JPH078300A

JPH078300A - Ｄｎａ解析法

Info

Publication number: JPH078300A
Application number: JP15553493A
Authority: JP
Inventors: Kazuko Kawamoto; 和子川本; Hideki Kanbara; 秀記神原; Hiroko Furuyama; 宏子古山; Kazunobu Okano; 和宣岡野
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1993-06-25
Filing date: 1993-06-25
Publication date: 1995-01-13
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: JP3383360B2

Abstract

(57)【要約】【目的】従来大変な労力と時間及び熟練を要していた
ＤＮＡ解析の基本的な操作を簡便化することである。【構成】ＤＮＡを制限酵素などを用い特定配列を切断
して５^,末端に既知の配列を有するＤＮＡ断片を調製す
るプロセスおよびこのＤＮＡ断片において５^,末端のの
既知のＤＮＡの配列に続く所望数の塩基配列の特徴を利
用して特定のＤＮＡ断片のみの塩基配列を選択的に読み
取るプロセスを含むＤＮＡ解析法。【効果】塩基配列決定の一連の操作が、培養を行わな
い無生物系のため、特別な施設を必要とせずに簡便に短
時間に行える。また、全て試験管中で行えるため、自動
化にも適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ等の核酸の塩基
配列を生物学的な手法を用いることなく決定する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、ヒトや他生物の塩基配列を決定す
る場合、莫大な長さのＤＮＡを制限酵素で切断し、大腸
菌や酵母などの微生物に１断片ずつ組み込んで、１微生
物由来のコロニーを形成し、各ＤＮＡ断片の選択を行っ
ていた。さらに、それぞれのコロニーを培養すること
で、ＤＮＡ断片を増幅し、塩基配列決定操作に必要な、
大量で単一なＤＮＡ断片を得ていた。この方法は、クロ
ーニングと呼ばれ、生物学的な手法であるため、培養な
どの手間がかかり、また、自動化に不適であるという難
点があった。このような、従来技術に関しては、モレキ
ュラークローニング、ア、ラボラトリーマニュアル（第
２版１〜４章、９章）（1989年コールドスプリングハ
ーバー発行) に記載がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術におい
て、塩基配列決定操作で必要とする単一なＤＮＡ断片
は、大腸菌や酵母などを用い生物学的に調製されてい
た。この手法は、ＤＮＡ断片を大腸菌や酵母のＤＮＡに
組み込んで、増幅、選択を行うため、Ｐ２と呼ばれる特
別な施設を必要としていた。また、微生物の培養やコロ
ニー選択など、自動化に適さない手法を含んでいるた
め、これらの方法は手間がかかる等の難点があった。

【０００４】本発明の目的は、塩基配列の解析を試験管
レベルで全てが行えるようにし、増幅、選択操作の自動
化などに適用可能な方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、被解析ＤＮＡ
の特定配列を切断して５^,末端に既知の配列を有するＤ
ＮＡ断片を調製するプロセスおよびこのＤＮＡ断片にお
いて５^,末端の既知のＤＮＡの配列に続く所望数、好ま
しくは２〜６の塩基配列の特徴を利用して特定のＤＮＡ
断片のみの塩基配列を選択的に読み取るプロセスを含む
ことを特徴とするＤＮＡ解析法である。

【０００６】そして、被解析ＤＮＡの特定配列の切断
は、例えば制限酵素等の酵素あるいは化学的方法等によ
り行われる。上記ＤＮＡ断片においては、その末端塩基
に蛍光標識を導入することができる。このＤＮＡ断片の
末端塩基への蛍光標識の導入は蛍光標識オリゴヌクレオ
チドのライゲーションによる方法あるいは蛍光標識ヌク
レオチドのポリメラーゼ反応による相補鎖合成による方
法を用いることができる。

【０００７】上記特定のＤＮＡ断片のみの塩基配列の選
択的な読み取りは、ＤＮＡ断片における５^,末端の既知
のＤＮＡ配列とそれに続く２〜６塩基の配列とからなる
オリゴポリヌクレオチドと相補的塩基配列を有するオリ
ゴポリヌクレオチドをプライマーとして用いて特定のＤ
ＮＡ断片のみの塩基配列を選択的に塩基配列相補鎖合成
反応を行こなわしめることにより行われる。そして、前
記塩基配列相補鎖合成反応は、好ましくは６０℃以上で
行うことができる。

【０００８】以下、本発明を詳しく説明する。莫大な長
さのＤＮＡを解析する手法の第１段階として、特定の配
列を手がかりにするために、その配列を認識し切断する
性質をもつ制限酵素を用いてＤＮＡを切断した。ここで
用いる制限酵素はいずれでもよく、例えば Hind III、N
ot Ｉなどが用いられる。生成した多種類のＤＮＡ断片
について、その分離分取を容易にするために前記ＤＮＡ
断片の末端塩基を蛍光体等で標識することができる（図
２）。この標識物としては、FITC(fluoresceine isothi
ocyanate:発光波長525nm)、Texas Red(sulforhodamine
101:発光波長613nm)等の蛍光体、化学発光体、あるい
は、ＲＩなどが用いられる。さらに、生成した多種類の
ＤＮＡ断片はそれぞれを高効率に増幅するために、必要
に応じて予め分離分取操作を行う。この分離分取は、厳
密なものでなくてもよく、ゲル電気泳動、液体クロマト
グラフあるいはアフィニティクロマトグラフを用いるこ
とにより１つの分画あたりＤＮＡ５〜６種以下となるよ
うにする。次に更に必要に応じて、塩基配列決定操作に
必要な量のＤＮＡ断片は、前記分離分取操作により得ら
れた各分画のＤＮＡ断片を得るために両末端の既知配列
を利用して、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction ) 法
等の酵素を用いた相補鎖伸長反応を繰返し行うことがで
きる。

【０００９】この段階で得られるＤＮＡ断片は、数種の
ＤＮＡ断片が混合しているが、さらに厳密に１種のＤＮ
Ａ断片を選択し、塩基配列を決定する。その選択塩基配
列決定操作は次のように行う。数種のＤＮＡ断片の混合
物に前記１種のＤＮＡ断片における５^,末端の制限酵素
切断部の既知のＤＮＡ配列とそれに続く２〜６塩基の配
列とからなるオリゴポリヌクレオチドと相補的塩基配列
を有するオリゴポリヌクレオチドをプライマーとして加
え、アデニン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）
およびシトシン（Ｃ）の４種の塩基、ddＡＴＰ、ddＴＴ
Ｐ、ddＧＴＰ及びddＣＴＰ並びにＤＮＡ合成酵素の存在
下に特定の鋳型ＤＮＡだけを選択して相補鎖合成を行わ
しめ、得られる３’末端がアデニン、チミジン、グアニ
ンおよびシトシンであるそれぞれのＤＮＡ断片群につい
て電気泳動に掛けることより選択的に塩基配列の決定を
行う。さらに、前記プライマーの選択性を高めるため
に、プライマーの結合能力を弱める６０℃以上で相補鎖
合成反応を行うことができる。これは、前記プライマー
とＤＮＡ断片の対合が水素結合によるため、反応温度を
上げると、プライマーの３’末端配列部分で安定を保て
るのは、それらの対合が完全に一致する配列を持ったも
のだけになる。従って、対合反応温度（アニーリング温
度）を６０℃以上にすると、より効率的に選択が行われ
る。これにより、より高選択性が得られる。

【００１０】上記選択塩基配列決定の原理を図１及び図
５で説明する。図１の最後の工程の塩基配列決定操作に
おいて、多種類の鋳型９または１１と、１種類のプライ
マー１０を混合し、対合反応をさせてプライマー１０と
完全に対合できる鋳型９だけが塩基配列決定されるもの
である。さらに詳しくは、図１において５〜６種類から
なるＤＮＡ断片群７は、両末端の制限酵素切断部の既知
配列部と中央の未知配列部から構成された２本鎖ＤＮＡ
である。このＤＮＡ断片を、熱により図５の１本鎖ＤＮ
Ａ９または１１にして、制限酵素切断部の既知配列部に
相補的な配列と、それに続く未知配列部の５’末端２塩
基と相補的な塩基配列で構成されたプライマー１０を付
着させる。１本鎖ＤＮＡ９または１１の既知配列部に続
く５’末端側２塩基は、未知であり、ＤＮＡ断片の種類
により配列が異なる。従って、ＤＮＡの種類により、完
全に対合するプライマーの種類が異なる。このことは、
１種類のプライマーに対しては、１種類のＤＮＡ断片の
み〔図５の（１）の場合〕が対合し、したがって１種類
の塩基配列のみが選択的に読み取られ解析、決定でき
る。なお、５^,末端の制限酵素切断部の既知のＤＮＡ配
列とそれに続く所望数の塩基における所望数の塩基数
は、プライマーが機能するための塩基数は少なくとも６
塩基であるから、ライゲーションにより結合する既知塩
基配列部を必要とするのは未知配列部が６塩基以下の場
合である。未知配列部が６塩基以上の場合には既知配列
部を必要とない。

【００１１】

【作用】制限酵素で切断し、ライゲーションで既知配列
のオリゴマーを結合させることにより、配列が未知のＤ
ＮＡ断片の両側に、既知のＤＮＡ配列を導入することが
できる。ＤＮＡ断片に蛍光体を標識するプロセスは、分
離分取操作を容易にすることができる。分離分取後は、
各フラクション中に含まれるＤＮＡ断片の種類は、５〜
６種類以下であり、次のＤＮＡ増幅、選択塩基配列決定
を容易にすることができる。分離分取されたＤＮＡは既
知配列ではさまれた未知配列を持つため、広く用いられ
ているＰＣＲ法により酵素的に増幅することができる。
共通配列に続く２〜６塩基まで含んだプライマーを使用
することにより選択的に相補鎖合成を行い、特定のＤＮ
Ａ断片の配列だけを、読み取ることができる。相補鎖伸
長の選択性は、温度にも依存しており、反応温度を６０
℃以上に高めることで選択性を高めることができる。

【００１２】以下、本発明を実施例により具体的に説明
する。ただし、この実施例により本発明の技術的範囲が
限定されるものではない。

【００１３】

【実施例】以下、本発明の実施例を図１〜図６を用いて
説明する。図１は、新しい塩基配列決定法のフローを示
したものである。図２〜図６は、各工程の技術を詳細に
示したものである。配列を知りたい被解析ＤＮＡ１を、
特定の配列を認識して切断する制限酵素(Hind III) ２
を用いて切断する。この操作により、末端の塩基配列が
が決まったＤＮＡ断片群３が生成する。

【００１４】このＤＮＡ断片の末端塩基に、必要に応じ
て、図２に示した方法で蛍光体４を標識する。図２にお
いて、(１)は、蛍光体を標識したＤＮＡのモノマー１２
をＤＮＡ合成酵素を用いてＤＮＡ断片３の末端に取り込
む方法である。ＤＮＡモノマー１２の標識物には、FITC
(fluoresceine isothiocyanate:発光波長525nm)を使用
した。(２)は、制限酵素２で切断された末端の１本鎖の
突出した部分と、結合可能な突出を持つ短いＤＮＡ断片
１３を、ＤＮＡ連結酵素により連結する方法である。短
いＤＮＡ断片１３には、あらかじめ、アミノ基などを介
して蛍光体４が標識されている。この標識物には、Texa
s Red(sulforhodamine 101:発光波長613nm)を使用し
た。

【００１５】作成されたＤＮＡ断片群は、必要に応じ
て、図３に示したようにゲル１４を用いて電気泳動によ
り分離分取される。本実施例では、内径２mmのガラス管
１５につめた８％Ｔ,３％Ｃのアクリルアミドゲルを分
離部に用いた。ＤＮＡ断片２０は、短いものほど早く移
動するので、短い断片から順番に分注容器１９中に分取
される。ガラス管中の一定の位置に照射したレーザ２１
は、ＤＮＡ断片が通過すると標識した蛍光体４を励起す
る。この時、蛍光の移動をモニターすることにより、分
取されたＤＮＡ断片の長さ、混合本数などを推定するこ
とができる。分離分取操作は、ＤＮＡ断片の分子量の違
い、または、塩基配列の特異性の違いを利用することに
より行われる。この分離分取操作は、次のＰＣＲ操作を
行う場合にそれを効率的にするための前処理として効果
的な操作である。ＰＣＲも、得られたＤＮＡ断片の量よ
り、塩基配列決定操作に必要な量を得るために、必要に
応じて行われる。

【００１６】ＰＣＲ法は、図４に示したように、ＤＮＡ
断片３を酵素的に増幅する方法である。制限酵素(Hind
III) ２で切断され、分離分取されたＤＮＡ断片群６
は、温度を上昇することにより、１本鎖ＤＮＡ２２に解
離される。それぞれの３’末端側は、既知配列であるた
め、これに結合可能なＤＮＡ鎖(プライマー)２３を、温
度を低下させることにより結合させる。プライマー２３
を始点として、それぞれの相補鎖を合成し、もとのDNA
のコピー８を作成する。再び温度を上げることにより作
成されたＤＮＡ鎖を１本鎖にに解離して、このサイクル
をｎ回繰り返すと２のｎ乗倍に増幅される。

【００１７】この様な方法を用いて大量に得られた５〜
６種類からなるＤＮＡ断片群７は、図５に示す選択塩基
配列決定法により１種類だけ選択されて、塩基配列が決
定される。図１のように５〜６種類からなるＤＮＡ断片
群７は、両末端の制限酵素切断部の既知配列部と中央の
未知配列部から構成される。このＤＮＡ断片を熱によ
り、図５のように１本鎖ＤＮＡ９または１１にして、次
いでこれに前記既知配列部とそれに続く３’末端側２塩
基とから構成される塩基配列と相補的な塩基配列からな
るプライマー１０を付着させる。ＤＮＡ断片の３’末端
側２個の塩基は未知配列であり、ＤＮＡ断片の種類によ
り塩基配列の種類が異なる。従って、ＤＮＡ断片の種類
によりそれぞれに完全に結合するプライマーの種類も異
なってくる。図５中で(1)は、DNA断片９に完全に対合し
た場合を表し、(２)はＤＮＡ断片１に完全に対合しない
場合を表している。即ち、(1)は、相補鎖合成反応が進
行するが(２)は、相補鎖合成反応が進まない。このよう
にして、５〜６種類からなるＤＮＡ断片群７から１種類
のＤＮＡ断片のみが選択的にその塩基配列を決定するこ
とができる。

【００１８】この選択塩基配列決定操作に必要なプライ
マーの構造について、例えば未知配列部の３’末端の配
列が２塩基である場合を図６に示す。ＤＮＡ断片の３’
末端の既知配列部に対合する部分２８はライゲーション
などにより新たに連結された既知配列に対合する部分２
６と制限酵素認識配列に対合する部分２７により構成さ
れている。これに続く３’末端側は、未知配列部分に結
合するため、全ての場合に対応できるよう１塩基目４種
類、２塩基目４種類の４×４計１６種類用意される。

【００１９】上記プライマーとＤＮＡ断片の対合は、水
素結合によるものであるから対合反応温度を上げると、
３’末端配列部分で対合が安定を保てるのは、それら対
合が完全に一致する配列を持ったものだけになる。従っ
て、対合反応温度（アニーリング温度）を６０℃以上に
すると、より効率的に選択が行われ選択性が高められ
る。

【００２０】これらに従って既知配列部と未知配列部分
を持つＤＮＡと選択プライマーを用いて、次の通り通常
行われている塩基配列決定操作を行った。10 mM Tris-H
Cl, pH 8.5, 6 mM MgCl₂ 存在下で、１pmolのプライマ
ーとサンプルＤＮＡ 0.45 pmolと、耐熱性の酵素である
AmpliTaq _RＤＮＡ polymerase１ユニットを 15 μl
に混合する。予め、0.5 mlのサンプルチューブに、ＤＮ
Ａの基質である dＡＴＰ、 dＣＴＰ、 dＧＴＰ、 dＴＴ
Ｐにストップ基質であるddＡＴＰを総量１μl に調製し
て分注したＡ反応チューブ、ddＣＴＰを含んだＣ反応チ
ューブ、ddＧＴＰを含んだＧ反応チューブ、ddＴＴＰを
含んだＴ反応チューブを用意しておく。それぞれのＡ、
Ｃ、Ｇ、Ｔチューブにプライマーとサンプルの混合液を
3.5μl ずつ分注する。さらに、ミネラルオイルを１〜
２滴加え、ＤＮＡサーマルサイクラにセットする。サイ
クル反応条件は、１〜15サイクルは、95℃ 30_sec、72℃
１min を繰り返す。15〜30サイクルは、95℃ 30_sec、72
℃１min を繰り返す。このサイクル反応により、ＤＮＡ
相補鎖合成を行い、３’末端がＡ、Ｃ、Ｇ、ＴであるＤ
ＮＡ断片を生成する。サイクル反応終了後、反応停止液
であるホルムアミドを２μl 加え、蛍光式ＤＮＡシーク
エンサーにセットされたゲルにロードする。40 cm のゲ
ルに1400Ｖの電圧を加えてＤＮＡ断片を分離して、塩基
配列の決定を行う。

【００２１】この場合は、対合反応温度（アニーリング
温度）を６０℃以上にするために、耐熱性酵素として、
タックポリメラーゼを用いたタックサイクルシーケンシ
ングを行った。その他の耐熱性酵素を用いることも可能
である。また、配列や、鋳型の混合状態により対合反応
温度（アニーリング温度）を６０℃以上でなくても選択
対合が行われる場合がある。このような場合には、耐熱
性酵素でないポリメラーゼを用いて塩基配列決定操作を
行うともできる。プライマーに標識がされていない場合
には、ストップ基質に標識して反応を行うターミネータ
ーシーケンシング法を用いても選択的塩基配列決定は達
成される。

【００２２】

【発明の効果】本発明によれば、塩基配列決定の一連の
操作を無生物学的に行えるため特別な施設を必要とせず
に簡便に塩基配列決定操作が行える。また、培養を行わ
ないため、短時間に塩基配列決定操作が行える。また、
全て試験管中で行えるため、自動化にも適している。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の塩基配列決定法のフロー図。

【図２】ＤＮＡ断片への蛍光標識方法を示す図。

【図３】ＤＮＡ断片の分離分取方法を示す図。

【図４】ＰＣＲ法を用いたＤＮＡ断片の増幅方法示す
図。

【図５】選択塩基配列決定方法の基本反応図。

【図６】選択塩基配列決定方法に用いるプライマーの構
造を示す図。

【符号の説明】

１・・・被解析ＤＮＡ、２・・・制限酵素、３・・・末
端が決まった配列をもつＤＮＡ断片群、４・・・蛍光
体、５・・・制限酵素で切断され、蛍光標識されたＤＮ
Ａ断片群、６・・・分離分取されたＤＮＡ断片群、７・
・・増幅されたＤＮＡ断片群、８・・・コピーされたＤ
ＮＡ断片、９・・・１本鎖に分離され選択されたＤＮ
Ａ、10・・・選択プライマー、11・・・１本鎖に分離さ
れ選択されないＤＮＡ、12・・・蛍光体などを標識した
ＤＮＡモノマー、13・・・切断されたＤＮＡ断片の突出
した１本鎖の部分と結合可能な突出をもつ短いＤＮＡ断
片、14・・・ゲル、15・・・ガラス管、16・・・上部バ
ッファー槽、17・・・下部バッファー槽、18・・・電
極、19・・・分注容器、20・・・分子量分離されたＤＮ
Ａ断片群、21・・・蛍光体励起レーザ、22・・・１本鎖
に分離されたＤＮＡ断片、23・・・ＤＮＡ増幅用プライ
マー、24・・・１本鎖ＤＮＡ断片の５’側の既知配列、
25・・・１本鎖ＤＮＡ断片の３’側の既知配列、26・・
・ライゲーションなどにより新たに連結された配列と結
合する部分、27・・・制限酵素認識配列に結合する部
分、28・・・ＤＮＡ断片の５’末端側の既知配列部に結
合する部分、29・・・既知配列部とそれに続く３’末端
側に結合する未知配列部に結合する２〜６塩基部分

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡野和宣東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被解析ＤＮＡの特定配列を切断して５^,
末端に既知の配列を有するＤＮＡ断片を調製するプロセ
スおよびこのＤＮＡ断片において５^,末端の既知のＤＮ
Ａの配列に続く所望数の塩基配列の特徴を利用して特定
のＤＮＡ断片のみの塩基配列を選択的に読み取るプロセ
スを含むことを特徴とするＤＮＡ解析法。
【請求項２】被解析ＤＮＡの特定配列の切断を制限酵
素で行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ解析
法。
【請求項３】ＤＮＡ断片の末端塩基に蛍光標識を導入
することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ解析法。
【請求項４】ＤＮＡ断片の末端塩基への蛍光標識の導
入が蛍光標識オリゴヌクレオチドのライゲーションによ
ることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ解析法。
【請求項５】ＤＮＡ断片の末端塩基への蛍光標識の導
入が蛍光標識ヌクレオチドのポリメラーゼ反応による相
補鎖合成によることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ
解析法。
【請求項６】ＤＮＡ断片において５^,末端の既知のＤ
ＮＡの配列に続く所望数の塩基配列の塩基数が２〜６塩
基数であることを特徴とする請求項２〜５のいずれかの
項記載のＤＮＡ解析法。
【請求項７】ＤＮＡ断片における５^,末端の既知のＤ
ＮＡ配列とそれに続２〜６塩基の配列とからなるオリゴ
ポリヌクレオチドと相補的塩基配列を有するオリゴポリ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて特定のＤＮＡ断
片の塩基配列を選択的に読み取ることを特徴とする請求
項２〜６のいずれかの項記載のＤＮＡ解析法。
【請求項８】前記プライマーを用いて特定のＤＮＡ断
片だけの塩基配列を選択的に読み取るための塩基配列相
補鎖合成反応を６０℃以上で行うことを特徴とする請求
項２〜７のいずれかの項記載のＤＮＡ解析法。