaske-kontroller og et bærerstykke med et overflateareal for cellevekst som svarte til 50 vanlige rulleflasker (50 R.B.E.) ved

i en hastighet på 20-25 millioner celler pr. RBE.

I åtte dager ble kontrollene og bæreren tilført et Delbecco's minimum Essensielt (DME) dyrkingsmedium med næringsstoffer som inneholdt 4,5 g glukose pr. liter. Dyrkingssystemet med bærer ble styrt som tidligere beskrevet, mens rulleflaske-dyrkingene ble gjort på en vanlig kjent måte. Etter denne perioden ble celleveksten høstet med en trypsin-EDTA-oppløs-ning ifølge de foretrukne fremgangsmåtene som tidligere er beskrevet for anvendelse med apparaturen ifølge figur 6. Celleutbyttene var som følger:

EKSEMPEL 3

Som i eksempel 2 ble en Vero-celledyrking foretatt på et bærerstykke ved å bruke de ovenfor nevnte teknikker for poding, dyrking og innhøsting. I dette tilfellet hadde imidlertid bæreren en ytelse på 220 RBE. På nytt ble cellene høstet etter 8 dager med de følgende resultater:

Mens oppfinnelsen er blitt beskrevet med særlig henvisning til foretrukket form, vil det være åpenbart for fagfolk innen teknikken hvor oppfinnelsen hører hjemme at, etter at oppfinnelsen er blitt forstått kan forskjellige endringer og modifikasjoner gjøres uten å avvike fra ånden og omfanget av oppfinnelsen slik det er deffinert i kravene.

i

Claims (25)

1. Immobilisert cellesammensetning, karakterisert ved at den omfatter: a) et ensartet bærerstykke med stort overflateareal som har en mangfoldighet av innbyrdes parallelle gjennomløpende kanaler, i det kanalene har vegger dannet av en medium-uopp-løslig, ikke-giftig sammensetning og bæreren har minst ca.

3 kanaler pr. cm <2> tverrsnittsareal, og b) en populasjon av plante- eller dyrevevceller festet til de porøse kanalveggene.

2. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at dimensjonene på kanalene og kanalveggene er slik at bæreren inneholder ca. 15-150 kanaler pr. cm <2> tverrsnittsareal.

3. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at bæreren har et profilforhold i området på ca. 1:100.

4. Sammensetning ifølge krav 2, karakterisert ved bæreren inneholder minst 60 kanaler pr. cm2 .

5. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at kanalveggene er dannet av et sintret, porøst keramisk materiale valgt fra gruppen bestående av cordierit, alluminiumoksyd, silisiumdioksyd, titaniumoksyd, mullit, zirkoniumoksyd, spodumen,glimmer og kombinasjoner derav.

6. Fremgangsmåte for å dyrke plante- eller dyrevevceller hvor cellene er festet til et ensartet, medium-uoppløslig, ikke-giftig bærerstykke og et næringsstoffmedium for celler får strømme forbi cellene, karakterisert ved at a) bæreren består av et ensartet stykke med en mangfoldighet av parallelle gjennomløpende kanaler, b) kanalene har vegger egnet for cellefesting, og c) bæreren har minst ca. 3 kanaler pr. cm <2> tverrsnittareal.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at næringsstoffmediet for cellene overvåkes konstant med hensyn på næringsstoff- og metabolitnivåer og justeringer gjøres hele tiden med mediet for å optimalisere næringsstoffnivåene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at kanalveggene er danjiet av en sammensetning valgt fra gruppen bestående av cordierit, alluminiumoksyd, silisiumdioksyd, titaniumoksyd, mullit, zirkoniumoksyd, spodumen, glimmer og kombinasjoner derav.

9. Apparat for å dyrke plante- eller dyrevevceller hvor cellene er festet til minst en mediumuoppløslig, ikke-giftig bærer og har et hjelpemiddel for å tilføre en strøm av næringsstoffmedium for celler, karakterisert ved at: a) bæreren består av en ensartet bærerstykkestruktur som omfatter en mangfoldighet av innbyrdes parallelle gjennomløpende kanaler, b) kanalene har vegger egnet for cellefesting, c) bæreren har minst ca. 3 kanaler pr. cm <2> tverrsnittsareal, og d) et hjelpemiddel er tilveiebragt for å styre næringsstoffmediet for cellene forbi de festete cellene.

10. Apparatur ifølge krav 9, karakterisert ved at den porøse sammensetningen er valgt fra gruppen bestående av cordierit, alluminiumoksyd, silisiumdioksyd, titaniumoksyd, mullit, zirkonium, spodumen, glimmer og blandinger derav.

11. Apparatur ifølge krav 9, karakterisert ved at et hjelpemiddel er tilveiebragt for kontinuerlig overvåking av næringsstoff- og metabolitnivåer og å justere næringsstoffnivåene i mediet til optimale nivåer.

12. Fremgangsmåte for å montere en immobilisert cellesammen setning med et ensartet bærerstykke med indre dyrkingsoverflater, overføringsmidler for innløp og utløp for enhetlig strømning av næringsstoffmedium for cellene inn i og ut av bæreren, og et hjelpemiddel for å styre den ikke-turbulente mediumstrømmen gjennom bæreren, karakterisert ved å: a) velge ut en glassinnfatning som er dimensjonert og utformet; i) til å være komplementær i form i forhold til bæreren, ii) til å muliggjøre innføring av bæreren i innfatningen og iii) til å muliggjøre innføring av innløps- og utløps-midlene for overføring av strømmen inn i innfatningen, b) innføre bæreren i innfatningen, c) innføre overføringsmidlene i innfatningen slik at de er plassert ved innløp- og utløpsendene av bæreren, og d) varme opp innfatningen hvorved glassinnfatningen krymper rundt og fester bæreren til overføringsmidlene.

13. Immobilisert cellesammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at bæreren har minst to deler, i det hver del er dimensjonert og utformet for å rettes inn mot og orienteres i forhold til sin nabodel slik at et dyrkingsmedium kan strømme gjennom bæreren.

14. Apparatur ifølge krav 9, karakterisert ved at bæreren har minst to deler, i det hver del er dimensjonert og utformet for å rettes inn mot og orienteres i forhold til sin nabodel slik at et dyrkingsmedium kan strømme gjennom bæreren.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at a) bæreren består av et ensartet stykke omsluttet av et krympbart materiale med en mangfoldighet av parallelle gjennomløpende kanaler og b) midler for overføring av en strøm av næringsstoffmedium for celler er anordnet ved endene av bærerstykket som skal fattes om av det krympbare materiale når det er krympet.

16. Apparatur ifølge krav 9, karakterisert ved at bærerstykket er omgitt av et krympbart materiale for å styre næringsstoffmediet for celler forbi de festete cellene.

17. Fremgangsmåte for å montere en immobilisert cellesammensetning som har et ensartet bærerstykke med indre dyrkings-flater for celler, innløps- ag. utløps-overføringsmidler for enhetlig strømning av næringsstoffmedium for celler inn i og ut av bæreren, og et hjelpemiddel for å styre en ikke-turbulent mediumstrøm gjennom bæreren, karakterisert ved a: a) velge en krympbar form dimensjonert og utformet: i) til å være komplementær i form i forhold til bæreren, ii) til å muliggjøre innføring av bæreren i formen, iii) til å muliggjøre innføring av innløps- og utløps-overf øringsmidler , b) innføre bæreren i formen, c) innføre overføringsmidlene i formen ved enten den ene eller den andre enden av den innførte bærer, og d) få formen til å krympe rundt og feste overgangsmidlene og bæreren, i det det dannes en hylse hvor mediet vil strømme ikke-turbulent inn i, gjennom og ut av montasjen.

18. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at bæreren er belagt med en glasur.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at bæreren er belagt med en glasur.

20. Apparatur ifølge krav 9, karakterisert ved at bæreren er belagt med en glasur.

21. Fremgangsmåte for å pode festbare plante- eller dyrevevceller på minst en mediumuoppløslig, ikke-giftig bærer, karakterisert ved å: a) oversvømme bæreren med et dyrkingsmedium som inneholder dyreserum, b) plassere bæreren i en langsgående horisontal stilling, c) inokulere mediet med en enhetlig cellesuspensjon som sirkuleres over bæreren, d) la cellene felles ut på bæreren i en tilstrekkelig lang tid til å gi festing av cellene til de horisontale bærerover-flater, e) resirkulere cellemediet over bæreren, f) endre orienteringen av bæjieren slik at et ikke-eksponert overflateareal plasseres i en horisontal stilling, og g) gjenta utfellings-, resirkulerings-, inokulerings- og reorienteringstrinnene inntil alle bæreroverflåtene er blitt eksponert mot utfellende celler mens de er i en horisontal stilling.

22. Fremgangsmåte for å pode festbare plante- eller dyrevevceller på minst en mediumuoppløslig, ikke-giftig bærer, karakterisert ved å: a) oversvømme bæreren med et dyrkingsmedium, b) plassere bæreren i en langsgående horisontal stilling, c) inokulere mediet med en enhetlig cellesuspensjon som sirkuleres over bæreren, d) la cellene falle ut på bæreren i en tilstrekkelig lang tid til å gi festing av cellene til de horisontale bæreroverflåtene, e) resirkulere cellemediet over bæreren, f) gjenta inokuleringstrinnet, g) endre orienteringen av bæreren slik at et ikke-eksponert overflateareal plasseres i en horisontal posisjon, og h) gjenta utfellings-, resirkulerings-, inokulerings- og reorienteringstrinnene inntil alle bæreroverflåtene er blitt eksponert mot utfellende celler mens de er i en horisontal posisj on.

23. Fremgangsmåte for å høste festet plante- eller dyrevevceller fra en bærer, karakterisert ved å: a) fjerne oppløslige faktorer i dyrkingsmediet som kan inhibere dugeligheten til disassosieringsmidler, b) behandle cellene som skal høstes med disassosieringsmidler, d.v.s. reagenser som er i stand til å bryte opp celle-celle-og celle-overflate-bindinger, i et tidsrom som er tilstrekkelig til å bevirke den ønskete grad av oppbryting, og c) tilføre en pulset skjærkraft på de behandlete cellene ved å sirkulere væskemediet.

24. Fremgangsmåte for å bestemme graden av metning av festete plante- og dyrevevceller på ejn. bærer, karakterisert v e d å: a) først overvåke glukose- og oksygenforbrukshastighetene hos en voksende cellepopulasjon inntil metning er oppnådd for å etablere en cellevekstprofil, b) beregne graden av cellemetning i etter hverandre følgende celledyrkinger ved å overvåke endringshastighetene i glukose-og oksygenforbrukshastighetene, og sammenligne profilen med den overvåkete endringshastighet på et bestemt tidspunkt.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at metning av bæreren med festete celler indikeres når endringshastighetene begynner å flate ut.