KR20170003695A - 비대립 유전자-특이적 프라이머 및 대립 유전자-특이적 블로커 올리고뉴클레오티드를 중첩하는 조성물을 사용한 대립 유전자-특이적 증폭 - Google Patents
비대립 유전자-특이적 프라이머 및 대립 유전자-특이적 블로커 올리고뉴클레오티드를 중첩하는 조성물을 사용한 대립 유전자-특이적 증폭 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 블로커 및 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 블로커 올리고뉴클레오티드는 표적-중립적 부분서열 및 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 1 서열을 포함한다. 비표적 특이적 부분서열은 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 표적-중립적 부분서열과 연속적이다. 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 효소 연장을 유도하기에 충분하고; 여기서 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 제 2 서열을 포함한다. 제 2 서열은 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩하고; 여기서 제 2 서열은 중첩 부분서열 및 비중첩 부분서열을 포함한다. 제 2 서열은 비표적 특이적 부분서열을 포함하지 않는다.
Description
(관련 출원의 상호참조)
본 출원은 2014년 5월 19일자로 제출된 미국 가출원 제 62/000,114호의 우선권을 주장하며, 그 전체를 참조로서 본 명세서에 포함한다.
(서열 목록)
서열 목록은 전자 형식으로만 출원서에 제출되며 본 명세서에 참조로서 포함된다. 서열 목록 텍스트 파일 "14-21013-WO(260947.00251)_SL.txt"은 2015년 5월 18일에 작성되었으며 크기는 13,144바이트이다.
DNA 및 RNA 서열의 작은 차이가 전반적인 신체 건강 및 인간을 포함한 유기체의 건강에 큰 차이를 가져올 수 있다. 예를 들면, 박테리아 게놈에 있어서의 단일 염기 변화가 항생 물질 내성을 야기할 수 있고, 인간 게놈에 있어서의 단일 염기 변화는 암의 진행으로 이어질 수 있다. 게놈 분야의 발달과 수반되는 다수의 핵산 바이오마커 서열 및 분자의 발견으로, 단일 염기 변화를 식별할 수 있는 신뢰성 있고, 강고하고, 염가이며 정확한 핵산 분석법을 개발하기 위해 생명공학 산업으로부터의 강력한 요구가 있다. 특히, 대립 유전자-특이적인 다수의 PCR 분석법이 개발되고 있다.
희귀 돌연변이의 선택적 검출에 대한 PCR 접근법은 크게 2개의 군: (A) 대립 유전자-특이적 프라이머, 및 (B) 비대립 유전자-특이적 프라이머로 분류할 수 있다.
대립 유전자-특이적 프라이머의 예는 증폭 불응 돌연변이계(ARMS), 대립 유전자-특이적 블로커 PCR(ASB-PCR), 및 경쟁적 대립 유전자-특이적 TaqMan PCR(castPCR)을 포함한다. (B)의 예는 PNA 블로커 PCR 및 저변성 온도 PCR에서의 동시 증폭(COLD-PCR)을 포함한다.
본 발명 이전에는, 대립 유전자-특이적 프라이머는 공지된 단일 염기 돌연변이를 검출할 때 일반적으로 우수하고(돌연변이 민감성이 보다 높음), 대립 유전자-특이적 블로커를 갖는 비대립 유전자-특이적 프라이머는 일반적으로 다수의 밀접하게 클러스팅된 돌연변이(핫스팟) 또는 알려지지 않은 돌연변이 서열의 검출에 적용된다.
ARMS, ASB-PCR, castPCR과 같은 대립 유전자-특이적 PCR 프라이머는 일반적으로 프라이머의 3'-최말단 위치에 대립 유전자-특이적 뉴클레오티드를 갖는다. 대립 유전자-특이적 PCR 프라이머는 DNA 폴리메라아제 효소의 식별을 이용하여 적절히 쌍을 이루는 염기를 특이적으로 연장시키지만, 옳지 않은 DNA 폴리메라아제 연장 이벤트가 발생하면, 프라이머의 일부분인 희귀 대립 유전자 뉴클레오티드가 템플릿에 받아들여지고, 계속해서 증폭 사이클이 비특이적이 된다는 사실에 의해 제한된다. 대립 유전자-특이적 PCR 프라이머는 최초의 옳지 않은 증폭 이벤트까지만 특이적이다. 비대립 유전자-특이적 프라이머를 이용한 대립 유전자-특이적 검출은 정밀한 변성 온도 조절, 및 보다 소규모의 서열에 대한 제한적 분석이 필요하다. 비대립 유전자-특이적 프라이머를 이용한 대립 유전자-특이적 검출은 돌연변이 민감성이 낮으며 폴리메라아제 도입 오류에 보다 취약하다.
따라서, 증가된 대립 유전자-특이적 증폭 및 개선된 돌연변이 민감성을 갖는 대립 유전자-특이적 블로커 올리고뉴클레오티드와 비대립 유전자-특이적 프라이머의 조성물이 필요로 된다. 그러므로, 과량의 변이체에서 소량의 표적을 검출하는데 적합한 새로운 접근법의 개발이 진단적 적용을 위한 전제조건이다. 따라서, 본 발명은 비대립 유전자-특이적 프라이머 및 대립 유전자-특이적 블로커 올리고뉴클레오티드의 조성물을 제공하여 암 진단 등과 같은 질병의 진단적 적용을 위한 보다 정확하고 효율적인 툴을 제공한다.
본 발명은 대립 유전자-특이적 증폭을 위해 대립 유전자-특이적 블로커 올리고뉴클레오티드 및 비대립 유전자-특이적 프라이머를 중첩하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 블로커 및 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 제공한다. 블로커 올리고뉴클레오티드는 표적-중립적 부분서열(target-neutral subsquence) 및 블로커 변이성 부분서열(blocker variable subsequence)을 갖는 제 1 서열을 포함한다. 그러나, 일부의 경우에 있어서 블로커 올리고뉴클레오티드는 검출되어야 하는 표적 핵산이 삽입 감지를 위한 것이라면 블로커 변이성 부분서열을 포함하지 않아도 좋다. 블로커 변이성 부분서열은 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 표적-중립적 부분서열과 연속적이다. 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 효소 연장을 유도하기에 충분하고; 여기서 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 제 2 서열을 포함한다. 제 2 서열은 중첩 부분서열 및 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다. 제 2 서열은 블로커 변이성 부분서열과 상동인 임의의 서열을 포함하지 않아도 좋다.
본 발명은 또한 표적 서열의 증폭을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 변이체 서열을 갖는 제 1 핵산의 하나 이상의 복제본 및 제 2 핵산의 적어도 하나의 복제본을 함유하는 샘플을 얻는 단계를 포함하고; 여기서 상기 제 2 핵산은 표적 서열을 갖는다. 표적 서열 및 변이형 서열은 각각 상동성 부분서열 및 변이성 부분서열을 포함한다. 변이성 부분서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 더 포함한다. 또한, 표적 서열의 변이성 부분서열은 표적-특이적 부분서열이고 변이체 서열의 변이성 부분서열은 비표적 특이적 부분서열이다.
샘플을 얻은 후, 블로커 올리고뉴클레오티드는 샘플에 도입된다. 블로커 올리고뉴클레오티드는 표적-중립적 부분서열 및 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 1 부분서열을 포함한다. 표적-중립적 부분서열은 상동성 부분서열의 일부분에 상보적이고 블로커 변이성 부분서열은 비표적 특이적 부분서열에 상보적이다. 또한, 블로커 변이성 부분서열은 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 표적-중립적 부분서열과 연속적이다.
그 후에, 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드가 샘플에 도입된다. 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 효소의 연장을 유도하기에 충분하다. 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 상동성 부분서열의 제 2 부분에 상보적인 제 2 서열을 포함한다. 또한, 제 2 서열은 중첩 부분서열 및 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다. 제 2 서열은 변이성 부분서열에 상보적인 임의의 서열을 포함하지 않는다.
다음 단계에서, DNA 폴리메라아제, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 폴리메라아제 기반의 핵산 증폭에 필요한 하나 이상의 시약이 샘플에 도입되고; 상기 샘플은 핵산 증폭을 달성하기에 충분한 조건 하에 반응한다.
본 발명의 이점은 개선된 돌연변이 민감성 매칭 및/또는 우수한 대립 유전자-특이적 프라이머 접근법이다.
본 발명의 다른 이점은 상당한 (8℃)온도 견뢰성을 갖는 간단한 2-단계 열 사이클링 프로토콜이다.
본 발명의 또 다른 이점은 복잡한 백본 또는 뉴클레오티드 변형없이 저렴한 DNA 프라이머 및 블로커 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 이점은 고충실도 효소와의 상용성이다.
본 발명의 또 다른 이점은 대립 유전자-특이적 블로커가 표적보다 변이체에 보다 강하게 결합하여 비대립 유전자-특이적 프라이머를 변이체에 결합된 블로커와 비교하여 표적에 결합된 블로커를 보다 바람직하게 치환하는 것이다. 비대립 유전자-특이적 프라이머를 사용한 이점은 부정하게 증폭된 변이체가 표적 서열보다는 변이체 서열을 갖는 증폭물(앰플리콘)을 생성한다는 것이다. 따라서, 특이성은 사이클마다 복합적이다.
이 요약은 상세한 설명에서 추가로 후술되는 간략화된 형태의 본 발명의 개시, 특정 양태, 이점 및 신규한 특징을 소개하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 주제의 주요 특징 또는 필수적인 기능을 식별하기 위한 것이 아니고 청구된 주제의 범위를 제한하려고 하는 것도 아니다.
상기 요약뿐만 아니라 예시 실시형태에 대한 이하의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해된다. 본 개시를 설명하기 위해, 본 발명의 예시적 구조가 도면에 나타내어져 있다. 그러나, 본 개시는 본 명세서에 개시된 특정 방법 및 수단에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명에 의한 대립 유전자-특이적 증폭을 위한 대립 유전자-특이적 블로커 및 비대립 유전자-특이적 프라이머의 개략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의한 프라이머 및 블로커의 열역학적 설계의 개략도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 의한 서열로부터의 ΔGo값의 계산에 대한 개락도를 나타낸다. 도 3은 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 1, 33, 1, 34, 2, 33, 2, 및 34를 개시하고 있다.
도 4는 실시예 1에 의한 인간 게놈 DNA의 희귀 대립 유전자 검출의 개략도를 나타낸다. 도 4는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 3-4, 35, 32, 36, 및 32를 개시하고 있다.
도 5는 실시예 2에 의한 드문 온도 견뢰성(rare temperature robustness)의 개략도를 나타낸다. 도 5는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 5-6 및 37-38을 개시하고 있다.
도 6a는 실시예 3에 의한 증가된 프라이머 설계의 유연성에 대한 개략도를 나타낸다.
도 6b는 실시예 3에 의한 인간 SNP rs3789806를 증폭시키는 4세트의 프라이머와 블로커 쌍의 핵산 서열의 개략도를 나타낸다. 도 6b는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 5-12 및 39-40을 개시하고 있다.
도 7a는 실시예 4에 의한 ΔΔGo=2kal/mol으로 일정할 때 ΔGo rxnl 의 시뮬레이션 효과에 대한 개략도를 나타낸다.
도 7b(I)는 실시예 4에 의한 SMAD7 rs4939827에 대한 실험적 검증의 개략도를 나타낸다. 도 7b(I)는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 3, 13-16, 4, 17, 및 35-36을 개시하고 있다.
도 7b(II)는 실시예 4에 의한 SMAD7 rs4939827에 대한 실험적 검증의 개략도를 나타낸다. 도 7b(II)는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 3, 18-23, 36, 및 35를 개시하고 있다.
도 8은 실시예 5에 의한 3' 비상동성 영역의 블로커의 개략도를 나타낸다. 도 8은 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 5, 24, 및 37-38을 개시하고 있다.
도 9a는 실시예 6에 의한 TaqMan® 프로브를 사용한 다중화의 개략도를 나타낸다.
도 9b는 실시예 6에 의한 TaqMan® 프로브를 사용한 다중화의 개략도를 나타낸다.
도 10은 실시예 7에 의한 프라이머 및 블로커의 프로텍터의 개략도를 나타낸다.
도 11a는 실시예 8에 의한 결실(STAG2 rs200841330)의 감지에 대한 개략도를 나타낸다. 도 11a는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 25-26 및 41-42를 개시하고 있다.
도 11b는 실시예 8에 의한 삽입(STAG2 rs200841330) 감지에 대한 개략도를 나타낸다. 도 11b는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 25, 43, 42, 및 41을 개시하고 있다.
도 12는 실시예 9에 의한 업스트림 블로커의 개략도를 나타낸다. 도 12는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 27-28 및 44-45를 개시하고 있다.
도 13은 실시예 10에 의한 진균류의 리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA의 특이적 증폭에 대한 개략도를 나타낸다.
도 14는 실시예 11에 의한 이중 NASP의 개략도를 나타낸다. 도 14는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 29, 10, 46-49, 및 30-31을 개시하고 있다.
도 1은 본 발명에 의한 대립 유전자-특이적 증폭을 위한 대립 유전자-특이적 블로커 및 비대립 유전자-특이적 프라이머의 개략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의한 프라이머 및 블로커의 열역학적 설계의 개략도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 의한 서열로부터의 ΔGo값의 계산에 대한 개락도를 나타낸다. 도 3은 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 1, 33, 1, 34, 2, 33, 2, 및 34를 개시하고 있다.
도 4는 실시예 1에 의한 인간 게놈 DNA의 희귀 대립 유전자 검출의 개략도를 나타낸다. 도 4는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 3-4, 35, 32, 36, 및 32를 개시하고 있다.
도 5는 실시예 2에 의한 드문 온도 견뢰성(rare temperature robustness)의 개략도를 나타낸다. 도 5는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 5-6 및 37-38을 개시하고 있다.
도 6a는 실시예 3에 의한 증가된 프라이머 설계의 유연성에 대한 개략도를 나타낸다.
도 6b는 실시예 3에 의한 인간 SNP rs3789806를 증폭시키는 4세트의 프라이머와 블로커 쌍의 핵산 서열의 개략도를 나타낸다. 도 6b는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 5-12 및 39-40을 개시하고 있다.
도 7a는 실시예 4에 의한 ΔΔGo=2kal/mol으로 일정할 때 ΔGo rxnl 의 시뮬레이션 효과에 대한 개략도를 나타낸다.
도 7b(I)는 실시예 4에 의한 SMAD7 rs4939827에 대한 실험적 검증의 개략도를 나타낸다. 도 7b(I)는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 3, 13-16, 4, 17, 및 35-36을 개시하고 있다.
도 7b(II)는 실시예 4에 의한 SMAD7 rs4939827에 대한 실험적 검증의 개략도를 나타낸다. 도 7b(II)는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 3, 18-23, 36, 및 35를 개시하고 있다.
도 8은 실시예 5에 의한 3' 비상동성 영역의 블로커의 개략도를 나타낸다. 도 8은 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 5, 24, 및 37-38을 개시하고 있다.
도 9a는 실시예 6에 의한 TaqMan® 프로브를 사용한 다중화의 개략도를 나타낸다.
도 9b는 실시예 6에 의한 TaqMan® 프로브를 사용한 다중화의 개략도를 나타낸다.
도 10은 실시예 7에 의한 프라이머 및 블로커의 프로텍터의 개략도를 나타낸다.
도 11a는 실시예 8에 의한 결실(STAG2 rs200841330)의 감지에 대한 개략도를 나타낸다. 도 11a는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 25-26 및 41-42를 개시하고 있다.
도 11b는 실시예 8에 의한 삽입(STAG2 rs200841330) 감지에 대한 개략도를 나타낸다. 도 11b는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 25, 43, 42, 및 41을 개시하고 있다.
도 12는 실시예 9에 의한 업스트림 블로커의 개략도를 나타낸다. 도 12는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 27-28 및 44-45를 개시하고 있다.
도 13은 실시예 10에 의한 진균류의 리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA의 특이적 증폭에 대한 개략도를 나타낸다.
도 14는 실시예 11에 의한 이중 NASP의 개략도를 나타낸다. 도 14는 나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS 29, 10, 46-49, 및 30-31을 개시하고 있다.
본 발명은 특정 도면을 참조하여 특정 실시형태에 대해 설명될 것이지만, 본 발명은 청구범위에 의해서만이지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 설명된 도면은 단지 개략적이며 비한정적이다. 도면에서, 일부 요소들의 사이즈는 설명을 위해 과장되거나 왜곡될 수 있으며 스케일대로 그려지지 않을 수 있다. 본 발명의 요소는 최초 출현 시에 "단수"로 지정되고 달리 명시되어 있지 않으면 두번째 또는 이후의 출현에 대해서는 "그" 또는 "상기"로 지정된다.
본 발명은 이제 본 발명의 모든 실시형태는 아니지만 일부 실시형태가 나타내어진 첨부된 도면을 차조하여 여기서 보다 상세히 후술될 것이다. 실제로, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고 본 명세서에 설명된 실시형태에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 이들 실시형태는 이러한 개시가 모든 법적 요구사항을 만족하도록 제공된다.
정의
달리 정의되어 있지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "블로커 올리고뉴클레오티드"는 길이가 약 12개~약 100개의 뉴클레오티드인 적어도 하나의 연속적인 가닥을 말하고, 본 명세서에 그렇게 명시되어 있으면 폴리메라아제 연쇄 반응과 같은 증폭 공정 시에 효소 연장을 방지하는 그 3' 말단에 뉴클레오티드 서열 또는 작용기를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머 올리고뉴클레오티드"는 길이가 약 12개~약 100개의 뉴클레오티드인 적어도 하나의 연속적인 가닥을 포함하고 폴리메라아제 연쇄 반응과 같은 증폭 공정 시에 효소 연장을 허용하기에 충분한 분자를 말한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표적-중립적 부분서열"은 표적 핵산 및 변이체 핵산의 서열에 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 말한다. 예를 들면, 증폭의 표적이 되는 소망의 핵산 서열(표적 핵산)은 변이성 영역(변이체 핵산)을 제외하고는 표적 핵산에 대해 우세한 상동성 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 샘플에 존재할 수 있으며, 이러한 변이성 영역은 일부 경우에 있어서 표적 핵산과 단일 뉴클레오티드의 차이만이 존재한다. 이러한 예에 있어서, 표적-중립적 부분서열은 2개의 핵산 간에 공유되는 상동성 서열의 적어도 일부에 상보적이지만, 변이성 영역은 아니다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "블로커 변이성 부분서열"는 변이체 핵산의 변이 영역에 상보적인 블로커 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 말한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "중첩 부분서열"은 본 명세서에 설명된 조성물에 사용된 블로거 올리고뉴클레오티드 서열의 일부분과 상동인 프라이머 올리고뉴클레오티드의 적어도 5개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 프라이머 올리고뉴클레오티드의 중첩 부분서열은 블로커 변이성 부분서열의 5' 또는 3'에 상관없이 블로커 올리고뉴클레오티드의 표적-중립적 부분서열의 임의의 부분에 상동일 수 있다. 따라서, 용어 "비중첩 부분서열"은 중첩 부분서열이 아닌 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 말한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 서열"은 증폭되거나, 동정되거나, 또는 단리되는 단일 뉴클레오티드 다형성과 같은 원하는 대립 유전자를 보유하는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체 서열"는 원하는 대립 유전자를 보유하지 않는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 예를 들면, 일부 경우에 있어서 변이체 서열은 야생형 대립 유전자를 보유하고 있는 반면 표적 서열은 돌연변이 대립 유전자를 보유하고 있다. 따라서, 일부 경우에 있어서 변이체 서열 및 표적 서열은 게놈 내의 공통된 유전자좌(locus)로부터 유래되어 각각의 서열이 소망의 대립 유전자, 뉴클레오티드 또는 군 또는 그 둘 사이에서 변이되는 뉴클레오티드를 보유하고 있는 영역을 제외하고는 실질적으로 상동일 수 있다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 대립 유전자-특이적 증폭을 위한 대립 유전자-특이적 블로커 올리고뉴클레오티드 및 비대립 유전자-특이적 프라이머 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 블로커 올리고뉴클레오티드 및 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 블로커 올리고뉴클레오티드는 표적-중립적 부분서열 및 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 1 서열을 포함한다. 블로커 변이성 부분서열은 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 표적-중립적 부분서열과 연속적이다. 즉, 블로커 변이성 부분서열은 표적-중립적 부분서열을 2개의 부분, 블로커 변이성 부분서열의 3' 부분 및 5' 부분으로 나눌 수 있다. 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 효소 연장을 유도하기에 충분하고; 여기서 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 제 2 서열을 포함한다. 제 2 서열은 중첩 부분서열 및 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열과 중첩한다. 제 2 서열은 블로커 변이성 부분서열을 포함하지 않는다. 따라서, 프라이머 올리고뉴클레오티드는 비대립 유전자-특이적 프라이머로서 특성화될 수 있다. 중첩 영역은 블로커 변이성 부분서열의 5'측 또는 블로커 변이성 부분서열의 3'측 중 하나의 블로커 올리고뉴클레오티드의 표적-중립적 부분서열의 일부분과 상동일 수 있다. 도 1에 나타내어진 바와 같이, 프라이머 올리고뉴클레오티드 중첩 부분서열은 블로커 변이성 부분서열의 5'측(블로커 상에 "C"로 표시) 상에 있는 블로커의 표적-중립적 부분서열과 상동이다. 여기서, 표적-중립적 부분서열은 블로거 변이 부분서열 C의 양측에 있는 블로커의 부분들이다. 도 12는 프라이머의 중첩 부분서열이 블로거 변이서 부분서열 C의 3'인 블로커의 표적-중립적 부분서열의 일부분과 상동인 일례를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 블로커 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 또는 그 부근의 비상보적 서열 영역 또는 작용기를 더 포함하고 효소 연장을 방지한다. 일례로, 블로커 올리고뉴클레오티드의 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
제 2 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT)를 산출하고 제 1 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT)를 산출하며, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT-ΔGo BT≥-8kcal/mol
비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 3)를 산출하고, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
-4kcal/mol≥ΔGo 3≥-12kcal/mol
일례로, 제 2 서열은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다. 다른 예로, 제 2 서열은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다.
일례로, 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 2~약 10,000배 높다. 다른 예로, 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~약 1,000배 높다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 효소 연장을 유도하기에 충분한 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 제 1 서열 또는 제 2 서열과 중첩하지 않는 제 3 서열을 포함하고, 표적-중립적이며, 폴리메라아제 연쇄 반응을 이용하여 핵산의 영역을 증폭시키기 위해 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하기에 충분하다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드는 제 1 표적-중립적 부분서열 및 제 2 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 4 서열을 포함한다. 제 2 블로커 변이성 부분서열은 전형적으로 표적의 안티센스 서열을 결합하도록 설계되는 것을 고려하면 표적 핵산의 비표적 특이적 부분서열과 동일한 서열을 갖는다. 제 2 블로커 변이성 부분서열은 제 2 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 제 2 표적-중립적 부분서열과 연속적이다. 제 3 서열은 제 2 중첩 부분서열 및 제 2 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 또는 그 부근의 제 2 비상보성 서열 영역 또는 제 2 작용기를 더 포함하고 효소 연장을 방지한다. 일례로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 제 2 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 이들에 한정되는 것은 아니다.
제 3 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT2)를 산출하고 제 4 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT2)를 산출하며, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT2-ΔGo BT2≥-8kcal/mol
제 2 비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 6)를 산출하고, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
-4kcal/mol≥ΔGo 6≥-12kcal/mol.
일례로, 제 3 서열은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드에 의해 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다. 다른 예로, 제 3 서열은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오티드에 의해 제 2 표적-중립적 서열의 5' 말단과 중첩한다.
상기 임의의 실시형태에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 블로커 올리고뉴클레오티드는 각각 약 12개의 뉴클레오티드의 길이~약 100개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 임의의 실시형태에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 블로커 올리고뉴클레오티드는 각각 약 15개의 뉴클레오티드의 길이~약 90개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 임의의 실시형태에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티느 및 블로커 올리고뉴클레오티드는 각각 약 20개의 뉴클레오티드의 길이~약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 임의의 실시형태에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 블로커 올리고뉴클레오티드는 각각 약 20개의 뉴클레오티드의 길이~약 70개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 임의의 실시형태에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 블로커 올리고뉴클레오티드는 각각 약 20개의 뉴클레오티드의 길이~약 60개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 임의의 실시형태에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 블로커 올리고뉴클레오티드는 각각 21개, 22개, 23개, 24개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 또는 50개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
일례로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 2~약 10,000배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~약 1,000배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 10~약 900배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 20~800배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 30~700배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 40~약 600배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 50~약 500배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 60~약 400배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 70~약 300배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 80~약 200배 높다. 다른 예로, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 90~약 100배 높다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 폴리메라아제 연쇄 반응에 필요한 시약을 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 복수의 뉴클레오시드 트리포스페이트를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 DNA 포리메라아제 또는 RNA 폴리메라아제를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 폴리메라아제 연쇄 반응에 필요한 시약, 복수의 뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 폴리메라아제를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 블로커 변이성 부분서열은 단일 뉴클레오티드이다.
본 발명은 또한 표적 서열의 증폭을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 변이체 서열을 갖는 제 1 핵산의 하나 이상의 복제본 및 제 2 핵산의 적어도 하나의 복제본을 함유하는 샘플을 얻는 단계를 포함하고; 여기서 상기 제 2 핵산은 표적 서열을 갖는다. 표적 서열 및 변이체 서열은 각각 상동성 부분서열 및 변이성 부분서열을 갖는다. 변이성 부분서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 더 포함하지만, 2-5개의 뉴클레오티드를 포함해도 좋다. 또한, 표적 서열의 변이성 부분서열은 표적-특이적 부분서열이고, 변이성 부분서열은 비표적 특이적 부분서열이다.
상기 방법은 (b) 블로커 올리고뉴클레오티드를 상기 샘플에 도입하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 블로커 올리고뉴클레오티드는 표적-중립적 부분서열 및 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 1 서열을 포함한다. 표적-중립적 부분서열은 상동성 부분서열의 일부분에 상보적이며 블로커 변이성 부분서열은 비표적 특이적 부분서열에 상보적이다. 또한, 블로커 변이성 부분서열은 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 표적-중립적 부분서열과 연속적이다.
상기 방법은 (c) 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 상기 샘플에 도입하는 단계를 더 포함하다. 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 효소 연장을 유도하기에 충분하다. 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 제 2 서열을 포함한다. 또한, 제 2 서열은 상동성 부분서열의 제 2 부분에 상보적이고, 제 2 서열이 중첩 부분서열 및 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩해도 좋다. 제 2 서열은 변이성 부분서열에 상보적인 임의의 서열을 포함하지 않는다.
상기 방법은 (d) DNA 폴리메라아제, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 폴리메라아제 기반의 핵산 증폭에 필요한 하나 이상의 시약을 상기 샘플에 도입하는 단계; 및 (e) 핵산 증폭을 달성하기에 충분한 조건 하에 상기 샘플을 반응시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 블로커 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 또는 그 부근의 비상보적 서열 영역 또는 작용기를 더 포함하고 효소 연장을 방지한다. 일례로, 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
제 2 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT)를 산출하고 제 1 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT)를 산출하며, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT-ΔGo BT≥-8kcal/mol
비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 3)를 산출하고, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
-4kcal/mol≥ΔGo 3≥-12kcal/mol
일례로, 제 2 서열은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드에 의해 블로커의 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다(즉, "중첩 부분서열). 즉, 제 2 서열은 블로커의 블로커 변이성 부분서열의 5'측에 있는 블로커의 표적-중립적 부분서열의 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드와 상동인 중첩 부분서열을 포함한다. 다른 예로, 제 2 서열은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오디드에 의해 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다. 또 다른 예로, 제 2 서열은 블로커의 블로커 변이성 부분서열의 3'측에 있는 블로커의 표적-중립적 부분서열의 부분에 상보적인 중첩 부분서열을 포함한다.
일례로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 2~약 10,000배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~약 1,000배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 10~약 500배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 20~약 250배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 40~약 125배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 50~100배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 노도보다 약 300~약 400배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 500~약 600배 높다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, DNA 폴리메라아제는 열 안정성 DNA 폴리메라아제이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 샘플을 적어도 10 사이클에 노출시킴으로써 핵산 증폭을 달성하기에 충분한 조건을 더 포함한다. 각각의 사이클은 적어도 2개의 상이한 온도 노출을 갖고, 하나의 온도 노출은 적어도 85℃의 온도 노출이고, 하나의 온도 노출은 75℃ 이하이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 절단 효소(nicking enzyme), 재조합 효소, 헬리카제, RNAse 역전사 효소, 또는 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 효소를 샘플에 도입하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드를 샘플에 도입하는 단계를 더 포함한다. 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 제 3 서열을 포함한다. 또한, 제 3 서열은 변이성 부분서열과 중첩하지 않는다. 또한, 제 3 서열은 표적-중립적이며 표적 서열을 갖는 핵산의 영역을 증폭시키기 위해 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하기에 충분하다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드를 상기 샘플에 도입하는 단계를 더 포함한다. 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드는 제 4 서열을 포함하고; 여기서 상기 제 4 서열은 제 2 표적-중립적 부분서열 및 제 2 블로커 변이성 부분서열을 갖는다. 또한, 제 2 블로커 변이성 부분서열은 블로커 변이성 부분서열에 대한 상보적 서열이다. 또한, 제 2 블로커 변이성 부분서열은 제 2 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 제 2 표적-중립적 부분서열과 연속적이다. 또한, 제 3 서열은 제 2 중첩 부분서열 및 제 2 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5 뉴클레오티드에 의해 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 또는 그 부근의 제 2 비상보적 서열 영역 또는 제 2 작용기를 더 포함하고 효소 연장을 방지한다. 일례로, 제 2 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
제 3 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT2)를 산출하고 제 4 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT2)를 산출하며, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT2-ΔGo BT2≥-8kcal/mol
제 2 비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 6)를 산출하고, 이것은 이하의 조건을 만족한다.
-4kcal/mol≥ΔGo 6≥-12kcal/mol
일례로, 제 3 서열은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드에 의해 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다. 다른 예로, 제 3 서열은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오티드에 의해 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단과 중첩한다.
일례로, 샘플에 도입된 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 노도보다 약 2~약 10,000배 높다. 다른 예로, 샘플에 도입된 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플에 도입된 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~약 1,000배 높다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 표적 서열을 증폭시키는 방법은 샘플로부터 분취량(aliquot)을 제거하는 단계; 및 상기 정의된 단계 (b)~(e)를 반복하는 단계를 더 포함한다.
도 1은 대립 유전자-특이적 증폭을 위한 대립 유전자-특이적 블로커 및 비대립 유전자-특이적 프라이머의 개략도를 나타낸다. 핵산 시약 혼합물은 2개의 올리고뉴클레오티드종, 프라이머(프라이머 올리고뉴클레오티드) 및 변이체 특이적 블로커(블로커 올리고뉴클레오티드)을 포함하고, 이것은 함께 작용하여 폴리메라아제 기반의 증폭 방법과 함께 신뢰성 있는 드문 표적 증폭을 가능하게 한다. 블로커는 디데옥시뉴클레오티드 또는 3-탄소 링커와 같은 비연장성 변형으로 3' 말단에서 변형될 수 있다. 프라이머 및 블로커의 서열은 표적 핵산 서열 및 변이체 핵산 서열에 대한 그 하이브리다이제이션의 열 역학에 기초하여 합리적으로 설계된다. 일부 실시형태에 있어서, 블로커는 프라이머보다 상당히 높은 농도로 존재하여 프라이머에 결합하기 전에 다수의 표적 및 변이체 핵산 서열이 블로커에 결합한다. 프라이머는 블로커-표적 또는 블로커-변이체 분자에 일시적으로 결합하고, 표적 또는 변이체에 결합할 때 블로커를 치환할 가능성을 갖는다. 블로커 서열이 변이체 서열에 대해 특이적이기 때문에, 그 변이체로부터의 치환은 그 표적으로부터의 치환보다 열 역학적으로 덜 유리하다. 따라서, 비대립 유전자-특이적 프라이머는 변이체 서열을 증폭시키는 것보다 높은 수율/효율로 표적 서열을 증폭시킨다. 프라이머의 비대립 유전자-특이적 특성은 부정하게 증폭된 변이체 서열이 표적 대립 유전자보다는 변이체 대립 유전자를 가지므로 후속되는 증폭 사이클도 표적에 대한 증폭 바이어스를 나타낸다는 것을 의미한다.
고농도의 변이체 특이적 블로커는 프라이머가 결합할 기회를 갖기 전에 블로커가 먼저 표적 및 변이체와 결합할 가능성을 높인다. 프라이머는 블로커와 중첩되지 않는 고유 영역을 통해 표적-블로커 또는 변이체-블로커 복합체와의 결합을 개시하고, 계속해서 무효소(enzyme-free) 가닥 치환의 공정을 거쳐 블로커를 치환할 수 있다.
도 2는 프라이머 및 블로커의 열 역학적 설계의 개략도를 도시한다. 프라이머 및 블로커의 서열은 바람직한 열 역학적 반응을 달성하도록 합리적으로 설계된다. 여기서, 프라이머, 블로커, 표적 및 변이체 핵산 서열은 도 2 중의 숫자 1~8로 표시된 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 영역으로 세분화된다. 프라이머와 표적 간의 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT) 및 블로커와 표적 간의 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT)는 이하를 만족한다.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT-ΔGo BT≥-8kcal/mol
상기 부등식을 만족하는 프라이머 및 블로커 시스템은 표적에 결합된 프라이머와 각각의 사이클에서 변이체에 결합된 프라이머 간의 하이브리다이제이션 수율에 큰 차이를 발생시켜 표적-특이적 증폭을 야기한다.
무효소 가닥 치환의 공정은 프라이머 결합 대 블로커 결합의 상대적인 열 역학에 의해 유도된다. 블로커는 표적(ΔGo가 더 음성일수록 더 강한 유리성(favourability)을 나타내기 때문에 결합의 표준 자유 에너지 ΔGo BT는 ΔGo BT＞ΔGo BT) 보다 변이체(결합의 표준 자유 에너지 ΔGo BV)에 더 유리하게 하이브리다이징된다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 프라이머는 표적(결합의 표준 자유 에너지 ΔGo PT는 ΔGo PV＞ΔGo PT )과 마찬가지로 변이체(결합의 표준 자유 에너지 ΔGo PV)에 유리하게 하이브리다이징된다.
표적과의 결합에서 블로커를 치환하는 프라이머의 반응 BT＋P ↔ PT＋B는 변이체와의 결합에서 블로커를 치환하는 프라이머의 반응 BV＋P ↔ PV＋B보다 더 음성인(보다 유리한) 표준 자유 에너지 ΔGo rxn1=ΔGo PT-ΔGo BT를 갖는다. 본 발명의 양호한 성능을 위해, 프라이머 및 블로커는 일반적으로 ΔGo rxn1≤0이고 ΔGo rxn2≥0이 되도록 설계되어야 한다. 그러나, 블로커와 프라이머의 상대적인 농도가 반응의 평형 분포와 효과적인 열 역학에 영향을 미칠 수 있기 때문에, ΔGo rxn1 및 ΔGo rxn2의 가이드라인은 절대적이지 않다.
도 3은 서열로부터의 ΔGo값의 계산에 대한 개략도를 도시한다. 다른 영역의 상호작용에 대한 ΔGo를 계산하는데 다른 규정이 존재하고; 도 3에 최근방 이웃 모델에 기초한 예시적인 에너지 계산이 나타내어져 있다. ΔGo 1 -5, ΔGo 4 -7, 및 ΔGo 4 -8은 하이브리다이제이션 개시(ΔGo init) 시의 표준 자유 에너지, 및 제 6 영역에 인접하는 추가의 염기 중층(base stack)을 더 포함한다. 다른 방법을 사용하여 계산된 표준 자유 에너지 ΔGo은 동일한 ΔGo PT, ΔGo PV, ΔGo BT, 및 ΔGo BV값을 야기할 수 있지만, 개별 영역(예를 들면, ΔGo 3 - 6)의 열 역학이 다를 수 있다. 예시적인 실시예는 본 발명에 사용된 ΔGo 계산의 방법을 나타내기 위한 것이고, 분석을 위한 서열을 제시하려고 하는 것은 아니며; 상기 열거된 서열은 너무 짧아서 안정하게 결합할 수 없을 수 있다. 프라이머 서열, 블로커 서열, 표적 서열, 변이체 서열, 작업 온도, 및 작업 버퍼 조건으로부터의 ΔGo PT, ΔGo PV, ΔGo BT, 및 ΔGo BV의 계산은 당업자에 의해 공지된다.
도 4는 2개의 인간 저장소 샘플 NA18537 및 NA 18562의 SMAD7 유전자좌 주위의 부분서열 및 본 발명의 블로커 설계 및 프로브를 나타낸다. 프라이머/블로커 세트의 설계는 SMAD7 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 A 변이체를 특이적으로 증폭시키도록 설계되었다. 블로커는 SMAD7 SNP의 G-변이체를 갖는 변이체 템플릿에 완전히 상보적이 되도록 설계되며, Taq DNA 폴리메라아제에 의한 효소 연장을 방지하는 3-탄소 링커(C3)를 갖는 3' 말단에서 작용화된다. 역방향 프라이머(reverse primer)는 전방향 프라이머(forward primer)의 3'에 결합하고, 어느 대립 유전자에도 특이적이지 않다. 프라이머 및 블로커의 다양한 부분서열을 설명하기 위해 사용되는 용어의 설명을 위해, 올리고뉴클레오티드는 이하와 같이 설명될 수 있다. 블로커 올리고뉴클레오티드는 서열의 나머지와 정렬되어 나타내어지는 시토신 뉴클레오티드의 5' 및 3'의 서열을 포함하는 표적-중립적 부분서열을 포함한다 - 시토신 뉴클레오티드는 이 경우에 있어서 블로커의 블로커 변이성 부분서열을 나타낸다. 프라이머 올리고뉴클레오티드의 중첩 부분서열은 블로커 변이성 부분서열(시토신)의 5'측에 있는 블로커 서열에 상동인 서열을 포함한다.
도 5는 56℃~66℃ 범위의 어닐링/연장 온도에서 인간 SNP rs3789806 (C/G) C 대립 유전자를 표적으로 하는 프라이머-블로커 쌍의 성능을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 원하지 않는 상호작용을 피하기 위해 더 많은 설계 공간을 갖는 프라이머 설계를 보여준다.
도 7a 및 도 7b는 ΔGo rxn1의 설계를 통해 대립 유전자-특이적 PCR 거동의 조절을 보여준다. 도 7a에 있어서의 시뮬레이션은 ΔGo rxn1이 더 양성이 되도록 프라이머와 블로커가 설계될 때, ΔCq값이 더 크다는 것을 시사한다. 그러나, ΔGo rxn1의 보다 양의 값에서는, 표적의 증폭도 느려지므로 Cq의 값이 더 커진다. 시뮬레이션은 ΔΔGo가 2kcal/mol으로 일정하다고 가정한다. 상단 서브그래프는 하이브리다이제이션 수율에 대한 ΔGo rxn1(별 모양 표시) 및 ΔGo rxn2(도트 표시)의 상이한 값의 예측된 효과를 보여준다. 하단 서브그래프는 각각의 프라이머와 블로커쌍에 대한 표적 및 변이체의 시뮬레이션된 증폭 곡선을 나타낸다. 설명된 모든 경우에 있어서, 프라이머에 대한 블로커의 농도비는 20:1이다. 도 7b(I) 및 도 7b(II)는 증폭 선택성에 영향을 미치는 ΔGo rxn1의 실험적 결과를 나타낸다. 블로커의 3' 말단을 늘리거나 짧게 함으로써 상이한 ΔGo rxn1값을 달성했다. 예상한 대로, ΔGo rxn1이 보다 양성일수록 표적과 변이체 모두에 대한 Cq가 더 커진다. 우리는 표적에 대해 가장 큰 ΔCq 및 상대적으로 작은 Cq 딜레이(Cq＜28)를 야기하는 최적의 중간체 ΔGo rxn1를 관찰했다. 시뮬레이션과 달리, ΔCq는 ΔGo rxn1에 의해 단조롭게 증가하지 않는다. 프라이머-다이머 및 비특이적 증폭의 형성은 Cq 상한을 발생시킨다.
PCR 공정의 동역학 시뮬레이션은 이하와 같이 표현된다.
Tfn＋1 = Tfn＋Pn·[Pn/(Pn＋Bn)＋Y(ΔGo rxn1)·Bn/(Pn + Bn)]·Trn
Trn＋1 = Trn＋Rn·Tfn
Vfn＋1 = Vfn＋Pn·[Pn/(Pn＋Bn)＋Y(ΔGo rxn2)·Bn/(Pn＋Bn)]·Vrn
Vrn＋1 = Vrn＋Rn·Vfn
여기서, Tfn은 사이클 n에서 표적의 전방향 가닥의 정규화된 농도이고, Trn은 사이클 n에서 표적의 역방향 가닥의 정규화된 농도이고, Vfn은 사이클 n에서 변이체의 전방향 가닥의 정규화된 농도이고, Vrn은 사이클 n에서 변이체의 전방향 가닥의 정규화된 농도이고, Pn은 사이클 n에서 전방향 프라이머의 정규화된 농도이고, Bn은 사이클 n에서의 블로커의 정규화된 농도이고, Rn은 사이클 n에서 역방향 프라이머의 정규화된 농도이고, Y(ΔGo)는 ΔGo 반응 표준 자유 에너지가 주어진 치환 반응의 하이브리다이제이션 수율이다. 시뮬레이션 결과는 도 7a에 나타내어진다.
도 8은 비연장성 화학적 작용화보다는 3' 말단에서 비상동성 서열을 갖는 블로커를 나타낸다. 비상동성 서열은 표적 또는 변이체 중 하나의 다운스트림 영역에 결합하지 않기 때문에, 비상동성 영역이 효소 연장을 효과적으로 방지한다. 표적 Cq 및 ΔCq값은 실시예 1에 나타내어지는 것과 유사하며, 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드 등의 작용기와 마찬가지로 3' 말단의 비상동성 서열이 효소 연장을 효과적으로 방지할 수 있음을 나타낸다. 여기서, fP, rP, 및 B는 각각 전방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 블로커(전방향 프라이머에 대한)를 나타낸다.
표준 블로킹 PCR에 있어서, 전방향 프라이머만이 표적 서열을 증폭시키기 위해 바이어싱되고; 역방향 프라이머는 표적과 변이체를 거의 동등하게 증폭시킨다. 전방향 및 역방향 프라이머 모두가 표적 서열만을 증폭시키도록 바이어싱되면 증폭 특이성을 더 향상시킬 수 있다(돌연변이 민감성의 대략 2차적 개선). 이중 표적-특이적 증폭을 달성하기 위해, 전방향 및 역방향 프라이머는 단거리로 분리되도록 설계되어 변이체-특이적 블로커와 중첩한다. 한도 내에서, 프라이머-결합 영역은 표적과 변이체 사이의 일치성이 다른 단일 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 전방향 및 역방향의 변이체-특이적 블로커는 표적의 상보적 가닥에 결합하고 둘 모두 변이 영역에 걸쳐 있기 때문에 서로 부분적으로 상보적이다. 블로커는 부분적인 상보성에도 불구하고 작업 조건에서 블로커 분자의 대부분이 서로 하이브리다이징되지 않도록 설계된다.
도 9a 및 도 9b는 각각 인간 BRAF rs3789806 및 IL23R rs 1884444 SNPs에 대해 설계된 프라이머-블로커 시스템이 동일한 반응으로 다중화되는 것을 나타낸다. 블로커 결합 영역의 상응하는 다운스트림을 표적으로 하는 TaqMan® 프로브를 설계하여 판독 메커니즘으로서 사용된다.
도 10은 프라이머 또는 블로커가 다른 프라이머, 블로커, 또는 템플릿에 비특이적으로 결합하여 비특이적 증폭을 일으키는 것을 나타낸다. 하부 패널은 프라이머와 블로커의 비특이적 결합을 억제하는 프로텍터의 설계를 제공한다. 프로텍터 올리고뉴클레오티드는 프라이머 및 블로커 서열에 부분적으로 상보적이다. 화학량론적으로 과잉의 프로텍터가 존재하면 프라이머와 블로커 모두 부분적으로 이중 가닥이 된다. 블로커는 핵산 서열의 영역 5에 비상보적인 서열을 갖는 새로운 영역 11을 보유하고, 프로텍터는 영역 11에 상보적인 서열을 갖는 새로운 영역 10을 보유한다.
도 11a 및 도 11b는 각각 결실 및 삽입을 감지하는 프라이머 및 블로커 설계를 나타낸다. 프라이머는 비표적-특이적이며, 이 방법은 염기의 불확실한 수 또는 불확실한 위치로의 결실 또는 삽입을 감지하는데 사용될 수도 있다.
도 12는 프라이머를 SNP 위치의 3'에 위치시키고 블로커를 프라이머의 5'에 위치시킴으로써 본 발명의 열등한 구현을 보여준다. 이 구현은 제 1 사이클에서만 하이브리다이제이션 특이성이 발생되므로 ΔCq는 바람직한 설계보다 작다.
도 13은 과량의 상동성 인간 DNA에 있어서 3개의 병원성 진균종의 진균류 18S DNA 서열에 대한 선택적 증폭을 나타낸다. 진균류 18S 부분서열 및 그 상동성 인간 부분서열은 다수의 영역에서 다르기 때문에, 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두에 상응하는 블로커종을 설계하여 증폭 특이성을 최대화했다.
도 14는 변이체-대립 유전자 블로커의 2개의 세트를 각각의 프라이머에 하나씩 사용함으로써 전방향 및 역방향 프라이머 모두에 대한 표적-특이적 증폭의 사용을 설명한다. 블로커는 부분적으로 서로 상보적이지만, 작업 조건에서는 서로에 대해 우세하게 하이브리다이징되지 않는다. 블로커 및 프라이머는 전방향 프라이머가 역방향 블로커로부터 연장될 수 없고, 역방향 프라이머가 전방향 블로커로부터 연장될 수 없도록 설계된다. 도 14는 예비 실험 결과를 나타낸다.
프라이머 및 블로커 조합은 절단 효소 증폭 반응(NEAR), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 및 회전환 증폭(RCA)을 포함하는 핵산에 대한 다른 효소 증폭 분석에 적용될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 과량의 변이체에서 소량의 표적을 검출하는데 특히 적합하다. 본 발명의 암 진단적 적용을 위해, 변이체는 야생형 DNA 서열을 나타낼 수 있고, 표적은 암 DNA 서열을 나타낼 수 있다. 본 발명의 전염병 진단적 적용을 위해, 변이체는 병원성 DNA 서열을 나타낼 수 있고, 표적은 상동성 인간 DNA 서열을 나타낼 수 있다.
실시예
실시예 1
도 4는 2개의 인간 저장소 샘플 NA18537 및 NA18562의 SMAD7 유전자좌 주위의 프로브 및 블로커 설계 및 부분서열에 대한 본 발명의 실시예 1을 나타낸다. 개념 증명 확인을 위해 SMAD7 유전자좌의 건강한 인간 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) rs4939827 (C/T)을 선택했다. 표적으로서의 T 대립 유전자 및 C 대립 유전자 변이체는 임의로 지정되었다. 인간 저장소 게놈 DNA 샘플 NA18562(C 대립 유전자의 동형 접합성) 및 NA18537(T 대립 유전자의 동형 접합성)은 Coriell®로부터 입수했으며, 상응하는 뉴클레오티드 서열은 1000 Genomes 웹사이트에서 입수했다. 의도하지 않은 중합을 방지하기 위해, 블로커는 3' 말단에서 C3 스페이서에 의해 개질되었다. qPCR 실험 결과는 0% 표적(100% 변이체)으로부터 0.1% 표적(99.9% 변이체)을 구별했다. 0.1% 표적 샘플은 0.1% NA18537과 99.9% NA18562를 혼합함으로써 제조되었다. 100% 변이체와 100% 표적 간의 정량화 사이클(ΔCq)의 평균차는 14.8이었고, 100% 변이체(그래프에서 "WT"로 표시)와 0.1% 표적 사이의 평균차는 4.2이었다. 모든 실험은 Bio-Rad CFX96™ qPCR 기기의 96-웰 플레이트에서 수행되었다. 각각의 웰에, 200nM 프라이머, 2μM 블로커 및 20ng 인간 게놈 DNA를 Bio-rad iTaq™ SYBR® Green Supermix에서 혼합했다. 95℃에서 3분 개시 공정 후에, 95℃에서 10초간의 변성 단계 및 60℃에서 30초간의 어닐링/연장 단계를 65 사이클 수행했다. 도 5~12에 나타내어진 실험예는 유사한 프로토콜을 사용했다.
표 1은 1000 Genomes 데이터베이스에서 추출한 인간 게놈 DNA 샘플 NA 18562 및 NA18537에 있어서 4세트의 SNP쌍에 대한 대립 유전자-특이적 증폭 결과의 예를 나타낸다. 각각의 SNP쌍에 대해, 각각의 대립 유전자 변이체의 프라이머 및 블로커 설계를 디자인하고 테스트했다. "블로커"열에 나타내어진 염기 동정은 억제된(변이체) 대립 유전자를 나타내고, "-"은 블로커가 추가되지 않았음을 의미한다. 모든 경우에 있어서, 두 대립 유전자 사이의 큰 ΔCq값은 7.1에서 14.6까지 관찰되었다. 모든 실험은 Bio-rad iTaq™ SYBR® Green Supermix에서 400nM의 각 프라이머 및 4μM의 블로커를 사용하여 3회 수행되었다. 프라이머 및 블로커 서열 또는 실험 조건의 임의의 경험적 최적화없이 열 역학적으로 구동된 설계의 성능이 결과로 나타내어졌다.
실시예 2
도 5는 56℃~66℃ 범위의 어닐링/연장 온도에서 인간 SNP rs3789806 (C/G) C 대립 유전자를 표적으로 하는 프라이머-블로커 쌍의 성능에 대한 본 발명의 실시예 2를 나타내다. 실시예 2는 56℃~64℃에서 양호한 대립 유전자-특이적 증폭을 나타내었고 적어도 8℃의 온도 견뢰성을 나타내었다. 400nM의 각 프라이머 및 4μM의 블로커를 사용하였고, 어닐링/연장 온도 이외의 다른 실험 조건은 실시예 1에서 설명한 바와 동일했다.
실시예 3
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 실시예 3을 나타낸다. 본 발명에 나타내어진 프라이머의 설계는 원하지 않는 상호작용을 피하기 위해 더 많은 설계 공간을 제공했다. 각각 특이적으로 인간 SNP rs3789806 C 대립 유전자를 증폭시키는 4세트의 프라이머와 블로커 쌍의 핵산 서열은 ΔCq＞11을 나타내었다. 400nM의 각 프라이머 및 4μM의 블로커를 사용했고, 다른 실험 조건은 실시예 1에서 설명한 바와 동일했다.
실시예 4
도 7a, 도 7b(I) 및 도 7b(II)는 ΔGo rxn1의 설계를 통해 대립 유전자-특이적 PCR 거동을 제어하기 위한 본 발명의 실시예 4를 나타낸다. 도 7a의 시뮬레이션은 ΔGo rxn1이 더 양성이 되도록 프라이머와 블로커가 설계되었을 때, ΔCq값이 더 컸음을 보여주었다. 그러나, ΔGo rxn1의 보다 양의 값에서는, 표적의 증폭이 느려지므로 Cq의 값이 더 커진다. 시뮬레이션은 ΔΔGo가 2kcal/mol으로 이정하다고 가정했다. 상단 서브그래프는 하이브리다이제이션 수율에 대한 ΔGo rxn1(별 모양 표시) 및 ΔGo rxn2(도트 표시)의 상이한 값의 효과를 예측했다. 하단 서브그래프는 각각의 프라이머와 블로커쌍에 대한 표적 및 변이체의 시뮬레이션된 증폭 곡선을 예측했다. 설명된 모든 경우에 있어서, 프라이머에 대한 블로커의 농도비는 20:1이었다. 도 7b(I) 및 도 7b(II)는 증폭 선택성에 영향을 미치는 ΔGo rxn1의 실험 결과를 나타낸다. 블로커의 3' 말단을 늘리거나 짧게 함으로써 상이한 ΔGo rxn1값이 달성되었다. 예상한 대로, ΔGo rxn1가 더 양성일수록 표적과 변이체에 대한 Cq가 더 커졌다. 최적의 중간체 ΔGo rxn1는 표적에 대해 가장 큰 ΔCq 및 상대적으로 작은 Cq 딜레이(Cq＜28)를 야기했다. 시뮬레이션과 달리, 프라이머-다이머 및 비특이적 증폭의 형성이 Cq 상한에 의해 발생되기 때문에 ΔCq는 ΔGo rxn1에 의해 단조롭게 증가하지 않았다. 200nM의 각 프라이머 및 2μM의 블로커를 사용했고, 다른 실험 결과는 실시예 1에서 설명한 바와 동일했다.
실시예 5
도 8은 비연장성 화학적 작용화보다는 3' 말단에서 비상동성 서열을 갖는 블로커에 대한 본 발명의 실시예 5를 나타낸다. 비상동성 서열은 표적 또는 변이체 중 하나의 다운스트림 영역에 결합하지 않기 때문에, 비상동성 영역이 효소 연장을 효과적으로 방지한다. 400nM의 각 프라이머 및 4μM 블로커를 사용했고, 다른 실험 조건은 실시예 1에서 설명된 것과 동일했다. 표적 Cq 및 ΔCq값은 실시예 4에 나타내어지는 것과 유사했으며, 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드 등의 작용기와 마찬가지로 3' 말단의 비상동성 서열이 효소 연장을 효과적으로 방지하는 것을 나타낸다. 도 8에 잇어서, fP, rP, 및 B는 각각 전방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 블로커(전방향 프라이머에 대한)를 나타낸다.
실시예 6
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 실시예 6을 나타낸다. 비대립 유전자-특이적 프라이머 및 대립 유전자 특이저 블로커의 실시간 PCR 구현을 위해, 대립 유전자-특이적이 아닌 역방향 프라이머도 필요했다. SYBR® Green Supermix와 TaqMan®을 실험에서 사용했으며 둘 사이의 현저한 차이는 없었다. 인간 BRAF rs3789806 및 IL23R rs 1884444 SNP에 대해 설계된 프라이머-블로커 시스템은 동일 반응으로 다중화되었다. 블로커 결합 영역의 상응하는 다운스트림을 표적으로 하는 TaqMan® 프로브를 설계하여 판독 메커니즘으로 사용했다. BRAF rs3789806 앰플리콘의 TaqMan® 프로브는 FAM 형광단, Iowa Black FQ 소광제, 및 내부 ZEN 소광제에 의해 개질되었고, IL23R rs 1884444 앰플리콘의 TaqMan® 프로브는 Cy5 형광단 및 Iowa Black RQ 소광제로 개질되었다. 도 9a는 BRAF rs3789806 G 대립 유전자 및 IL23R rs 1884444 T 대립 유전자의 다중화된 검출의 증폭 결과를 나타낸다. 염기 동정은 블로커가 억제하는(변이) 대립 유전자를 나타냈다. 도 9b는 BRAF rs3789806 C 대립 유전자 및 IL23R rs 1884444 G 대립 유전자의 다중화된 검출을 나타낸다. 각각의 실험에 있어서, 게놈 DNA 샘플을 Bio-rad iQ Supermix에서 400nM의 각 프라이머, 4μM의 각 블로커 및 200nM의 각 TaqMan® 프로브와 혼합했다. qPCR 프로토콜은 실시예 1에 나타내어진 것과 동일했다.
실시예 7
도 10은 프라이머 또는 블로커를 다른 프라이머, 블로커, 또는 템플릿에 비특이적으로 결합시키는 본 발명의 실시예 7을 나타낸다. 실시예 7은 비특이적 증폭을 야기했다. 하부 패널은 프라이머와 블로커의 비특이적 결합이 억제된 프로텍터의 설계를 제공했다. 블로커는 핵산 서열 상의 영역 5에 비상보적인 서열을 갖는 새로운 영역 11을 보유했으며, 프로텍터는 영역 11에 상보적인 서열을 갖는 새로운 영역 10을 보유했다.
실시예 8
도 11a 및 도 11b는 결실 및 삽입을 감지하기 위한 프라이머 및 블로커 설계에 대한 본 발명의 실시예 8을 나타낸다. Del rs200841330은 개념 증명 결과를 나타내는데 사용되었다. 400nM의 각 프라이머 및 4μM의 블로커를 사용했으며, 다른 실험 결과는 실시예 1에 나타내어진 것과 동일했다. 프라이머는 비대립 유전자-특이적이기 때문에, 이 방법은 염기의 불확실한 수 및 불확실한 위치로의 결실 또는 삽입을 감지하는데 사용될 수도 있다.
실시예 9
도 12는 프라이머를 SNP 위치의 3'에 위치시키고 블로커를 프라이머의 5'에 위치시킴으로써 본 발명의 실시예 9를 나타낸다. 실시예 9는 제 1 사이클에서만 하이브리다이제이션 특이성이 발생되므로 ΔCq는 바람직한 설계보다 작았다. 프라이머 농도는 400nM이었고, 블로커 농도는 4μM이었다. 실험 조건은 실시예 1에 나타내어진 것과 동일했다.
실시예 10
도 13은 과량의 상동성 인간 DNA에 있어서 3개의 병원성 진균종의 진균류 18S DNA 부분서열의 선택적 증폭을 위한 본 발명의 실시예 10을 나타낸다. 진균류 18S 부분서열 및 그 상동성 인간 부분서열은 다수의 영역에서 다르기 때문에, 증폭 특이성을 최대화하기 위해 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두에 상응하는 블로커종을 설계했다. 3개의 진균류종으로부터의 18S 부분서열의 gBlock 단편(서열이 확인된 400bp 이중가닥 DNA, IDT) 및 인간의 공통된 서열을 실험에 사용했다. 각각의 진균류 DNA gBlock 단편의 60,000 복제본(0.1%), 60 복제본(0.0001%) 및 0 복제본(100% 인간)을 인간 DNA의 60,000,000 복제본과 개별적으로 혼합했다. 모든 경우에 있어서, 결과는 100만분의 1에 이르는 희귀 서열을 검출했다. 200nM의 각 프라이머 및 1μM의 각 블로커를 사용했으며, 다른 실험 결과는 실시예 1에 나타내어진 것과 동일했다.
실시예 11
도 14는 본 발명의 실시예 11을 나타낸다. 도 14는 전방향 및 역방향 프라이머 모두에 대한 대립 유전자-특이적 증폭의 사용을 설명하고; 2세트의 변이체-대립 유전자 블로커를 각각의 프라이머에 하나씩 사용했다. 블로커는 서로 부분적으로 상보적이지만, 작업 조건에서는 서로의 우세한 하이브리다이제이션을 서포트하지 못한다. 블로커와 프라이머는 전방향 프라이머가 역방향 블로커로부터 연장될 수 없도록 설계되었고, 역방향 프라이머는 전방향 블로커로부터 연장될 수 없도록 설계되었다. 도 14는 예비 실험 결과를 보여주었다.
본 개시의 특정 실시형태에 대한 상술한 설명은 예시 및 설명을 목적으로 제시되었다. 본 발명의 원리 및 그 실제 적용을 가장 잘 설명하고 당업자가 본 발명을 가장 잘 활용할 수 있도록 하기 위해 예시 실시형태가 선택 및 설명되었으며, 다양한 변경이 이루어진 다양한 실시형태는 고려되는 특정 용도에 적합하다.
SEQUENCE LISTING
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 1
agctgaccta a 11
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 2
acctaagcga t 11
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 3
cagcctcatc caaaagagga aa 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 4
aaaagaggaa acaggacccc agagctc 27
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 5
tgtatataga cggtaaaata aacaccaaga 30
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 6
acaccaagac gtggtaaata tttacctggt c 31
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 7
gagccttgta tatagacggt aaaataaac 29
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 8
cggtaaaata aacaccaaga cgtggtaaat atttac 36
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 9
tggagccttg tatatagacg gtaaa 25
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 10
gacggtaaaa taaacaccaa gacgtggtaa a 31
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 11
actggagcct tgtatataga cgg 23
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 12
gtatatagac ggtaaaataa acaccaagac gtggt 35
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 13
aaaagaggaa acaggacccc aga 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 14
aaaagaggaa acaggacccc agag 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 15
aaaagaggaa acaggacccc agagc 25
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 16
aaaagaggaa acaggacccc agagct 26
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 17
aaaagaggaa acaggacccc agagctcc 28
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 18
aaaagaggaa ataggacccc aga 23
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 19
aaaagaggaa ataggacccc agag 24
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 20
aaaagaggaa ataggacccc agagc 25
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 21
aaaagaggaa ataggacccc agagct 26
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 22
aaaagaggaa ataggacccc agagctc 27
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 23
aaaagaggaa ataggacccc agagctcc 28
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 24
acaccaagac gtggtaaata tttacctggt caaaa 35
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 25
cgatatggtt tgtttcaagg tatgattttt a 31
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 26
aaggtatgat ttttaattaa aaattgttgt tcacatttga agg 43
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
gtggtaaata tttacctggt ccctg 25
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 28
ggtaaaataa acaccaagac gtggtaaata tttac 35
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 29
tggagccttg tatatagacg gtaaaat 27
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 30
accaggtaaa tatttaccac gtcttggtgt t 31
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 31
catcaacaac agggaccagg taaatat 27
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 32
ctcactctaa accccagcat t 21
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 33
atcgcttagg tcagct 16
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 34
atcacttagg tcagct 16
<210> 35
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 35
agggagctct ggggtcctat ttcctctttt ggatgaggct gtga 44
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 36
agggagctct ggggtcctgt ttcctctttt ggatgaggct gtga 44
<210> 37
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 37
cagggaccag gtaaatattt accacctctt ggtgtttatt ttaccgtcta tatacaa 57
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 38
cagggaccag gtaaatattt accacgtctt ggtgtttatt ttaccgtcta tatacaa 57
<210> 39
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 39
cagggaccag gtaaatattt accacctctt ggtgtttatt ttaccgtcta tatacaaggc 60
tccagtt 67
<210> 40
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 40
cagggaccag gtaaatattt accacgtctt ggtgtttatt ttaccgtcta tatacaaggc 60
tccagtt 67
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 41
accttcaaat gtgaacaatt tttaattaaa aatcatacct tgaaacaaac catatcgat 59
<210> 42
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 42
accttcaaat gtgaacaaca atttttaatt aaaaatcata ccttgaaaca aaccatatcg 60
at 62
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> May be 3' C3 modified
<400> 43
aaggtatgat ttttaattaa aaattgttca catttgaagg 40
<210> 44
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 44
acagggacca ggtaaatatt taccacctct tggtgtttat tttaccg 47
<210> 45
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 45
acagggacca ggtaaatatt taccacgtct tggtgtttat tttaccg 47
<210> 46
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 46
aacatcaaca acagggacca ggtaaatatt taccacctct tggtgtttat tttaccgtct 60
atatacaagg ctccagt 77
<210> 47
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 47
aacatcaaca acagggacca ggtaaatatt taccacgtct tggtgtttat tttaccgtct 60
atatacaagg ctccagt 77
<210> 48
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 48
actggagcct tgtatataga cggtaaaata aacaccaaga cgtggtaaat atttacctgg 60
tccctgttgt tgatgtt 77
<210> 49
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 49
actggagcct tgtatataga cggtaaaata aacaccaaga ggtggtaaat atttacctgg 60
tccctgttgt tgatgtt 77
Claims (45)
- 3' 말단 또는 그 부근의 비상보적 서열 영역 또는 작용기를 포함하고 효소 연장을 방지하며, 표적-중립적 부분서열 및 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 1 서열을 포함하는 블로커 올리고뉴클레오티드로서, 상기 블로커 변이성 부분서열은 상기 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 상기 표적-중립적 부분서열과 연속적인 블로커 올리고뉴클레오티드; 및
효소 연장을 유도하기에 충분하고, 제 2 서열을 포함하는 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드로서, 상기 제 2 서열은 중첩 부분서열 및 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 표적-중립적 부분서열과 중첩하고, 또한 상기 제 2 서열은 상기 블로커 변이성 부분서열을 포함하지 않는 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 중첩 부분서열은 상기 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 중첩 부분서열은 상기 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 2 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT)를 산출하고 상기 제 1 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT)를 산출하며, 이하의 조건을 만족하는 올리고뉴클레오티드 조성물.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT-ΔGo BT≥-8kcal/mol - 제 1 항에 있어서,
상기 비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 3)를 산출하고, 이하의 조건을 만족하는 올리고뉴클레오티드 조성물.
-4kcal/mol≥ΔGo 3≥-12 kcal/mol - 제 1 항에 있어서,
상기 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 2~10,000배 높은 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~1,000배 높은 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항에 있어서,
효소 연장을 유도하기에 충분하고 제 3 서열을 포함하는 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드를 더 포함하며, 상기 제 3 서열은 상기 제 1 서열 또는 제 2 서열과 중첩되지 않고, 또한 상기 제 3 서열은 표적-중립적이며 폴리메라아제 연쇄 반응을 이용하여 핵산의 영역을 증폭시키기 위해 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하기에 충분한 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 9 항에 있어서,
3' 말단 또는 그 부근의 제 2 비상보적 서열 영역 또는 제 2 작용기를 포함하고 효소 연장을 방지하며, 제 2 표적-중립적 부분서열 및 제 2 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 4 서열을 포함하는 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드를 더 포함하고, 상기 제 2 블로커 변이성 부분서열은 상기 블로커 변이성 부분서열에 상보적인 서열이고, 상기 제 2 블로커 변이성 부분서열은 상기 제 2 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 상기 제 2 표적-중립적 부분서열과 연속적이며, 상기 제 3 서열은 제 2 중첩 부분서열 및 제 2 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 상기 제 2 표적-중립적 부분서열과 중첩하고, 또한 상기 제 3 서열은 상기 제 2 블로커 변이성 부분서열을 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2 중첩 부분서열은 상기 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2 중첩 부분서열은 상기 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 10 항에 있어서,
상기 제 3 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT2)를 산출하고 제 4 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT2)를 산출하며, 이하의 조건을 만족하는 올리고뉴클레오티드 조성물.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT2-ΔGo BT2≥-8kcal/mol - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2 비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 6)를 산출하며, 이하의 조건을 만족하는 올리고뉴클레오티드 조성물.
-4kcal/mol≥ΔGo 3≥-12kcal/mol - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 상기 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 2~약 10,000배 높은 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 상기 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~약 1,000배 높은 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리메라아제 연쇄 반응에 필요한 시약을 더 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
복수의 뉴클레오시드 트리포스페이트를 더 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
DNA 폴리메라아제를 더 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리메라아제 연쇄 반응에 필요한 시약, 복수의 뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 폴리메라아제를 더 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 블로커 변이성 부분서열은 단일 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 조성물. - a. 변이체 서열을 포함하는 제 1 핵산의 하나 이상의 복제본 및 표적 서열을 포함하는 제 2 핵산의 적어도 하나의 복제본을 가능한 한 함유하는 샘플을 얻는 단계로서, 상기 표적 서열 및 변이체 서열은 각각 상동성 부분서열 및 변이성 부분서열을 포함하고, 상기 변이성 부분서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 또한 상기 표적 서열의 상기 변이성 부분서열은 표적-특이적 부분서열이며 상기 변이체 서열의 변이성 부분서열은 비표적 특이적 부분서열인 단계;
b. 상기 샘플에 블로커 올리고뉴클레오티드를 도입하는 단계로서, 상기 블로커 올리고뉴클레오티드는 표적-중립적 부분서열 및 블로커 변이성 부분서열을 포함하는 제 1 서열을 포함하고, 상기 표적-중립적 부분서열은 상기 상동성 부분서열의 일부분에 상보적이며 상기 블로커 변이성 부분서열은 상기 비표적 특이적 부분서열에 상보적이고, 상기 블로커 변이성 부분서열은 상기 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하며 상기 표적-중립적 부분서열과 연속적인 단계;
c. 상기 샘플에 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 도입하는 단계로서, 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 효소 연장을 유도하기에 충분하고, 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드는 제 2 서열을 포함하고, 상기 제 2 서열은 상기 상동성 부분서열의 제 2 부분에 상보적이고, 상기 제 2 서열은 중첩 부분서열 및 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 상기 표적-중립적 부분서열과 중첩하고, 또한 상기 제 2 서열은 상기 변이성 부분서열에 상보적인 임의의 서열을 포함하지 않는 단계;
d. 상기 샘플에 DNA 폴리메라아제, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 폴리메라아제 기반의 핵산 증폭에 필요한 하나 이상의 시약을 도입하는 단계; 및
e. 핵산 증폭을 달성하기에 충분한 조건 하에 상기 샘플을 반응시키는 단계를 포함하는 표적 서열의 증폭 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 블로커 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 또는 그 부근의 비상보적 서열 영역 또는 작용기를 포함하고 효소 연장을 방지하는 방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드를 포함하는 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 DNA 폴리메라아제는 열 안정성 DNA 폴리메라아제인 방법. - 제 26 항에 있어서,
핵산 증폭을 달성하기에 충분한 상기 조건은 상기 샘플을 적어도 10 사이클에 노출시키는 것을 포함하고, 각각의 사이클은 적어도 2개의 상이한 온도 노출을 포함하고, 하나의 온도 노출은 적어도 85℃이고, 하나의 온도 노출은 75℃ 이하인 방법. - 제 23 항에 있어서,
절단 효소, 재조합 효소, 헬리카제, RNAse, 역전사 효소, 또는 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 상기 샘플에 도입하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 중첩 부분서열은 상기 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드인 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 중첩 부분서열은 상기 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오티드인 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 제 2 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT)를 산출하며 상기 제 1 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT)를 산출하고, 이하의 조건을 만족하는 방법.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT-ΔGo BT≥-8kcal/mol - 제 23 항에 있어서,
상기 비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 3)를 산출하고, 이하의 조건을 만족하는 방법.
-4kcal/mol≥ΔGo 3≥-12kcal/mol - 제 23 항에 있어서,
상기 샘플에 도입된 상기 블로커 올리고뉴클레티드의 농도는 상기 샘플에 도입된 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 2~10,000배 높은 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 샘플에 도입된 상기 블로커 올리고뉴클레티드의 농도는 상기 샘플에 도입된 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~1,000배 높은 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 샘플에 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드를 도입하는 단계로서, 상기 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티는 제 3 서열을 포함하고, 상기 제 3 서열은 상기 변이성 부분서열과 중첩되지 않고, 또한 상기 제 3 서열은 표적-중립적이며 상기 표적 서열을 포함하는 핵산의 영역을 증폭시키기 위해 상기 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하기에 충분한 단계를 더 포함하는 방법. - 제 35 항에 있어서,
상기 샘플에 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드를 도입하는 단계로서, 상기 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드는 제 2 표적-중립적 부분서열 및 제 2 블로커 변이성 부분서열을 갖는 제 4 서열을 포함하고, 상기 제 2 블로커 변이성 부분서열은 상기 블로커 변이성 부분서열에 상보적인 서열이고, 상기 제 2 블로커 변이성 부분서열은 상기 제 2 표적-중립적 부분서열에 의해 그 3' 및 5' 말단측에 위치하고 상기 제 2 표적-중립적 부분서열과 연속적이며, 상기 제 3 서열은 제 2 중첩 부분서열 및 제 2 비중첩 부분서열을 포함하도록 적어도 5개의 뉴클레오티드에 의해 상기 제 2 표적-중립적 부분서열과 중첩하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제 36 항에 있어서,
상기 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드는 상기 3' 말단 또는 그 부근의 제 2 비상보적 서열 영역 또는 제 2 작용기를 포함하는 방법. - 제 37 항에 있어서,
상기 제 2 작용기는 3-탄소 스페이서 또는 디데옥시뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법. - 제 36 항에 있어서,
상기 제 2 중첩 부분서열은 상기 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 5개의 뉴클레오티드~약 40개의 뉴클레오티드인 방법. - 제 36 항에 있어서,
상기 제 2 중첩 부분서열은 상기 제 2 표적-중립적 부분서열의 5' 말단의 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 약 7개의 뉴클레오티드~약 30개의 뉴클레오티드인 방법. - 제 36 항에 있어서,
상기 제 3 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo PT2)를 산출하며 상기 제 4 서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo BT2)를 산출하고, 이하의 조건을 만족하는 방법.
＋2kcal/mol≥ΔGo PT2-ΔGo BT2≥-8kcal/mol - 제 36 항에 있어서,
상기 제 2 비중첩 부분서열은 하이브리다이제이션의 표준 자유 에너지(ΔGo 6)를 산출하고, 이하의 조건을 만족하는 방법.
-4kcal/mol≥ΔGo 3≥-12kcal/mol - 제 36 항에 있어서,
상기 샘플에 도입된 상기 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 상기 샘플에 도입된 상기 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 2~10,000배 높은 방법. - 제 36 항에 있어서,
상기 샘플에 도입된 상기 제 2 블로커 올리고뉴클레오티드의 농도는 상기 샘플에 도입된 상기 제 2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도보다 약 5~약 1,000배 높은 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 단계 (e)에 계속해서 상기 샘플로부터 분취량을 제거하는 단계 및 상기 단계 (b)~(e)를 반복하는 단계를 포함하는 방법.
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