DE04727930T1 - Verfahren zur Charakterisierung von Polynukleotiden - Google Patents
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Abstract
Verfahren
zur Identifizierung spezifischer Eigenschaften von in einer Probe
vorhandenen Zielpolynukleotiden, umfassen die Schritte:
i) Anfügen einer Polynukleotidsignalsequenz, die für die zu untersuchende Eigenschaft spezifisch ist, an ein Ende jedes Zielpolynukleotids in der Probe,
ii) In-Kontakt-bringen des Zielpolynukleotids mit einem Molekül, das mit dem Zielpolynukleotid wechselwirkt, falls die Eigenschaft vorliegt,
iii) Abtrennen der wechselwirkenden Zielpolynukleotide von denjenigen, die nicht wechselwirken,
iv) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) und
v) Identifizieren, welche Signalsequenzen und in welcher Reihenfolge diese in den abgetrennten Zielpolynukleotiden vorliegen, um derart die Eigenschaften jedes Zielpolynukleotids zu bestimmen.
i) Anfügen einer Polynukleotidsignalsequenz, die für die zu untersuchende Eigenschaft spezifisch ist, an ein Ende jedes Zielpolynukleotids in der Probe,
ii) In-Kontakt-bringen des Zielpolynukleotids mit einem Molekül, das mit dem Zielpolynukleotid wechselwirkt, falls die Eigenschaft vorliegt,
iii) Abtrennen der wechselwirkenden Zielpolynukleotide von denjenigen, die nicht wechselwirken,
iv) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) und
v) Identifizieren, welche Signalsequenzen und in welcher Reihenfolge diese in den abgetrennten Zielpolynukleotiden vorliegen, um derart die Eigenschaften jedes Zielpolynukleotids zu bestimmen.
Claims (15)
- Verfahren zur Identifizierung spezifischer Eigenschaften von in einer Probe vorhandenen Zielpolynukleotiden, umfassen die Schritte: i) Anfügen einer Polynukleotidsignalsequenz, die für die zu untersuchende Eigenschaft spezifisch ist, an ein Ende jedes Zielpolynukleotids in der Probe, ii) In-Kontakt-bringen des Zielpolynukleotids mit einem Molekül, das mit dem Zielpolynukleotid wechselwirkt, falls die Eigenschaft vorliegt, iii) Abtrennen der wechselwirkenden Zielpolynukleotide von denjenigen, die nicht wechselwirken, iv) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) und v) Identifizieren, welche Signalsequenzen und in welcher Reihenfolge diese in den abgetrennten Zielpolynukleotiden vorliegen, um derart die Eigenschaften jedes Zielpolynukleotids zu bestimmen.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt (iii) durch (a) Anfügen einer Polynukleotidadaptersequenz an diejenigen Zielpolynukleotide, die mit dem Molekül wechselwirken, und b) Durchführen einer Polynukleotidamplifikationsreaktion mit denjenigen Zielpolynukleotiden, die sowohl die Signalsequenz als auch den Adapter umfassen, durchgeführt wird.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Verfahren durchgeführt wird, um die Nukleinsäuresequenz der Zielpolynukleotide zu bestimmen.
- Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Adapterpolynukleotid eine Restriktionsenzymerkennungssequenz umfasst, welche die spätere Spaltung nach dem Amplifikationsschritt erlaubt.
- Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifikation unter Verwendung der Polymerasereaktion durchgeführt wird.
- Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Adapter- und die Signalsequenz Erkennungssequenzen für in der Polymerasereaktion verwendete Oligonukleotideprimer umfassen.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe in n Reaktionskompartimente aufgeteilt wird, wobei n die Anzahl verschiedener zu untersuchender Eigenschaften ist und die Signalsequenz für jedes Kompartiment spezifisch für dieses Kompartiment ist.
- Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Restriktionsenzymerkennungssequenz spezifisch für ein Enzym der Klasse IIs ist.
- Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Enzym SfaNI oder EarI ist.
- Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Polymerasereaktion unter Verwendung von Methyl-dCTP als Ersatz für dCTP durchgeführt wird.
- Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Adapter auf einem Trägermaterial immobilisiert ist.
- Verfahren nach Anspruch 6, wobei sequentielle Signalsequenzen und gegebenenfalls sequentielle Adapter Erkennungssequenzen für verschiedene Oligonukleotidprimer umfassen.
- Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Zielpolynukleotids, umfassend die Schritte: i) Behandeln einer Probe eines doppelsträngigen Zielpolynukleotids zur Erzeugung von Überhängen an jedem Ende, von denen eines zu sequenzieren ist, wobei jeder Überhang eine definierte Anzahl von Basen aufweist, ii) Aufteilen der Probe und In-Kontakt-bringen jeder getrennten Probe mit einer doppelsträngigen Polynukleotidsignalsequenz und einem doppelsträngigen Adapterpolynukleotid, wobei jede Signalsequenz eine spezifische Polynukleotidsequenz der gleichen Länge wie derjenigen des zu sequenzierenden Überhangs darstellt und einen Überhang umfasst, der die Hybridisierung und Ligation mit demjenigen Ende des Zielpolynukleotids erlaubt, das dem zu sequenzierenden gegenüberliegt, und wobei jeder Adapter einen Überhang umfasst, dessen Sequenz komplementär zu der sequenzierten Überhangsequenz ist, iii) Durchführen der Polymerasereaktion mit der/den Probe(n) unter Verwendung von Primern, die an den Enden der Signalsequenz und der Adaptersequenz hybridisieren, wobei das Produkt der Polymerasereaktion eine Restriktionsschnittstelle umfasst, welche die Abspaltung des Adapters zur Bildung eines neuen zu sequenzierenden Überhangs erlaubt, wobei gegebenenfalls die Schritte (i) bis (iii) unter Verwendung von Restriktionsenzymen wiederholt werden, um die Überhänge zu erzeugen, und iv) Identifizieren, welche Signalsequenzen in den amplifizierten Produkten und in welcher Reihenfolge diese vorliegen, um derart die Sequenz des Zielpolynukleotids zu bestimmen.
- Verfahren nach Anspruch 13, wobei der mit der Signalsequenz ligierende Überhang mindestens 3 Basen aufweist.
- Verfahren nach Anspruch 13 und Anspruch 14, wobei der zu sequenzierende Überhang 4 Basen aufweist.
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