CN102892904B - 植入前遗传筛查用的比较性基因组杂交阵列方法 - Google Patents

Abstract

提供了测试样品基因组DNA中存在拷贝数不均衡的确定方法。所述方法可以分别测量单一测试样品与第一杂交阵列的杂交和多个参照样品与多个其他各自测试阵列的杂交。基于最佳拟合参照阵列，可以相对于待测阵列来确定拷贝数。所述最佳拟合可以在最接近或最相似的测得信号信噪比的基础上予以确定。

Description

植入前遗传筛查用的比较性基因组杂交阵列方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年3月16日提交的美国专利申请12/724,865的权益，其全部内容通过引用并入本文。

领域

本发明涉及用于检测胚胎、卵母细胞、极体或相关活检物的细胞内遗传异常的方法。

背景

在IVF(体外受精)领域中，希望在胚胎植入前鉴定胚胎细胞中的染色体数量和染色体组。越来越多的证据表明影响胚胎存活率的最重要因素之一是染色体不均衡，包括拷贝数增加/损失和整个染色体的非整倍体(染色体数目异常)。

当前的测试方法首先涉及代表被测试胚胎的遗传物质的分离。非整倍体分析中目前使用的样本是与卵母细胞相关的极体切片、来自卵裂球切片(与第3天胚胎相关)的单细胞、或囊胚滋养层细胞切片(与第5天胚胎或囊胚相关)。但在某些情况下，在过程中的其他点或多个点采集的样品经证明更有效。然后通过多种方法对极体或细胞进行测试来检测拷贝数的不均衡。虽然文献中经常见到的术语是PGD，但考虑到本申请的目的，还是把这类测试方法简称为胚胎植入前遗传筛查(PGS)。名词PGS还应当包括测试极体来评估卵母细胞的质量从而例如保证信息可靠的卵子库服务。

比较基因组杂交(CGH)技术已被用于检测基因组DNA中是否存在被扩增或删除的序列(对应所谓拷贝数的变化)以及它们的位置。一般来说，基因组DNA分离自正常的参照细胞，也分离自测试细胞。将两个核酸样品差异标记，然后与参照细胞的中期染色体原位杂交。参照和测试DNA中的重复序列被去除，或者通过某些手段降低它们的杂交能力。通过检测来自两个DNA的信号比率改变的区域，可以识别测试细胞中拷贝数增加或减少的染色体区域。这类拷贝数变化的区域的检测对诊断遗传疾病尤其重要。

如以上描述的中期CGH已被采用并且有能力筛查所有染色体中的异常。为了将CGH分析应用到PGS环境，需要在分析前将整个基因组扩增从而使DNA的量从单个细胞(5-10pg)增加到适合中期CGH(1μg)的水平。常用的扩增方法包括DOP-PCR(Teleniusetal，1992)，或者更近期的全基因组扩增试剂盒，比如GENOMEPLEX(Rubicongenomics)和REPLI-G(Qiagen)。临床情景中使用细胞分裂中期CGH的主要问题是它可能需要大约4天来完成，在不进行后续周期中的胚胎冷冻和植入的情况下，这与IVF中胚胎植入前所需的时间框架不相容。此外，该方法技术上颇有挑战性，需要较高的专业水平来实施和分析。这些困难限制了中期CGH在PGS中的广泛使用。

Pinkel等人在1998和2003年公开了已广为人知的阵列比较基因组杂交的技术，以下简称为arrayCGH。1998年，Solinas-Toldo等人描述了类似的“基于矩阵的比较基因组杂交”方法。

arrayCGH技术就利用双链DNA的结合特异性方面来说，与CGH依赖于相似的分析原理。在arrayCGH中，参照细胞的中期染色体被可能数以千计的固体支持物结合的未标记靶核酸(探针)集合所取代，例如，已经被置入染色体特定位置的克隆的阵列。因此ArrayCGH是一类高通量检测两个DNA样本之间拷贝数差异的比较技术，其中所述两个DNA样品与相同的杂交区域杂交。它比CGH具有的优势是它能达到更高的分辨率，并且在拷贝数检测很重要的其他领域之外，还能够应用于由拷贝数变化所诱发的遗传性疾病的检测和诊断。虽然细节有所不同，可以使用多种不同的探针类型，包括在寡核苷酸、PAC和细菌人工染色体(BAC)阵列中遇到的探针类型。

ArrayCGH目前被用于在体质细胞遗传学中协助临床医务人员研究基因组不均衡，并且越来越多地用于癌症研究。这些应用有着令人难以置信的要求，要求为这些应用设计的微阵列的生产标准比那些用于学术或临床前研究应用的微阵列的标准严格得多。

ArrayCGH相对中期CGH所具有的优点在于解释更简单并且容易实现自动化；此外完整分析所需要的时间更短。ArrayCGH可用于检测单个细胞中的非整倍体，并已成功地应用于PGS。对这项技术，必须将单细胞扩增，采用那些与中期CGH使用的方法相同的方法。ArrayCGH允许在48小时内完成整个基因组的全面分析，这使得在不需要PGS中细胞冻存的情况下进行非整倍体筛查。

为了达到最佳的分析结果，arrayCGH需要测试样品和参照样品在质量和浓度方面很好地匹配。在PGS的情形中，任何分析的起点对卵子库来说都是代表受精胚胎或卵母细胞的遗传物质。目前，有可能检验极体或卵裂球内所含的遗传物质、由8细胞胚胎提取的单个细胞，或者替代的来自胚泡或相关活检物的少量细胞。由于从这类材料中只能获得有限量的DNA，多数下游分析需要利用DNA扩增程序来产生众多拷贝数量的原料。应当明白，当受精过程开始时，有两种极体(PB1和PB2)被排出。这个过程并非这么简单。本文中，名词“极体”可包括排出的或者由初级或次级卵母细胞切片的极体。

虽然可以使用未扩增的基因组参照材料，相应的arrayCGH结果可能显示出由于扩增测试与未扩增参照的匹配度不好造成的高噪音水平。因此，这种情形中使用的参照材料往往是“正常”的DNA样品集合稀释到包含大致类似量的DNA作为少数单个细胞。然后使用相同的方法将这种稀释的参照材料和试验样品一样进行扩增。即使采取了这些步骤来配合测试和参照样本的性质，这并不总是有效，结果的明确性可能有不同。这可能是多种原因造成的，包括在起始DNA的定量中的小误差和因此造成的稀释样品中的DNA量的变化；扩增过程的随机性质造成的变化；参照中不存在的测试样品中的杂质的扩增；低样品DNA“质量”导致的增加的非特异性扩增；样品提取和保存中使用的试剂的用量和类型的不同。在所有情况中，扩增样品和参照所产生的差异都可能改变和模糊真实的扩增结果，导致arrayCGH特性改变，并且往往会增加噪音和抑制动态范围。

PGS是一种诊断应用，每个实验的标准做法是包括一个内部对照以证明实验成功运作，并且能够对各个实验之间由于例如前面描述过的扩增问题产生的动态范围的变化进行评估。使用arrayCGH时，解决这一问题最常用的方法是使用一个相对于测试样品拷贝数增加/减少已知的参照样品。然后，可以用这些来衡量每个单独检测的表现。

参照样品常常与测试样品的性别不匹配，使得对于X和Y染色体测试相对参照样品的log2比率发生位移，因此动态范围的测量值也发生位移。虽然适用许多情况，但是对于PGS的情况，一般不可能预先知道样品的性别，特别是对于卵裂球或囊胚切片样品的非整倍体筛查，可以是任一性别。因此，使用一个单一参照作为内部对照不可能可靠。此外，给测试样品选择单个适当的参照，并且参照在性染色体以外的区域的拷贝数不均衡是已知的一般是不可能的，因为胚胎/卵母细胞中的拷贝数变化程度非常高，目前的研究表明没有区域是可预见的稳定的。在一些实施方案中，可以根据非整倍体状态选择用于植入的胚胎。在其它实施方案中，基于较小的遗传畸变进行选择。

替代的方法是使用包含非人类对照序列的参照。然而，这种方法不理想，因为很难选择能够准确模仿人类序列的行为的非人类序列。无论如何，使用非人类对照序列还是会遭受相同的扩增偏向性和其他偏向性，作为单一参照这样的选择有挑战性。

为了克服PGS的这一问题，有必要进行两次分析单一测试样品的常规arrayCGH杂交，一次相对男性参照样品，另一次相对女性参照样品以确保分析正确运行。但是，这种策略的相关成本对于该应用来说过高。

当从胚胎(例如囊胚/滋养外胚层)取出的是两个或更多个细胞时，发生测试样品镶嵌现象的概率在PGS的情形中变得很高，因为胚胎常常是嵌合的。使问题更复杂的是，由于活检方法的不精确，从胚胎取出的细胞数量可能是未知的。虽然arrayCGH可以检测镶嵌，但由于缺乏足够复杂的内部对照，不能提供直接量化这种嵌合的手段，而且因为同样的原因，可能会错误地将实验噪音当作镶嵌现象。这种情形中，ArrayCGH依赖于单一参照样本同样有问题。

ArrayCGH需要有对比的荧光染料来标记测试和参照样本。常用的染料对Cy3和Cy5经常用于arrayCGH。Cy5染料易被环境中的臭氧降解，特别是结合高湿度时，这对分析质量的影响可能造成实验数据的丢失。使用ArrayCGH时其中两种荧光标记的样品与同一杂交区域竞争杂交，从而通过比例比较可以确定遗传物质的相对增加或减少。通常，一个样品是遗传组成未知的测试样品，一个样品是已知具有正常拷贝数的参照样品，其中所谓正常根据具体应用限定。ArrayCGH是一种强大可靠的技术，但是PGS应用提出了独特的技术挑战。在一些实施方案中，对胚胎染色体内容的评估可以通过直接在受精后提取细胞进行，或者间接地通过评估极体和产生胚胎的卵母细胞。在一些实施方案中，存在这样的应用，其唯一目的是要评估卵母细胞的内容，并不需要生产胚胎。这在本文中称为卵子库。

Buffart等(2008)提议了一种他们命名为“acrossarrayCGH”(aaCGH)的改良arrayCGH技术，作为对当前技术的改进。AaCGH与arrayCGH类似，但是，相较测试和参照样品均与单一杂交区域杂交，该技术中从独立的杂交区域比较测试和参照样品。由本发明的作者自主开发的这种方法，提供了成本以及可能数据质量方面的优势，因为它消除了任何由于染料偏向性造成的噪音。据报道，利用aaCGH获得的信息的质量可以媲美甚至超越使用一般双通道arrayCGH获得的信息的质量。据描述是使用多格式阵列，将参照样品和测试样品同时在同一载片上杂交，并且测试和参照被标以相同的荧光染料。他们将单个测试样品与单个参照样品进行比较。但该方法不能克服PGS面临的独特挑战。

也可以利用有别于arrayCGH的SNP阵列技术来确定DNA样品中的拷贝数，该技术也已运用在PGS应用中。SNP阵列提供对所有染色体的筛查，并允许并行基因分型。所用机制与arrayCGH的机制相当不同，因为该技术不进行比较。这项技术中不使用参照样品并且不进行同时杂交，确定拷贝数的方法依赖于各个等位基因的量化和随后的比例分析，而相反arrayCGH不对个别等位基因进行评估。SNP阵列的缺点包括噪音水平增加、操作方案更长、数据解释复杂和伦理问题，并有可能对单倍体样品的适用性较低。

分子细胞遗传学技术FISH(荧光原位杂交)使用染色体特异性DNA探针，常常被应用到PGS中，在间期核给出可检测性信号。虽然不需要扩增步骤，该技术存在的一个明显缺点是由于受到可供标记DNA探针的不同颜色的数量限制，只能同时评估有限数量的染色体。用于常规胚胎筛查的最全面的FISH方法目前只能评估一半的染色体，因此，会错过一些染色体异常。FISH的其他缺点包括很难进行评分的重叠信号。

概述

本发明的一个特征是提供一种方法用于确定待测DNA样品中存在的基因组DNA的拷贝数不均衡，所述方法能够降低与传统arrayCGH相关的测试和参照样品不匹配所造成的分析失败的风险。这种方法可以提高分析质量、准确性和产量。

本发明的另一个特征是提供一种方法用于确定待测DNA样品中存在的基因组DNA的拷贝数不均衡，所述方法分别测量单个测试样品与一个杂交阵列的杂交，以及一组参照样品与一或多个其他杂交阵列的杂交。

本发明再有一个特征是提供一种方法用于确定基因组DNA中存在的拷贝数不均衡，所述方法包括选择待测DNA和参照DNA样品的最佳配对。

本发明提供了一种方法用于确定测试样品的基因组DNA中拷贝数不均衡情形的存在。样品可以包括对来自测试样品的样品基因组DNA或者其扩增产物进行标记，形成标记的待测DNA；将标记过的待测DNA与第一杂交阵列杂交；对来自参照样品的第一参照基因组DNA或者其扩增产物进行标记，形成标记的第一参照DNA；将标记过的第一参照DNA与第二杂交阵列杂交；对来自第二参照样品的第二参照基因组DNA或其扩增产物进行标记，形成标记的第二参照DNA；将标记过的第二参照DNA与第三杂交阵列杂交。所述方法可以包括在标记过的待测DNA进行杂交后，分析第一杂交阵列来确定由标记过的待测DNA的杂交所产生的信号强度；在标记过的第一参照DNA进行杂交后，分析第二杂交阵列来确定由标记过的第一参照DNA的杂交所产生的信号强度；和在标记过的第二参照DNA进行杂交后，分析第三杂交阵列来确定由标记过的第二参照DNA的杂交所产生的信号强度。

本发明提供了一种方法，所述方法通过将测试杂交阵列的信号强度与两个或更多个参照杂交阵列中至少一个的信号强度进行比较来评估样品基因组DNA中至少一个区域的拷贝数。

本发明的其它特征和优点将在以下描述中给出，并且部分上根据描述是显而易见的或者可以由实施本发明而得知。借助说明书和所附权利要求中特别指出的要素和组合，可以认识到并且实现本发明的目的和其它优点。

应当明白的是，以上的一般性描述和下面的详细描述仅用于示范和解释，是为了给所要求保护的本发明进一步的解释。

附图简述

引入本申请并构成一部分的附图阐述了本发明的一些实施方案，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1是演示根据本发明，确定待测DNA样品中拷贝数的示范性方法的流程图。

图2是显示根据本发明，制备一组参照DNA样品的示范性方法的流程图。

图3是显示根据本发明，如何确定待测DNA样品的拷贝数的流程图。

图4是显示根据本发明，如何在两项比率信息的基础上，确定待测DNA样品中拷贝数发生变化的区域的流程图。

图5显示了一对图形，其中上方的图形显示与男性参照比较的样品，下方图形显示与女性参照比较的样品。

发明详述

本发明涉及一种用于检测非整倍体或基因组DNA中较小拷贝数不均衡的存在或较小不均衡的方法。根据本发明，检测非整倍体或拷贝数不均衡(“检测方法“)的方法可以用于在卵子库之前分析卵母细胞；或者在利用体外受精程序进行的植入之前，用于胚胎植入前遗传筛查(PGS)来鉴定胚胎细胞内的染色体数量和染色体组。所述检测方法可以鉴别基因组DNA中可以代表测试胚胎的染色体区域(“待测DNA”)，所述区域包含了增加或减少的拷贝数。检测方法可以包括使用单通道阵列比较基因组杂交(“单通道arrayCGH”)，从而待测DNA与杂交阵列杂交，并且一或多个拷贝数已知的DNA分子(“参照DNA”)与一或多个不同杂交阵列杂交。待测DNA中的拷贝数不均衡可以通过检测这样的区域来识别，所述区域中由参照DNA杂交产生的信号强度和由待测DNA杂交产生的不同。本发明的多种性能可以包括WO96/17958和2009年10月30日提交的美国专利申请12/609,156中描述的基因组杂交方法、装置和试剂盒，所述文献通过引用全部并入本文。

检测方法可以包括标记从测试样品获得的测试样品DNA以形成待测DNA，和将标记的待测DNA与第一杂交阵列杂交。测试样品DNA可以经过标记以便能够对测试样品DNA与第一杂交阵列的杂交进行检测和/或测量。标记过的待测DNA杂交所生成的信号可以经过检测和分析来确定第一杂交阵列产生的信号强度，从而获得测试杂交结果。可以将测试杂交结果与参照杂交结果，或者一或多个参照DNA与一或多个不同于第一杂交阵列的其他杂交阵列所生成的信号强度进行比较。例如，可以通过将参照DNA标记并将标记过的参照DNA与第二杂交阵列杂交来确定参照DNA的信号强度。标记过的参照DNA杂交生成的信号可以经过检测和分析来确定参照DNA的信号强度。待测DNA中存在的拷贝数不均衡可以通过鉴定第一杂交阵列中的一或多个这样的区域来确定，所述区域的信号强度与第二杂交阵列中的一或多个相应区域产生的信号强度不同。

标记过的参照DNA杂交所产生的信号强度的确定可以在确定标记过的待测DNA杂交所产生的信号强度之前或者之后进行。如果在确定标记过的待测DNA杂交所产生的信号强度之前确定标记过的参照DNA杂交所产生的信号强度，参照杂交结果可以记录和存储为历史性参照杂交结果。然后可以将之后获得的测试样品DNA的测试杂交结果与历史性参照杂交结合进行比较以确定待测DNA中是否存在拷贝数不均衡。使用历史性参照杂交结果可以避免在每次需要与具体的测试杂交结果进行比较时，真的给参照样品进行杂交。

检测方法中可以使用一个以上的参照DNA或者复数个参照DNA样本。例如，确定参照DNA的信号强度后，可以确定第二参照DNA的信号强度。第二参照DNA的信号强度可以通过对第二参照DNA进行标记并与第三杂交阵列杂交来确定。标记过的第二参照DNA杂交所生成的信号经过检测和分析可以确定第二参照DNA杂交产生的信号强度。拷贝数不均衡的存在可以通过鉴定第一杂交阵列中的一或多个这样的区域来确定，所述区域的信号强度与第二和/或第三杂交阵列中的一或多个相应区域产生的信号强度不同。

用于确定测试样品的基因组DNA中存在拷贝数不均衡的方法可以包括：对来自测试样品的样品基因组DNA或其扩增产物进行标记，形成标记的待测DNA；将标记过的待测DNA与第一杂交阵列杂交；对来自参照样品的第一参照基因组DNA或其扩增产物进行标记，形成标记的第一参照DNA；将标记过的第一参照DNA与第二杂交阵列杂交；对来自第二参照样品的第二参照基因组DNA或其扩增产物进行标记，形成标记的第二参照DNA；将标记过的第二参照DNA与第三杂交阵列杂交。所述方法可以包括在标记过的待测DNA进行杂交后，分析第一杂交阵列以确定由标记过的待测DNA的杂交所产生的信号强度；在标记过的第一参照DNA进行杂交后，分析第二杂交阵列以确定由标记过的第一参照DNA的杂交所产生的信号强度；和在标记过的第二参照DNA进行杂交后，分析第三杂交阵列以确定由标记过的第二参照DNA的杂交所产生的信号强度。通过将第一杂交阵列的信号强度与第二杂交阵列和第三杂交阵列中的至少一个的信号强度进行比较，可以给样品基因组DNA的至少一个区域评估拷贝数。

相对标记过的待测DNA，标记过的第一参照DNA可以在基因组的一或多个预先指定的区域中包含至少一个拷贝数变化。标记过的第二参照DNA与标记过的第一参照DNA一样，可以包含至少一个预先指定的区域相对标记过的待测DNA的拷贝数变化不同。某些情况中，标记过的待测DNA杂交所产生的信号强度与标记过的第一参照DNA杂交所产生的信号强度在所述一或多个预先指定的区域进行比较；标记过的待测DNA杂交所产生的信号强度与标记过的第二参照DNA杂交所产生的信号强度在所述一或多个预先指定的区域进行比较；并且方法还包括在预期拷贝数的基础上确定方法的动态范围。标记过的第一参照DNA可以来自从第一物种(例如，来自诸如人的哺乳动物)的雄性动物；标记过的第二参照DNA可以来自第一物种的雌性动物。标记过的第一参照DNA和标记过的第二参照DNA可以包含来自相同动物物种的雄性和雌性的DNA的混合物。标记过的第一参照DNA可以包含三倍体，第二参照DNA可以包含单体性。在一些实施方案中，所述第一参照DNA可以在任何染色体上包含一个小扩增，所述第二参照DNA可以排除这样的小扩增。

标记过的待测DNA杂交所产生的信号强度可以与标记过的第一参照DNA杂交所产生的信号强度在一或多个预先指定的区域内进行比较，以确定拷贝数的第一评估值；标记过的待测DNA杂交所产生的信号强度可以与标记过的第二参照DNA杂交所产生的信号强度在一或多个预先指定的区域内进行比较，以确定拷贝数的第二评估值，所述拷贝数的第一和第二评估值可以合并以获得拷贝数总体评估值。在一些实施方案中，在评估拷贝数前对信号强度进行归一化。

在某些情况中，来自参照样品的第一参照基因组DNA或其扩增产物可以包含由第一扩增技术产生的扩增产物；来自参照样品的第二参照基因组DNA或其扩增产物可以包含由相同的第一扩增技术产生的扩增产物。来自参照样品的第一参照基因组DNA或其扩增产物可以包含复数个不同扩增产物，每个是由对不同起始浓度的同样第一参照基因组DNA进行扩增形成的。所述方法可以包括在拷贝数评估的基础上确定人极体或胚胎的非整倍体状态。所述方法还可以包括利用拷贝数信息，例如非整倍体状态，来选择IVF程序中植入的胚胎。所述方法可以包括从测试样品中分离基因组DNA以形成样品基因组DNA或其扩增产物。

测试样品可以包含至少一个来自胚胎的细胞。第一基因组参照DNA可以包含由具有染色体异常的动物的组织或细胞获得的DNA。在一些实施方案中，第一基因组参照DNA包含由镶嵌组织或细胞获得的DNA。在某些情况中，标记过的第一参照DNA具有第一DNA浓度，包含正常雄性DNA；标记过的第二参照DNA具有第二DNA浓度并包含相同的正常雄性DNA作为标记过的第一参照DNA，所述第二浓度是相对第一浓度而言稀释了的。雌性的DNA可以被用来代替雄性的DNA，或者附加给雄性的DNA。标记过的第一参照DNA可以包含从至少两个个体的血样中提取的基因组DNA的汇合。

根据本发明，提供了用于确定测试样品的基因组DNA中存在拷贝数不均衡的方法，所述方法包括标记待测DNA以形成标记过的待测DNA；将标记过的待测DNA与第一杂交阵列杂交；杂交后对第一杂交阵列进行分析得到第一杂交结果；和将所述第一杂交结果与历史参照杂交结果进行比较，所述历史参照杂交结果是由标记过的第一参照DNA与第二杂交阵列杂交得到的。所述方法还可以包括将第一杂交结果与历史参照杂交结果进行比较，所述历史参照杂交结果是由标记过的第二参照DNA与第三杂交阵列杂交得到的；以及通过鉴定第一杂交阵列中的一或多个这样的区域来确定存在拷贝数不均衡，所述区域的信号强度与第二杂交阵列和第三杂交阵列中的至少一个的一或多个相应区域产生的信号强度不同。标记过的第一参照DNA可以来自第一物种的雄性动物，标记过的第二参照DNA可以来自第一物种的雌性动物。

本发明还提供了存储在处理器中的参照阵列数据集的文库。每个参照阵列数据集可以包含在各个参照阵列上进行拷贝数杂交分析过程中从各个参照阵列收集的数据，其中(1)从中收集各个数据集的每个参照阵列包含与从中收集数据的每个其他参照阵列共有的元素，和(2)从中收集各个数据集的每个拷贝数杂交分析是在与从中收集数据的每个其他拷贝数杂交分析有一或多个不同的条件下进行的。文库中的至少两个参照阵列数据集可以彼此不同。在一些实施方案中，一些参照数据集是在相同条件下生成的，以评估技术的变化性。每个参照阵列数据集可以包括荧光信号强度数据。

本发明还提供了一种方法，所述方法包括将拷贝数杂交分析过程中由测试阵列收集的测试阵列数据集与文库中的参照阵列数据集进行比较；和利用信号处理器确定测试阵列数据集和文库中的数据集之间的比率。可以确定文库中的最佳拟合数据集，并且是由处理器确定的SNR比率谱最大化的参照阵列数据集。

根据本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包含第一拷贝数杂交阵列；与第一拷贝数杂交阵列相同的第二拷贝数杂交阵列；与第一拷贝数杂交阵列相同的第三拷贝数杂交阵列；第一参照基因组DNA；第二参照基因组DNA；和说明书，所述说明书指导了如何将在第一拷贝数杂交阵列上进行的杂交分析产生的测试结果与在第二拷贝数杂交阵列上利用第一参照基因组DNA进行的杂交分析产生的测试结果进行比较。说明书也可以是关于如何将在第一拷贝数杂交阵列上进行的杂交分析产生的测试结果与在第三拷贝数杂交阵列上利用第二参照基因组DNA进行的杂交分析产生的测试结果进行比较。在某些情况中，所述第一参照基因组DNA可以包含参照基因组DNA的扩增产物。本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包含拷贝数杂交阵列；含有存储在上面的复数个参照阵列数据集的电子存储介质；和说明书，其指导了如何将在拷贝数杂交阵列上进行的杂交分析产生的测试结果所对应的数据集与所述复数个参照阵列数据集进行比较。

由于测试和参照DNA样品的测量可以在分开的杂交阵列进行，因此进行所述检测方法不需要使用对比强的染料来标记。此外，可以将待测DNA与无限个参照样品进行比较，而不是简单的共杂交的那个参照。这样为了给测试样品确定最佳分析结果，可以进行尽可能多的比较。

使用一个以上的参照DNA还可以避免由于测试和参照DNA匹配不佳造成分析失败的风险，并且允许选择测试和参照DNA的单一最佳配对。所述多个参照DNA可以包括从单细胞DNA扩增获得的与待测DNA良好匹配的参照DNA。换句话说，可以从产生的一系列参照DNA中挑选能够给出与待测DNA最佳比较结果的单个参照DNA。例如，可以通过对扩增方案的小改动产生一系列参照DNA样品，从而得到与待测DNA良好匹配的参照DNA。扩增方案中的这种小改动可以造成一系列技术性变异。此外，生成的参照DNA可以具有特定的已知生物性质。例如，生成的参照DNA可能来自镶嵌型个体或者来自特定性别的个体。生成的参照DNA可以含有一或多个染色体异常。为了与测试样品的状况匹配，参照DNA可以来源于受损细胞。参照DNA可以来源于与测试样品在生物学上相关的个体。

这里使用的杂交阵列可以包含微阵列，或者结合在固体支持物上的未标记靶核酸(探针)集合，例如，已经被定位到染色体位置上的克隆阵列。杂交阵列可以包含复数个探针或靶核酸分子，比如至少两个结合在固体支持物或表面上的靶核酸分子。靶核酸分子可以组织在固体表面上预先指定的位置，其中每个探针占据离散的位置。结合在固体表面上的靶核酸分子可以是复数个相同靶核酸分子、复数个不同核酸分子，或者两者的组合。例如，在希望能够多路检测分析(即一次检测一个以上核酸分子)的实施方案中，可以使用与不同核酸分子结合的复数个不同靶核酸分子。所述固体表面可以是适用于arrayCGH的任何表面，包括柔性和刚性表面。柔性表面可以包括，但不限于尼龙膜。刚性表面可包括，但不限于玻片。固体表面上还可以包括三维基质或复数个珠子。可以使用任何合适的方法将靶核酸固定在固体表面上。

应当理解，虽然本文描述的是DNA杂交，可以使用任何种类的核酸，比如RNA、DNA或cDNA。同样地，靶核酸分子或探针可以是，例如RNA、DNA或cDNA。核酸可以来源于任何生物。探针可以是合成的寡核苷酸，或者可以来源于克隆的DNA或PCR产物。寡核苷酸可以是原位合成的，或者合成然后易位排列。克隆DNA可以是细菌人工染色体(BAC)克隆或者PI-衍生的人工染色体(PAC)。核酸分子的序列可以源于已知与疾病有关的染色体位置，可以经选择代表要确定是否与疾病关联的染色体区域，或者可以对应其转录待分析的基因。

可以将参照DNA标记并与杂交阵列杂交。杂交阵列经洗涤以除去任何非特异性结合的标记物。然后可以将杂交阵列扫描，记录并存储参照DNA的信号强度作为历史参照杂交结果，以备与待测DNA样品的测试杂交结果进行比较。同样，可以给复数个不同参照DNA生成和记录一组历史参照杂交结果。所述复数个参照DNA样品可以单独地标记和杂交以便分开具有相同阵列设计的杂交阵列。可以将杂交阵列扫描，扫描的数据转换成历史参照杂交结果，存储留待后用。由于历史参照杂交结果能够被记录，不需要将复数个参照DNA杂交一次以上。历史参照杂交结果可以反复用于使用一或多个不同待测DNA进行的后续分析。待测DNA可以经过标记与杂交阵列杂交，所述杂交阵列与获得历史参照杂交结果使用的杂交阵列具有相同的阵列设计。历史参照杂交结果可以经电子方式或者以电子存储介质传送给终端用户。

应当理解，本文所用的“扫描”是指扫描仪执行的任何常规方法，所述方法允许对样品与杂交阵列的杂交进行检测。扫描可以包括，例如从扫描仪的光源发光，在扫描仪的检测器接收从杂交阵列的各个位置反射的发射光。在一些实施方案中，扫描可以包括，例如激发微阵列上的荧光染料；和在扫描仪的检测器，测量发射的荧光强度。扫描在例如WO96/17958和2009年10月30日提交的美国专利申请12/609,156中有进一步描述，两份文献中每一个同通过引用全部并入本文。

图1是阐述确定待测DNA样品的拷贝数的一个方法的流程图。如图1所示，标记过的待测DNA样品可以杂交到杂交区域A。杂交所产生的信号强度或振幅可以经测量构建待测DNA样品的振幅图谱(amplitudeprofile)。待测DNA样品的振幅图谱可以经过归一化。可以选择一组参照DNA样品，并分别与杂交区域A以外的杂交区域杂交。可以测量每个参照DNA杂交生成的信号强度或振幅来构建参照DNA振幅图谱。参照DNA振幅图谱可以经过归一化。通过比较待测DNA样品振幅图谱和参照DNA振幅图谱可以确定待测DNA样品的拷贝数。在一些实施方案中，相同的阵列是指阵列包含许多相同的内容，例如至少90％的相同内容，但其他内容可以不同。同样，可以在扩增过程中有轻微的变化，只要仍被认为是相同的即可。

在一些实施方案中，每个参照DNA都会有相关的振幅分布。然后通过得到测试振幅与参照振幅(或多个参照振幅)的比率，和可能的各种归一化，确定拷贝数的初始评估值。这个拷贝数评估值中自然有噪音，可以使用其它步骤来评定某个评估的拷贝数是否很可能对应于生物拷贝数的真实变化，还是仅仅是由于噪音造成的(因此拷贝数为零)。

复数个不同参照DNA可以包括具有特定的已知生物性质的参照DNA。例如，参照DNA可以来自男性或女性样品。参照DNA可以是从具有所需的染色体异常的细胞株得到的。参照DNA可以得自混合样品。通过将具有不同但已知核型的细胞或提取的DNA合并可以构建合成镶嵌参照样品以便复制镶嵌核型模式。这种合并可以发生在制备参照DNA的任何阶段，或者随后的标记。

为了与测试样品的状况匹配，参照DNA可以来源于损伤细胞。参照DNA可以来自与采集测试样品的个体在生物学上相关的个体。

待测DNA可以由测试样品，比如待测细胞、细胞群或被研究的组织制备。待测DNA可以分离自一或多个待测细胞。待测DNA可以从极体获得，其中卵子的一半染色体组在受精前被排出。待测DNA可以得自卵裂球、从8细胞胚胎提取的单个细胞或者来自胚泡或相关活检物(例如囊胚期活检物)的少数细胞。待测细胞可以包含至少一个来自胚胎的细胞。为了产生待测DNA的大量拷贝数，可以使用DNA扩增程序。

参照DNA可以由参照细胞、细胞群或组织来制备。参照细胞可以是正常的非患病细胞，或者它们可以来自病变组织样品，作为疾病其他方面的标准。参照DNA是目标基因或核酸分子的拷贝数已知的基因组物质。

参照DNA可以使用多种起始材料来生成。起始材料的例子可以包括一或多个个体捐献的组织，比如血液。起始材料的其他来源可以包括单细胞。可以采用标准程序从合适的组织或细胞中分离参照DNA。参照DNA或起始材料可以选自具有正常染色体的个体和/或具有染色体异常的个体，所述染色体异常是比如一或多个染色体的增加或丢失，或者一个或多个染色单体的增加或丢失。所述单细胞可以来源于体外细胞培养或者可以是离体人类细胞，与待检测的样品是相同或者不同类型。可以选择因为它们的染色质结构与待检测样品的染色质结构类似或不类似的单细胞，例如可以选择具有致密染色质的精子细胞。同样，可以选择处于细胞周期不同阶段的细胞。或者，也可以从细胞培养物或血液中提取质量高的浓缩基因组参照DNA，并在提取后稀释到与从单细胞获得的浓度相当的水平。

虽然，用于产生参照DNA和测试样品的材料的供体可能存在家庭关系，这样的关系不是必需的。为了能够在测试样品和亲代样品间进行直接比较，参照材料可以从父母一方或双方获得。

多种条件可被用于生成复数个质量各异的参照DNA。参照DNA可以从不同完整性的细胞中产生，例如，由受损细胞产生的参照样本。可以将参照DNA在样品采集后处理，比如从福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取的DNA。参照DNA可以经过物理处理，比如加热或超声处理。也可以使用化学处理，比如酶消化或蛋白酶消化。还可以进行其他在IVF程序中刺激测试样品状况的处理。这类处理可以包括矿物油混入和混入培养基，以便将造成测试样品和参照样品间分析差别的任何因素的贡献归一化。

参照DNA的制备涉及全基因组扩增的采用。全基因组扩增方案可以做些改动以便在扩增的DNA产物中引入变化。为了扩增，可以使用SUREPLEXDNA扩增，或其他合宜的扩增。所用DNA扩增的确切属性不是本发明的关键。虽然可以使用未扩增的基因组参照DNA，但因为扩增的待测DNA与未经扩增的参照DNA匹配不佳可能造成高噪音水平。因此，所使用的参照材料可以是“正常”的DNA样品集合，其经过稀释包含与少量单细胞大致类似量的DNA。这种稀释的参照材料然后可以利用和测试样品相同的方法进行扩增。为了补偿测试和参照DNA的扩增之间的差别，可以精心构造参照样品组，以便跨越造成匹配不佳的变异范围。这种策略可以减少与常规arrayCGH相关的由于测试和参照样本之间匹配不佳导致的分析失败的风险。如本文描述的，将测试和参照样品的测量分开使得可以将单个测试样品的测量值与一系列参照样品的测量值进行比较。这样，可以找出测试和参照样本的单个最优配对，或者替代地，可以将来自多个比较的结合合并并与待测DNA比较。

图2的流程图显示了制备一组参照DNA样品的示范性方法。如图2所示，通过变化产生一组参照DNA样品的扩增方案可以给参照DNA引入变异。可以构建多个相同的参照DNA样品对。每个参照DNA样品对可以包含正常男性参照DNA和正常女性参照DNA。每个样品对可经不同程度的稀释产生梯度稀释。样品对内的每个参照DNA可以稀释到相同的程度。可以利用和扩增待测DNA所用的相同扩增方法，将每个样品对的每个参照DNA进行扩增。

待测DNA和参照DNA可以经过标记以允许检测杂交复合物。附着到DNA上的具体标记不是本发明的关键方面，只要所述标记不会明显地干扰DNA与靶核酸分子的杂交。标记可以是具有可检测的物理或化学性质的任何材料。所述标记可以包括，例如荧光染料、放射性标记物或者酶。一般情况下，优选arrayCGH中常用的荧光标记，比如Cy3和Cy5。例如可以使用来自BLUEGNOME的CYTOCHIP。对标记生成的信号可以使用标准的检测和分析方法。对于荧光标记，可以使用阵列比较基因组杂交(“arrayCGH”)中通常使用的标准方法。杂交阵列可以在带有多色分束器的荧光显微镜中成像。可以用CCD相机、激光扫描仪、它们的组合等获取不同颜色的图像，将数字化图像存储在计算机中。然后可以利用计算机程序对阵列所产生的信号进行分析。

测试DNA和参照DNA的单一最佳配对的选择和待测DNA中拷贝数不均衡的确定可以实现自动化，以简化数据的分析和解释和/或提高重复性。可以提供一组算法来实现参照数据选择以及给分析评分的自动化。这些算法可以简化数据的分析、解释和/或提高重复性。所述算法可以包括参照选择算法和访问算法(callingalgorithm)。其中参照选择算法可以将待测DNA的测试杂交结果与相应的一组历史参照杂交结果进行比较，并确定复数个参照DNA中哪个参照DNA与待测DNA产生最佳的比较结果。

某些情况中，检测方法可能受到由于阵列内的杂交变化性和/或样品在不同时间杂交所造成的空间噪声。这样检测方法可以包括用于空间偏差校正的方法或用于阵列间杂交的空间校正的方法。由于待测DNA和参照DNA杂交差异造成的任何空间偏置都可以通过本领域已知方法检测和去除，例如2009年10月30日提交的美国专利申请12/609,156中描述的方法，该申请的内容通过引用全部并入本文。

参照选择算法可以用衡量标准对每个测试/参照比较的结果进行表征。所述衡量标准可以是例如，信噪比。信号分量定义为杂交阵列中选定的染色体对log2比率中值之间的差别，其中比率是待测和参照之间的。通过给每个染色体取杂交阵列中的靶核酸组或探针组，并从每个单个探针log2比率中减去染色体中值log2比率可以得到噪声分量。一旦除去染色体倾向(chromosometrends)，通过计算所有探针的四分位距可以确定噪声。

参照选择算法可以选择使比率数据(代表待测DNA中的拷贝数)的SNR最大化的参照DNA。然后可以将测试-参照配对自动呈现给访问算法。访问算法可以应用于鉴定待测和参照样品之间拷贝数不均衡的区域。访问算法可以将观察到的不均衡模式与预期的不均衡模式进行比较。因为参照样品的核型是已知的，然后就可以推断出待测样品的核型。样品的最后分类可以是“整倍体”(没有拷贝数不均衡)或“非整倍体”(拷贝数不均衡)。在某些情况中，测试数据可能质量差，使得获得的任何结果都不可靠。这些情况中，访问算法可以将结果分类为“没有结果”。

图3的流程图显示了如何确定待测DNA样品的拷贝数。如图3所示，通过将待测DNA样品振幅谱除以每个参照DNA的参照DNA振幅谱可以构建一组虚拟比率谱。可以计算每个虚拟比率谱的“噪音”和“动态范围”。所述动态范围可以在X/Y染色体的比率基础上计算。选择一对比率谱，它们对应参照样品对，具有低噪音和预期动态范围的最佳组合。换言之，可以选择出待测DNA和参照DNA对的最佳“扩增”匹配。应用访问算法可以在所述比率谱对的基础上，确定待测DNA中拷贝数变化的区域。

应当理解，如果分离待测DNA的测试样品来自第一极体，可以形成参照DNA和待测DNA的一个最佳配对，虽然因为其他地方概括的原因可能仍然需要选择第二个配对。如果待测DNA分离自事先不知道性别的卵裂球切片，参照选择算法则可选择两个最佳配对。在一些实施方案中，可以选择无限数量的配对。如果待测DNA分离自卵裂球切片，参照DNA则可以包括不同质量的男性基因组DNA和女性基因组DNA。两个最佳配对可以包括待测DNA与男性参照DNA，和待测DNA与女性参照DNA。然后访问算法可以识别配对中一个或两者中存在的拷贝数不均衡。这些不均衡可以与预期的不均衡模式进行比较。因为两个参照样品的核型都是已知的，所以可以推断出测试样品的核型。

图4的流程图显示了如何在两个比率谱的基础上确定待测DNA中有拷贝数变化的区域。如图4所示，将正常待测DNA样品杂交后的信号强度与正常男性化女性参照DNA的信号强度比较从而确定拷贝数不均衡。待测DNA样品与和该待测DNA有相同拷贝数的参照DNA可以是相同性别。可以得到正常待测DNA和正常男性参照DNA，以及待测DNA和正常女性参照DNA的比率谱。对于每个比率谱，可以利用算法来确定待测DNA中有潜在显著性的异常区域，换句话说，谱图中比基线噪声明显更大的异常区域。通过考虑待测DNA样品及其性别错配的参照DNA所对应的比率谱中的X/Y比率，可以确定与真实拷贝数变化一致的显著比率水平。利用前面阶段获得的显著比率水平，可以判断出每个异常区域与真实的拷贝数变化是否一致。可以将各个比率谱的拷贝数访问值合并，通过例如取均值，形成待测DNA的单一拷贝数访问值。但是应当理解，在比率谱与样品和参照之间性别匹配一致的比率谱基础上，X和Y染色体区域访问值优先。

一个以上待测DNA可杂交到相同的杂交区域。例如，两个或更多个待测DNA样品可以用不同染料标记，并且杂交到相同的杂交区域。

在一些实施方案中，测试样品是男性的，第一参照是女性的，第二参照是男性的。在某些情况中，测试样品是女性的，第一参照是男性的，第二参照是女性的。这两种情况中，都可以利用第一参照建立动态范围，用于检测所有的染色体，而第二参照可以用于访问X/Y。为了解决因不知样品性别而带来的困难，如果测试样品是极体，可以使用女性参照和男性参照两种，以便一个参照与样品匹配，另一个提供关于动态范围的信息。

应当理解，本文所用的“拷贝数”是相对参照基因组来说。例如，如果参照是男性DNA和女性DNA的混合物，拷贝数不一定为整数。某些情况中，可以将三倍体参照作为正常使用，即会有不同的拷贝数。

根据本发明，第一参照是包含第一确定的参照中拷贝数变化的样品的扩增产物。在一些实施方案中，第一参照是第一预先确定区域的扩增产物，第二参照在预先确定的区域内有删除，而不是在所述预定区域内没有变化。

根据本发明，如果使用不同的标记，第一、第二、第三和任何其他杂交区域可以是相同的。

虽然本文描述的方法是为IVF设计的，所述方法也适用于产前、肿瘤学和/或干细胞情境。检测方法在使用不同扩增条件下，还允许代表不同镶嵌程度的许多参照。

即使样本的性别是已知的，能够将该样品相对性别匹配的和性别不匹配的参照来分析一般来说仍是有用的。例如，在对极体进行检测的情况下，可以知道样品是女性的，因此为了获得一个内部动态范围对照，可以选择男性参照作为实际参照。但这样的副作用是对极体的X和Y染色体的解释被复杂化。因此有益的做法仍然是用性别错配计算动态范围并提供染色体1-22的访问值，而用性别匹配来访问所有染色体。

在某些情况下，预先确定的区域内至少一个参照样品与测试样品有拷贝数差异。该拷贝数差可以用作“对照”来有效地表示实验的动态范围(其依赖于具体讨论的个别测试样品和杂交条件)。例如，如果预计测试和参照中特定预先确定区域之间的拷贝数差异是“1”，由于实验的原因，差异只有“0.25”，这样就得到了关于试验动态范围的信息，因此特定试验中0.25可以是显著的。然后动态范围或“显著性”的这个评估值可以被用来评估其他参照数据集中或者相同数据集不同染色体中的拷贝数变化。

实施例

提供一种包含丢失一个拷贝的染色体13和19的正常女性样品。图5显示了一对曲线，其中每个图上部曲线显示了样品与男性参照的比较，底部曲线显示了样品与女性参照的比较。在图5上部曲线中，样品与男性参照进行了比较，X染色体显示为增益，因为女性中有两个拷贝的X，而男性参照中只有一个拷贝；同样地Y染色体显示为丢失，因为女性中没有Y，男性参照中有一个。这些预期的X/Y变化提供了关于什么是重要的指示。13号和19号染色体明显是丢失。

图5的底部曲线显示了相同样品与女性参照的对比。在这种情况下，X和Y染色体的数目预计在样品和参照中是相同的。同样，可以看出13号和19号染色体的丢失，特别是结合从上部曲线中X/Y比较获得的关于动态范围的信息。

本公开中所有提到的参考文献的全部内容均通过引用并入本文。此外，当用量、浓度或其他数值或参数以范围、优选的范围或优选上限值和优选下限值列表的形式给出时，应当理解为具体公开了由所有上限(或优选值)和所有下限(或优选值)构成的全部范围，无论所述范围是否被单独公开。文中提及数值范围的情况中，除非另有说明，所述范围意在包括它们的端点、和范围内的所有整数和小数。限定范围时，本发明的范围无意限于提及的具体数值。

考虑这里公开的说明书和本发明的实施，本发明的其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。本说明书和实施例应当被视为示范性的，发明教导的真正范围和精神由以下权利要求及其等同体指示。

Claims (14)

1.一种用于非诊断目的的用于确定测试样品的基因组DNA中拷贝数不均衡情形的存在的方法，所述方法包括:

a)对来自第一测试样品的物种的第一样品基因组DNA或其扩增产物进行标记，形成标记的第一待测DNA；

b)将标记过的第一待测DNA与第一杂交阵列杂交；

c)对来自第一参照样品的人类男性的第一参照基因组DNA或者其扩增产物进行标记，形成标记的第一参照DNA；

d)将标记过的第一参照DNA与第二杂交阵列杂交，所述第二杂交阵列与所述第一杂交阵列相同；

e)对来自所述人类女性的第二参照样品的第二参照基因组DNA或其扩增产物进行标记，形成标记的第二参照DNA；

f)将标记过的第二参照DNA与第三杂交阵列杂交，所述第三杂交阵列与所述第一杂交阵列相同；

g)在标记过的第一待测DNA进行杂交后，分析第一杂交阵列来确定由标记过的第一待测DNA的杂交所产生的信号强度；

h)在标记过的第一参照DNA进行杂交后，分析第二杂交阵列来确定由标记过的第一参照DNA的杂交所产生的信号强度；

i)在标记过的第二参照DNA进行杂交后，分析第三杂交阵列来确定由标记过的第二参照DNA的杂交所产生的信号强度；

j)通过将第一杂交阵列的信号强度与第二杂交阵列和第三杂交阵列中的信号强度进行比较来评估第一样品基因组DNA中的至少一个区域的拷贝数；和

k)基于所评估的拷贝数，确定第一待测样品的第一样品基因组DNA中的拷贝数不均衡情形的存在。

2.权利要求1所述的方法，其中相对标记过的第一待测DNA，标记过的第一参照DNA和标记过的第二参照DNA中的至少一个在所述物种的基因组的一或多个预先指定的区域中包含至少一个拷贝数变化。

3.权利要求2所述的方法，其中所述标记过的第二参照DNA与标记过的第一参照DNA一样，包含至少一个预先指定的区域，该区域相对标记过的第一待测DNA有不同的拷贝数变化。

4.权利要求2所述的方法，其中将标记过的第一待测DNA杂交所产生的信号强度与下列的至少一项进行比较：标记过的第一参照DNA在所述一或多个预先指定的区域内杂交所产生的信号强度，以及标记过的第二参照DNA在所述一或多个预先指定的区域内杂交所产生的信号强度，并且该方法还包括基于预期拷贝数来确定该方法的动态范围。

5.权利要求1所述的方法，其中将第一杂交阵列的一或多个区域中的标记过的第一待测DNA杂交所产生的信号强度与标记过的第一参照DNA杂交所产生的信号强度在第二杂交阵列的一或多个对应区域内进行比较，以确定拷贝数的第一评估值；将标记过的第一待测DNA杂交所产生的信号强度与标记过的第二参照DNA杂交所产生的信号强度在第三杂交阵列的所述一或多个对应区域内进行比较，以确定拷贝数的第二评估值，将所述拷贝数的第一和第二评估值合并以获得拷贝数总体评估值。

6.权利要求1所述的方法，其中在评估拷贝数前对信号强度进行归一化。

7.权利要求1所述的方法，其中来自第一参照样品的第一参照基因组DNA或其扩增产物包含由扩增技术产生的扩增产物；来自第二参照样品的第二参照基因组DNA或其扩增产物包含由所述扩增技术产生的扩增产物。

8.权利要求1所述的方法，其中来自第一参照样品的第一参照基因组DNA或其扩增产物包含浓度各异的多个不同参照DNA。

9.权利要求1所述的方法，还包括：

将标记过的第三参照DNA与第四杂交阵列杂交；

将标记过的第四参照DNA与第五杂交阵列杂交；

将标记过的第五参照DNA与第六杂交阵列杂交，

其中对拷贝数进行评估包括将第一杂交阵列的信号强度与由第二、第三、第四、第五和第六杂交阵列中每个阵列的信号强度进行比较。

10.权利要求1所述的方法，还包括从第一待测样品中分离出基因组DNA以形成第一样品基因组DNA或其扩增产物。

11.权利要求1的方法，其中第一基因组参照DNA和第二基因组参照DNA中的至少一个包含从具有染色体异常的人类的组织或细胞中得到的DNA。

12.权利要求1所述的方法，其中第一基因组参照DNA和第二基因组参照DNA中的至少一个包含从嵌合的组织或细胞获得的DNA。

13.权利要求1所述的方法，其中标记过的第一参照DNA和标记过的第二参照DNA中的至少一个包含从至少两个个体的血样中提取的基因组DNA的汇合。

14.一种用于非诊断目的的用于确定测试样品的基因组DNA中拷贝数不均衡情形的存在的方法，所述方法包括：

a)标记人类的第一待测基因组DNA以形成标记过的第一待测DNA；

b)将标记过的第一待测基因组DNA与第一杂交阵列杂交；

c)杂交后对第一杂交阵列进行分析得到第一杂交结果；

d)将第一杂交结果与参照数据进行比较，所述参照数据包括所述人类男性的标记过的第一参照DNA与第二杂交阵列杂交产生的历史参照杂交结果，所述第二杂交阵列与所述第一杂交阵列相同；

e)将第一杂交结果与历史参照杂交结果进行比较，所述历史参照杂交结果是由所述人类女性的标记过的第二参照DNA与第三杂交阵列杂交得到的，所述第三杂交阵列与所述第一杂交阵列相同；和

f)通过鉴定第一杂交阵列的一或多个区域中产生的第一信号强度来确定第一种拷贝数不均衡情形的存在，所述区域的信号强度与第二杂交阵列和第三杂交阵列中的一或多个相应区域产生的至少一种信号强度不同或等同。