JP2022538359A - 単一細胞イメージングをｒｎａトランスクリプトミクスと関連付けるためのシステムと方法 - Google Patents

単一細胞イメージングをｒｎａトランスクリプトミクスと関連付けるためのシステムと方法 Download PDF

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Abstract

【解決手段】単一細胞イメージングをRNAトランスクリプトミクスと関連付けるためのシステムと方法。複数の単一細胞は、その表面に結合された複数のオリゴヌクレオチドを有するマイクロビーズとともに、マイクロウェル内に単離される。各オリゴヌクレオチドは、そのビーズに固有の細胞識別光学バーコード配列と、細胞溶解後のRNAキャプチャー用のRNA結合配列とを含む。このシステムは、細胞識別光学バーコードに相補的で光学的に標識された複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブを、マイクロウェルアレイ上に流し、複数のプローブに応答してマイクロウェルの画像を取得するようにも構成される。システム及び複数の固有の細胞識別光学バーコード及び相補的光学的ハイブリダイゼーションプローブは、マイクロウェルアレイ上に存在する細胞の表現型イメージングと単一細胞全トランスクリプトームシーケンシングとの間のリンクを容易にする。【選択図】図１Ａ

Description

（優先権主張）
この出願は、2019年6月27日に出願された米国仮出願番号62/867,830の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
本明細書は、一般に、単一細胞イメージング(single cell imaging)を全ゲノムRNA転写プロファイリングに関連付けるための自動化されたシステム及び方法に関する。
マイクロ流体力学(microfluidics)とcDNAバーコーディング（barcoding）の最近の進歩により、単一細胞RNAシーケンス（RNA-Seq（scRNA-seq））のスループットが劇的に向上した[1-5]。ただし、以前の又は拡張性の低い手法[6-8]とは異なり、これらの新しいツールは、個々の生細胞(live cell)から得られた表現型情報をそれらの発現プロファイルに直接関連付ける簡単な方法を提供しない。それにもかかわらず、scRNA-シーケンスのマイクロウェルベース（microwell-based）の実装は、生細胞イメージング、蛍光抗体法、タンパク質分泌アッセイなどを含む、様々な表現型測定と互換性がある[3、9-12]。これらの方法は、微細加工されたチャンバー（microfabricated chamber）のアレイに個々の細胞とバーコード付きRNAキャプチャービーズを同時にカプセル化することを含む。バーコード付きビーズはマイクロウェルにランダムに分布しているため、マイクロウェルで測定された表現型を対応する発現プロファイルに直接関連付けることはできない。
本開示は、単一細胞イメージングデータを全ゲノムRNA転写プロファイリングと関連付けるための自動化されたシステム及び方法を提供する。
本明細書は、単一細胞イメージングデータとRNAトランスクリプトミクス（transcriptomics）の関連付けを可能にする、自動化された単一細胞イメージング及びサンプル調製の複数の方法とシステムを説明する。例示的なシステムは、流体（fluidic）サブシステム、熱的（thermal）サブシステム、及びマイクロウェルアレイを保持及びスキャンするように構成された電動ステージを含むイメージングサブシステムを含む機器アセンブリを備える。システムは、前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムを含み、前記制御サブシステムは複数の操作を実行するように構成されている。この複数の操作は、前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセット（subset）が前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し、及び、前記マイクロウェルアレイ内の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得することを含む。制御サブシステムは、前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列（cell identifying optical barcode sequence）を有するマイクロビーズ及びRNA結合配列を、前記マイクロウェルアレイ上に流すように構成され、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在する。制御サブシステムは、前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ（cell lysis buffer）、及びRNAライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すように構成されている。制御サブシステムは、前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブ（optical hybridization probe）のＮ個のプールの第１を流し、及び、そこに付着した前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズするように構成される。制御サブシステムは、各位置について、イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得するように構成され、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用される。制御サブシステムは、前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得するように構成される。制御サブシステムは、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、各位置について、第２の画像を使用して前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶するように構成される。
例示的な方法は、単一細胞イメージングデータをRNAトランスクリプトミクスと関連付けるための自動化方法を含む。前記方法は、流体サブシステムを使用して複数の細胞をマイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に複数の単一の細胞として存在し；マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得すること；前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列及びRNA結合配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びRNAライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、そこに付着した前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記複数のビーズに、前記複数のプローブをハイブリダイズすること；を含む。前記制御サブシステムは、前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記第２の画像を用いて前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；並びに、前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータ（sequencing data）を受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること；を行うように構成される。
本明細書で説明されている複数のコンピュータシステムは、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、又はそれらの任意の組み合わせで実装することができる。いくつかの例では、複数のコンピュータシステムは、コンピュータのプロセッサによって実行されると、そこに格納したコンピュータ読み取り可能媒体を使用してステップを実行するようにコンピュータを制御する、コンピュータ実行可能命令を実装され得る。適切なコンピュータ読み取り可能媒体の例は、ディスクメモリデバイス、チップメモリデバイス、プログラマブルロジックデバイス、及び特定用途向け集積回路などの非一時的なコンピュータ読み取り可能媒体が含まれる。さらに、本書に記載の主題を実施するコンピュータ読み取り可能媒体は、単一の装置又はコンピューティングプラットフォーム上に配置され得るか、又は複数の装置又はコンピューティングプラットフォームにわたって分散され得る。
例示的な方法が、単一細胞の光学的表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定するために提供される。前記方法は、システムを初期化することを含み、前記システムは、流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、ここで前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み；前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムを複数の操作を実行するために用いる。前記複数の操作は、前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得し、及び、１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴を測定すること；前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列及びRNA結合配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びRNAライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；並びに、前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること、を有する。前記方法は、前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴と、前記第１の画像のそれぞれに関連する核酸シーケンシングデータとの間の関係の表現（representation）を生成することを含み、ここで、前記単一細胞の表現型の特徴と、前記関連するシーケンシングデータとの間の相関は、単一細胞の光学的表現型と、その単一細胞のトランスクリプトミクスに基づく細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する。
本開示の自動化されたシステム及び方法は、複数のRNAライブラリの調製に加えて、複数の核酸シーケンシングライブラリ(sequencing library)の調製に使用することができる。例えば、細胞識別光学バーコード配列及び細胞核酸をキャプチャーするためのプライマー配列を有する複数のマイクロビーズを、マイクロウェルアレイ上に流すことができる。前記プライマー配列は、RNA、mRNA、及び非コードRNAをキャプチャーするためのオリゴ（dT）；あらゆるDNA若しくはRNAをキャプチャーするためのランダム配列；又はDNA遺伝子座若しくはRNA転写物を標的とする特定の配列、であり得る。このように、自動化されたシステムは、単一細胞イメージングを固有の光学バーコード読み出しと関連付け、核酸ライブラリを調製するために提供される。同様に、単一細胞イメージングデータを核酸シーケンシングデータに関連付けるための自動化された方法が提供される。さらに、単一細胞の光学的表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定するための方法が提供され、ここで、前記単一細胞の表現型の特徴と、前記関連するシーケンシングデータとの間の相関は、単一細胞の光学的表現型と、その単一細胞の核酸配列に基づく細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する。
単一細胞画像を固有の(unique)光学バーコード読み出しと関連付け、複数のRNAライブラリを調製するための例示的な自動システムを示す図である。 単一細胞画像を固有の光学バーコード読み出しと関連付け、複数のRNAライブラリを調製するための例示的な自動システムを示す図である。 単一細胞画像を固有の光学バーコード読み出しと関連付け、複数のRNAライブラリを調製するための例示的な自動システムを示す図である。 システムを実装するための例示的な機械装置を示す図である。 筐体（enclosure）を備えた装置の3Dモデルを示す図である。 内部コンポーネントを説明するためにサイドカバーが取り外された装置の実装例を示す図である。 イメージングサブシステムの例の3Dモデルを示す図である。 熱的サブシステムの例の上から見た図である。 試薬カートリッジと流体マニホールド（manifold）との間のインターフェースを含む例示的なサブシステムのブロック図である。 単一細胞画像を固有の光学バーコード読み出しと関連付け、細胞の表現型データを全ゲノムRNA転写配列データ(sequence data)と関連付けるために自動化システムを使用して複数のRNAライブラリを調製するための例示的な方法のフロー図である。 単一細胞画像を固有の光学バーコード読み出しと関連付け、細胞の表現型データを全ゲノムRNA転写配列データと関連付けるために自動化システムを使用して複数のRNAライブラリを調製するための例示的な方法のフロー図である。 システムによって実行され得る複数のプロセスを示す図である。 システムによって実行され得る複数のプロセスを示す図である。 システムによって実行され得る複数のプロセスを示す図である。 システムによって実行され得る複数のプロセスを示す図である。 PCRハンドル、細胞識別光学バーコード、固有の分子識別子、及びオリゴ（dT）RNA結合配列を有する複数のオリゴヌクレオチドが付着した複数のマイクロビーズの設計の例を示す概略図である（Ａ上部）。 細胞識別光学バーコードにハイブリダイズ（hybridize）された相補的光学的ハイブリダイゼーションプローブの２つの異なる例を示す概略図である（Ｂ中央）。 細胞識別光学バーコードにハイブリダイズ（hybridize）された相補的光学的ハイブリダイゼーションプローブの２つの異なる例を示す概略図である（Ｃ下部）。 細胞ローディング（loading）（10,000マイクロウェルアレイ内に～1000細胞）、ロードされた複数の細胞の明視野検出と蛍光イメージング、ビーズローディング（10,000マイクロウェルアレイ内に～8,500ビーズ）、及び次のアレイの個々のマイクロウェル内での細胞溶解（cell lysis）を含む、本開示の自動システムの複数のデータと画像を示す図である。 アレイの個々のマイクロウェル内での細胞溶解の複数の画像と、それに続く蛍光細胞溶解物の除去を示す洗浄と、続いて、オンデバイス ワークフロー（on-device workflow）にかけられた複数のビーズと複数のネガティブコントロールビーズ（オンデバイス ワークフローにかけられなかった複数のビーズ）から抽出されたビーズフリーPCR産物のキャピラリー及びゲル電気泳動分析を示すグラフと、を示す図である。 自動化された細胞イメージング及びサンプル調製のための例示的な方法のフロー図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、セグメント化及び標識された複数のマイクロウェルの二値画像を示す図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による複数のマイクロウェル内の複数の細胞の明視野画像を示す図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、生体染色（live-stain）された複数の細胞の蛍光画像を示す図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、細胞溶解後の図１０Ｃの複数のマイクロウェルの蛍光画像を示す図である。 PCRハンドル、3つの別々の部分（NN、NN、及びNNNN）に分割された8ヌクレオチドの固有の分子識別子（UMI）、細胞バーコードS、細胞バーコードQ、及びオリゴ(dT)RNA結合配列を含む複数のマイクロビーズに付着した、複数のオリゴヌクレオチドの設計例を示す概略図であり、ここで、細胞バーコードS及び細胞バーコードQの固有の組み合わせは、本書で開示される主題の１又はそれ以上の実施形態による、各ビーズの細胞識別光学バーコードを構成する。 、2つの8ヌクレオチド配列（それぞれが96配列のプール(pool)のメンバーである細胞バーコードS及び細胞バーコードQ）を含む、オリゴヌクレオチドが付着した複数のマイクロビーズのセットのスプリットプール（split-pool）、固相合成の例を示す概略図であり、ここで、本書で開示される主題の１又はそれ以上の実施形態による、２回のスプリットプール後の複数の配列の固有の組み合わせは、合計962 = 9,216個の固有の細胞識別光学バーコードを構成する。 本書で開示される主題の１又はそれ以上の実施形態による複数のシーケンシャル（sequential）ハイブリダイゼーションプローブプールの合成を示す概略図である。 本開示の自動化システムを使用して実施された単一細胞RNA-seq実験における、各細胞識別バーコードのヒト及びマウスのアラインされた複数の転写分子（transcript molecule）の数を示す散布図であり、複数の細胞識別バーコードの大部分は１つの種に強く関連しており、一部は両方に関連しており、複数の細胞がビーズと一緒にカプセル化されていることを示す。 本開示の自動化システムを使用した単一細胞RNA-seq実験からの、ヒト又はマウスの複数のトランスクリプトームアノテーション（transcriptome annotation）のいずれか（分子の少なくとも70％がヒト又はマウスのトランスクリプトームのいずれかにアラインしている）に関連付けられた細胞識別バーコードについて、細胞ごとに検出された転写分子の数の分布を示すバイオリン図である。 本開示の自動化システムを使用した単一細胞RNA-seq実験からの、ヒト又はマウスの複数のトランスクリプトームアノテーション（annotation）のいずれか（分子の少なくとも70％がヒト又はマウスのトランスクリプトームのいずれかにアラインしている）に関連付けられた複数の細胞識別バーコードについて、細胞ごとに検出された遺伝子の数の分布を示すバイオリン図である。 本開示の自動システムのアレイの個々のマイクロウェルに存在する複数のビーズ上の、相補的細胞識別光学バーコードにハイブリダイズされた8塩基のCy3標識及び8塩基のCy5標識の光学プローブの生の蛍光画像及び解析された蛍光画像を比較する画像を示す図である。 蛍光ハイブリダイゼーションイメージングのサイクルの画像を示す図であり、8塩基のCy5標識オリゴヌクレオチド及び8塩基のCy3標識オリゴヌクレオチドのプールされたセットが複数のビーズと共にロードされてアレイに導入され、本開示の自動化システムにおける各ビーズ上の第１及び第２の配列をそれぞれプローブするため、チャンネル２及び３のそれぞれで画像化された。 各ビーズ上の、共に細胞識別光学バーコード配列を形成する２つのバーコード配列を識別するため、蛍光ハイブリダイゼーションイメージングのサイクルのソフトウェア解析の画像を示す図である。8塩基のCy5標識オリゴヌクレオチド及び8塩基のCy3標識オリゴヌクレオチドからなる複数の相補的光学プローブのプールされたセットが、複数のビーズと共にロードされてアレイ装置に導入され、本開示の自動化システムにおける各ビーズ上で、それぞれ第１及び第２のバーコード配列をプローブするためにチャンネル２と３のそれぞれで画像化された。複数のプールされたプローブのこの混合物のソフトウェア解析は、検出された蛍光がチャンネル２に対して「陽性」、チャンネル３に対して「陽性」、又は両方に対して陽性であることを示す。 「ビーズごとの」復号化戦略で実行することができる複数の細胞識別光学バーコードの光学的復号化を示す予言的な例の概略図である。スケールバー：本開示の１又はそれ以上の実施形態による、５０μｍ（マルチウェル画像）及び１０μｍ（シングルウェル画像） 本開示の１又はそれ以上の実施形態による「ビーズごと」と「サイクルごと」の複数の復号化方法を比較して、複数の細胞画像に正常にリンク（link）できる複数のscRNA-seq発現プロファイルの割合を示す予言的な例の棒グラフの図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による混合種実験において、異なる配列読み取り(read)深度で細胞ごとに検出可能な分子数の分布を示すバイオリン図における、分子キャプチャー効率を示す予言的例のグラフの図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による混合種実験において、異なる配列読み取り深度で細胞ごとに検出可能な遺伝子数の分布を示すバイオリン図における、分子キャプチャー効率を示す予言的例のグラフの図である。 ヒト及びマウスの生体染色の蛍光強度比によって示されるように、一意にアラインされたヒト及びマウスの、マルチプレット（multiplet）の除去前に画像にリンクされた各細胞識別光学バーコードの読み取りの数により、本開示の１又はそれ以上の実施形態に従って得られるリンク精度（linking accuracy）を示す予言的例の散布図である。 ヒト及びマウスの生体染色の蛍光強度比によって示されるように、一意にアラインされたヒト及びマウスの、マルチプレット（multiplet）の除去後に画像にリンクされた各細胞識別光学バーコードの読み取りの数により、本開示の１又はそれ以上の実施形態に従って得られるリンク精度を示す予言的例の散布図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、膠芽腫におけるすべてのリンクした（linked）細胞の単一細胞階層的ポアソン因子分解（single cell hierarchical Poisson factorization）（scHPF）分析からの細胞スコア行列のUMAP埋め込みを示す、scRNA-seq発現プロファイルのクラスタリングの予言的な例のプロットにおける、膠芽腫の細胞の光学的及び転写（transcriptional）表現型の対の測定を示す図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、scHPF分析からの細胞系統（cell lineage）因子のスコアによって着色された細胞系統因子のスコアを示す（各細胞系統因子のマーカー遺伝子がリストされている）、scRNA-seq発現プロファイルのクラスタリングの予言的な例のプロットにおける、膠芽腫の複数の細胞の光学的及び転写表現型の対の測定を示す図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、16個の細胞イメージング特徴（cell imaging feature）のzスコア値を含むイメージングメタ特徴（imaging meta-feature）の識別を示す予言的な例のヒートマップ、及び教師なし階層的クラスタリングからの３つの特徴クラスター（feature cluster）、細胞サイズ、形状、及びカルセイン染色強度を示す樹状図における、膠芽腫の複数の細胞の光学的及び転写表現型の対の測定を示す図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、細胞イメージング表現型の不均一性と、各フェノグラフ（Phenograph）細胞クラスターにおけるイメージングメタ特徴の分布とを示す、scRNA-seq発現プロファイルのクラスタリングを示す予言的な例の箱ひげ図における、膠芽腫の細胞の光学的及び転写表現型の対の測定を示す図である。 本開示の１又はそれ以上の実施形態による、複数の細胞イメージングクラスターによって着色される複数の悪性細胞の２次元拡散マップの予言的な例のプロットに示されるように、イメージング特徴をクラスター化するだけで膠芽腫の２つの主要な腫瘍細胞系統を区別できるという点で、光学的表現型と転写系統の関係を示す図である。 プロセスの様々な側面を制御するためのGUIの例のスクリーンショットを含む図である。 GUIの例の別のスクリーンショットの図である。 そのスキャンのそのチャンネルのイメージングパラメータを設定するため、蛍光チャンネルの１つにおけるマイクロウェルアレイのライブ画像を表??示する例示的なGUIのスクリーンショットの図である。 細胞ローディング操作のための様々なステップ及びそれらのパラメータを設定するための例示的なGUIのスクリーンショットの図である。 マイクロウェルアレイのスキャンの明視野イメージング結果を表示するための例示的なGUIのスクリーンショットの図である。 マイクロウェルアレイのスキャンの蛍光イメージング結果を表示するための別のGUIのスクリーンショットの図である。
単一細胞分離及び次世代シーケンシング（NGS）サンプル調製用の市販のシステムの中で、単一細胞画像を固有の光学バーコード読み出しと関連付け、単一細胞表現型データをRNAトランスクリプトミクスと関連付けることを可能にする単一細胞RNAライブラリを調製できるものは存在しない。本書は、例えば4～5時間の実行あたり数千の単一細胞の、自動化された単一細胞、全トランスクリプトームRNAライブラリ調製と組み合わせられた高品質のマルチチャンネル蛍光イメージングを可能にする複数の方法とシステムについて記述する。このシステムは、単一細胞の全トランスクリプトームシーケンシング（「RNA-Seq」）データ品質メトリクス（data quality metrics）を確立できる。動作中、システムは、単一細胞画像の取り込み、単一細胞画像と対応する固有の光学バーコード読み出し（光学バーコード配列を識別する固有の細胞に基づく）との関連付け、及び単一細胞の光学的表現型解析及び発現シーケンシング又はSCOPESeqと称される、次世代シーケンシング（NGS）サンプル調製方法を自動化する。
本開示の自動細胞イメージング及びRNAライブラリサンプル調製システムにおいて、複数の単一細胞は、その表面に結合された複数のオリゴヌクレオチドを有するマイクロビーズとともに、マイクロウェルアレイの個々の反応チャンバー内に単離される。各オリゴヌクレオチドは、そのビーズに固有の細胞識別光学バーコード配列と、細胞溶解後のRNAキャプチャー（capture）用のRNA結合配列とを含む。「細胞識別光学バーコード配列」は、本明細書では「細胞識別光学バーコード」とも同じ意味に称される。細胞識別光学バーコード及びRNA結合配列を有するマイクロビーズは、本明細書では、「mRNAキャプチャービーズ」又は「RNAキャプチャービーズ」又は「マイクロビーズ」又は場合によっては「ビーズ」とも同じ意味に称される。複数のマイクロビーズ上のオリゴヌクレオチドは、シーケンシング用のアダプター配列（adapter sequence）（例えば、イルミナプラットフォーム（Illumina platform）上のシーケンシング用）（さもなければ「PCRハンドル」とも呼ばれる）を含むことができる。本開示の細胞識別光学バーコードを有するマイクロビーズ及び相補的光学的ハイブリダイゼーションプローブは、2016年5月26日に出願され、WO2016/191533として公開された米国特許出願PCT/US2016/034270、及び2018年11月27日に出願され、WO2019/104337として公開された米国特許出願PCT/US2018/62650に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このシステムは、細胞識別光学バーコードに相補的でフルオロフォアなどの光学ラベルで標識された複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブを、マイクロウェルアレイ上に流し、複数のプローブに応答して複数のマイクロウェルの画像を取得するように構成される。システム及び複数の固有の細胞識別光学バーコード及び相補的光学的ハイブリダイゼーションプローブは、マイクロウェルアレイ上に存在する細胞の表現型イメージングと単一細胞全トランスクリプトームシーケンシングとの間のリンクを容易にする。
図１Ａ～１Ｃは、単一細胞の単離及びサンプル調製のための例示的なシステム１００の図である。システム１００は、表現型的に複数の単一細胞を特徴付けるとともに、シーケンシングのために核酸内容物をキャプチャー及び調製するため使用されることができる。RNAキャプチャービーズ及び複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブからの固有の光学バーコード読み出しの使用を通して、システム１００は、単一細胞によって発現される、生細胞画像とRNAの配列との間の直接のリンクを提供することができる。
図１Ａは、システム１００の概観図である。システム１００は、コンピュータサブシステム１０２、機器アセンブリ１０４、実験環境１０６（例えば、複数の電源及び環境制御サブシステムなどの１又はそれ以上の実験装置）、及びユーザ１０８を含む。機器アセンブリ１０４は、マイクロウェルアレイ１１２を収容するための任意のアダプタプレートを含む。
通常、ユーザ１０８は、マイクロウェルアレイ１１２を任意のアダプタプレートにロードし、それをシステム１００内に配置する。システム１００は、入力リザーバから複数の細胞をマイクロウェルアレイ１１２に流し、複数の細胞が個々のマイクロウェルに収容されることを可能にする。システム１００は、スキャニング、画像解析、及びRNAライブラリサンプル調製プロトコルを提供する。サンプル調製は、流体及び熱的サブシステムの制御を含むことができる。
図１Ｂは、コンピュータサブシステム１０２のブロック図である。コンピュータサブシステム１０２は、少なくとも１つのプロセッサ１２０、メモリ１２２、プロセッサ１２０及びメモリ１２２を使用してコンピュータプログラムとして実装されるコントローラ１２４、及びグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）１２６を含む。例えば、コンピュータサブシステム１０２は、モニタ及びキーボード及びマウスを備えたデスクトップコンピュータであり得るか、又はコンピュータサブシステム１０２は、ラップトップ又はタブレットコンピュータ又は任意の他の適切な装置であり得る。コンピュータサブシステム１０２は、例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）ケーブルによって、機器アセンブリ１０４に操作可能に結合されている。いくつかの例では、コンピュータサブシステム１０２が機器に統合されている。
コントローラ１２４は、それぞれが単一細胞を含む複数のマイクロウェルを識別するようにプログラムされている。コントローラ１２４は、複数のマイクロウェル内の複数の細胞の画像における他の関連する特徴を識別するようにプログラムされることができる。
図６Ａ～６Ｂを参照して以下に説明するように、コントローラ１２４は、システム１００にSCOPESeqプロセスを自動化させるようにプログラムされている。例えば、コントローラ１２４は、アレイ１３０内の各マイクロウェルの記録を格納し、及び、マイクロウェルの１又はそれ以上の画像と、細胞の表現型情報のようなマイクロウェル内容物の識別特徴（identifying feature）と、相補的な光学的ハイブリダイゼーションプローブの存在下でマイクロウェルに存在するマイクロビーズに関連する光学バーコードの読み出し（例えば、蛍光シグナル）と、を各マイクロウェル記録に関連付けするようにプログラムすることができる。
図１Ｃは、機器アセンブリ１０４のブロック図である。機器アセンブリ１０４は、マイクロウェルアレイ１３０上の個々のマイクロウェル１３０を画像化するための様々な構成要素を含むことができる。例えば、機器アセンブリ１０４は、パワーブレイクアウトボード（power breakout board）１３８及び様々なモータを制御するためのモータ制御システム１３２を含むことができる。モータ制御システム１３２は、例えば、コントローラ１２４が機器アセンブリ１０４の様々な構成要素を制御又は処理することを可能にするTTL及び複数のシャッター機能を含むことができる。
機器アセンブリ１０４は、デジタルカメラ１４０又は他の適切な画像化(imaging)装置、通信ハブ（例えば、USBハブ１４２）、蛍光発光ダイオード（LED）エンジン１４４、及びライトガイド１４６を含むことができる。ライトガイド１４６は、LEDエンジンから顕微鏡へ蛍光励起光を伝える。代替の構成は、光ファイバーバンドル、又はLEDエンジンと顕微鏡光学トレイン（optical train）との直接結合を含む。
蛍光LEDエンジン１４４は、ライトガイドアダプタ１４６を介してマイクロウェルアレイ１１２を照明するように構成された複数の狭帯域LEDを含むことができる。
機器アセンブリ１０４は、電動XYステージ１４８、及び顕微鏡対物レンズ１５２を移動するように構成されたオートフォーカスモータ１５０を含む顕微鏡サブシステム（例えば、内部（internal）倒立顕微鏡）を有する。通常、カメラ１４０及び蛍光LEDエンジン１４４及び顕微鏡サブシステムは、落射蛍光構成で配置される。機器アセンブリ１０４は、イメージング中にマイクロウェルアレイ１１２を照明するための明視野LED１５８を含む。
機器アセンブリ１０４は、マイクロ流体サブシステム及び熱的サブシステム１５２を含む。熱的サブシステム１５２は、例えば、XYステージ１４８上のステージヒータ、及びステージヒータを制御するための熱制御システムを含むことができる。マイクロ流体サブシステムは、ポンプ、圧力コントローラ、及び流体マニホールドを含む。マイクロ流体サブシステムは、例えば、試薬カートリッジから試薬を注ぐための６方向バルブ及び２４試薬（24-reagent）バルブのような、様々な適切なバルブを含む。図６Ａ～６Ｂを参照して以下でさらに説明されるように、コントローラ１２４は、マイクロ流体サブシステム及び熱的サブシステムを制御してSCOPE-seqプロセスを自動化するようにプログラムされている。
いくつかの例では、マイクロ流体サブシステムは、SCOPEseqプロセスの生化学的反応を満たすために、例えば、１８の異なる試薬のマイクロ流体フロー制御のために構成される。さらに、設定値の5μL/分以内に制御される様々な流量は、例えば10μL/分から200μL/分まで使用されることができる。
マイクロ流体サブシステムは、有機性油から水性油、フッ素化油（fluorinated oil）に至るまでの様々な試薬と互換性のある、正確で単純な流量測定機能のために構成された流量ユニットを含むことができる。ユニットは、マイクロ流体サブシステム全体で正確な流量制御を提供する流量コントローラへの測定フィードバック機能を持つことができる。
マイクロ流体サブシステムは、細胞の剪断応力のない流体の動きを容易にするために、パルスのない流れのために構成されたフロー制御ユニットを含むことができる。このユニットは、試薬の切り替えの間でミリ秒の応答時間をとることができ、かつ気泡のない流体の流れを持つことができる。
マイクロ流体サブシステムは、例えば２セットの固有のバルブユニットである複数のバルブユニットを含むことができる。第１に、マイクロチップに流入する様々な試薬を切り替えるため、第２の多方向バルブと多重化できる多方向双方向バルブが使用されることができる。これらのスイッチユニットは、新しい試薬の流れに迅速に適応するためにミリ秒の応答時間を持つ。これにより、フッ素化オイルによるマイクロウェルシーリングに適切なフロー応答が提供される。第２に、試薬をマイクロチップの出力ポートからサンプル収集又は廃棄リザーバに向けるため、多方向バルブが使用されてもよい。複数の多方向バルブユニットはまた、静水圧の流れを排除し、画像化と加熱に必要な加圧されたフローセル（flow cell）を提供する。
マイクロ流体サブシステムは、複数の加圧試薬リザーバを含むことができる。例えば、複数の試薬の適切なシーリングを確実にするだけでなく、マイクロ流体サブシステムへの流体の流れのための複数の十分な加圧環境を維持する複数の試薬カートリッジが使用されることができる。
熱的サブシステムは、様々な生化学的アッセイに適切な条件を促進するために必要なときに一定の温度制御を提供するために、ワークフロー全体で加熱及び冷却できる１又はそれ以上のペルチェユニットを含むことができる。いくつかの例では、熱的サブシステムは、適切なアッセイ温度を設定及び制御するためのペルチェユニットに対し、適切なPIDフィードバックを容易にするために、例えば１℃の精度で、比例、積分、微分（PID）熱制御ユニットを含む。いくつかの例では、熱的サブシステムは、例えば、図５Ａに示されるように、XYステージと一体化したステージヒータを含む。熱的サブシステムは、例えば、溶解を加速するため、RT及びEXO1プロセスを促進するために使用されることができ、場合によっては、光学プローブハイブリダイゼーションの融解（melting）を促進するために使用されることができる。
図２は、システム１００の機械的装置２００の例を示している。装置２００は、蛍光エンジン２０２、アダプタプレート２０４、アレイステージ２０８、ステージヒータ２０６、及びXYＺステージ制御システム２２４を含む。装置２００は、ポンプ２１０及び圧力コントローラ２１２を含む。装置２００は、明視野モジュール２１４、流体制御装置２１６、及び試薬カートリッジ２１８を含む。装置２００は、カメラ２２０及び光学スタック（optical stack）２２２を含む。装置２００は、電子機器（例えば電源）及び流体制御装置２２６を含む。
図３Ａは、筐体を備えた装置２００の3Dモデルを示している。図３Ｂは、内部コンポーネントを説明するためにサイドカバーが取り外された装置２００の実装例を示している。
図４は、例示的なイメージングサブシステム４００の3Dモデルを示す。イメージングサブシステム４００は、XYステージ４０２、対物レンズ４０４、及びフィルタセット４０６を含む。イメージングサブシステム４００は、液体光ガイド入口４０８、フォーカスドライブ４１０、及びカメラ４１２を含む。イメージングサブシステム４００は、LEDエンジン４１４を含み、それは例えば、LEDコントローラ、複数のLED、組み合わせ光学系（combining optics）、及び光ガイド出口ポートを含むことができる。
図５Ａは、例示的な熱的サブシステム５００の上から見た図である。サブシステム５００は、XYステージ５０２、及びマイクロウェルアレイ５０２を加熱するためのステージヒータ５０４を含む。サブシステム５００は、サンプルに熱を加えながらサンプルの画像化を可能にするガラス部品５０６を含むことができる。いくつかの例では、コンピュータ制御サブシステムは、サブシステム５００を自動的に制御するように構成される。
図５Ｂは、試薬カートリッジと流体マニホールドとの間のインターフェースを含む例示的なサブシステム５５０のブロック図である。サブシステム５５０は、サブシステム５５０を固定するための押圧留め金（pressure clasp）５５２を含む。押圧留め金の例が詳細図５５４に示されている。サブシステム５５０は、複数の流体ライン５５６、単一の圧力入力５５８、並びに異なるサイズのリザーバ５６０及び５６２を含む。
図６Ａ～６Ｂは、単一細胞の表現型と遺伝子発現配列データの関連付けに使用するための固有の光学バーコード読み出しのキャプチャーだけでなく、自動システムを使用したシーケンシングのために単一細胞からRNAライブラリを調製するための例示的な方法のフロー図である。
複数の細胞は最初にマイクロウェルアレイ上に流され、特定のマイクロウェルに単独で存在する細胞の比較的大きな割合でランダムな分布を提供する。単一細胞を含む複数のマイクロウェルを決定すると共に表現型データを収集するため、この時点で複数の細胞がマイクロウェルアレイ上で画像化されることができる。表現型情報の収集を容易にするために、当業者によって理解されるであろう任意の方法で複数の細胞が染色されることができる。次に、複数のマイクロビーズがチャンバーに流れ込む。複数のウェルのサイズと複数のビーズのサイズは、特定のマイクロウェルに１つのビーズのみが存在できるように調和されており、例えば75％、80％、85％、又は95％を超えるウェルが単一のビーズを含むように複数のビーズの濃度が使用される。
次に、溶解バッファがマイクロウェルアレイに流され、直後に過フッ素化油が流されることができる。油は、水性のクロスコンタミネーションから各マイクロウェルを効果的に「シール」する。次に、溶解後にRNAが複数のビーズにキャプチャーされ、逆転写酵素ミックス(mix)がその後にマイクロウェルアレイに流されることができる。この時点で、複数のビーズにキャプチャーされたRNAはcDNAに逆転写され、複数の相補的な光学的ハイブリダイゼーションプローブが流入されることができ、及び、ビーズ－細胞のリンクを決定するために画像化されることができる。マイクロウェル位置の細胞識別光学バーコードと、その位置の第１の画像との関連性のデータは、システムによって記憶され、ライブラリ調製前に撮影された複数の細胞画像を、シーケンシング中に生成されたゲノム（又はトランスクリプトームの（transcriptomic））データにリンクするために使用される。
図６Ｂは、システムによって実行されるプロセス６００のフロー図である。図６Ｂは、複数のマイクロウェルの画像の画像解析による細胞溶解の自動検証６０２を示している。図６Ｂはまた、複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブをロードし、マイクロウェルアレイをＮ回画像化し、各マイクロウェル位置での複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブと細胞識別光学バーコードとの間の一致を決定するために画像解析を実行することによって、複数の単一細胞画像を固有の光学バーコード読み出し６０４と関連付ける方法を示す。この方法は、その位置の細胞識別光学バーコードと、ビーズのロード前にキャプチャーされたその位置のマイクロウェル内容物の第１の画像との間の関連性のデータを記憶することを含む。
図６Ｃ～６Ｆは、図６Ｂに示されるプロセス６００を実行する際にシステムによって実行され得るプロセスを示す。
図６Ｃは、システムによって実行されるイメージングのためのプロセス６１０のフロー図である。プロセス６１０は、スキャニングのためのマイクロウェルアレイ限界を決定することを含む（６１２）。プロセス６１０は、アレイをスキャンしてアドレスをアレイ位置に割り当て、各マイクロウェルのXY及びオートフォーカス（Z）位置を決定することを含む（６１４）。プロセス６１０は、アレイをスキャンして細胞表現型の１又はそれ以上の第１の画像を取得し、各マイクロウェル内の細胞の数を決定することを含む（６１６）。プロセス６１０は、ビーズローディング（loading）及び単一細胞－ビーズ対を定量化するためにアレイをスキャンすることを含む（６１８）。プロセス６１０は、細胞溶解の完了を評価するためにアレイをスキャンすることを含む（６２０）。プロセス６１０は、細胞溶解物の洗浄を評価するためにアレイをスキャンすることを含む（６２２）。プロセス６１０は、ビーズ光逆多重化（optical demultiplexing）のための１又はそれ以上の第２の画像を取得するためにアレイをスキャンすることを含む（６２４）。
図６Ｄは、チップスキャン限界（chip scan limit）を決定するためのプロセス６２６のフロー図である。プロセス６２６は、視野の現在の位置を初期位置に移動し（６２８）、オートフォーカスし、画像を取得し、画像をセグメント化する（６３０）ことを含む。プロセス６２６は、現在の位置が角にあるかどうかを決定することを含む（６３２）。現在の位置が角にない場合、プロセス６２６は、現在の位置をマイクロウェルアレイの左上隅に向かって移動させ（６３４）、角が見つかるまで繰り返すことを含む。角が見つかると、プロセス６２６は、角のXY位置を記録し、アレイの左上隅をオートフォーカス（Z）することを含む。プロセス６２６は、右下隅について繰り返すことを含む。
図６Ｅは、プローブのハイブリダイゼーション及び融解の制御のシステムのためのプロセス６３８のフロー図である。プロセス６３８は、ハイブリダイゼーションバッファ（hybridization buffer）５４０を流すことを含む。プロセス６３８は、１又は複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブの次のプールを流し、次いで、ハイブリダイゼーションを可能にするためにプログラムされた時間の長さ休止することを含む（６４２）。プロセス６３８は、１又はそれ以上のチャンネルで蛍光スキャンを実行することを含む（６４４）。プロセス６３８は、融解バッファ（melting buffer）を流し、融解を可能にするためにプログラムされた時間の長さ休止することを含む（６４８）。プロセス６３８は、融解を評価するために１又はそれ以上のチャンネルで蛍光スキャンを実行することを含む（６５０）。プロセス６３８は、各ビーズに付着された固有の細胞識別光学バーコード配列がデコードされ得るまで、光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールのそれぞれについてステップ６４０、６４２、６４４、６４８、及び６５０を繰り返すことを含む。
図６Ｆは、光逆多重化のためのプロセス６５２のフロー図である。プロセス６５２は、ビーズを含むマイクロウェル及び蛍光チャンネルごとに実行される。プロセス６５２は、Ｎ個のプローブプールの各スキャンの蛍光強度を定量化することを含む（６５４）。プロセス６５２は、強度を低から高にソート(sorting)ことを含む（６５６）。プロセス６５２は、ソートされたリスト内の値間の強度差を計算することを含む（６５８）。プロセス６５２は、例えば、最大の強度差を境界付ける２つの強度の間の閾値を選択することによって、最大の強度差に基づいて強度閾値を決定することを含む（６６０）。プロセス６５２は、閾値強度より低い強度を有するプールに値０を割り当てることと、閾値強度を超える強度を有するプールに値１を割り当てることと、を含む（６６２）。このプロセスは、０及び１の値によって生成されたバイナリコード（binary code）を、細胞識別光学バーコード配列にマッピングすることを含む（６６４）。
例えば、実施例５に記述された光逆多重化の例示的な方法の以下の議論を考慮する。この例示的方法では、256個の可能なバイナリコードのうち96個が使用される（複数のビーズ及び光学的ハイブリダイゼーションプローブの設計及び合成のため、図１１Ａ～１１Ｃ及び実施例例２と３を参照のこと）。この実施形態では、シーケンスされた細胞識別光学バーコードの数（自動システムのマイクロウェルアレイでの実験あたり～1,000細胞）は、合計9,216（つまり、96X96=9,216の固有のバーコード）の可能なバーコードよりもはるかに少ない。従って、光学デコーディング（optical decoding）のエラーは、主にビーズにマッピングできないバイナリコードを割り当てるか、又はシーケンシングデータに表示されない細胞識別光学バーコードを割り当てることになる。両方の種類の誤った割り当ては、誤ったリンクではなく、イメージング及びシーケンシングデータセットのリンクの失敗にさらにつながる。従って、より正確な光学デコーディング方法は、より高い割合のリンクされたイメージング及びシーケンシングデータを与えるであろう。
イメージングから細胞バーコード配列をデコードするため、「サイクルごと」の方法が使用されることができ、この方法は、各ハイブリダイゼーションサイクルのすべてのビーズにわたって強度値の二峰性分布に基づいて、各ビーズのバイナリコードを呼び出す。この方法は、「１」状態の母集団のビーズ蛍光強度値が、「ゼロ」状態の母集団のビーズ蛍光強度値から十分に分離されている場合にうまく機能する。ただし、ビーズはより短い波長で自己蛍光を示すため、２つの集団はCy3発光チャンネルで明確に分離されない。
イメージングから細胞バーコード配列を正確にデコードするために、システムは修正された「ビーズごとの」蛍光強度分析戦略を利用できる。各ビーズの細胞バーコード配列は、8つの強度値を昇順で並べ替え、隣接する値の各ペア間の相対強度変化を計算し、バイナリコードを割り当てるために最大相対強度変化に基づいて閾値を設定し、実際の細胞バーコード配列へバイナリコードをマッピングすることによって決定される（図１７Ａを参照）。マッピングできないバイナリコードについて、コードが細胞バーコード配列に正常にマッピングされるまで、次に大きい相対強度の変化に基づいてバイナリコードが繰り返し再割り当てされる。この方法は各ビーズを独立にデコードするため、「1」と「0」の強度状態の分離が不十分な場合に、より良い結果を与えることができる。
実施例５は、サイクルごと及びビーズごとの方法の比較を記述する。データセットPJ070及びPJ069では、「サイクルごと」法を使用したわずか24％及び37％と比較して、「ビーズごと」法を使用して46％及び57％のscRNA-seqプロファイルが細胞画像にリンクされる。両方のデータセットで、「ビーズごと」法（図１７Ｂ）を使用してリンクされた細胞の割合で少なくとも20％の増加が観察され、これは、「ビーズごと」法が画像解析による細胞識別光学バーコード配列デコーディングにより適していることを示す。
●サイクルごと
サイクルごとの方法は、ステージごとのデコーディング方法から変更され
■各サイクル及び各蛍光チャンネルについて；
■N対数変換された平均強度値を取得し；
■50個のビン(bin)を使用して強度ヒストグラムを計算し；
■強度値の中央値Mを決定し、強度値がMよりも小さい最大のビンをB1として識別し、強度値がMよりも大きい最大のビンをB2として識別し；
■B1とB2の間の強度値を持つ最低のビンB3を識別し；
■ビンB3の中央強度値Iを取得し、Iより小さい強度値に0を割り当て、Iより大きい強度値に1を割り当てる。
■バイナリコードテーブルを参照する。割り当てられたコードがテーブルにある場合は、対応する細胞バーコード配列を返す。
●ビーズごと
ビーズごとの方法は、コア(core)ごとのデコーディング方法から変更され
■各ビーズ及び各蛍光チャンネルについて;
■8つの平均蛍光強度値x1、x2、・・・、x8を取得し；
■y1、y2、・・・、y8をソートされた値とし；
■fn =（yn+1 - yn）/ yn、n = 1,2、・・・、7を、隣接するソートされた値間の相対強度倍率変化(fold change)とし；
■最大の倍率変化
Figure 2022538359000002
 を決定し、y1、y2、・・・、yNの値に0を割り当て、値yN+1、yN+2、・・・、y8に1を割り当て；
■バイナリコードテーブルを参照する。ステップ4で割り当てられたコードがテーブルにある場合は、対応する細胞バーコード配列を返し；
■それ以外の場合は、リスト{fn}からfNを削除し、対応する細胞バーコード配列が返されるか、リスト{fn}が空になるまで、ステップ4、5を繰り返す。
図７Ａ～７Ｃは、複数のマイクロビーズ上の相補的細胞識別光学バーコード配列への光学的ハイブリダイゼーションプローブの結合を示している。図７Ａは、アダプター配列、ビーズに固有の細胞識別光学バーコード配列、固有の分子識別子（UMI）配列、及びRNAキャプチャー用のオリゴdTを含む、オリゴヌクレオチドが付着した複数のマイクロビーズの例を示している。図７Ｂは、ハイブリダイゼーションを介し、イメージング中の識別のためにプローブに直接付着したフルオロフォアと共に、マイクロビーズのその相補的細胞識別光学バーコード配列への光学的ハイブリダイゼーションプローブの結合を示す。図７Ｃは、光学的ハイブリダイゼーションプローブが２つの別の分子で構成され、そのうちの第１が細胞識別光学バーコード配列及びユニバーサル結合配列（universal binding sequence）に相補的な配列を含み、第２がユニバーサル結合配列に相補的な配列を含むと共に、複数の蛍光プローブの簡単で費用効果の高い合成を容易にするため、蛍光標識などの光学標識も含む。この場合、複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブの最初の複数の分子がマイクロウェルアレイに流れ、次に２番目の複数の分子が流れ、続いてイメージング、及び両方のプローブの除去が行われる。図６Ｂの６０４に示されるように、Ｎ回の繰り返しの数を最小化するために、複数のハイブリダイゼーションプローブを一度にシステムのマイクロウェルアレイに流すことができる。
図８Ａ～８Ｂは、システム１００の細胞及びビーズのローディング、ならびに個々のウェルにおける細胞溶解に続く本開示の方法についてのデータ及び画像を示す。流体サブシステムを使用した10％の細胞ローディング（10,000マイクロウェルアレイ内に～1000細胞）が示され、続いて蛍光標識された細胞の蛍光イメージングが示され、その画像は、マイクロウェルが単一細胞を含むことを示している。マイクロウェルごとに単一細胞が大部分となるよう、複数の細胞がロードされることができる。流体サブシステムを使用して、複数の細胞よりも高密度で複数のビーズがロードされ、単一細胞－単一ビーズ対の数を最大化するようロードされることができる。85％のビーズがロードされた（10,000マイクロウェルアレイ内に～8,500ビーズ）システムのマイクロウェルアレイが図８Ａに示される。細胞溶解は、ビーズをロードした後に実行されることができ、この場合、流体サブシステムを使用して溶解バッファがマイクロウェルアレイに流され、続いて直ちにマイクロウェルをシールするために油を流す。図８Ａに示すように、複数の細胞は蛍光検出下で小さな点として始まるが、細胞が溶解すると色素がマイクロウェル全体に拡散し、溶解が正常に行われたことを示す。さらに、蛍光シグナルはウェル内に残り、マイクロウェル間のクロスコンタミネーションが発生していないことを示す（つまり、油がウェルを適切に覆っている）。
図８Ｂは、溶解物（lysate）がマイクロウェルを満たした状態で、溶解をより詳細に示し、そこでは細胞の残滓を見ることができる。システム１００による画像処理は、染料の拡散を解析することにより、溶解の成功した完了を自動的に検出することができる。
溶解後に油が洗い流されると、溶解物はマイクロウェルから完全に除去され、イメージング中に暗反応（dark response）を示す。このQCステップは、マイクロウェルアレイが正常に洗浄され、RTミックスがすべてのビーズと接触する能力を持っていることを確認する（RNAはこの時点でビーズに付着しているため、洗い流されたり、クロスコンタミネーションを引き起こすことにならない）。システム１００の複数の操作の完了後、複数のビーズは除去され、かつDNA増幅とそれに続く核酸シーケンシングを含むさらなるcDNAライブラリ調製のためにプールされ得る。図８Ｂの電気泳動図は、本開示のシステム１００及び方法で調製されたcDNAが、シーケンシングに必要なcDNAの正しい長さ及び濃度を有することを示している。
図９は、単一細胞イメージングデータをＲＮＡトランスクリプトミクスと関連付けるための例示的な自動化された方法８００のフロー図である。方法８００は、例えば、図１のコントローラ１２４のような制御サブシステムによって実行されることができる。
方法８００は、システム１００のマイクロウェルアレイ上に細胞を流し（８０２）、マイクロウェルアレイ内の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得すること（８０４）を含む。第１の画像は、例えば、アレイの複数のマイクロウェルにロードされた細胞及び複数の細胞の表現型に関する情報を表現することができる。各画像は、アレイ内のマイクロウェルの対応する位置に関連付けられている。この位置は、例えば、マイクロウェルアレイ上のX-Y座標として指定されることができる。いくつかの例では、方法８００は、各位置について、その位置の第１の画像を使用して、その位置に対応するマイクロウェルに描かれた細胞の数を決定することを含む。これにより、１以上の細胞を含むマイクロウェルのデータを下流で排除できる。
方法８００は、流体サブシステムを使用して、マイクロウェルアレイ上に、付着された細胞識別光学バーコード配列を有する複数のRNAキャプチャービーズを流すことを含む（８０６）。方法８００は、流体サブシステムを使用して溶解バッファをマイクロウェルアレイに流すること、イメージングサブシステムを使用してマイクロウェルアレイを画像化すること、及びマイクロウェル内の溶解の完了を監視するため画像解析を実行することを含む（８０８）。方法８００は、画像解析の実行に基づいて溶解の完了を決定した後、流体サブシステムを使用してマイクロウェルアレイ上に逆転写ミックス(reverse transcription mix)を流すことを含む（８１０）。
方法８００は、前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、そこに付着した前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすることを含む（８１２）。方法８００は、前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得することを含み、前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用される（８１４）。光学的ハイブリダイゼーションプローブを流した後、マイクロビーズを含むマイクロウェルの画像内に十分な強度の光が識別される場合、一致と見極めることができる。
方法８００は、流動及びハイブリダイズのステップを繰り返すこと、及びプローブのＮ個のプールのそれぞれについて１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得することを含む（８１６）。
方法８００は、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定すること、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶することを含む（８１８）。例えば、細胞識別光学バーコードを決定することは、その値の各ビット位置が、光学的ハイブリダイゼーションプローブ又は光学的ハイブリダイゼーションプローブのプールと、細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致に対応するようにフォーマットされたデジタル値を含むことができる。
方法８００は、シーケンシングのためにマイクロビーズがマイクロウェルアレイから除去される。方法８００は、前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶することを含む（８２０）。
方法８００は、プロセスの様々な側面を制御するためのグラフィカルユーザインターフェース（GUI）を表示することを含むことができる。例えば、GUIは、実行の開始及び停止のための制御を提供することができる。 GUIは、実行の様々な段階で指定された複数の細胞の画像を提供できる。 GUIは、実行中にステータスレポートを表示できる。
いくつかの例では、方法８００は、複数のマイクロビーズを回収することを含む。例えば、複数のマイクロビーズを回収することは、ビーズが重力によって流路（flow channel）に定着することを可能にするためにチップを反転させることを含み得る。マイクロビーズの回収は、ビーズを流路内に「浮かせる」高密度流体を流すことを含み得る。マイクロビーズの回収は、流れをパルス化して、ビーズをウェルから流路に攪拌することを含み得る。マイクロビーズの回収は、ビーズを超音波処理して、ビーズをウェルから流路に攪拌することを含み得る。マイクロビーズの回収は、ビーズからcDNAを化学的又は光学的に切断し、それを収集しつつビーズ自体を残したままにすることを含み得る。
図１０Ａ-１０Ｄは画像解析を示している。図１０Ａは、セグメント化及び標識された複数のマイクロウェルの二値画像を示している。図１０Ｂは、複数のマイクロウェル内の複数の細胞の明視野画像を示している。図１０Ｃは、生体染色された細胞の蛍光画像を示している。図１０Ｄは、細胞溶解後の図１０Ｃの複数のマイクロウェルの蛍光画像を示している。
図１１Ａは、マイクロウェルアレイ内でビーズと共にカプセル化（co-encapsulated）された所定の細胞の画像を識別するための光学デコーディングを可能にする、RNAキャプチャービーズに付着した細胞識別光学バーコード配列の一実施形態を示す図である。この例では、細胞バーコードは2つの8ヌクレオチド配列を含み、それぞれが96配列のプールのメンバー（member）である。 8ヌクレオチドのランダム配列は3つの部分に分散され、固有の分子識別子（UMI）、及びビーズ上の他の複数の機能配列（functional sequence）間のスペーサーの両方として機能する。すべてのビーズ上のオリゴヌクレオチドは、2つの共通の配列である5 '末端のユニバーサルPCRアダプターと、RNAキャプチャー及びcDNA増幅用の3'末端のオリゴ（dT）とを共有している。オリゴヌクレオチドは、実施例２に記載され、図１１Ｂに示されているように、スプリットプール固相合成によって合成されることができる。ビーズは一緒にプールされて複数の共通の配列及びランダムUMIが加えられ、96の反応に分割されて96個の細胞バーコード配列の1つが加えられる。２回のスプリットプール後、合計962 = 9,216個の細胞バーコードが生成される。自動システムを使用した方法で細胞からcDNAを生成するためには、細胞がこれらのビーズと共にカプセル化され、ハイブリダイゼーションによって細胞RNAがビーズ上にキャプチャーされた後に細胞が溶解され、その後にRNAが逆転写される。
細胞イメージングを同じ細胞からのscRNA-seqとリンクさせるために、各ビーズ上の細胞識別光学バーコード配列は、シーケンシャル（sequential）蛍光プローブハイブリダイゼーションによってマイクロウェルアレイで識別される。各細胞バーコード（つまり、図１１Ａの「S」と「Q」）は、細胞識別光学バーコード配列内の固有で予め定義された8ビットのバイナリコードに対応する。バイナリコードの各ビットは、１サイクルのプローブハイブリダイゼーションで読み取られることができ、ここで、ハイブリダイズされたプローブの有無は、それぞれ1又は0を示す。細胞識別光学バーコード配列の2つの部分は、2セットの異なる色の蛍光プローブを使用して同時にデコードされ得る。このデコーディングスキームを実現するために、ハイブリダイゼーションの各サイクルに対して蛍光プローブのプールが生成される（実施例３を参照）。対応するバイナリコードで「1」とマークされた細胞バーコード配列にハイブリダイズできるすべてのプローブがプールされ、例えばCy5又はCy3のようなフルオロフォアと結合される。細胞識別光学バーコード配列を有する2つの8ヌクレオチド配列に対する別個のフルオロフォア結合プローブが次に一緒にプールされ、最終的なプローブプールを形成する（図１１Ｃ）。従って、すべての可能な細胞バーコード配列は、2色のプローブハイブリダイゼーションで8サイクルでデコーディングされ得る。このアプローチは、高速なイメージングと互換性があり、より高いスループットをもたらす。
自動化された機器を使用してcDNAライブラリ調製から得られるシーケンシングデータの精度が図１２－１４に示される。この例示的方法では、実験は、実施例１に説明されるように、2つの異なる色の生体染色色素で標識されたヒト（U87）とマウス（3T3）の混合細胞で実行された。5つの実験から得られたシーケンシングデータが表１に示される。このデータは、自動化されたシステムが複数の細胞型から複数の高純度のcDNAライブラリを生成できることを示している。
図１２は、単一細胞RNA-seq実験における、各細胞識別バーコードのヒト及びマウスのアラインされた(aligning) 転写分子の数を示す散布図であり、複数の細胞識別バーコードの大部分は１つの種に強く関連しており、一部は両方に関連しており、複数の細胞がビーズと一緒にカプセル化されていることを示す。本開示の方法は、データセットからのマルチプレット（multiplet）の除去を可能にする。図１３は、単一細胞RNA-seq実験からの、ヒト又はマウスのトランスクリプトームアノテーションのいずれか（分子の少なくとも70％がヒト又はマウスのトランスクリプトームのいずれかにアラインしている）に関連付けられた細胞識別バーコードについて、細胞ごとに検出された転写分子の数の分布を示すバイオリン図である。図１４は、単一細胞RNA-seq実験からの、ヒト又はマウスのトランスクリプトームアノテーションのいずれか（分子の少なくとも70％がヒト又はマウスのトランスクリプトームのいずれかにアラインしている）に関連付けられた細胞識別バーコードについて、細胞ごとに検出された遺伝子の数の分布を示すバイオリン図である。
自動システムでの光学的ハイブリダイゼーションプローブのイメージングが実施例４に記述される。図１５Ａは、アレイの個々のマイクロウェルに存在する複数のビーズ上の、相補的細胞識別光学バーコードにハイブリダイズされた8塩基のCy3標識及び8塩基のCy5標識の光学プローブの生の蛍光画像及び解析された蛍光画像を比較する画像を示す図である。図１５Ｂは、蛍光ハイブリダイゼーションイメージングのサイクルの画像を示す図であり、8塩基のCy5標識オリゴヌクレオチド及び8塩基のCy3標識オリゴヌクレオチドのプールされたセットが複数のビーズと共にロードされてアレイ装置に導入され、各ビーズ上の第１及び第２の配列をそれぞれプローブするため、チャンネル２及び３のそれぞれで画像化された。
図１６は、各ビーズ上の、共に細胞識別光学バーコード配列を形成する２つのバーコード配列を識別するため、蛍光ハイブリダイゼーションイメージングのサイクルのソフトウェア解析の画像を示す図である。8塩基のCy5標識オリゴヌクレオチド及び8塩基のCy3標識オリゴヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブのプールされたセットが、複数のビーズと共にロードされてアレイ装置に導入され、各ビーズ上で、それぞれ第１及び第２のバーコード配列をプローブするためにチャンネル２と３のそれぞれで画像化された。複数のプールされたプローブのこの混合物のソフトウェア解析は、検出された蛍光がチャンネル２に対して「陽性」、チャンネル３に対して「陽性」、又は両方に対して陽性であることを示す。実施例６に記載されるように、本開示の自動化されたシステム及び方法は、イメージング及びシーケンシングデータの高精度のリンクをもたらすことができる。例えば実験は、スループット、分子キャプチャー効率、及びイメージングデータとシーケンシングデータのリンクの精度の観点から、細胞識別光学バーコードを含むRNAキャプチャビーズを使用して、単一細胞の表現型画像と核酸配列データをリンクさせることを実証するために行われる。実験は、2つの異なる色の生体染色色素で標識されたヒト（U87）とマウス（3T3）の混合細胞を使用して実行される。複数の混合細胞がマイクロウェルにロードされ、1回の実験で転写プロファイルが取得される。飽和シーケンシング深度（saturating sequencing depth）では、細胞あたり3,548個の遺伝子から平均10,245個のRNA転写物が検出される（図１８Ａ、１８Ｂ）。リンクの精度を評価するために、各細胞の種は、蛍光標識の色及びRNA-seqの種特異的なアラインメント率（alignment rate）から識別され（特定の種のトランスクリプトームにアラインする（aligning）読み取りの90％を超える細胞が、種特異的と見なされる）、2つの細胞種の呼び出し(call)の一貫性が調べられる。イメージングデータとのリンクに成功した4,145個のscRNA-seqプロファイルでは、99.2％（0.8％エラー率）のクラスバランスのとれた（class-balanced）リンク精度が得られ、2色イメージングからはヒト細胞の98.8％とマウス細胞の99.6％が種の呼び出しに一致している（図１８Ｃ）。さらに、2色の細胞画像から複数の混合種と単一種のマルチプレット（multiplet）を手動で識別することにより、マルチプレットが確実に除去される。画像ベースとシーケンシングベースの混合種マルチプレットを比較することにより、68.8％のマルチプレット検出感度と97.0％の特異性が得られる。低純度の転写プロファイルの大部分が除去される（図１８Ｄ）。高いリンク精度が確認されているため、シーケンシングでは検出されたがイメージングでは検出されなかった混合種マルチプレットは、正解データ（ground truth）として機能するscRNA-seqデータの不完全性が原因であると考えられる。
本開示の自動化されたシステム及び方法は、単一細胞の光学的表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定するために使用することができる。例えば、悪性形質転換神経膠芽腫（GBM）細胞のイメージング特徴と系統同一性（lineage identitity）との間の関係の同定は、実施例７に記載されている。本書に記載の細胞識別光学バーコードを使用し、ヒト組織サンプルからの光学的及び転写表現型の対の収集を実証するため、実験は、ヒトGBM手術サンプルから分離され（dissociated）、エステラーゼ活性を報告する蛍光色素であるカルセインAMで標識された細胞に対して行われる。1,954個のscRNA-seqプロファイルが取得され、そのうち1,110個が生細胞画像にリンクされる。細胞マルチプレットは、画像解析に基づいて除去される。細胞の大集団は、遺伝子発現に基づいて、GBMに広がる2つの一般的に同時発生する異数性である第7染色体の増幅と第10染色体の喪失で識別される。集団を定義する主要な遺伝子シグネチャーは、計算分析によって識別される。骨髄細胞、内皮細胞、周皮細胞、悪性形質転換星状細胞様細胞（astrocyte-like cell）、間葉様細胞、オリゴデンドロサイト前駆様細胞（progenitor like cell）/神経芽細胞前駆様細胞（OPC / NPC）、及びサイクリング細胞（cycling cell）を含む、GBMのscRNA-seqから従前に報告されたすべての主要な細胞型が回収される（図１９Ａ、１９Ｂ）。16個のイメージング特徴が複数の細胞画像から測定され、それらの特徴は、教師なし階層的クラスタリングを使用して、細胞サイズ、形状、及びカルセインAM強度の3つのカテゴリにグループ化され（図１９Ｃ）、3つのイメージングベースのメタ特徴（meta-feature）が作成される。メタ特徴をscRNA-seq細胞型にリンクすることにより、骨髄細胞（クラスター7及び12）は比較的丸くて小さく、エステラーゼ活性が高く；内皮細胞は大きく、予想通り丸くなく、中間のエステラーゼ活性を持ち；周皮細胞は中間の形状、サイズ、強度を持っていることがわかる（図１９Ｄ）。
GBMの複数の悪性細胞は、複数の神経系統に似ており、間葉系表現型を示す可能性がある。複数の悪性GBM細胞は可塑性が高く、分化と脱分化を起こすことが知られているため、それらの系統関係を視覚化するために拡散マップが使用される。複数の悪性細胞は、上記のように異数性に基づいて選択され、悪性細胞の遺伝子発現の次元が減少し、因子分解された（factorized）データが拡散マップで視覚化され、それは2つの主要な分岐を明らかにする。一方の枝は複数の星状細胞様細胞で構成され、間葉様細胞で終わり、もう一方の枝は複数のOPC / NPC細胞とサイクリング細胞で構成されている。これは、複数の星状細胞様及び間葉系神経膠腫細胞が複数のOPC様神経膠腫細胞よりも顕著に静止していることを示す、以前に発表された研究と一致している。
悪性細胞のイメージング特徴が2つの主要な細胞系統にどのように関連しているかを調べるために、細胞イメージング特徴の教師なしクラスタリングが、scRNA-seqで観察される2つの主要な系統に対応するかどうかが尋ねられる。悪性細胞は、階層的クラスタリングを使用して上記の3つのイメージングメタ特徴によってクラスター化され、2つの主要な細胞イメージングクラスターが識別される。悪性細胞を埋め込んだ拡散マップ上に2つのイメージングクラスターをプロットすることにより、OPC/NPCサイクリングの枝では、丸い形状、低強度、小さいサイズの複数の細胞（イメージングクラスター0）が濃縮され（enriched）、星状細胞-間葉系の枝では、粗い形状、高強度で大きなサイズの複数の細胞（イメージングクラスター1）が濃縮されていることがわかる（図２０）。この発見は、2つのイメージングクラスター内の複数の細胞の発現プロファイルを比較する発現差異解析（differential expression analysis）によってさらに支持される。予想した通り、複数のOPC / NPC（MAP2、OLIG1、DLL3）及び複数のサイクリング細胞（CDK6）の複数のマーカーは、イメージングクラスター0で大幅に濃縮されているが、複数の星状細胞様細胞（APOE、GFAP、GJA1、AQP4、ALDOC）及び複数の間葉系細胞（CHI3L1、CD44、CHI3L2、CCL2）の複数のマーカーは、イメージングクラスター1で大幅に濃縮されている。従って、この腫瘍の複数の悪性形質転換細胞の主要な遺伝子発現と基本的なイメージング特徴との間には明確な対応関係がある。
単一細胞の光学的表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定するための例示的な方法が提供される。この方法はシステムを初期化することを含み、前記システムは、流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムとを含み、前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み；前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み；複数の操作を実行するために前記制御サブシステムを用いる。この操作は、前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得し、及び、１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴を測定すること；前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列及びRNA結合配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びRNAライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；前記流動ステップ及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；並びに、前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること、を含む。この方法は、前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴と、前記第１の画像のそれぞれに関連する核酸シーケンシングデータとの間の関係の表現を生成することを含み、ここで、前記単一細胞の表現型の特徴と、前記関連するシーケンシングデータとの間の相関は、単一細胞の光学的表現型と、その単一細胞のトランスクリプトミクスに基づく細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する。
一例では、前記細胞の光学的表現型の特徴が、面積、平均強度、強度の標準偏差、最小強度、最大強度、中央値強度、周囲長、幅、高さ、長軸、短軸、真円度(circularity)、フェレット径(Feret's diameter)、最小のフェレット径、円形度(roundness)、又は面積包絡度(solidity)の１又はそれ以上である。ただし、前記方法はこれらの細胞の光学的表現型の特徴に限定されない。この方法の利点の1つは、表面の特徴に加え、細胞内を含む、細胞の光学的表現型の特徴の幅広いレパートリーを測定できることである。これは、細胞の表面に発現した変化のみを識別できるFACSとは対照的である。
細胞の光学表現型の特徴は、当業者に理解されているように、明視野、暗視野、蛍光、発光、ラマン、又は散乱顕微鏡又は他の顕微鏡から導き出されることができる。
単一細胞の光学表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する方法において、前記複数の細胞は、組織、腫瘍、細胞培養物、又は血液サンプル、尿サンプル、又は唾液サンプルを含むがこれらに限定されない任意の種類の体液を含むことができる。
この方法では、前記複数の細胞は、ヒト、哺乳動物、又は動物の細胞であり得る。一例では、前記複数の細胞は、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、間質細胞、幹細胞、神経細胞、又は腫瘍細胞である。
単一細胞の光学表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する方法の一例において、前記複数の細胞は免疫細胞であり、測定される光学的表現型の特徴は、当業者に知られている免疫細胞型の免疫表現型を特徴づけるような、免疫表現型の特徴を含む。
単一細胞の光学表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する方法の他の例において、この方法で使用される前記複数の細胞は、遺伝子改変を受けた細胞である。遺伝子編集された細胞の１又はそれ以上の細胞光学的表現型の特徴を測定することにより、目標は、光学表現型の特徴と遺伝子改変の有無にかかわらない細胞クローンとの間の対応を特定することである。この対応が特定されると、より高価な遺伝子シーケンシングを必要とせずに、遺伝子改変に対して陽性又は陰性のいずれかの所望の細胞クローンが光学的方法によって特定されることができる。これは、他と同様に免疫療法の細胞への応用を持つ。一例では、遺伝子改変を受けた複数の細胞は、幹細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞である。
図２１は、プロセスの様々な側面を制御するため、特に、マイクロウェルアレイの明視野及びマルチチャンネル蛍光スキャンのパラメータを設定するためのGUIの例のスクリーンショットを含む。図２１は、実験の明視野及び蛍光チャンネルを制御するための様々なユーザーインターフェースコントロールを示す。GUIは、XYステージとオートフォーカスモータを手動で動かすためのユーザーインターフェースコントロールも含む。
図２２は、スキャンの明視野チャンネルのイメージングパラメータを設定するためのマイクロウェルアレイの生の明視野画像を表示する、GUIの例の別のスクリーンショットである。図２２は、ライブビュー（live view）の例、つまりイメージングシステムからのマイクロウェルアレイのビューを示す。ユーザーインターフェースコントロールを使用して、ユーザは、例えばフォーカスが適切かどうかを確認したり、マイクロウェルアレイの左上隅と右下隅にマークを付けてスキャンの境界を設定したりといった、ライブ画像を見ることができる。
図２３は、そのスキャンのそのチャンネルのイメージングパラメータを設定するため、蛍光チャンネルの１つにおけるマイクロウェルアレイのライブ画像を表??示する例示的なGUIのスクリーンショットである。図２３に示す例では、GUIは、例えば細胞又はビーズを観察するための蛍光ライブフィード（live feed）を示す。
図２４は、細胞ローディング操作のための様々なパラメータを設定するための例示的なGUIのスクリーンショットである。GUIは、実験の特性（property）を指定し、マイクロウェルアレイのスキャンを開始するための様々なユーザーインターフェース要素を含む。
図２５は、マイクロウェルアレイのスキャンの明視野イメージング結果を表示するための例示的なGUIのスクリーンショットである。図２５に示す例は、単一の画像につなぎ合わされた様々な画像のモザイクを示す。
図２６は、マイクロウェルアレイのスキャンの蛍光イメージング結果を表示するための別のGUIのスクリーンショットである。表示パラメータを指定するため、ユーザーインターフェースコントロールが使用され得る。
本開示の自動化されたシステムの一例では、システムは、単一細胞イメージングを固有の光学バーコード読み出しと関連付け、RNAライブラリ以外の複数のシーケンシングライブラリを調製するために使用される。例えば、システムは、流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムは以下の、前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある前記細胞の１又はそれ以上の第１の画像を取得すること；前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列、及び細胞核酸をキャプチャーするためのプライマー配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びシーケンシングライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；並びに、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；を含む複数の操作を実行するように構成されている。
前記自動化されたシステムのこの例では、細胞核酸をキャプチャーするようデザインされた前記プライマー配列は、RNA、mRNA、及び非コードRNAをキャプチャーするためのオリゴ（dT）；あらゆるDNA若しくはRNAをキャプチャーするためのランダム配列；又はDNA遺伝子座若しくはRNA転写物を標的とする特定の配列、であり得る。
一例では、本開示の自動化されたシステムは、単一細胞イメージングデータを、RNAトランスクリプトミクスだけでなく核酸シーケンシングデータと関連付けるための方法に使用され得る。例えば、前記方法はシステムを初期化することを含み、前記システムは、流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと；前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムを以下の、前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得すること；前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列、及び細胞核酸をキャプチャーするためのプライマー配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びシーケンシングライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；並びに、前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること；を含む複数の操作を実行するために用い、これにより、前記単一細胞イメージングデータが、その細胞の前記核酸配列と関連付けられる。
この自動化されたシステムのこの例では、前記プライマー配列は、RNA、mRNA、及び非コードRNAをキャプチャーするためのオリゴ（dT）；あらゆるDNA若しくはRNAをキャプチャーするためのランダム配列；又はDNA遺伝子座若しくはRNA転写物を標的とする特定の配列、であり得る。
一例では、本開示の自動化されたシステムは、単一細胞の光学的表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定するための方法であって、システムを初期化することを含み、前記システムは、流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと；前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムを以下の、前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得し、及び、１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴を測定すること；前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列を有する複数のマイクロビーズ、及び細胞核酸に結合するためのプライマー配列を、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びシーケンシングライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること、を含む複数の操作を実行するために用いる。前記方法は、前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴と、前記第１の画像のそれぞれに関連する核酸シーケンシングデータとの間の関係の表現を生成することを含み、ここで、前記単一細胞の表現型の特徴と、前記関連するシーケンシングデータとの間の相関は、単一細胞の光学的表現型と、その単一細胞の核酸配列に基づく細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する。
前記方法の一例では、前記プライマー配列は、RNA、mRNA、及び非コードRNAをキャプチャーするためのオリゴ（dT）；あらゆるDNA若しくはRNAをキャプチャーするためのランダム配列；又はDNA遺伝子座若しくはRNA転写物を標的とする特定の配列、であり得る。
従って、方法及びシステムは、特定の実施形態、特徴、及び例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本主題の有用性は、このように限定されるのではなく、本書の開示に基づいて本主題の分野における通常の技術者にそれ自体を示唆するような他の多くの変形、修正、及び代替の実施形態に拡張する。
本書に記載の構造及び特徴の様々な組み合わせ及び半(sub)組み合わせが期待されるとともに、本開示の知識を有する当業者には明らかであろう。本書に開示される様々な特徴及び要素のいずれも、本書に反対として示されない限り、１又はそれ以上の他の開示される特徴及び要素と組み合わせられてもよい。同様に、以下に請求される主題は、請求項の範囲及び均等等物を含む限り、その範囲内のすべてのそのような変形、修正、及び代替の実施形態を含むものとして、広く解釈及び解釈されることを意図している。
実施例１
自動システムでの単一細胞RNA-Seq
装置の準備。一般的に使用されるエラストマーポリマーであるポリジメチルシロキサン（PDMS）からマイクロウェルアレイ装置が製造され、使用の1日前に洗浄バッファ（20 mM Tris-HCl pH 7.9、50 mM NaCl、0.1％Tween-20）内で加湿チャンバーに保管された。
細胞の準備。5つの異なる実験が行われ、そのうちの4つはマウス（3T3）/ヒト（U87）の複数の混合細胞を含み、1つは複数のU87ヒト細胞のみであった。0.25％トリプシン-EDTA（Life Technologies、カタログ番号25200-072）を使用して、複数の細胞が単一細胞懸濁液に分離され；複数のヒトU87細胞がカルセインAM（ThermoFisher Scientific、カタログ番号C3100MP）で染色され、複数のマウス3T3細胞が1X TBS中のカルセイン赤橙色（ThermoFisher Scientific、カタログ番号C34851）で37℃で15分間染色された。複数のU87及び3T3細胞が1：1の比率で混合され、最終的な総細胞濃度を1000細胞/μlとした。
システムの初期化。マイクロウェルアレイ装置が機器アセンブリに挿入され、自動システムは、細胞及びビーズのローディングの自動化とそれに続く単一細胞RNAシーケンシングライブラリ調製用に構成された。単一細胞懸濁液が細胞ローディングリザーバにロードされた。複数のビーズ（Chemgenes Drop-SEQビーズ）がビーズローディングリザーバに加えられた。単一細胞RNA-Seqライブラリ調製試薬が試薬リザーバにロードされ、試薬リザーバが機器アセンブリに取り付けられた。
次のステップが自動システム上で実行された。
細胞ローディング。トリス緩衝生理食塩水（TBS）を装置に流した後、複数の単一細胞が装置の個々のマイクロウェルに約10％の密度でロードされた（図８Ａを参照）。
細胞イメージング。細胞がロードされたマイクロウェル装置は、明視野及び蛍光チャンネル下でスキャンされた（図８Ａ）。明視野画像は、LED光源と広視野10× 0.3NA対物レンズを使用して撮影された。蛍光画像は、LED光源、クアッドバンドフィルターセット、カルセインAM及びカルセイン赤橙色につきそれぞれ470 nm（GFPチャンネル）及び555 nm（TRITCチャンネル）励起の広視野10× 0.3NA対物レンズを使用して撮影された。
イメージングベースのマルチプレット識別。 2色の生体染色蛍光画像は、緑のカルセインAM信号及びマゼンタのカルセイン赤橙信号と併合（merge）された。各ウェルは、最小の境界正方形(smallest bounding square)内で自動的に検査された。複数の混合種の細胞を含むウェルは、少なくとも１つの緑色のオブジェクト及びマゼンタのオブジェクトを持つと判断され、単一細胞を持つウェルは、１つの緑色のオブジェクト又は１つのマゼンタのオブジェクトのみを持つと判断された。
ビーズのローディングとイメージング。マイクロウェル装置をTBSで洗浄した後、イメージングによって確認されたように、複数のビーズが装置の個々のマイクロウェルに約80％の密度でロードされた（図８Ａ）。
細胞溶解とイメージング。マイクロウェルアレイ装置をTBSで洗浄した後、溶解バッファ（1％ 2-メルカプトエタノール（Fisher Scientific、カタログ番号BP176-100）、99％バッファTCL（Qiagen、カタログ番号1031576））、続いて過フッ素化油（Sigma-Aldrich、カタログ番号F3556-25ML）が装置内に流され、50℃で20分間インキュベートされて、細胞溶解が促進された。細胞溶解の程度を評価するため、装置が品質管理ステップとして画像化された（図８Ａ）。溶解後、装置の温度が25℃で90分間保持され、複数のビーズ上へのRNAのキャプチャーが促進された。マイクロウェルを開封し、キャプチャーされていないRNA分子をすべて除去するため、RNase阻害剤（洗浄バッファ中0.02 U/μL SUPERaseIN（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号AM2696））が添加された洗浄バッファが装置を洗い流された（flushed through）。蛍光細胞溶解物が十分に除去されていることを確認するための品質チェックとして、装置が再度画像化された（図８Ｂを参照）。
画像解析。溶解は、ImageJを使用して画像を解析することで確認された。複数のマイクロウェルを特定するために、背景画像と明視野画像の差が取られ、大津の方法（https://doi.org/10.1109/TSMC.1979.4310076）を使用して閾値が計算された。二値画像を生成するため閾値が使用され、それが拡張されて複数の穴（hole）が埋められた。細胞ローディング及び溶解の効率を測定するための複数のウェルのマスクを作成するため、バイナリオブジェクトが特定された。細胞ローディング後、生体染色画像内の複数のマイクロウェルの平均蛍光強度が測定された。平均強度値は二峰性分布に従い、より高い強度の集団は複数の細胞を含む複数のマイクロウェルに対応した。細胞溶解後、マイクロウェル装置の蛍光強度が測定され、元々細胞が含まれた複数のウェルの溶解効率が計算された。図１０Ａは、セグメント化及び標識された複数のマイクロウェルの二値画像を示す。図１０Ｂは、複数のマイクロウェル内の細胞の明視野画像を示す。図１０Ｃは、生体染色された複数の細胞の蛍光画像を示す。図１０Ｄは、細胞溶解後の図１０Ｃのマイクロウェルの蛍光画像を示す。
逆転写。逆転写混合物（1X Maxima RTバッファ、1 mM dNTPs、1 U / μL SUPERaseIN、2.5 μMテンプレートスイッチオリゴ、10 U / μL マキシマ Hマイナス逆転写酵素（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号EP0752）、0.1％Tween-20）が装置内に流し込まれ、続いて25℃で30分間、次に42℃で90分間インキュベートされた。 RNase阻害剤が添加された洗浄バッファが装置を洗い流した。
マイクロウェル装置が機器アセンブリから取り外され、エキソヌクレアーゼI反応混合物（1X Exo-Iバッファ、1 U / μL Exo-I（New England Biolabs、カタログ番号M0293L））が装置に流され、続いて37℃で45分間インキュベートされた。TE / TWバッファ（10 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、0.01％Tween-20）が装置を洗い流した。複数のビーズが収集され、シーケンシングのためにプールされた。図８Ｂは、オンデバイス ワークフローにかけられた複数のビーズと複数のネガティブコントロールビーズ（つまり、オンデバイス逆転写にかけられなかった複数のDrop-SEQビーズ）から抽出されたビーズフリーPCR産物のキャピラリー及びゲル電気泳動分析のグラフを示す。
自動システムから離れて実行される（performed off ）PCR及びシーケンシング：
プールされたビーズが、TE / SDSバッファ（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0.5％SDS）、TE / TWバッファ、及びヌクレアーゼフリー水で順次洗浄された。 cDNA増幅は、50 μLのPCR溶液（1X Hifi Hot Start Readyミックス（Kapa Biosystems、カタログ番号KK2601）、1 μM SMRTpcrプライマー（表EV5））で、サーモサイクラーで14回の増幅サイクル（95℃ 3分、4サイクルの（98℃ 20秒、65℃ 45秒、72℃ 3分）、10サイクルの（98℃ 20秒、67℃ 20秒、72℃ 3分）、72℃ 5分）で実行された。PCR産物は、複数のAMPure常磁性ビーズ（Beckman、カタログ番号A63881）を使用し、ビーズ－サンプルの体積比が0.6：1で精製された。次に、精製されたcDNAがタグメントされ（tagment）、invitro転位用のNexteraキット（Illumina、FC-131-1024）を使用して増幅された。反応あたりのインプット（input）として0.8ngのcDNAが使用された。ライブラリにバーコードを付けるため、固有のi7インデックスプライマーが使用された。i5インデックスプライマーは、cDNAの5 '末端（RNAの3'末端に対応）を選択的に増幅するためのユニバーサルP5プライマーに置き換えられた。ビーズ－サンプルの体積比が0.6：1と1：1の2ラウンドのSPRI常磁性ビーズベースの精製が、Nextera PCR産物で連続して実行され、シーケンシング準備された（sequencing ready）ライブラリが取得された。26サイクルの読み取り1、58サイクルの読み取り2、及び8サイクルのインデックス読み取りを使用したIllumina NextSeq500でシーケンシングする前に、20％PhiXライブラリ（Illumina、FC-131-1024）がスパイクイン（spiked-in）された。カスタムシーケンシングプライマーが読み取り1に使用された。
上記の5つの実験から得られたシーケンシングデータが表1に示される。データは、自動システムが複数の細胞型から高純度のcDNAライブラリを生成できることを示す。
Figure 2022538359000003
第二次標本（Sub-sampling）分析。scRNA-seqデータの飽和挙動（saturation behavior）と感度を分析するために、アラインされた（aligned）読み取りがランダムに第二次標本化され、scRNA-seq分析で再処理された（re-processed）。次に、合計読み取りから検出された複数の細胞に基づいて、細胞あたりの分子及び細胞あたりの遺伝子の2つの統計が計算される。
検証データ。自動システムでの混合種実験のシーケンシング結果を検証する追加データが図１２－１４に示される。
図１２は、上記の混合種実験の1つからの、各細胞識別バーコードのヒト及びマウスのアラインされた転写分子の数を示す散布図である。このプロットは、複数の細胞識別バーコードの大部分は１つの種に強く関連しており、一部は両方に関連しており、複数の細胞がビーズと一緒にカプセル化されていることを示す。
図１３は、上記の混合種実験の1つからの、ヒト又はマウスの複数のトランスクリプトームアノテーションのいずれか（分子の少なくとも70％がヒト又はマウスのトランスクリプトームのいずれかにアラインしている）に関連付けられた細胞識別バーコードについて、細胞ごとに検出された転写分子の数の分布を示すバイオリン図を示す。
図１４は、上記の混合種実験の1つからの、ヒト又はマウスの複数のトランスクリプトームアノテーションのいずれか（分子の少なくとも70％がヒト又はマウスのトランスクリプトームのいずれかにアラインしている）に関連付けられた複数の細胞識別バーコードについて、細胞ごとに検出された遺伝子の数の分布を示すバイオリン図を示す。
実施例２
複数の細胞識別光学バーコード配列を有する複数のビーズの構築
8 nt細胞バーコード配列は、Rパッケージ「DNAbarcodes」を使用して次の基準で設計された：配列は互いに少なくとも3レーベンシュタイン距離であり、2ヌクレオチドより長いホモポリマーを含む配列でGC含量が40％未満又は60％を超えるか、又は完全に自己相補的な配列は除去された。二次構造の形成が少ないことに基づいて、配列がさらに選択された。
ビーズの設計が図１１Ａに示される。ビーズ合成は、図１１Ｂに示すように、Chemgenes Corp（マサチューセッツ州、ウィルミントン）によって実行された。柔軟な鎖リンカーを有するToyopearl HW-65S樹脂（平均粒子径約30ミクロン）（Tosoh Biosciences、カタログ番号19815、Tosoh Bioscience）が、逆方向ホスホルアミダイト合成の固体支持体として使用された。複数のビーズは、50マイクロモルスケールの配列「TTTTTTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACNN」で合成され、96個の部分にスプリットされて「S」細胞バーコード配列の1つが追加され、「NN」を追加するため一緒にプールされ、96個の部分にスプリットされて「Q」細胞バーコード配列の1つが追加され、及び、「NNNN」と30個の「T」を追加するために一緒にプールされた。
実施例３
光学デコーディング用の複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブプールのラベリングと生成
3'-アミノ修飾を有する8-nt細胞バーコードに相補的な192個のオリゴヌクレオチドが合成及び精製され（Sigma-Aldrich）、その後200μMで水に再懸濁された。バイナリコードの各ビットに対応するプローブ混合物を生成するために、「1」でラベル付けされたオリゴヌクレオチドが採取され（図１１Ｃを参照）、プールされ、0.1 M四ホウ酸ナトリウム（pH 8.5）カップリングバッファ（coupling buffer）に、最終濃度22μMで0.6μg/μL反応性フルオロフォアと共に再懸濁された。Sulfo-CY5 NHSエステル（Lumiprobe、カタログ番号21320）が複数のSオリゴプールと結合され、Sulfo-CY3 NHSエステル（Lumiprobe、カタログ番号23320）が複数のQオリゴプールと室温で一晩結合させられた。過剰なフルオロフォアが除去され、エタノール沈殿（80％エタノール、0.06 M NaCl、6μg/ mLグリコーゲン）によってオリゴが回収された。NanoDrop（Thermo Scientific）を使用して、複数のプローブの濃度が定量化された。複数のプローブプールは、各プローブの最終濃度が約20 nMになるように希釈され、2つの明確にラベル付けされたプローブプールは、使用前にバイナリコードビットごとに一緒に混合される。
実施例４
自動システムでの複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのイメージング
図６Ｂに示される、複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのローディング、イメージング、及び複数のプローブの取り外しの自動システムのステップは、次のように検証された。複数のDROP SEQビーズ（Chemgenes）が、上記の実施例１で説明したようにマイクロウェルアレイにロードされた。次に、イメージングバッファ（2xSSC、0.1％Tween-20）を装置に流すことにより、洗浄が行われた。装置は、明視野、Cy3及びCy5発光チャンネルでスキャンされた。蛍光画像は、LED光源（Lumencor、AURA III、390 / 22nm、475 / 28nm、555 / 28nm、635 / 22nm）、クアッドバンドフィルターセット（Semrock、LED-DA / FI / TR / Cy5-B-000）、広視野10倍対物レンズ（オリンパス、UPLFLN10X2）、及びCy3とCy5につきそれぞれ555nmと649nmの励起を使用して取得された。20 nMの濃度のイメージングバッファ中の複数のハイブリダイゼーションプローブの1又はプールが装置に流し込まれ、10分間インキュベートされた。装置にイメージングバッファを流すことにより、複数のハイブリダイズしていないプローブを除去するために洗浄が行われた。装置は、明視野、Cy3及びCy5発光チャンネルでスキャンされた。イメージング後、融解バッファが装置に流し込まれ、10分間インキュベートされ、複数のハイブリダイズしたプローブが除去された。これらのステップは、1又はそれ以上の単一又はプールされたプローブを使用して、1回以上繰り返される。完了すると、イメージングバッファを流すことにより、装置が洗浄された。
図１５Ａは、本開示の自動システムのアレイの個々のマイクロウェルに存在する複数のビーズ上の、相補的細胞識別光学バーコードにハイブリダイズされた8塩基のCy3標識及び8塩基のCy5標識の光学プローブの生の蛍光画像及び解析された蛍光画像を比較する画像を示す。
図１５Ｂは、蛍光ハイブリダイゼーションイメージングのサイクルの画像を示す図であり、8塩基のCy5標識オリゴヌクレオチドのプールされたセット及び8塩基のCy3標識オリゴヌクレオチドのセットが、複数のビーズがロードされたアレイ装置に導入され、各ビーズ上の第１及び第２の配列をそれぞれプローブするため、チャンネル２及び３のそれぞれで画像化された。
図１６は、各ビーズ上の、共に細胞識別光学バーコード配列を形成する２つのバーコード配列を識別するため、蛍光ハイブリダイゼーションイメージングのサイクルのソフトウェア解析の画像を示す図である。8塩基のCy5標識オリゴヌクレオチド及び8塩基のCy3標識オリゴヌクレオチドからなる複数のハイブリダイゼーションプローブのプールされたセットが、複数のビーズがロードされたアレイ装置に導入され、各ビーズ上で、それぞれ第１及び第２のバーコード配列をプローブするためにチャンネル２と３のそれぞれで画像化された。プールされたプローブのこの混合物のソフトウェア解析は、検出された蛍光がチャンネル２に対して「陽性」、チャンネル３に対して「陽性」、又は両方に対して陽性であることを示す。
実施例５
細胞識別光学バーコード配列を有するRNAキャプチャービーズを使用した単一細胞RNA-Seq及び光学デコーディング
本実験では、256個の可能なバイナリコードのうち96個が使用され（複数のビーズ及び光学的ハイブリダイゼーションプローブの設計及び合成のため、図１１Ａ～１１Ｃ及び実施例２と３を参照のこと）、さらに重要なことに、シーケンスされた細胞識別光学バーコードの数（実験あたり10,000細胞未満）は、合計92,160の可能なバーコードよりもはるかに少ない。従って、光学デコーディング（optical decoding）のエラーは、主にビーズにマッピングできないバイナリコードを割り当てるか、又はシーケンシングデータに表示されない細胞識別光学バーコードを割り当てることになる。両方の種類の誤った割り当ては、誤ったリンクではなく、イメージング及びシーケンシングデータセットのリンクの失敗にさらにつながる。従って、より正確な光学デコーディング方法は、より高い割合のリンクされたイメージング及びシーケンシングデータを与えるであろう。
「ビーズごと」の光学デコーディング方法を「サイクルごと」の方法と比較するために、2つの方法が2つのデータセットでテストされる。
イメージングから細胞識別光学バーコード配列をデコードするため、「サイクルごと」の方法が使用され、この方法は、各ハイブリダイゼーションサイクルのすべてのビーズにわたって強度値の二峰性分布に基づいて、各ビーズのバイナリコードを呼び出す。この方法は、「１」状態の母集団のビーズ蛍光強度値が、「ゼロ」状態の母集団のビーズ蛍光強度値から十分に分離されている場合にうまく機能する。ただし、ビーズはより短い波長で自己蛍光を示すため、２つの集団はCy3発光チャンネルで明確に分離されない。
イメージングから細胞バーコード配列を正確にデコードするために、修正された「ビーズごとの」蛍光強度分析戦略を利用できる。各ビーズの細胞バーコード配列は、8つの強度値を昇順で並べ替え、隣接する値の各ペア間の相対強度変化を計算し、バイナリコードを割り当てるために最大相対強度変化に基づいて閾値を設定し、実際の細胞バーコード配列へのバイナリコードをマッピングすることによって決定される（図１７Ａ）。マッピングできないバイナリコードについて、コードが細胞バーコード配列に正常にマッピングされるまで、次に大きい相対強度の変化に基づいてバイナリコードが繰り返し再割り当てされる。この方法は各ビーズを独立にデコードするため、「1」と「0」の強度状態の分離が不十分な場合に、より良い結果を与えることが期待できる。
データセットPJ070及びPJ069では、「サイクルごと」法を使用したわずか24％及び37％と比較して、「ビーズごと」法を使用して46％及び57％のscRNA-seqプロファイルが細胞画像にリンクされる。両方のデータセットで、「ビーズごと」法（図１７Ｂ）を使用してリンクされた細胞の割合で少なくとも20％の増加が観察され、これは、「ビーズごと」法が画像解析による細胞識別光学バーコード配列デコーディングにより適していることを示す。
次の実験は、光学デコーディング方法を比較するために実行される：
準備。マイクロウェルアレイ装置は、洗浄バッファ（20 mM Tris-HCl pH7.9、50 mM NaCl、0.1％Twe20）で満たされ、使用の1日前に加湿チャンバー内に保管される。細胞培養物（Cell culture）又は組織サンプルが単一細胞懸濁液に分離され、望ましい蛍光色素で染色される。
細胞ローディング。事前に満たされたマイクロウェルアレイ装置は、トリス緩衝生理食塩水（TBS）でフラッシュされる。単一細胞懸濁液が、マイクロウェルアレイ装置にピペットで入れられる。 3分後、トラップされていない複数の細胞がTBSで洗い流される。
細胞イメージング。細胞をロードされたマイクロウェル装置は、自動蛍光顕微鏡（Nikon、Eclipse Ti2）を使用して、明視野及び蛍光チャンネルの下でスキャンされる。明視野画像は、RGB光源（Lumencor、Lida）と広視野10× 0.3 NA対物レンズ（Nikon、カタログ番号MRH00101）を使用して撮影される。蛍光画像は、LED光源（Lumencor、SPECTRA X）、クアッドバンドフィルターセット（Chroma、カタログ番号89402）、広視野10× 0.3 NA対物レンズ（Nikon、カタログ番号MRH00101）を使用し、それぞれカルセインAM及びカルセイン赤橙色について470 nm（GFPチャンネル）及び555 nm（TRITCチャンネル）励起で撮影される。
scRNA-seq（マイクロウェル装置で実行されるステップ）。複数のビーズ（Chemgenes）がピペットでマイクロウェル装置に入れられ、複数のトラップされていないビーズが1xTBSで洗い流される。複数の細胞とビーズを含むマイクロウェル装置は、前述のようにコンピュータ制御の試薬及び温度送達システムに接続されている。溶解バッファ（1％ 2-メルカプトエタノール（Fisher Scientific、カタログ番号BP176-100））、99％バッファTCL（Qiagen、カタログ番号1031576）、及び過フッ素化油（Sigma-Aldrich、カタログ番号F3556-25ML）が装置に流し込まれ、続いて細胞溶解を促進するために50℃で20分間インキュベートされ、その後にRNAキャプチャーのために25℃で90分間インキュベートされる。マイクロウェルを開封し、キャプチャーされていないRNA分子をすべて除去するため、RNase阻害剤（洗浄バッファ中、0.02 U / μL SUPERaseIN（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号AM2696））が添加された洗浄バッファが装置に洗い流される。逆転写混合物（1X Maxima RTバッファ、1 mM dNTPs、1 U / μL SUPERaseIN、2.5 μMテンプレートスイッチオリゴ、10 U / μL マキシマ Hマイナス逆転写酵素（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号EP0752）、0.1％Tween-20）が装置に流し込まれ、次に25℃で30分間、その後に42℃で90分間インキュベートされる。RNase阻害剤を添加された洗浄バッファが装置に洗い流される。装置は自動試薬供給システムから取り外される。エキソヌクレアーゼI反応混合物（1X Exo-Iバッファ、1 U / μL Exo-I（New England Biolabs、カタログ番号M0293L））がピペットで装置に入れられ、続いて37℃で45分間インキュベートされる。 TE / TWバッファ（10 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、0.01％Tween-20）が装置に洗い流される。
複数の光逆多重化方法。複数のcDNAを有するビーズを含むマイクロウェル装置は、コンピュータ制御の試薬送達(delivery)及びスキャンシステムに接続されている。融解バッファ（150 mM NaOH）が装置に注入され、10分間インキュベートされる。次に、装置がイメージングバッファ（2xSSC、0.1％Tween-20）で洗浄される。自動イメージングプログラムは、明視野、Cy3及びCy5発光チャンネルで装置をスキャンする。蛍光画像は、LED光源（Lumencor、スペクトルx）、クアッドバンドフィルターセット（Chroma、カタログ番号89402）、広視野10倍対物レンズ（Nikon、カタログ番号MRH00101）、及びそれぞれCy3及びCy5について555nm及び649nmの励起を使用して取得される。ハイブリダイゼーション溶液（以下に説明するプローブプールＡを添加されたイメージングバッファ）が装置に注入され、10分間インキュベートされる。次に、装置がイメージングバッファで洗浄される。自動イメージングプログラムは、明視野、Cy3及びCy5発光チャンネルで装置をスキャンする。プローブプールBからHを使用して、以前のステップを7回繰り返す。融解バッファが装置に注入され、10分間インキュベートされる。次に、装置がイメージングバッファで洗浄され、自動試薬送達システムから切断される。
複数の光プローブプールの作成。細胞イメージングを同じ細胞からのscRNA-seqとリンクさせるために、マイクロウェルアレイ内の各ビーズ上の細胞識別光学バーコード配列は、シーケンシャル蛍光プローブハイブリダイゼーションによって識別される。各細胞識別光学バーコード配列が固有の予め定義された8ビットのバイナリコードに対応する、時間的バーコード手順（temporal barcoding strategy）が使用される（図１１Ａ－１１Ｂを参照）。バイナリコードの各ビットは、１サイクルのプローブハイブリダイゼーションで読み取られることができ、ここで、ハイブリダイズされたプローブの有無は、それぞれ1又は0を示す。細胞バーコードの2つの部分は、2セットの異なる色の蛍光プローブを使用して同時にデコードされ得る。このデコーディングスキームを実現するために、ハイブリダイゼーションの各サイクルに対して蛍光プローブのプールが生成される。対応するバイナリコードで「1」とマークされた細胞バーコード配列にハイブリダイズできるすべてのプローブがプールされ、フルオロフォア、Cy5又はCy3と結合される（図１１Ｃ）。細胞識別光学バーコードを共に有する２つの８ヌクレオチド細胞バーコード配列「Ｓ」及び「Ｑ」に対する、別個のフルオロフォア結合プローブが一緒にプールされ、最終的なプローブプールを形成する（図１１Ｃ）。従って、すべての可能な細胞バーコード配列は、2色プローブハイブリダイゼーションで8サイクルでデコードされる。このアプローチはスケーラブルであり、すべてのプライマーが光学的にデコード可能なバーコードを含むため、ビーズ表面に明るい信号を提供する。従って、細胞識別光学バーコードを含むビーズは、高速なイメージングと互換性があり、より高いスループットをもたらす。
マイクロウェル装置から離れて実行されるscRNA-seqステップ。複数のマイクロウェルをシールするため、複数の細胞とビーズを含む装置に過フッ素化油がピペットで注入される。次に、装置は10の領域にカットされる。各領域からの複数のビーズは、ビーズを含むPDMSの各小片(piece)を100％エタノールに浸し、ボルテックスし、ウォーターバス超音波処理し、1.7mLマイクロ遠心チューブで遠心分離することによって分離され、抽出される。その後、PDMSはピンセットで除去される。各領域から抽出された複数のビーズは、下流のライブラリ構築のために別々の反応で処理される。複数のビーズが、TE / SDSバッファ（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0.5％SDS）、TE / TWバッファ、及びヌクレアーゼフリー水で順次洗浄される。 cDNA増幅は、50 μLのPCR溶液（1X Hifi Hot Start Readyミックス（Kapa Biosystems、カタログ番号KK2601）、1 μM SMRTpcrプライマー）で、サーモサイクラーで14回の増幅サイクル（95℃ 3分、4サイクルの（98℃ 20秒、65℃ 45秒、72℃ 3分）、10サイクルの（98℃ 20秒、67℃ 20秒、72℃ 3分）、72℃ 5分）で実行される。各小片からのPCR産物はプールされ、SPRI常磁性ビーズ（Beckman、カタログ番号A63881）を使用し、ビーズ－サンプルの体積比が0.6：1で精製される。次に、精製されたcDNAがタグメントされ（tagment）、invitro転位用のNexteraキット（Illumina、FC-131-1024）を使用して増幅される。反応あたりのインプット（input）として0.8ngのcDNAが使用される。装置の各小片から得られたライブラリにバーコードを付けるため、固有のi7インデックスプライマーが使用される。i5インデックスプライマーは、cDNAの5 '末端（RNAの3'末端に対応）を選択的に増幅するためのユニバーサルP5プライマーに置き換えられる。ビーズ－サンプルの体積比が0.6：1と1：1の2ラウンドのSPRI常磁性ビーズベースの精製が、Nextera PCR産物で連続して実行され、シーケンシング準備された（sequencing ready）ライブラリが取得される。得られた単一細胞RNA-Seqライブラリはプールされ、26サイクルの読み取り1、58サイクルの読み取り2、及び8サイクルのインデックス読み取りを使用したIllumina NextSeq500でシーケンシングする前に、20％PhiXライブラリ（Illumina、FC-131-1024）がスパイクイン（spiked-in）される。カスタムシーケンシングプライマーが読み取り1に使用される。
自動試薬送達システム。自動試薬送達及びスキャンシステムは、自動光学デコーディング用に設計されている。このシステムでは、流体の流れを駆動させるため、圧力レギュレータ（SMC Pneumatics、カタログ番号AW20-N02-Z-A）によって安定化された固定陽圧（～1 psi）が使用される。マイクロウェル装置は、インキュベーションステップ中に常に加圧され、蒸発と気泡の形成を防ぐ。2つの10チャンネルロータリーセレクターバルブ（IDEX Health＆Science、カタログ番号MLP778-605）が並列に接続され、14の試薬チャンネル間を切り替える。マイクロウェル装置の下流にある三方電磁弁（Cole-Parmer、カタログ番号EW-01540-11）は、試薬フローのオン/オフスイッチとして使用される。マルチチャンネルセレクターバルブは、USBデジタルI/O装置（National Instruments、カタログ番号SCB-68A）によって制御される。三方電磁弁は、自家製のトランジスタスイッチ回路を介して、同じUSBデジタルI/O装置によって制御される。システムは、イメージングソフトウェア（Nikon、NIS-Elements）によって制御される。
ビーズの光学デコーディング分析。細胞バーコードの光学デコーディングのため、8サイクルのプローブハイブリダイゼーション（AからH）が使用される。サイクルごとに、装置は明視野、Cy3及びCy5発光チャンネルで画像化される。複数のビーズは、最初にImageJパーティクルアナライザプラグインによって明視野画像で識別され、明視野画像内の複数のビーズの位置が記録される。次に、Cy3及びCy5画像の各ビーズの平均蛍光強度が測定される。サイクルBからHで識別された複数のビーズは、サイクルAの最も近いビーズにマッピングされる。従って、プローブハイブリダイゼーションマトリックスは、n個のビーズ× 16の強度値（Cy3の場合は8、Cy5の場合は8）で取得される。イメージングデータから細胞バーコードを呼び出すために、2つの方法がテストされる。
サイクルごと。サイクルごとの方法では、各サイクル及び各蛍光チャンネルについて；N対数変換された平均強度値を取得し；50個のビン(bin)を使用して強度ヒストグラムを計算し；強度値の中央値Mを決定し、強度値がMよりも小さい最大のビンをB1として識別し、強度値がMよりも大きい最大のビンをB2として識別し；B1とB2の間の強度値を持つ最低のビンB3を識別し；ビンB3の中央強度値Iを取得し、Iより小さい強度値に0を割り当て、Iより大きい強度値に1を割り当てる。バイナリコードテーブルを参照する。割り当てられたコードがテーブルにある場合は、対応する細胞識別光学バーコード配列を返す。
ビーズごと。ビーズごとの方法では、各ビーズ及び各蛍光チャンネルについて;8つの平均蛍光強度値x1、x2、・・・、x8を取得し；y1、y2、・・・、y8をソートされた値とし；fn =（yn+1 - yn）/ yn、n = 1,2、・・・、7を、隣接するソートされた値間の相対強度倍率変化(fold change)とし；最大の倍率変化
Figure 2022538359000004
 を決定し、y1、y2、・・・、yNの値に0を割り当て、値yN+1、yN+2、・・・、y8に1を割り当て；バイナリコードテーブルを参照する。割り当てられたコードがテーブルにある場合は、対応する細胞バーコード配列を返し；それ以外の場合は、リスト{fn}からfNを削除し、対応する細胞バーコード配列が返されるか、リスト{fn}が空になるまで、次に大きい倍率変化（fold change）を用いてプロセスを繰り返す。
実施例６
複数の細胞識別光学バーコードを含む複数のRNAキャプチャービーズを使用した、イメージング及びシーケンシングデータのリンクの精度
実験は、スループット、分子キャプチャー効率、及びイメージングデータとシーケンシングデータのリンクの精度の観点から、複数の細胞識別光学バーコードを含む複数のRNAキャプチャービーズを使用して、単一細胞の表現型画像と核酸配列データをリンクさせることを実証するために行われる。
実験は、2つの異なる色の生体染色色素で標識されたヒト（U87）とマウス（3T3）の混合細胞を使用して実行される。複数の混合細胞が比較的高い濃度でマイクロウェルにロードされ、1回の実験で9061個の転写プロファイルが取得される。飽和シーケンシング深度（saturating sequencing depth）では、細胞あたり3,548個の遺伝子から平均10,245個のRNA転写物が検出される（図１８Ａ、１８Ｂ）。リンクの精度を評価するために、各細胞の種は、蛍光標識の色及びRNA-seqの種特異的なアラインメント率（alignment rate）から識別され（特定の種のトランスクリプトームにアラインする（aligning）読み取りの90％を超える細胞が、種特異的と見なされる）、2つの細胞種の呼び出し(call)の一貫性が調べられる。イメージングデータとのリンクに成功した4,145個のscRNA-seqプロファイルでは、99.2％（0.8％エラー率）のクラスバランスのとれた（class-balanced）リンク精度が得られ、2色イメージングからはヒト細胞の98.8％とマウス細胞の99.6％が種の呼び出しに一致している（図１８Ｃ）。さらに、2色の細胞画像から複数の混合種と単一種のマルチプレット（multiplet）を手動で識別することにより、マルチプレットが確実に除去される。画像ベースとシーケンシングベースの混合種マルチプレットを比較することにより、68.8％のマルチプレット検出感度と97.0％の特異性が得られる。低純度の転写プロファイルの大部分が除去される（図１８Ｄ）。高いリンク精度が確認されているため、シーケンシングでは検出されたがイメージングでは検出されなかった混合種マルチプレットは、正解データ（ground truth）として機能するscRNA-seqデータの不完全性が原因であると考えられる。
方法。
細胞培養。ヒトU87及びマウス3T3細胞が、10％ウシ胎児血清（FBS、Life Technologies、カタログ番号16000044）を添加されたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Life Technologies、カタログ番号11965118）で、37℃??の5％二酸化炭素で培養される。
ヒトとマウスの細胞の混合実験。
37℃で10分間の培地内で、複数のヒトU87細胞がカルセインAM（ThermoFisher Scientific、カタログ番号C3100MP）で染色され、複数のマウス3T3細胞がカルセイン赤橙色（ThermoFisher Scientific、カタログ番号C34851）で染色される。次に、複数の染色された細胞は、0.25％トリプシン-EDTA（Life Technologies、カタログ番号25200-072）によって単一細胞懸濁液に分離され、TBSバッファに再懸濁される。U87及び3T3細胞が1：1の比率で混合され、最終的な総細胞濃度は1000細胞/μlである。混合された細胞懸濁液は処理及びシーケンシングされ、上記の実施例５に記載されているように画像及びシーケンシングデータが処理される。
イメージングベースのマルチプレット識別。2色の生体染色蛍光画像は、緑のカルセインAM信号及びマゼンタのカルセイン赤橙信号と併合（merge）された。各ウェルは、最小の境界正方形内で手動で検査された。複数の混合種の細胞を含むウェルは、少なくとも１つの緑色のオブジェクト及びマゼンタのオブジェクトを持つと判断され、単一細胞を持つウェルは、１つの緑色のオブジェクト又は１つのマゼンタのオブジェクトのみを持つと判断される。
第二次標本（Sub-sampling）分析。scRNA-seqデータ（図１８Ａ）の飽和挙動（saturation behavior）と感度を分析するために、上記のプロセスを用いて、アラインされた（aligned）読み取りがランダムに第二次標本化され、scRNA-seq分析で、再処理される（re-processed）。次に、合計読み取りから検出された細胞に基づいて、細胞あたりの分子及び細胞あたりの遺伝子の2つの統計が計算される。
イメージングとscRNA-seqデータのリンクの精度。リンクの精度は、scRNA-seqと、単一種に関連付けられた複数の細胞バーコードについてのイメージングベースの種の呼び出し（calling）との間の一致として定義される。scRNA-seqデータでは、特定の種に一意にアラインし読み取りの90％を超える細胞は、単一の種に対応すると見なされる。イメージングデータでは、イメージングベースの種の呼び出しは、細胞の生体染色色（staining color）に基づいて決定される。カルセインAM強度が724を超える細胞は、イメージングベースのヒト細胞と呼ばれる。カルセインの赤橙色の強度が2,048を超える細胞は、イメージングベースのマウス細胞と呼ばれる。強度閾値は、強度値の二峰性ガウス分布の2つの平均値間の最短ビンの強度として決定される。
実施例７
ヒト神経膠芽腫サンプルにおける単一細胞RNA-Seq及び細胞表現型画像解析の統合
本書に記載の細胞識別光学バーコードを使用して、ヒト組織サンプルからの光学的及び転写表現型の収集を実証するため、実験は、ヒト神経膠芽腫（GBM）手術サンプルから分離され（dissociated）、エステラーゼ活性を報告する蛍光色素であるカルセインAMで標識された細胞に対して行われる。1,954個のscRNA-seqプロファイルが取得され、そのうち1,110個が生細胞画像にリンクされる。細胞マルチプレットは、画像解析に基づいて除去される。カルセインAMは一般的に生体染色として使用され、このため、蛍光強度の低い複数の外れ値の細胞も除去される。悪性形質転換されたGBM細胞は、成人の脳の非腫瘍性神経細胞型に似ていることが多く、従って、単純なマーカーベースの分析では、悪性の状態を確認するには不十分である。これに対処するために、細胞の大集団が、遺伝子発現に基づいて、GBMに広がる2つの一般的に同時発生する異数性である第7染色体の増幅と第10染色体の喪失で識別される。集団を定義する主要な遺伝子シグネチャーを識別するために単一細胞階層的ポアソン因子分解（scHPF）を使用して、データの低次元表現が計算され、さらに細胞全体にわたるそれらの分布が均一マニフォールド近似及び射影（UMAP）を使用して視覚化される。骨髄細胞、内皮細胞、周皮細胞、悪性形質転換星状細胞様細胞（astrocyte-like cell）、間葉様細胞、オリゴデンドロサイト前駆様細胞（progenitor like cell）/神経芽細胞前駆様細胞（OPC / NPC）、及びサイクリング細胞（cycling cell）を含む、GBMのscRNA-seqから従前に報告されたすべての主要な細胞型が回収される（図１９Ａ、１９Ｂ）。16個のイメージング特徴が複数の細胞画像から測定され、それらの特徴は、教師なし階層的クラスタリングを使用して、細胞サイズ、形状、及びカルセインAM強度の3つのカテゴリにグループ化され、3つのイメージングベースのメタ特徴（meta-feature）が作成される。メタ特徴をscRNA-seq細胞型にリンクすることにより、骨髄細胞（クラスター7及び12）は比較的丸くて小さく、エステラーゼ活性が高く；内皮細胞は大きく、予想通り丸くなく、中間のエステラーゼ活性を持ち；周皮細胞は中間の形状、サイズ、強度を持っていることがわかる（図１９Ｄ）。
悪性形質転換GBM細胞のイメージング特徴と系統同一性との間の関係の同定。GBMの複数の悪性細胞は、複数の神経系統に似ており、間葉系表現型を示す可能性がある。複数の悪性GBM細胞は可塑性が高く、分化と脱分化を起こすことが知られているため、それらの系統関係を視覚化するために拡散マップが使用される。複数の悪性細胞は、上記のように異数性に基づいて選択され、悪性細胞の遺伝子発現の次元がscHPFによって減少し、因子分解されたデータが拡散マップで視覚化され、それは2つの主要な分岐を明らかにする。一方の枝は複数の星状細胞様細胞で構成され、間葉様細胞で終わり、もう一方の枝は複数のOPC / NPC細胞とサイクリング細胞で構成されている。これは、複数の星状細胞様及び間葉系神経膠腫細胞が複数のOPC様神経膠腫細胞よりも顕著に静止していることを示す、以前に発表された研究と一致している。
悪性細胞のイメージング特徴が2つの主要な細胞系統にどのように関連しているかを調べるために、細胞イメージング特徴の教師なしクラスタリングが、scRNA-seqで観察される2つの主要な系統に対応するかどうかが尋ねられる。悪性細胞は、階層的クラスタリングを使用して上記の3つのイメージングメタ特徴によってクラスター化され、2つの主要な細胞イメージングクラスターが識別される。悪性細胞を埋め込んだ拡散マップ上に2つのイメージングクラスターをプロットすることにより、OPC/NPCサイクリングの枝では、丸い形状、低強度、小さいサイズの複数の細胞（イメージングクラスター0）が濃縮され（enriched）、星状細胞-間葉系の枝では、粗い形状、高強度で大きなサイズの複数の細胞（イメージングクラスター1）が濃縮されていることがわかる（図２０）。この発見は、2つのイメージングクラスター内の複数の細胞の発現プロファイルを比較する発現差異解析（differential expression analysis）によってさらに支持される。予想した通り、複数のOPC / NPC（MAP2、OLIG1、DLL3）及び複数のサイクリング細胞（CDK6）の複数のマーカーは、イメージングクラスター0で大幅に濃縮されているが（FDR <0.05、マンホイットニーU検定）、複数の星状細胞様細胞（APOE、GFAP、GJA1、AQP4、ALDOC）及び複数の間葉系細胞（CHI3L1、CD44、CHI3L2、CCL2）の複数のマーカーは、イメージングクラスター1で大幅に濃縮されている（FDR <0.05、マンホイットニーU検定）。従って、この腫瘍の悪性形質転換細胞の主要な遺伝子発現と基本的なイメージング特徴の間には明確な対応関係がある。
方法。GBM組織処理。単細胞懸濁液は、WHOグレードIVGBMの外科的切除中に収集された過剰な物質から得られる。患者は匿名であり、標本は匿名化されている。組織は機械的に分離され、続いてハンクの平衡塩溶液中で37℃でパパインと共に30分間インキュベートされる。複数の細胞は、100xgで遠心分離後にTBSに再懸濁され、続いて塩化アンモニウムで室温で15分間赤血球が選択的に溶解される。最後に、細胞がTBSで洗浄され、Countess（ThermoFisher）を使用して定量される。複数の細胞はカルセインAM（ThermoFisher Scientific、カタログ番号C3100MP）で染色される。 GBM細胞懸濁液は、複数の細胞識別光学バーコードを含む複数のRNAキャプチャービーズを使用して処理及びシーケンスされ、本明細書の実施例５～７に記載されるようにしてイメージング及びシーケンシングデータが処理される。マルチプレットは、カルセインAM蛍光画像の最小の境界正方形内の各ウェルの手動検査に基づいて除去される。複数の死細胞は、カルセインAM蛍光強度に基づいて識別される。ガウス分布が蛍光強度ヒストグラムにフィットされ、5パーセンタイル未満の閾値が設定され、閾値より低い強度の複数の細胞が除去される。
生細胞の画像解析。画像はImageJソフトウェアを使用して分析される。複数の細胞を含む複数のマイクロウェルを識別するために、マイクロウェルの輪郭は、局所的な閾値を使用して明視野画像からオブジェクトとして識別され、次に、複数の生体染色画像内の複数のマイクロウェルの平均蛍光強度が測定される。平均強度値は二峰性分布に従い、強度の高い集団は複数の細胞を含む複数のマイクロウェルに対応する。細胞の光学的表現型を抽出するために、複数の細胞を含む複数のマイクロウェルのみが選択され、各細胞は、対応するマイクロウェルの最小の境界正方形内で個別に分析される。細胞は、自動閾値と粒子アナライザーを使用して、生体染色蛍光画像で識別される。ソフトウェアによって識別された複数の細胞を持つ複数のマイクロウェルは除外される。蛍光画像の各細胞について、16のイメージング特徴：面積、平均強度、強度の標準偏差、最小強度、最大強度、中央値強度、周囲長、幅、高さ、長軸、短軸、真円度、フェレット径、最小のフェレット径、円形度、及び面積包絡度、が測定される
光学的にバーコード化された複数のビーズを用いたscRNA-seqの分析。複数の細胞識別光学バーコード配列を含む複数のビーズを使用して収集されたscRNA-seqデータを分析するため、デザインされたオリゴヌクレオチド配列、NN（8-nt細胞バーコード S）NN（8-nt細胞バーコードQ）NNNN）に基づいて、Read 1から細胞識別光学バーコードとUMIが最初に抽出される。192個の8nt細胞バーコード配列は、すべての配列ペア（sequence pair）で少なくとも3のハミング距離を有する。従って、細胞バーコード配列で1つの置換エラーが訂正される。完全な細胞バーコードを持つ読み取り（read）のみが保持される。次に、3'ポリ（A）テール（>7Aの領域で示される）、及びポリ（A）テール除去後の24ヌクレオチド未満のフラグメントの除去の後、Read 2から併合（merge）されたヒト/マウスゲノム（ヒトの場合はGRCh38、マウスの場合はGRCm38）へ、STAR v.2.7.0アライナを使用して、読み取りが併合されたGENCODEトランスクリプトームアノテーション（両方の種のGENCODE v.24）にアラインされる。アノテーションされたストランド（annotated strand）上のエクソンに一意にマッピングされた読取りのみがダウンストリーム分析に含まれる。同一の細胞バーコード、UMI（1回の置換エラー訂正後）及び遺伝子マッピングを使用した読み取りは、同じcDNA分子に由来し、折り畳まれている（collapsed）と見なされる。最後に、この情報は分子カウントマトリックス（count matrix）を生成するために使用される。
細胞イメージングとシーケンシングデータをリンクするための光学的にバーコード化された複数のビーズ。イメージングから識別された複数の細胞識別光学バーコードを、細胞イメージング表現型にリンクするために、光学デコーディング中に取得されたマイクロウェル装置の明視野画像が、左上及び右下のマイクロウェルに基づいて生細胞イメージングの画像にマッピングされる。次に、複数の細胞はマイクロウェル半径内で最も近くマッピングされたビーズに登録される。細胞イメージングの表現型を発現プロファイルにリンクするために、登録された複数の細胞を含む複数の細胞バーコードのみが考慮され、イメージング及びシーケンシングから複数の細胞識別光学バーコードの正確で固有のマッピングが見つけられる。
単一細胞階層的ポアソン因子分解（scHPF）分析。scRNA-seqの結果の次元を減らすために、デフォルトパラメータとK = 13のscHPFを使用して、遺伝子カウントマトリックス（gene count matrix）が因子分解される。ファクター（factor）の1つは、高い遺伝子スコア（上位50個の遺伝子の中で）を持ついくつかのヒートショックを含み、おそらく特定の複数の細胞の分離アーティファクト（dissociation artifact）を示す。このファクターは、すべてのダウンストリーム分析で除去される。
悪性細胞の同定。細胞の異数性分析は、前述のようにscHPFモデルに基づいて実行された。scHPFに帰属する（imputed）発現マトリックスを計算するため、遺伝子及び細胞の重み行列（変数θとβの期待行列）がscHPFモデルで乗算され、結果の行列がlog2（期待カウント/10000 + 1）として対数変換される。各体細胞染色体上の平均遺伝子発現は、前述のようにscHPFに帰属するカウントマトリックスを使用して計算される。悪性腫瘍スコアは、Chr.7遺伝子の平均発現と、Chr.10遺伝子のそれとの差、<log2（Chr.7発現）>-<log2（Chr.10発現）>として定義される。二重（double）ガウス分布が悪性度スコアにフィットされ、2つの平均強度間の最短ビンのスコアが悪性及び非悪性細胞集団を分離する閾値として使用される。悪性及び非悪性細胞の間の染色体平均発現の差は、非悪性細胞の平均発現を差し引かれた発現として計算される。
scRNA-seqのクラスタリングと視覚化。scHPFモデル（図１９Ａ）を視覚化するために、細胞スコア行列から計算されたピアソン相関距離行列を使用してUMAP埋め込みが生成される。scRNA-seqプロファイルをクラスター化するため、ピアソン相関行列及びk = 50と共にルーバンコミュニティ（Louvain community）検出のフェノグラフ実装が使用され、k最近傍グラフが作成される。
細胞の光学的表現型のクラスタリング。細胞イメージング特徴の次元を減らすために、16個の細胞イメージング特徴がz正規化され、相関距離と共にPythonモジュール「SciPy」の「リンケージ（linkage）」法を使用して階層的にクラスター化される。図１９Ｃの樹状図は、k = 3としてカットされ、細胞サイズ、形状、及びエステラーゼ活性に対応するイメージング特徴の3つのクラスターを形成する。メタ特徴の複数の値は、各クラスター内のイメージング特徴の平均として計算される。複数の悪性細胞をそれらの光学的表現型に基づいてクラスター化するために、相関距離と共にPythonモジュール「SciPy」の「リンケージ」法を使用して、イメージングメタ特徴が階層的にクラスター化される。
悪性形質転換された複数のGBM細胞の拡散マップ埋め込み。デフォルトパラメータとK = 15のscHPFを使用して、悪性形質転換された複数のGBM細胞の分子数マトリックス（上記の異数性分析によって特定）が、因子分解される。さらなる分析の前に、15のファクターのうちの1つが除去され、これは細胞のサブセットの分離アーティファクトを表す可能性が高いため、ヒートショック応答遺伝子の高いスコアを示す。次に、拡散成分がDMAPS Pythonライブラリを使用して計算される。scHPF細胞スコア行列から計算されたピアソン相関距離行列は、カーネル帯域幅0.5の入力として使用される。最初の2つの拡散成分が図１９Ｄにプロットされている。
scRNA-seq差次的発現（differential expression）。マンホイットニーU検定は、差次的発現分析に使用される。細胞の2つのグループを対ごとに比較するために、細胞の数が多いグループは、細胞の数が少ないグループと同じ細胞番号にランダムに第二次標本化される。次に、2つのグループが細胞ごとに検出された同一の分子の平均数を持つよう、細胞ごとに検出された分子の平均数が多いグループから検出された分子がランダムに第二次標本化される。結果として得られる第二次標本化された行列は、scranRパッケージに実装されているランダムプーリング（random pooling）法を使用して正規化される。最後に、結果として得られる正規化された行列は、PythonパッケージSciPyの「mannwhitneyu」関数を使用したマンホイットニーU検定を使用し、遺伝子ごとの差次的発現検定にかけられる。結果としてのp値は、Pythonパッケージstatsmodelsの「multipletests」関数に実装されているBenjamini-Hochberg法を使用して修正される。
参考文献
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9. Yuan J, Sims PA: An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Sci Rep 2016, 6:33883.
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12. Sims CE, Allbritton NL: Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip 2007, 7:423-440.

Claims (53)

  1. 単一細胞イメージングを固有の光学バーコード読み出しと関連付け、複数のRNAライブラリを調製するための自動システムであって、前記システムは、
    流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、
    前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、
    前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、
    前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムは以下の、
    前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；
    前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある前記細胞の１又はそれ以上の第１の画像を取得すること；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列及びRNA結合配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びRNAライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；
    前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；
    前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；
    前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；並びに、
    プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；
    を含む複数の操作を実行するように構成された、
    システム。
  2. 前記複数の操作は、前記イメージングサブシステムを使用して前記マイクロウェルアレイを画像化し、前記マイクロウェル内の細胞溶解の完了を監視するために画像解析を実行することを含む、請求項１に記載のシステム。
  3. RNAライブラリサンプル調製用の前記１又はそれ以上の試薬が逆転写ミックスを含み、
    前記複数の操作は、画像解析の実行に基づいて細胞溶解の完了を決定した後、前記流体サブシステムを使用して前記マイクロウェルアレイ上に前記逆転写ミックスを流すことを含む、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記複数の操作は、前記複数の位置の各位置について、その位置の前記第１の画像を使用して、前記その位置に対応するマイクロウェルに描かれた細胞の数を決定することを含む、請求項１に記載のシステム。
  5. 前記複数の操作は、前記複数のマイクロビーズを回収することを含む、請求項１に記載のシステム。
  6. 前記複数の操作は、
    各細胞識別光学バーコードについて、核酸シーケンシングデータを受け取り、
    前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶することを含む、請求項１に記載のシステム。
  7. マイクロウェルアレイを含む、請求項１に記載のシステム。
  8. 前記熱的サブシステムは、前記マイクロウェルアレイを保持する前記ステージと熱的に接続され、前記複数の操作は、前記熱的サブシステムを制御して前記マイクロウェルアレイに熱を加えることを含む、請求項１に記載のシステム。
  9. 前記流体サブシステムは、流量ユニット、流量制御ユニット、１又はそれ以上のバルブユニット、及び１又はそれ以上の加圧された試薬リザーバを含み、前記複数の操作は、前記流量制御ユニット及びバルブ切替を制御することを含む、請求項１に記載のシステム。
  10. 単一細胞イメージングデータをRNAトランスクリプトミクスと関連付けるための自動化方法であって、前記方法はシステムを初期化することを含み、前記システムは、
    流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、
    前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、
    前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、
    前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムを以下の、
    前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；
    前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得すること；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列及びRNA結合配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びRNAライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；
    前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；
    前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；
    前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；
    プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；並びに、
    前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること；
    を含む複数の操作を実行するために用い、
    これにより前記単一細胞イメージングデータが、その細胞の前記RNAトランスクリプトームと関連付けられる、方法。
  11. 前記イメージングサブシステムを使用して前記マイクロウェルアレイを画像化し、前記マイクロウェル内の細胞溶解の完了を監視するために画像解析を実行することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. RNAライブラリ調製用の前記１又はそれ以上の試薬が逆転写ミックスを含み、画像解析の実行に基づいて細胞溶解の完了を決定した後、前記流体サブシステムを使用して前記マイクロウェルアレイ上に前記逆転写ミックスを流すことを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記複数の位置の各位置について、その位置の前記第１の画像を使用して、前記その位置に対応するマイクロウェルに描かれた細胞の数を決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記複数のマイクロビーズを回収することを含む、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記熱的サブシステムを制御して前記マイクロウェルアレイに熱を加えることを含む、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記流体サブシステムは、流量ユニット、流量制御ユニット、１又はそれ以上のバルブユニット、及び１又はそれ以上の加圧された試薬リザーバを含み、前記方法は、前記流量制御ユニット及びバルブ切替を制御することを含む、請求項１０に記載の方法。
  17. イメージングサブシステムを使用して、その位置にある前記１又はそれ以上の第１の画像を取得することはさらに、
    細胞の光学的表現型の特徴の１又はそれ以上を測定すること；及び
    前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴と、前記第１の画像のそれぞれに関連する核酸シーケンシングデータとの間の関係の表現を生成すること、を含み、
    ここで、前記単一細胞の表現型の特徴と、前記関連するシーケンシングデータとの間の相関は、単一細胞の光学的表現型と、その単一細胞のトランスクリプトミクスに基づく細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する、請求項１０に記載の方法。
  18. 前記細胞の光学的表現型の特徴が、面積、平均強度、強度の標準偏差、最小強度、最大強度、中央値強度、周囲長、幅、高さ、長軸、短軸、真円度、フェレット径、最小のフェレット径、円形度、又は面積包絡度の１又はそれ以上を含む、請求項１０に記載の方法。
  19. 単一細胞の光学的表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定するための方法であって、システムを初期化することを含み、前記システムは、
    流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、
    前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、
    前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、
    前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムを以下の、
    前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；
    前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得し、及び、１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴を測定すること；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列及びRNA結合配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びRNAライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；
    前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；
    前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；
    前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；
    プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；
    前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること；並びに、
    前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴と、前記第１の画像のそれぞれに関連する前記核酸シーケンシングデータとの間の関係の表現を生成すること、
    を含む複数の操作を実行するために用い、
    ここで、前記単一細胞の表現型の特徴と、前記関連するシーケンシングデータとの間の相関は、単一細胞の光学的表現型と、その単一細胞のトランスクリプトミクスに基づく細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する、方法。
  20. 前記細胞の光学的表現型の特徴が、面積、平均強度、強度の標準偏差、最小強度、最大強度、中央値強度、周囲長、幅、高さ、長軸、短軸、真円度、フェレット径、最小のフェレット径、円形度、又は面積包絡度の１又はそれ以上を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記細胞の光学的表現型の特徴が、明視野、暗視野、蛍光、発光、ラマン、又は散乱顕微鏡の１又はそれ以上から導き出される、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記複数の細胞が、組織、腫瘍、細胞培養物、体液、血液サンプル、尿サンプル、又は唾液サンプルを含む、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記複数の細胞がヒト、哺乳動物、又は動物の細胞である、請求項１９に記載の方法。
  24. 前記複数の細胞が、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、間質細胞、幹細胞、神経細胞、又は腫瘍細胞である、請求項１９に記載の方法。
  25. 前記複数の細胞が免疫細胞であり、前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴が免疫表現型の特徴を含む、請求項１９に記載の方法。
  26. 前記複数の細胞が遺伝子改変を受けた細胞であり、前記特定された対応が、前記光学的表現型の特徴と、前記遺伝子改変を伴う又は伴わない細胞クローンとの間のものである、請求項１９に記載の方法。
  27. 遺伝子改変を受けた前記複数の細胞が、幹細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞である、請求項２６に記載の方法。
  28. 単一細胞イメージングを固有の光学バーコード読み出しと関連付け、複数のシーケンシングライブラリを調製するための自動システムであって、前記システムは、
    流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、
    前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、
    前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、
    前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムは以下の、
    前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；
    前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある前記細胞の１又はそれ以上の第１の画像を取得すること；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列、及び細胞核酸をキャプチャーするためのプライマー配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びシーケンシングライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；
    前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；
    前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；
    前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；並びに、
    プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；
    を含む複数の操作を実行するように構成された、
    システム。
  29. 前記プライマー配列は、
    RNA、mRNA、及び非コードRNAをキャプチャーするためのオリゴ（dT）；
    あらゆるDNA若しくはRNAをキャプチャーするためのランダム配列；又は
    DNA遺伝子座若しくはRNA転写物を標的とする特定の配列、である、請求項２８に記載のシステム。
  30. 前記複数の操作は、前記イメージングサブシステムを使用して前記マイクロウェルアレイを画像化し、前記マイクロウェル内の細胞溶解の完了を監視するために画像解析を実行することを含む、請求項２８に記載のシステム。
  31. 前記複数の操作は、前記複数の位置の各位置について、その位置の前記第１の画像を使用して、前記その位置に対応するマイクロウェルに描かれた細胞の数を決定することを含む、請求項２８に記載のシステム。
  32. 前記複数の操作は、前記複数のマイクロビーズを回収することを含む、請求項２８に記載のシステム。
  33. 前記複数の操作は、
    各細胞識別光学バーコードについて、核酸シーケンシングデータを受け取り、
    前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶することを含む、請求項２８に記載のシステム。
  34. マイクロウェルアレイを含む、請求項２８に記載のシステム。
  35. 前記熱的サブシステムは、前記マイクロウェルアレイを保持する前記ステージと熱的に接続され、前記複数の操作は、前記熱的サブシステムを制御して前記マイクロウェルアレイに熱を加えることを含む、請求項２８に記載のシステム。
  36. 前記流体サブシステムは、流量ユニット、流量制御ユニット、１又はそれ以上のバルブユニット、及び１又はそれ以上の加圧された試薬リザーバを含み、前記複数の操作は、前記流量制御ユニット及びバルブ切替を制御することを含む、請求項２８に記載のシステム。
  37. 単一細胞イメージングデータを核酸シーケンシングデータと関連付けるための自動化方法であって、前記方法はシステムを初期化することを含み、前記システムは、
    流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、
    前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、
    前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、
    前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムを以下の、
    前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；
    前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得すること；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列、及び細胞核酸をキャプチャーするためのプライマー配列を有する複数のマイクロビーズを、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びシーケンシングライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；
    前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；
    前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；
    前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；
    プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；並びに、
    前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること；
    を含む複数の操作を実行するために用い、
    これにより、前記単一細胞イメージングデータが、その細胞の前記核酸配列と関連付けられる、方法。
  38. 前記プライマー配列は、
    RNA、mRNA、及び非コードRNAをキャプチャーするためのオリゴ（dT）；
    あらゆるDNA若しくはRNAをキャプチャーするためのランダム配列；又は
    DNA遺伝子座若しくはRNA転写物を標的とする特定の配列、である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記イメージングサブシステムを使用して前記マイクロウェルアレイを画像化し、前記マイクロウェル内の細胞溶解の完了を監視するために画像解析を実行することを含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記複数の位置の各位置について、その位置の前記第１の画像を使用して、前記その位置に対応するマイクロウェルに描かれた細胞の数を決定することを含む、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記複数のマイクロビーズを回収することを含む、請求項３７に記載の方法。
  42. 前記熱的サブシステムを制御して前記マイクロウェルアレイに熱を加えることを含む、請求項３７に記載の方法。
  43. 前記流体サブシステムは、流量ユニット、流量制御ユニット、１又はそれ以上のバルブユニット、及び１又はそれ以上の加圧された試薬リザーバを含み、前記方法は、前記流量制御ユニット及びバルブ切替を制御することを含む、請求項３７に記載の方法。
  44. 単一細胞の光学的表現型と、細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定するための方法であって、システムを初期化することを含み、前記システムは、
    流体サブシステム、熱的サブシステム、及びイメージングサブシステムを含む機器アセンブリと、
    前記機器アセンブリに結合された制御サブシステムと、を含み、
    前記イメージングサブシステムがマイクロウェルアレイを保持するように構成されたステージを含み、
    前記制御サブシステムは少なくとも１つのプロセッサ及びメモリを含み、前記制御サブシステムを以下の、
    前記流体サブシステムを使用して複数の細胞を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数の細胞のサブセットが前記マイクロウェル内に単一の細胞として存在し；
    前記マイクロウェルアレイ内の複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用して、その位置にある１又はそれ以上の第１の画像を取得し、及び、１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴を測定すること；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞識別光学バーコード配列を有する複数のマイクロビーズ、及び細胞核酸に結合するためのプライマー配列を、前記マイクロウェルアレイ上に流すこと、ここで前記複数のビーズのサブセットが前記マイクロウェル内に単一細胞－ビーズ対として存在し；
    前記流体サブシステムを使用して、細胞溶解バッファ、及びシーケンシングライブラリ調製用の１又はそれ以上の試薬を前記マイクロウェルアレイ上に流すこと；
    前記流体サブシステムを使用して、前記マイクロウェルアレイ上に複数の光学的ハイブリダイゼーションプローブのＮ個のプールの第１を流し、及び、前記細胞識別光学バーコード配列内の相補的ヌクレオチド配列を有してそこに位置する前記ビーズに、前記プローブをハイブリダイズすること；
    前記複数の位置の各位置について、前記イメージングサブシステムを使用してその位置での蛍光強度を定量化するために１又はそれ以上の第２の画像を取得すること、ここで前記１又はそれ以上の第２の画像のそれぞれは、少なくとも１つの前記光学的ハイブリダイゼーションプローブと、前記細胞識別光学バーコードとの間の一致又は不一致を表現するバイナリコードを生成するために使用され；
    前記流動及びハイブリダイズのステップを繰り返し、プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれについて前記１又はそれ以上の第２の画像ステップを取得すること；及び、
    プローブの前記Ｎ個のプールのそれぞれの前記バイナリコードを前記細胞識別バーコード配列にマッピングすることにより、前記複数の位置の各位置について、前記位置の前記細胞識別光学バーコードを決定し、及び、前記位置の前記細胞識別光学バーコードとその位置の前記第１の画像との関連性のデータを記憶すること；
    前記複数の位置の各位置について、各細胞識別光学バーコードについて核酸シーケンシングデータを受け取った後、前記核酸シーケンシングデータ、前記細胞識別光学バーコード、及び前記細胞識別光学バーコードに関連付けられた前記第１の画像の間の関連性のデータを記憶すること；並びに、
    前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴と、前記第１の画像のそれぞれに関連する前記核酸シーケンシングデータとの間の関係の表現を生成すること、
    を含む複数の操作を実行するために用い、
    ここで、前記単一細胞の表現型の特徴と、前記関連するシーケンシングデータとの間の相関は、単一細胞の光学的表現型と、その単一細胞の核酸配列に基づく細胞型、系統、又はクローンとの間の対応を特定する、方法。
  45. 前記プライマー配列は、
    RNA、mRNA、及び非コードRNAをキャプチャーするためのオリゴ（dT）；
    あらゆるDNA若しくはRNAをキャプチャーするためのランダム配列；又は
    DNA遺伝子座若しくはRNA転写物を標的とする特定の配列、である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記細胞の光学的表現型の特徴が、面積、平均強度、強度の標準偏差、最小強度、最大強度、中央値強度、周囲長、幅、高さ、長軸、短軸、真円度、フェレット径、最小のフェレット径、円形度、又は面積包絡度の１又はそれ以上を含む、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記細胞の光学的表現型の特徴が、明視野、暗視野、蛍光、発光、ラマン、又は散乱顕微鏡の１又はそれ以上から導き出される、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記複数の細胞が、組織、腫瘍、細胞培養物、体液、血液サンプル、尿サンプル、又は唾液サンプルを含む、請求項４４に記載の方法。
  49. 前記複数の細胞がヒト、哺乳動物、又は動物の細胞である、請求項４４に記載の方法。
  50. 前記複数の細胞が、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、間質細胞、幹細胞、神経細胞、又は腫瘍細胞である、請求項４４に記載の方法。
  51. 前記複数の細胞が免疫細胞であり、前記１又はそれ以上の細胞の光学的表現型の特徴が免疫表現型の特徴を含む、請求項４４に記載の方法。
  52. 前記複数の細胞が遺伝子改変を受けた細胞であり、前記特定された対応が、前記光学的表現型の特徴と、前記遺伝子改変を伴う又は伴わない細胞クローンとの間のものである、請求項４４に記載の方法。
  53. 遺伝子改変を受けた前記複数の細胞が、幹細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞である、請求項４４に記載の方法。
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