JPH09266800A - 試料調製方法及びこれに用いる試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡ断片混合物を既存プライマーを用いる
塩基配列決定方法を提供する。 【解決手段】 試料ＤＮＡ１をＮｌａ ＩＩＩで切断し
たＤＮＡ断片群３０３を含む液３２０にＤＮＡオリゴマ
ー３０４を添加し、制限酵素切断部の３’末端に既知の
塩基配列のＤＮＡオリゴマー３０４を結合し、オリゴマ
ー結合物を含む液を１６本のチューブに分注し異なるプ
ライマー（ＤＮＡ断片の選別機能を持つ選別配列を３’
末端、５’末端側のアンカー配列に持つ）を入れ相補鎖
合成反応を行ない、生成物のゲル電気泳動スペクトルを
用い、ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅に必要なＰＣＲ用選別プ
ライマーを決定する。チューブ３２３に分取された液を
ＰＣＲの組合せの数（ｋ）の容器に分取し、各容器にＰ
ＣＲ用選別プライマーを添加し、アンカープライマー及
びプライマーセットのプライマーの組合せを用いＰＣＲ
増幅を行ない、得たＤＮＡ断片を精製し塩基配列決定用
の鋳型とする。 【効果】 ＤＮＡの効率の良い分析・塩基配列決定がで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は酵素によるＤＮＡ相
補鎖合成を利用したＤＮＡ分析方法、ＤＮＡ塩基配列決
定方法に用いられるＤＮＡ試料の調製方法及びこれに用
いる試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ゲノム解析を中心にＤＮＡ塩基配列決定
の高効率化のニーズが高まっている。放射性同位元素を
用いてＤＮＡ断片を標識し、ゲル電気泳動によりＤＮＡ
の長さを計測して、人手によって行なう従来の塩基配列
決定法に代わり、ＤＮＡを蛍光体で標識し、ゲル電気泳
動しながら光を当てて自動的にＤＮＡ断片を光学検出す
る装置（ＤＮＡシーケンサー）が普及してきている。こ
の装置は、目的とするＤＮＡにプライマーと呼ばれるＤ
ＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせ、酵素を用いた相
補鎖合成で塩基配列決定に用いる種々の長さのＤＮＡ断
片を作製し、ゲル電気泳動でＤＮＡ断片の長さを調べて
塩基配列決定するものでサンガー法あるいはダイデオキ
シ法と呼ばれている。ここで一度に塩基配列決定できる
長さは、ゲルによる長さ分離能で決められており、４０
０〜７００塩基長である。これより長い数Ｋ塩基から数
十Ｋ塩基のＤＮＡ塩基配列決定は手間と時間のかかる作
業である。

【０００３】従来、長いＤＮＡ（数Ｋ〜数十Ｋ塩基）の
塩基配列決定にはショットガン法が用いられてきた。シ
ョットガン法では試料ＤＮＡを超音波などを用いてラン
ダムに切断し、ＤＮＡ断片をクローニングして大腸菌等
に埋め込み、コロニー培養した後、各コロニー中の大腸
菌を培養してＤＮＡのコピーを増やす。次いで試料ＤＮ
Ａを抽出して解析する。この方法では、取り出したコロ
ニーに含まれるＤＮＡには断片化した試料ＤＮＡが含ま
れるが、ＤＮＡ断片が試料ＤＮＡのどの部分であるの
か、塩基配列決定するまで分からないため、決定しよう
とするＤＮＡ鎖長の１０〜２０倍ものＤＮＡに相当する
ＤＮＡ断片を取り解析しなくてはならない。このため、
時間と手間が大いにかかり大きな障害となっている。

【０００４】一方、塩基配列決定しようとするＤＮＡ断
片を端から順に決めていく方法（プライマーウォーキン
グ；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６、６９１７−６９２１（１９８
９））も提案されている。この方法では、ＤＮＡ断片の
塩基配列を決定したら、その中から次のプライマー領域
を選びダイデオキシ法により塩基配列を再び決定する。
このため無駄が少なく効率の良い塩基配列決定ができる
が、時系列的に塩基配列を決めていくので時間がかかる
点と、解析の都度プライマーを用意する手間がかかる点
に欠点がある。

【０００５】従来技術ではないが、上記欠点を克服する
方法（フラグメントウォーキング法）が発明者により提
案されている（特願平７−２３８１４１号）。このフラ
グメントウォーキング法では、塩基配列決定しようとす
る試料ＤＮＡを４塩基認識酵素などの制限酵素で完全に
切断し、重複のない断片群を作製する。生成したＤＮＡ
断片では制限酵素が認識して切断する部分の塩基配列を
除くと塩基配列は未知である。こられＤＮＡ断片は既知
の塩基配列を持ったプライマーがハイブリダイズし相補
鎖合成の起点となるプライミングサイトを特に持ってな
い。そこで生成したＤＮＡ断片の３’末端側に既知の塩
基配列のオリゴマーを結合してプライミングサイトとす
る。プライマーをＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ相補
鎖合成でＤＮＡ伸長鎖を作る時、プライマーの３’末端
の２塩基（選別配列と呼ぶ）がＤＮＡ断片と完全に相補
的でピッタリとハイブリダイズしている時には反応が進
行するが、そうでない時には反応が遅いか全く進まない
ことが知られている。そこで蛍光標識プライマーの３’
末端（相補鎖伸長側）に任意の２塩基（１６通りの塩基
配列がある）をつけておき、ＤＮＡ断片の中から蛍光標
識プライマーと完全に相補な配列を持つ特定の断片を選
び相補鎖合成したり、塩基配列決定できる（ＤＮＡ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ １、２３１−２３７（１９９４））。

【０００６】ＤＮＡ断片群中に含まれるＤＮＡ断片の種
類が少なく、１種のプライマーと完全に相補的なＤＮＡ
断片が１個の時には各断片の塩基配列を上記プライマー
を用いて、それぞれ決定できる。１種のプライマーが２
つ以上のＤＮＡ断片とハイブリダイズする場合には、予
め長さ分離するなどしてから上述の操作を行なう。この
ようにして、フラグメントウォーキング法では、混合状
態にあるＤＮＡ断片の塩基配列を、１６種のプライマー
を用いてクローニングなどせずに、重複なく簡単に並列
して決定できる。ＤＮＡ断片相互のつながりを決定し、
試料ＤＮＡ全体の塩基配列を決めるには次の様に行な
う。前述した１６種の蛍光標識プライマーは末端にプラ
イミングサイトを持つ断片ＤＮＡにだけハイブリダイズ
し、元の切断されていない試料ＤＮＡにはハイブリダイ
ズしない。しかし、断片ＤＮＡにハイブリダイズした上
記プライマーを相補鎖伸長すると、伸長した部分は元の
試料ＤＮＡと相補的であり、元の試料ＤＮＡにハイブリ
ダイズする。そこで、上記プライマーを用いて各ＤＮＡ
断片の塩基配列決定用の相補鎖合成反応を行なう時、反
応温度を昇降するサイクルシーケンス条件下で行ない、
反応液中に未切断の試料ＤＮＡを加えると、ＤＮＡ断片
の塩基配列に加えて、切断部に続く元の試料ＤＮＡの塩
基配列をも決定できる。この方法では異なる１６種のプ
ライマーを用いて各ＤＮＡ断片とそれに続く塩基配列を
並列して決定でき非常に効率が良い。この方法は、ＤＮ
Ａ断片から次のＤＮＡ断片へ塩基配列をつなげて歩いて
行くのに似ているのでフラグメントウォーキング法と呼
んでいる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】フラグメントウォーキ
ング法は非常に効率の良い方法であるが、プライマーと
して、３’末端の２塩基すべての組み合わせの１６種の
プライマーを用意する必要がある。蛍光式ＤＮＡシーケ
ンサーには、現在、１色方式（ＤＮＡ断片の末端塩基種
を１種の蛍光体で識別し、末端塩基種が異なるＤＮＡ断
片を異なる泳動路で泳動させる）、及び４色方式（ＤＮ
Ａ断片の末端塩基種に対応して４種の蛍光体で識別し、
ＤＮＡ断片を同一の泳動路で泳動させる）があるが、高
スループットを達成するには４色方式が都合が良い。し
かし、上記のフラグメントウォーキング法を４色方式に
適用しようとすると、１６×４＝６４もの蛍光標識プラ
イマーを最低でも用意する必要があり、フラグメントウ
ォーキング法の実用面での課題の１つとなっている。

【０００８】本発明の目的は、この課題を解決し、市販
のユニバーサルプライマーあるいは手持ちの少数のプラ
イマーを用いて、フラグメントウォーキング法を容易に
実行するための、ＤＮＡ分析方法、ＤＮＡ塩基配列決定
方法に用いられるＤＮＡ試料の調製方法、及びこれに用
いる試薬キットを提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明では、３’末端に
２塩基からなる選別配列を持つプライマーにアンカーを
つけたアンカー付の選別プライマー（以下、簡単のため
にアンカープライマーと呼ぶ）を用いて、鋳型となるＤ
ＮＡ断片のコピー数をＰＣＲで増やす。アンカー部分の
相補鎖がＤＮＡ断片の末端に導入されるが、アンカー部
分に蛍光標識プライマーをハイブリダイズさせ塩基配列
決定反応を行なう。アンカープライマー（合計１６種）
は蛍光標識されている必要はなく、塩基配列決定用に使
用する蛍光標識プライマーには、通常のシーケンシング
に用いている４種の蛍光体でそれぞれ標識されたユニバ
ーサルプライマーを用いる。

【００１０】１６種のアンカープライマーは、混合ＤＮ
Ａ断片の中の特定のＤＮＡ断片にハイブリダイズして相
補鎖伸長し、特定のＤＮＡ断片のコピー数を増やすのに
用いられる。この結果、ＤＮＡ断片の混合物の中から、
アンカープライマーが完全にハイブリダイズするＤＮＡ
断片だけを増やし、特定のＤＮＡ断片を実質的に抜き出
すことができる。抜き出されたＤＮＡ断片には、蛍光標
識プライマーがハイブリダイズする部分が導入されてお
り、シーケンシング反応を行なうことができるようにな
っている。即ち、通常のポリメラーゼ反応のプライマー
となり得る塩基配列をもつユニバーサルな蛍光標識プラ
イマーを用い、蛍光標識プライマーの種類を増やすこと
なくフラグメントウォーキング法を容易に実行できる。

【００１１】このような蛍光標識プライマーの例として
は、Ｍ１３系ベクターに用いる、塩基配列（配列番号
１） ５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’ をもつプライマー、Ｔ７系ベクターに用いる、塩基配列
（配列番号２） ５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’ をもつプライマー等の、一般にユニバーサルプライマー
と呼ばれるプライマーの他に、任意の配列をもつ蛍光標
識プライマーが利用できる。もちろん、蛍光標識として
周知の蛍光体が利用できる。

【００１２】本発明の構成の特徴を以下に詳細に説明す
ると、本発明の構成（ａ）では、（１）試料ＤＮＡを制
限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程
と、（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩
基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程
と、（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記制限酵素
により認識される配列と実質的に相補な配列と、３’末
端側に１〜４塩基からなる選択配列とを有し、５’末端
側に少なくとも８マー以上のアンカー配列を有するアン
カープライマーを用いて相補鎖合成しＤＮＡ鎖を得る工
程と、（４）少なくとも上記アンカー配列と実質的に同
じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズし
ないプライマーを用いて、工程（３）で得た上記ＤＮＡ
鎖を鋳型として相補鎖合成を行なう工程とを有する試料
調製方法に特徴がある。

【００１３】本発明の構成（ｂ）では、（１）試料ＤＮ
Ａを切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成す工程と、
（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配
列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチドと実質的に相補な塩基配
列と、３’末端側に１〜４塩基からなる上記ＤＮＡ断片
を選別するための配列とを有し、５’末端側に少なくと
も８マー以上のアンカー配列を有するアンカープライマ
ーと、上記アンカー配列と実質的に同じ塩基配列を有
し、単独では上記ＤＮＡ断片に安定にハイブリダイズし
ないプライマーを用いて、上記ＤＮＡ断片をその末端塩
基配列毎に区分けしてＰＣＲ増幅する工程とを有する試
料調製方法に特徴がある。

【００１４】本発明の構成（ｃ）では、（１）試料ＤＮ
Ａを制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成す
る工程と、（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端
側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加す
る工程と、（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記制
限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列
と、３’末端側に１〜４塩基からなる選択配列とを有
し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列
を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換され、上記
制限酵素で切断できない塩基配列部分を有するアンカー
プライマーと、上記制限酵素で切断を受ける塩基配列を
有するプライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮ
Ａ断片を増幅する工程と、（４）増幅された上記特定の
ＤＮＡ断片の片方の末端を切断したＤＮＡ鎖を得る工程
と、（５）少なくとも上記アンカー配列と実質的に同じ
配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしな
い蛍光標識プライマーを用いて、工程（４）で得た上記
ＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない相補鎖合成Ｄ
ＮＡ断片を得る工程と、（６）上記蛍光標識プライマー
と上記相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、工程（４）で得
た上記ＤＮＡ鎖、上記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケン
シング反応を行なう工程とを有し、上記ＤＮＡ鎖の塩基
配列と上記ＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の上記試
料ＤＮＡの塩基配列を決定する塩基配列方法に特徴があ
り、上記蛍光標識プライマーは、少なくとも上記アンカ
ー配列と実質同じ配列を持つことにも特徴がある。

【００１５】本発明の構成（ｄ）では、（１）試料ＤＮ
Ａを第１の制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を
生成する工程と、（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも
３’末端側に塩基配列が既知であり、第２の制限酵素に
よる認識部配列をもつオリゴヌクレオチドを付加する工
程と、（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記第１の
制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配
列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第１の選択配列
を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第１のア
ンカー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換
され、上記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分
を有する第１のアンカープライマーと、上記オリゴヌク
レオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する認識
部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩
基からなる第２の選択配列を有し、５’末端側に少なく
とも８マー以上の第２のアンカー配列を有し、上記オリ
ゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、上記第２の制
限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアン
カープライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ
断片を増幅する工程と、（４）増幅された上記特定のＤ
ＮＡ断片の第１の末端を上記第２の制限酵素により切断
して第１のＤＮＡ鎖を、増幅された上記特定のＤＮＡ断
片の第２の末端を上記第１の制限酵素により切断して第
２のＤＮＡ鎖をそれぞれ得る工程と、（５）少なくとも
上記第１のアンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上
記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第１の蛍光標
識プライマーと、少なくとも上記第２のアンカー配列と
実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブ
リダイズしない第２の蛍光標識プライマーとを用いて、
工程（４）で得た上記第１、第２のＤＮＡ鎖を鋳型とし
て相補鎖合成を行ない第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断
片を得る工程と、（６）上記第１、第２の蛍光標識プラ
イマーと上記第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用
い、工程（４）で得た上記第１、第２のＤＮＡ鎖、上記
試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工
程とを有し、上記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列と、
上記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の
上記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する塩基配列方法に特
徴があり、上記第１の蛍光標識プライマーは、少なくと
も上記第１のアンカー配列と実質同じ配列を、上記第２
の蛍光標識プライマーは、少なくとも上記第２のアンカ
ー配列と実質同じ配列を、それぞれ持つことにも特徴が
ある。

【００１６】本発明の構成（ｅ）では、ライゲーション
用オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列と、制限酵素
が認識する認識部配列と、ユニバーサルプライマーと同
じ配列とを有し、３’末端側に１塩基〜４塩基からなる
選択配列を有し、ＤＡＮ断片の末端の塩基配列を選択を
可能とする複数のアンカープライマーからなる試薬キッ
トに特徴があり、上記アンカープライマーは、上記ＤＡ
Ｎ断片の末端の２塩基の配列を選択する選択配列が、２
塩基からなるすべての組み合わせの塩基配列を含むこと
にも特徴がある。

【００１７】本発明の構成（ｆ）では、少なくともライ
ゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライ
マーからなる試薬キットにおいて、上記相補鎖合成用プ
ライマーが、上記オリゴヌクレオチドと実質的に相補な
配列、制限酵素が認識する認識部配列と、この認識部配
列の３’末端側に２塩基からなる選択配列とを有する１
６種のプライマーからなる第１のプライマーセットと、
この第１のプライマーセットの各プライマーの５’末端
側にアンカー配列を付加し、上記各プライマーの上記認
識部配列の一部の塩基を置換した１６種のプライマーか
らなる第２のプライマーを含む試薬キットに特徴があ
る。

【００１８】本発明の構成（ｇ）では、少なくともライ
ゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライ
マーからなる試薬キットにおいて、上記相補鎖合成用プ
ライマーが、上記オリゴヌクレオチド、及び第１の制限
酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列
と、３’末端側に１〜４塩基からなる第１の選択配列を
有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第１のアン
カー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換さ
れ、上記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を
有する第１のアンカープライマーセットと、上記オリゴ
ヌクレオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する
認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜
４塩基からなる第２の選択配列を有し、５’末端側に少
なくとも８マー以上の第２のアンカー配列を有し、上記
オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、上記第２
の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２の
アンカープライマーセットを含む試薬キットに特徴があ
り、上記第１、第２の選択配列の塩基が２塩基からな
り、２塩基からなるすべての組み合わせの塩基配列を含
むことにも特徴がある。

【００１９】本発明の構成（ｈ）では、構成（ａ）、
（ｂ）の試料調製方法により調製された試料を分析する
分析方法に特徴がある。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、図を参照して本発明の実施
の形態を詳細に説明する。

【００２１】（第１の実施例）図１は、本発明の試料調
製法を用いるＤＮＡ解析プロセスを説明する図である。
解析しようとする試料ＤＮＡ３０１（数Ｋｂ〜１０Ｋｂ
の長を持つ）を含む溶液３０２を２分割して、それぞれ
第１のチューブ３０２−１、第２のチューブ３０２−２
に分取する。第１のチューブ３０２−１に含まれる試料
ＤＮＡを制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで切断し、ＤＮＡ断片
群３０３を得る。Ｎｌａ ＩＩＩは塩基配列−ＣＡＴＧ
−を認識し、３’末端に−ＣＡＴＧ（３’）の塩基配列
を持つＤＮＡ断片を生成する。使用する制限酵素は、Ｓ
ａｕ ３Ａｌ、Ｈｈａ Ｉ、Ｍａｅ Ｉの他何でも良い
が、切断部位が頻度高く現われる４塩基認識酵素が良
い。ＤＮＡ断片群３０３を含む液３２０にＤＮＡオリゴ
マー３０４を添加して、制限酵素による切断部の少なく
とも３’末端に既知の塩基配列を持つＤＮＡオリゴマー
３０４を結合する。ＤＮＡオリゴマー３０４を結合する
方法には、ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによるポリＡ鎖の
付加とライゲーションを用いた方法があるが、ここでは
ライゲーションを用いた例で説明する。ライゲーション
反応生成物を含む液３２１は、２分割してチューブ３２
２、３２３に分取しておく。

【００２２】図２は、ＤＮＡオリゴマー３０４をライゲ
ーション結合したＤＮＡ断片を示す図である。図２にお
いて、Ｎ、及びｎは塩基配列を決定しようとするＤＮＡ
断片を構成するヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれ
かである）であり、Ｎｌａ ＩＩＩにより認識される認
識配列３０５は５’−ＣＡＴＧ−３’である。ＤＮＡオ
リゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖の３’末端側は
相補鎖合成しないようにｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅで置換するなどして相補鎖がこれ以上伸びないよ
うにする。もちろん、ＤＮＡオリゴマーの段階で３’−
ＯＨをアミノ基やビオチン等の残基で修飾し、３’伸長
を妨げる型としておいて良い。ＤＮＡオリゴマー３０４
を結合した後のＤＮＡ鎖の３’末端側は相補鎖合成しな
いようにするのは、使用するアンカープライマーによる
相補鎖合成でアンカープライマーの３’末端（ＤＮＡ断
片の選別を行なうための塩基配列を持つ部分）がＤＮＡ
断片と完全に相補的でない場合には、アンカー部分と相
補的な鎖ができないようにするためである。アンカープ
ライマーの３’末端がＤＮＡ断片と完全にマッチした鎖
では、反対側の末端（合成鎖の３’末端）にアンカープ
ライマーの一部がハイブリダイズし、更に、伸長してア
ンカー部分と相補的な塩基配列を３’末端側に持つＤＮ
Ａ断片が合成される。

【００２３】図３（ａ）は、ＤＮＡオリゴマー３０４を
結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイ
ズするアンカープライマーセット（アンカープライマー
セット）の概念図、図３（ｂ）は、ＤＮＡオリゴマー
３０４を結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイ
ブリダイズするプライマーセットの概念図である。Ｄ
ＮＡ断片に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に相補的
な部分３１５と、その５’末端側にアンカー配列３１１
とを持ち、３’末端側のＸＸで示す２塩基（１〜４塩基
で良い）からなる選別配列３１２を持つ１６種（１〜４
塩基に対応して４〜２５６種）のアンカープライマーセ
ット３０６を用意する。選別配列３１２は特定のＤＮＡ
断片をＤＮＡ断片の混合物の中から選択するための塩基
配列である。このアンカープライマーセット３０６のア
ンカー部分３１１あるいはアンカー部分３１１を含む部
分の塩基配列は実質ユニバーサル配列としておく。この
時、図３（ａ）の３１３に示す様に、アンカープライマ
ーセット３０６の３’末端から６塩基目の塩基（制限酵
素の認識配列内の１つ、ここではＣである）を、別の塩
基、例えばＴに変えたアンカープライマー（アンカープ
ライマーセット）１６種と、変化させずＣのままのプ
ライマーセット３０７（プライマーセット）とを用意
する。この例では、図３（ｂ）に示す様に、プライマー
セットにはアンカーをつける必要はないが、後のチェ
ックに都合のよいように、ＴｅｘａｓＲｅｄあるいはＦ
ＩＴＣで蛍光標識３１４をつけておく。

【００２４】１種の蛍光体で蛍光標識されたプライマー
セットとＤＮＡ断片混合物とを用いてプライマーの伸
長反応を行なう。即ち、図１に示す様に、ライゲーショ
ン反応生成物を含む液を含むチューブ３２２から、液を
１６本のチューブ３２２−１、３２２−２、…、３２２
−１６に分注し、ぞれぞれ異なるプライマーを入れて相
補鎖合成をする。即ち、各チューブにはそれぞれ異なっ
た選別配列３１２を有するプライマーが加えられる。相
補鎖合成の産物はゲル電気泳動される。図４は、相補鎖
合成の産物のゲル電気泳動スペクトルの例である。電気
泳動パターンには、選別配列３１２を有するプライマー
と、ＤＮＡ鎖（２本鎖）のうちの＋鎖、及び−鎖のそれ
ぞれとから相補鎖合成された産物が、泳動開始点から等
距離Ｌに対を成して出現する。プライマーの３’末端の
２塩基が完全にＤＮＡ断片とマッチする時には相補鎖合
成がおこり、そのＤＮＡ断片と同じ長さの蛍光標識ＤＮ
Ａ断片が生成する。そこで図４のスペクトルを得ること
でＤＮＡ断片群中にいかなる長さの断片があり、その末
端の塩基配列は何であるかがわかる。図５は、検出され
たＤＮＡ断片の構造例を示す図である。例えば、選別配
列（プライマー選択配列）ＡＧを持つプライマー、及び
選別配列（プライマー選択配列）ＴＣを持つプライマー
で得たｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍには、ＤＮＡ
鎖長約４００塩基のＤＮＡ断片が現われる。

【００２５】これらから、元の試料ＤＮＡを制限酵素に
より切断した２本鎖ＤＮＡ断片の中には、長さが約４０
０ｂｐであり、それぞれの鎖の３’末端側の塩基配列が
それぞれ３’□ＧＴＡＣＴＣ…５’、及び３’□ＧＴＡ
ＣＡＧ…５’であるＤＮＡ断片が含まれることがわか
る。ここで「□」はライゲーションでＤＮＡ断片中に導
入したオリゴマーの塩基配列であり、「…」はＤＮＡ断
片に固有の塩基配列である。制限酵素認識部の塩基配列
３’ＧＴＡＣ５’に続く５’末端側の塩基配列は、それ
ぞれＡＧ、及びＴＣに相補的な塩基配列となる。即ち、
図５に示したＤＮＡ断片がＤＮＡ断片混合物中にあるこ
とがわかる。このＤＮＡ断片だけを取り出すには末端塩
基配列がＡＧ、及びＴＣをそれぞれ持つアンカープライ
マーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａ
ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行ない、そのＤＮＡ断片の
コピー数を他より数桁大きくすればよい。

【００２６】このようにして得たＤＮＡ断片の塩基配
列、及びそれらに連なる元の試料ＤＮＡの塩基配列を、
４種の蛍光体でそれぞれ標識されたプライマーを用いて
決定する。既存の４種の蛍光標識プライマーを用いてシ
ーケンシングをするために、ＰＣＲ用のプライマーとし
て５’末端側にアンカーの入ったアンカープライマーセ
ット３０６を用いる。即ち、このアンカープライマー
は、図３（ａ）にす様に既存のプライマーと共通なアン
カー配列３１１、ライゲーションでＤＮＡ断片の３’末
端側に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４と実質相補で
あり、アンカープライマーセット３０６に共通する共通
プライマー配列３１５、制限酵素が認識する塩基配列の
１部あるいは全部と共通な塩基配列、及び３’末端側に
２塩基からなる選別配列３１２を持つプライマーであ
る。アンカー配列３１１と共通プライマー配列３１５
は、一部が共通でも良いが、共通部分の長さは８マー以
下であり、４種の蛍光体でそれぞれ標識された既存のプ
ライマー単独では、ＤＮＡ断片に導入したＤＮＡオリゴ
マー３０４の塩基配列に安定にハイブリダイズし相補鎖
合成を行なうことはできないことが必要である。共通プ
ライマー配列３１５はＤＮＡオリゴマー３０４と実質相
補な塩基配列を持つ。また、アンカー部分３１１の塩基
配列は１０マー以上、望ましくは１５マー以上が安定な
ハイブリダイズを得る上で必要である。

【００２７】ここでプライマー配列に工夫をする。即
ち、これらアンカープライマーは、ＤＮＡ断片に導入
されたＤＮＡオリゴマー３０４と相補な塩基配列と、
３’末端に２塩基の選択配列（ＸＸ）３１２を持つが、
制限酵素が認識する塩基配列−ＣＡＴＧ−の５’末端側
の１塩基の種類を変化させておく。図３（ａ）の例で
は、塩基配列−ＣＡＴＧ−のうちＣをＴに変化させてあ
り（Ｔの代わりにＡ、Ｇとしてもよい）、このアンカー
プライマーは、３’末端から６塩基目の塩基Ｔ３１３が
ミスマッチを起こすが、ＤＮＡ断片の末端に導入された
ＤＮＡオリゴマー３０４に安定にハイブリダイズし、相
補鎖を形成する。この結果、形成されたＤＮＡ鎖は本実
施例で用いた制限酵素で切断できない型となる。なお、
塩基配列−ＣＡＴＧ−のうちＡを、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれ
かに変化させても、このアンカープライマーは、３’末
端から５塩基目の塩基がミスマッチを起こすが、ＤＮＡ
断片の末端に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に安定
にハイブリダイズし、相補鎖を形成する。この結果同様
に、形成されたＤＮＡ鎖は本実施例で用いた制限酵素で
切断できない型となる。また、１６種のプライマー（プ
ライマーセット）を用意する。これらプライマーは図
３（ｂ）に示すように、アンカー配列を持たないが、選
択配列（ＸＸ）３１２を持ったプライマーであり、３’
末端から２塩基目から６塩基目の塩基配列は塩基配列−
ＣＡＴＧ−に相補であり、５’末端の蛍光標識３１４を
つけてもよく、つけなくてもよい。

【００２８】図４の結果を用いて、１３０塩基より長い
ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するのに必要なＰＣＲ用選別プ
ライマーを決定する。図１に示すように、チューブ３２
３に分取された液を、ＰＣＲの組み合わせの数（ｋ）
（電気泳動パターンにおいて、相補鎖合成された産物
が、泳動開始点から等距離に出現する対の数以下であ
り、決定されたＰＣＲ用選別プライマーの種類の数に等
しい）の容器３２３−１、３２３−２、…、３２３−ｋ
に分割し、容器にそれぞれ異なるＰＣＲ用選別プライマ
ーを添加して、選別プライマーを用いたＰＣＲ増幅を行
なう。このＰＣＲ増幅には、アンカープライマーセット
、及びプライマーセットのプライマーの組合せを用
いる。ここで１３０塩基（通常１５０塩基）以下のＤＮ
Ａ断片は解析しなくても、次に述べるように各ＤＮＡ断
片の接続操作で全体塩基配列を決定できるのでＰＣＲ増
幅は行なわない。

【００２９】ＰＣＲ増幅で得たＤＮＡ断片を透析などで
精製し、塩基配列決定用の鋳型とする。図６は、アンカ
ープライマーを用いた相補鎖合成（ＰＣＲ増幅）によ
り得られる産物の一例を示す図である。図６において、
３０４’の部分はＤＮＡオリゴマー３０４の伸長部分で
ある。ここで得たＤＮＡ断片は、アンカープライマーセ
ット３０６（アンカープライマーセット）のアンカー
プライマー、及びプライマーセット３０７（プライマー
セット）のプライマーをそれぞれ末端に持つＤＮＡ断
片である。プライマーセット３０７のプライマーが結合
した部分３０５の−ＣＡＴＧ−は先に用いた制限酵素を
用いると、切断部位４００で切断されるが、アンカープ
ライマーセット３０６のアンカープライマーの結合した
側の部分３５１の−ＣＡＴＡ−は−ＣＡＴＧ−と異なる
ため先に用いた制限酵素により切断されない。

【００３０】この結果、先の制限酵素でＰＣＲ増幅産物
を切断後１本鎖として、アンカー配列３１１と同じ塩基
配列を持つ蛍光標識プライマー３３０（＊は蛍光標識を
示す）を用いて相補合成すると、３’末端側に元の試料
ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、元の試料ＤＮＡ
鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長可能なＤＮＡ断
片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０２）が生成
する。次いで、先に第２のチューブ３０２−２に分取し
た断片化前の元の試料ＤＮＡ３０１と、塩基配列決定用
の試薬（ｄｄＮＴＰ：ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む試薬）とを加え
てシーケンシング反応を行なう。蛍光標識プライマー３
３０を用いたシーケンシング反応からＰＣＲ増幅したＤ
ＮＡ断片の塩基配列がわかり、予め用意した上記の相補
鎖伸長した蛍光標識プライマー４０２を用いたシーケン
シング反応からこのＤＮＡ断片がつながるべき塩基配列
（つなぎの塩基配列）がわかる。即ち、ＤＮＡ断片の塩
基配列と、この塩基配列に隣接する塩基配列を決定でき
る。

【００３１】図６に示すＤＮＡ断片は、アンカープライ
マーセット３０６のアンカープライマーとプライマーセ
ット３０７（プライマーセット）のプライマーをそれ
ぞれ末端に持つＤＮＡ断片である。異なるＰＣＲ選別プ
ライマー（図３（ａ）、図３（ｂ）において、異なる選
別配列を持つプライマーセット３０７、３０６のプライ
マー）を用いた反応から、試料ＤＮＡ３０１の塩基配列
を読むことができる。上記シーケンス反応では、異なる
発光波長を持つ４種の蛍光体でそれぞれ標識されたプラ
イマーを用いて、いわゆるＡ反応、Ｃ反応、Ｇ反応、及
びＴ反応を行なうもので、蛍光標識プライマー３３０と
して通常の４色プライマーを用いることができるので、
取り扱いが簡単で便利である。即ち、３’末端に選択配
列を持つ１６種の蛍光標識プライマー（４色なので合計
６４種のプライマーとなる）を作る必要がない利点があ
る。

【００３２】（第２の実施例）本実施例は２本鎖ＤＮＡ
の塩基配列を３’末端、５’末端の両側から同時に決定
する例である。図７は、選択配列を持つアンカープライ
マー、標識プライマーとＤＮＡ断片の関係を示す図であ
る。蛍光標識されたフォワードプライマー（＋鎖を相補
鎖伸長合成するために使用されるプライマー）１７１、
及びプライマー（−鎖を相補鎖伸長合成するために使用
されるプライマー）３７１を用いるが、標識蛍光体はそ
れぞれＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（３１４、発光波長６１５ｎ
ｍ）、及びＣｙ−５（１４１、発光波長６５４ｎｍ）を
用いた。以後、これらプライマーを、プライマー−ａ
（１７１、フォワードプライマー）、プライマー−ｂ
（３７１）と呼ぶ。プライマー−ａ（１７１）、−ｂ
（３７１）、アンカープライマー（３６１、３６２）と
ＤＮＡオリゴマー３０４を末端に付けたＤＮＡ断片の関
係を図７に示した。プライマー−ａ（１７１）とアンカ
ープライマー−ａ（３６１）のアンカー配列は実質共通
の塩基配列を持ち、プライマー−ｂ（３７１）とアンカ
ープライマー−ｂ（３６２）のアンカー配列は実質共通
の塩基配列を持つ。プライマー−ａ、−ｂは、部分的に
ＤＮＡ断片にハイブリダイズすることはあっても安定で
はなくアンカープライマーの存在なしでは相補鎖合成は
起こさない塩基配列としてある。即ち、アンカープライ
マーが伸長してできたＤＮＡ鎖３１６の部分にだけ安定
にハイブリダイズし、シーケンシング産物を作る。

【００３３】ＤＮＡ断片に結合させるＤＮＡオリゴマー
の塩基配列の中にｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素Ｆｏｋ Ｉ
による制限酵素認識部（−ＧＧＡＴＧ−）３１８を入れ
ておく。この制限酵素Ｆｏｋ Ｉは制限酵素認識部３１
８より３’末端側の９塩基の部位３１７を切断する制限
酵素で、後で述べるように、ＤＮＡ断片に結合したＤＮ
Ａオリゴマーを除去するのに用いることができる。アン
カープライマー−ａ（３６１）は制限酵素認識部（但
し、塩基が置換された制限酵素認識部である）３５１
（ここではＮｌａ ＩＩＩによる制限酵素認識部）の塩
基配列−ＣＡＴＧ−を一部変化させ３１３のようにＣ→
Ｔとし−ＴＡＴＧ−と変化させて、制限酵素Ｎｌａ Ｉ
ＩＩで切断できなくしたものとするが、ｃｌａｓｓ２Ａ
の制限酵素切断の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）３１８は
持つので、Ｆｏｋ Ｉでは切断される。一方、アンカー
プライマー−ｂ（３６２）は制限酵素認識配列部−ＣＡ
ＴＧ−３０５は保存するが、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素
の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）の一部３１９を変化させ
−ＧＴＡＴＧ−とし、Ｆｏｋ Ｉでは切断されないよう
にしてある。即ち、アンカープライマー−ａと−ｂを用
いて、ＰＣＲ増幅した産物は制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで
片側を、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素で反対側を切断で
き、それぞれＤＮＡ断片の末端に導入したＤＮＡオリゴ
マーを除去できるよう工夫してある。もちろん、アンカ
ープライマー−ａ、及び−ｂは、３’末端に２塩基から
なる選別配列３１２（図７の例では、ＡＧ、ＴＣ）を持
っており、それぞれ１６種のプライマーからなるアンカ
ープライマーセットである。

【００３４】以下、手順に従って説明する。第１の実施
例と同様に解析しようとする試料ＤＮＡ（数Ｋｂ〜１０
Ｋｂ）を含む液が２分割される。分割された一方の液
は、試料ＤＮＡを制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩ（他の４塩基
認識酵素でもよい）で切断する。制限酵素による切断部
には既知の塩基配列を持ったＤＮＡオリゴマーをライゲ
ーションにより結合する。ここで用いたＤＮＡオリゴマ
ーは、塩基配列（配列番号３）、 ５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧ−３’ をもつヘルパーオリゴマー１０１と、塩基配列（配列番
号４）、 ３’−ＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣ−５’ の３’端にビオチン（Ｂｉｏ）が導入され、５’端にリ
ン酸基（Ｐ）を有する ３’ Ｂｉｏ−ＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣ Ｐ−５’ の構造を持つリンカーオリゴマー１０２である。ヘルパ
ーオリゴマー１０１は、Ｎｌａ ＩＩＩにより生じる突
出端であるＣＡＴＧ−３’を除いた塩基配列はリンカー
オリゴマー１０２の塩基配列と相補的な関係にあり、ビ
オチン（Ｂｉｏ）は伸長反応をブロックするために導入
されたものであり、３’端のＯＨ基をビオチン（Ｂｉ
ｏ）以外の物質で修飾してもよい。ＤＮＡオリゴマーを
導入したＤＮＡ鎖には、一方の末端近傍にＮｌａ ＩＩ
Ｉ、他方の末端の近傍にＦｏｋ Ｉにより認識される切
断部が存在する。導入されたリンカーオリゴマー１０２
の３’末端は、これ以上鎖伸長しないようにビオチンで
ロックされている。ライゲーションの収率が悪い場合
は、５’−Ｐを持たないリンカーを用いて、ヘルパオリ
ゴマー１０１のみをライゲーションした後、ポリメラー
ゼ反応で相補鎖を合成する。

【００３５】この場合、３’末端はターミナルヌクレオ
チジルトランスフェラーゼでジデオキシヌクレオチドを
３’末端に導入してロックする。この手法を用いれば、
プライマー同士がライゲーションでダイマーとなること
を防げれるので、高効率でヘルパオリゴマー１０１とリ
ンカーオリゴマー１０２の塩基配列をＤＮＡ鎖に導入で
きる。ＤＮＡ断片のセルフライゲーションは大過剰（１
００倍）のオリゴマーを用いることで防止できる。アン
カープライマー−ａ（アンカープライマーセットａ）、
及びアンカープラマイマー−ｂ（アンカープライマーセ
ットｂ）は、導入されたＤＮＡオリゴマー、及びＮｌａ
ＩＩＩによる認識部に共通してハイブリダイズする
が、アンカープライマー−ａは、Ｎｌａ ＩＩＩによる
認識部の塩基配列が−ＣＡＴＧＮＮ３’から−ＴＡＴＧ
ＮＮ３’へと変化している。一方、アンカープライマー
−ｂは、Ｆｏｋ Ｉによる認識部の塩基配列が−ＧＧＡ
ＴＧＣＡＴＧＮＮから−ＧＴＡＴＧＣＡＴＧＮＮへと変
化している。これらの変化は、いずれも相補鎖合成には
支障のない点置換である。

【００３６】図８は、選択配列を持つアンカープイライ
マーを用いてＤＮＡ断片を選別してＰＣＲを行なうに先
立ち少量のＤＮＡ断片でプライマーの対を決定する方法
を説明する図である。ＤＮＡ断片の混合物をＰＣＲ増幅
するためのプライマーの対を決定するために、第１の実
施例と同様の電気泳動スペクトルを作る。即ち、先に２
分割された一方の試料溶液（制限酵素により切断された
ＤＮＡ断片群を含む）を、さらに、図８に示すように１
６分割しそれぞれ容器に収納し、それぞれにアンカープ
ライマーセットｂに属する１６種のプライマー１１０を
１種づつ加え、更に蛍光標識（＊）されたフォワードプ
ライマー１１１を加え、サイクルシーケンシングの条件
下で相補鎖伸長して、フォワードプライマー１１１から
伸長した相補鎖１０６を形成する。ここではアンカープ
ライマー−ｂを用いたが、アンカープライマー−ａ、あ
るいはまったく点置換を持たないプライマーセットでも
同様に使用できる。反応ではまずアンカープライマー−
ｂ（１１０）がＤＮＡ断片１００にハイブリダイズし、
３’末端が完全にマッチしたものについて相補鎖伸長１
０３がおこる。ここでマッチしない側の鎖は伸長しな
い。相補鎖は導入オリゴマー（ヘルパーオリゴマー１０
１）部分まで行なわれ、結果として伸長鎖の３’末端に
ヘルパオリゴマー１０１にハイブリダイズする塩基配列
１０４ができる。熱サイクル反応により、この相補鎖伸
長１０３は、更に続いて、プライマー１１０のアンカー
配列と相補な塩基配列１０５を３’末端にもつＤＮＡ断
片を形成する。即ち、フォワードプライマー１１１のハ
イブリダイズする塩基配列１０５部分が形成される。こ
の塩基配列１０５部分にフォワードプライマー１１１が
ハイブリダイズし、伸長した相補鎖１０６を形成する。
以後は、通常のＰＣＲと同様に反応が進み、アンカープ
ライマー−ａの末端塩基配列が完全にハイブリダイズす
る、ＤＮＡ断片と実質同じ長さ（両端のアンカープライ
マーの長さだけ長い）の蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。

【００３７】ここではＤＮＡ断片混合物の長さを、ＤＮ
Ａ断片の末端の２塩基種毎に求めるのに用いたが、ＤＮ
Ａ断片混合物をその末端の２塩基配列毎にＰＣＲ増幅す
る手法としても有効である。選別配列を２塩基から３あ
るいは４塩基に増やすと１塩基ミスマッチしていてもプ
ライマーとして機能することがある。これを防ぐため、
例えば３塩基の選択配列を持つ場合、アンカープライマ
ーの３’末端から４塩基目（選択配列の手前の塩基）に
イノシンを入れ、末端の結合力を弱める。この場合、更
に選択配列にミスマッチがあると相補鎖合成は非常に困
難になり選別特性を上げるのに都合が良い。

【００３８】各１６種のアンカープライマー−ｂ毎に得
られた蛍光標識ＤＮＡ鎖をゲル電気泳動分離して、混合
物中に含まれるＤＮＡ鎖の末端塩基配列と長さを知るこ
とができる。このようにして得られた末端塩基配列と長
さを用いて、ＰＣＲ用プライマーを決めるが、２つのプ
ライマーはそれぞれアンカープライマー−ａ、及び−ｂ
から１種づつ選ぶ。この２つのプライマー（例えば、ア
ンカープライマー−ａ（３６１）、及び−ｂ（３６
２））を用いてＰＣＲ増幅することにより、図７に示す
ような、一方の末端近傍にＮｌａ ＩＩＩ、他方の末端
希望にＦｏｋ Ｉによる切断部を持つＤＮＡ断片を得
る。得られた種々のＤＮＡ断片をエタノール沈殿により
精製した後、バッファー液に溶かしてそれぞれ２分割
し、各ＤＮＡ断片について（ａ）、及び（ｂ）の溶液を
得る。（ａ）の溶液にはＮｌａ ＩＩＩを入れ、（ｂ）
の溶液にはＦｏｋ Ｉを入れ、ＤＮＡ断片を切断する。
Ｎｌａ ＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片を１本鎖化
し、蛍光標識プライマー１７１（フォワードプライマ
ー）を用いてサイクル反応下で相補合成すると、３’末
端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、
元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長
可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー
４０４）が生成する。同様にして、Ｆｏｋ Ｉにより切
断されたＤＮＡ断片を１本鎖化し、蛍光標識プライマー
３７１を用いてサイクル反応下で相補合成すると、３’
末端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持
ち、元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖
伸長可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライ
マー４０６）が生成する。このようにして、元の試料Ｄ
ＮＡ鎖３０１にハイブリダイズしてさらに相補鎖伸長可
能なＤＮＡ断片４０４、４０６を予め用意する。

【００３９】次いで、両者を混合し（最後まで別々でも
良い）、制限酵素による切断前の全長をもつ試料ＤＮＡ
３０１を加え、更に、塩基配列決定用の試薬（ｄｄＮＴ
Ｐ：ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅを含む試薬）とを加えてサイクルシーケ
ンシング反応を行なう。この反応により、ＤＮＡ鎖の前
後の塩基配列決定に必要な情報を得ることができる。即
ち、蛍光標識プライマー１７１、３７１を用いたシーケ
ンシング反応からＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の塩基配列
がわかり、上記の相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４
０４、４０６を用いたシーケンシング反応からこのＤＮ
Ａ断片がつながるべき塩基配列（つなぎの塩基配列）が
わかる。即ち、第１の実施例と同様にＤＮＡ断片の塩基
配列と、この塩基配列に隣接する塩基配列を決定でき
る。

【００４０】ここではプライマーはＤＮＡ２本鎖（＋、
−鎖）に対応して２色（２種の蛍光標識されたプライマ
ー）であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの識別は、異なる電気泳動
路で行なう、即ち、末端塩基種毎に異なる電気泳動路で
泳動させる（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、６４
８−６５１（１９９１））。

【００４１】一方、４色蛍光体プライマー（４種の蛍光
体のそれぞれで標識されたプライマー）を用いる時に
は、（ａ）の溶液と（ｂ）の溶液を混合せずに、第１の
実施例と同様にして行なう。このようにＤＮＡ鎖の両端
に異なる切断部を持つプライマーでＰＣＲを行なうこと
で、２本鎖の両側から同時に塩基配列決定をできるので
効率が良い。また、両末端の続きの塩基配列を同時に知
ることができるので、塩基配列決定するＤＮＡ断片の数
を最小にできる利点がある。

【００４２】以上の各実施例での試料ＤＮＡの長さは数
Ｋｂ〜１０Ｋｂであればよく、検査対象から抽出された
ＤＮＡから断片化されたＤＮＡ断片試料であってもよい
ことはいうまでもない。

【００４３】

【発明の効果】プライマーセットを用いて塩基配列決定
する方法は多色計測を用いるシステムでは準備するプラ
イマーの数が多く大変であったが、本発明ではアンカー
プライマーにＤＮＡ断片の選別機能を持たせることによ
り、少数の既存プライマーを用いて簡単に長い試料ＤＮ
Ａの塩基配列決定ができる。さらに、ＤＮＡ鎖の両端に
制限酵素により切断可能な異なる切断部を持つプライマ
ーでＰＣＲを行ない、２本鎖の両側から同時に塩基配列
決定できるので効率が良い。

【００４４】（配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ 配列番号：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ 配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧ 配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の試料調製法を用いるＤＮＡ解析プロセ
スを説明する図。

【図２】ＤＮＡオリゴマーをライゲーション結合したＤ
ＮＡ断片を示す図。

【図３】（ａ）は、ＤＮＡオリゴマーを結合した後のＤ
ＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするアンカー
プライマーセットの概念図、（ｂ）は、ＤＮＡオリゴマ
ーを結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリ
ダイズするプライマーセットの概念図。

【図４】１６種の選択プライマーを用いて得たＤＮＡ断
片の相補鎖合成の産物のゲル電気泳動スペクトルの例を
示す図。

【図５】検出されたＤＮＡ断片の構造例を示す図。

【図６】アンカープライマーを用いた相補鎖合成（ＰＣ
Ｒ増幅）により得られる産物の一例を示す図。

【図７】選択配列を持つアンカープライマー、標識プラ
イマーとＤＮＡ断片の関係を示す図。

【図８】選択配列を持つアンカープイライマーを用いて
ＤＮＡ断片を選別してＰＣＲを行なうに先立ち少量のＤ
ＮＡ断片でプライマーの対を決定する方法を説明する
図。

【符号の説明】

３０１…切断前の試料ＤＮＡ、３０２…試料ＤＮＡを含
む溶液、３０２−１…第１のチューブ、３０２−２…第
２のチューブ、３０３…制限酵素切断されたＤＮＡ断片
群、３０４…ＤＮＡオリゴマー、３０４’…ＤＮＡオリ
ゴマーの伸長部分、３０５…制限酵素認識配列部−ＣＡ
ＴＧ−、３０６…アンカープライマーセット、３０７…
プライマーセット、３１１…アンカー配列、３１２…選
別配列、３１３…アンカープライマーセットの３’末端
から６塩基目の塩基、３１４…蛍光標識（Ｔｅｘａｓ
Ｒｅｄ）、１４１…蛍光標識（Ｃｙ−５）、３１５…Ｄ
ＮＡオリゴマーに相補的な部分（共通プライマー配
列）、３１６…アンカープライマーが伸長してできたＤ
ＮＡ鎖（相補鎖合成されたアンカー配列）、３１７…制
限酵素Ｆｏｋ Ｉの制限酵素認識部より３’末端側の９
塩基の部位、３１８…制限酵素Ｆｏｋ Ｉによる制限酵
素認識部（−ＧＧＡＴＧ−）、３１９…ｃｌａｓｓ２Ａ
の制限酵素の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）の一部、３２
０…ＤＮＡ断片群を含む液、３２１…ライゲーション反
応生成物を含む液、３２２、３２３…チューブ、３２２
−１、３２２−２、〜、３２２−１６…チューブ、３２
３−１、３２３−２、〜、３２３−ｋ…容器、３３０…
蛍光標識プライマー、３５１…塩基が置換された認識配
列、３６１…アンカープライマー−ａ（ＡＧ選別配列を
持ったアンカープライマー）、３６２…アンカープライ
マー−ｂ（ＴＧ選別配列を持ったアンカープライマ
ー）、３７１…プライマー−ｂ、１７１…プライマー−
ａ（フォワードプライマー）、１００…ＤＮＡ断片、１
０１…ヘルパーオリゴマー、１０２…リンカーオリゴマ
ー、１０３…ＤＮＡ断片の合成相補（相補鎖伸長鎖）、
１０４…リンカーオリゴマーにハイブリダイズする塩基
配列、１０５…プライマーのアンカー配列と相補な塩基
配列、１０６…プライマー１１１から伸長した相補鎖、
１１０…アンカープライマーセットに属する１６種のプ
ライマー、１１１…フォワードプライマー、４００…制
限酵素切断部位、４０２、４０４、４０６…相補鎖伸長
した蛍光標識プライマー。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複
   数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮ
   Ａ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知である
   オリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記オリ
   ゴヌクレオチド、及び前記制限酵素により認識される配
   列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基か
   らなる選択配列とを有し、５’末端側に少なくとも８マ
   ー以上のアンカー配列を有するアンカープライマーを用
   いて相補鎖合成しＤＮＡ鎖を得る工程と、（４）少なく
   とも前記アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、前記
   試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしないプライマーを用
   いて、工程（３）で得た前記ＤＮＡ鎖を鋳型として相補
   鎖合成を行なう工程とを有することを特徴とする試料調
   製方法。
2. 【請求項２】（１）試料ＤＮＡを切断して複数長さのＤ
   ＮＡ断片を生成す工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の少な
   くとも３’末端側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレ
   オチドを付加する工程と、（３）前記オリゴヌクレオチ
   ドと実質的に相補な塩基配列と、３’末端側に１〜４塩
   基からなる前記ＤＮＡ断片を選別するための配列とを有
   し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列
   を有するアンカープライマーと、前記アンカー配列と実
   質的に同じ塩基配列を有し、単独では前記ＤＮＡ断片に
   安定にハイブリダイズしないプライマーを用いて、前記
   ＤＮＡ断片をその末端塩基配列毎に区分けしてＰＣＲ増
   幅する工程とを有することを特徴とする試料調製方法。
3. 【請求項３】３’末端に制限酵素が認識する認識部配列
   に続く１塩基〜４塩基からなるＤＮＡ断片を選別するた
   めの選択配列を持つプライマーと、前記認識部配列の一
   部の塩基を置換し、前記制限酵素により切断されないよ
   うにしたプライマーとを用いて、少なくとも１回の相補
   鎖合成を行なう工程と、両端近傍に異なる制限酵素が認
   識する認識部配列を有するＤＮＡ鎖を合成する工程とを
   有することを特徴とする試料調製方法。
4. 【請求項４】請求項３に記載の方法において、前記ＤＮ
   Ａ鎖の片方の末端を制限酵素で切断し、試料ＤＮＡの塩
   基配列を決定するための鋳型ＤＮＡを作製する工程を有
   することを特徴とする試料調製法。
5. 【請求項５】（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複
   数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮ
   Ａ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知である
   オリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記オリ
   ゴヌクレオチド、及び前記制限酵素により認識する認識
   部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩
   基からなる選択配列とを有し、５’末端側に少なくとも
   ８マー以上のアンカー配列を有し、前記認識部配列の一
   部の塩基が置換され、前記制限酵素で切断できない塩基
   配列部分を有するアンカープライマーと、前記制限酵素
   で切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用い
   て、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
   （４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の片方の末端を
   切断したＤＮＡ鎖を得る工程と、（５）少なくとも前記
   アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、前記試料ＤＮ
   Ａに直接ハイブリダイズしない蛍光標識プライマーを用
   いて、工程（４）で得た前記ＤＮＡ鎖を鋳型として相補
   鎖合成を行ない相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、
   （６）前記蛍光標識プライマーと前記相補鎖合成ＤＮＡ
   断片とを用い、工程（４）で得た前記ＤＮＡ鎖、前記試
   料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程
   とを有し、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列と前記ＤＮＡ鎖の塩
   基配列に隣接する部分の前記試料ＤＮＡの塩基配列を決
   定することを特徴とする塩基配列決定方法。
6. 【請求項６】（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複
   数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮ
   Ａ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知である
   オリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記オリ
   ゴヌクレオチド、及び前記制限酵素により認識する認識
   部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩
   基からなる選択配列とを有し、５’末端側に少なくとも
   ８マー以上のアンカー配列を有し、前記認識部配列の一
   部の塩基が置換され、前記制限酵素で切断できない塩基
   配列部分を有するアンカープライマーと、前記制限酵素
   で切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用い
   て、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
   （４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の片方の末端を
   切断したＤＮＡ鎖を得る工程と、（５）少なくとも前記
   アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、前記試料ＤＮ
   Ａに直接ハイブリダイズしない蛍光標識プライマーを用
   いて、工程（４）で得た前記ＤＮＡ鎖、前記試料ＤＮＡ
   を鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有
   し、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列と前記ＤＮＡ鎖の塩基配列
   に隣接する部分の前記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する
   ことを特徴とする塩基配列決定方法。
7. 【請求項７】請求項５または請求項６に記載の方法にお
   いて、前記蛍光標識プライマーは、少なくとも前記アン
   カー配列と実質同じ配列を持つことを特徴とする塩基配
   列決定方法。
8. 【請求項８】（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複
   数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮ
   Ａ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知である
   オリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記オリ
   ゴヌクレオチド、及び前記制限酵素により認識する認識
   部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩
   基からなる選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８
   マー以上のアンカー配列を有し、前記認識部配列の一部
   の塩基が置換され、前記制限酵素で切断できない塩基配
   列部分を有するアンカープライマーと、前記制限酵素で
   切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用いて、
   ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程とを有
   し、増幅された前記特定のＤＮＡ断片の塩基配列を決定
   することを特徴とする塩基配列決定方法。
9. 【請求項９】（１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切断
   し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前
   記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知
   であり、第２の制限酵素による認識部配列をもつオリゴ
   ヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記オリゴヌク
   レオチド、及び前記第１の制限酵素により認識する認識
   部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩
   基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少なく
   とも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、前記認識
   部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素で
   切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープラ
   イマーと、前記オリゴヌクレオチド、及び前記第１の制
   限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列
   と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択配列を
   有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２のアン
   カー配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの一部の塩基
   が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない塩基配
   列部分を有する第２のアンカープライマーとを用いて、
   ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
   （４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第１の末端を
   前記第２の制限酵素により切断して第１のＤＮＡ鎖を、
   増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第２の末端を前記第
   １の制限酵素により切断して第２のＤＮＡ鎖をそれぞれ
   得る工程と、（５）少なくとも前記第１のアンカー配列
   と実質的に同じ配列を有し、前記試料ＤＮＡに直接ハイ
   ブリダイズしない第１の蛍光標識プライマーと、少なく
   とも前記第２のアンカー配列と実質的に同じ配列を有
   し、前記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第２の
   蛍光標識プライマーとを用いて、工程（４）で得た前記
   第１、第２のＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない
   第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、
   （６）前記第１、第２の蛍光標識プライマーと前記第
   １、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、工程（４）
   で得た前記第１、第２のＤＮＡ鎖、前記試料ＤＮＡを鋳
   型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、前
   記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列と、前記第１、第２
   のＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の前記試料ＤＮＡ
   の塩基配列を決定することを特徴とする塩基配列決定方
   法。
10. 【請求項１０】（１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切
    断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）
    前記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既
    知であり、第２の制限酵素による認識部配列をもつオリ
    ゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記オリゴヌ
    クレオチド、及び前記第１の制限酵素により認識する認
    識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４
    塩基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少な
    くとも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、前記認
    識部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素
    で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープ
    ライマーと、前記オリゴヌクレオチド、及び前記第１の
    制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配
    列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択配列
    を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２のア
    ンカー配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの一部の塩
    基が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない塩基
    配列部分を有する第２のアンカープライマーとを用い
    て、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
    （４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第１の末端を
    前記第２の制限酵素により切断して第１のＤＮＡ鎖を、
    増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第２の末端を前記第
    １の制限酵素により切断して第２のＤＮＡ鎖をそれぞれ
    得る工程と、（５）前記第１、第２の蛍光標識プライマ
    ー用い、工程（４）で得た前記第１、第２のＤＮＡ鎖、
    前記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行な
    う工程とを有し、前記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列
    と、前記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部
    分前記試料ＤＮＡの塩基配列を決定することを特徴とす
    る塩基配列決定方法。
11. 【請求項１１】請求項９または請求項１０に記載の方法
    において、前記第１の蛍光標識プライマーは、少なくと
    も前記第１のアンカー配列と実質同じ配列を、前記第２
    の蛍光標識プライマーは、少なくとも前記第２のアンカ
    ー配列と実質同じ配列を、それぞれ持つことを特徴とす
    る塩基配列決定方法。
12. 【請求項１２】（１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切
    断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）
    前記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既
    知であり、第２の制限酵素による認識部配列をもつオリ
    ゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記オリゴヌ
    クレオチド、及び前記第１の制限酵素により認識する認
    識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４
    塩基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少な
    くとも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、前記認
    識部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素
    で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープ
    ライマーと、前記オリゴヌクレオチド、及び前記第１の
    制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配
    列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択配列
    を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２のア
    ンカー配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの一部の塩
    基が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない塩基
    配列部分を有する第２のアンカープライマーとを用い
    て、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程とを
    有し、増幅された前記特定のＤＮＡ断片の塩基配列を決
    定することを特徴とする塩基配列決定方法。
13. 【請求項１３】ライゲーション用オリゴヌクレオチドと
    相補的な塩基配列と、制限酵素が認識する認識部配列
    と、ポリメラーゼ反応のプライマーとなり得る塩基配列
    とを有し、３’末端側に１塩基〜４塩基からなる選択配
    列を有し、ＤＡＮ断片の末端の塩基配列を選択を可能と
    する複数のアンカープライマーからなることを特徴とす
    る試薬キット。
14. 【請求項１４】請求項１３に記載の試薬キットにおい
    て、前記アンカープライマーは、前記ＤＡＮ断片の末端
    の２塩基の配列を選択する選択配列が、２塩基からなる
    すべての組み合わせの塩基配列を含むことを特徴とする
    試薬キット。
15. 【請求項１５】少なくともライゲーション用オリゴヌク
    レオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キット
    において、前記相補鎖合成用プライマーが、前記オリゴ
    ヌクレオチドと実質的に相補な配列、制限酵素が認識す
    る認識部配列と、該認識部配列の３’末端側に２塩基か
    らなる選択配列とを有する１６種のプライマーからなる
    第１のプライマーセットと、該第１のプライマーセット
    の各プライマーの５’末端側にアンカー配列を付加し、
    前記各プライマーの前記認識部配列の一部の塩基を置換
    した１６種のプライマーからなる第２のプライマーを含
    むことを特徴とする試薬キット。
16. 【請求項１６】少なくともライゲーション用オリゴヌク
    レオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キット
    において、前記相補鎖合成用プライマーが、前記オリゴ
    ヌクレオチド、及び第１の制限酵素により認識する認識
    部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩
    基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少なく
    とも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、前記認識
    部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素で
    切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープラ
    イマーセットと、前記オリゴヌクレオチド、及び前記第
    １の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補
    な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択
    配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２
    のアンカー配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの一部
    の塩基が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない
    塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーセット
    を含むことを特徴とする試薬キット。
17. 【請求項１７】請求項１６に記載の試薬キットにおい
    て、前記第１、第２の選択配列の塩基が２塩基からな
    り、２塩基からなるすべての組み合わせの塩基配列を含
    むことを特徴とする試薬キット。
18. 【請求項１８】請求項１に記載の試料調製方法により調
    製された試料を分析することを特徴とする分析方法。
19. 【請求項１９】請求項２に記載の試料調製方法により調
    製された試料を分析することを特徴とする分析方法。
20. 【請求項２０】請求項３に記載の試料調製方法により調
    製された試料を分析することを特徴とする分析方法。
21. 【請求項２１】請求項４に記載の試料調製方法により調
    製された試料を分析することを特徴とする分析方法。
22. 【請求項２２】請求項４に記載の試料調製方法により調
    製された試料を分析することを特徴とする分析方法であ
    り、前記ＤＮＡ鎖の片方の末端を制限酵素で切断し、Ｄ
    ＮＡ断片の長さ決定するための鋳型ＤＮＡを作製する工
    程を有することを特徴とする分析方法。