CN117957060A - 新一代体积原位测序仪 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对体积组织样本进行自动原位测序的测序仪。具体地，本发明提供了一种能够并行处理多个样本的自动体积原位测序设备。本发明还提供了所述测序仪的制作和使用方法。
Description
背景技术
从单个细胞到整个组织，各种长度尺度的生物样本包含复杂、异质遗传信息。细胞内核酸的空间形态可揭示细胞功能特性和异常；RNA表达的累积分布可定义细胞类型或功能；并且组织内细胞类型位置的系统性变化可定义组织功能。将核酸中编码的解剖联系信息与整个组织的细胞类型分布相结合，即可覆盖众多组织区域和部分。因此，小到单个分子，大到整个大脑，原位核酸测序技术必须能够融合各种分辨率。为了在数量级长度差异范围内有效收集并记录上述信息，新发明需要增强原位测序技术的稳健性、快速性、自动化和高通量性质。
发明内容
本发明提供了一种对体积组织样本进行自动原位测序的测序设备。具体地，本发明提供了一种能够以高分辨率并行处理多个样本的自动体积原位测序设备。所述测序设备将自动浸没与自动原位测序功能相结合。所述测序设备对受益于其高分辨率能力的组合测序特别有用。本发明还提供了所述测序仪的制作和使用方法。
在一个方面，本发明提供了一种测序设备，包括：(a)一个照明和检测模块，包括：一个转盘共聚焦部件，包括通过平面照明校正进行照明的多条激光线，其中，所述多条激光线用于以一个或多个波长的激发光照亮样本；一个带通发射滤光片；一个长通图像分割器；一个第一摄像机，在第一波长范围内检测荧光发射；以及一个第二摄像机，在第二波长范围内检测荧光发射，其中，所述第一摄像机和第二摄像机可同时检测发射；(b)一个显微镜模块，包括：一个电动载物台，能够沿x、y和z轴进行多轴定位；一个物镜Z驱动器；一个物镜转轮，包括多个物镜，其中，每个物镜提供不同的放大率，其中，一个或多个物镜是浸没物镜，其中，每个浸没物镜具有物镜浸没环；以及多个光学器件，其中，所述光学器件将光从物镜引导到所述照明和检测模块；(c)一个自动浸没介质模块，包括：i)一个容器，包含浸没介质；ii)多条流体管线，与容器以及显微镜模块物镜的物镜浸没环耦合，其中，所述流体管线将浸没介质引入和引出物镜浸没环，其中，所述浸没环捕获多余的浸没介质；以及iii)一组泵，与流体管线和微控制器连接，其中，所述微控制器控制泵通过流体管线添加和移除浸没介质，所述自动浸没介质模块在成像期间向物镜顶部的物镜浸没环提供受控体积的浸没介质；(d)一个多孔板，其中，可通过移动电动载物台将多孔板的孔定位到用于成像的物镜下方；(e)一个流体耦合塔，其中，所述流体耦合塔位于电动载物台顶部，将流体管线定位到多孔板的孔中；(f)一个流体管理模块，包括：一个对称旋转阀，包括一个旋转阀机构；一个泵，其中，所述泵与流体管线连接；以及多个气泡检测器，其中，所述气泡检测器位于通向泵的流体管线的任一侧，其中，所述流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过流体管线单向或双向流动；(g)一个试剂、缓冲液和废液模块，包括：i)一个滑动托盘，其中，可将试剂盒和缓冲液盒定位到滑动托盘中并与流体管理模块耦合；ii)一个废液模块，包括一个废液容器，其中，所述废液容器与来自流体管理泵的流体管线耦合；以及iii)一个加盖机构，其中，所述加盖机构在从系统中移除废液容器以进行废液废弃处置时关闭废液容器，在将废液容器放回到系统中时打开废液容器；(h)一个电气模块，包括：i)一个第一固件板，控制自动浸没介质模块的介质分配；以及ii)一个第二固件板，控制流体管理模块以及试剂、缓冲液和废液模块，其中，所述电气模块调节向系统的其他模块供应的电力；以及(i)一个处理器，经过编程可提供用户界面并操作测序设备的各个模块。
在某些实施例中，所述多条激光线包括至少4条激光线。在某些实施例中，所述多条激光线包括至少5条激光线。在一些实施例中，所述带通发射滤光片是五带通发射滤光片。
在某些实施例中，所述电动载物台具有压电z轴。
在某些实施例中，所述浸没介质是水。
在某些实施例中，所述浸没介质经过过滤且不含气泡。
在某些实施例中，所述测序设备进一步包括每个物镜上的O形环以及收缩包装涂层。
在某些实施例中，所述测序设备进一步包括一个监测流体管线中压力的压力监测器，其中，可利用流体管线中压力的增加，检测流体管线的潜在堵塞。
在某些实施例中，所述测序设备进一步包括多个发光二极管(LED)，其中，每个LED可通过发光提供系统的状态指示。
在某些实施例中，所述测序设备进一步包括一个用于显示信息并提供用户界面的显示部件。
在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：(a)将选定样本定位到多孔板中；(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；(e)显示步骤(d)中产生的图像；(f)向用户提供界面，以便用户细化对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；(h)计算样本中目标区域的体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。
在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
在某些实施例中，所述测序是组织样本中靶核酸的原位测序。在一些实施例中，所述组织样本是厚度为50-200μm的厚组织切片。在其他实施例中，所述组织样本是厚度为5-20μm的薄组织切片。在一些实施例中，所述原位测序是顺序或组合原位测序。
在另一方面，本发明提供了一种使用本发明所述测序设备的方法，包括：将样本装入多孔板中；选择多孔板中需测序的样本；选择测序方案；以及使用本发明所述的测序设备对选定样本中的核酸进行测序。在某些实施例中，所述测序是组织样本中靶核酸的原位测序。在一些实施例中，所述组织样本是厚度为50-200μm的厚组织切片。在其他实施例中，所述组织样本是厚度为5-20μm的薄组织切片。在一些实施例中，所述原位测序是顺序或组合原位测序。
在另一方面，本发明提供了一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：(a)将选定样本定位到多孔板中；(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；(e)显示步骤(d)中产生的图像；(f)向用户提供界面，以便用户选择对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；(h)计算目标区域的样本体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
在另一方面，本发明提供了一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。在一些实施例中，所述计算机进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
在另一方面，本发明提供了一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
在另一方面，本发明提供了一种非暂态计算机可读介质，包括程序指令，其中，所述程序指令由计算机中的处理器执行时，使处理器执行本发明所述的任何计算机实现方法。
在另一方面，一种自动浸没介质模块包括：(a)一个容器，包含浸没介质；(b)多条流体管线，与容器以及显微镜模块物镜的物镜浸没环耦合，其中，所述流体管线将浸没介质引入和引出浸没物镜上的物镜浸没环，所述浸没环捕获多余的浸没介质；以及(c)一组泵，与流体管线和微控制器连接，其中，所述微控制器控制泵通过流体管线添加和移除浸没介质，其中，所述自动浸没介质模块在成像期间向物镜顶部的物镜浸没环提供受控体积的浸没介质。
在另一方面，本发明提供了一种使用所述自动浸没介质模块的方法，包括：使用所述自动浸没介质模块将浸没介质输送到与显微镜浸没物镜附接的物镜浸没环。
在另一方面，本发明提供了一种流体管理模块，包括：一个对称旋转阀，包括一个旋转阀机构；一个泵，其中，所述泵与流体管线连接；以及多个气泡检测器，其中，所述气泡检测器位于通向泵的流体管线的任一侧，其中，所述流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过流体管线双向或单向流动。
在另一方面，本发明提供了一种试剂、缓冲液和废液模块，包括：(a)一个滑动托盘，其中，可将试剂盒和缓冲液盒定位到滑动托盘中并与流体管理模块耦合；(b)一个废液模块，包括一个废液容器，其中，所述废液容器与来自流体管理泵的流体管线耦合；以及(c)一个加盖机构，其中，所述加盖机构在从系统中移除废液容器以进行废液废弃处置时关闭废液容器，在将废液容器放回到系统中时打开废液容器。
附图说明
图1显示了包括各种模块的测序设备。
图2显示了能够在宽场和共聚焦模式下进行双重成像的双摄像机。
图3显示了覆盖405nm、488nm、561nm、637nm和730nm的5条激光线以及光束调节单元。
图4显示了显微镜部件图。
图5显示了带4×、20×、40×和60×物镜的六位置转换器。如图所示，40×和60×物镜上设有水环。
图6显示了用于24孔多孔板的手动流体耦合系统。
图7显示了在具有转换器和压电Z的XY电动载物台顶部设有多孔板的流体耦合系统。
图8显示了自动流体输送系统。
图9显示了自动流体输送系统部件图。
图10显示了提供振动隔离的定制工作台顶部的光敏样本保护罩。如图所示，工作台顶部下方的搁板上设有带盖板的5条激光线、光束调节单元以及配备高数据通量成像处理器的工作站。还显示了与工作台连接的4K显示部件。
图11显示了自动流体输送系统的面板端口。
图12显示了测序设备模块化零件的组装。
图13从不同角度显示了与现有成像装置耦合的独立流体模块的示意图，包括1)显微镜及工作台、2)多孔板和3)测序仪。
图14显示多孔板和盖板的示意图。
图15显示了多孔板的示意图，其中，多条流体管线与多孔板连接并插入多孔板的一些选定孔中。
图16显示了多孔板的示意图，其中，多条流体管线与多孔板连接并插入多孔板的所有孔中。
图17显示了在孔上方设有盖板的多孔板。对于多孔板的每个孔，所述盖板包括用于流体管线的支架，所述支架引导流体管线插入孔上方盖板的孔洞中。
图18从不同角度显示了1)显微镜及工作台、2)有盖多孔板和3)测序仪的示意图，其中，所述多孔板与测序仪连接或断开。
图19显示了紧凑型自动流体输送系统的设计。
图20显示了紧凑型自动流体输送系统的设计。
图21显示缓冲液和试剂托盘的设计。
图22显示了缓冲液托盘的设计，包含用于缓冲液密封瓶的托架和用于跟踪的RFID标签。
图23显示了缓冲液托盘的替代设计。上图显示了带各种缓冲液保护盖的缓冲液托盘。下图显示了设计用于容纳缓冲液密封瓶的缓冲液托盘。
图24显示了试剂托盘的设计，包含用于Eppendorf管的托架、密封件和用于跟踪的RFID标签。
图25显示了用于试剂加注验证的称重站、用于将试剂耗材固定在秤上的夹具以及加注歧管。
图26显示了缓冲液加注站。
图27显示了物镜，其中，40×和60×物镜上设有套环。
图28显示了向40×和60×物镜上套环提供流体的流体图。
图29显示了进液环。60×物镜具有1个O形环，40×物镜具有2个O形环。
图30显示了显微镜与浸没水分配器的连接。
图31显示了与Nikon Ti2e显微镜配合使用的浸没水分配器与40×和60×物镜的连接。
图32显示了工作台顶部光敏样本保护罩及其下方工作站搁板和与工作台附接的显示部件的示意图。
图33显示了工作台顶部光敏样本保护罩及其下方工作站搁板和工作台上显示部件的示意图。
图34显示了自动流体输送系统的流体图，包括流体管线与试剂托盘、缓冲液托盘、蠕动泵、电动旋转阀、压力传感器和气泡检测器的连接。
图35显示了流体图，包括与流体管线连接的一组泵以及与浸没介质模块及40×和60×显微镜物镜的连接。
图36显示了流体图，包括与注射泵、电动旋转阀和多孔板的连接。
图37显示了抽吸双阀示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种对体积组织样本进行自动原位测序的测序仪。具体地，本发明提供了一种能够并行处理多个样本的自动体积原位测序设备。本发明还提供了所述测序仪的制作和使用方法。
在说明所述对体积组织样本进行自动原位测序的测序仪以及此类测序仪的制作和使用方法之前，应理解，本发明不限于所述特定设备、方法或组合物，当然，也可能有所不同。还应理解，由于本发明的范围仅受所附权利要求的限制，所以本发明中的术语仅用于描述特定实施例，而非旨在限制本发明的范围。
在提供数值范围的情况下，应理解，本发明具体公开了此范围上限与下限之间的每个居中值(除非上下文另有明确规定，否则精确到下限单位的十分之一)。在所述范围内的任何所述值或居中值与在所述范围内的任何其他所述值或居中值之间的每个较小范围均包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立包括在该范围内或排除在该范围外，并且在较小范围内包括任何一个限值、两个限值或两个限值都不包括的每个范围也包含在本发明中，但受规定范围内任何具体排除限值的限制。如果标注的范围包括一个或两个限值，本发明还包括排除这些任一或两个限值的范围。
除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但一些潜在和优选的方法和材料如下所述。本发明提及的所有出版物通过引用成为本发明的一部分，用于公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。应理解，本公开与其所含出版物的任何公开内容如有矛盾，以本公开为准。
在阅读本公开后，本领域技术人员可明显看出，本发明所述和所示的各个实施例具有离散的组成部分和特征，在不偏离本发明的范围或精神的情况下，这些组成部分和特征可以很容易与其他多个实施例中任一实施例的特征分离或组合。可以按照所列事件的顺序或按逻辑上可行的任何其他顺序实施所列举的任何方法。
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则本发明和所附权利要求中使用的单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”也包括复数指称对象。因此，例如，用语“一种细胞”也包括多种此类细胞，用语“所述肽”包括本领域技术人员已知的一种或多种肽及其等同物，例如寡肽或多肽，以此类推。
本发明所讨论的出版物仅供在本申请递交日期之前公开之用。本发明的任何内容均不应解释为承认由于先前的发明，本发明无权先于此类出版物出版。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，后者可能需要单独确认。
定义
术语“约”，特别是涉及给定数量时，旨在涵盖正或负百分之五的偏差。
术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白”在本发明中可互换使用，系指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物；以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。该定义涵盖全长蛋白及其片段。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如磷酸化、糖基化、乙酰化、羟基化、氧化等，以及化学或生物化学修饰或衍生氨基酸和具有修饰肽主链的多肽。该术语还包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白(具有或不具有N端甲硫氨酸残基)；免疫标记蛋白；等等。该术语包括包含脂肪酸部分、脂质部分、糖部分和碳水化合物部分中一个或多个部分的多肽。
本发明所用术语“靶核酸”系指任何存在于单个细胞中的多核苷酸核酸分子(例如DNA分子；RNA分子、修饰核酸等)。在一些实施例中，所述靶核酸是编码RNA(例如mRNA)。在一些实施例中，所述靶核酸是非编码RNA(例如tRNA、rRNA、微RNA(miRNA)、成熟miRNA、未成熟miRNA；等等)。在一些实施例中，所述靶核酸是细胞环境中RNA分子(例如mRNA、前体mRNA等)的剪接变体。因此，合适的靶核酸可以是未剪接RNA(例如前体mRNA、mRNA)、部分剪接RNA或完全剪接RNA等。目标靶核酸在细胞群内可能表达各异，即具有不同的丰度，其中，通过本发明所述的方法，可以分析和比较单个细胞中核酸(包括但不限于RNA转录本)的表达水平。靶核酸还可以是DNA分子，例如变性基因组、病毒、质粒等。例如，可采用所述方法检测癌细胞群(其中靶核酸以不同丰度存在于该群体内细胞基因组中)以及被病毒感染的细胞中的拷贝数变异，从而确定病毒载量和动力学等。
术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸分子”在本发明中可互换使用，系指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包括糖和磷酸基团(可能通常存在于RNA或DNA中)，或者修饰或取代糖或磷酸基团。可替代地，多核苷酸的主链可包括合成亚基的聚合物，例如亚磷酰胺和/或硫代磷酸酯，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯或混合氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。Peyrottes等人(1996)《核酸研究》24:1841-1848；Chaturvedi等人(1996)《核酸研究》24:2318-2323。多核苷酸可包含一个或多个L-核苷。多核苷酸可包括修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿酰基及其他糖，以及连接基团(例如氟代核糖和硫代酸酯)和核苷酸分支。非核苷酸组分可中断核苷酸序列。多核苷酸经修饰可包含N3'-P5'(NP)氨基磷酸酯、吗啉代氨基磷酸酯(MF)、锁核酸(LNA)、2'-O-甲氧基乙基(MOE)或2'-氟代阿拉伯糖核酸(FANA)，这些组分可增强多核苷酸对核酸酶降解的抗性(例如，参见：Faria等人(2001)《自然生物技术》19:40-44；Toulme(2001)《自然生物技术》19:17-18)。多核苷酸可通过与标记组分缀合等方式在聚合后得到进一步修饰。该定义还包括以下其他类型的修饰：采用帽状结构；用类似物取代一个或多个天然核苷酸；以及引入使多核苷酸附着于蛋白、金属离子、标记组分及其他多核苷酸或固相支持体的手段。根据本发明中更详细的描述，可通过与脂质体结合、微囊化等方式以各种制剂提供免疫调节核酸分子。用于扩增的多核苷酸通常为单链形式，以便实现最大扩增效率，但也可以为双链形式。对于双链多核苷酸，可在使用其制备延伸产物前进行链分离处理。这一变性步骤通常会受热量影响，但也可以先用碱处理，再进行中和。
提及蛋白、多肽或肽时，“分离”系指所提及的分子与自然界中发现该分子的整个生物体分离和离散，或者存在于其他同类生物大分子基本上不存在的情况。就多核苷酸而言，术语“分离”系指核酸分子完全或部分缺乏自然界中通常与之相关的序列；或缺乏自然界中存在的序列，但具有与之相关的异源序列；或指分子与染色体无关。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本发明中可互换使用，系指无脊椎动物和脊椎动物，包括但不限于节肢动物(例如昆虫、甲壳纲动物、蛛形纲动物)、头足类动物(例如章鱼、鱿鱼)、两栖动物(例如蛙、蝾螈、蚓螈)、鱼、爬行动物(例如龟、鳄目动物、蛇、蚓蜥、蜥蜴、大蜥蜴)、哺乳动物，包括人类和非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物，包括黑猩猩及其他猿类和猴类；实验动物，例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠和毛丝鼠；家养动物，例如狗和猫；农场动物，例如绵羊、山羊、猪、马和牛；以及鸟类，例如家禽、野禽和猎禽，包括鸡、火鸡及其他鹑鸡类、鸭和鹅。在一些情况下，本发明所述的方法可用于实验动物、兽医应用以及疾病动物模型的开发，包括但不限于啮齿动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；灵长类动物和转基因动物。
本发明所用术语“用户”系指通过与本发明公开的设备和/或系统交互来进行本发明所公开方法中一个或多个步骤的人员。用户可以是使用本发明所述测序设备的受试者。
测序设备
本发明提供了一种对体积组织样本进行自动原位测序的测序仪。具体地，本发明提供了一种能够并行处理多个样本的自动体积原位测序设备。在一些实施例中，所述测序设备包括一个照明和检测模块、一个显微镜模块、一个自动浸没介质模块、一个多孔板、一个流体耦合塔或独立流体模块、一个流体管理模块、一个试剂、缓冲液和废液模块、一个电气模块以及一个处理器。
在一些实施例中，所述照明和检测模块包括：一个转盘共聚焦部件，包括通过平面照明校正进行照明的多条激光线，其中，所述多条激光线用于以一个或多个波长的激发光照亮样本；一个带通发射滤光片；一个长通图像分割器；一个第一摄像机，在第一波长范围内检测荧光发射；以及一个第二摄像机，在第二波长范围内检测荧光发射，其中，所述第一摄像机和第二摄像机可同时检测发射。在某些实施例中，所述多条激光线包括至少4条激光线。在一些实施例中，所述多条激光线包括5条与五带通发射滤光片配合使用的激光线。在某些实施例中，所述电动载物台具有压电z轴。在其他实施例中，使用物镜z轴驱动器并保持电动载物台z不变。
所述显微镜模块包括：一个电动载物台，能够沿x、y和z轴进行多轴定位；一个物镜Z驱动器；一个物镜转轮，包括多个物镜，其中，每个物镜提供不同的放大率；以及多个光学器件，其中，所述光学器件将光从物镜引导到所述照明和检测模块。所述物镜可包括浸没物镜，其中，每个浸没物镜具有物镜浸没环。在某些实施例中，所述浸没物镜进一步包括每个物镜上的O形环以及收缩包装涂层，以防溢出物损坏显微镜的光学器件或机械零件等。所述物镜还可包括不带浸没环的干物镜。在一些实施例中，所述显微镜模块包括一个共聚焦显微镜。在一些实施例中，所述显微镜模块包括一个落射荧光显微镜。
所述自动浸没介质模块包括：i)一个容器，包含浸没介质；ii)多条流体管线，与容器以及显微镜模块物镜的物镜浸没环耦合，其中，所述流体管线将浸没介质引入和引出物镜浸没环，其中，所述浸没环捕获多余的浸没介质；以及iii)一组泵，与流体管线和微控制器连接，其中，所述微控制器控制泵通过流体管线添加和移除浸没介质，其中，所述自动浸没介质模块在成像期间向物镜顶部的物镜浸没环提供受控体积的浸没介质。在某些实施例中，所述浸没介质是水。在某些实施例中，所述浸没介质经过过滤且不含气泡。
可通过移动电动载物台将多孔板的孔定位到用于成像的物镜下方。在一些实施例中，所述流体耦合塔位于电动载物台顶部，将流体管线定位到多孔板的孔中，以便通过流体管线添加和移除孔中的样本。在一些实施例中，未将流体耦合接口附接到电动载物台，而是采用由用户手动放置在样本板上方并固定到载物台的独立流体耦合接口模块，其中，所述流体耦合接口在测序期间将流体管线与样本耦合。
所述流体管理模块包括：一个对称旋转阀，包括一个旋转阀机构；一个泵，其中，所述泵与流体管线连接；以及多个气泡检测器，其中，所述气泡检测器位于通向泵的流体管线的任一侧，其中，所述流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过流体管线单向或双向流动。可使用一组气泡检测器确保浸没流体管线不含气泡。此外，可通过以下方式避免气泡：加入一定体积的流体，去除多余的流体，然后加入更多流体，并将载物台移动到孔边缘，再移回样本中心，从而去除在浸没流体添加期间可能形成的任何附加气泡。
所述试剂、缓冲液和废液模块包括：i)一个滑动托盘，其中，可将试剂盒和缓冲液盒定位到滑动托盘中并与流体管理模块耦合；ii)一个废液模块，包括一个废液容器，其中，所述废液容器与来自流体管理泵的流体管线耦合；以及iii)一个加盖机构，其中，所述加盖机构在从系统中移除废液容器以进行废液废弃处置时关闭废液容器，在将废液容器放回到系统中时打开废液容器。
所述电气模块包括：i)一个第一固件板，控制自动浸没介质模块的介质分配；以及ii)一个第二固件板，控制流体管理模块以及试剂、缓冲液和废液模块，其中，所述电气模块调节向系统的其他模块供应的电力。
在某些实施例中，所述测序设备进一步包括一个监测流体管线中压力的压力监测器，其中，可利用流体管线中压力的增加，检测流体管线的潜在堵塞。
在某些实施例中，所述测序设备进一步包括多个发光二极管(LED)，其中，每个LED可通过发光提供系统的状态指示。
在某些实施例中，所述测序设备包括一个经过编程可提供用户界面并操作测序设备模块的处理器。在一些实施例中，所述测序设备进一步包括一个用于显示信息并提供用户界面的显示部件。
在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：(a)将选定样本定位到多孔板中；(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；(e)显示步骤(d)中产生的图像；(f)向用户提供界面，以便用户细化对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；(h)计算样本中目标区域的体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
在某些实施例中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦或落射荧光扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
在某些实施例中，所述测序是组织样本中靶核酸的原位测序。在一些实施例中，所述组织样本是厚度为50-200μm的厚组织切片。在其他实施例中，所述组织样本是厚度为5-20μm的薄组织切片。在一些实施例中，所述原位测序是顺序或组合原位测序。
测序仪部件的模块化使用
在一些实施例中，所述流体部件可作为独立测序模块，与任何兼容成像系统配合使用。通向样本的流体管线可与样本板和显微镜载物台磁性和/或机械耦合，使耦合件可轻松附接到接合位置和从该位置拆除，并使流体部件与样本孔耦合。在所述耦合件的一个实例中，将通向每个样本孔的流体管线捆绑在一起，并利用通过机械导轨和磁性夹具与显微镜载物台耦合的可拆卸式板盖(参见示意图)引导到每个样本孔。在所述耦合件的另一实施例中，将模块化耦合塔固定到显微镜载物台。用作独立测序模块时，流体部件促进试剂和缓冲液套件的使用，以及多个流体添加和移除循环内多个样本孔中流体交换的自动化。用作原位测序设备时，流体部件可与样本形式兼容的现有显微装置耦合，例如倒置显微镜。与薄切片样本(5-20μm)配合使用时，显微镜可以是具有3条、4条或5条照明或检测通道的落射荧光显微镜。与薄或厚切片样本配合使用时，显微镜可以是落射荧光显微镜、共聚焦显微镜(转盘或点扫描)、结构照明显微镜或光片或斜面光片显微镜。
浸没水分配模块(IWD)可用作测序仪集成流体系统的子模块。可替代地，该模块可作为独立套件，用于显微镜浸没物镜的自动浸没。在一个实例中，所述模块与试剂/缓冲液/耗材流体模块串联使用，在单独现有显微镜装置上实现样本的并行和自动测序。在该实例中，所述浸没流体储液器和浸没流体废液处于流体设备的外部，因此用户可以手动填充浸没流体储液器和清空废液储液器。浸没水分配模块通过浸没环与显微镜物镜连接，浸没环设计用于使浸没液体流过物镜的成像玻璃而不会产生气泡，并提供精确、一致的液体体积和流速，同时实现与物镜主体的紧密密封，以便去除多余的液体。浸没环的确切尺寸经调整可与特定的物镜相匹配，以确保配合适当，但其他浸没水分配模块子部件的功能与成像系统的制作和生产无关。
控制测序仪的软件为控制照明、检测、显微镜和载物台部件提供了抽象层，因此只要具有适当的配置文件或其他硬件插件，即可模块化地与各种成像装置配合使用。因此，特定成像和显微装置在测序仪的操作方面并无特殊之处，软件、物镜浸没模块、样本、试剂和缓冲液流体及耗材可得到模块化应用并重新配置为一种或多种部件组合。
在一些实施例中，所述试剂和缓冲液流体部件从可重复使用的储液器中抽取流体。在所述测序仪的另一实施例中，所述试剂和缓冲液流体部件从耗材储液器中抽取流体。在一个实例中，加注后将耗材储液器密封，使试剂/缓冲液流体模块的吸管针刺穿密封件。在一个实例中，组装耗材时机械支撑密封件，以确保密封件被贯穿并避免施加到吸管针上的力过大或力未与吸管针的平行轴对齐。通常在每次开始使用测序仪时更换耗材储液器，并且通过检测耗材的标识程序化地跟踪其使用情况。在一个实例中，使用集成到耗材中的RFID和测序仪流体模块中的RFID读取器进行耗材检测。在另一实施例中，使用耗材上的条形码和集成到测序仪流体模块中的条形码扫描仪进行耗材检测。
在另一实施例中，所述流体模块抽取原位测序循环中使用的缓冲液和试剂。在所述流体模块的一个实例中，由制冷部件冷却部分或全部缓冲液或试剂。在所述流体模块的一些实施例中，部分或全部缓冲液或试剂对温度敏感，例如连接酶等酶，或者参与SCAL、SEDAL或SEDAL2测序化学反应的ATP等分子。在另一实施例中，所述缓冲液和试剂流体模块抽取用于其他测序或循环标记化学反应的液体，例如，用于与样本中序列杂交的低聚物，或用于检测样本中杂交事件的荧光标记低聚物。在另一实施例中，所述缓冲液和试剂流体模块抽取用于以染料标记样本的液体。在另一实施例中，所述缓冲液和试剂流体模块抽取用于与样本进行CLICK化学反应的液体。在另一实施例中，所述缓冲液和试剂流体模块抽取用于淬灭样本中荧光信号的液体。在另一实施例中，所述缓冲液和试剂流体模块抽取包含添加或去除样本中信号的酶组分的流体。
计算机实现方法
本公开提供了可用于使用本发明所述测序设备的系统和计算机实现方法。在某些实施例中，所述测序设备包括一个经过编程可提供用户界面并操作测序设备模块的处理器。在一些实施例中，所述测序设备进一步包括一个用于显示信息并提供用户界面的显示部件。所述系统还可包括一个或多个用于处理组织图像的图形信息并将其输出到显示部件的图形板。
在一些实施例中，所述计算机实现方法用于在用户与测序仪固件和硬件之间提供界面，以便进行测序运行设置，选择测序运行选项，选择和界定样本目标区域(ROI)，等等。所述计算机实现方法可用于控制测序设备的不同模块以及样本间测序的并行化，并进行日志记录、误差监测、数据采集、管理和传输以及运行进度监测。
在一个实施例中，本发明提供了一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：(a)将选定样本定位到多孔板中；(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；(e)显示步骤(d)中产生的图像；(f)向用户提供界面，以便用户选择对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；(h)计算目标区域的样本体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
在另一实施例中，本发明提供了一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。在一些实施例中，所述计算机进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
在另一实施例中，本发明提供了一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
可在数字电子电路中或者在计算机软件、固件或硬件中实现所述方法。所公开的及其他实施例可实现为计算机可读介质上经编码供数据处理装置执行或控制该装置运行的一个或多个计算机程序产品，即一个或多个计算机程序指令模块。所述计算机可读介质可以是机器可读存储设备、机器可读存储基板、记忆设备、影响机器可读传播信号的物质的组合物或其任何组合。
计算机程序(也称为程序、软件、软件应用程序、脚本或代码)可由任何形式的编程语言(包括编译或解释语言)编写而成，并且可部署为任何形式，包括独立程序，或者模块、部件、子例程或其他适用于计算环境的单元。计算机程序不必与文件系统中的文件相对应。某个程序可存储在保存其他程序或数据的文件的一部分(例如标记语言文档中存储的一个或多个脚本)中、专用于所述程序的单个文件中或多个协调文件(例如存储一个或多个模块、子程序或代码部分的文件)中。计算机程序可部署为在一台计算机上执行，或者在位于一个站点或分布于多个站点并通过通信网络互连的多台计算机上执行。
在又一方面，用于执行所述计算机实现方法的系统可包括一个处理器、一个存储部件(即存储器)、一个显示部件以及通用计算机中常见的其他部件。所述存储部件存储处理器可访问的信息，包括处理器可执行的指令以及可检索、操纵或存储的数据。
所述存储部件包含指令。例如，如本发明所述，所述存储部件可包含用于提供测序设备用户界面、操作测序设备和处理原位测序成像数据的指令。如本发明所述，所述计算机处理器与存储部件耦合，可执行存储部件中存储的指令，从而接收原位测序成像数据并根据一种或多种算法分析数据。所述显示部件显示信息并提供用户界面。
所述存储部件可以是任何能够存储处理器可访问信息的类型，例如硬盘、存储卡、ROM、RAM、DVD、CD-ROM、USB闪存盘、可写和只读存储器。所述处理器可以是任何众所周知的处理器，例如来自英特尔公司的处理器。可替代地，所述处理器可以是专用控制器，例如ASIC。
在某些实施例中，将原位测序成像数据上传并存储到云数据存储系统中。在一些实施例中，所述云数据存储系统是公共云存储系统。在其他实施例中，所述云数据存储系统是私有云存储系统。云数据存储空间可用于存储原始图像、中间处理文件和最终数据产品。处理可从数据采集系统将数据集上传到云存储空间中开始。编码方案、码本、图像采集参数和样本元数据等配置参数可由用户通过数据管理网络界面输入，或者由随测序数据一同上传到云存储空间中的配置文件自动生成。各个配置参数集存储在云数据库中。在一些情况下，可对单个数据集使用不同配置参数，通过多次处理运行，优化处理参数。
所述指令可以是任何由处理器直接(例如机器代码)或间接(例如脚本)执行的指令集。对此，术语“指令”、“步骤”和“程序”在本发明中可互换使用。所述指令可存储为供处理器直接处理的目标代码形式，或者以任何其他计算机语言存储，包括按需解释或提前编译的脚本或独立源代码模块集合。
可由处理器根据指令检索、存储或修改数据。例如，数据可存储在计算机寄存器中，也可存储在关系数据库中，作为具有多个不同字段和记录的表格、XML文档或平面文件，但系统不受任何特定数据结构的限制。数据还可格式化为任何计算机可读格式，例如但不限于二进制值、ASCII或Unicode。另外，数据可包括任何足以识别相关信息的信息，例如数字、描述性文本、专有代码、指针、其他存储器中(包括其他网络位置)所存储数据的引用或用于通过函数计算相关数据的信息。
在某些实施例中，所述处理器和存储部件可包括多个可存储或不存储在同一物理外壳内的处理器和存储部件。例如，一些指令和数据可存储在可移动CD-ROM上，而其他指令和数据可存储在只读计算机芯片内。部分或全部指令和数据可存储在物理上远离处理器但处理器仍可访问的位置。同理，所述处理器可包括可并行或不并行工作的处理器的集合。
在一些实施例中，可由云计算系统执行所述方法。在一些实施例中，可将图像数据文件以及用于处理成像数据的编程导出到云计算机，由云计算机运行程序并向用户返回输出信息。所述方法可包括在传输前可选压缩成像数据，从而减小数据量并提高传输速度。在数据采集过程中，将采集到的图像与详细说明光学规格、载物台位置和测序信息的元数据文件相结合；可选压缩成像数据，该过程与成像采集分开进行；以及可选将采集到的数据卸载到远程云存储介质、网络附加存储系统或单独大型文件系统。
以下示例将进一步说明用于执行本发明所公开方法的系统部件。
原位基因测序
本发明公开的测序设备可用于完整组织内细胞中靶核酸的原位基因测序。一种进行原位测序的方法可包括：(a)在允许进行特异性杂交的条件下使用至少一对寡核苷酸引物接触固定透化完整组织，其中，所述引物对包括一个第一寡核苷酸和一个第二寡核苷酸；其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别包括一个第一互补区、一个第二互补区序列和一个第三互补区；其中，所述第二寡核苷酸进一步包括一个条形码序列；其中，所述第一寡核苷酸的第一互补区与靶核酸的第一部分互补，其中，所述第一寡核苷酸的第二互补区与第二寡核苷酸的第一互补区互补，其中，所述第一寡核苷酸的第三互补区与第二寡核苷酸的第三互补区互补，其中，所述第二寡核苷酸的第二互补区与靶核酸的第二部分互补，其中，所述靶核酸的第一部分与靶核酸的第二部分相邻；(b)加入连接酶以连接第二寡核苷酸并产生闭合核酸环；(c)在存在核酸分子的情况下实施滚环扩增，其中，所述实施过程包括使用第二寡核苷酸作为模板，使用第一寡核苷酸作为聚合酶的引物，形成一个或多个扩增子；(d)在水凝胶亚基存在的情况下嵌入一个或多个扩增子，形成一个或多个水凝胶嵌入式扩增子；(e)在允许进行连接的条件下使用测序引物集接触具有条形码序列的一个或多个水凝胶嵌入式扩增子，其中，所述测序引物集包括一个可解码碱基的第三寡核苷酸和一个可将经解码碱基转化为信号的第四寡核苷酸，其中，仅当第三寡核苷酸和第四寡核苷酸与同一扩增子的相邻序列互补时，所述连接才会发生；(f)重复步骤(e)；以及(g)使用本发明所述的测序设备对一个或多个水凝胶嵌入式扩增子进行成像，从而确定完整组织内细胞中靶核酸的基因序列。
在一些实施例中，采用通过动态退火和连接校正误差的测序方法(SEDAL)进行原位测序，从而确定靶核酸的序列。SEDAL方法包括在允许进行连接的条件下使用一对引物接触具有条形码序列的一个或多个水凝胶嵌入式扩增子，其中，所述引物对包括一个第三寡核苷酸和一个第四寡核苷酸，其中，仅当第三寡核苷酸和第四寡核苷酸与同一扩增子连接时，所述连接才会发生。在一些实施例中，SEDAL与STARmap配合使用。在此类实施例中，本发明所述的方法包括在室温下进行操作，以便最佳地保持组织形态，同时降低背景噪声并减小误差。在此类其他实施例中，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤包括避免误差随着测序的进行而累积。
在一些实施例中，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤发生两次或以上，例如，包括但不限于三次或以上、四次或以上、五次或以上、六次或以上或者七次或以上。在某些实施例中，对于薄组织试样，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤发生四次或以上。在其他实施例中，对于厚组织试样，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤发生六次或以上。在一些实施例中，可使用一对引物接触一个或多个扩增子24小时或以上、24小时或以下、18小时或以下、12小时或以下、8小时或以下、6小时或以下、4小时或以下、2小时或以下、60分钟或以下、45分钟或以下、30分钟或以下、25分钟或以下、20分钟或以下、15分钟或以下、10分钟或以下、5分钟或以下或者2分钟或以下。
可通过多种不同显微术类型中的任何一种，例如光学显微术(例如明场、斜照、暗场、相差、微分干涉相差、干涉反射、落射荧光、共聚焦等显微术)、激光显微术、电子显微术和扫描探针显微术，分析采用主题方法制备的试样。在一些方面，非暂态计算机可读介质先将通过对多轮原位测序实行显微术而采集到的原始图像转换成经解码的基因标识和空间位置，再分析每个细胞的基因表达组成。
SEDAL寡核苷酸引物
在一些实施例中，所公开的方法包括一个第三寡核苷酸和一个第四寡核苷酸。在某些方面，所述第三寡核苷酸配置为解码碱基，所述第四寡核苷酸配置为将经解码碱基转化为信号。在一些方面，所述信号是荧光信号。在示例性方面，所述在允许进行连接的条件下使用一对引物接触具有条形码序列的一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤涉及仅在完全匹配的情况下，第三寡核苷酸和第四寡核苷酸分别连接，形成用于成像的稳定产物。在某些方面，利用连接酶的错配敏感性，确定靶核酸分子的基本序列。
涉及双链体时，术语“完全匹配”系指构成双链体的多核苷酸和/或寡核苷酸链彼此配合，形成双链结构，使每条链中的每个核苷酸均与另一条链中的核苷酸进行沃森-克里克碱基配对。术语“双链体”包括但不限于脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷、肽核酸(PNA)等可用核苷类似物的配对。双链体中两个寡核苷酸之间的“错配”系指双链体中的一对核苷酸无法进行沃森-克里克键合。
在一些实施例中，所述方法包括多个与靶核苷酸序列杂交的第三寡核苷酸，包括但不限于5个或更多(例如8个或更多、10个或更多、12个或更多、15个或更多、18个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多)第三寡核苷酸。在一些实施例中，本公开所述的方法包括多个与15个或更多(例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个)不同靶核苷酸序列杂交的第三寡核苷酸，包括但不限于15个或更多第三寡核苷酸，例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个不同第三寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括多个第四寡核苷酸，包括但不限于5个或更多(例如8个或更多、10个或更多、12个或更多、15个或更多、18个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多)第四寡核苷酸。在一些实施例中，本公开所述的方法包括多个与15个或更多(例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个)不同靶核苷酸序列杂交的第四寡核苷酸，包括但不限于15个或更多第四寡核苷酸，例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个不同第四寡核苷酸。可使用多个寡核苷酸对进行反应，其中一对或多对与每个靶核酸特异性结合。例如，为了提高灵敏度并减少可变性，可针对一个靶核酸使用两个引物对。细胞中多个不同靶核酸的检测也值得关注，例如，检测至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多12个、至多15个、至多18个、至多20个、至多25个、至多30个、至多40个或更多不同靶核酸。
在某些实施例中，SEDAL涉及因碱基错配而活性受损的连接酶、第三寡核苷酸和第四寡核苷酸。在此情况下，术语“受损”系指连接酶的活性降低约20％或以上，例如25％或以上、50％或以上、75％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上、100％。在一些实施例中，所述第三寡核苷酸的长度为5-15个核苷酸，包括但不限于5-13个核苷酸、5-10个核苷酸或5-8个核苷酸。在一些实施例中，所述第三寡核苷酸的Tm处于室温(22-25℃)下。在一些实施例中，所述第三寡核苷酸简并或部分简并。在一些实施例中，所述第四寡核苷酸的长度为5-15个核苷酸，包括但不限于5-13个核苷酸、5-10个核苷酸或5-8个核苷酸。在一些实施例中，所述第四寡核苷酸的Tm处于室温(22-25℃)下。在碱基读段所对应的每个SEDAL循环后，可剥离第四寡核苷酸，从而避免误差随着测序的进行而累积。在此类实施例中，使用甲酰胺剥离第四寡核苷酸。
在一些实施例中，SEDAL涉及洗涤第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，以去除未结合的寡核苷酸，此后露出用于成像的荧光产物。在某些示例性实施例中，可使用可检测的标记，检测本发明所述的一个或多个核苷酸和/或寡核苷酸。在某些实施例中，可使用可检测的标记，检测一个或多个扩增子。可检测标志物的示例包括各种放射性部分、酶、辅基、荧光标志物、发光标志物、生物发光标志物、金属颗粒、蛋白-蛋白结合对、蛋白-抗体结合对等。荧光蛋白的示例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白等。生物发光标志物的示例包括但不限于荧光素酶(例如细菌、萤火虫、叩头虫等)、萤光素、水母素等。具有视觉可检测信号的酶系统的示例包括但不限于半乳糖苷酶、葡糖醛酸苷酶、磷酸酶、过氧化物酶、胆碱酯酶等。可识别标志物还包括放射性化合物，例如125I、35S、14C或3H。可从市面上多种来源购得可识别标志物。
有关荧光标记及其与核苷酸和/或寡核苷酸的附着，参见众多文献，包括：Haugland，《荧光探针和研究化学品手册》，第九版(Molecular Probes,Inc.，尤金，2002)；Keller和Manak，《DNA探针》，第二版(Stockton出版社，纽约，1993)；Eckstein，编辑，《寡核苷酸及类似物：实用方法》(IRL出版社，牛津，1991)；以及Wetmur，《生物化学与分子生物学评论》，26:227-259(1991)。以下参考文献样本公开了适用于本发明的具体方法：第4,757,141号、第5,151,507号和第5,091,519号美国专利。在一个方面，使用一种或多种荧光染料作为标记，获得标记靶序列，例如，参见以下文献的公开内容：第5,188,934号美国专利(4,7-二氯荧光素染料)；第5,366,860号美国专利(光谱可分辨罗丹明染料)；第5,847,162号美国专利(4,7-二氯罗丹明染料)；第4,318,846号美国专利(醚取代荧光素染料)；第5,800,996号美国专利(能量转移染料)；Lee等人；第5,066,580号美国专利(黄嘌呤染料)；第5,688,648号美国专利(能量转移染料)；等等。还可使用量子点进行标记，参见以下专利及专利出版物的公开内容：第6,322,901号、第6,576,291号、第6,423,551号、第6,251,303号、第6,319,426号、第6,426,513号、第6,444,143号、第5,990,479号、第6,207,392号、第2002/0045045号和第2003/0017264号美国专利。本发明所用术语“荧光标记”包括通过一种或多种分子的荧光吸收和/或发射特性传递信息的信号传导部分。此类荧光特性包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特征、能量转移等。
易于掺入核苷酸和/或寡核苷酸序列中的市售荧光核苷酸类似物包括但不限于Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(Amersham Biosciences，新泽西州皮斯卡特维)、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、TEXAS REDTM-5-dUTP、CASCADE BLUETM-7-dUTP、BODIPY TMFL-14-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、BODIPY TMTR-14-dUTP、RHODAMINE GREENTM-5-dUTP、OREGON GREENRTM488-5-dUTP、TEXAS REDTM-12-dUTP、BODIPYTM630/650-14-dUTP、BODIPYTM650/665-14-dUTP、ALEXA FLUORTM488-5-dUTP、ALEXA FLUORTM532-5-dUTP、ALEXAFLUORTM568-5-dUTP、ALEXA FLUORTM594-5-dUTP、ALEXA FLUORTM546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、TEXAS REDTM-5-UTP、mCherry、CASCADE BLUETM-7-UTP、BODIPYTMFL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、BODIPYTMTR-14-UTP、RHODAMINE GREENTM-5-UTP、ALEXA FLUORTM488-5-UTP、LEXA FLUORTM546-14-UTP(Molecular Probes,Inc.，俄勒冈州尤金)等。用于定制合成具有其他荧光团的核苷酸的方案为本领域所知(参见：Henegariu等人(2000)《自然生物技术》18:345)。
其他可用于合成后附着的荧光团包括但不限于ALEXA FLUORTM350、ALEXAFLUORTM532、ALEXA FLUORTM546、ALEXA FLUORTM568、ALEXA FLUORTM594、ALEXA FLUORTM647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、Dansyl、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 514、Pacific Blue、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、Texas Red(可购自：Molecular Probes,Inc.，俄勒冈州尤金)、Cy2、Cy3.5、Cy5.5、Cy7(Amersham Biosciences，新泽西州皮斯卡特维)等。还可使用FRET串联荧光团，包括但不限于PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、APC-Cy7、PE-Alexa染料(610、647、680)、APC-Alexa染料等。
可使用金属银或金颗粒增强来自荧光标记核苷酸和/或寡核苷酸序列的信号(Lakowicz等人(2003)《生物技术》34:62)。
还可使用生物素或其衍生物作为核苷酸和/或寡核苷酸序列上的标记，随后通过可检测标记亲和素/链霉亲和素衍生物(例如藻红蛋白缀合链霉亲和素)或可检测标记抗生物素抗体进行结合。可掺入地高辛作为标记，随后通过可检测标记抗地高辛(例如荧光素化抗地高辛)抗体进行结合。可将氨基烯丙基-dUTP残基掺入寡核苷酸序列中，随后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生荧光染料偶联。一般而言，可将缀合物对的任何成员掺入检测用寡核苷酸中，但前提是可检测标记缀合物配偶体可以结合以便进行检测。本发明所用术语“抗体”系指任何类别的抗体分子或其任何亚片段，例如Fab。
其他适用于寡核苷酸序列的标记可包括荧光素(FAM)、地高辛、二硝基苯酚(DNP)、丹磺酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六聚组氨酸(6×His)、磷酸氨基酸(例如P-tyr、P-ser、P-thr)等。在一个实施例中，使用以下半抗原/抗体对进行检测，其中每种抗体均经过可检测标记衍生化：生物素/α-生物素、地高辛/α-地高辛、二硝基苯酚(DNP)/α-DNP、5-羧基荧光素(FAM)/α-FAM。
在某些示例性实施例中，可间接标记核苷酸和/或寡核苷酸序列，尤其可先用半抗原标记，再通过捕获剂进行结合，例如，参见以下公开内容：第5,344,757号、第5,702,888号、第5,354,657号、第5,198,537号和第4,849,336号美国专利，以及第WO 91/17160号PCT出版物等。可使用许多不同的半抗原捕获剂对。示例性半抗原包括但不限于生物素、des-生物素及其他衍生物、二硝基苯酚、丹磺酰、荧光素、CY5、地高辛等。生物素的捕获剂可以是亲和素、链霉亲和素或抗体。抗体可用作其他半抗原的捕获剂(许多染料-抗体可从市面上购得，例如：Molecular Probes，俄勒冈州尤金)。
在一些实施例中，采用基于竞争性退火和连接的测序方法(SCAL)进行原位测序，从而确定靶核酸的序列。所述方法包括进行一个或多个测序循环，其中每个循环包括：(a)使用读段寡核苷酸和荧光标记解码探针集接触靶核酸，其中，所述读段寡核苷酸包括一个与靶核酸上读段序列互补的第一互补区，每个解码探针包括一个与靶核酸上探针结合位点互补的第二互补区；(b)将读段寡核苷酸与荧光标记解码探针集中的一个解码探针连接，产生荧光连接产物，其中，仅当读段寡核苷酸和解码探针与靶核酸上的相邻序列结合并且读段寡核苷酸和解码探针均具有与靶核酸序列完全互补的序列时，所述连接才会发生；(c)去除未连接的探针；(d)对荧光连接产物进行成像，以检测与读段寡核苷酸连接的解码探针的荧光标记，其中，所述荧光标记标识靶核酸序列的核苷酸；以及(e)通过将竞争寡核苷酸与靶核酸结合，去除靶核酸中的荧光连接产物，其中，所述竞争寡核苷酸包括一个第三互补区，所述第三互补区包括一个与靶核酸上读段序列互补的序列，所述荧光连接产物从靶核酸中解离出来。
在示例性方面，所述连接涉及仅在完全匹配的情况下，读段寡核苷酸和荧光标记解码探针分别连接，形成用于成像的稳定产物。在某些方面，利用连接酶的错配敏感性，确定靶核酸分子的基本序列。通过向测序连接混合物中加入聚乙二醇(PEG)聚合物，可以显著加快靶核酸上信号的增加。示例性PEG聚合物的分子量为300g/mol-10,000,000g/mol。在一些实施例中，在读段寡核苷酸和荧光标记解码探针连接期间存在PEG 6000聚合物。
在某些实施例中，所述荧光标记解码探针集包括：一个编码鸟嘌呤的第一探针，其中，所述第一探针包括一个第一荧光标记；一个编码腺嘌呤的第二探针，其中，所述第二探针包括一个第二荧光标记；一个编码胞嘧啶的第三探针，其中，所述第三探针包括一个第三荧光标记；以及一个编码胸腺嘧啶的第四探针，其中，所述第四探针包括一个第四荧光标记。
在某些实施例中，每个荧光标记解码探针编码与读段寡核苷酸和荧光标记解码探针连接处相邻的1-3个碱基，其中，编码不同碱基序列的荧光标记解码探针包括不同的荧光标记。
在某些实施例中，通过优化当前测序循环所用荧光标记解码探针的序列，尽可能减少与其他测序循环所用荧光标记解码探针的交叉杂交。
在某些实施例中，所述读段寡核苷酸的长度为8-11个核苷酸，包括该范围内的任何长度，例如8个、9个、10个或11个核苷酸。在一些实施例中，所述读段寡核苷酸的解链温度为17℃-20℃，包括该范围内的任何解链温度，例如17℃、18℃、19℃或20℃。
在某些实施例中，所述竞争寡核苷酸进一步包括一个第四互补区，所述第四互补区包括一个与至少一部分探针结合位点互补的序列。在一些实施例中，所述竞争寡核苷酸的第四互补区包括一个与靶核酸上整个探针结合位点完全互补的序列。在某些实施例中，所述竞争寡核苷酸进一步包括一个第五互补区，所述第五互补区包括一个与竞争剂特异性互补位点(该位点与靶核酸上读段序列相邻)互补的序列。在一些实施例中，所述竞争剂特异性互补位点的长度为2-16个核苷酸，包括该范围内的任何长度，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸。在某些实施例中，对于初始测序循环之后的测序循环，上一个测序循环中使用的竞争寡核苷酸存在于一个或多个后续测序循环期间。
在某些实施例中，所述读段寡核苷酸进一步包括一个竞争剂特异性互补序列。在一些实施例中，所述读段寡核苷酸的竞争剂特异性互补序列的长度为2-16个核苷酸，包括该范围内的任何长度，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸。在某些实施例中，通过优化当前测序循环所用读段寡核苷酸的序列，尽可能减少与其他测序循环所用读段寡核苷酸的交叉杂交。
在某些实施例中，使用对不同靶核酸具有特异性的多个读段寡核苷酸、荧光标记解码探针集和竞争寡核苷酸，对多个不同靶核酸进行同时或顺序测序。
在某些实施例中，所述竞争寡核苷酸从与当前进行测序循环步骤(a)或(b)的靶核酸不同的靶核酸中去除通过上一轮测序获得的连接产物。在某些实施例中，所述竞争寡核苷酸从当前进行测序循环步骤(a)或(b)的相同靶核酸中去除通过上一轮测序获得的连接产物。在某些实施例中，所述竞争寡核苷酸是轮次特异性竞争寡核苷酸，所述轮次特异性竞争寡核苷酸包括一个第四互补区，所述第四互补区包括一个与下一个测序循环所用读段序列互补的序列。
测序读段可以呈5'至3'正向或3'至5'反向。对于正向测序读段，每个荧光标记解码探针在5'端具有荧光团修饰，每个读段寡核苷酸在5'端具有磷酸盐。对于反向测序读段，每个荧光标记解码探针在5'端具有磷酸盐，在3'端具有荧光团修饰。
在某些实施例中，通过顺序编码进行所述测序。在一些实施例中，对于每个测序循环，每个读段寡核苷酸包括一个单一顺序正交读段序列和一个单一相邻竞争剂特异性互补序列。在一些实施例中，所述单一顺序正交读段序列的长度为8-11个核苷酸，包括该范围内的任何长度，例如8个、9个、10个或11个核苷酸。在一些实施例中，所述单一相邻竞争剂特异性互补序列的长度为2-16个核苷酸，包括该范围内的任何长度，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸。在一些实施例中，对于每个测序循环，每个竞争寡核苷酸包括一个与读段寡核苷酸的单一顺序正交读段序列和单一相邻竞争剂特异性互补序列以及至少一部分荧光标记解码探针序列互补的序列。在一些实施例中，所述竞争寡核苷酸的序列与荧光标记解码探针的序列部分或完全互补。
在某些实施例中，通过组合编码进行所述测序。在一些实施例中，使用多个读段寡核苷酸进行测序，其中，每个读段寡核苷酸包括一个第一互补区，所述第一互补区包括一个与靶核酸上单独组合读段位置的读段序列互补的组合读段序列，其中，所述靶核酸上各个单独位置的读段序列与探针结合位点相邻。在一些实施例中，每个读段寡核苷酸进一步包括一个与读段序列相邻的竞争剂特异性互补序列。在一些实施例中，所述竞争剂特异性互补序列与荧光标记解码探针不互补。在一些实施例中，所述读段序列的长度为8-11个核苷酸，包括该范围内的任何长度，例如8个、9个、10个或11个核苷酸。在一些实施例中，所述竞争剂特异性互补序列的长度为2-16个核苷酸，包括该范围内的任何长度，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸。在一些实施例中，对于每个测序循环，在每个单独组合读段位置，所述竞争寡核苷酸包括一个与读段寡核苷酸的组合读段序列和竞争剂特异性互补序列以及至少一部分荧光标记解码探针序列互补的序列。在一些实施例中，所述组合编码采用汉明码。
本发明所述的测序方法可用于完整组织内细胞中靶核酸的原位基因测序。在一些实施例中，所述对完整组织内细胞中靶核酸进行原位基因测序的方法包括：(a)在允许进行特异性杂交的条件下使用至少一对寡核苷酸引物接触固定透化完整组织，其中，所述引物对包括一个第一寡核苷酸和一个第二寡核苷酸；其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别包括一个第一互补区、一个第二互补区序列和一个第三互补区；其中，所述第二寡核苷酸进一步包括一个条形码序列；其中，所述第一寡核苷酸的第一互补区与靶核酸的第一部分互补，其中，所述第一寡核苷酸的第二互补区与第二寡核苷酸的第一互补区互补，其中，所述第一寡核苷酸的第三互补区与第二寡核苷酸的第三互补区互补，其中，所述第二寡核苷酸的第二互补区与靶核酸的第二部分互补，其中，所述靶核酸的第一部分与靶核酸的第二部分相邻；(b)加入连接酶以连接第二寡核苷酸并产生闭合核酸环；(c)在核酸分子存在的情况下实施滚环扩增，其中，所述实施过程包括使用第二寡核苷酸作为模板，使用第一寡核苷酸作为聚合酶的引物，形成一个或多个扩增子；(d)在水凝胶亚基存在的情况下嵌入一个或多个扩增子，形成一个或多个水凝胶嵌入式扩增子；(e)根据本发明所述的方法对一个或多个扩增子进行测序。在某些实施例中，通过顺序编码进行所述测序。在其他实施例中，通过组合编码进行所述测序。
在一些实施例中，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤发生两次或以上，例如，包括但不限于三次或以上、四次或以上、五次或以上、六次或以上、七次或以上、八次或以上、九次或以上、十次或以上、十一次或以上，或者十二次或以上。在某些实施例中，对于薄组织试样，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤发生四次或以上。在其他实施例中，对于厚组织试样，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤发生六次或以上。在一些实施例中，可使用一对引物接触一个或多个扩增子24小时或以上、24小时或以下、18小时或以下、12小时或以下、8小时或以下、6小时或以下、4小时或以下、2小时或以下、60分钟或以下、45分钟或以下、30分钟或以下、25分钟或以下、20分钟或以下、15分钟或以下、10分钟或以下、5分钟或以下，或者2分钟或以下。在一些实施例中，进行12个或更多测序循环，包括13个或更多循环、14个或更多循环、15个或更多循环、16个或更多循环、17个或更多循环，或者18个或更多测序循环。在一些实施例中，在室温下进行所述方法，以便保持组织形态，同时降低背景噪声并减小误差。在一些实施例中，所述接触一个或多个水凝胶嵌入式扩增子的步骤包括避免误差随着测序的进行而累积。
可通过多种不同显微术类型中的任何一种，例如光学显微术(例如明场、斜照、暗场、相差、微分干涉相差、干涉反射、落射荧光、共聚焦等显微术)、激光显微术、电子显微术和扫描探针显微术，分析采用主题方法制备的试样。在一些方面，非暂态计算机可读介质先将通过对多轮原位测序实行显微术而采集到的原始图像转换成经解码的基因标识和空间位置，再分析每个细胞的基因表达组成。
涉及双链体时，术语“完全匹配”系指构成双链体的多核苷酸和/或寡核苷酸链彼此配合，形成双链结构，使每条链中的每个核苷酸均与另一条链中的核苷酸进行沃森-克里克碱基配对。术语“双链体”包括但不限于脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷、肽核酸(PNA)等可用核苷类似物的配对。双链体中两个寡核苷酸之间的“错配”系指双链体中的一对核苷酸无法进行沃森-克里克键合。
在一些实施例中，所述方法包括多个与靶核苷酸序列杂交的读段寡核苷酸，包括但不限于5个或更多(例如8个或更多、10个或更多、12个或更多、15个或更多、18个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多)读段寡核苷酸。在一些实施例中，本公开所述的方法包括多个与15个或更多(例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个)不同靶核苷酸序列杂交的读段寡核苷酸，包括但不限于15个或更多读段寡核苷酸，例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个不同读段寡核苷酸。
在一些实施例中，所述方法包括多个荧光标记解码探针，包括但不限于4个或更多(例如8个或更多、10个或更多、12个或更多、16个或更多、18个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多)荧光标记解码探针。在一些实施例中，本公开所述的方法包括多个与15个或更多(例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个)不同靶核苷酸序列杂交的荧光标记解码探针，包括但不限于15个或更多荧光标记解码探针，例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个不同荧光标记解码探针。
可使用多对寡核苷酸引物进行反应，其中一对或多对与每个靶核酸特异性结合。例如，为了提高灵敏度并减少可变性，可针对一个靶核酸使用两个引物对。细胞中多个不同靶核酸的检测也值得关注，例如，检测至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多12个、至多15个、至多18个、至多20个、至多25个、至多30个、至多40个或更多不同靶核酸。
在某些实施例中，使用因碱基错配而活性受损的连接酶、读段寡核苷酸和荧光标记解码探针进行测序。在此情况下，术语“受损”系指连接酶的活性降低约20％或以上，例如25％或以上、50％或以上、75％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上、100％。在一些实施例中，所述第三寡核苷酸的长度为5-15个核苷酸，包括但不限于5-13个核苷酸、5-10个核苷酸或5-8个核苷酸。在一些实施例中，所述第三寡核苷酸的Tm处于室温(22-25℃)下。在一些实施例中，所述读段寡核苷酸简并或部分简并。在一些实施例中，所述荧光标记解码探针寡核苷酸的长度为5-15个核苷酸，包括但不限于5-13个核苷酸、5-10个核苷酸或5-8个核苷酸。在一些实施例中，所述第四寡核苷酸的Tm处于室温(22-25℃)下。在碱基读段所对应的每个测序循环后，通过将竞争寡核苷酸与靶核酸结合，去除靶核酸中的荧光连接产物，其中，所述竞争寡核苷酸包括一个第三互补区，所述第三互补区包括一个与靶核酸上读段序列互补的序列，所述荧光连接产物从靶核酸中解离出来。
在一些实施例中，测序涉及通过洗涤去除未结合的寡核苷酸和未连接的探针，此后露出用于成像的荧光产物。在某些示例性实施例中，使用可检测的荧光标记，检测本发明所述的一个或多个核苷酸和/或寡核苷酸。在某些实施例中，使用可检测的荧光标记，例如荧光蛋白、荧光染料或荧光量子点，标记探针。
有关荧光标记及其与核苷酸和/或寡核苷酸的附着，参见众多文献，包括：Haugland，《荧光探针和研究化学品手册》，第九版(Molecular Probes,Inc.，尤金，2002)；Keller和Manak，《DNA探针》，第二版(Stockton出版社，纽约，1993)；Eckstein，编辑，《寡核苷酸及类似物：实用方法》(IRL出版社，牛津，1991)；以及Wetmur，《生物化学与分子生物学评论》，26:227-259(1991)。以下参考文献样本公开了适用于本发明的具体方法：第4,757,141号、第5,151,507号和第5,091,519号美国专利。在一个方面，使用一种或多种荧光染料作为标记，获得标记靶序列，例如，参见以下文献的公开内容：第5,188,934号美国专利(4,7-二氯荧光素染料)；第5,366,860号美国专利(光谱可分辨罗丹明染料)；第5,847,162号美国专利(4,7-二氯罗丹明染料)；第4,318,846号美国专利(醚取代荧光素染料)；第5,800,996号美国专利(能量转移染料)；Lee等人；第5,066,580号美国专利(黄嘌呤染料)；第5,688,648号美国专利(能量转移染料)；等等。还可使用量子点进行标记，参见以下专利及专利出版物的公开内容：第6,322,901号、第6,576,291号、第6,423,551号、第6,251,303号、第6,319,426号、第6,426,513号、第6,444,143号、第5,990,479号、第6,207,392号、第2002/0045045号和第2003/0017264号美国专利。本发明所用术语“荧光标记”包括通过一种或多种分子的荧光吸收和/或发射特性传递信息的信号传导部分。此类荧光特性包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特征、能量转移等。
易于掺入核苷酸和/或寡核苷酸序列中的市售荧光核苷酸类似物包括但不限于Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(Amersham Biosciences，新泽西州皮斯卡特维)、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、TEXAS REDTM-5-dUTP、CASCADE BLUETM-7-dUTP、BODIPY TMFL-14-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、BODIPY TMTR-14-dUTP、RHODAMINE GREENTM-5-dUTP、OREGON GREENRTM488-5-dUTP、TEXAS REDTM-12-dUTP、BODIPYTM630/650-14-dUTP、BODIPYTM650/665-14-dUTP、ALEXA FLUORTM488-5-dUTP、ALEXA FLUORTM532-5-dUTP、ALEXAFLUORTM
568-5-dUTP、ALEXA FLUORTM594-5-dUTP、ALEXA FLUORTM546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、TEXAS REDTM-5-UTP、mCherry、CASCADE BLUETM-7-UTP、BODIPYTMFL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、BODIPYTMTR-14-UTP、RHODAMINE GREENTM-5-UTP、ALEXA FLUORTM488-5-UTP、LEXA FLUORTM546-14-UTP(Molecular Probes,Inc.，俄勒冈州尤金)等。用于定制合成具有其他荧光团的核苷酸的方案为本领域所知(参见：Henegariu等人(2000)《自然生物技术》18:345)。
其他可用于合成后附着的荧光团包括但不限于ALEXA FLUORTM350、ALEXAFLUORTM532、ALEXA FLUORTM546、ALEXA FLUORTM568、ALEXA FLUORTM594、ALEXA FLUORTM647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、Dansyl、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 514、Pacific Blue、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、Texas Red(可购自：Molecular Probes,Inc.，俄勒冈州尤金)、Cy2、Cy3.5、Cy5.5、Cy7(Amersham Biosciences，新泽西州皮斯卡特维)等。还可使用FRET串联荧光团，包括但不限于PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、APC-Cy7、PE-Alexa染料(610、647、680)、APC-Alexa染料等。
荧光蛋白的示例包括但不限于绿色荧光蛋白、超折叠绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、Dronpa(光开关绿色荧光蛋白)、黄绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、紫色荧光蛋白、mApple、mNectarine、mNeptune、mCherry、mStrawberry、mPlum、mRaspberry、mCrimson3、mCarmine、mCardinal、mScarlet、mRuby2、FusionRed、mNeonGreen、TagRFP675和mRFP1等。
可使用金属银或金颗粒增强来自荧光标记核苷酸和/或寡核苷酸序列的信号(Lakowicz等人(2003)《生物技术》34:62)。
还可使用生物素或其衍生物作为核苷酸和/或寡核苷酸序列上的标记，随后通过可检测标记亲和素/链霉亲和素衍生物(例如藻红蛋白缀合链霉亲和素)或可检测标记抗生物素抗体进行结合。可掺入地高辛作为标记，随后通过可检测标记抗地高辛(例如荧光素化抗地高辛)抗体进行结合。可将氨基烯丙基-dUTP残基掺入寡核苷酸序列中，随后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生荧光染料偶联。一般而言，可将缀合物对的任何成员掺入检测用寡核苷酸中，但前提是可检测标记缀合物配偶体可以结合以便进行检测。本发明所用术语“抗体”系指任何类别的抗体分子或其任何亚片段，例如Fab。
其他适用于寡核苷酸序列的标记可包括荧光素(FAM)、地高辛、二硝基苯酚(DNP)、丹磺酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六聚组氨酸(6×His)、磷酸氨基酸(例如P-tyr、P-ser、P-thr)等。在一个实施例中，使用以下半抗原/抗体对进行检测，其中每种抗体均经过可检测标记衍生化：生物素/α-生物素、地高辛/α-地高辛、二硝基苯酚(DNP)/α-DNP、5-羧基荧光素(FAM)/α-FAM。
在某些示例性实施例中，可间接标记核苷酸和/或寡核苷酸序列，尤其可先用半抗原标记，再通过捕获剂进行结合，例如，参见以下公开内容：第5,344,757号、第5,702,888号、第5,354,657号、第5,198,537号和第4,849,336号美国专利，以及第WO 91/17160号PCT出版物等。可使用许多不同的半抗原捕获剂对。示例性半抗原包括但不限于生物素、des-生物素及其他衍生物、二硝基苯酚、丹磺酰、荧光素、CY5、地高辛等。生物素的捕获剂可以是亲和素、链霉亲和素或抗体。抗体可用作其他半抗原的捕获剂(许多染料-抗体可从市面上购得，例如：Molecular Probes，俄勒冈州尤金)。
在一些实施例中，向洗涤和成像缓冲液(即“抗褪色缓冲液”)中加入抗氧化剂化合物，以减少荧光成像期间的光漂白。示例性抗氧化剂包括但不限于Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)和Trolox-醌、没食子酸丙酯、叔丁基氢醌、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、抗坏血酸和生育酚。此类抗氧化剂对荧光团具有抗褪色作用。换言之，抗氧化剂减少覆瓦期间的光漂白，大大提高敏感荧光团的信噪比(SNR)，增强较厚样本的SNR成像。曝光时间固定时，通过加入抗氧化剂，可以增加曝光期间未漂白荧光团的浓度，从而提高信噪比。通过加入抗氧化剂，还可以消除较长曝光时间内(由光漂白前有限荧光团寿命导致)的收益递减，增加曝光时间，从而提高信噪比。
示例性测序循环可选先快速洗涤样本，再首次加入信号。根据对特定轮次选用顺序编码还是组合编码，加入并连接相应的读段寡核苷酸集、荧光标记解码探针及其轮次特异性竞争剂。进行组合编码时，加入用于给定位置x的读段寡核苷酸、荧光标记双碱基编码寡核苷酸集以及上一个标记位置的竞争寡核苷酸(但首轮标记除外，在该情况下省略竞争寡核苷酸)。进行顺序编码时，加入用于给定轮次x的读段寡核苷酸、四通道荧光团混合物和轮次x-1竞争寡核苷酸，但首轮标记除外。测序连接混合物中存在PEG会显著加快靶标上信号的增加。将样本在成像缓冲液中孵育后，对样本进行成像，并在下一个测序循环之前快速冲洗。
此外，采用多个测序循环时，通过从探针中切割荧光团或剥离探针，可以消除轮次间的信号遗留。例如，可使用甲酰胺剥离荧光团。可替代地，可使用硫醇连接染料，在荧光团与寡核苷酸探针之间实现二硫连接，以便能够在还原环境中从寡核苷酸探针中切割荧光团。可用于切割二硫键的示例性二硫化物还原剂包括但不限于三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)和b-巯基乙醇(BME)。在一轮测序期间荧光成像之后，加入剥离剂和/或还原剂，随后通过洗涤步骤在另一轮测序之前去除扩散荧光信号。
本发明公开的方法还提供了一种筛选候选剂的方法。所述方法通过本发明所述方法确定完整组织内细胞中靶核酸的基因序列，并检测靶核酸的基因表达水平，从而确定候选剂是否调控完整组织内细胞中核酸的基因表达，其中，相对于不使用候选剂时靶核酸的表达水平，使用候选剂时靶核酸的表达水平变化表明，候选剂调控完整组织内细胞中核酸的基因表达。
在某些方面，与现有基因表达分析工具相比，本发明公开的方法可缩短处理时间，提高多重性、效率和灵敏度，降低误差率，并增加空间分辨细胞类型。所述方法改进了用于原位测序的连接法测序技术(SCAL和SEDAL2)，误差更小。在一些其他方面，本发明公开的方法包括利用单细胞和/或单分子敏感性，针对生物医学研究和临床诊断(例如癌症、细菌感染、病毒感染等)，进行空间测序(例如试剂、芯片或服务)。
基于分子内连接的核酸特异性扩增(SNAIL)
可采用一种高效方法从细胞RNA原位产生cDNA文库，在本发明中称为SNAIL，即基于分子内连接的核酸特异性扩增。在某些实施例中，所述方法包括在允许进行特异性杂交的条件下使用至少一对寡核苷酸引物接触固定透化完整组织，其中，所述引物对包括一个第一寡核苷酸和一个第二寡核苷酸。
更普遍地，组织内目标细胞中的核酸作为用于组装复合物的支架，该复合物包括一对引物，即本发明所述的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在一些实施例中，所述接触固定透化完整组织的步骤包括将引物对与同一靶核酸杂交。在一些实施例中，所述靶核酸是RNA。在此类实施例中，所述靶核酸可以是mRNA。在其他实施例中，所述靶核酸是DNA。
本发明所用术语“杂交”系指在充分互补的核苷酸序列之间通过沃森-克里克碱基配对形成复合物。引物与靶标(模板)“杂交”时，此类复合物(或杂交体)足够稳定，可发挥所需的预激功能，例如，帮助DNA聚合酶启动DNA合成。应理解，杂交序列无需完全互补即可提供稳定的杂交体。在许多情况下，不考虑由四个或更多核苷酸组成的环，碱基错配率小于约10％时，形成稳定的杂交体。因此，本发明所用术语“互补”系指寡核苷酸与其“补体”通常具有约90％或更高同源性时，在检测条件下形成稳定的双链体。
SNAIL寡核苷酸引物
在主题方法中，所述SNAIL寡核苷酸引物包括至少一个第一寡核苷酸和一个第二寡核苷酸；其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别包括一个第一互补区、一个第二互补区和一个第三互补区；其中，所述第二寡核苷酸进一步包括一个条形码序列；其中，所述第一寡核苷酸的第一互补区与靶核酸的第一部分互补，其中，所述第一寡核苷酸的第二互补区与第二寡核苷酸的第一互补区互补，其中，所述第一寡核苷酸的第三互补区与第二寡核苷酸的第三互补区互补，其中，所述第二寡核苷酸的第二互补区与靶核酸的第二部分互补，其中，所述第一寡核苷酸的第一互补区与第二寡核苷酸的第二互补区相邻。在一个替代实施例中，所述第二寡核苷酸是闭合环状分子，并且省略连接步骤。
本公开提供了在接触固定透化组织时杂交对不同靶核酸具有特异性的多个寡核苷酸引物的方法。在一些实施例中，所述方法包括多个与靶核苷酸序列杂交的第一寡核苷酸，包括但不限于5个或更多(例如8个或更多、10个或更多、12个或更多、15个或更多、18个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多)第一寡核苷酸。在一些实施例中，本公开所述的方法包括多个与15个或更多(例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个)不同靶核苷酸序列杂交的第一寡核苷酸，包括但不限于15个或更多第一寡核苷酸，例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个不同第一寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括多个第二寡核苷酸，包括但不限于5个或更多(例如8个或更多、10个或更多、12个或更多、15个或更多、18个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多)第二寡核苷酸。在一些实施例中，本公开所述的方法包括多个与15个或更多(例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个)不同靶核苷酸序列杂交的第二寡核苷酸，包括但不限于15个或更多第二寡核苷酸，例如20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多以及至多80个不同第二寡核苷酸。可使用多个寡核苷酸对进行反应，其中一对或多对与每个靶核酸特异性结合。例如，为了提高灵敏度并减少可变性，可针对一个靶核酸使用两个引物对。细胞中多个不同靶核酸的检测也值得关注，例如，检测至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多12个、至多15个、至多18个、至多20个、至多25个、至多30个、至多40个或更多不同靶核酸。通常，使用前通过将引物加热到至少约50℃、至少约60℃、至少约70℃、至少约80℃以及至多约99℃、至多约95℃、至多约90℃进行变性。
在一些实施例中，接触样本前通过加热对引物进行变性。在某些方面，选用寡核苷酸的解链温度(Tm)，尽可能减少溶液中的连接。核酸的“解链温度”或“Tm”系指加热或碱基对之间氢键合的其他解离方式(例如酸或碱处理等)导致核酸损失一半螺旋结构的温度。核酸分子的Tm取决于其长度和碱基组成。与富含AT碱基对的核酸分子相比，富含GC碱基对的核酸分子具有更高的Tm。温度低于Tm时，分离的核酸互补链自发地再结合或退火，形成双链体核酸。温度比Tm低约25℃时，核酸杂交速率最高。可利用以下关系估计Tm：Tm＝69.3+0.41(GC)％(Marmur等人(1962)《分子生物学杂志》5:109-118)。
在某些实施例中，所述多个第二寡核苷酸包括一个锁式探针。在一些实施例中，所述探针包括一个可测量并定量的可检测标记。术语“标记”和“可检测标记”系指能够检测到的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”系指能够在可检测范围内发出荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体示例包括但不限于藻红蛋白、Alexa染料、荧光素、YPet、CyPet、Cascade蓝、别藻蓝素、Cy3、Cy5、Cy7、罗丹明、丹磺酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、吖啶酯、生物素、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和脲酶。
在一些实施例中，所述一个或多个第一寡核苷酸和第二寡核苷酸结合到不同靶核酸区域或靶位点。在一对中，靶位点各不相同，并且是靶核酸上的相邻位点，例如，通常相距至多15个核苷酸(例如，相距至多10个、8个、6个、4个或2个核苷酸)，也可以是相连位点。靶位点通常以相同方向存在于靶核酸的同一条链上。相对于细胞中的其他核酸，所选择的靶位点还提供单一结合位点。每个靶位点的长度通常为约19至约25个核苷酸，例如约19-23个核苷酸、约19-21个核苷酸或约19-20个核苷酸。在所选择的第一和第二寡核苷酸对中，各个寡核苷酸具有允许其结合到相关靶位点的相似解链温度，例如，Tm可起始于约50℃、约52℃、约55℃、约58℃、约62℃、约65℃、约70℃或约72℃。所选择的靶位点GC含量通常为至多约20％、至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约70％。
在一些实施例中，所述第一寡核苷酸包括一个第一互补区、一个第二互补区和一个第三互补区。所述第一寡核苷酸的靶位点可指第一互补区。综上所述，所述第一寡核苷酸的第一互补区可具有19-25个核苷酸的长度。在某些方面，所述第一寡核苷酸的第二互补区具有3-10个核苷酸的长度，例如，包括4-8个核苷酸或4-7个核苷酸。在一些方面，所述第一寡核苷酸的第二互补区具有6个核苷酸的长度。在一些实施例中，所述第一寡核苷酸的第三互补区同样具有6个核苷酸的长度。在此类实施例中，所述第一寡核苷酸的第三互补区具有3-10个核苷酸的长度，例如，包括4-8个核苷酸或4-7个核苷酸。
在一些实施例中，所述第二寡核苷酸包括一个第一互补区、一个第二互补区和一个第三互补区。所述第二寡核苷酸的靶位点可指第二互补区。综上所述，所述第二寡核苷酸的第二互补区可具有19-25个核苷酸的长度。在某些方面，所述第一寡核苷酸的第一互补区具有3-10个核苷酸的长度，例如，包括4-8个核苷酸或4-7个核苷酸。在一些方面，所述第一寡核苷酸的第一互补区具有6个核苷酸的长度。在一些方面，所述第二寡核苷酸的第一互补区包括第二寡核苷酸的5'端。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的第三互补区同样具有6个核苷酸的长度。在此类实施例中，所述第二寡核苷酸的第三互补区具有3-10个核苷酸的长度，例如，包括4-8个核苷酸或4-7个核苷酸。在又一些实施例中，所述第二寡核苷酸的第三互补区包括第二寡核苷酸的3'端。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的第一互补区与第二寡核苷酸的第三互补区相邻。
在一些方面，所述第二寡核苷酸包括一个条形码序列，其中，所述第二寡核苷酸的条形码序列提供用于识别靶核酸的条形码编制信息。术语“条形码”系指用于识别单个细胞或细胞亚群的核酸序列。条形码序列可在扩增期间与目标靶核酸连接，用于将扩增子回溯到靶核酸的来源细胞。通过使用具有包含条形码序列的区域以及与靶核酸互补的区域的寡核苷酸进行扩增，可以在扩增期间向目标靶核酸中加入条形码序列，从而将条形码序列掺入最终扩增靶核酸产物(即扩增子)中。
组织
如本发明所述，所公开的方法包括完整组织原位测序技术，该技术至少在允许进行特异性杂交的条件下使用至少一对寡核苷酸引物接触固定透化完整组织。适合与本发明所述方法配合使用的组织试样通常包括从活体或死亡受试者体内收集到的任何类型的组织试样，例如活检试样和尸检试样，包括但不限于上皮、肌肉、结缔组织和神经组织。可采用本发明所述的方法收集和处理组织试样，处理后立即进行显微分析，或者可保存组织试样，以后(例如，在储存较长时间后)进行显微分析。在一些实施例中，本发明所述的方法可用于以稳定、易用且完好无损的形式保存组织试样，以便将来进行分析。在一些实施例中，本发明所述的方法可用于分析先前保存或储存的组织试样。在一些实施例中，所述完整组织包括脑组织，例如视皮层切片。在一些实施例中，所述完整组织是薄切片，其厚度为5-20μm，例如，包括但不限于5-18μm、5-15μm或5-10μm。在其他实施例中，所述完整组织是厚切片，其厚度为20-200μm，例如，包括但不限于20-150μm、50-100μm或50-80μm。
本发明的方面包括固定完整组织。本发明所用术语“固定”系指保护生物材料(例如组织、细胞、细胞器、分子等)以防其腐坏和/或降解的过程。固定可通过任何便利的方案实现。固定可包括使用固定试剂(即包含至少一种固定剂的试剂)接触样本。根据温度、样本性质和固定剂，可在较宽时间范围内使用固定试剂接触样本。例如，可使用固定试剂接触样本24小时或以下、18小时或以下、12小时或以下、8小时或以下、6小时或以下、4小时或以下、2小时或以下、60分钟或以下、45分钟或以下、30分钟或以下、25分钟或以下、20分钟或以下、15分钟或以下、10分钟或以下、5分钟或以下，或者2分钟或以下。
可使用固定试剂接触样本5分钟-24小时范围内的一段时间，例如10分钟-20小时、10分钟-18小时、10分钟-12小时、10分钟-8小时、10分钟-6小时、10分钟-4小时、10分钟-2小时、15分钟-20小时、15分钟-18小时、15分钟-12小时、15分钟-8小时、15分钟-6小时、15分钟-4小时、15分钟-2小时、15分钟-1.5小时、15分钟-1小时、10分钟-30分钟、15分钟-30分钟、30分钟-2小时、45分钟-1.5小时或55分钟-70分钟。
根据所使用的方案和试剂，可在不同温度下使用固定试剂接触样本。例如，在一些实例中，可在-22℃-55℃温度范围内使用固定试剂接触样本，其中关注的具体范围包括但不限于50℃-54℃、40℃-44℃、35℃-39℃、28℃-32℃、20℃-26℃、0℃-6℃和-18℃--22℃。在一些实例中，可在-20℃、4℃、室温(22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃下使用固定试剂接触样本。
可使用任何便利的固定试剂。常见的固定试剂包括交联固定剂、沉淀固定剂、氧化固定剂、汞剂等。交联固定剂通过共价键化学上连接两个或多个分子，可使用多种交联试剂。合适交联固定剂的示例包括但不限于醛(例如：甲醛，也俗称为“多聚甲醛”和“福尔马林”；戊二醛；等等)、亚氨酸酯、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯等。合适沉淀固定剂的示例包括但不限于醇(例如甲醇、乙醇等)、丙酮、乙酸等。在一些实施例中，所述固定剂是甲醛(即多聚甲醛或福尔马林)。固定试剂中甲醛的合适最终浓度为0.1-10％、1-8％、1-4％、1-2％、3-5％或3.5-4.5％，包括约1.6％，保持10分钟。在一些实施例中，将样本固定在最终浓度为4％的甲醛(由38％、37％、36％、20％、18％、16％、14％、10％、8％、6％等更浓缩的储备溶液稀释而来)中。在一些实施例中，将样本固定在最终浓度为10％的甲醛中。在一些实施例中，将样本固定在最终浓度为1％的甲醛中。在一些实施例中，所述固定剂是戊二醛。固定试剂中戊二醛的合适浓度为0.1-1％。固定试剂可包含一种以上任意组合的固定剂。例如，在一些实施例中，使用包含甲醛和戊二醛的固定试剂接触样本。
本发明所用术语“透化”系指使样本的细胞(细胞膜等)可渗透于核酸探针、抗体、化学底物等实验试剂的过程。可使用任何便利的方法和/或试剂进行透化。合适的透化试剂包括去垢剂(例如皂素、曲拉通X-100、吐温-20等)、有机固定剂(例如丙酮、甲醇、乙醇等)、酶等。可在一定浓度范围内使用去垢剂。例如，可使用0.001％-1％去垢剂、0.05％-0.5％去垢剂或0.1％-0.3％去垢剂进行透化(例如0.1％皂苷、0.2％吐温-20、0.1-0.3％曲拉通X-100等)。在一些实施例中，在冰上使用甲醇进行透化，持续至少10分钟。
在一些实施例中，可使用同一溶液作为固定试剂和透化试剂。例如，在一些实施例中，所述固定试剂包含0.1％-10％甲醛和0.001％-1％皂苷。在一些实施例中，所述固定试剂包含1％甲醛和0.3％皂苷。
根据温度、样本性质和透化试剂，可在较宽时间范围内使用透化试剂接触样本。例如，可使用透化试剂接触样本24小时或以上、24小时或以下、18小时或以下、12小时或以下、8小时或以下、6小时或以下、4小时或以下、2小时或以下、60分钟或以下、45分钟或以下、30分钟或以下、25分钟或以下、20分钟或以下、15分钟或以下、10分钟或以下、5分钟或以下，或者2分钟或以下。根据所使用的方案和试剂，可在不同温度下使用透化试剂接触样本。例如，在一些实例中，可在-82℃-55℃温度范围内使用透化试剂接触样本，其中关注的具体范围包括但不限于：50℃-54℃、40℃-44℃、35℃-39℃、28℃-32℃、20℃-26℃、0℃-6℃、-18℃--22℃和-78℃--82℃。在一些实例中，可在-80℃、-20℃、4℃、室温(22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃下使用透化试剂接触样本。
在一些实施例中，使用酶透化试剂接触样本。酶透化试剂通过部分降解阻碍检测试剂渗透样本的细胞外基质或表面蛋白来透化样本。可在固定之后和靶标检测之前的任何时间点使用酶透化试剂进行接触。在一些实例中，所述酶透化试剂是蛋白酶K(一种市售酶)。在此类情况下，接触样本时，先使用蛋白酶K，再使用固定后试剂。蛋白酶K处理(即，使用蛋白酶K进行接触；也俗称为“蛋白酶K消化”)可在一定的时间和温度范围以及针对所研究的各个细胞类型或组织类型凭经验确定的酶浓度范围内进行。例如，可使用蛋白酶K接触样本30分钟或以下、25分钟或以下、20分钟或以下、15分钟或以下、10分钟或以下、5分钟或以下，或者2分钟或以下。可使用1μg/ml或更低、2μg/ml或更低、4μg/ml或更低、8μg/ml或更低、10μg/ml或更低、20μg/ml或更低、30μg/ml或更低、50μg/ml或更低或100μg/ml或更低浓度的蛋白酶K接触样本。可在2℃至55℃温度范围内使用蛋白酶K接触样本，其中关注的具体范围包括但不限于：50℃-54℃、40℃-44℃、35℃-39℃、28℃-32℃、20℃-26℃和0℃-6℃。在一些情况下，可在4℃、室温(22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃下使用蛋白酶K接触样本。在一些实施例中，不使用酶透化试剂接触样本。在一些实施例中，不使用蛋白酶K接触样本。使用至少一种固定试剂和一种透化试剂接触完整组织后，产生固定透化组织。
连接酶
在一些实施例中，所公开的方法包括加入连接酶以连接第二寡核苷酸并产生闭合核酸环。在一些实施例中，所述加入连接酶的步骤包括加入DNA连接酶。在替代实施例中，所述第二寡核苷酸的提供形式为闭合核酸环，并且省略加入连接酶的步骤。在某些实施例中，连接酶是有利于对靶核酸分子进行测序的酶。
本发明所用术语“连接酶”系指常用于将多个多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸两端的酶。连接酶包括ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD-i依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，例如EC 6.5.1.1(ATP依赖性连接酶)、EC 6.5.1.2(NAD+依赖性连接酶)、EC 6.5.1.3(RNA连接酶)所述的任何连接酶。连接酶的具体示例包括：细菌连接酶，例如大肠杆菌DNA连接酶和Taq DNA连接酶、热稳定DNA连接酶(Technologies Corp.，属于/>的一部分，威斯康星州麦迪逊)；以及噬菌体连接酶，例如T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶及其突变体。
滚环扩增
在一些实施例中，本发明所述的方法包括在存在核酸分子的情况下实施滚环扩增的步骤，其中，所述实施过程包括使用第二寡核苷酸作为模板，使用第一寡核苷酸作为聚合酶的引物，形成一个或多个扩增子。在此类实施例中，通过连接第二核苷酸，形成单链环状多核苷酸模板。所述环状多核苷酸包括一个与第一寡核苷酸互补的区域。在适当dNTP前体及存在其他辅因子的情况下加入DNA聚合酶后，通过复制模板的多个拷贝，延长第一寡核苷酸。该扩增产物可与检测探针结合，因此易于检测。在一些实施例中，在不存在dNTP的情况下预孵育聚合酶，使聚合酶在滚环扩增之前均匀地渗透样本。
在一些实施例中，仅当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸与同一靶核酸分子杂交时，方可使第二寡核苷酸环化，并通过滚环扩增产生包含多个cDNA拷贝的cDNA纳米球(即扩增子)。术语“扩增子”系指PCR反应或其他核酸扩增过程的扩增核酸产物。在一些实施例中，将胺修饰核苷酸纳入滚环扩增反应。
用于滚环扩增的技术为本领域所知(例如，参见：Baner等人，《核酸研究》26:5073-5078，1998；Lizardi等人，《自然—遗传学》19:226，1998；Schweitzer等人，《美国国家科学院院刊》97:101 13-119，2000；Faruqi等人，《英国医学委员会—基因组学》2:4，2000；Nallur等人，《核酸研究》29:el 18，2001；Dean等人，《基因组研究》11:1095-1099，2001；Schweitzer等人，《自然生物技术》20:359-365，2002；第6,054,274号、第6,291,187号、第6,323,009号、第6,344,329号和第6,368,801号美国专利)。在一些实施例中，所述聚合酶是phi29 DNA聚合酶。
在某些方面，所述核酸分子包含胺修饰核苷酸。在此类实施例中，所述胺修饰核苷酸包含丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺部分修饰。其他胺修饰核苷酸的示例包括但不限于5-氨基烯丙基-dUTP部分修饰、5-丙炔氨基-dCTP部分修饰、N6-6-氨基己基-dATP部分修饰或7-脱氮-7-丙炔氨基-dATP部分修饰。
组织-水凝胶环境中嵌入扩增子
在一些实施例中，所公开的方法包括在水凝胶亚基存在的情况下嵌入一个或多个扩增子，形成一个或多个水凝胶嵌入式扩增子。所述水凝胶-组织化学反应包括使核酸共价附着于原位合成水凝胶，以便进行组织透明化、酶扩散和多循环测序，而现有水凝胶-组织化学方法无法实现这一点。在一些实施例中，为了让扩增子能够嵌入组织-水凝胶环境中，将胺修饰核苷酸纳入滚环扩增反应，使用丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯通过丙烯酰胺部分官能化，并与丙烯酰胺单体共聚合，形成水凝胶。
本发明所用术语“水凝胶”或“水凝胶网络”系指由非水溶性聚合物链组成的网络，有时是以水为分散介质的胶态凝胶。换言之，水凝胶是一类可吸收大量水而不溶解的聚合材料。水凝胶可包含99％以上的水，并且可包括天然或合成聚合物或其组合。水凝胶因其含水量极大而具有与天然组织非常相似的柔韧度。有关合适水凝胶的详细说明，可参见第20100055733号公开美国专利申请，所述申请通过本发明的具体引用，成为本发明的一部分。本发明所用术语“水凝胶亚基”或“水凝胶前体”系指可通过交联或“聚合”形成三维(3D)水凝胶网络的亲水性单体、预聚物或聚合物。公认的是，在水凝胶亚基存在的情况下，通过对生物样本进行上述固定，可以使样本的组分与水凝胶亚基交联，以便将分子组分固定到位，并保持组织结构和细胞形态，而不受任何科学理论的约束。
在一些实施例中，所述嵌入包括将一个或多个扩增子与丙烯酰胺共聚合。本发明所用术语“共聚物”系指包含一个以上亚基类型的聚合物。该术语涵盖包含两个、三个、四个、五个或六个亚基类型的聚合物。
在某些方面，所述嵌入包括将一个或多个水凝胶嵌入式扩增子透明化，其中，所述靶核酸基本上留存在一个或多个水凝胶嵌入式扩增子中。在此类实施例中，所述透明化包括从一个或多个水凝胶嵌入式扩增子中基本上去除多种细胞组分。在一些其他实施例中，所述透明化包括从一个或多个水凝胶嵌入式扩增子中基本上去除脂质和/或蛋白。本发明所用术语“基本上”系指透明化前样本中的原始量减少约70％或以上，例如75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上、100％。
在一些实施例中，所述将水凝胶嵌入式扩增子透明化的步骤包括对样本进行电泳。在一些实施例中，使用包含离子型表面活性剂的缓冲溶液对扩增子进行电泳。在一些实施例中，所述离子型表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施例中，在约10伏特至约60伏特范围内的电压下对样本进行电泳。在一些实施例中，将样本电泳约15分钟至约10天范围内的一段时间。在一些实施例中，所述方法进一步涉及在封固剂中孵育透明化样本，所述封固剂的折射率与透明化组织的折射率相匹配。在一些实施例中，所述封固剂会提高样本的光学透明度。在一些实施例中，所述封固剂包括甘油。
细胞
本发明公开的方法包括一种对完整组织内细胞中靶核酸进行原位基因测序的方法。在某些实施例中，所述细胞存在于细胞群中。在某些其他实施例中，所述细胞群包含多个细胞类型，包括但不限于兴奋性神经元、抑制性神经元和非神经元细胞。用于本发明所述检测的细胞可以是生物体及源自生物体的单一细胞类型，或者可以是细胞类型的混合物。所述细胞包括天然细胞及细胞群、基因工程细胞系、源自转基因动物的细胞等。实际上可考虑任何细胞类型和大小。合适的细胞包括细菌、真菌、植物和动物细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如复杂细胞群，例如天然组织，例如血液、肝脏、胰腺、神经组织、骨髓、皮肤等。可将一些组织破碎成单分散悬液。可替代地，所述细胞可以是培养群体，例如源自复杂群体的培养物和源自单一细胞类型的培养物(其中细胞分化成多个谱系，或者对刺激具有不同反应)等。
可用于本发明的细胞类型包括干细胞和祖细胞(例如胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经嵴细胞等)、内皮细胞、肌细胞、心肌、平滑肌和骨骼肌细胞、间充质细胞、上皮细胞；造血细胞，例如淋巴细胞，包括T细胞，例如Th1 T细胞、Th2 T细胞、ThO T细胞、细胞毒性T细胞；B细胞、前B细胞等；单核细胞；树突状细胞；中性粒细胞；以及巨噬细胞；自然杀伤细胞；肥大细胞等；脂肪细胞以及与胸腺、内分泌腺、胰腺、脑等特定器官相关的细胞(例如神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、树突状细胞等)及其基因修饰细胞。造血细胞可与炎性过程、自身免疫性疾病等相关，内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等可与心血管疾病相关；几乎任何类型的细胞均可与以下病变相关：肿瘤，例如肉瘤、癌和淋巴瘤；肝细胞疾病；肾细胞疾病；等等。
所述细胞还可以是不同类型的转化细胞或肿瘤细胞，例如不同细胞来源的癌、不同细胞类型的淋巴瘤等。美国模式培养物集存库(弗吉尼亚州马纳萨斯)收集并提供了来自150余个不同物种的4,000余种细胞系，其中癌细胞系多达950余种，包括700种人类癌细胞系。美国国家癌症研究所汇编了来自大量人类肿瘤细胞系的临床、生物化学和分子数据，这些数据可通过ATCC或NCI获得(Phelps等人(1996)《细胞生物化学杂志》增刊24:32-91)。所述细胞包括自发地衍生的不同细胞系，或者针对所需生长或反应特征从单个细胞系中选择的细胞；并且可包括源自相似肿瘤类型但来自不同患者或部位的多种细胞系。
细胞可以是：非贴壁细胞，例如血细胞，包括单核细胞、T细胞、B细胞；肿瘤细胞等；或贴壁细胞，例如上皮细胞、内皮细胞、神经细胞等。为了分析贴壁细胞，可通过保留其识别和结合探针分子的能力的方式，将其从所贴附的基质及其他细胞中解离出来。
可利用本领域已知的多种技术，通过抽取、灌洗、洗涤、手术解剖等方式，从个体的血液、骨髓、实体组织(例如实体瘤)、腹水等多种组织中采集此类细胞。可从固定或未固定、新鲜或冷冻、完整或分解的样本中获得细胞。可利用已知技术机械地或酶促地分解组织。
本公开非限制方面示例
上述发明主题的各个方面(包括实施例)可以单独或与一个或多个其他方面或实施例相结合而产生效益。在不限制以上描述的情况下，下面提供了本公开编号1-34的某些非限制性方面。在阅读本公开后，本领域技术人员可明显看出，每个独立编号的方面可以与前面或后面的任何独立编号的方面一起使用或组合。这旨在为各个方面的所有此类组合提供支持，不限于以下明确提供的方面的组合：
1.一种测序设备，包括：
(a)一个照明和检测模块，包括：一个转盘共聚焦部件，包括通过平面照明校正进行照明的多条激光线，其中，所述多条激光线用于以一个或多个波长的激发光照亮样本；一个带通发射滤光片；一个长通图像分割器；一个第一摄像机，在第一波长范围内检测荧光发射；以及一个第二摄像机，在第二波长范围内检测荧光发射，其中，所述第一摄像机和第二摄像机可同时检测发射；
(b)一个显微镜模块，包括：一个电动载物台，能够沿x、y和z轴进行多轴定位；一个物镜Z驱动器；一个物镜转轮，包括多个物镜，其中，每个物镜提供不同的放大率，一个或多个物镜是浸没物镜，每个浸没物镜具有物镜浸没环；以及多个光学器件，其中，所述光学器件将光从物镜引导到所述照明和检测模块；
(c)一个自动浸没介质模块，包括：i)一个容器，包含浸没介质；ii)多条流体管线，与容器以及显微镜模块浸没物镜的物镜浸没环耦合，其中，所述流体管线将浸没介质引入和引出物镜浸没环，其中，所述浸没环捕获多余的浸没介质；以及iii)一组泵，与流体管线和微控制器连接，其中，所述微控制器控制泵通过流体管线添加和移除浸没介质，其中，所述自动浸没介质模块在成像期间向浸没物镜顶部的物镜浸没环提供受控体积的浸没介质；
(d)一个多孔板，其中，可通过移动电动载物台将多孔板的孔定位到用于成像的物镜下方；
(e)一个流体耦合塔，其中，所述流体耦合塔位于电动载物台顶部，将流体管线定位到多孔板的孔中；
(f)一个流体管理模块，包括：一个对称旋转阀，包括一个旋转阀机构；一个泵，其中，所述泵与流体管线连接；以及多个气泡检测器，其中，所述气泡检测器位于通向泵的流体管线的任一侧，其中，所述流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过流体管线单向或双向流动；
(g)一个试剂、缓冲液和废液模块，包括：i)一个滑动托盘，其中，可将试剂盒和缓冲液盒定位到滑动托盘中并与流体管理模块耦合；ii)一个废液模块，包括一个废液容器，其中，所述废液容器与来自流体管理泵的流体管线耦合；以及iii)一个加盖机构，其中，所述加盖机构在从系统中移除废液容器以进行废液废弃处置时关闭废液容器，在将废液容器放回到系统中时打开废液容器；
(h)一个电气模块，包括：i)一个第一固件板，控制自动浸没介质模块的介质分配；以及ii)一个第二固件板，控制流体管理模块以及试剂、缓冲液和废液模块，其中，所述电气模块调节向系统的其他模块供应的电力；以及
(i)一个处理器，经过编程可提供用户界面并操作测序设备的各个模块。
2.根据方面1所述的测序设备，其中，所述多条激光线包括至少5条激光线。
3.根据方面2所述的测序设备，其中，所述带通发射滤光片是五带通发射滤光片。
4.根据方面1-3中任一项所述的测序设备，其中，所述电动载物台具有压电z轴。
5.根据方面1-4中任一项所述的测序设备，其中，所述浸没介质是水。
6.根据方面1-5中任一项所述的测序设备，其中，所述浸没介质经过过滤且不含气泡。
7.根据方面1-6中任一项所述的测序设备，进一步包括每个物镜上的O形环以及收缩包装涂层。
8.根据方面1-7中任一项所述的测序设备，进一步包括一个监测流体管线中压力的压力监测器，其中，可利用流体管线中压力的增加，检测流体管线的潜在堵塞。
9.根据方面1-8中任一项所述的测序设备，进一步包括多个发光二极管(LED)，其中，每个LED可通过发光提供系统的状态指示。
10.根据方面1-9中任一项所述的测序设备，进一步包括一个用于显示信息并提供用户界面的显示部件。
11.根据方面1-10中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：
(a)将选定样本定位到多孔板中；
(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；
(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；
(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；
(e)显示步骤(d)中产生的图像；
(f)向用户提供界面，以便用户选择对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；
(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；
(h)计算样本中目标区域的体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；
(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；
(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及
(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
12.根据方面1-11中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：
向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；
限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及
推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。
13.根据方面1-12中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
14.根据方面1-13中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：
在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；
采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及
在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
15.根据方面1-14中任一项所述的测序设备，其中，所述测序是组织样本中靶核酸的原位测序。
16.根据方面15所述的测序设备，其中，所述组织样本是厚度为20μm-200μm的组织切片。
17.根据方面1-16中任一项所述的测序设备，其中，所述原位测序是顺序或组合原位测序。
18.根据方面1-17中任一项所述的测序设备，其中，所述显微镜模块包括一个落射荧光显微镜、一个共聚焦显微镜、一个结构照明显微镜或一个光片或斜面光片显微镜。
19.根据方面18所述的测序设备，其中，所述共聚焦显微镜是转盘或点扫描共聚焦显微镜。
20.一种使用根据方面1-19中任一项所述的测序设备的方法，包括：
将样本装入多孔板中；
选择多孔板中需测序的样本；
选择测序方案；以及
使用根据方面1-19中任一项所述的测序设备对选定样本中的核酸进行测序。
21.根据方面20所述的方法，其中，所述测序是组织样本的原位体积测序。
22.根据方面20或21所述的方法，其中，所述组织样本是厚度为20-200μm的组织切片。
23.根据方面20-22中任一项所述的方法，其中，所述原位测序是顺序或组合原位测序。
24.一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：
(a)将选定样本定位到多孔板中；
(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；
(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；
(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；
(e)显示步骤(d)中产生的图像；
(f)向用户提供界面，以便用户选择对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；
(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；
(h)计算目标区域的样本体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；
(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；
(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及
(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
25.一种非暂态计算机可读介质，包括程序指令，其中，所述程序指令由计算机中的处理器执行时，使处理器执行根据方面24所述的方法。
26.一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：
向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；
限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及
推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。
27.根据方面26所述的计算机实现方法，其中，所述计算机进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
28.一种非暂态计算机可读介质，包括程序指令，其中，所述程序指令由计算机中的处理器执行时，使处理器执行根据方面26或27所述的方法。
29.一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：
在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；
采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及
在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
30.一种非暂态计算机可读介质，包括程序指令，其中，所述程序指令由计算机中的处理器执行时，使处理器执行根据方面29所述的方法。
31.一种自动浸没介质模块，包括：
(a)一个容器，包含浸没介质；
(b)多条流体管线，与容器以及显微镜模块物镜的物镜浸没环耦合，其中，所述流体管线将浸没介质引入和引出浸没物镜上的物镜浸没环，所述浸没环捕获多余的浸没介质；以及
(c)一组泵，与流体管线和微控制器连接，其中，所述微控制器控制泵通过流体管线添加和移除浸没介质，其中，所述自动浸没介质模块在成像期间向物镜顶部的物镜浸没环提供受控体积的浸没介质。
32.一种使用根据方面31所述的自动浸没介质模块的方法，包括：使用根据方面31所述的自动浸没介质模块将浸没介质输送到与显微镜浸没物镜附接的物镜浸没环。
33.一种流体管理模块，包括：一个对称旋转阀，包括一个旋转阀机构；一个泵，其中，所述泵与流体管线连接；以及多个气泡检测器，其中，所述气泡检测器位于通向泵的流体管线的任一侧，其中，所述流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过流体管线双向或单向流动。
34.一种试剂、缓冲液和废液模块，包括：
(a)一个滑动托盘，其中，可将试剂盒和缓冲液盒定位到滑动托盘中并与流体管理模块耦合；
(b)一个废液模块，包括一个废液容器，其中，所述废液容器与来自流体管理泵的流体管线耦合；以及
(c)一个加盖机构，其中，所述加盖机构在从系统中移除废液容器以进行废液废弃处置时关闭废液容器，在将废液容器放回到系统中时打开废液容器。
实验性示例
以下示例旨在向本领域普通技术人员全面公开和说明如何制作和使用本发明，而非限制发明人认定的发明范围，亦不代表以下实验是所进行的全部或唯一实验。本发明已尽最大努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但读者仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度单位为摄氏度，压力为大气压力或接近大气压力。
本说明书引用的所有出版物和专利申请通过本发明的引用，成为本发明的一部分，如同具体且单独地说明每个单独出版物或专利申请通过引用成为本发明的一部分。
本发明的描述涉及发明人发现或提出的特定实施例，包括本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，根据本公开，在不偏离本发明预定范围的情况下，可以对特定示例化实施例进行很多修改和改变。例如，由于密码子冗余，在不影响蛋白序列的情况下，可以对基本DNA序列进行改变。另外，出于生物功能等同性考虑，在不影响生物作用种类或数量的情况下，可以对蛋白结构进行改变。所有此类修改均属于所附权利要求的范围。
示例1
新一代体积原位测序仪
概述
1.集成流体和快速共聚焦平台以及多达5条通道的成像
2.自动浸没介质模块
稳健气泡预防程序
3.样本/流体耦合塔
4.定制废液容器
5.测序仪软件
a.GUI
b.快速样本查找算法(通用于3D测序样本)
c.测序时间、并行性、试剂消耗和磁盘空间联合优化(通用于3D测序样本)
d.对样本界面和xyz位置进行闭环检测，尽可能减小多个轮次之间的数据偏移。
技术说明
在能够对许多样本并行进行多个测序轮次和成像循环的自动集成流体和成像平台上对样本进行测序。所述测序仪具有多个关键模块：
照明和检测模块集成来自Andor Technologies的部件，由转盘共聚焦部件、五激光线照明、Borealis平面照明校正、五带通发射滤光片、长通图像分割器以及用于同时检测短波长和长波长照明发射的两个检测摄像机组成。
定制显微镜模块组合采用电动XYZ载物台(具有压电Z)、物镜Z驱动器、转轮、由低到高放大率不等的多个物镜以及将光从物镜引导到照明和检测模块的光学器件。
新型自动浸没介质模块与需要在物镜与盖玻片之间使用浸没介质的物镜耦合，向物镜顶部提供精确受控体积的经过滤无气泡介质(例如水)，同时管理流入和流出。该模块与高放大率浸没物镜相结合，能够实现样本的并行测序，而无需手动添加浸没介质。一组泵和微控制器管理浸没介质的添加和移除，从而尽可能减小盖玻片上的表面张力(尽可能减小样本在Z维度上的偏移)，避免气泡，防止液体溢出，并确保物镜上的体积足以进行长时间的成像。这涉及液体流速的算法协调、物镜相对于样本在x、y和z方向上的位置、可去除气泡的液体更换步骤以及流体更换时机。例如，通过套环将经校准体积的浸没介质(通常是水)进给到物镜上后，沿对角线移动载物台，以防气泡形成。浸没环捕获多余的浸没介质，防止介质通过多个O形环以及物镜上的收缩包装涂层进入物镜。集成到物镜转台中的中央塔管理将浸没介质引入或引出物镜浸没环的流体管线。
放置在XYZ载物台上的新型流体耦合塔将流体管线定位到多孔样本板中。通过该耦合器，可以轻松从显微镜载物台上添加和移除样本，并将流体管线与样本配合，同时尽可能减少自动显微镜载物台上的结构负载(载物台上的重量过大时，精确定位和快速移动会受到影响)。束流中断装置检测样本是否完全耦合到系统中，结构元件在运行期间预防流体管线损坏或用户人身损害。
流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过对称旋转阀、泵和旋转阀机构双向移动。定制固件控制泵移动并监测管线压力。通过在通向(位于旋转阀之前)泵的管线的任一侧使用气泡检测器，可以使流向泵的液体以精确的体积移动。通过监测管线中的压力，可以获得标称流体流量并检测管线的潜在堵塞。
试剂、缓冲液和废液模块安排系统中测序试剂和缓冲液的添加以及废液的移除。其滑动托盘组成，所述滑动托盘可由容纳定制试剂盒和缓冲液盒并随后与流体管理模块自动耦合。废液模块通过加盖机构设计从流体管理泵接收流出管线，该设计确保废液容器在从系统移除以进行废液废弃处置时关闭，但在放回到系统中时打开。
电气模块调节向系统的各个部件供应的电力。一个固件板控制自动浸没介质分配器，第二固件板控制流体管理模块以及试剂、缓冲液和废液模块。此外，LED显示系统的相关状态指示。
定制计算机软件程序兼具后端和GUI模块，在用户与测序仪固件和硬件之间提供界面，包括定序运行设置、测序运行选项、样本目标区域(ROI)界定、测序和成像所需的高级操作、自动浸没系统的高级控制、样本间测序的并行化、日志记录、误差监测、数据采集、管理和传输以及运行进度监测。该计算机软件程序包含多种新型算法，以实现运行设置以及测序轮次的成像一致。自动3D样本查找和ROI指定算法通过最大限度的摄像机像素合并进行低放大率宽场成像模式采集，快速检测XY平面中来自样本的信号。使用该信号分割样本周围的XY边界框。随后，为了确定样本的近似Z范围，以更高的放大率但仍通过最大限度的摄像机像素合并沿Z方向在共聚焦成像模式下对XY边界进行快速二次采样。通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内快速收集单个Z平面，并向用户显示该平面。此时，用户可通过界面选择对选定样本进行测序时需成像的预期XY ROI。随后，在先前经采样的Z范围内对XYROI进行更详细的采集。向用户显示体积，并根据体积在给定ROI中沿Z方向分割样本范围。在测序开始前，用户可通过界面更精细地调整体积的Z范围。根据ROI界定得出的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并进一步转换成显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，以便在测序期间对XYZ ROI进行最佳成像。利用ROI界定算法，可实现快速半自动3D ROI界定，并尽可能减少用户交互(例如孔中样本的随意手动控制和搜索以及剪辑界定和测试，此类交互对于缺乏经验的用户而言极其耗时且困难)的总量。对用户想要测序的每个样本孔进行自动ROI程序。
第二算法指导用户进行测序运行设置，以确保最佳的样本并行性和测序仪时间效率，同时防止收集到的数据量受到(存储或传输)限制，或者缓冲液和试剂的用量超出可用量。用户会关注不同样本类型中不同XYZ范围的ROI，而超出ROI的多余成像体积与用户无关，因此该算法对于空间测序方法(尤其是体积测序方法)至关重要。另外，单次样本采集可产生数太字节的需存储和/或传输的原始数据。进一步地，由于测序套件具有最大容量的缓冲液和试剂，特别是可根据确切的测序方案和所需的轮次数量，限制用户规定使用的样本量。因此，优化算法需要平衡多样本测序时间、缓冲液/试剂可用性、测序方案、总数据收集量和传输容量，以及XYZ方向上的ROI范围。该算法可严格限制总测序时间(例如三天)、总数据采集量和采集速率(与可用数据传输/卸载速率相关)、所有样本的最高ROI预算以及最大缓冲液/试剂可用量，同时推荐使最大预期测序量满足这些限制的ROI和样本方案组合。根据不同数量的样本和成像类型，可得出不同时间的最佳并行化解决方案，因此上述优化还涉及使用子程序优化器实现样本测序并行化。
在样本测序期间应用的另一种算法无需由完美聚焦系统硬件利用经盖玻片反射成一定角度的红外激光在闭环中查找Z位置设定点。所述算法在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在该位置的特征Z轮廓。采用分割方法确定样本顶部和底部分界面，并在剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离。这样，即使各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上存在偏移，也可以确保将样本Z偏移减小到一定的容差以下，促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。在无法使用完美聚焦硬件系统进行组合测序的情况下，必须对齐各轮次间衍射受限光斑的精确位置，因此该算法尤为重要；并且当样本厚度很小时，相对于Z方向上的总样本范围，任何轮次中Z方向上的偏移都可能很大，导致每个轮次中样本范围边缘的数据丢失百分比较大，因此该算法也很重要。此类算法还可用于XY方向上的对齐，但考虑到采集的长宽比，由XY方向上意外样本移动导致的数据丢失百分比通常极小。
Claims (34)
1.一种测序设备，包括：
(a)一个照明和检测模块，包括：一个转盘共聚焦部件，包括通过平面照明校正进行照明的多条激光线，其中，所述多条激光线用于以一个或多个波长的激发光照亮样本；一个带通发射滤光片；一个长通图像分割器；一个第一摄像机，在第一波长范围内检测荧光发射；以及一个第二摄像机，在第二波长范围内检测荧光发射，其中，所述第一摄像机和第二摄像机可同时检测发射；
(b)一个显微镜模块，包括：一个电动载物台，能够沿x、y和z轴进行多轴定位；一个物镜Z驱动器；一个物镜转轮，包括多个物镜，其中，每个物镜提供不同的放大率，其中，一个或多个物镜是浸没物镜，其中，每个浸没物镜具有物镜浸没环；以及多个光学器件，其中，所述光学器件将光从物镜引导到所述照明和检测模块；
(c)一个自动浸没介质模块，包括：i)一个容器，包含浸没介质；ii)多条流体管线，与容器以及显微镜模块浸没物镜的物镜浸没环耦合，其中，所述流体管线将浸没介质引入和引出物镜浸没环，其中，所述浸没环捕获多余的浸没介质；以及iii)一组泵，与流体管线和微控制器连接，其中，所述微控制器控制泵通过流体管线添加和移除浸没介质，其中，所述自动浸没介质模块在成像期间向浸没物镜顶部的物镜浸没环提供受控体积的浸没介质；
(d)一个多孔板，其中，可通过移动电动载物台将多孔板的孔定位到用于成像的物镜下方；
(e)一个流体耦合塔，其中，所述流体耦合塔位于电动载物台顶部，将流体管线定位到多孔板的孔中；
(f)一个流体管理模块，包括：一个对称旋转阀，包括一个旋转阀机构；一个泵，其中，所述泵与流体管线连接；以及多个气泡检测器，其中，所述气泡检测器位于通向泵的流体管线的任一侧，其中，所述流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过流体管线单向或双向流动；
(g)一个试剂、缓冲液和废液模块，包括：i)一个滑动托盘，其中，可将试剂盒和缓冲液盒定位到滑动托盘中并与流体管理模块耦合；ii)一个废液模块，包括一个废液容器，其中，所述废液容器与来自流体管理泵的流体管线耦合；以及iii)一个加盖机构，其中，所述加盖机构在从系统中移除废液容器以进行废液废弃处置时关闭废液容器，在将废液容器放回到系统中时打开废液容器；
(h)一个电气模块，包括：i)一个第一固件板，控制自动浸没介质模块的介质分配；以及ii)一个第二固件板，控制流体管理模块以及试剂、缓冲液和废液模块，其中，所述电气模块调节向系统的其他模块供应的电力；以及
(i)一个处理器，经过编程可提供用户界面并操作测序设备的各个模块。
2.根据权利要求1所述的测序设备，其中，所述多条激光线包括至少5条激光线。
3.根据权利要求2所述的测序设备，其中，所述带通发射滤光片是五带通发射滤光片。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的测序设备，其中，所述电动载物台具有压电z轴。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的测序设备，其中，所述浸没介质是水。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的测序设备，其中，所述浸没介质经过过滤且不含气泡。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的测序设备，进一步包括每个物镜上的O形环以及收缩包装涂层。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的测序设备，进一步包括一个监测流体管线中压力的压力监测器，其中，可利用流体管线中压力的增加，检测流体管线的潜在堵塞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的测序设备，进一步包括多个发光二极管(LED)，其中，每个LED可通过发光提供系统的状态指示。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的测序设备，进一步包括一个用于显示信息并提供用户界面的显示部件。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：
(a)将选定样本定位到多孔板中；
(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；
(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；
(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；
(e)显示步骤(d)中产生的图像；
(f)向用户提供界面，以便用户选择对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；
(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；
(h)计算样本中目标区域的体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；
(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；
(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及
(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：
向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；
限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及
推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的测序设备，其中，所述处理器进一步经过编程可执行以下各个步骤：
在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；
采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及
在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的测序设备，其中，所述测序是组织样本中靶核酸的原位测序。
16.根据权利要求15所述的测序设备，其中，所述组织样本是厚度为20μm-200μm的组织切片。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的测序设备，其中，所述原位测序是顺序或组合原位测序。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的测序设备，其中，所述显微镜模块包括一个落射荧光显微镜、一个共聚焦显微镜、一个结构照明显微镜或一个光片或斜面光片显微镜。
19.根据权利要求18所述的测序设备，其中，所述共聚焦显微镜是转盘或点扫描共聚焦显微镜。
20.一种使用根据权利要求1-19中任一项所述的测序设备的方法，包括：
将样本装入多孔板中；
选择多孔板中需测序的样本；
选择测序方案；以及
使用根据权利要求1-19中任一项所述的测序设备对选定样本中的核酸进行测序。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述测序是组织样本的原位体积测序。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述组织样本是厚度为20-200μm的组织切片。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述原位测序是顺序或组合原位测序。
24.一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：
(a)将选定样本定位到多孔板中；
(b)通过摄像机像素合并进行宽场成像模式采集，从而以低放大率检测XY平面中来自选定样本的信号；
(c)使用该信号分割样本周围的XY边界框；
(d)对XY边界框内的样本进行成像，产生图像，其中，通过摄像机像素合并以比步骤(b)所用放大率更高的放大率沿Z方向在共聚焦成像模式下进行成像，从而确定样本的近似Z范围，其中，通过先前确定的Z范围的中点在XY范围内收集单个Z平面；
(e)显示步骤(d)中产生的图像；
(f)向用户提供界面，以便用户选择对选定样本进行测序时需进一步成像的样本中的预期目标XY区域；
(g)在先前经采样的Z范围内对选定目标XY区域中的样本进行成像；
(h)计算目标区域的样本体积，并向用户显示目标区域的样本体积计算值；
(i)沿Z范围分割目标区域中样本的图像；
(j)向用户提供界面，以便用户在开始测序前调整样本体积的Z范围，其中，源自用户界定目标区域的成像范围自动转换成给定成像物镜的适当剪辑视场，并调整显微镜载物台位置、物镜Z定位和压电边界，从而在测序期间沿XYZ轴对目标区域进行成像；以及
(k)重复步骤(a)-(j)，界定用户想要测序的多孔板中每个样本的目标区域。
25.一种非暂态计算机可读介质，包括程序指令，其中，所述程序指令由计算机中的处理器执行时，使处理器执行根据权利要求24所述的方法。
26.一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：
向用户提供界面，以便用户选择一个或多个用于测序的样本以及测序方案，其中，根据可用缓冲液和试剂用量以及选定测序方案限制用户选择的样本量；
限制所有待测序和成像样本的总测序时间、总数据采集量、采集速率以及目标区域的最大总体积；以及
推荐在限制范围内最大限度地对样本中预期目标区域进行测序的方案。
27.根据权利要求26所述的计算机实现方法，其中，所述计算机进一步经过编程可根据待测序样本的数量和测序时采用的成像类型，优化样本测序并行化。
28.一种非暂态计算机可读介质，包括程序指令，其中，所述程序指令由计算机中的处理器执行时，使处理器执行根据权利要求26或27所述的方法。
29.一种计算机实现方法，其中，所述计算机执行以下各个步骤：
在给定样本剪辑的起始XY位置沿Z方向进行快速共聚焦扫描，以确定样本在起始XY位置的Z轮廓；
采用分割方法确定样本顶部和底部分界面；以及
在样本剪辑开始时将物镜Z位置设置为与该分界面保持固定距离，其中，将各轮次间样本相对于载物台和物镜在Z方向上的偏移减小到选定容差以下，从而促进采集后处理期间各个轮次的下游亚像素配准。
30.一种非暂态计算机可读介质，包括程序指令，其中，所述程序指令由计算机中的处理器执行时，使处理器执行根据权利要求29所述的方法。
31.一种自动浸没介质模块，包括：
(a)一个容器，包含浸没介质；
(b)多条流体管线，与容器以及显微镜模块物镜的物镜浸没环耦合，其中，所述流体管线将浸没介质引入和引出浸没物镜上的物镜浸没环，所述浸没环捕获多余的浸没介质；以及
(c)一组泵，与流体管线和微控制器连接，其中，所述微控制器控制泵通过流体管线添加和移除浸没介质，其中，所述自动浸没介质模块在成像期间向物镜顶部的物镜浸没环提供受控体积的浸没介质。
32.一种使用根据权利要求31所述的自动浸没介质模块的方法，包括：使用根据权利要求31所述的自动浸没介质模块将浸没介质输送到与显微镜浸没物镜附接的物镜浸没环。
33.一种流体管理模块，包括：一个对称旋转阀，包括一个旋转阀机构；一个泵，其中，所述泵与流体管线连接；以及多个气泡检测器，其中，所述气泡检测器位于通向泵的流体管线的任一侧，其中，所述流体管理模块允许试剂、缓冲液和废液通过流体管线双向或单向流动。
34.一种试剂、缓冲液和废液模块，包括：
(a)一个滑动托盘，其中，可将试剂盒和缓冲液盒定位到滑动托盘中并与流体管理模块耦合；
(b)一个废液模块，包括一个废液容器，其中，所述废液容器与来自流体管理泵的流体管线耦合；以及
(c)一个加盖机构，其中，所述加盖机构在从系统中移除废液容器以进行废液废弃处置时关闭废液容器，在将废液容器放回到系统中时打开废液容器。
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| PB01 | Publication | ||
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