KR20240023042A - 체적 차세대 인시투 시퀀서 - Google Patents

체적 차세대 인시투 시퀀서 Download PDF

Info

Publication number
KR20240023042A
KR20240023042A KR1020237043325A KR20237043325A KR20240023042A KR 20240023042 A KR20240023042 A KR 20240023042A KR 1020237043325 A KR1020237043325 A KR 1020237043325A KR 20237043325 A KR20237043325 A KR 20237043325A KR 20240023042 A KR20240023042 A KR 20240023042A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequencing
sample
immersion
objective
region
Prior art date
Application number
KR1020237043325A
Other languages
English (en)
Inventor
칼 에이 다이서로스
이썬 비 리치맨
Original Assignee
더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 filed Critical 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티
Publication of KR20240023042A publication Critical patent/KR20240023042A/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G01N15/1433—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N21/8483—Investigating reagent band
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices

Abstract

체적 조직 샘플의 자동화 인시투 시퀀싱을 위한 시퀀서가 제공된다. 특히, 다수의 샘플에 대해 병렬로 작동할 수 있는 자동화 체적 인시투 시퀀싱 디바이스가 제공된다. 시퀀서의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

용적 측정용 차세대 제자리 시퀀서
생물학적 샘플은 개별 세포 및 전체 조직의 길이 스케일에 걸친 복잡하고 이질적인 유전 정보를 함유한다. 세포 내의 핵산의 공간 패턴은 세포 기능의 특성 및 이상을 드러낼 수 있고; RNA 발현의 누적 분포는 세포 유형 또는 기능을 정의할 수 있고; 조직 내의 세포 유형의 위치에서의 체계적인 변화는 조직 기능을 정의할 수 있다. 핵산에 인코딩된 해부학적 연결성 정보 및 조직-전체 세포 유형 분포의 조합은 많은 조직 영역 및 섹션에 걸쳐 있을 수 있다. 따라서, 인시투 핵산 시퀀싱(in situ nucleic acid sequencing)을 위한 기술은 개별 분자만큼 작고 전체 뇌만큼 큰 분해능을 연결할 수 있어야 한다. 수십 배의 길이 차이에 걸쳐 이러한 정보를 효율적으로 수집하고 기록하기 위해서는 인시투 시퀀싱 기술의 강건성, 신속성, 자동화 및 고속대량 특성을 향상시키기 위한 신규한 발명이 필요하다.
체적 조직 샘플(volumetric tissue sample)의 자동화 인시투 시퀀싱을 위한 시퀀싱 디바이스가 제공된다. 특히, 다수의 샘플에 대해 동시에 고분해능으로 작동할 수 있는 자동화 체적 인시투 시퀀싱 디바이스(automated volumetric in situ sequencing device)가 제공된다. 시퀀싱 디바이스는 자동화된 침지와 자동화 인시투 시퀀싱 기능을 결합한다. 시퀀싱 디바이스는 고분해능 능력으로부터 이익을 얻는 조합 시퀀싱에 특히 유용하다. 시퀀서의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다.
일 양태에서, 시퀀싱 디바이스가 제공되고, 상기 디바이스는 (a) 조명 및 검출 모듈로서, 플랫 조명 보정부(flat illumination correction)를 구비하는 조명하기 위한 복수의 레이저 라인을 포함하는 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트로서, 복수의 레이저 라인은 하나 이상의 파장의 여기 광으로 샘플을 조명하는 데 사용되는, 상기 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트, 대역통과 방출 필터, 롱-패스(long-pass) 이미지 스플리터, 제1 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제1 카메라 및 제2 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제2 카메라를 포함하되, 제1 카메라 및 제2 카메라는 방출을 동시에 검출할 수 있는, 상기 조명 및 검출 모듈; (b) 현미경 모듈로서, x, y, 및 z 축을 따라 다축 포지셔닝이 가능한 전동식 스테이지, 대물렌즈 Z 드라이브, 다수의 대물렌즈를 포함하는 대물렌즈 터릿 휠(objective turret wheel)로서, 각각의 대물렌즈는 상이한 배율을 제공하고, 하나 이상의 대물렌즈가 침지 대물렌즈(immersion objective)이고, 각각의 침지 대물렌즈는 대물렌즈 침지 칼라(objective immersion collar)를 갖는, 상기 대물렌즈 터릿 휠, 및 대물렌즈로부터 상기 조명 및 검출 모듈로 광을 라우팅하는 광학계(optic)를 포함하는, 상기 현미경 모듈; (c) 자동화 침지 매질 모듈로서, i) 침지 매질을 포함하는 용기, ii) 용기에 그리고 현미경 모듈의 대물렌즈의 대물렌즈 침지 칼라에 커플링된 유체 라인으로서, 유체 라인은 현미경 모듈의 침지 대물렌즈의 대물렌즈 침지 칼라로 또는 대물렌즈 침지 칼라로부터 침지 매질을 운반하고, 침지 칼라는 과잉 침지 매질을 포획하는, 상기 유체 라인 및 iii) 유체 라인에 그리고 마이크로컨트롤러에 연결된 일련의 펌프를 포함하되, 마이크로컨트롤러는 유체 라인을 통해 침지 매질의 펌프 첨가 및 제거를 제어하고, 자동화 침지 매질 모듈은 이미징 동안 대물렌즈의 상부에서 대물렌즈 침지 칼라에 제어된 체적의 침지 매질을 제공하는, 상기 자동화 침지 매질 모듈; (d) 다중-웰 플레이트로서, 전동식 스테이지가 이미징에 사용되는 대물렌즈 아래에 다중-웰 플레이트의 웰을 포지셔닝하도록 이동될 수 있는, 상기 다중-웰 플레이트; (e) 유체 커플링 타워로서, 전동식 스테이지의 상부에 있고 다중-웰 플레이트의 웰에 유체 라인을 포지셔닝하는, 상기 유체 커플링 타워; (f) 유체 관리 모듈로서, 로터리 밸브 기구를 포함하는 대칭형 로터리 밸브, 유체 라인에 연결된 펌프, 및 펌프로 이어지는 유체 라인의 어느 한 측면 상에 포지셔닝되는 버블 검출기를 포함하되, 유체 라인을 통해 시약, 완충제 및 폐기물의 단방향 또는 양방향 이동을 가능하게 하는, 상기 유체 관리 모듈; (g) 시약, 완충제 및 폐기물 모듈로서, i) 슬라이딩 트레이로서, 시약 카트리지 및 완충제 카트리지가 슬라이딩 트레이에 포지셔닝되고 유체 관리 모듈에 커플링될 수 있는, 상기 슬라이딩 트레이, ii) 유체 관리 펌프로부터의 유체 라인에 커플링되는 폐기물 용기를 포함하는 폐기물 모듈, 및 iii) 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 폐기물 용기를 닫고, 폐기물 용기가 시스템으로 다시 배치될 때 폐기물 용기를 개방하는 캐핑 기구를 포함하는, 상기 시약, 완충제 및 폐기물 모듈; (h) 전기 모듈로서, i) 자동화 침지 매질 모듈로부터 매질 분배를 제어하는 제1 펌웨어 보드 및 ii) 유체 관리 모듈 및 시약, 완충제 및 폐기물 모듈을 제어하는 제2 펌웨어 보드를 포함하되, 시스템의 다른 모듈에 대한 전력을 조절하는, 상기 전기 모듈; 및 (i) 사용자 인터페이스를 제공하고 시퀀싱 디바이스의 모듈을 작동시키도록 프로그래밍된 프로세서를 포함한다.
특정 실시형태에서, 복수의 레이저 라인은 적어도 4개의 레이저 라인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 복수의 레이저 라인은 적어도 5개의 레이저 라인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대역통과 방출 필터는 펜타-대역통과 방출 필터이다.
특정 실시형태에서, 전동식 스테이지는 피에조 z-축을 갖는다.
특정 실시형태에서, 침지 매질은 물이다.
특정 실시형태에서, 침지 매질은 여과되고 버블이 없다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 각각의 대물렌즈 위에 수축-래핑된 코팅(shrink-wrapped coating) 및 O-링을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 유체 라인의 압력을 모니터링하기 위한 압력 모니터를 추가로 포함하고, 여기서 유체 라인의 압력 증가는 유체 라인의 잠재적인 막힘을 검출하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 복수의 발광 다이오드(LED)를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 LED는 시스템에 대한 상태 표시를 제공하기 위해 광을 방출할 수 있다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 정보를 디스플레이하고 사용자 인터페이스를 제공하기 위한 디스플레이 컴포넌트를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 (a) 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계; (b) 카메라 비닝과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율에서 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계; (c) 신호를 사용하여 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계; (d) XY 바운딩 박스 내에서 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝으로 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 그리고 XY 범위에 걸쳐 수집되는 단계; (e) 단계 (d)에서 생성된 이미지를 디스플레이하는 단계; (f) 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미징될 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 정제하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계; (g) 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 선택된 관심 XY 영역에서 샘플을 이미징하는 단계; (h) 샘플에서 관심 영역의 체적을 계산하고, 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 사용자에게 디스플레이하는 단계; (i) Z 범위를 따라 관심 영역에서 샘플의 이미지를 분할하는 단계; (j) 사용자에 의해 정의된 관심 영역으로부터 유래된 이미징 범위는 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주된 시야로 자동 변환되어 시퀀싱 동안 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 XYZ 축을 따라 상기 관심 영역의 이미징을 위한 피에조 경계를 조정하는 단계; 및 (k) 사용자가 시퀀싱하고자 하는 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 단계 (j)를 반복하는 단계를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍된다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택할 수 있도록 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지를 제한하는 단계; 시퀀싱 및 이미징될 모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계, 및 제약 조건 내에서 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍된다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍된다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z의 빠른 공초점 스위프를 수행하여 시작 XY 포지션에서 샘플의 Z 프로파일을 결정하는 단계; 분할 방법을 사용하여 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및 샘플 몽타주의 시작에서 인터페이스로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 스테이지 및 대물렌즈에 대한 샘플의 Z에서의 드리프트(drift)가 선택된 허용 오차 미만으로 감소되어 획득 후 프로세싱 동안의 라운드를 가로질러 다운스트림 서브픽셀 등록을 용이하게 하는 단계를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍된다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱은 조직 샘플에서 표적 핵산의 인시투 시퀀싱이다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 50 내지 200㎛의 두께를 갖는 두꺼운 조직 슬라이스이다. 다른 실시형태에서, 조직 샘플은 5 내지 20㎛의 두께를 갖는 얇은 조직 슬라이스이다. 일부 실시형태에서, 인시투 시퀀싱은 순차적 또는 조합적 인시투 시퀀싱이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 시퀀싱 디바이스를 사용하는 방법이 제공되며, 방법은 샘플을 다중-웰 플레이트에 로딩하는 단계; 다중-웰 플레이트에서 어떤 샘플이 시퀀싱되는 지 선택하는 단계; 시퀀싱 프로토콜을 선택하는 단계; 및 본 명세서에 기재된 시퀀싱 디바이스를 사용하여 선택된 샘플에서 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 시퀀싱은 조직 샘플에서 표적 핵산의 인시투 시퀀싱이다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 50 내지 200㎛의 두께를 갖는 두꺼운 조직 슬라이스이다. 다른 실시형태에서, 조직 샘플은 5 내지 20㎛의 두께를 갖는 얇은 조직 슬라이스이다. 일부 실시형태에서, 인시투 시퀀싱은 순차적 또는 조합적 인시투 시퀀싱이다.
또 다른 양태에서, 컴퓨터 구현 방법이 제공되며, 컴퓨터는 (a) 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계; (b) 카메라 비닝과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율에서 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계; (c) 신호를 사용하여 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계; (d) XY 바운딩 박스 내에서 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝으로 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 그리고 XY 범위에 걸쳐 수집되는 단계; (e) 단계 (d)에서 생성된 이미지를 디스플레이하는 단계; (f) 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미지화될 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 선택하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계; (g) 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 선택된 관심 XY 영역에서 샘플을 이미징하는 단계; (h) 관심 영역의 샘플 체적을 계산하고, 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 사용자에게 디스플레이하는 단계; (i) Z 범위를 따라 관심 영역에서 샘플의 이미지를 분할하는 단계; (j) 사용자가 시퀀싱을 시작하기 전에 샘플 체적의 Z 범위를 조정할 수 있도록 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 사용자에 의해 정의된 관심 영역으로부터 유래된 이미징 범위는 시퀀싱 동안 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 XYZ 축을 따라 관심 영역의 이미징을 위한 피에조 경계를 조정하기 위해, 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주된 시야로 자동 변환되는 단계; 및 (k) 사용자가 시퀀싱하고자 하는 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 단계 (j)를 반복하는 단계를 포함하는 단계들을 수행한다.
또 다른 양태에서, 컴퓨터 구현 방법이 제공되며, 컴퓨터는 사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택하기 위해 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지를 제한하는 단계; 시퀀싱 및 이미징될 모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계; 및 제약 내의 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계를 포함하는 단계들을 수행한다. 일부 실시형태에서, 컴퓨터는 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍된다.
또 다른 양태에서, 컴퓨터 구현 방법이 제공되며, 컴퓨터는 시작 XY 포지션에서 샘플의 Z 프로파일을 결정하기 위해 주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z의 빠른 공초점 스위프를 수행하는 단계; 분할 방법을 사용하여 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및 샘플 몽타주의 시작에서 계면으로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 스테이지 및 대물렌즈에 대한 샘플의 Z에서의 드리프트는 획득 후 프로세싱 동안 라운드에 걸친 다운스트림 서브픽셀 등록을 촉진하기 위해 선택된 허용 오차 미만으로 감소되는 단계를 포함하는 단계들을 수행한다.
또 다른 양태에서, 컴퓨터의 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서로 하여금 본 명세서에 기재된 임의의 컴퓨터 구현 방법을 수행하게 하는 프로그램 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체가 제공된다.
또 다른 양태에서, 자동화 침지 매질 모듈은 (a) 침지 매질을 포함하는 용기; (b) 용기에 그리고 현미경 모듈의 대물렌즈의 대물렌즈 침지 칼라에 커플링된 유체 라인으로서, 유체 라인은 침지 대물렌즈 상의 대물렌즈 침지 칼라로 및 이로부터 침지 매질을 운반하고, 침지 칼라는 과잉의 침지 매질을 포획하는, 유체 라인; 및 (c) 유체 라인에 그리고 마이크로컨트롤러에 연결된 일련의 펌프로서, 마이크로컨트롤러는 유체 라인을 통해 침지 매질의 펌프 첨가 및 제거를 제어하고, 자동화 침지 매질 모듈은 이미징 동안 대물렌즈의 상부에서 대물렌즈 침지 칼라에 제어된 체적의 침지 매질을 제공하는, 일련의 펌프를 포함한다.
또 다른 양태에서, 자동화 침지 매질 모듈을 사용하는 방법이 제공되며, 방법은 현미경의 침지 대물렌즈에 부착된 대물렌즈 침지 칼라에 침지 매질을 전달하기 위해 자동화 침지 매질 모듈을 사용하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 유체 관리 모듈이 제공되며, 모듈은 로터리 밸브 기구를 포함하는 대칭형 로터리 밸브, 유체 라인에 연결된 펌프, 및 펌프로 이어지는 유체 라인의 어느 한 쪽 상에 포지셔닝되는 버블 검출기를 포함하며, 여기서, 유체 관리 모듈은 유체 라인을 통한 시약, 완충제 및 폐기물의 양방향 또는 단방향 이동을 가능하게 한다.
또 다른 양태에서, 시약, 완충제 및 폐기물 모듈이 제공되며, 모듈은 (a) 슬라이딩 트레이로서, 시약 카트리지 및 완충제 카트리지는 슬라이딩 트레이에 포지셔닝되고 유체 관리 모듈에 커플링될 수 있는, 슬라이딩 트레이; (b) 폐기물 용기를 포함하는 폐기물 모듈로서, 폐기물 용기는 유체 관리 펌프로부터의 유체 라인에 커플링되는, 폐기물 모듈; 및 (c) 캐핑 기구로서, 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 폐기물 용기를 폐쇄하고, 폐기물 용기가 시스템에 다시 배치될 때 폐기물 용기를 개방하는, 상기 캐핑 기구를 포함한다.
도 1은 다양한 모듈을 포함하는 시퀀싱 디바이스를 도시한다.
도 2는 광시야 및 공초점 모드에서 이중 이미징이 가능한 이중 카메라를 도시한다.
도 3은 405 nm, 488 nm, 561 nm, 637 nm, 및 730 nm를 커버하는 5개의 레이저 라인 및 빔 컨디셔닝 유닛을 도시한다.
도 4는 현미경 컴포넌트의 다이어그램을 도시한다.
도 5는 4x, 20x, 40x, 및 60x 배율을 갖는 대물렌즈를 갖는 6-포지션 노즈피스(nosepiece)를 도시한다. 워터 칼라(water collar)는 40x 및 60x 대물렌즈에 나타나 있다.
도 6은 24개의 웰을 갖는 다중-웰 플레이트에 대한 수동 작동식 유체 커플링 시스템을 도시한다.
도 7은 노즈피스 및 피에조 Z를 갖는 XY 전동식 스테이지의 상부에 다중-웰 플레이트를 갖는 유체 커플링 시스템을 도시한다.
도 8은 자동화 유체 전달 시스템을 도시한다.
도 9는 자동화 유체 전달 시스템의 컴포넌트의 다이어그램을 도시한다.
도 10은 진동 격리(vibration isolation)를 제공하는 맞춤형 테이블의 상부에 감광성 샘플을 위한 인클로저(enclosure)를 도시한다. 커버 및 빔 컨디셔닝 유닛을 갖는 5개의 레이저 라인 및 높은 데이터 처리량 이미징을 위한 프로세서를 갖는 워크스테이션은 테이블 상부 아래의 선반에 도시되어 있다. 테이블에 연결된 4K 디스플레이 컴포넌트가 또한 도시되어 있다.
도 11은 자동화 유체 전달 시스템을 위한 보드 포트를 도시한다.
도 12는 시퀀싱 디바이스의 모듈식 부분의 어셈블리를 도시한다.
도 13은 다양한 각도에서 도시된, 1) 현미경 및 테이블, 2) 다중-웰 플레이트, 및 3) 시퀀서를 포함하는 기존의 이미징 셋업에 커플링되는 독립형 유체 모듈의 개략도를 도시한다.
도 14는 다중-웰 플레이트 및 커버의 개략도를 도시한다.
도 15는 다중-웰 플레이트에 연결되고 다중-웰 플레이트의 일부 선택된 웰에 삽입된 다중 유체 라인을 갖는 다중-웰 플레이트의 개략도를 도시한다.
도 16은 다중-웰 플레이트에 연결되고 다중-웰 플레이트의 모든 웰에 삽입된 다중 유체 라인을 갖는 다중-웰 플레이트의 개략도를 도시한다.
도 17은 웰 위에 커버를 갖는 다중-웰 플레이트를 도시한다. 다중-웰 플레이트의 각각의 웰에 대해, 커버는 웰 위의 커버의 구멍 내로 유체 라인의 삽입을 안내하는 유체 라인용 홀더를 포함한다.
도 18은 시퀀서에 연결되거나 시퀀서로부터 제거된 다중-웰 플레이트를 갖는 다양한 각도로부터의 1) 현미경 및 테이블, 2) 커버링된 다중-웰 플레이트, 및 3) 시퀀서의 개략도를 도시한다.
도 19는 컴팩트 자동화 유체 전달 시스템의 설계를 도시한다.
도 20은 컴팩트 자동화 유체 전달 시스템의 설계를 도시한다.
도 21은 완충제 및 시약 트레이에 대한 설계를 도시한다.
도 22는 시일링된 완충제 병용 캐리어 및 추적을 위한 RFID 태그를 포함하는 완충제 트레이의 설계를 도시한다.
도 23은 완충 트레이에 대한 대안적인 설계를 도시한다. 상부에는 개별 완충제용 캡을 갖는 완충 트레이가 도시되어 있다. 하부에는 시일링된 완충제 병을 보유하도록 설계된 완충제 트레이가 도시되어 있다.
도 24는 에펜도르프(Eppendorf) 튜브용 캐리어, 시일, 및 추적을 위한 RFID 태그를 포함하는 시약 트레이의 설계를 도시한다.
도 25는 시약 충전 검증을 위한 칭량 스테이션, 저울 상에 시약 소모품을 보유하기 위한 고정구(fixture), 및 충전 매니폴드를 도시한다.
도 26은 완충제 충전 스테이션을 도시한다.
도 27은 40x 및 60x 대물렌즈 상에 칼라를 갖는 대물렌즈를 도시한다.
도 28은 40x 및 60x 대물렌즈 상의 칼라에 유체를 제공하기 위한 유체 다이어그램을 도시한다.
도 29는 피드 칼라(feed collar)를 도시한다. 60x 대물렌즈는 1개의 O-링을 가지며, 40x 대물렌즈는 2개의 O-링을 갖는다.
도 30은 침지 물 디스펜서에 대한 연결부를 갖는 현미경을 도시한다.
도 31은 40x 및 60x 대물렌즈에 대한 연결부를 갖는 Nikon Ti2e 현미경과 함께 사용하기 위한 침지 워터 디스펜서를 도시한다.
도 32는 워크스테이션을 위한 아래에 선반을 갖는 테이블의 상부 상의 감광성 샘플을 위한 인클로져 및 테이블에 부착된 디스플레이 컴포넌트의 개략도를 도시한다.
도 33은 워크스테이션을 위한 아래에 선반을 갖는 테이블의 상부 상의 감광성 샘플을 위한 인클로져 및 테이블 상의 디스플레이 컴포넌트의 개략도를 도시한다.
도 34는 시약 트레이, 완충제 트레이, 연동 펌프, 모터 구동식 회전 밸브, 압력 센서, 및 버블 검출기에 대한 유체 라인 연결부를 도시하는 자동화 유체 전달 시스템에 대한 유체학 다이어그램을 도시한다.
도 35는 침지 매질 모듈 및 40x 및 60x 현미경 대물렌즈에 대한 연결부를 갖는 유체 라인에 연결된 일련의 펌프를 갖는 유체학 다이어그램을 도시한다.
도 36은 시린지 펌프, 모터 구동식 로터리 밸브, 및 다중-웰 플레이트에 대한 연결부를 갖는 유체학 다이어그램을 도시한다.
도 37은 흡인 이중 밸브 개략도를 도시한다.
체적 조직 샘플의 자동화 인시투 시퀀싱을 위한 시퀀서가 제공된다. 특히, 다수의 샘플에 대해 병렬로 작동할 수 있는 자동화 체적 인시투 시퀀싱 디바이스가 제공된다. 시퀀서의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다.
체적 조직 샘플의 자동화 인시투 시퀀싱을 위한 시퀀서 및 이러한 시퀀서의 제조 및 사용 방법이 기재되기 전에, 본 발명은 기재된 특정 디바이스, 방법 또는 조성물로 제한되지 않으며, 이는 물론, 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하기 위한 것이고, 제한하려는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하는데, 왜냐하면, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재 값이 하한 단위의 10분의 1까지 또한 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 언급된 범위의 임의의 언급된 값 또는 개재 값과 그러한 언급된 범위의 임의의 다른 언급된 또는 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있고, 더 작은 범위에 어느 하나, 둘 모두의 한계가 포함되거나 포함되지 않는 각각의 범위가 또한 본 발명에 포함되며, 단, 언급된 범위에 한계를 상세하게 배제한다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 일부 잠재적이고 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 기술하고 개시하기 위해 참조로서 본 명세서에 포함된다. 본 개시내용은 모순이 있는 정도까지 포함된 간행물의 임의의 개시를 대체하는 것으로 이해된다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기재되고 예시된 각각의 개별 실시형태는 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 실시형태의 특징으로부터 용이하게 분리되거나 이와 조합될 수 있는 개별 컴포넌트 및 특징을 갖는다. 언급된 임의의 방법은 언급된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "펩타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩타이드 및 이의 등가물, 예를 들어, 당업자에게 공지된 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 등에 대한 언급을 포함한다.
본 명세서에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개 날짜는 독립적으로 확인되어야 할 수 있는 실제 공개 날짜와 다를 수 있다.
정의
특히 주어진 양과 관련하여 용어 "약"은 ±5%의 편차를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "펩타이드", "올리고펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 폴리머뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 폴리머 및 비-자연 발생 아미노산 폴리머에도 적용된다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 모두는 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현-후 변형, 예를 들어, 인산화, 글리코실화, 아세틸화, 하이드록실화, 산화 등뿐만 아니라 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 용어는 또한 이종성 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않는 이종성 및 상동성 리더 서열과의 융합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 융합 단백질; 면역학적으로 태그된 단백질; 등을 포함한다. 상기 용어는 지방산 모이어티, 지질 모이어티, 당 모이어티, 및 탄수화물 모이어티 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 핵산"은 단일 세포에 존재하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자; RNA 분자, 변형된 핵산 등)이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 코딩 RNA(예를 들어, mRNA)이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 비-코딩 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 마이크로RNA(miRNA), 성숙 miRNA, 미성숙 miRNA; 등)이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 세포와 관련하여 RNA 분자(예를 들어, mRNA, 프리-mRNA 등)의 스플라이스 변이체이다. 따라서, 적합한 표적 핵산은 스플라이싱되지 않은 RNA(예를 들어, 프리-mRNA, mRNA), 부분적으로 스플라이싱된 RNA, 또는 완전히 스플라이싱된 RNA 등일 수 있다. 관심 표적 핵산은 세포 집단 내에서, 가변적으로 발현될 수 있고, 즉, 상이한 존재비를 가질 수 있으며, 여기서, 본 발명의 방법은 개별 세포에서 RNA 전사체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 핵산의 발현 수준의 프로파일링 및 비교를 가능하게 한다. 표적 핵산은 또한 DNA 분자, 예를 들어, 변성된 게놈, 바이러스, 플라스미드 등일 수 있다. 예를 들어, 방법은 예를 들어, 집단에서 세포의 게놈에 표적 핵산이 상이한 존재비로 존재하는 암 세포 집단에서 카피 수 변이체; 바이러스 로드 및 동역학을 결정하기 위한 바이러스-감염된 세포, 등을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산 분자"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드의 백본은 당 및 포스페이트 기(통상적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있는 바와 같음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드의 백본은 합성 서브유닛, 예컨대, 포스포라미디트, 및/또는 포스포로티오에이트의 폴리머를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오사이드 포스포라미데이트 또는 혼합된 포스포라미데이트-포스포디에스터 올리고머일 수 있다(Peyrottes et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvediet al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:2318-2323). 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 L-뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 우라실, 다른 당, 및 연결기, 예컨대, 플루오로리보스 및 티오에이트, 및 뉴클레오타이드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 컴포넌트에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 N3'-P5'(NP) 포스포라미데이트, 모르폴리노 포스포로시아미데이트(MF), 잠금 핵산(LNA), 2'-O-메톡시에틸(MOE), 또는 2'-플루오로, 아라비노-핵산(FANA)을 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 뉴클레아제 분해에 대한 폴리뉴클레오타이드의 내성을 향상시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Faria et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:40-44; Toulme (2001) Nature Biotechnol. 19:17-18] 참조). 폴리뉴클레오타이드는 중합 후, 예컨대, 표지 컴포넌트와의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이러한 정의에 포함되는 다른 유형의 변형은 캡, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오타이드의 유사체로의 치환, 및 폴리뉴클레오타이드를 단백질, 금속 이온, 표지 컴포넌트, 다른 폴리뉴클레오타이드, 또는 고체 지지체에 부착시키기 위한 수단의 도입이다. 면역조절 핵산 분자는, 예를 들어, 본 명세서에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 리포솜과의 회합, 마이크로캡슐화로 다양한 제형으로 제공될 수 있다. 증폭에 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 증폭에서 최대 효율을 위해 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 폴리뉴클레오타이드는 연장 생성물을 제조하는 데 사용되기 전에 먼저 이의 가닥을 분리하도록 처리될 수 있다. 이러한 변성 단계는 통상적으로 열의 영향을 받지만, 대안적으로 알칼리를 사용하여 수행된 후 중화될 수 있다.
"단리된"은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 언급할 때, 지시된 분자가 자연에서 발견되는 분자와 함께 전체 유기체로부터 분리되고 이와 별개이거나 동일한 유형의 다른 생물학적 거대 분자의 실질적인 부재 하에 존재하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 용어 "단리된"은 자연에서 이와 정상적으로 관련된 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 결여된 핵산 분자; 또는 자연에 존재하지만 이와 회합된 이종성 서열을 갖는 서열; 또는 염색체로부터 해리된 분자이다.
용어 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 절지동물(예를 들어, 곤충, 갑각류, 거미류), 두족류(예를 들어, 문어, 오징어), 양서류(예를 들어, 개구리, 도롱뇽, 맹금류), 어류, 파충류(예를 들어, 거북이, 악어, 뱀, 양서류, 도마뱀, 투아타라), 인간을 포함하는 포유동물 및 인간이 아닌 포유동물, 예컨대, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종을 포함하는 비-인간 영장류; 실험 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니피그, 및 친칠라; 가축, 예컨대, 개 및 고양이; 농장 동물, 예컨대, 양, 염소, 돼지, 말 및 소; 및 조류, 예컨대, 닭, 칠면조 및 다른 담즙성 조류, 오리, 및 거위를 포함하는 가축, 야생 및 사냥감 조류를 포함하지만 이로 제한되지 않는 무척추동물 및 척추동물을 지칭한다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 실험 동물, 수의학적 적용, 및 마우스, 래트, 및 햄스터를 포함하는 설치류; 영장류, 및 트랜스제닉 동물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 질환에 대한 동물 모델 발병에서 사용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사용자"는 본 명세서에 개시된 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위해 본 명세서에 개시된 디바이스 및/또는 시스템과 상호작용하는 사람을 지칭한다. 사용자는 본 명세서에 기재된 시퀀싱 디바이스를 사용하는 대상체일 수 있다.
시퀀싱 디바이스
체적 조직 샘플의 자동화 인시투 시퀀싱을 위한 시퀀서가 제공된다. 특히, 다수의 샘플에 대해 병렬로 작동할 수 있는 자동화 체적 인시투 시퀀싱 디바이스가 제공된다. 일부 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 조명 및 검출 모듈, 현미경 모듈, 자동화 침지 매질 모듈, 다중-웰 플레이트, 유체 커플링 타워 또는 독립형 유체 모듈, 유체 관리 모듈, 시약, 완충제 및 폐기물 모듈, 전기 모듈, 및 프로세서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조명 및 검출 모듈은 플랫 조명 보정부를 구비하는 조명을 위한 복수의 레이저 라인을 포함하는 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트(여기서, 복수의 레이저 라인은 하나 이상의 파장의 여기 광으로 샘플을 조명하는 데 사용됨), 대역통과 방출 필터, 롱-패스 이미지 스플리터, 제1 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제1 카메라 및 제2 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제2 카메라를 포함하고, 여기서, 제1 카메라 및 제2 카메라는 방출을 동시에 검출할 수 있다. 특정 실시형태에서, 복수의 레이저 라인은 적어도 4개의 레이저 라인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 레이저 라인은 펜타-대역통과 방출 필터와 함께 사용되는 5개의 레이저 라인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 전동식 스테이지는 피에조 z-축을 갖는다. 다른 실시형태에서, 대물렌즈 z축 드라이브가 사용되며, 전동식 스테이지 z는 일정하게 유지된다.
현미경 모듈은 x, y, 및 z 축을 따라 다축 포지셔닝이 가능한 전동식 스테이지, 대물렌즈 Z 드라이브, 다수의 대물렌즈를 포함하는 대물렌즈 터릿 휠(여기서, 각각의 대물렌즈는 상이한 배율을 제공함), 및 대물렌즈로부터 조명 및 검출 모듈로 광을 라우팅하는 광학계를 포함한다. 대물렌즈는 각각의 침지 대물렌즈가 대물렌즈 침지 칼라를 갖는 침지 대물렌즈를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 침지 대물렌즈는, 예를 들어, 현미경의 광학계 또는 기계적 부품을 손상시킬 수 있는 유출을 방지하기 위한 O-링 및 다중-웰 플레이트의 수축-래핑된 코팅, 여기서, 전동식 스테이지를 추가로 포함한다. 대물렌즈는 또한 침지 칼라가 없는 건조 대물렌즈를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 현미경 모듈은 공초점 현미경을 포함한다. 일부 실시형태에서, 현미경 모듈은 에피형광 현미경을 포함한다.
자동화 침지 매질 모듈은 i) 침지 매질을 포함하는 용기, ii) 용기에 그리고 현미경 모듈의 대물렌즈의 대물렌즈 침지 칼라에 커플링된 유체 라인으로서, 유체 라인은 대물렌즈 침지 칼라로 및 그로부터 침지 매질을 운반하며, 침지 칼라는 과잉의 침지 매질을 포획하는, 유체 라인, 및 iii) 유체 라인에 그리고 마이크로컨트롤러에 연결된 일련의 펌프로서, 마이크로컨트롤러는 유체 라인을 통한 침지 매질의 펌프 첨가 및 제거를 제어하고, 자동화 침지 매질 모듈은 이미징 동안 대물렌즈의 상부에서 대물렌즈 침지 칼라에 제어된 체적의 침지 매질을 제공하는, 일련의 펌프를 포함한다. 특정 실시형태에서, 침지 매질은 물이다. 특정 실시형태에서, 침지 매질은 여과되고 버블이 없다.
전동식 스테이지는 이미징에 사용되는 대물렌즈 아래에 다중-웰 플레이트의 웰을 포지셔닝시키기 위해 이동될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유체 커플링 타워는 전동식 스테이지의 상부에 있고, 유체 라인을 사용하여 웰로부터 샘플의 첨가 또는 제거를 가능하게 하도록 다중-웰 플레이트의 웰에 유체 라인을 포지셔닝시킨다. 일부 실시형태에서, 유체 커플링 인터페이스는 전동식 스테이지에 부착되지 않는다. 대신, 독립형 유체 커플링 인터페이스 모듈이 사용되며, 이는 사용자에 의해 샘플 플레이트 위에 수동으로 배치되고 스테이지에 고정되며, 여기서 유체 커플링 인터페이스는 시퀀싱의 지속기간 동안 샘플에 유체 라인을 커플링한다.
유체 관리 모듈은 로터리 밸브 기구를 포함하는 대칭형 로터리 밸브, 유체 라인에 연결된 펌프, 및 펌프로 이어지는 유체 라인의 어느 한 쪽에 포지셔닝되는 버블 검출기를 포함하며, 여기서 유체 관리 모듈은 유체 라인을 통해 시약, 완충제 및 폐기물의 단방향 또는 양방향 이동을 가능하게 한다. 침지 유체 라인에 버블이 없는 것을 보장하기 위해 일련의 버블 검출기가 사용될 수 있다. 또한, 버블는 일정 체적의 유체를 첨가하고, 과량의 유체를 제거한 다음, 더 많은 유체를 첨가하고, 스테이지를 웰 에지로 그리고 다시 샘플 중심으로 이동시켜 침지 유체 첨가 동안 형성될 수 있는 임의의 추가 버블을 제거함으로써 피할 수 있다.
시약, 완충제 및 폐기물 모듈은 i) 슬라이딩 트레이로서, 시약 카트리지 및 완충제 카트리지는 슬라이딩 트레이에 포지셔닝되고 유체 관리 모듈에 커플링될 수 있는, 상기 슬라이딩 트레이, ii) 폐기물 모듈로서, 유체 관리 펌프로부터 유체 라인에 커플링된 폐기물 용기를 포함하는, 상기 폐기물 모듈, 및 iii) 캐핑 기구로서, 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 폐기물 용기를 폐쇄하고 폐기물 용기가 폐기물 처리 시스템에 다시 배치될 때 폐기물 용기를 개방하는, 상기 캐핑 기구를 포함한다.
전기 모듈은 i) 자동화 침지 매질 모듈로부터의 매질 분배를 제어하는 제1 펌웨어 보드 및 ii) 유체 관리 모듈 및 시약, 완충제 및 폐기물 모듈을 제어하는 제2 펌웨어 보드를 포함하며, 여기서 전기 모듈은 시스템의 다른 모듈에 대한 전력을 조절한다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 유체 라인의 압력을 모니터링하기 위한 압력 모니터를 추가로 포함하며, 여기서 유체 라인의 압력 증가는 유체 라인의 잠재적인 막힘을 검출하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 복수의 발광 다이오드(LED)를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 LED는 시스템에 대한 상태 표시를 제공하기 위해 광을 방출할 수 있다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 사용자 인터페이스를 제공하고 시퀀싱 디바이스의 모듈을 작동시키도록 프로그래밍된 프로세서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 정보를 디스플레이하고 사용자 인터페이스를 제공하기 위한 디스플레이 컴포넌트를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 (a) 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계; (b) 카메라 비닝과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율에서 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계; (c) 신호를 사용하여 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계; (d) XY 바운딩 박스 내에서 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝으로 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 그리고 XY 범위에 걸쳐 수집되는, 단계; (e) 단계 (d)에서 생성된 이미지를 디스플레이하는 단계; (f) 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미징될 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 정제하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계; (g) 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 선택된 관심 XY 영역에서 샘플을 이미징하는 단계; (h) 샘플에서 관심 영역의 체적을 계산하고, 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 사용자에게 디스플레이하는 단계; (i) Z 범위를 따라 관심 영역에서 샘플의 이미지를 분할하는 단계; (j) 사용자가 시퀀싱을 시작하기 전에 샘플 체적의 Z 범위를 조정하고(여기서, 사용자에 의해 정의된 관심 영역으로부터 유래된 이미징 범위가 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주화된 시야로 자동적으로 전환됨) 시퀀싱 동안 XYZ 축을 따른 관심 영역의 이미징을 위한 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 피에조 경계를 조정하기 위해 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계; 및 (k) 사용자가 시퀀싱하고자 하는 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 (j)를 반복하는 단계를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍된다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택하기 위해 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지를 선택하는, 단계; 시퀀싱되고 이미징될모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계; 및 제약 내의 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍된다. 특정 실시형태에서, 프로세서는 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍된다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z에서 빠른 공초점 또는 에피형광 스위프를 수행하여 시작 XY 포지션에서 샘플의 Z 프로파일을 결정하는 단계; 분할 방법을 사용하여 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및 샘플 몽타주의 시작에서 계면으로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 스테이지 및 대물렌즈에 대한 샘플의 Z에서의 드리프트는 획득 후 프로세싱 동안의 라운드에 걸쳐 다운스트림 서브픽셀 등록을 촉진하기 위해 선택된 허용 오차 미만으로 감소되는, 단계를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍된다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱은 조직 샘플에서 표적 핵산의 인시투 시퀀싱이다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 50 내지 200㎛의 두께를 갖는 두꺼운 조직 슬라이스이다. 다른 실시형태에서, 조직 샘플은 5 내지 20㎛의 두께를 갖는 얇은 조직 슬라이스이다. 일부 실시형태에서, 인시투 시퀀싱은 순차적 또는 조합적 인시투 시퀀싱이다.
시퀀서 컴포넌트의 모듈식 사용
일부 실시형태에서, 유체 컴포넌트는 임의의 상용 가능한 이미징 시스템과 함께 사용하기 위한 독립형 시퀀싱 모듈로서 작용할 수 있다. 샘플에 대한 유체 라인은 자기적으로 및/또는 기계적으로 샘플 플레이트 및 현미경 스테이지에 커플링되어, 커플링이 맞물린 포지션에 용이하게 부착 및 탈착 가능하고, 유체 컴포넌트가 샘플 웰에 커플링되도록 할 수 있다. 이러한 커플링의 일 예에서, 각 샘플 웰로 보내지는 유체 라인은 함께 번들링되고, 기계적 가이드 및 자기 고정구를 통해 현미경 스테이지에 커플링되는 탈착 가능한 플레이트 리드(도식 참조)를 통해 각 샘플 웰로 라우팅된다. 커플링의 또 다른 실시형태에서, 현미경 스테이지에 부착되도록 모듈식 커플링 타워가 제공된다. 독립형 시퀀싱 모듈로서 사용될 때, 유체 컴포넌트는 시약 및 완충제 키트의 사용 및 다수의 유체 첨가 및 제거 사이클에 걸쳐 다수의 샘플 웰로부터의 유체 교환의 자동화를 용이하게 한다. 인시투 시퀀싱을 위한 디바이스로 사용될 때, 유체 컴포넌트는 샘플 포맷, 예를 들어, 도립 현미경과 상용 가능한 기존의 현미경 설정에 커플링될 수 있다. 얇은 섹션 샘플(5 내지 20㎛)과 함께 사용될 때, 현미경은 3, 4, 또는 5개의 조명 또는 검출 채널을 갖는 에피형광 현미경일 수 있다. 얇은 또는 두꺼운 섹션 샘플과 함께 사용될 때, 현미경은 에피형광 현미경, 공초점 현미경(스피닝 디스크 또는 포인트 스캐닝), 구조화 조명 현미경, 또는 광 시트 또는 경사-평면 광 시트 현미경(light sheet or oblique-plane light sheet microscope)일 수 있다.
침지 물 분배 모듈(IWD)은 시퀀서를 위한 통합 유체 시스템의 서브모듈로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 이는 현미경 침지 대물렌즈의 자동화된 침지를 위한 독립형 키트로 사용될 수 있다. 일 예에서, 이는 별도의 기존 현미경 설정에서 샘플의 병렬 및 자동화된 시퀀싱을 가능하게 하기 위해 시약/완충제/소모품 유체 모듈과 함께 사용된다. 이 경우에, 침지 유체 저장소 및 침지 유체 폐기물은 유체 디바이스의 외부에 있어서, 사용자는 침지 유체 저장소를 수동으로 채우고 폐기물 저장소를 비울 수 있다. 침지 물 분배 모듈은 버블이 도입되지 않고 액체의 체적 및 유량이 정확하고 일정하도록 대물렌즈의 이미징 유리를 가로질러 침지 액체를 유동하도록 설계된 침지 칼라를 통해 현미경 대물렌즈에 연결되며, 과량의 액체가 제거될 수 있도록 대물렌지 바디에 대한 단단한 시일링을 제공한다. 침지 칼라의 정확한 치수는 적절한 피트(fit)를 보장하기 위해 특정 대물 렌즈와 일치하도록 조정되지만, 다른 침지 물 분배 모듈 서브컴포넌트의 기능은 이미징 시스템의 제조 및 제작과 무관하다.
시퀀서를 제어하는 소프트웨어는 조명, 검출, 현미경, 및 스테이지 컴포넌트의 제어에 대한 추상 층(abstraction layer)을 제공하고, 이에 따라, 다양한 이미징 설정과 함께 모듈식으로 사용될 수 있으며, 단, 적절한 구성 파일 또는 다른 하드웨어 플러그인이 제공된다. 따라서, 특정 이미징 및 현미경 검사법 설정은 시퀀서의 작동에서 특권이 없으며, 소프트웨어, 대물렌즈 침지 모듈, 샘플, 시약 및 완충제 유체, 및 소모품은 모듈식으로 사용되고 컴포넌트의 하나 이상의 조합으로 재구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 시약 및 완충제 유체 컴포넌트는 재사용 가능한 저장소로부터 유체를 인출한다. 시퀀서의 또 다른 실시형태에서, 시약 및 완충제 유체 컴포넌트는 소모품 저장소로부터 유체를 인출한다. 일 예에서, 소모품 저장소는 충전된 후 시일링되며, 시일은 시약/완충제 유체 모듈의 시퍼 바늘(sipper needle)에 의해 천공된다. 일 예에서, 시일은 시일의 일관된 천공을 보장하고 시퍼 바늘에 대한 과도한 힘 또는 시퍼 바늘의 평행한 축에 정렬되지 않은 힘을 피하기 위해 소모품의 어셈블리에서 기계적으로 지지된다. 소모품 저장소는 일반적으로 시퀀서의 각각의 사용이 시작될 때 교체되고, 이들의 사용은 소모품의 동일성의 검출을 통해 프로그램적으로 추적된다. 일 예에서, 소모품에 통합된 RFID 및 시퀀서 유체 모듈의 RFID 리더의 사용을 통해 소모품의 검출이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 소모품의 검출은 소모품 상의 바코드 및 시퀀서 유체 모듈에 통합된 바코드 스캐너의 사용을 통해 수행된다.
또 다른 실시형태에서, 유체 모듈은 인시투 시퀀싱 사이클에서 사용되는 완충제 및 시약으로부터 인출한다. 유체 모듈의 일 예에서, 완충제 또는 시약의 일부 또는 전부는 냉동 컴포넌트에 의해 냉각된다. 유체 모듈의 일부 실시형태에서, 완충제 또는 시약의 일부 또는 전부는, 예를 들어, SCAL, SEDAL, 또는 SEDAL2 시퀀싱 화학에 관여하는 ATP와 같은 분자 또는 리가제와 같은 효소 또는 온도 민감성이다. 또 다른 실시형태에서, 완충제 및 시약 유체 모듈은 다른 시퀀싱 또는 주기적 표지화 화학에 사용되는 액체, 예를 들어, 샘플에서 서열에 혼성화하는 데 사용되는 올리고, 또는 샘플에서 혼성화 이벤트를 검출하는 데 사용되는 형광 표지된 올리고를 인출한다. 또 다른 실시형태에서, 완충제 및 시약 유체 모듈은 염료로 샘플의 표지화에 사용되는 액체를 인출한다. 또 다른 실시형태에서, 완충제 및 시약 유체 모듈은 샘플과의 클릭(CLICK) 화학 반응에 사용되는 액체를 인출한다. 또 다른 실시형태에서, 완충제 및 시약 유체 모듈은 샘플에서 형광 신호를 켄칭하기 위해 액체를 인출한다. 다른 실시형태에서, 완충제 및 시약 유체 모듈은 샘플로부터 신호를 추가하거나 제거하는 효소 컴포넌트를 함유하는 유체를 인출한다.
컴퓨터 구현 방법
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 시퀀싱 디바이스를 사용하는 데 사용되는 시스템 및 컴퓨터 구현 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 사용자 인터페이스를 제공하고 시퀀싱 디바이스의 모듈을 작동시키도록 프로그래밍된 프로세서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시퀀싱 디바이스는 정보를 디스플레이하고 사용자 인터페이스를 제공하기 위한 디스플레이 컴포넌트를 추가로 포함한다. 시스템은 또한 조직 이미지의 그래픽 정보를 처리하고 디스플레이 컴포넌트로 출력하기 위한 하나 이상의 그래픽 보드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 컴퓨터 구현 방법은 예를 들어, 시퀀싱 실행 설정을 수행하고, 시퀀싱 실행 옵션을 선택하고, 관심 샘플 영역(ROI)을 선택 및 정의하기 위해 사용자와 시퀀서 펌웨어 및 하드웨어 사이에 인터페이스를 제공하는 데 사용된다. 컴퓨터 구현 방법은 시퀀싱 디바이스의 상이한 모듈 및 샘플에 걸친 시퀀싱의 병렬화를 제어하고, 로깅, 오류 모니터링, 데이터 획득, 관리 및 전달을 제공하고, 진행 모니터링을 실행하는 데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 컴퓨터 구현 방법이 제공되며, 컴퓨터는 (a) 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계; (b) 카메라 비닝과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율에서 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계; (c) 신호를 사용하여 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계; (d) XY 바운딩 박스 내에서 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝으로 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 그리고 XY 범위에 걸쳐 수집되는, 단계; (e) 단계 (d)에서 생성된 이미지를 디스플레이하는 단계; (f) 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미징될 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 선택하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계; (g) 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 선택된 관심 XY 영역에서 샘플을 이미징하는 단계; (h) 관심 영역의 샘플 체적을 계산하고, 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 사용자에게 디스플레이하는 단계; (i) Z 범위를 따라 관심 영역에서 샘플의 이미지를 분할하는 단계; (j) 사용자가 시퀀싱을 시작하기 전에 샘플 체적의 Z 범위를 조정하고(여기서, 사용자에 의해 정의된 관심 영역으로부터 유래된 이미징 범위는 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주화된 시야로 자동적으로 전환됨) 시퀀싱 동안 XYZ 축을 따라 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 관심 영역의 이미징을 위한 피에조 경계를 조정하기 위해 사용자에게 인터페이스르르 제공하는 단계; 및 (k) 사용자가 시퀀싱하고자 하는 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 (j)를 반복하는 단계를 포함하는 단계들을 수행한다.
또 다른 실시형태에서, 컴퓨터 구현 방법이 제공되며, 컴퓨터는 사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택하기 위해 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지에 제한되는, 단계; 시퀀싱 및 이미징될 모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계; 및 제약 내의 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계를 포함하는 단계들을 수행한다. 일부 실시형태에서, 컴퓨터는 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍된다.
또 다른 실시형태에서, 컴퓨터 구현 방법이 제공되며, 컴퓨터는 시작 XY 포지션에서 샘플의 Z 프로파일을 결정하기 위해 주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z에서 빠른 공초점 스위프를 수행하는 단계; 분할 방법을 사용하여 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및 샘플 몽타주의 시작에서 계면으로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 스테이지 및 대물렌즈에 대한 샘플의 Z에서의 드리프트는 획득 후 프로세싱 동안의 라운드에 걸쳐 다운스트림 서브픽셀 등록을 용이하게 하기 위해 선택된 허용 오차 미만으로 감소되는, 단계를 포함하는 단계들을 수행한다.
방법은 디지털 전자 회로에서, 또는 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어에서 구현될 수 있다. 개시된 및 다른 실시형태는 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 제품, 즉, 데이터 프로세싱 장치에 의한 실행을 위해 또는 이의 동작을 제어하기 위해 컴퓨터 판독가능 매체 상에 인코딩된 컴퓨터 프로그램 명령의 하나 이상의 모듈로서 구현될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 머신-판독가능 저장 디바이스, 머신-판독가능 저장 기판, 메모리 디바이스, 머신-판독가능 전파 신호 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
컴퓨터 프로그램(프로그램, 소프트웨어, 소프트웨어 애플리케이션, 스크립트, 또는 코드로도 알려짐)은 컴파일된 또는 인터프리트된 언어를 포함하는 임의의 형태의 프로그래밍 언어로 작성될 수 있고, 독립형 프로그램 또는 컴퓨팅 환경에서 사용하기에 적합한 모듈, 컴포넌트, 서브루틴, 또는 다른 유닛을 포함하는 임의의 형태로 배치될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 반드시 파일 시스템의 파일에 대응하는 것은 아니다. 프로그램은 다른 프로그램 또는 데이터를 보유하는 파일의 부분(예를 들어, 마크업 언어 문서에 저장된 하나 이상의 스크립트), 관심 프로그램 전용의 단일 파일, 또는 다수의 조정된 파일(예를 들어, 하나 이상의 모듈, 서브 프로그램, 또는 코드의 일부를 저장하는 파일)에 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 하나의 컴퓨터에서 또는 하나의 사이트에 위치하거나 다수의 사이트에 걸쳐 분산되고 통신 네트워크에 의해 상호 연결된 다수의 컴퓨터에서 실행되도록 배치될 수 있다.
추가의 양태에서, 기재된 바와 같은 컴퓨터 구현 방법을 수행하기 위한 시스템은 프로세서, 저장 컴포넌트(즉, 메모리), 디스플레이 컴포넌트, 및 범용 컴퓨터에 통상적으로 존재하는 다른 컴포넌트를 포함할 수 있다. 저장 컴포넌트는 프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령 및 프로세서에 의해 검색, 조작 또는 저장될 수 있는 데이터를 포함하는 프로세서에 의해 액세스 가능한 정보를 저장한다.
저장 컴포넌트는 설명서를 포함한다. 예를 들어, 저장 컴포넌트는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 시퀀싱 디바이스에 대한 사용자 인터페이스를 제공하고, 시퀀싱 디바이스를 작동시키고, 인시투 시퀀싱 이미징 데이터를 처리하기 위한 명령을 포함할 수 있다. 컴퓨터 프로세서는 저장 컴포넌트에 커플링되고, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 인시투 시퀀싱 이미징 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 데이터를 분석하기 위해 저장 컴포넌트에 저장된 명령을 실행하도록 구성된다. 디스플레이 컴포넌트는 정보를 표시하고 사용자 인터페이스를 제공한다.
저장 컴포넌트는 하드-드라이브, 메모리 카드, ROM, RAM, DVD, CD-ROM, USB 플래시 드라이브, 쓰기-가능, 및 읽기-전용 메모리와 같은 프로세서에 의해 액세스 가능한 정보를 저장할 수 있는 임의의 유형일 수 있다. 프로세서는 Intel Corporation의 프로세서와 같은 임의의 잘 알려진 프로세서일 수 있다. 대안적으로, 프로세서는 ASIC와 같은 전용 제어기일 수 있다.
특정 실시형태에서, 인시투 시퀀싱 이미징 데이터는 클라우드 데이터 저장 시스템에 업로드되고 저장된다. 일부 실시형태에서, 클라우드 데이터 저장 시스템은 공용 클라우드 저장 시스템이다. 다른 실시형태에서, 클라우드 데이터 저장 시스템은 사설 클라우드 저장 시스템이다. 클라우드 데이터 스토리지는 미가공 이미지, 중간 처리된 파일, 및 최종 데이터 제품을 저장하는 데 사용될 수 있다. 프로세싱은 데이터 획득 시스템에 의해 클라우드 스토리지로의 데이터세트의 업로드로 시작할 수 있다. 인코딩 방식, 코드북, 이미지 획득 파라미터, 및 샘플 메타데이터와 같은 구성 파라미터는 데이터 관리 웹 인터페이스를 사용하여 사용자에 의해 입력되거나 시퀀싱 데이터와 함께 클라우드 스토리지에 업로드된 구성 파일로부터 자동으로 생성될 수 있다. 각 구성 파라미터 세트는 클라우드 데이터베이스에 저장된다. 일부 경우에, 상이한 구성 파라미터를 사용하는 다중 처리 실행은 처리 파라미터를 최적화하기 위해 단일 데이터세트에 적용될 수 있다.
명령은 프로세서에 의해 직접적으로(예컨대, 기계 코드) 또는 간접적으로(예컨대, 스크립트) 실행될 임의의 세트의 명령일 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "명령", "단계" 및 "프로그램"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 명령은 프로세서에 의한 직접 처리를 위해 목적 코드 형태로, 또는 주문형으로 해석되거나 미리 컴파일되는 독립적인 소스 코드 모듈의 콜렉션 또는 스크립트를 포함하는 임의의 다른 컴퓨터 언어로 저장될 수 있다.
데이터는 명령에 따라 프로세서에 의해 검색, 저장 또는 수정될 수 있다. 예를 들어, 시스템이 임의의 특정 데이터 구조에 의해 제한되지는 않지만, 데이터는 컴퓨터 레지스터에, 관계형 데이터베이스에 복수의 상이한 필드 및 레코드, XML 문서, 또는 플랫 파일을 갖는 테이블로서 저장될 수 있다. 데이터는 또한 이진 값, ASCII 또는 유니코드와 같은(이에 제한되지 않음) 임의의 컴퓨터-판독가능 포맷으로 포맷될 수 있다. 또한, 데이터는 숫자, 설명 텍스트, 독점 코드, 포인터, 다른 메모리(다른 네트워크 위치 포함)에 저장된 데이터에 대한 참조 또는 관련 데이터를 계산하기 위한 함수에 의해 사용되는 정보와 같은 관련 정보를 식별하기에 충분한 임의의 정보를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 프로세서 및 저장 컴포넌트는 동일한 물리적 하우징 내에 저장되거나 저장되지 않을 수 있는 다수의 프로세서 및 저장 컴포넌트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 명령 및 데이터의 일부는 탈착식 CD-ROM에 저장되고 나머지는 읽기 전용 컴퓨터 칩 내에 저장될 수 있다. 명령 및 데이터의 일부 또는 모두는 프로세서로부터 물리적으로 멀리 떨어져 있지만 여전히 프로세서에 의해 액세스 가능한 위치에 저장될 수 있다. 유사하게, 프로세서는 병렬로 동작하거나 동작하지 않을 수 있는 프로세서들의 콜렉션을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 클라우드 컴퓨팅 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이미지 데이터 파일 및 이미징 데이터를 처리하기 위한 프로그래밍은 프로그램을 실행하고 사용자에게 출력을 반환하는 클라우드 컴퓨터로 내보내질 수 있다. 방법은 데이터 크기를 감소시키고 전송 속도를 증가시키기 위해 전송 전에 이미징 데이터의 선택적 압축을 포함할 수 있다. 데이터 획득 프로세스 동안, 획득된 이미지는 광학 사양, 스테이지 포지션, 및 시퀀싱 정보; 이미징 획득과 별개의 프로세스로서 이미징 데이터의 선택적 압축; 및 획득으로부터 원격 클라우드 저장 매체, 네트워크 부착 저장 시스템, 또는 별도의 대형 파일 시스템으로의 데이터의 선택적 오프로딩을 상세히 설명하는 메타데이터 파일과 커플링된다.
본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 위한 시스템의 컴포넌트는 하기 실시예에 추가로 기재된다.
인시투 유전자 시퀀싱
본 명세서에 개시된 시퀀싱 디바이스는 온전한 조직의 세포에서 표적 핵산의 인시투 유전자 시퀀싱에 사용될 수 있다. 인시투 시퀀싱은 (a) 고정되고 투과된 온전한 조직을 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 프라이머 쌍은 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드 각각은 제1 상보성 영역, 제2 상보성 영역 서열, 및 제3 상보성 영역을 포함하고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 바코드 서열을 추가로 포함하고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 표적 핵산의 제1 부분에 상보적이고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역에 상보적이고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은 올리고뉴클레오타이드는 제2 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역에 상보적이고, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 표적 핵산의 제2 부분에 상보적이고, 표적 핵산의 제1 부분은 표적 핵산의 제2 부분에 인접한, 단계; (b) 리가제를 첨가하여 제2 올리고뉴클레오타이드를 라이게이션시키고 폐쇄형 핵산 사이클을 생성하는 단계; (c) 핵산 분자의 존재 하에 롤링 사이클 증폭을 수행하는 단계로서, 수행하는 단계는 제2 올리고뉴클레오타이드를 주형으로서 사용하고 제1 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 하나 이상의 앰플리콘을 형성하는 것을 포함하는 단계; (d) 하이드로겔 서브유닛의 존재 하에 하나 이상의 앰플리콘을 포매하여 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 형성시키는 단계; (e) 바코드 서열을 갖는 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 라이게이션을 허용하는 조건 하에 시퀀싱 프라이머의 세트와 접촉시키는 단계로서, 시퀀싱 프라이머 세트는 염기를 디코딩하도록 구성된 제3 올리고뉴클레오타이드 및 디코딩된 염기를 신호로 전환하도록 구성된 제4 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 라이게이션은 제3 올리고뉴클레오타이드 및 제4 올리고뉴클레오타이드 둘 모두가 동일한 앰플리콘의 인접한 서열에 상보적인 경우에만 발생하는, 단계; (f) 단계 (e)를 반복하는 단계; 및 (g) 온전한 조직의 세포에서 인시투로 표적 핵산의 유전자 서열을 결정하기 위해 본 명세서에 기재된 시퀀싱 디바이스를 사용하여 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 이미징하는 단계를 포함하는, 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인시투 시퀀싱은 표적 핵산의 서열을 결정하기 위해 동적 어닐링 및 라이게이션에 의한 오류-수정을 갖는 시퀀싱(SEDAL)을 사용하여 수행된다. SEDAL 방법은 라이게이션을 허용하는 조건 하에 바코드 서열을 갖는 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 한 쌍의 프라이머와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 한 쌍의 프라이머는 제3 올리고뉴클레오타이드 및 제4 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 라이게이션은 제3 올리고뉴클레오타이드 및 제4 올리고뉴클레오타이드 둘 모두가 동일한 앰플리콘에 라이게이션될 때에만 발생한다. 일부 실시형태에서, SEDAL은 STARmap과 함께 사용된다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서의 방법은 낮은 백그라운드 노이즈 및 오류 감소와 함께 조직 모폴로지의 최상의 보존을 위해 실온에서 작동하는 단계를 포함한다. 이러한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 접촉시키는 것은 시퀀싱이 진행됨에 따라 오류 축적을 제거하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘의 접촉은 비제한적으로, 예를 들어, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 또는 7회 이상을 포함하는 2회 이상 발생한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘의 접촉은 얇은 조직 표본에 대해 4회 이상 발생한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘의 접촉은 두꺼운 조직 표본에 대해 6회 이상 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 앰플리콘은 24시간 이상, 24시간 이하, 18시간 이하, 12시간 이하, 8시간 이하, 6시간 이하, 4시간 이하, 2시간 이하, 60분 이하, 45분 이하, 30분 이하, 25분 이하, 20분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 5분 이하, 또는 2분 이하 동안 한 쌍의 프라이머에 의해 접촉될 수 있다.
본 방법을 사용하여 제조된 표본은 임의의 다수의 상이한 유형의 현미경, 예를 들어, 광학 현미경(예를 들어, 명시야, 경사 조명, 암시야, 위상 콘트라스트, 미분 간섭 콘트라스트, 간섭 반사, 에피형광, 공초점 현미경, 등), 레이저 현미경, 전자 현미경, 및 주사 프로브 현미경에 의해 분석될 수 있다. 일부 양태에서, 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체는 다수의 라운드의 인시투 시퀀싱의 현미경을 통해 획득된 미가공 이미지를 먼저 디코딩된 유전자 동일성 및 공간 위치로 변환한 다음, 유전자 발현의 세포별 조성을 분석한다.
SEDAL 올리고뉴클레오타이드 프라이머
일부 실시형태에서, 개시된 방법은 제3 올리고뉴클레오타이드 및 제4 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 양태에서, 제3 올리고뉴클레오타이드는 염기를 디코딩하도록 구성되고, 제4 올리고뉴클레오타이드는 디코딩된 염기를 신호로 전환시키도록 구성된다. 일부 양태에서, 신호는 형광 신호이다. 예시적인 양태에서, 라이게이션을 허용하는 조건 하에 바코드 서열을 갖는 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 한 쌍의 프라이머와 접촉시키는 것은 제3 올리고뉴클레오타이드 및 제4 올리고뉴클레오타이드 각각을 라이게이션하여 완벽한 일치가 발생할 때에만 이미징하기 위한 안정한 생성물을 형성하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 리가제 효소의 미스매치 민감성은 표적 핵산 분자의 기본 서열을 결정하는 데 사용된다.
이중체(duplex)와 관련하여 사용될 때, 용어 "완전히 매칭된"은 이중체를 구성하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 가닥이 서로 이중 가닥 구조를 형성하여 각 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 다른 가닥의 뉴클레오타이드와 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는 것을 의미한다. 용어 "이중체"는 사용될 수 있는 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대, 데옥시이노신, 2-아미노퓨린 염기를 갖는 뉴클레오사이드, 펩타이드 핵산(PNA) 등의 페어링을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 2개의 올리고뉴클레오타이드 사이의 이중체에서 "미스매치"는 이중체에서 한 쌍의 뉴클레오타이드가 왓슨-크릭 결합을 일으키지 못하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 방법은 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는, 5개 이상의 제3 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상의 제3 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제3 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 15개 이상, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 또는 최대 80개의 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 15개 이상의 제3 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 또는 최대 80개의 상이한 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제3 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 5개 이상의 제4 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제4 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 15개 이상, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 또는 최대 80개의 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 15개 이상의 제4 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 또는 최대 80개의 상이한 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제4 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 복수의 올리고뉴클레오타이드 쌍이 반응에 사용될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 쌍은 각각의 표적 핵산에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 민감성을 개선하고 가변성을 감소시키기 위해 2개의 프라이머 쌍이 하나의 표적 핵산에 사용될 수 있다. 세포에서 복수의 상이한 표적 핵산을 검출하는 것, 예를 들어, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 12, 최대 15, 최대 18, 최대 20, 최대 25, 최대 30, 최대 40 또는 그 초과의 별개의 표적 핵산을 검출하는 것이 또한 고려된다.
특정 실시형태에서, SEDAL은 염기 미스매치에 의해 장애된 활성을 갖는 리가제, 제3 올리고뉴클레오타이드, 및 제4 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 맥락에서 용어 "장애된"은 대략 20% 이상, 예컨대, 25% 이상, 예컨대, 50% 이상, 예컨대, 75% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100%만큼 감소되는 리가제의 활성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제3 올리고뉴클레오타이드는 5 내지 13개의 뉴클레오타이드, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드, 또는 5 내지 8개의 뉴클레오타이드를 포함하지만 이로 제한되지 않는 5 내지 15개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제3 올리고뉴클레오타이드의 Tm은 실온(22 내지 25℃)이다. 일부 실시형태에서, 제3 올리고뉴클레오타이드는 축퇴성, 또는 이의 부분적이다. 일부 실시형태에서, 제4 올리고뉴클레오타이드는 5 내지 13개의 뉴클레오타이드, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드, 또는 5 내지 8개의 뉴클레오타이드를 포함하지만 이로 제한되지 않는 5 내지 15개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제4 올리고뉴클레오타이드의 Tm은 실온(22 내지 25℃)이다. 염기 판독에 상응하는 SEDAL의 각 사이클 후, 제4 올리고뉴클레오타이드는 스트립핑될 수 있으며, 이는 시퀀싱이 진행됨에 따라 오류 축적을 제거한다. 이러한 실시형태에서, 제4 올리고뉴클레오타이드는 포름아미드에 의해 스트립핑된다.
일부 실시형태에서, SEDAL은 제3 올리고뉴클레오타이드 및 제4 올리고뉴클레오타이드를 세척하여 결합되지 않은 올리고뉴클레오타이드를 제거한 후, 이미징을 위해 형광 생성물을 드러내는 것을 포함한다. 특정 예시적인 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 검출하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 하나 이상의 앰플리콘을 검출하는 데 사용될 수 있다. 검출 가능한 마커의 예는 다양한 방사성 모이어티, 효소, 보결 그룹, 형광 마커, 발광성 마커, 생물발광성 마커, 금속 입자, 단백질-단백질 결합 쌍, 단백질-항체 결합 쌍 등을 포함한다. 형광 단백질의 예는 황색 형광 단백질(YFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 시안 형광 단백질(CFP), 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 생물발광 마커의 예는 루시페라제(예를 들어, 박테리아, 반딧불이, 클릭 딱정벌레 등), 루시페린, 애쿼린 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 시각적으로 검출 가능한 신호를 갖는 효소 시스템의 예는 갈락토시다제, 글루코리미다제, 포스파타제, 퍼옥시다제, 콜린에스테라제 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 식별 가능한 마커는 또한 125I, 35S, 14C, 또는 3H와 같은 방사성 화합물을 포함한다. 식별 가능한 마커는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하다.
형광 표지 및 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드에 대한 이들의 부착은 문헌[Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller and Manak, DNA Probes, 2nd Edition (Stockton Press, New York, 1993); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); 및 Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26:227-259 (1991)]을 포함하는 여러 논문에 개시되어 있다. 본 발명에 적용 가능한 특정 방법론은 하기 참고문헌 샘플에 개시되어 있다: 미국 특허 제4,757,141호, 제5,151,507호 및 제5,091,519호. 일 양태에서, 하나 이상의 형광 염료는, 예를 들어, 미국 특허 제5,188,934호(4,7-다이클로로플루오레세인 염료); 미국 특허 제5,366,860호(스펙트럼 분해 가능한 로다민 염료); 미국 특허 제5,847,162호(4,7-다이클로로로다민 염료); 미국 특허 제4,318,846호(에터-치환된 플루오레세인 염료); 미국 특허 제5,800,996호(에너지 전달 염료); 문헌(Lee et al.); 미국 특허 제5,066,580호(크산틴 염료); 미국 특허 제5,688,648호(에너지 전달 염료); 등에 의해 개시된 바와 같이 표지된 표적 서열을 위한 표지로서 사용된다. 표지화는 또한 하기 특허 및 특허 공보에 개시된 바와 같이 양자점으로 수행될 수 있다: 미국 특허 제6,322,901호, 제6,576,291호, 제6,423,551호, 제6,251,303호, 제6,319,426호, 제6,426,513호, 제6,444,143호, 제5,990,479호, 제6,207,392호, 제2002/0045045호 및 제2003/0017264호. 본 명세서에서 사용되는 용어 "형광 표지"는 하나 이상의 분자의 형광 흡수 및/또는 방출 특성을 통해 정보를 전달하는 신호전달 모이어티를 포함한다. 이러한 형광 특성은 형광 강도, 형광 수명, 방출 스펙트럼 특성, 에너지 전달 등을 포함한다.
뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열에 용이하게 혼입되는 상업적으로 이용 가능한 형광 뉴클레오타이드 유사체는 Cy3-dCTP, Cy3-dUTP, Cy5-dCTP, Cy5-dUTP(Amersham Biosciences, 뉴저지 피스카타웨이 소재), 플루오레세인-12-dUTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, TEXAS RED™-5-dUTP, CASCADE BLUE™-7-dUTP, BODIPY TMFL-14-dUTP, BODIPY TMR-14-dUTP, BODIPY TMTR-14-dUTP, RHODAMINE GREEN™-5-dUTP, OREGON GREENR™ 488-5-dUTP, TEXAS RED™-12-dUTP, BODIPY™ 630/650-14-dUTP, BODIPY™ 650/665-14-dUTP, ALEXA FLUOR™ 488-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 532-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 568-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 594-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 546-14-dUTP, 플루오레세인-12-UTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, TEXAS RED™-5-UTP, mCherry, CASCADE BLUE™-7-UTP, BODIPY™ FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, BODIPY™ TR-14-UTP, RHODAMINE GREEN™-5-UTP, ALEXA FLUOR™ 488-5-UTP, LEXA FLUOR™ 546-14-UTP(Molecular Probes, Inc. 오레곤 유진 소재), 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 다른 형광단을 갖는 뉴클레오타이드의 맞춤 합성을 위한 프로토콜은 당 분야에 공지되어 있다(문헌[Henegariu et al. (2000) Nature Biotechnol. 18:345] 참조).
합성 후 부착에 이용 가능한 다른 형광단은 ALEXA FLUOR™ 350, ALEXA FLUOR™ 532, ALEXA FLUOR™ 546, ALEXA FLUOR™ 568, ALEXA FLUOR™ 594, ALEXA FLUOR™ 647, BODIPY 493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우, 단실, 리사민 로다민 B, 마리나 블루, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific Blue, 로다민 6G, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸 로다민, 텍사스 레드(Molecular Probes, Inc.로부터 입수 가능함, 오레곤주 유진 소재), Cy2, Cy3.5, Cy5.5, Cy7(Amersham Biosciences, 뉴저지 피스카타웨이 소재) 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, PE-Texas Red, APC-Cy7, PE-Alexa 염료(610, 647, 680), APC-Alexa 염료 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 FRET 탠덤 형광단이 또한 사용될 수 있다.
금속성 은 또는 금 입자는 형광 표지된 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열로부터의 신호를 향상시키기 위해 사용될 수 있다(Lakowicz et al. (2003) Bio Techniques 34:62).
비오틴 또는 이의 유도체는 또한 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열 상의 표지로서 사용될 수 있고, 후속적으로 검출 가능하게 표지된 아비딘/스트렙타비딘 유도체(예를 들어, 피코에리트린-컨쥬게이션된 스트렙타비딘), 또는 검출 가능하게 표지된 항-비오틴 항체에 의해 결합될 수 있다. 디곡시제닌은 표지로서 혼입되고, 후속하여 검출 가능하게 표지된 항-디곡시제닌 항체(예를 들어, 플루오레세인화된 항-디곡시제닌)에 의해 결합될 수 있다. 아미노알릴-dUTP 잔기는 올리고뉴클레오타이드 서열에 혼입되고 후속하여 N-하이드록시 숙신이미드(NHS) 유도체화된 형광 염료에 커플링될 수 있다. 일반적으로, 컨쥬게이트 쌍의 임의의 구성원은 검출 가능하게 표지된 컨쥬게이트 파트너가 검출을 허용하도록 결합될 수 있는 한 검출 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 항체는 임의의 부류의 항체 분자, 또는 이의 임의의 서브-단편, 예컨대, Fab를 지칭한다.
올리고뉴클레오타이드 서열에 대한 다른 적합한 표지는 플루오레세인(FAM), 디곡시게닌, 다이나이트로페놀(DNP), 단실, 비오틴, 브로모데옥시우리딘(BrdU), 헥사히스티딘(6xHis), 포스포르-아미노산(예를 들어, P-tyr, P-ser, P-thr), 등을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 하기 합텐/항체 쌍이 검출을 위해 사용되며, 여기서 각각의 항체는 하기 검출 가능한 표지로 유도체화된다: 비오틴/α-비오틴, 디곡시게닌/α-디곡시게닌, 다이나이트로페놀(DNP)/α-DNP, 5-카복시플루오레세인(FAM)/α-FAM.
특정 예시적인 실시형태에서, 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열은 특히, 예를 들어, 미국 특허 제5,344,757호, 제5,702,888호, 제5,354,657호, 제5,198,537호 및 제4,849,336호, PCT 공개 WO 91/17160호 등에 개시된 바와 같이, 포획제에 의해 결합되는 합텐으로 간접적으로 표지될 수 있다. 많은 상이한 합텐-포획제 쌍이 이용 가능하다. 예시적인 합텐은 비오틴, 데스-비오틴 및 다른 유도체, 다이나이트로페놀, 단실, 플루오레세인, CY5, 디곡시게닌 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 비오틴의 경우, 포획제는 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 항체일 수 있다. 항체는 다른 합텐에 대한 포획제로서 사용될 수 있다(많은 염료-항체 쌍이 상업적으로 입수 가능함, 예를 들어, Molecular Probes(오레곤주 유진 소재)).
일부 실시형태에서, 인시투 시퀀싱은 표적 핵산의 서열을 결정하기 위해 경쟁적 어닐링 및 라이게이션에 의한 시퀀싱(sequencing by competitive annealing and ligation: SCAL)을 사용하여 수행되고, 상기 방법은 하나 이상의 시퀀싱 사이클을 수행하는 단계를 포함하며, 각각의 사이클은 (a) 표적 핵산을 리드 올리고뉴클레오타이드(read oligonucleotide) 및 형광 표지된 디코딩 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 리드 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 상의 리딩 서열(reading sequence)에 상보적인 제1 상보성 영역을 포함하고, 각각의 디코딩 프로브는 표적 핵산 상의 프로브 결합 부위에 상보적인 제2 상보성 영역을 포함하는, 단계; (b) 리드 올리고뉴클레오타이드를 형광 표지된 디코딩 프로브 세트의 디코딩 프로브 중 하나에 라이게이션하여 형광 라이게이션 생성물을 생성하는 단계로서, 라이게이션은 리드 올리고뉴클레오타이드 및 디코딩 프로브가 표적 핵산 상의 인접한 서열에 결합하는 경우에만 발생하고, 리드 올리고뉴클레오타이드 및 디코딩 프로브 둘 모두는 표적 핵산의 서열에 정확히 상보적인 서열을 갖는, 단계; (c) 라이게이션되지 않은 프로브를 제거하는 단계; (d) 형광 라이게이션 생성물을 이미징하여 리드 올리고뉴클레오타이드에 라이게이션된 디코딩 프로브의 형광 표지를 검출하는 단계로서, 형광 표지는 표적 핵산의 서열의 뉴클레오타이드를 식별하는, 단계; 및 (e) 경쟁자 올리고뉴클레오타이드를 표적 핵산에 결합시킴으로써 표적 핵산으로부터 형광 라이게이션 생성물을 제거하는 단계로서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 상의 리딩 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제3 상보성 영역을 포함하고, 형광 라이게이션 생성물은 표적 핵산으로부터 해리되는, 단계를 포함한다.
예시적인 양태에서, 라이게이션은 각각의 리드 올리고뉴클레오타이드 및 형광 표지된 디코딩 프로브 라이게이션을 포함하여 완벽한 매치가 발생할 때만 이미징을를 위한 안정한 생성물을 형성한다. 특정 양태에서, 리가제 효소의 미스매치 민감성은 표적 핵산 분자의 기본 서열을 결정하는 데 사용된다. 시퀀싱 라이게이션 혼합물에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머를 포함시키면 표적 핵산에 대한 신호 첨가가 실질적으로 가속화된다. 예시적인 PEG 폴리머는 300 g/mol 내지 10,000,000 g/mol 범위의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, PEG 6000 폴리머는 리드 올리고뉴클레오타이드 및 형광 표지된 디코딩 프로브의 라이게이션 동안 존재한다.
특정 실시형태에서, 형광 표지된 디코딩 프로브의 세트는 구아닌을 인코딩하는 제1 프로브(여기서, 제1 프로브는 제1 형광 표지를 포함함), 아데닌을 인코딩하는 제2 프로브(여기서, 제2 프로브는 제2 형광 표지를 포함함), 사이토신을 인코딩하는 제3 프로브(여기서, 제3 프로브는 제3 형광 표지를 포함함), 및 티민을 인코딩하는 제4 프로브(여기서, 제4 프로브는 제4 형광 표지를 포함함)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 각각의 형광 표지된 디코딩 프로브는 리드 올리고뉴클레오타이드가 형광 표지된 디코딩 프로브에 라이게이션된 라이게이션 접합부에 인접한 1 내지 3개의 염기를 인코딩하며, 여기서 상이한 염기 서열을 인코딩하는 형광 표지된 디코딩 프로브는 상이한 형광 표지를 포함한다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱의 현재 사이클에 대한 형광 표지된 디코딩 프로브의 서열은 다른 시퀀싱 사이클에 대한 형광 표지된 디코딩 프로브와의 교차-하이브리드화를 최소화하도록 최적화된다.
특정 실시형태에서, 리드 올리고뉴클레오타이드의 길이는 8, 9, 10, 또는 11개의 뉴클레오타이드와 같은 이러한 범위 내의 임의의 길이를 포함하는 8 내지 11개의 뉴클레오타이드 범위이다. 일부 실시형태에서, 리드 올리고뉴클레오타이드는 17℃, 18℃, 19℃, 또는 20℃와 같은 이러한 범위 내의 임의의 용융 온도를 포함하여, 17℃ 내지 20℃ 범위의 용융 온도를 갖는다.
특정 실시형태에서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 프로브 결합 부위의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함하는 제4 상보성 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드의 제4 상보성 영역은 표적 핵산 상의 전체 프로브 결합 부위에 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 상의 리딩 서열에 인접한 경쟁자-특이적 상보성 부위에 상보적인 서열을 포함하는 제5 상보성 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 경쟁자-특이적 상보적 부위는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 뉴클레오타이드와 같은 하기 범위 내의 임의의 길이를 포함하는 2개의 뉴클레오타이드 내지 16개의 뉴클레오타이드의 길이 범위이다. 특정 실시형태에서, 초기 시퀀싱 사이클 후의 시퀀싱 사이클의 경우, 이전의 시퀀싱 사이클에 사용된 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 후속 시퀀싱 사이클 동안 존재한다.
특정 실시형태에서, 리드 올리고뉴클레오타이드는 경쟁자-특이적 상보적 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 리드 올리고뉴클레오타이드의 경쟁자-특이적 상보적 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 뉴클레오타이드와 같은 하기 범위 내의 임의의 길이를 포함하는 2개의 뉴클레오타이드 내지 16개의 뉴클레오타이드의 길이 범위이다. 특정 실시형태에서, 시퀀싱의 현재 사이클에 대한 리드 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다른 시퀀싱 사이클에 대한 리드 올리고뉴클레오타이드와의 교차-하이브리드화를 최소화하도록 최적화된다.
특정 실시형태에서, 다중 리드 올리고뉴클레오타이드, 형광 표지된 디코딩 프로브의 세트, 및 상이한 표적 핵산에 대한 특이성을 갖는 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 복수의 상이한 표적 핵산을 동시에 또는 순차적으로 시퀀싱하는 데 사용된다.
특정 실시형태에서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 시퀀싱 사이클의 단계 (a) 또는 (b)를 현재 겪고 있는 표적 핵산과 상이한 표적 핵산으로부터 이전 라운드의 시퀀싱으로부터 라이게이션 생성물을 제거한다. 특정 실시형태에서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 시퀀싱 사이클의 단계 (a) 또는 (b)를 현재 겪고 있는 동일한 표적 핵산으로부터 이전 라운드의 시퀀싱으로부터 라이게이션 생성물을 제거한다. 특정 실시형태에서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 다음 시퀀싱의 사이클에 대한 리딩 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제4 상보성 영역을 포함하는 라운드-특이적 경쟁자 올리고뉴클레오타이드이다.
시퀀싱 리드는 5'에서 3' 정방향 또는 3'에서 5' 역방향일 수 있다. 정방향으로의 시퀀싱 리드의 경우, 각각의 형광 표지된 디코딩 프로브는 5' 말단에 형광단 변형을 갖고, 각각의 리드 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에 포스페이트를 갖는다. 역방향으로의 시퀀싱 판독을 위해, 각각의 형광 표지된 디코딩 프로브는 5' 말단에 포스페이트 및 3' 말단에 형광단 변형을 갖는다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱은 순차적 인코딩으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 각각의 리드 올리고뉴클레오타이드는 시퀀싱의 각각의 사이클에 대해 독특한 순차적인 직교 판독 서열 및 독특한 인접한 경쟁자-특이적 상보적 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 독특한 순차적 직교 판독 서열은 8, 9, 10, 또는 11개의 뉴클레오타이드와 같은 하기 범위 내의 임의의 길이를 포함하는 8개의 뉴클레오타이드 내지 11개의 뉴클레오타이드의 길이 범위이다. 일부 실시형태에서, 독특한 인접한 경쟁자-특이적 상보적 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 뉴클레오타이드와 같은 하기 범위 내의 임의의 길이를 포함하는 2개의 뉴클레오타이드 내지 16개의 뉴클레오타이드의 길이 범위이다. 일부 실시형태에서, 각각의 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 리드 올리고뉴클레오타이드의 독특한 순차적인 직교 판독 서열 및 독특한 인접한 경쟁자-특이적 상보적 서열에 상보적인 서열 및 시퀀싱의 각 사이클에 대한 형광 표지된 디코딩 프로브의 서열의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드의 서열은 형광 표지된 디코딩 프로브의 서열에 대해 부분적 상보성 또는 완전한 상보성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱은 조합 인코딩으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 다중 리드 올리고뉴클레오타이드가 시퀀싱에 사용되며, 여기서 각각의 리드 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 상의 별도의 조합 리드 포지션에서 리딩 서열에 상보적인 조합 판독 서열을 포함하는 제1 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적 핵산 상의 각각의 별도의 포지션에서의 리딩 서열은 프로브 결합 부위에 인접한다. 일부 실시형태에서, 각각의 리드 올리고뉴클레오타이드는 리딩 서열에 인접한 경쟁자-특이적 상보적 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 경쟁자-특이적 상보적 서열은 형광 표지된 디코딩 프로브에 상보적이지 않다. 일부 실시형태에서, 리딩 서열은 8, 9, 10, 또는 11개의 뉴클레오타이드와 같은 하기 범위 내의 임의의 길이를 포함하는 8개의 뉴클레오타이드 내지 11개의 뉴클레오타이드의 길이 범위이다. 일부 실시형태에서, 경쟁자-특이적 상보적 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 뉴클레오타이드와 같은 하기 범위 내의 임의의 길이를 포함하는 2개의 뉴클레오타이드 내지 16개의 뉴클레오타이드의 길이 범위이다. 일부 실시형태에서, 각각의 개별 조합 리드 포지션에 대해, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 시퀀싱의 각 사이클에 대해 조합 판독 서열 및 리드 올리고뉴클레오타이드의 경쟁자-특이적 상보적 서열에 상보적인 서열 및 형광 표지된 디코딩 프로브의 서열의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조합 인코딩은 해밍 코드를 사용한다.
본 명세서에 기재된 시퀀싱 방법은 온전한 조직의 세포에서 표적 핵산의 인시투 유전자 시퀀싱에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 온전한 조직에서 세포에서 표적 핵산의 인시투 유전자 시퀀싱 방법은 (a) 고정되고 투과된 온전한 조직을 특이적 혼성화를 허용하는 조건 하에 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 한 쌍의 프라이머는 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드는 제1 상보성 영역, 제2 상보성 영역 서열, 및 제3 상보성 영역을 포함하고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 바코드 서열을 추가로 포함하고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 표적 핵산의 제1 부분에 상보적이고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역에 상보적이고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역에 상보적이고, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 표적 핵산의 제2 부분에 상보적이고, 표적 핵산의 제1 부분은 표적 핵산의 제2 부분에 인접하는, 단계; (b) 리가제를 첨가하여 제2 올리고뉴클레오타이드를 라이게이션하고 폐쇄형 핵산 사이클을 생성하는 단계; (c) 핵산 분자의 존재 하에 롤링 사이클 증폭을 수행하는 단계로서, 수행하는 단계는 제2 올리고뉴클레오타이드를 주형으로서 사용하고 제1 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 하나 이상의 앰플리콘을 형성하는 것을 포함하는, 단계; (d) 하이드로겔 서브유닛의 존재 하에 하나 이상의 앰플리콘을 포매하여 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 형성시키는 단계; (e) 본 명세서에 기재된 방법에 따라 하나 이상의 앰플리콘을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 시퀀싱은 순차적 인코딩으로 수행된다. 다른 실시형태에서, 시퀀싱은 조합 인코딩으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘과의 접촉은 비제한적으로, 예를 들어, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 또는 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상, 10회 이상, 11회 이상, 또는 12회 이상을 포함하는, 2회 이상 일어난다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘과의 접촉은 얇은 조직 표본에 대해 4회 이상 발생한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘과의 접촉은 두꺼운 조직 표본에 대해 6회 이상 발생한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 앰플리콘은 24시간 이상, 24시간 이하, 18시간 이하, 12시간 이하, 8시간 이하, 6시간 이하, 4시간 이하, 2시간 이하, 60분 이하, 45분 이하, 30분 이하, 25분 이하, 20분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 5분 이하, 또는 2분 이하 동안 한 쌍의 프라이머에 의해 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 13회 이상의 사이클, 14회 이상의 사이클, 15회 이상의 사이클, 16회 이상의 사이클, 17회 이상의 사이클, 또는 18회 이상의 사이클의 시퀀싱을 포함하는 12회 이상의 사이클의 시퀀싱이 수행된다. 일부 실시형태에서, 방법은 낮은 백그라운드 노이즈 및 오류 감소를 갖는 조직 모폴로지의 보존을 위해 실온에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 접촉시키는 것은 시퀀싱이 진행됨에 따라 오류 축적을 제거하는 것을 포함한다.
본 방법을 사용하여 제조된 표본은 임의의 다수의 상이한 유형의 현미경, 예를 들어, 광학 현미경(예를 들어, 명시야, 경사 조명, 암시야, 위상 콘트라스트, 미분 간섭 콘트라스트, 간섭 반사, 에피형광, 공초점 현미경, 등), 레이저 현미경, 전자 현미경, 및 주사 프로브 현미경에 의해 분석될 수 있다. 일부 양태에서, 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체는 다수의 라운드의 인시투 시퀀싱의 현미경을 통해 획득된 미가공 이미지를 먼저 디코딩된 유전자 동일성 및 공간 위치로 변환한 다음, 유전자 발현의 세포별 조성을 분석한다.
이중체와 관련하여 사용될 때, 용어 "완전히 매칭된"은 이중체를 구성하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 가닥이 서로 이중 가닥 구조를 형성하여 각 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 다른 가닥의 뉴클레오타이드와 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성함을 의미한다. 용어 "이중체"는 사용될 수 있는 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대, 데옥시이노신, 2-아미노퓨린 염기를 갖는 뉴클레오사이드, 펩타이드 핵산(PNA) 등의 페어링을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 2개의 올리고뉴클레오타이드 사이의 이중체에서 "미스매치"는 이중체에서 한 쌍의 뉴클레오타이드가 왓슨-크릭 결합을 겪지 못하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 방법은 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는, 5개 이상의 리드 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상 또는 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상의 리드 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 리드 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 15개 이상, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 및 최대 80개의 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 15개 이상의 리드 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 및 최대 80개의 상이한 리드 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 리드 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 4개 이상의 형광 표지된 디코딩 프로브, 예를 들어, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 16개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상의 형광 표지된 디코딩 프로브를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 형광 표지된 디코딩 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 15개 이상, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 및 최대 80개의 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 15개 이상의 형광 표지된 디코딩 프로브, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 및 최대 80개의 상이한 형광 표지된 디코딩 프로브를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 형광 표지된 디코딩 프로브를 포함한다.
복수의 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 반응에 사용될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 쌍은 각각의 표적 핵산에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 민감성을 개선하고 가변성을 감소시키기 위해 2개의 프라이머 쌍이 하나의 표적 핵산에 사용될 수 있다. 세포에서 복수의 상이한 표적 핵산을 검출하는 것, 예를 들어, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 12, 최대 15, 최대 18, 최대 20, 최대 25, 최대 30, 최대 40개 또는 그 초과의 별개의 표적 핵산을 검출하는 것이 또한 고려된다.
특정 실시형태에서, 시퀀싱은 염기 미스매치에 의해 장애된 활성을 갖는 리가제, 리드 올리고뉴클레오타이드, 및 형광 표지된 디코딩 프로브로 수행된다. 이러한 맥락에서 용어 "장애된"은 대략 20% 이상, 예컨대, 25% 이상, 예컨대, 50% 이상, 예컨대, 75% 이상, 예컨대, 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100%만큼 감소되는 리가제의 활성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제3 올리고뉴클레오타이드는 5 내지 13개 뉴클레오타이드, 5 내지 10개 뉴클레오타이드, 또는 5 내지 8개 뉴클레오타이드를 포함하지만 이로 제한되지 않는 5 내지 15개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제3 올리고뉴클레오타이드의 Tm은 실온(22 내지 25℃)이다. 일부 실시형태에서, 리드 올리고뉴클레오타이드는 축퇴성, 또는 이의 부분적으로 축퇴된다. 일부 실시형태에서, 형광 표지된 디코딩 프로브 올리고뉴클레오타이드는 5 내지 13개 뉴클레오타이드, 5 내지 10개 뉴클레오타이드, 또는 5 내지 8개 뉴클레오타이드를 포함하지만 이로 제한되지 않는 5 내지 15개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제4 올리고뉴클레오타이드의 Tm은 실온(22℃ 내지 25℃)이다. 염기 판독에 상응하는 시퀀싱의 각 사이클 후, 형광 라이게이션 생성물은 경쟁자 올리고뉴클레오타이드를 표적 핵산에 결합시킴으로써 표적 핵산으로부터 제거되고, 여기서 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 상의 리딩 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제3 상보성 영역을 포함하고, 형광 라이게이션 생성물은 표적 핵산으로부터 해리된다.
일부 실시형태에서, 시퀀싱은 결합되지 않은 올리고뉴클레오타이드 및 라이게이션되지 않은 프로브를 제거하기 위해 세척한 후, 이미징을 위해 형광 생성물을 드러내는 것을 포함한다. 특정 예시적인 실시형태에서, 검출 가능한 형광 표지는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 검출하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 검출 가능한 형광 표지, 예컨대, 형광 단백질, 형광 염료, 또는 형광 양자점은 프로브를 표지하는 데 사용된다.
형광 표지 및 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드에 대한 이들의 부착은 문헌[Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller and Manak, DNA Probes, 2nd Edition (Stockton Press, New York, 1993); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach　(IRL Press, Oxford, 1991); 및 Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,　26:227-259 (1991)]을 포함하는 다수의 논문에 기재되어 있다. 본 발명에 적용 가능한 특정 방법론은 하기 참고문헌의 샘플에 개시되어 있다: 미국 특허 제4,757,141호, 제5,151,507호 및 제5,091,519호. 일 양태에서, 하나 이상의 형광 염료는, 예를 들어, 미국 특허 제5,188,934호(4,7-다이클로로플루오레세인 염료); 미국 특허 제5,366,860호(스펙트럼 분해 가능한 로다민 염료); 미국 특허 제5,847,162호(4,7-다이클로로로다민 염료); 미국 특허 제4,318,846호(에터-치환된 플루오레세인 염료); 미국 특허 제5,800,996호(에너지 전달 염료), 문헌[Lee et al.]; 미국 특허 제5,066,580호(크산틴 염료); 미국 특허 제5,688,648호(에너지 전달 염료); 등에 의해 기재된 바와 같이, 표지된 표적 서열을 위한 표지로서 사용된다. 표지는 또한 하기 특허 및 특허 공보에 개시된 바와 같이 양자점으로 수행될 수 있다: 미국 특허 제6,322,901호, 제6,576,291호, 제6,423,551호, 제6,251,303호, 제6,319,426호, 제6,426,513, 제6,444,143호, 제5,990,479호, 제6,207,392호, 공개 제2002/0045045호 및 공개 제2003/0017264호. 본 명세서에서 사용되는 용어 "형광 표지"는 하나 이상의 분자의 형광 흡수 및/또는 방출 특성을 통해 정보를 전달하는 신호전달 모이어티를 포함한다. 이러한 형광 특성은 형광 강도, 형광 수명, 방출 스펙트럼 특성, 에너지 전달 등을 포함한다.
뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열에 용이하게 혼입되는 상업적으로 이용 가능한 형광 뉴클레오타이드 유사체는 Cy3-dCTP, Cy3-dUTP, Cy5-dCTP, Cy5-dUTP(Amersham Biosciences, 뉴저지 피스카타웨이 소재), 플루오레세인-12-dUTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, TEXAS RED™-5-dUTP, CASCADE BLUE™-7-dUTP, BODIPY TMFL-14-dUTP, BODIPY TMR-14-dUTP, BODIPY TMTR-14-dUTP, RHODAMINE GREEN™-5-dUTP, OREGON GREENR™ 488-5-dUTP, TEXAS RED™-12-dUTP, BODIPY™ 630/650-14-dUTP, BODIPY™ 650/665-14-dUTP, ALEXA FLUOR™ 488-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 532-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 568-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 594-5-dUTP, ALEXA FLUOR™ 546-14-dUTP, 플루오레세인-12-UTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, TEXAS RED™-5-UTP, mCherry, CASCADE BLUE™-7-UTP, BODIPY™ FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, BODIPY™ TR-14-UTP, RHODAMINE GREEN™-5-UTP, ALEXA FLUOR™ 488-5-UTP, LEXA FLUOR™ 546-14-UTP(Molecular Probes, Inc. 오레곤 유진 소재), 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 다른 형광단을 갖는 뉴클레오타이드의 맞춤 합성을 위한 프로토콜은 당 분야에 공지되어 있다(문헌[Henegariu et al. (2000) Nature Biotechnol. 18:345] 참조).
합성 후 부착에 이용 가능한 다른 형광단은 ALEXA FLUOR™ 350, ALEXA FLUOR™ 532, ALEXA FLUOR™ 546, ALEXA FLUOR™ 568, ALEXA FLUOR™ 594, ALEXA FLUOR™ 647, BODIPY 493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우, 단실, 리사민 로다민 B, 마리나 블루, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific Blue, 로다민 6G, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸 로다민, 텍사스 레드(Molecular Probes, Inc.로부터 입수 가능함, 오레곤주 유진 소재), Cy2, Cy3.5, Cy5.5, Cy7(Amersham Biosciences, 뉴저지 피스카타웨이 소재) 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, PE-Texas Red, APC-Cy7, PE-Alexa 염료(610, 647, 680), APC-Alexa 염료 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 FRET 탠덤 형광단이 또한 사용될 수 있다.
형광 단백질의 예는 녹색 형광 단백질, 수퍼폴더 녹색 형광 단백질, 향상된 녹색 형광 단백질, Dronpa(광스위칭 가능 녹색 형광 단백질), 황녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 오렌지색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 보라색 형광 단백질, mApple, mNectarine, mNeptune, mCherry, mStrawberry, mPlum, mRaspberry, mCrimson3, mCarmine, mCardinal, mScarlet, mRuby2, FusionRed, mNeonGreen, TagRFP675, 및 mRFP1 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
금속성 은 또는 금 입자는 형광 표지된 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열로부터의 신호를 향상시키기 위해 사용될 수 있다(Lakowicz et al. (2003) Bio Techniques 34:62).
비오틴 또는 이의 유도체는 또한 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열 상의 표지로서 사용될 수 있고, 후속적으로 검출 가능하게 표지된 아비딘/스트렙타비딘 유도체(예를 들어, 피코에리트린-컨쥬게이션된 스트렙타비딘), 또는 검출 가능하게 표지된 항-비오틴 항체에 의해 결합될 수 있다. 디곡시제닌은 표지로서 혼입되고, 후속하여 검출 가능하게 표지된 항-디곡시제닌 항체(예를 들어, 플루오레세인화된 항-디곡시제닌)에 의해 결합될 수 있다. 아미노알릴-dUTP 잔기는 올리고뉴클레오타이드 서열에 혼입되고 후속하여 N-하이드록시 숙신이미드(NHS) 유도체화된 형광 염료에 커플링될 수 있다. 일반적으로, 컨쥬게이트 쌍의 임의의 구성원은 검출 가능하게 표지된 컨쥬게이트 파트너가 검출을 허용하도록 결합될 수 있는 한 검출 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 항체는 임의의 부류의 항체 분자, 또는 이의 임의의 서브-단편, 예컨대, Fab를 지칭한다.
올리고뉴클레오타이드 서열에 대한 다른 적합한 표지는 플루오레세인(FAM), 디곡시게닌, 다이나이트로페놀(DNP), 단실, 비오틴, 브로모데옥시우리딘(BrdU), 헥사히스티딘(6xHis), 포스포르-아미노산(예를 들어, P-tyr, P-ser, P-thr) 등을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 하기 합텐/항체 쌍이 검출을 위해 사용되며, 여기서 각각의 항체는 검출 가능한 표지로 유도체화된다: 비오틴/α-비오틴, 디곡시게닌/α-디곡시게닌, 다이나이트로페놀(DNP)/α-DNP, 5- 카복시플루오레세인(FAM)/α-FAM.
특정 예시적인 실시형태에서, 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 서열은 특히, 예를 들어, 미국 특허 제5,344,757호, 제5,702,888호, 제5,354,657호, 제5,198,537호 및 제4,849,336호, PCT 공개 WO 91/17160호 등에 기재된 바와 같은, 포획제에 의해 이후 결합되는 합텐으로 간접적으로 표지될 수 있다. 많은 상이한 합텐-포획제 쌍이 이용 가능하다. 예시적인 합텐은 비오틴, 데스-비오틴 및 다른 유도체, 다이나이트로페놀, 단실, 플루오레세인, CY5, 디곡시게닌 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 비오틴의 경우, 포획제는 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 항체일 수 있다. 항체는 다른 합텐에 대한 포획제로서 사용될 수 있다(많은 염료-항체 쌍이 상업적으로 입수 가능함, 예를 들어, Molecular Probes, 오레곤주 유진 소재).
일부 실시형태에서, 항산화제 화합물은 형광 이미징 동안 광표백을 감소시키기 위해 세척 및 이미징 완충제(즉, "퇴색 방지 완충제")에 포함된다. 예시적인 항산화제는 비제한적으로, Trolox(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산) 및 Trolox-퀴논, 프로필-갈레이트, 3차 부틸하이드로퀴논, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 글루타티온, 아스코르브산 및 토코페롤을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 항산화제는 형광단에 대해 퇴색 방지 효과를 갖는다. 즉, 항산화제는 타일링(tiling) 동안 광표백을 감소시키고, 민감한 형광단의 신호 대 잡음비(SNR)를 크게 향상시키고, 더 두꺼운 샘플의 더 높은 SNR 이미징을 가능하게 한다. 고정된 노출 시간 동안, 항산화제를 포함하는 것은 광에 노출되는 동안 비-표백된 형광단의 농도를 증가시킴으로써 SNR을 증가시킨다. 항산화제를 포함하는 것은 또한 (광표백 전 제한된 형광단 수명에 의해 야기되는) 더 긴 노출 시간의 수익 체감(diminishing return)을 제거하여, 증가된 노출 시간을 허용함으로써 증가된 SNR을 제공한다.
예시적인 시퀀싱 사이클은 선택적으로 제1 신호 첨가로 진행하기 전에 간단한 샘플 세척으로 시작된다. 특정 라운드에 대해 순차적 또는 조합적 인코딩이 사용되는지 여부에 따라, 상응하는 세트의 리드 올리고뉴클레오타이드, 형광 표지된 디코딩 프로브, 및 이들의 라운드-특이적 경쟁자가 첨가되고 라이게이션된다. 조합 인코딩에서, 주어진 포지션 x에 대한 리드 올리고뉴클레오타이드가 첨가되고, 추가로 형광 표지된 디염기-인코딩 올리고뉴클레오타이드의 세트, 및 표지된 이전 포지션에 대한 경쟁자 올리고뉴클레오타이드가 첨가된다(이 경우 표지의 첫 번째 라운드가 아닌 경우, 경쟁자 올리고뉴클레오타이드는 생략됨). 순차적 인코딩에서, 제1 라운드의 표지화인 경우를 제외하고, 주어진 라운드 x에 대한 리드 올리고뉴클레오타이드, 4-채널 형광단 혼합물, 및 라운드 x-1 경쟁자 올리고뉴클레오타이드가 첨가된다. 시퀀싱 라이게이션 혼합물에서 PEG의 존재는 표적에 대한 신호 첨가를 실질적으로 가속화시킨다. 이미징 완충제에서 샘플을 인큐베이션한 후, 샘플은 이미징되고, 다음 시퀀싱 사이클을 진행하기 전에 간단히 세정된다.
또한, 프로브로부터의 형광단 절단 또는 프로브 스트리핑은 다중 시퀀싱 사이클이 사용될 때 한 라운드에서 다음 라운드로의 신호 이월을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광단은 포름아미드로 제거될 수 있다. 대안적으로, 형광단과 올리고뉴클레오타이드 프로브 사이에 다이설파이드 연결을 갖는 티올-연결된 염료가 사용될 수 있으며, 이는 환원 환경에서 올리고뉴클레오타이드 프로브로부터 형광단의 절단을 가능하게 한다. 다이설파이드 결합을 절단하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 다이설파이드 환원제는 비제한적으로, 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 다이티오트레이톨(DTT), 및 β-머캅토에탄올(BME)을 포함한다. 시퀀싱 라운드 동안 형광 이미징 후, 스트리핑제 및/또는 환원제가 첨가되고, 후속 세척 단계는 다른 라운드의 시퀀싱을 수행하기 전에 확산성 형광 신호를 제거한다.
본 명세서에 개시된 방법은 또한 후보 제제가 온전한 조직에서 표적 핵산의 유전자 서열을 결정하기 위해 본 명세서에 기재된 방법을 수행하고 표적 핵산의 유전자 발현 수준을 검출함으로써 온전한 조직의 세포에서 핵산의 유전자 발현을 조절하는 지를 결정하기 위해 후보 제제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 여기서, 후보 제제의 부재 하에 표적 핵산의 발현 수준에 비해 후보 제제의 존재 하에 표적 핵산의 발현 수준의 변경이 후보 제제가 온전한 조직의 세포에서 핵산의 유전자 발현을 조절함을 나타낸다.
특정 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 기존의 유전자 발현 분석 툴과 비교하여 더 빠른 처리 시간, 더 높은 다중성, 더 높은 효율, 더 높은 민감성, 더 낮은 오류율, 및 더 공간적으로 분해된 세포 유형을 제공한다. 방법은 오류 감소를 갖는 인시투 시퀀싱을 위한 개선된 라이게이션에 의한 시퀀싱 기술(SCAL 및 SEDAL2)을 제공한다. 일부 다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 단일-세포 및/또는 단일-분자 민감성을 갖는 생물의학 연구 및 임상 진단(예를 들어, 암, 박테리아 감염, 바이러스 감염 등)을 위한 공간적 시퀀싱(예를 들어, 시약, 칩 또는 서비스)을 포함한다.
분자내 라이게이션을 통한 핵산의 특이적 증폭(SNAIL)
분자내 라이게이션을 통한 핵산의 특이적 증폭을 위해 인시투로 세포 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 생성하기 위한 효율적인 접근법이 이용될 수 있으며, 이는 본 명세서에서 SNAIL로 지칭된다. 특정 실시형태에서, 방법은 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에 고정되고 투과된 온전한 조직을 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 프라이머 쌍은 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
보다 일반적으로, 조직에서 관심 세포에 존재하는 핵산은 본 명세서에서 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드로 지칭되는 한 쌍의 프라이머를 포함하는 복합체의 어셈블리를 위한 스캐폴드로서 작용한다. 일부 실시형태에서, 고정되고 투과된 온전한 조직을 접촉시키는 것은 프라이머 쌍을 동일한 표적 핵산에 혼성화시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 RNA이다. 이러한 실시형태에서, 표적 핵산은 mRNA일 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적 핵산은 DNA이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화하다" 및 "혼성화"는 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 통해 복합체를 형성하기에 충분히 상보적인 뉴클레오타이드 서열 사이의 복합체의 형성을 지칭한다. 프라이머가 표적(주형)과 "혼성화"하는 경우, 이러한 복합체(또는 하이브리드)는, 예를 들어, DNA 합성을 개시하기 위해 DNA 폴리머라제에 의해 요구되는 프라이밍 기능을 제공하기에 충분히 안정하다. 혼성화 서열은 안정한 하이브리드를 제공하기 위해 완전한 상보성을 가질 필요는 없음이 이해될 것이다. 많은 상황에서, 4개 이상의 뉴클레오타이드의 루프를 무시하고, 약 10% 미만의 염기가 미스매치인 안정한 하이브리드가 형성될 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적"은 일반적으로 약 90% 이상의 상동성이 존재하는 검정 조건 하에 이의 "보체"와 안정한 이중체를 형성하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
SNAIL 올리고뉴클레오타이드 프라이머
대상 방법에서, SNAIL 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 적어도 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하고; 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드 각각은 제1 상보성 영역, 제2 상보성 영역, 및 제3 상보성 영역을 포함하고; 제2 올리고뉴클레오타이드가 바코드 서열을 추가로 포함하고; 제1 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 표적 핵산의 제1 부분에 상보적이고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역에 상보적이고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역에 상보적이고, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 표적 핵산의 제2 부분에 상보적이고, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역에 인접한다. 대안적인 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드는 폐쇄된 원형 분자이고, 라이게이션 단계가 생략된다.
본 개시내용은 고정되고 투과된 조직을 접촉시키는 것이 상이한 표적 핵산에 대해 특이성을 갖는 복수의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 혼성화시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 5개 이상의 제1 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상의 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 15개 이상, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 및 최대 80개의 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 15개 이상의 제1 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 및 최대 80개의 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 5개 이상의 제2 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상의 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 15개 이상, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 및 최대 80개의 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 15개 이상의 제2 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 및 최대 80개의 상이한 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 복수의 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 복수의 올리고뉴클레오타이드 쌍이 반응에 사용될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 쌍은 각각의 표적 핵산에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 민감성을 개선하고 가변성을 감소시키기 위해 2개의 프라이머 쌍이 하나의 표적 핵산에 사용될 수 있다. 세포에서 복수의 상이한 표적 핵산을 검출하는 것, 예를 들어, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 12, 최대 15, 최대 18, 최대 20, 최대 25, 최대 30, 최대 40 또는 그 초과의 별개의 표적 핵산을 검출하는 것이 또한 고려된다. 프라이머는 통상적으로 사용 전에, 통상적으로 적어도 약 50℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 70℃, 적어도 약 80℃, 및 최대 약 99℃, 최대 약 95℃, 최대 약 90℃의 온도로 가열함으로써 변성된다.
일부 실시형태에서, 프라이머는 샘플과 접촉하기 전에 가열함으로써 변성된다. 특정 양태에서, 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도(Tm)는 용액에서 라이게이션을 최소화하도록 선택된다. 핵산의 "용융 온도" 또는 "Tm"은 예를 들어, 산에 의한 염기쌍 사이의 수소 결합의 다른 해리 또는 가열로 인해, 또는 알칼리 처리 등에 의해 핵산의 나선 구조의 절반이 손실되는 온도로서 정의된다. 핵산 분자의 Tm은 이의 길이 및 염기 조성에 의존한다. GC 염기쌍이 풍부한 핵산 분자는 풍부한 AT 염기쌍을 갖는 것보다 더 높은 Tm을 갖는다. 핵산의 분리된 상보적 가닥은 온도가 Tm 미만으로 낮아질 때 자발적으로 재결합하거나 어닐링되어 이중체 핵산을 형성한다. 가장 높은 핵산 혼성화 속도는 Tm에서 대략 25℃ 낮은 온도에서 발생한다. Tm은 하기 관계를 이용하여 추정될 수 있다: Tm = 69.3 + 0.41(GC)%(Marmur et al. (1962) J. Mol. Biol. 5:109-118).
특정 실시형태에서, 복수의 제2 올리고뉴클레오타이드는 패드록 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 측정 및 정량화될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함한다. 용어 "표지" 및 "검출 가능한 표지"는 방사성 동위원소, 형광체, 화학발광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 발색단, 염료, 금속 이온, 금속 졸, 리간드(예를 들어, 비오틴 또는 합텐) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 검출 가능한 분자를 지칭한다. 용어 "형광체"는 검출 가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 이의 일부를 지칭한다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 표지의 특정 예는 피코에리트린, 알렉사 염료, 플루오레세인, YPet, CyPet, 캐스케이드 블루, 알로피코시아닌, Cy3, Cy5, Cy7, 로다민, 단실, 움벨리페론, 텍사스 레드, 루미놀, 아크라디뭄 에스터, 비오틴, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 황색 형광 단백질(EYFP), 청색 형광 단백질(BFP), 적색 형광 단백질(RFP), 반딧불이 루시페라제, 레닐라 루시페라제, NADPH, 베타-갈락토시다제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 및 우레아제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산, 또는 표적 부위의 상이한 영역에 결합한다. 한 쌍에서, 각각의 표적 부위는 상이하고, 표적 부위는 표적 핵산 상의 인접 부위, 예를 들어, 일반적으로 15개 이하의 뉴클레오타이드만큼 떨어져 있고, 예를 들어, 다른 부위로부터 10, 8, 6, 4, 또는 2개 이하의 뉴클레오타이드로부터 떨어져 있고, 인접 부위일 수 있다. 표적 부위는 통상적으로 동일한 배향으로 표적 핵산의 동일한 가닥에 존재한다. 표적 부위는 또한 세포에 존재하는 다른 핵산에 비해 독특한 결합 부위를 제공하도록 선택된다. 각각의 표적 부위는 일반적으로 길이가 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 약 19 내지 23개의 뉴클레오타이드, 약 19 내지 21개의 뉴클레오타이드, 또는 약 19 내지 20개의 뉴클레오타이드이다. 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드의 쌍은 쌍의 각각의 올리고뉴클레오타이드가 이의 동족 표적 부위에 결합하기 위해 유사한 용융 온도를 갖도록 선택되며, 예를 들어, Tm은 약 50℃, 약 52℃, 약 55℃, 약 58℃, 약 62℃, 약 65℃, 약 70℃, 또는 약 72℃일 수 있다. 표적 부위의 GC 함량은 일반적으로 약 20% 이하, 약 30% 이하, 약 40% 이하, 약 50% 이하, 약 60% 이하, 약 70% 이하이도록 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드는 제1, 제2, 및 제3 상보성 영역을 포함한다. 제1 올리고뉴클레오타이드의 표적 부위는 제1 상보성 영역을 지칭할 수 있다. 상기 요약된 바와 같이, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 19 내지 25개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 특정 양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은, 예를 들어, 4 내지 8개의 뉴클레오타이드 또는 4 내지 7개의 뉴클레오타이드를 포함하는 3 내지 10개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 6개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은 마찬가지로 6개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 이러한 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은, 예를 들어, 4 내지 8개의 뉴클레오타이드 또는 4 내지 7개의 뉴클레오타이드를 포함하는 3 내지 10개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 제2 제1 올리고뉴클레오타이드는 제1, 제2, 및 제3 상보성 영역을 포함한다. 제2 올리고뉴클레오타이드의 표적 부위는 제2 상보성 영역을 지칭할 수 있다. 상기 요약된 바와 같이, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제2 상보성 영역은 19 내지 25개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 특정 양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은, 예를 들어, 4 내지 8개의 뉴클레오타이드 또는 4 내지 7개의 뉴클레오타이드를 포함하는 3 내지 10개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 6개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은 마찬가지로 6개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 이러한 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은, 예를 들어, 4 내지 8개의 뉴클레오타이드 또는 4 내지 7개의 뉴클레오타이드를 포함하는 3 내지 10개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 추가 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드의 제1 상보성 영역은 제2 올리고뉴클레오타이드의 제3 상보성 영역에 인접한다.
일부 양태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드는 바코드 서열을 포함하고, 여기서 제2 올리고뉴클레오타이드의 바코드 서열은 표적 핵산의 확인을 위한 바코딩 정보를 제공한다. 용어 "바코드"는 단일 세포 또는 세포의 하위집단을 확인하는 데 사용되는 핵산 서열을 지칭한다. 바코드 서열은 증폭 동안 관심 표적 핵산에 연결될 수 있고, 표적 핵산이 유래된 세포로 앰플리콘을 역추적하는 데 사용될 수 있다. 바코드 서열은 바코드 서열을 포함하는 영역 및 표적 핵산에 상보적인 영역을 함유하는 올리고뉴클레오타이드로 증폭을 수행함으로써 증폭 동안 관심 표적 핵산에 첨가될 수 있으며, 이에 따라, 바코드 서열은 최종 증폭된 표적 핵산 생성물(즉, 앰플리콘) 내에 통합된다.
조직
본 명세서에 기재된 바와 같이, 개시된 방법은 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에 고정되고 투과된 온전한 조직을 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 적어도 접촉시킴으로써 온전한 조직의 인시투 시퀀싱 기술을 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기에 적합한 조직 표본은 일반적으로, 예를 들어, 생검 표본 및 부검 표본과 같은 살아있는 또는 죽은 대상체로부터 수집된 임의의 유형의 조직 표본을 포함하며, 이는 비제한적으로, 상피, 근육, 결합 및 신경 조직을 포함한다. 조직 표본은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 수집 및 처리될 수 있고, 처리 직후에 현미경 분석을 거칠 수 있거나, 보존되고 예를 들어, 연장된 기간 동안 저장 후 향후 시간에 현미경 분석을 거칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 향후 분석을 위해 조직 표본을 안정하고 액세스 가능하고 완전히 온전한 형태로 보존하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 이전에 보존되거나 저장된 조직 표본을 분석하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 온전한 조직은 시각 피질 슬라이스와 같은 뇌 조직을 포함한다. 일부 실시형태에서, 온전한 조직은, 비제한적으로, 예를 들어, 5 내지 18㎛, 5 내지 15㎛, 또는 5 내지 10㎛를 포함하는 5 내지 20㎛의 두께를 갖는 얇은 슬라이스이다. 다른 실시형태에서, 온전한 조직은, 비제한적으로, 예를 들어, 20 내지 150㎛, 50 내지 100㎛, 또는 50 내지 80㎛를 포함하는 20 내지 200㎛의 두께를 갖는 두꺼운 슬라이스이다.
본 발명의 양태는 온전한 조직을 고정시키는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "고정하는" 또는 "고정"은 생물학적 물질(예를 들어, 조직, 세포, 소기관, 분자 등)을 붕괴 및/또는 분해로부터 보존하는 공정이다. 고정은 임의의 편리한 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있다. 고정은 샘플을 고정 시약(즉, 적어도 하나의 고정제를 함유하는 시약)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 샘플은 온도, 샘플의 성질, 및 고정제(들)에 따를 수 있는 광범위한 시간 동안 고정 시약에 의해 접촉될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 24시간 이하, 18시간 이하, 12시간 이하, 8시간 이하, 6시간 이하, 4시간 이하, 2시간 이하, 60분 이하, 45분 이하, 30분 이하, 25분 이하, 20분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 5분 이하, 또는 2분 이하 동안 고정 시약에 의해 접촉될 수 있다.
샘플은 5분 내지 24시간, 예를 들어, 10분 내지 20시간, 10분 내지 18시간, 10분 내지 12시간, 10분 내지 8시간, 10분 내지 6시간, 10분 내지 4시간, 10분 내지 2시간, 15분 내지 20시간, 15분 내지 18시간, 15분 내지 12시간, 15분 내지 8시간, 15분 내지 6시간, 15분 내지 4시간, 15분 내지 2시간, 15분 내지 1.5시간, 15분 내지 1시간, 10분 내지 30분, 15분 내지 30분, 30분 내지 2시간, 45분 내지 1.5시간, 또는 55분 내지 70분 범위의 기간 동안 고정 시약에 의해 접촉될 수 있다.
샘플은 프로토콜 및 사용된 시약에 따라 다양한 온도에서 고정 시약에 의해 접촉될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 샘플은 -22℃ 내지 55℃ 범위의 온도에서 고정 시약에 의해 접촉될 수 있고, 여기서 특정 관심 범위는 50 내지 54℃, 40 내지 44℃, 35 내지 39℃, 28 내지 32℃, 20 내지 26℃, 0 내지 6℃, 및 -18 내지 -22℃를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 예에서, 샘플은 -20℃, 4℃, 실온(22 내지 25℃), 30℃, 37℃, 42℃, 또는 52℃의 온도에서 고정 시약에 의해 접촉될 수 있다.
임의의 편리한 고정 시약이 사용될 수 있다. 일반적인 고정 시약은 가교 고정제, 침전 고정제, 산화 고정제, 수은 등을 포함한다. 가교 고정제는 공유 결합에 의해 2개 이상의 분자를 화학적으로 연결하고, 광범위한 가교제가 사용될 수 있다. 적합한 가교 고정제의 예는 알데하이드(예를 들어, 포름알데하이드, 일반적으로 "파라포름알데하이드" 및 "포르말린"으로도 지칭됨; 글루타르알데하이드 등), 이미도에스터, NHS(N-하이드록시숙신이미드) 에스터, 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 적합한 침전 고정제의 예는 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올 등), 아세톤, 아세트산 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 고정제는 포름알데하이드(즉, 파라포름알데하이드 또는 포르말린)이다. 고정 시약에서 포름알데하이드의 적합한 최종 농도는 10분 동안 약 1.6%를 포함하여 0.1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 4%, 1 내지 2%, 3 내지 5%, 또는 3.5 내지 4.5%이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 4% 포름알데하이드의 최종 농도(보다 농축된 스톡 용액으로부터 희석된 바와 같이, 예를 들어, 38%, 37%, 36%, 20%, 18%, 16%, 14%, 10%, 8%, 6% 등)로 고정된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 10% 포름알데하이드의 최종 농도로 고정된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 1% 포름알데하이드의 최종 농도로 고정된다. 일부 실시형태에서, 고정제는 글루타르알데하이드이다. 고정 시약에서 글루타르알데하이드의 적합한 농도는 0.1 내지 1%이다. 고정 시약은 임의의 조합으로 하나 초과의 고정제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 샘플은 포름알데하이드 및 글루타르알데하이드 둘 모두를 함유하는 고정 시약과 접촉된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투과성" 또는 "투과하다"는 샘플의 세포(세포막 등)를 핵산 프로브, 항체, 화학적 기질 등과 같은 실험 시약에 투과성으로 만드는 공정을 지칭한다. 임의의 편리한 방법 및 /또는 투과화를 위한 시약이 사용될 수 있다. 적합한 투과화 시약은 세제(예를 들어, 사포닌, Triton X-100, Tween-20 등), 유기 고정제(예를 들어, 아세톤, 메탄올, 에탄올 등), 효소 등을 포함한다. 세제는 소정 범위의 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 0.001% 내지 1% 세제, 0.05% 내지 0.5% 세제, 또는 0.1% 내지 0.3% 세제가 투과화에 사용될 수 있다(예를 들어, 0.1% 사포닌(Saponin), 0.2% tween-20, 0.1 내지 0.3% triton X-100, 등). 일부 실시형태에서, 적어도 10분 동안 얼음 상의 메탄올이 투과화에 사용된다.
일부 실시형태에서, 동일한 용액이 고정 시약 및 투과화 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고정 시약은 0.1% 내지 10% 포름알데히드 및 0.001% 내지 1% 사포닌을 함유한다. 일부 실시형태에서, 고정 시약은 1% 포름알데하이드 및 0.3% 사포닌을 함유한다.
샘플은 온도, 샘플의 특성, 및 투과화 시약(들)에 따라 달라질 수 있는 광범위한 시간 동안 투과화 시약에 의해 접촉될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 24시간 이상, 24시간 이하, 18시간 이하, 12시간 이하, 8시간 이하, 6시간 이하, 4시간 이하, 2시간 이하, 60분 이하, 45분 이하, 30분 이하, 25분 이하, 20분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 5분 이하, 또는 2분 이하 동안 투과화 시약에 의해 접촉될 수 있다. 샘플은 프로토콜 및 사용된 시약에 따라 다양한 온도에서 투과화 시약에 의해 접촉될 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, 샘플은 -82℃ 내지 55℃ 범위의 온도에서 투과화 시약에 의해 접촉될 수 있고, 여기서 특정 관심 범위는 50 내지 54℃, 40 내지 44℃, 35 내지 39℃, 28 내지 32℃, 20 내지 26℃, 0 내지 6℃, -18 내지 -22℃, 및 -78 내지 -82℃를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 예에서, 샘플은 -80℃, -20℃, 4℃, 실온(22 내지 25℃), 30℃, 37℃, 42℃ 또는 52℃의 온도에서 투과화 시약에 의해 접촉될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 효소 투과화 시약과 접촉된다. 효소 투과화 시약은 검정 시약에 의한 샘플의 투과를 방해하는 세포외 매트릭스 또는 표면 단백질을 부분적으로 분해함으로써 샘플을 투과시킨다. 효소 투과화 시약과의 접촉은 고정 후 및 표적 검출 전 임의의 시점에 일어날 수 있다. 일부 경우에, 효소 투과화 시약은 상업적으로 이용 가능한 효소인 프로테이나제 K이다. 이러한 경우에, 샘플은 고정후 시약과 접촉하기 전에 프로테이나제 K와 접촉된다. 프로테이나제 K 처리(즉, 프로테이나제 K에 의한 접촉; 또한 통상적으로 "프로테이나제 K 분해"로도 지칭됨)는 조사 중인 각 세포 유형 또는 조직 유형에 대해 경험적으로 결정되는 효소 농도의 범위에 걸쳐 일정 범위의 시간에 걸쳐 수행될 수 있다. 또는 조사 중인 조직 유형. 예를 들어, 샘플은 30분 이하, 25분 이하, 20분 이하, 15분 이하, 10분 이하, 5분 이하, 또는 2분 이하 동안 프로테이나제 K에 의해 접촉될 수 있다. 샘플은 1 ㎍/ml 이하, 2 ㎍/ml 이하, 4 ㎍/ml 이하, 8 ㎍/ml 이하, 10 ㎍/ml 이하, 20 ㎍/ml 이하, 30 ㎍/ml 이하, 50 ㎍/ml 이하, 또는 100 ㎍/ml 이하의 프로테이나제 K와 접촉될 수 있다. 샘플은 2℃ 내지 55℃ 범위의 온도에서 프로테이나제 K에 의해 접촉될 수 있으며, 여기서 특정 관심 범위는 50 내지 54℃, 40 내지 44℃, 35 내지 39℃, 28 내지 32℃, 20 내지 26℃, 및 0 내지 6℃를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 예에서, 샘플은 4℃, 실온(22 내지 25℃), 30℃, 37℃, 42℃, 또는 52℃의 온도에서 프로테이나제 K에 의해 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 효소 투과화 시약과 접촉되지 않는다. 일부 실시형태에서, 샘플은 프로테이나제 K와 접촉되지 않는다. 적어도 고정 시약 및 투과화 시약과 온전한 조직의 접촉은 고정되고 투과된 조직의 생산을 초래한다.
리가제
일부 실시형태에서, 개시된 방법은 리가제를 첨가하여 제2 올리고뉴클레오타이드를 라이게이션하고 폐쇄형 핵산 사이클을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리가제를 첨가하는 것은 DNA 리가제를 첨가하는 것을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드는 폐쇄형 핵산 사이클로서 제공되고, 리가제를 첨가하는 단계는 생략된다. 특정 실시형태에서, 리가제는 표적 핵산 분자의 시퀀싱을 용이하게 하는 효소이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리가제"는 폴리뉴클레오타이드를 함께 연결하거나 단일 폴리뉴클레오타이드의 말단을 연결하는 데 통상적으로 사용되는 효소를 지칭한다. 리가제는 ATP-의존성 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 리가제, NAD-i-의존성 이중-가닥 DNA 또는 RNA 리가제 및 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 리가제, 예를 들어, EC 6.5.1.1(ATP-의존성 리가제), EC 6.5.1.2(NAD+-의존성 리가제), EC 6.5.1.3(RNA 리가제)에 기재된 임의의 리가제를 포함한다. 리가제의 특정 예는 박테리아 리가제, 예컨대, E. 콜라이 DNA 리가제 및 Taq DNA 리가제, Ampligase® 열안정성 DNA 리가제(Epicentre®Technologies Corp., lllumina®의 파트(part), 위스콘신 매디슨 소재) 및 파지 리가제, 예컨대, T3 DNA 리가제, T4 DNA 리가제 및 T7 DNA 리가제 및 이들의 돌연변이체를 포함한다.
롤링 사이클 증폭
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 핵산 분자의 존재 하에 롤링 사이클 증폭을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 수행하는 단계는 제2 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 사용하고 제1 올리고뉴클레오타이드를 폴리머라제를 위한 프라이머로서 사용하여 하나 이상의 앰플리콘을 형성하는 것을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 단일-가닥, 원형 폴리뉴클레오타이드 주형은 제2 뉴클레오타이드의 라이게이션에 의해 형성되며, 이 원형 폴리뉴클레오타이드는 제1 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 영역을 포함한다. 적절한 dNTP 전구체 및 다른 보조인자의 존재 하에 DNA 폴리머라제의 첨가 시에, 제1 올리고뉴클레오타이드는 주형의 다중 카피의 복제에 의해 신장된다. 이러한 증폭 생성물은 검출 프로브에 결합함으로써 용이하게 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머라제는 롤링 사이클 증폭을 수행하기 전에 폴리머라제가 샘플을 균일하게 침투하도록 하기 위해 dNTP 없이 사전 인큐베이션된다.
일부 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드가 동일한 표적 핵산 분자에 혼성화하는 경우에만, 제2 올리고뉴클레오타이드는 원형화되고 롤링-사이클 증폭되어 cDNA의 다중 카피를 함유하는 cDNA 나노볼(즉, 앰플리콘)을 생성할 수 있다. 용어 "앰플리콘"은 PCR 반응 또는 다른 핵산 증폭 과정의 증폭된 핵산 생성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 아민-변형된 뉴클레오타이드는 롤링 사이클 증폭 반응에 스파이킹된다.
롤링 사이클 증폭을 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Baner et al, Nucleic Acids Research, 26:5073-5078, 1998; Lizardi et al, Nature Genetics 19:226, 1998; Schweitzer et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:101 13-119, 2000; Faruqi et al, BMC Genomics 2:4, 2000; Nallur et al, Nucl. Acids Res. 29:el 18, 2001 ; Dean et al. Genome Res. 11:1095-1099, 2001; Schweitzer et al, Nature Biotech. 20:359-365, 2002; 미국 특허 제6,054,274호, 제6,291,187호, 제6,323,009호, 제6,344,329호 및 제6,368,801호] 참조). 일부 실시형태에서, 폴리머라제는 phi29 DNA 폴리머라제이다.
특정 양태에서, 핵산 분자는 아민-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 아민-변형된 뉴클레오타이드는 아크릴산 N-하이드록시숙신이미드 모이어티 변형을 포함한다. 다른 아민-변형된 뉴클레오타이드의 예는 5-아미노알릴-dUTP 모이어티 변형, 5-프로파르길아미노-dCTP 모이어티 변형, N6-6-아미노헥실-dATP 모이어티 변형, 또는 7-데아자-7-프로파르길아미노-dATP 모이어티 변형을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
조직-하이드로겔 환경에서 앰플리콘 포매
일부 실시형태에서, 개시된 방법은 하이드로겔 서브유닛의 존재 하에 하나 이상의 앰플리콘을 포매하여 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 형성하는 단계를 포함한다. 개시된 하이드로겔-조직 화학은 조직 제거, 효소 확산, 및 다중-사이클 시퀀싱을 위해 인시투 합성된 하이드로겔에 핵산을 공유 부착하는 것을 포함하는 반면, 기존의 하이드로겔-조직 화학 방법은 할 수 없다. 일부 실시형태에서, 조직-하이드로겔 환경에서 앰플리콘 포매를 가능하게 하기 위해, 아민-변형된 뉴클레오타이드는 롤링 사이클 증폭 반응에 스파이킹되고, 아크릴산 N-하이드록시숙신이미드 에스터를 사용하여 아크릴아미드 모이어티로 작용성화되고, 아크릴아미드 모노머와 공중합되어 하이드로겔을 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하이드로겔" 또는 "하이드로겔 네트워크"는 때때로 물이 분산 매질인 콜로이드 겔로서 발견되는 수불용성인 폴리머 사슬의 네트워크를 의미한다. 다시 말해서, 하이드로겔은 용해 없이 많은 양의 물을 흡수할 수 있는 폴리머 물질의 부류이다. 하이드로겔은 99% 초과의 물을 함유할 수 있고, 천연 또는 합성 폴리머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 하이드로겔은 또한 이들의 상당한 수분 함량으로 인해 천연 조직과 매우 유사한 정도의 유연성을 갖는다. 적합한 하이드로겔의 상세한 설명은 본 명세서에 참조로서 구체적으로 포함되는 공개된 미국 특허 제20100055733호에서 확인될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "하이드로겔 서브유닛" 또는 "하이드로겔 전구체"는 3차원(3D) 하이드로겔 네트워크를 형성하기 위해 가교되거나 "중합"될 수 있는 친수성 모노머, 프리폴리머, 또는 폴리머를 의미한다. 임의의 과학적 이론에 구속됨이 없이, 하이드로겔 서브유닛의 존재 하에 생물학적 표본의 이러한 고정은 표본의 컴포넌트를 하이드로겔 서브유닛에 가교시켜, 분자 컴포넌트를 적소에 고정시키고, 조직 구조 및 세포 모폴로지를 보존하는 것으로 여겨진다.
일부 실시형태에서, 포매는 하나 이상의 앰플리콘을 아크릴아미드와 공중합시키는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코폴리머"는 하나 초과의 유형의 서브유닛을 함유하는 폴리머를 기재한다. 상기 용어는 2, 3, 4, 5, 또는 6개 유형의 서브유닛을 포함하는 폴리머를 포함한다.
특정 양태에서, 포매는 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 제거하는 것을 포함하며, 여기서 표적 핵산은 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘에 실질적으로 보유된다. 이러한 실시형태에서, 제거는 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘으로부터 복수의 세포 컴포넌트를 실질적으로 제거하는 것을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 제거는 하나 이상의 하이드로겔-포매된 앰플리콘으로부터 지질 및/또는 단백질을 실질적으로 제거하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 제거 전 샘플에 존재하는 원래 양이 대략 70% 이상, 예컨대, 75% 이상, 예컨대, 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 예컨대, 90% 이상, 예컨대, 95% 이상, 예컨대, 99% 이상, 예컨대, 100%만큼 감소되었음을 의미한다.
일부 실시형태에서, 하이드로겔-포매된 앰플리콘을 제거하는 것은 표본에 대해 전기영동을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 앰플리콘은 이온성 계면활성제를 포함하는 완충제 용액을 사용하여 전기영동된다. 일부 실시형태에서, 이온성 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(SDS)이다. 일부 실시형태에서, 표본은 약 10 내지 약 60 볼트 범위의 전압을 사용하여 전기영동된다. 일부 실시형태에서, 표본은 약 15분 내지 약 10일 범위의 기간 동안 전기영동된다. 일부 실시형태에서, 방법은 투명화된 조직의 굴절률과 일치하는 굴절률을 갖는 마운팅 배지에서 투명화된 표본을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 마운팅 배지는 표본의 광학적 투명도를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 마운팅 배지는 글리세롤을 포함한다.
세포
본 명세서에 개시된 방법은 온전한 조직의 세포에서 표적 핵산의 인시투 유전자 시퀀싱을 위한 방법을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 세포의 집단에 존재한다. 특정 다른 실시형태에서, 세포의 집단은 흥분성 뉴런, 억제성 뉴런, 및 비-뉴런 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 복수의 세포 유형을 포함한다. 본 발명의 검정에 사용하기 위한 세포는 유기체, 유기체로부터 유래된 단일 세포 유형일 수 있거나, 세포 유형의 혼합물일 수 있다. 자연 발생 세포 및 세포 집단, 유전자 조작된 세포주, 트랜스제닉 동물로부터 유래된 세포 등이 포함된다. 거의 모든 세포 유형 및 크기가 수용될 수 있다. 적합한 세포는 박테리아, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 자연 발생 조직, 예를 들어, 혈액, 간, 췌장, 신경 조직, 골수, 피부 등과 같은 복합 세포 집단이다. 일부 조직은 단분산 현탁액으로 파괴될 수 있다. 대안적으로, 세포는 배양된 집단, 예를 들어, 복합체 집단으로부터 유래된 배양물, 세포가 다중 계통으로 분화된 단일 세포 유형으로부터 유래된 배양물, 또는 세포가 자극에 차별적으로 반응하는 배양물 등일 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 세포 유형은 줄기 및 전구 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 능선 세포 등, 내피 세포, 근육 세포, 심근, 평활근 및 골격근 세포, 중간엽 세포, 상피 세포; 조혈 세포, 예컨대, T-세포를 포함하는 림프구, 예컨대, Th1 T 세포, Th2 T 세포, ThO T 세포, 세포독성 T 세포; B 세포, 프리-B 세포 등; 단핵구; 수지상 세포; 호중구; 및 대식세포; 자연 살해 세포; 비만 세포 등; 지방세포, 특정 기관, 예컨대, 흉선, 내분비선, 췌장, 뇌와 관련된 세포, 예컨대, 뉴런, 아교세포, 성상세포, 수지상세포 등 및 이들의 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 조혈 세포는 염증 과정, 자가면역 질환 등과 관련될 수 있고, 내피 세포, 평활근 세포, 심근 세포 등은 심혈관 질환과 관련될 수 있고; 거의 모든 유형의 세포는 육종, 암종 및 림프종과 같은 신생물; 간 세포에 의한 간 질환; 신장 세포에 의한 신장 질환; 등과 관련될 수 있다.
세포는 또한 상이한 유형의 형질전환 또는 신생물성 세포, 예를 들어 상이한 세포 기원의 암종, 상이한 세포 유형의 림프종 등일 수 있다. 미국 표준 균주 은행(American Type Culture Collection, 버지니아 머내서스 소재)은 150개 이상의 상이한 종으로부터 4,000개 이상의 세포주를 수집하고 입수 가능하게 만들며, 950개의 암 세포주는 700개의 인간 암 세포주를 포함한다. 국립 암 연구소(National Cancer Institute)는 인간 종양 세포주의 큰 패널로부터 임상, 생화학적 및 분자 데이터를 컴파일링하였고, 이들은 ATCC 또는 NCI로부터 입수 가능하다(Phelps et al. (1996) Journal of Cellular Biochemistry Supplement 24:32-91). 자발적으로 유래되거나 개별 세포주로부터 요망되는 성장 또는 반응 특성을 위해 선택된 상이한 세포주가 포함되고; 유사한 종양 유형으로부터 유래하지만 별개의 환자 또는 부위로부터 유래된 다수의 세포주를 포함할 수 있다.
세포는 비-부착성일 수 있고, 예를 들어, 단핵구, T 세포, B-세포를 포함하는 혈액 세포; 종양 세포 등, 또는 부착성 세포, 예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포 등을 포함한다. 부착성 세포를 프로파일링하기 위해, 이들은 부착된 기질로부터, 및 다른 세포로부터, 프로브 분자를 인식하고 이에 결합하는 능력을 유지하는 방식으로 분해될 수 있다.
이러한 세포는 다양한 조직, 예를 들어, 혈액, 골수, 고형 조직(예를 들어, 고형 종양), 복수로부터, 예를 들어, 인출, 세척, 세척, 외과적 절개 등을 사용하여 당 분야에 공지된 다양한 기술에 의해 개체로부터 획득될 수 있다. 세포는 고정 또는 비고정, 신선 또는 냉동, 전체 또는 분해된 샘플로부터 수득될 수 있다. 조직의 분해는 공지된 기술을 사용하여 기계적으로 또는 효소적으로 발생할 수 있다.
본 개시내용의 비제한적인 양태의 예
상기 기재된 본 주제의 실시형태를 포함하는 양태는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양태 또는 실시형태와 조합하여 유리할 수 있다. 전술한 설명을 제한함이 없이, 1 내지 34로 번호가 매겨진 본 개시내용의 특정 비제한적인 양태가 하기에 제공된다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 개별적으로 번호가 매겨진 각각의 양태는 이전 또는 하기 개별적으로 번호가 매겨진 양태들 중 임의의 것과 함께 사용되거나 조합될 수 있다. 이는 이러한 모든 양태의 조합에 대한 지원을 제공하기 위한 것이고, 하기에 명시적으로 제공된 양태의 조합으로 제한되지 않는다:
1. 디바이스로서,
(a) 조명 및 검출 모듈로서, 플랫 조명 보정부를 구비하는 조명하기 위한 복수의 레이저 라인을 포함하는 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트로서, 상기 복수의 레이저 라인은 하나 이상의 파장의 여기 광으로 샘플을 조명하는 데 사용되는, 상기 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트, 대역통과 방출 필터, 롱-패스 이미지 스플리터, 제1 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제1 카메라 및 제2 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제2 카메라를 포함하되, 상기 제1 카메라 및 제2 카메라는 방출을 동시에 검출할 수 있는, 상기 조명 및 검출 모듈;
(b) 현미경 모듈로서, x, y, 및 z 축을 따라 다축 포지셔닝이 가능한 전동식 스테이지, 대물렌즈 Z 드라이브, 다수의 대물렌즈를 포함하는 대물렌즈 터릿 휠로서, 각각의 대물렌즈는 상이한 배율을 제공하고, 하나 이상의 대물렌즈가 침지 대물렌즈이고, 각각의 침지 대물렌즈는 대물렌즈 침지 칼라를 갖는, 상기 대물렌즈 터릿 휠, 및 상기 대물렌즈로부터 상기 조명 및 검출 모듈로 광을 라우팅하는 광학계를 포함하는, 상기 현미경 모듈;
(c) 자동화 침지 매질 모듈로서, i) 침지 매질을 포함하는 용기, ii) 상기 용기에 그리고 상기 현미경 모듈의 상기 침지 대물렌즈의 상기 대물렌즈 침지 칼라에 커플링된 유체 라인으로서, 상기 유체 라인은 상기 현미경 모듈의 상기 침지 대물렌즈의 상기 대물렌즈 침지 칼라로 또는 상기 대물렌즈 침지 칼라로부터 침지 매질을 운반하고, 상기 침지 칼라는 과잉 침지 매질을 포획하는, 상기 유체 라인 및 iii) 상기 유체 라인에 그리고 마이크로컨트롤러에 연결된 일련의 펌프를 포함하되, 상기 마이크로컨트롤러는 상기 유체 라인을 통해 상기 침지 매질의 펌프 첨가 및 제거를 제어하고, 상기 자동화 침지 매질 모듈은 이미징 동안 상기 침지 대물렌즈의 상부에서 대물렌즈 침지 칼라에 제어된 체적의 상기 침지 매질을 제공하는, 상기 자동화 침지 매질 모듈;
(d) 다중-웰 플레이트로서, 상기 전동식 스테이지가 이미징에 사용되는 상기 대물렌즈 아래에 상기 다중-웰 플레이트의 웰을 포지셔닝하도록 이동될 수 있는, 상기 다중-웰 플레이트;
(e) 유체 커플링 타워로서, 상기 전동식 스테이지의 상부에 있고 상기 다중-웰 플레이트의 웰에 상기 유체 라인을 포지셔닝하는, 상기 유체 커플링 타워;
(f) 유체 관리 모듈로서, 로터리 밸브 기구를 포함하는 대칭형 로터리 밸브, 유체 라인에 연결된 펌프, 및 상기 펌프로 이어지는 상기 유체 라인의 어느 한 측면 상에 포지셔닝되는 버블 검출기를 포함하되, 상기 유체 라인을 통해 시약, 완충제 및 폐기물의 단방향 또는 양방향 이동을 가능하게 하는, 상기 유체 관리 모듈;
(g) 시약, 완충제 및 폐기물 모듈로서, i) 슬라이딩 트레이로서, 시약 카트리지 및 완충제 카트리지가 상기 슬라이딩 트레이에 포지셔닝되고 상기 유체 관리 모듈에 커플링될 수 있는, 상기 슬라이딩 트레이, ii) 상기 유체 관리 펌프로부터의 유체 라인에 커플링되는 폐기물 용기를 포함하는 폐기물 모듈, 및 iii) 상기 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 상기 폐기물 용기를 닫고, 상기 폐기물 용기가 상기 시스템으로 다시 배치될 때 상기 폐기물 용기를 개방하는 캐핑 기구를 포함하는, 상기 시약, 완충제 및 폐기물 모듈;
(h) 전기 모듈로서, i) 상기 자동화 침지 매질 모듈로부터 매질 분배를 제어하는 제1 펌웨어 보드 및 ii) 상기 유체 관리 모듈 및 상기 시약, 완충제 및 폐기물 모듈을 제어하는 제2 펌웨어 보드를 포함하되, 상기 시스템의 다른 모듈에 대한 전력을 조절하는, 상기 전기 모듈; 및
(i) 사용자 인터페이스를 제공하고 상기 시퀀싱 디바이스의 모듈을 작동시키도록 프로그래밍된 프로세서
를 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
2. 양태 1에 있어서, 상기 복수의 레이저 라인이 적어도 5개의 레이저 라인을 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
3. 양태 2에 있어서, 상기 대역통과 방출 필터가 펜타-대역통과 방출 필터인, 시퀀싱 디바이스.
4. 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 전동식 스테이지가 피에조(piezo) z-축을 갖는, 시퀀싱 디바이스.
5. 양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 침지 매질이 물인, 시퀀싱 디바이스.
6. 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 침지 매질이 여과되고 버블이 없는, 시퀀싱 디바이스.
7. 양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 각각의 대물렌즈 위에 수축-래핑된 코팅(shrink-wrapped coating) 및 O-링을 추가로 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
8. 양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 유체 라인의 압력을 모니터링하기 위한 압력 모니터를 추가로 포함하되, 유체 라인의 압력 증가는 상기 유체 라인의 잠재적인 막힘을 검출하는 데 사용될 수 있는, 시퀀싱 디바이스.
9. 양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 복수의 발광 다이오드(LED)를 추가로 포함하되, 각각의 LED는 상기 시스템에 대한 상태 표시를 제공하기 위해 광을 방출할 수 있는, 시퀀싱 디바이스.
10. 양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 정보를 디스플레이하고 사용자 인터페이스를 제공하기 위한 디스플레이 컴포넌트를 추가로 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
11. 양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로세서가,
(a) 상기 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계;
(b) 카메라 비닝(camera binning)과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율로 상기 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계;
(c) 상기 신호를 사용하여 상기 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계;
(d) 상기 XY 바운딩 박스 내에서 상기 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 상기 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝과 함께 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 그리고 XY 범위에 걸쳐 수집되는, 상기 이미지를 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 생성된 상기 이미지를 디스플레이하는 단계;
(f) 상기 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미징될 상기 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 선택하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계;
(g) 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 상기 선택된 관심 XY 영역에서 상기 샘플을 이미징하는 단계;
(h) 상기 샘플에서 상기 관심 영역의 체적을 계산하고, 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계;
(i) 상기 Z 범위를 따라 상기 관심 영역에서 상기 샘플의 이미지를 분할하는 단계;
(j) 사용자가 시퀀싱을 시작하기 전에 상기 샘플 체적의 Z 범위를 조정할 수 있도록 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자에 의해 정의된 상기 관심 영역으로부터 유래된 상기 이미징 범위는 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주된 시야로 자동 변환되어 시퀀싱 동안 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 XYZ 축을 따라 상기 관심 영역의 이미징을 위한 피에조 경계를 조정하는, 상기 인터페이스를 제공하는 단계; 및
(k) 상기 사용자가 시퀀싱하고자 하는 상기 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 단계 (j)를 반복하는 단계
를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
12. 양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로세서가,
사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택할 수 있도록 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지를 제한하는, 상기 인터페이스를 제공하는 단계;
시퀀싱 및 이미징될 모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계, 및
상기 제약 내에서 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계
를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
13. 양태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로세서가 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
14. 양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로세서가,
주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z에서 빠른 공초점 스윕을 수행하여 상기 시작 XY 포지션에서 상기 샘플의 Z 프로파일을 결정하는 단계;
분할 방법을 사용하여 상기 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및
상기 샘플 몽타주의 시작에서 상기 계면으로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 상기 스테이지 및 상기 대물렌즈에 대한 상기 샘플의 Z에서의 드리프트는 획득후 프로세싱 동안 라운드에 걸친 다운스트림 서브픽셀 등록을 용이하게 하기 위해 선택된 허용 오차 미만으로 감소되는 단계
를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
15. 양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 시퀀싱이 조직 샘플에서 표적 핵산의 인시투 시퀀싱인, 시퀀싱 디바이스.
16. 양태 15에 있어서, 상기 조직 샘플이 20㎛ 내지 200㎛의 두께를 갖는 조직 슬라이스인, 시퀀싱 디바이스.
17. 양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 인시투 시퀀싱이 순차적 또는 조합적 인시투 시퀀싱인, 시퀀싱 디바이스.
18. 양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 현미경 모듈이 에피형광 현미경, 공초점 현미경, 구조 조명 현미경, 또는 광 시트 또는 사면 광 시트 현미경을 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
19. 양태 18에 있어서, 상기 공초점 현미경이 스피닝 디스크 또는 포인트 주사 공초점 현미경인, 시퀀싱 디바이스.
20. 양태 1 내지 19 중 어느 하나의 시퀀싱 디바이스를 사용하는 방법으로서,
상기 다중-웰 플레이트에 샘플을 로딩하는 단계;
상기 다중-웰 플레이트에서 어떤 샘플이 시퀀싱되는 지를 선택하는 단계;
시퀀싱 프로토콜을 선택하는 단계; 및
양태 1 내지 19 중 어느 하나의 시퀀싱 디바이스를 사용하여 상기 선택된 샘플에서 핵산을 시퀀싱하는 단계
를 포함하는, 방법.
21. 양태 20에 있어서, 상기 시퀀싱이 조직 샘플의 인시투 체적 시퀀싱(in situ volumetric sequencing)인, 방법.
22. 양태 20 또는 21에 있어서, 상기 조직 샘플이 20 내지 200㎛의 두께를 갖는 조직 슬라이스인, 방법.
23. 양태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 인시투 시퀀싱이 순차적 또는 조합적 인시투 시퀀싱인, 방법.
24. 컴퓨터 구현 방법으로서, 상기 컴퓨터는,
(a) 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계;
(b) 카메라 비닝과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율로 상기 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계;
(c) 상기 신호를 사용하여 상기 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계;
(d) 상기 XY 바운딩 박스 내에서 상기 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 상기 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝과 함께 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 및 XY 범위에 걸쳐 수집되는, 상기 이미지를 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 생성된 상기 이미지를 디스플레이하는 단계;
(f) 상기 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미징될 상기 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 선택하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계;
(g) 상기 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 선택된 관심 XY 영역에서 샘플을 이미징하는 단계;
(h) 상기 관심 영역의 샘플 체적을 계산하고, 상기 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계;
(i) Z 범위를 따라 상기 관심 영역에서 상기 샘플의 이미지를 분할하는 단계;
(j) 사용자가 시퀀싱을 시작하기 전에 상기 샘플 체적의 Z 범위를 조정할 수 있도록 상기 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자에 의해 정의된 관심 영역으로부터 유래된 이미징 범위는 시퀀싱 동안 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 XYZ 축을 따라 관심 영역의 이미징을 위한 피에조 경계를 조정하기 위해, 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주된 시야로 자동 변환되는 단계; 및
(k) 상기 사용자가 시퀀싱하고자 하는 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 단계 (j)를 반복하는 단계
를 포함하는 단계들을 수행하는, 방법.
25. 컴퓨터의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서가 양태 24의 방법을 수행하게 하는 프로그램 명령을 포함하는, 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
26. 컴퓨터 구현 방법으로서, 상기 컴퓨터는,
사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택할 수 있도록 상기 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지를 제공하는 단계;
시퀀싱 및 이미징될 모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계; 및
상기 제약 내에서 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계
를 포함하는 단계들을 수행하는, 방법.
27. 양태 26에 있어서, 상기 컴퓨터가 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍되는, 컴퓨터 구현 방법.
28. 컴퓨터의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서가 양태 26 또는 27의 방법을 수행하게 하는 프로그램 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
29. 컴퓨터 구현 방법으로서, 상기 컴퓨터는,
주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z에서 빠른 공초점 스윕을 수행하여 상기 시작 XY 포지션에서 상기 샘플의 Z 프로파일을 결정하는 단계;
분할 방법을 사용하여 상기 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및
상기 샘플 몽타주의 시작에서 상기 계면으로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 스테이지 및 대물렌즈에 대한 상기 샘플의 Z에서의 드리프트는 획득후 프로세싱 동안 라운드에 걸친 다운스트림 서브픽셀 등록을 용이하게 하기 위해 선택된 허용 오차 미만으로 감소되는 단계
를 포함하는 단계들을 수행하는, 방법.
30. 컴퓨터의 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 양태 29의 방법을 수행하게 하는 프로그램 명령을 포함하는, 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
31. 자동화된 침지 매체 모듈로서,
(a) 침지 매질을 포함하는 용기;
(b) 상기 용기에 그리고 현미경 모듈의 대물렌즈의 대물렌즈 침지 칼라에 커플링된 유체 라인으로서, 상기 유체 라인은 침지 대물렌즈 상의 대물렌즈 침지 칼라로 그리고 상기 대물렌즈 침지 칼라로부터 침지 매체를 운반하며, 상기 침지 칼라는 과잉의 침지 매질을 포획하는 단계; 및
(c) 유체 라인 및 마이크로컨트롤러에 연결된 일련의 펌프로서, 상기 마이크로컨트롤러는 상기 유체 라인을 통해 상기 침지 매질의 펌프 추가 및 제거를 제어하고, 상기 자동화 침지 매질 모듈은 이미징 동안 대물렌즈의 상부에서 상기 대물렌즈 침지 칼라에 제어된 체적의 상기 침지 매질을 제공하는 단계
를 포함하는, 자동화된 침지 매체 모듈.
32. 양태 31의 자동화 침지 매질 모듈을 사용하는 방법으로서, 양태 31의 자동화 침지 매질 모듈을 사용하여 현미경의 침지 대물렌즈에 부착된 대물렌즈 침지 칼라에 침지 매질을 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 유체 관리 모듈로서, 로터리 밸브 기구를 포함하는 대칭형 로터리 밸브, 유체 라인에 연결된 펌프 및 버블 검출기를 포함하되, 상기 버블 검출기는 펌프로 이어지는 상기 유체 라인의 어느 한 쪽에 포지셔닝되며, 상기 유체 관리 모듈은 상기 유체 라인을 통해 시약, 완충제 및 폐기물의 양방향 또는 단방향 이동을 허용하는, 유체 관리 모듈.
34. 시약, 완충제 및 폐기물 모듈로서,
(a) 슬라이딩 트레이로서, 시약 카트리지 및 완충제 카트리지가 상기 슬라이딩 트레이에 포지셔닝되고 유체 관리 모듈에 커플링될 수 있는, 상기 슬라이딩 트레이;
(b) 폐기물 용기를 포함하는 폐기물 모듈로서, 상기 폐기물 용기가 유체 관리 펌프로부터의 유체 라인에 커플링되는, 상기 폐기물 모듈; 및
(c) 캐핑 기구로서, 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 폐기물 용기를 닫고, 상기 폐기물 용기가 상기 시스템에 다시 배치될 때 상기 폐기물 용기를 개방하는, 상기 캐핑 기구
를 포함하는, 시약, 완충제 및 폐기물 모듈.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것이고, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것이 아니고 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것도 아니다. 사용된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련여 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것처럼 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 모드를 포함하는 것으로 본 발명자에 의해 발견되거나 제안된 특정 실시형태와 관련하여 기재되었다. 당업자라면 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 의도된 범위를 벗어나지 않으면서 예시된 특정 실시형태에서 수많은 변형 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 코돈 중복성으로 인해, 단백질 서열에 영향을 미치지 않으면서 기본 DNA 서열에서 변화가 이루어질 수 있다. 또한, 생물학적 기능적 동등성 고려로 인해, 종류 또는 양의 생물학적 작용에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에서 변화가 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예 1
체적 차세대 인시투 시퀀서
개요
1. 통합 유체 및 신속 공초점 플랫폼 및 최대 5개 채널 이미징
2. 자동화 침지 매질 모듈
강력한 버블 방지를 위한 루틴
3. 샘플/유체 커플링 타워
4. 맞춤형 폐기물 용기
5. 시퀀서 소프트웨어
a. GUI
b. 신속한 샘플 찾기 알고리즘(3D 시퀀싱 샘플용으로 일반적임)
c. 시퀀싱 시간, 병렬 처리, 시약 소비 및 디스크 공간 조인트 최적화(3D 시퀀싱 샘플용으로 일반적임)
d. 여러 라운드에 걸쳐 데이터의 최소 드리프트를 위한 샘플 인터페이스 및 xyz 포지션의 폐쇄-루프 검출.
기술적 설명
많은 샘플에 대해 여러 라운드의 시퀀싱 및 이미징 사이클을 병렬로 수행할 수 있는 자동화된 통합 유체 및 이미징 플랫폼에서 샘플을 시퀀싱하였다. 시퀀서는 다음과 같은 몇 가지 주요 모듈을 가지고 있다.
Andor Technologies로부터의 컴포넌트를 통합하는 조명 및 검출 모듈은 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트, 5개의 레이저 라인 조명, 보레알리스 플랫 조명 보정부(Borealis flat illumination correction), 펜타-대역통과 방출 필터, 롱-패스 이미지 스플리터, 및 단파장 및 장파장 조명에 의해 발생된 방출의 동시 검출을 위한 2개의 검출 카메라로 구성된다.
맞춤형 현미경 모듈은 전동식 XYZ 스테이지(피에조 Z 포함), 대물렌즈 Z 드라이브, 터릿 휠, 저배율에서 고배율 범위의 다수의 대물렌즈, 및 대물렌즈로부터 조명 및 검출 모듈로 광을 라우팅하는 광학계를 결합한다.
대물렌즈와 커버글라스 사이에 담지 매질을 필요로 하는 대물렌즈에 커플링되는 신규한 자동화 침지 매질 모듈은 유입 및 유출 둘 모두를 관리하는 대물렌즈의 상부에 정확하게 제어된 체적의 여과된, 버블이 없는 매질(예컨대, 물)을 제공한다. 이 모듈은 침지 매질의 수동 첨가를 필요로 하는 고배율 침지 대물렌즈를 갖는 샘플의 병렬 시퀀싱을 가능하게 한다. 침지 매질의 첨가 및 제거는 커버글라스에 대한 표면 장력이 최소화되고(샘플의 Z 치수에서의 이동을 최소화하고), 버블이 회피되고, 액체 오버플로우가 방지되고, 장기간 이미징을 위해 대물렌즈 상에 충분한 체적이 존재하도록 일련의 펌프 및 마이크로로컨트롤러에 의해 관리된다. 이는 액체 유량의 알고리즘적 조정, 샘플에 대한 x, y, 및 z에서의 대물렌즈의 포지션, 버블을 제거하기 위한 액체 교체 단계, 및 유체 교체 타이밍을 포함한다. 예를 들어, 보정된 체적의 침지 매질(일반적으로 물)을 칼라를 통해 대물렌즈에 공급한 후, 버블 형성이 발생하지 않도록 하는 대각선 스테이지 이동이 수행된다. 침지 칼라는 과잉 침지 매질을 포획하여 다수의 O-링 및 대물렌즈 위의 수축-래핑된 코팅을 통해 대물렌즈에 대한 매질 접근을 방지한다. 대물렌즈 침지 칼라로 및 이로부터 침지 매질을 가져오는 유체 라인은 대물렌즈 터릿에 통합되는 중앙 타워에 의해 관리된다.
XYZ 스테이지에 배치된 신규한 유체 커플링 타워는 유체 라인을 다중-웰 샘플 플레이트에 포지셔닝시킨다. 이 커플러는 자동화된 현미경 스테이지에 대한 구조적 부하를 최소화하면서 현미경 스테이지로부터 샘플의 용이한 첨가 및 제거 및 샘플에 대한 유체 라인의 결합을 가능하게 한다(스테이지 상의 과도한 중량은 정확한 포지셔닝 및 빠른 움직임을 억제함). 빔 차단은 샘플이 시스템에 완전히 커플링되었는지 여부를 검출하고 구조적 요소는 작동 동안 유체 라인의 손상 또는 사용자의 피해를 방지한다.
유체 관리 모듈은 대칭형 로터리 밸브, 펌프, 로터리 밸브 기구를 통해 시약, 완충제 및 폐기물의 양방향 이동을 가능하게 한다. 펌프 움직임은 맞춤형 펌웨어에 의해 제어되고 라인 압력은 모니터링된다. 펌프를 향해 이동하는 액체는 (로터리 밸브 전) 펌프로 이어지는 라인의 어느 한 측면에서 버블 검출기를 사용하여 정확한 체적 이동을 위해 프라이밍된다. 라인의 압력은 공칭 유체 유동에 대해 모니터링되고 라인의 잠재적인 막힘을 검출한다.
시약, 완충제 및 폐기물 모듈은 시퀀싱 시약 및 완충제를 시스템에 첨가하고 시스템으로부터 폐기물을 제거하는 것을 조직화한다. 이는 맞춤형 시약 및 완충제 카트리지가 포지셔닝되고 후속하여 자동화된 방식으로 유체 관리 모듈에 커플링되는 슬라이딩 트레이로 구성된다. 폐기물 모듈은 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 폐쇄되지만 시스템에 다시 배치될 때 개방되는 것을 보장하는 캐핑 기구 설계를 통해 유체 관리 펌프로부터 유출 라인을 수용한다.
전기 모듈은 시스템의 다양한 컴포넌트에 대한 전력을 조절한다. 하나의 펌웨어 보드는 자동화 침지 매질 디스펜서를 제어하고, 제2 펌웨어 보드는 시스템에 대한 관련 상태 표시를 표시하는 LED에 추가하여, 유체 관리 모듈 및 시약, 완충제 및 폐기물 모듈을 제어한다.
백엔드 및 GUI 모듈 둘 모두를 포함하는 맞춤형 컴퓨터 소프트웨어 프로그램은 시퀀싱 실행 설정, 시퀀싱 실행 옵션, 샘플 관심 영역(ROI) 정의, 시퀀싱 및 이미징을 위해 필요한 고수준의 작동, 자동화된 침지 시스템의 고수준 제어, 샘플에 걸친 시퀀싱의 병렬화, 로깅, 오류 모니터링, 데이터 획득, 관리 및 전달, 및 실행 진행 모니터링을 포함하는, 시퀀서 펌웨어 및 하드웨어와 사용자 사이에 인터페이스를 제공한다. 컴퓨터 소프트웨어 프로그램은 실행 설정 및 시퀀싱 라운드의 일관된 이미징을 위한 여러 신규 알고리즘을 포함한다. 자동화된 3D 샘플-찾기 및 ROI 사양 알고리즘은 최대 카메라 비닝(binning)으로 저배율, 광시야 이미징 모드 획득을 통해 샘플로부터 XY 평면의 신호를 빠르게 검출한다. 이 신호는 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 데 사용된다. 후속하여, 이 XY 경계는 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해, 더 높은 배율이지만 최대 카메라 비닝으로, Z의 공초점 이미징 모드에서 빠르게 서브샘플링된다. 단일 Z 평면은 XY 범위에 걸쳐 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 빠르게 수집되어 사용자에게 표시된다. 이 시점에서, 사용자는 주어진 샘플에 대한 시퀀싱 동안 이미지화될 원하는 XY ROI를 인터페이스를 통해 선택할 수 있다. 후속하여, XY ROI의 보다 상세한 획득은 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 획득된다. 이 체적은 사용자에게 표시되고 주어진 ROI에서 샘플 범위를 Z로 분할하는 데 추가로 사용된다. 사용자는 시퀀싱이 시작되기 전에 인터페이스를 통해 체적의 Z 범위를 더욱 미세하게 조정할 수 있다. 이 ROI 정의로부터 유래된 이미징 범위는 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주 시야로 자동 변환되고, 시퀀싱 동안 XYZ ROI의 최적의 이미징을 위해 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지션, 및 피에조 경계로 자동 변환된다. 이러한 ROI 정의 알고리즘을 사용하면 3D에서 신속한 반자동 ROI 정의가 가능하고 사용자 상호작용의 양을 최소화한다(예를 들어, 샘플 및 몽타주 정의 및 시험에 대한 임의의 수동 제어 및 웰 검색, 이는 지나치게 시간이 많이 걸리고 경험이 없는 사용자에게 어려움). 이 자동화된 ROI 절차는 사용자가 시퀀싱하려는 각 샘플 웰에 대해 수행된다.
두 번째 알고리즘은 최적의 샘플 병렬도 및 시퀀서 시간 효율을 보장하기 위해 시퀀싱 실행 설정에서 사용자를 안내하는 한편, 사용 가능한 것보다 많은 양의 데이터의 수집 또는 더 많은 완충제 및 시약의 사용을 방지한다. 이 알고리즘은 사용자가 상이한 샘플 유형에 걸쳐 다양한 XYZ 범위의 ROI에 관심이 있고 ROI를 초과하는 과량의 이미징 체적은 사용자와 관련이 없기 때문에 공간 시퀀싱 접근법, 특히 체적 접근법에 필수적이다. 또한, 단일 샘플 획득은 저장 및/또는 전송되어야 하는 많은 테라바이트의 미가공 데이터를 생성할 수 있다. 또한, 시퀀싱 키트는 완충제 및 시약의 최대 용량을 갖기 때문에, 사용자는 특히 정확한 시퀀싱 프로토콜 및 필요한 라운드 수에 따라 사용을 위해 정의될 수 있는 샘플의 수에 제한이 있다. 따라서, 다수의 샘플 시퀀싱 시간, 완충제/시약 가용성, 시퀀싱 프로토콜, 총 데이터 수집 및 전달 용량, 및 XYZ에서의 ROI 범위의 균형을 맞추는 최적화 알고리즘이 필요하다. 알고리즘은 총 시퀀싱 시간(예를 들어, 3일), 획득된 총 데이터 및 획득 속도(이용 가능한 데이터 전송/오프로딩 속도와 관련됨), 모든 샘플에 걸친 최대 ROI 예산, 및 완충제/시약을 포함하는 반면, 원하는 시퀀싱의 최대량을 이러한 제약으로 압축하는 샘플 프로토콜 및 ROI의 조합을 제안한다. 이러한 최적화는 또한 샘플 시퀀싱 병렬화를 위한 서브루틴 옵티마이저를 포함하는데, 이는 상이한 수의 샘플 및 이미징 유형이 다양한 시간의 최적 병렬화 솔루션을 생성할 수 있기 때문이다.
샘플의 시퀀싱 동안 적용된 또 다른 알고리즘은 폐쇄 루프에서 Z 포지션 설정점을 찾기 위해 커버글라스로부터 반사된 각진 적외선 레이저 광을 이용하는 소위 완벽한 초점 시스템 하드웨어에 대한 필요성을 제거한다. 이 알고리즘은 주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z의 빠른 공초점 스윕을 사용하여 그러한 포지션에서 샘플의 특징적인 Z 프로파일을 결정한다. 분할 방법을 사용하여 샘플 상단 및 하단 계면을 결정하고, 대물렌즈 Z 포지션은 몽타주 시작 시 이 계면으로부터 고정된 거리에 설정된다. 이는 스테이지에 대한 샘플의 Z에 드리프트가 있었고 라운드에 걸쳐 대물렌즈가 있었다 하더라도, 샘플 Z 드리프트가 일부 허용치 미만으로 감소하여 획득-후 프로세싱 동안 라운드에 걸쳐 다운스트림 서브픽셀 등록을 용이하게 하는 것을 보장한다. 이 알고리즘은 회절 제한된 스폿의 정확한 위치가 라운드에 걸쳐 정렬되어야 하는 조합 시퀀싱을 위한 완벽한 초점 하드웨어 시스템의 부재에서 특히 중요하고, 샘플 두께가 작을 때 추가로 중요하며, 이 경우 Z의 드리프트 그렇지 않으면 임의의 라운드에서 발생할 수 있는 Z의 총 샘플 범위에 비해 크므로, 샘플 범위의 에지에서 각 라운드에서 더 큰 백분율의 데이터 손실이 발생한다. 이러한 알고리즘은 또한 XY에서의 정렬을 위해 수행될 수 있지만, 획득의 종횡비로 인해 XY에서의 예상치 못한 샘플 이동으로 인한 데이터 손실의 백분율은 일반적으로 최소이다.

Claims (34)

  1. 시퀀싱 디바이스(sequencing device)로서,
    (a) 조명 및 검출 모듈로서, 플랫 조명 보정부(flat illumination correction)를 구비하는 조명하기 위한 복수의 레이저 라인을 포함하는 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트로서, 상기 복수의 레이저 라인은 하나 이상의 파장의 여기 광으로 샘플을 조명하는 데 사용되는, 상기 스피닝 디스크 공초점 컴포넌트, 대역통과 방출 필터, 롱-패스(long-pass) 이미지 스플리터, 제1 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제1 카메라 및 제2 파장 범위의 형광 방출을 검출하는 제2 카메라를 포함하되, 상기 제1 카메라 및 제2 카메라는 방출을 동시에 검출할 수 있는, 상기 조명 및 검출 모듈;
    (b) 현미경 모듈로서, x, y, 및 z 축을 따라 다축 포지셔닝이 가능한 전동식 스테이지, 대물렌즈 Z 드라이브, 다수의 대물렌즈를 포함하는 대물렌즈 터릿 휠(objective turret wheel)로서, 각각의 대물렌즈는 상이한 배율을 제공하고, 하나 이상의 대물렌즈가 침지 대물렌즈(immersion objective)이고, 각각의 침지 대물렌즈는 대물렌즈 침지 칼라(objective immersion collar)를 갖는, 상기 대물렌즈 터릿 휠, 및 상기 대물렌즈로부터 상기 조명 및 검출 모듈로 광을 라우팅하는 광학계(optic)를 포함하는, 상기 현미경 모듈;
    (c) 자동화 침지 매질 모듈로서, i) 침지 매질을 포함하는 용기, ii) 상기 용기에 그리고 상기 현미경 모듈의 상기 침지 대물렌즈의 상기 대물렌즈 침지 칼라에 커플링된 유체 라인으로서, 상기 유체 라인은 상기 현미경 모듈의 상기 침지 대물렌즈의 상기 대물렌즈 침지 칼라로 또는 상기 대물렌즈 침지 칼라로부터 침지 매질을 운반하고, 상기 침지 칼라는 과잉 침지 매질을 포획하는, 상기 유체 라인 및 iii) 상기 유체 라인에 그리고 마이크로컨트롤러에 연결된 일련의 펌프를 포함하되, 상기 마이크로컨트롤러는 상기 유체 라인을 통해 상기 침지 매질의 펌프 첨가 및 제거를 제어하고, 상기 자동화 침지 매질 모듈은 이미징 동안 상기 침지 대물렌즈의 상부에서 대물렌즈 침지 칼라에 제어된 체적의 상기 침지 매질을 제공하는, 상기 자동화 침지 매질 모듈;
    (d) 다중-웰 플레이트로서, 상기 전동식 스테이지가 이미징에 사용되는 상기 대물렌즈 아래에 상기 다중-웰 플레이트의 웰을 포지셔닝하도록 이동될 수 있는, 상기 다중-웰 플레이트;
    (e) 유체 커플링 타워로서, 상기 전동식 스테이지의 상부에 있고 상기 다중-웰 플레이트의 웰에 상기 유체 라인을 포지셔닝하는, 상기 유체 커플링 타워;
    (f) 유체 관리 모듈로서, 로터리 밸브 기구를 포함하는 대칭형 로터리 밸브, 유체 라인에 연결된 펌프, 및 상기 펌프로 이어지는 상기 유체 라인의 어느 한 측면 상에 포지셔닝되는 버블 검출기를 포함하되, 상기 유체 라인을 통해 시약, 완충제 및 폐기물의 단방향 또는 양방향 이동을 가능하게 하는, 상기 유체 관리 모듈;
    (g) 시약, 완충제 및 폐기물 모듈로서, i) 슬라이딩 트레이로서, 시약 카트리지 및 완충제 카트리지가 상기 슬라이딩 트레이에 포지셔닝되고 상기 유체 관리 모듈에 커플링될 수 있는, 상기 슬라이딩 트레이, ii) 상기 유체 관리 펌프로부터의 유체 라인에 커플링되는 폐기물 용기를 포함하는 폐기물 모듈, 및 iii) 상기 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 상기 폐기물 용기를 닫고, 상기 폐기물 용기가 상기 시스템으로 다시 배치될 때 상기 폐기물 용기를 개방하는 캐핑 기구를 포함하는, 상기 시약, 완충제 및 폐기물 모듈;
    (h) 전기 모듈로서, i) 상기 자동화 침지 매질 모듈로부터 매질 분배를 제어하는 제1 펌웨어 보드 및 ii) 상기 유체 관리 모듈 및 상기 시약, 완충제 및 폐기물 모듈을 제어하는 제2 펌웨어 보드를 포함하되, 상기 시스템의 다른 모듈에 대한 전력을 조절하는, 상기 전기 모듈; 및
    (i) 사용자 인터페이스를 제공하고 상기 시퀀싱 디바이스의 모듈을 작동시키도록 프로그래밍된 프로세서
    를 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복수의 레이저 라인이 적어도 5개의 레이저 라인을 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 대역통과 방출 필터가 펜타-대역통과 방출 필터인, 시퀀싱 디바이스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전동식 스테이지가 피에조(piezo) z-축을 갖는, 시퀀싱 디바이스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 침지 매질이 물인, 시퀀싱 디바이스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 침지 매질이 여과되고 버블이 없는, 시퀀싱 디바이스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 대물렌즈 위에 수축-래핑된 코팅(shrink-wrapped coating) 및 O-링을 추가로 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 라인의 압력을 모니터링하기 위한 압력 모니터를 추가로 포함하되, 유체 라인의 압력 증가는 상기 유체 라인의 잠재적인 막힘을 검출하는 데 사용될 수 있는, 시퀀싱 디바이스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 발광 다이오드(LED)를 추가로 포함하되, 각각의 LED는 상기 시스템에 대한 상태 표시를 제공하기 위해 광을 방출할 수 있는, 시퀀싱 디바이스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 정보를 디스플레이하고 사용자 인터페이스를 제공하기 위한 디스플레이 컴포넌트를 추가로 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세서가,
    (a) 상기 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계;
    (b) 카메라 비닝(camera binning)과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율로 상기 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계;
    (c) 상기 신호를 사용하여 상기 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계;
    (d) 상기 XY 바운딩 박스 내에서 상기 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 상기 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝과 함께 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 그리고 XY 범위에 걸쳐 수집되는, 상기 이미지를 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 생성된 상기 이미지를 디스플레이하는 단계;
    (f) 상기 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미징될 상기 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 선택하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계;
    (g) 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 상기 선택된 관심 XY 영역에서 상기 샘플을 이미징하는 단계;
    (h) 상기 샘플에서 상기 관심 영역의 체적을 계산하고, 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계;
    (i) 상기 Z 범위를 따라 상기 관심 영역에서 상기 샘플의 이미지를 분할하는 단계;
    (j) 사용자가 시퀀싱을 시작하기 전에 상기 샘플 체적의 Z 범위를 조정할 수 있도록 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자에 의해 정의된 상기 관심 영역으로부터 유래된 상기 이미징 범위는 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주된 시야로 자동 변환되어 시퀀싱 동안 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 XYZ 축을 따라 상기 관심 영역의 이미징을 위한 피에조 경계를 조정하는, 상기 인터페이스를 제공하는 단계; 및
    (k) 상기 사용자가 시퀀싱하고자 하는 상기 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 단계 (j)를 반복하는 단계
    를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세서가,
    사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택할 수 있도록 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지를 제한하는, 상기 인터페이스를 제공하는 단계;
    시퀀싱 및 이미징될 모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계, 및
    상기 제약 내에서 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계
    를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세서가 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세서가,
    주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z에서 빠른 공초점 스윕을 수행하여 상기 시작 XY 포지션에서 상기 샘플의 Z 프로파일을 결정하는 단계;
    분할 방법을 사용하여 상기 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및
    상기 샘플 몽타주의 시작에서 상기 계면으로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 상기 스테이지 및 상기 대물렌즈에 대한 상기 샘플의 Z에서의 드리프트(drift)는 획득후 프로세싱 동안 라운드에 걸친 다운스트림 서브픽셀 등록을 용이하게 하기 위해 선택된 허용 오차 미만으로 감소되는 단계
    를 포함하는 단계들을 수행하도록 추가로 프로그래밍되는, 시퀀싱 디바이스.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시퀀싱이 조직 샘플에서 표적 핵산의 인시투 시퀀싱(in situ sequencing)인, 시퀀싱 디바이스.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조직 샘플이 20㎛ 내지 200㎛의 두께를 갖는 조직 슬라이스인, 시퀀싱 디바이스.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인시투 시퀀싱이 순차적 또는 조합적 인시투 시퀀싱인, 시퀀싱 디바이스.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현미경 모듈이 에피형광 현미경, 공초점 현미경, 구조 조명 현미경, 또는 광 시트 또는 사면 광 시트 현미경(light sheet or oblique-plane light sheet microscope)을 포함하는, 시퀀싱 디바이스.
  19. 제18항에 있어서, 상기 공초점 현미경이 스피닝 디스크 또는 포인트 주사 공초점 현미경인, 시퀀싱 디바이스.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시퀀싱 디바이스를 사용하는 방법으로서,
    상기 다중-웰 플레이트에 샘플을 로딩하는 단계;
    상기 다중-웰 플레이트에서 어떤 샘플이 시퀀싱되는 지를 선택하는 단계;
    시퀀싱 프로토콜을 선택하는 단계; 및
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시퀀싱 디바이스를 사용하여 상기 선택된 샘플에서 핵산을 시퀀싱하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 시퀀싱이 조직 샘플의 인시투 체적 시퀀싱(in situ volumetric sequencing)인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 조직 샘플이 20 내지 200㎛의 두께를 갖는 조직 슬라이스인, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 인시투 시퀀싱이 순차적 또는 조합적 인시투 시퀀싱인, 방법.
  24. 컴퓨터 구현 방법으로서, 상기 컴퓨터는,
    (a) 다중-웰 플레이트에서 선택된 샘플을 위치시키는 단계;
    (b) 카메라 비닝과 함께 광시야 이미징 모드 획득을 사용하여 저배율로 상기 선택된 샘플로부터 XY 평면에서 신호를 검출하는 단계;
    (c) 상기 신호를 사용하여 상기 샘플 주위의 XY 바운딩 박스를 분할하는 단계;
    (d) 상기 XY 바운딩 박스 내에서 상기 샘플을 이미징하여 이미지를 생성하는 단계로서, 이미징은 상기 샘플의 대략적인 Z 범위를 결정하기 위해 카메라 비닝과 함께 단계 (b)에서 사용된 것보다 더 높은 배율로 Z의 공초점 이미징 모드에서 수행되고, 단일 Z 평면은 이전에 결정된 Z 범위의 중간점을 통해 및 XY 범위에 걸쳐 수집되는, 상기 이미지를 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 생성된 상기 이미지를 디스플레이하는 단계;
    (f) 상기 선택된 샘플의 시퀀싱 동안 추가로 이미징될 상기 샘플에서 원하는 관심 XY 영역을 사용자가 선택하기 위한 인터페이스를 제공하는 단계;
    (g) 상기 이전에 샘플링된 Z 범위에 걸쳐 선택된 관심 XY 영역에서 샘플을 이미징하는 단계;
    (h) 상기 관심 영역의 샘플 체적을 계산하고, 상기 계산된 관심 영역의 샘플 체적을 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계;
    (i) Z 범위를 따라 상기 관심 영역에서 상기 샘플의 이미지를 분할하는 단계;
    (j) 사용자가 시퀀싱을 시작하기 전에 상기 샘플 체적의 Z 범위를 조정할 수 있도록 상기 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자에 의해 정의된 관심 영역으로부터 유래된 이미징 범위는 시퀀싱 동안 현미경 스테이지 포지션, 대물렌즈 Z 포지셔닝, 및 XYZ 축을 따라 관심 영역의 이미징을 위한 피에조 경계를 조정하기 위해, 주어진 이미징 대물렌즈에 대한 적절한 몽타주된 시야로 자동 변환되는 단계; 및
    (k) 상기 사용자가 시퀀싱하고자 하는 다중-웰 플레이트에서 각각의 샘플에 대한 관심 영역을 획정하기 위해 단계 (a) 내지 단계 (j)를 반복하는 단계
    를 포함하는 단계들을 수행하는, 방법.
  25. 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체로서, 컴퓨터의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서가 제24항의 방법을 수행하게 하는 프로그램 명령을 포함하는, 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
  26. 컴퓨터 구현 방법으로서, 상기 컴퓨터는,
    사용자가 시퀀싱을 위한 하나 이상의 샘플 및 시퀀싱 프로토콜을 선택할 수 있도록 상기 사용자에게 인터페이스를 제공하는 단계로서, 상기 사용자는 이용 가능한 완충제 및 시약의 양 및 선택된 시퀀싱 프로토콜에 따라 얼마나 많은 샘플이 선택될 수 있는지를 제공하는 단계;
    시퀀싱 및 이미징될 모든 샘플에 걸쳐 총 시퀀싱 시간, 획득된 총 데이터, 획득 속도, 및 관심 영역의 최대 총 체적에 대한 제약을 제공하는 단계; 및
    상기 제약 내에서 샘플에서 원하는 관심 영역의 시퀀싱을 최대화하는 프로토콜을 제안하는 단계
    를 포함하는 단계들을 수행하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 컴퓨터가 시퀀싱될 샘플의 수 및 시퀀싱에 사용될 이미징 유형에 따라 샘플 시퀀싱 병렬화를 최적화하도록 추가로 프로그래밍되는, 컴퓨터 구현 방법.
  28. 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체로서, 컴퓨터의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서가 제26항 또는 제27항의 방법을 수행하게 하는 프로그램 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
  29. 컴퓨터 구현 방법으로서, 상기 컴퓨터는,
    주어진 샘플 몽타주의 시작 XY 포지션에서 Z에서 빠른 공초점 스윕을 수행하여 상기 시작 XY 포지션에서 상기 샘플의 Z 프로파일을 결정하는 단계;
    분할 방법을 사용하여 상기 샘플 상부 및 하부 계면을 결정하는 단계; 및
    상기 샘플 몽타주의 시작에서 상기 계면으로부터 고정된 거리에 대물렌즈 Z 포지션을 설정하는 단계로서, 라운드에 걸친 스테이지 및 대물렌즈에 대한 상기 샘플의 Z에서의 드리프트는 획득후 프로세싱 동안 라운드에 걸친 다운스트림 서브픽셀 등록을 용이하게 하기 위해 선택된 허용 오차 미만으로 감소되는 단계
    를 포함하는 단계들을 수행하는, 방법.
  30. 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체로서, 컴퓨터의 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 제29항의 방법을 수행하게 하는 프로그램 명령을 포함하는, 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
  31. 자동화된 침지 매체 모듈로서,
    (a) 침지 매질을 포함하는 용기;
    (b) 상기 용기에 그리고 현미경 모듈의 대물렌즈의 대물렌즈 침지 칼라에 커플링된 유체 라인으로서, 상기 유체 라인은 침지 대물렌즈 상의 대물렌즈 침지 칼라로 그리고 상기 대물렌즈 침지 칼라로부터 침지 매체를 운반하며, 상기 침지 칼라는 과잉의 침지 매질을 포획하는 단계; 및
    (c) 유체 라인 및 마이크로컨트롤러에 연결된 일련의 펌프로서, 상기 마이크로컨트롤러는 상기 유체 라인을 통해 상기 침지 매질의 펌프 추가 및 제거를 제어하고, 상기 자동화 침지 매질 모듈은 이미징 동안 대물렌즈의 상부에서 상기 대물렌즈 침지 칼라에 제어된 체적의 상기 침지 매질을 제공하는 단계
    를 포함하는, 자동화된 침지 매체 모듈.
  32. 제31항의 자동화 침지 매질 모듈을 사용하는 방법으로서, 제31항의 자동화 침지 매질 모듈을 사용하여 현미경의 침지 대물렌즈에 부착된 대물렌즈 침지 칼라에 침지 매질을 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 유체 관리 모듈로서, 로터리 밸브 기구를 포함하는 대칭형 로터리 밸브, 유체 라인에 연결된 펌프 및 버블 검출기를 포함하되, 상기 버블 검출기는 펌프로 이어지는 상기 유체 라인의 어느 한 쪽에 포지셔닝되며, 상기 유체 관리 모듈은 상기 유체 라인을 통해 시약, 완충제 및 폐기물의 양방향 또는 단방향 이동을 허용하는, 유체 관리 모듈.
  34. 시약, 완충제 및 폐기물 모듈로서,
    (a) 슬라이딩 트레이로서, 시약 카트리지 및 완충제 카트리지가 상기 슬라이딩 트레이에 포지셔닝되고 유체 관리 모듈에 커플링될 수 있는, 상기 슬라이딩 트레이;
    (b) 폐기물 용기를 포함하는 폐기물 모듈로서, 상기 폐기물 용기가 유체 관리 펌프로부터의 유체 라인에 커플링되는, 상기 폐기물 모듈; 및
    (c) 캐핑 기구로서, 폐기물 용기가 폐기물 처리를 위해 시스템으로부터 제거될 때 폐기물 용기를 닫고, 상기 폐기물 용기가 상기 시스템에 다시 배치될 때 상기 폐기물 용기를 개방하는, 상기 캐핑 기구
    를 포함하는, 시약, 완충제 및 폐기물 모듈.
KR1020237043325A 2021-05-21 2022-05-20 체적 차세대 인시투 시퀀서 KR20240023042A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163191460P 2021-05-21 2021-05-21
US63/191,460 2021-05-21
PCT/US2022/030232 WO2022246181A2 (en) 2021-05-21 2022-05-20 Volumetric next-generation in situ sequencer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240023042A true KR20240023042A (ko) 2024-02-20

Family

ID=84141873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237043325A KR20240023042A (ko) 2021-05-21 2022-05-20 체적 차세대 인시투 시퀀서

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4351787A2 (ko)
KR (1) KR20240023042A (ko)
CN (1) CN117957060A (ko)
AU (1) AU2022276432A1 (ko)
CA (1) CA3220594A1 (ko)
IL (1) IL308572A (ko)
WO (1) WO2022246181A2 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010025302A2 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Life Technologies Corporation Apparatus for and method of processing biological samples
WO2015081242A2 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Beckman Coulter, Inc. Fluidics system for flow cytometer
US10005080B2 (en) * 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
WO2019016048A1 (en) * 2017-07-17 2019-01-24 Novartis Ag DIP DECK FOR MICROSCOPE, MICROSCOPE, AND METHOD FOR MICROSCOPIC IMAGING SAMPLE
US11041199B2 (en) * 2018-12-20 2021-06-22 Omniome, Inc. Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022246181A9 (en) 2023-11-02
AU2022276432A1 (en) 2023-12-14
IL308572A (en) 2024-01-01
WO2022246181A2 (en) 2022-11-24
CA3220594A1 (en) 2022-11-24
CN117957060A (zh) 2024-04-30
WO2022246181A3 (en) 2022-12-29
EP4351787A2 (en) 2024-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210164039A1 (en) Method of in situ gene sequencing
US10982260B2 (en) Sequencing by emergence
US11427867B2 (en) Sequencing by emergence
CN108603227A (zh) 超分辨率测序
US20210388424A1 (en) Methods for analyzing target nucleic acids and related compositions
CA3140900A1 (en) Sequencing by emergence
CA3220740A1 (en) Next-generation volumetric in situ sequencing
WO2022159474A1 (en) Methods and compositions for internally controlled in situ assays
Gert et al. Reciprocal zebrafish-medaka hybrids reveal maternal control of zygotic genome activation timing
US20230212556A1 (en) Systems and methods for associating single cell imaging with rna transcriptomics
KR20240023042A (ko) 체적 차세대 인시투 시퀀서
US20230109070A1 (en) Clinical- and industrial-scale intact-tissue sequencing
EP3887545A1 (en) Sequencing by coalascence
EP4352262A1 (en) Scalable distributed processing software for next-generation in situ sequencing
EP4352263A1 (en) Sequencing chemistries and encodings for next-generation in situ sequencing
EP4349984A1 (en) Probe, probe set, and nucleic acid detection kit for mammals