JPH05111399A

JPH05111399A - 核酸試料蛍光検出方法

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Publication number: JPH05111399A
Application number: JP3274264A
Authority: JP
Inventors: Katsuji Murakawa; 克二村川; Hideki Kanbara; 秀記神原
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1991-10-22
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1993-05-07
Anticipated expiration: 2017-09-09
Also published as: JP3322894B2

Abstract

(57)【要約】【目的】生物、ウイルス等の遺伝子の解析に不可欠な
特定の核酸を正確かつ簡便に検出すること。【構成】鋳型となる同一又は異なる試料ＤＮＡの複数
領域に、それぞれ、オリゴヌクレオチドを結合させ、延
長鎖を酵素反応により伸長させ、得られた各領域に対応
する延長鎖を再度鋳型として使用して前記の反応を繰り
返すことにより、前記試料ＤＮＡの複数領域のＤＮＡを
それぞれ増幅させる核酸試料調製方法において、オリゴ
ヌクレオチドが同一でない配列を持つ少なくとも２種の
オリゴヌクレオチドであり、当該少なくとも２種のオリ
ゴヌクレオチドのうち、少なくとも２種のオリゴヌクレ
オチドを、それぞれ異なる蛍光色素で標識し、延長鎖を
酵素反応により伸長させることによって、異なる蛍光色
素で標識された前記複数領域に対応する核酸断片を調製
して、分子量分離し、蛍光色素を光で励起し蛍光検出す
ることを特徴とする核酸試料検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸試料検出方法、よ
り詳細には生物ウイルス等の遺伝子の解析に不可欠な特
定の核酸を正確かつ簡便に測定することを可能にする新
規の核酸試料蛍光検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸試料調製法の１つとして、特開昭62
-217161号に記載されているＰＣＲ (Polymerase Chain
Reaction)法が知られている。この方法は二本鎖ＤＮＡ
の各単鎖と各々相補的なオリゴヌクレオチドである２種
類のプライマーを使用して、特定の核酸配列部位を増幅
するものである。

【０００３】すなわち、まず、サンプルとなる二本鎖Ｄ
ＮＡを準備し、それぞれの一本鎖のＤＮＡに２種類のプ
ライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼを
作用させて各プライマーから延長鎖を生成させる。さら
に、得られた二本鎖の延長生成物に対し、上記の操作を
複数回繰り返すことにより、上記二本鎖ＤＮＡにおける
各プライマー間にはさまれ、かつ検出しようとする領域
を有するＤＮＡ断片を増幅して得ることができる。

【０００４】ＰＣＲで得られたＤＮＡは、分離用の担体
としてポリアクリルアミドやアガロース等のゲルを用い
て、電気泳動によって分子量分離した後、エチジウムブ
ロマイド等の色素で染色して蛍光により可視化すること
で検出できる。あるいは、得られるＤＮＡの配列が予想
できる場合は、ＰＣＲ産物ＤＮＡをナイロン等の膜に転
写後、ラジオアイソトープでラベルした、予想される配
列に相補な配列を持つプローブをハイブリダイズさせ、
オートラジオグラフィをとる、いわゆるブロッティング
の操作で、解析することができる。

【０００５】このＰＣＲ法はプライマーの塩基配列を選
択することにより、種々のＤＮＡ領域を特異的に増幅す
ることができる。このため、ＰＣＲ法で病原菌、ウイル
ス等のゲノムを検出し、感染症診断等を行うなどの応用
がなされている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記ＰＣＲ法は、２種
以上の異なる二本鎖ＤＮＡに対してそれぞれの一本鎖Ｄ
ＮＡに特異性を有するプライマーを同時に複数個使用す
ることで、異なるＤＮＡ領域を同一反応容器中で同時に
増幅させることが可能である。しかしながら、かかる反
応系で得られる複数の増幅されたＤＮＡの分別・分離に
際して以下の問題が生じる。

【０００７】(１) ＰＣＲ産物である複数のＤＮＡの分
子量が互いに同程度である場合、電気泳動に代表される
分子量による分離手段では分離できず、結果として迅速
・確実な分離が困難である場合が多い。 (２) ＰＣＲ産物である複数のＤＮＡの分子量が互いに
異なる場合であっても、目的ＤＮＡの長さや塩基配列等
についての情報なしには、各々のＤＮＡがどの核酸試料
の領域に由来するかを特定することが困難である。

【０００８】また、かかる情報がわかる場合であっても
前記特定のためのブロッティング等の操作は非常に手間
・時間がかかることが常である。 (３) ＰＣＲによる増幅反応は、目的外のＤＮＡの産生
を伴うのが常であり、この副生産物と目的とするＤＮＡ
産物とを分離しなければならず、かかる分離に際して前
記 (２) の問題が生ずる。

【０００９】さらに、遺伝子の診断等に広く応用が可能
な方法として、制限酵素で処理した任意のＤＮＡ断片を
分析することを内容とするＲＦＬＰ (restriction frag
mentlength polymorphism) 法 (吉田、代謝、22, 855
(1985)等) が注目されているが、本方法においては、同
時に複数種の制限酵素を作用させた場合、得られた切断
片がそれぞれどの制限酵素で切断されたものかを試別す
るのは困難である。また、同時に複数種の制限酵素を作
用させるのに相当する反応として、複数の短いオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして使用するときも、多数の
各々の産物がどのプライマーからの伸長産物であるかを
同定するのは容易ではない、という課題がある。

【００１０】ＰＣＲ法で２種以上の異なるＤＮＡに対し
てそれぞれに特異性を有するプライマーを用いる場合
に、上記の課題を解決することができれば複数の病原
菌、ウイルス等のゲノム中の目的領域を迅速・確実に検
出、同定することが可能になり、感染症の診断等の迅速
化・確実化に大きく寄与することが可能である。さらに
前記ＲＦＬＰ法の上記欠点を解決することができれば遺
伝子病等の診断技術の進歩に大きく貢献することが可能
である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するために鋭意研究を行なった結果、少なくとも
２種の配列の異なるＰＣＲ増幅用のプライマーを異なる
蛍光標識でラベルし、ＰＣＲによる増幅後蛍光分析を行
なうことにより上記課題を解決できることを見出した。

【００１２】すなわち、本発明は、鋳型となる同一又は
異なる試料ＤＮＡの複数領域に、それぞれ、オリゴヌク
レオチドを結合させ、延長鎖を酵素反応により伸長さ
せ、得られた各領域に対応する延長鎖を再度鋳型として
使用して前記の反応を繰り返すことにより、前記試料Ｄ
ＮＡの複数領域のＤＮＡをそれぞれ増幅させる核酸試料
調製方法において、オリゴヌクレオチドが相互に同一で
ない配列を持つ少なくとも２種のオリゴヌクレオチドで
あり、かつ、当該少なくとも２種のオリゴヌクレオチド
を、それぞれ異なる蛍光色素で標識し、延長鎖を酵素反
応により伸長させることによって、異なる蛍光色素で標
識された前記複数領域に対応する核酸断片を調製して、
分子量分離し、蛍光色素を光で励起し蛍光検出すること
を特徴とする核酸試料検出方法を提供するものである。

【００１３】本発明核酸検出方法においては、鋳型とな
る同一又は異なる試料ＤＮＡの複数領域に対応する少な
くとも２種のオリゴヌクレオチドプライマーのうち、最
低限２種を異なる蛍光色素で標識することが必要であ
る。本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーとして何
を選択するかによって２つの態様に大別することができ
る。

【００１４】先ず、配列がある程度判明しているＤＮＡ
試料に対して、特定領域のＤＮＡのみを検出する場合で
ある。かかる場合は、鋳型となる同一又は異なる試料Ｄ
ＮＡの複数領域に対応する少なくとも３種のオリゴヌク
レオチドのうち少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを
それぞれ異なる色素で標識することが必要である。

【００１５】試料ＤＮＡに対応するオリゴヌクレオチド
は、異なる二本鎖ＤＮＡを熱変性等して得られる一本鎖
ＤＮＡに対応するものであることが多く、この場合のオ
リゴヌクレオチド数は少なくとも４種である。しかしな
がら、同一の試料ＤＮＡの複数領域について調製する場
合で、対象とする領域が一部重複する場合で、調製すべ
きオリゴヌクレオチドを少なくとも３種とした場合も本
発明の適用対象となる。

【００１６】上記のオリゴヌクレオチドは、検出すべき
少なくとも３種の異なる試料ＤＮＡに対して、それぞれ
異なる領域に対して厳密に相補性を有するべく設計する
のが好ましいが、数塩基程度の非相補的な塩基が含まれ
ることは許容される。このオリゴヌクレオチドの長さ
は、原則として特に制限されるものではないが、試料Ｄ
ＮＡの特定領域と高い特異性を持たせるという見地よ
り、少なくとも10mer以上であるのが好ましい。

【００１７】次に、本発明を制限酵素を利用したＲＦＬ
Ｐ (Restriction-Fragments LengthPolymorphism)法
(吉田、代謝、22, 855 (1985)等) に類似した分析、す
なわち、比較的その構造が明らかにされていない種々の
核酸試料とプライマーの反応産物のパターンをプライマ
ーの塩基配列を変化させることで得て、ゲノム分析等に
供する方法に用いる場合が想定される。

【００１８】かかる場合は、選択すべきオリゴヌクレオ
チドは必ずしも試料ＤＮＡと高い特異性を有する必要は
なく、２種以上の異なる配列を有する任意の配列の混合
物をプライマーとなるオリゴヌクレオチドとして選択す
ることができる。用いられるオリゴヌクレオチドは、特
異性の余り高くない数mer のごく短いオリゴマーであっ
てもよいが、通常５mer から14mer 、より好ましくは８
mer から10mer のオリゴヌクレオチドが用いられる。

【００１９】本発明に用いられるオリゴヌクレオチド
は、常法により化学合成が可能であり、かつ実際のゲノ
ム等から制限酵素を用いて切り出して得ることも可能で
ある。そして、上記により得られたオリゴヌクレオチド
のうち少なくとも２種のオリゴヌクレオチドをそれぞれ
異なる蛍光色素で標識する必要がある。かかる２種のオ
リゴヌクレオチドは、それぞれの異なる塩基配列を有す
るものでなければならない。

【００２０】用いられる蛍光色素の種類、組合せは異な
る波長の蛍光を発する色素の組合せである限りは特に限
定されない。すなわち、一定の励起光によって一定の波
長の蛍光を発するものであれば、励起光の波長が近似し
ているか否かを問わず選択が可能である。例えばテトラ
メチルローダミンイソチアネイト (ＴＲＩＴＣ) 、スル
フォローダミン101 の塩化スルホン酸誘導体、フルオロ
セインイソチアネイト(ＦＩＴＣ) 、４−フルオローク
−ニトロベンゾフラザン (ＮＢＤ−Ｆ) 等を挙げること
ができる。特に好ましいものとして、テトラメチルロー
ダミンイソチアネイト (ＴＲＩＴＣ) 、スルフォローダ
ミン 101の塩化スルホン酸誘導体を挙げることができ
る。

【００２１】蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの標識方
法は特に限定されるものではないが、例えば、アミノ基
導入試薬を用いて核酸塩基に直接蛍光体標識をする方法
や特開昭61-44353号開示の方法、すなわち、オリゴヌク
レオチドの蛍光体標識部位のリン酸結合を官能基を有す
るホスホン酸結合に置き換え、この官能基を蛍光体結合
させることにより蛍光体標識を実現し、オリゴヌクレオ
チドの任意の位置に標識物を導入できる方法を採用する
ことができる。

【００２２】尚、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレ
オチド分子が蛍光標識されている必要はない。次に上記
により得られた異なる蛍光色素で標識したオリゴヌクレ
オチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase cha
in reaction : PCR)法、すなわち、鋳型となる核酸試料
に、複数の標識したオリゴヌクレオチドを結合させ、延
長鎖を酵素を用いた反応で伸長させ、得られた延長鎖を
再度鋳型として前記の反応を繰り返し、同一の核酸試料
を増幅させる核酸試料調製方法により、測定すべき核酸
試料を増幅させることが必要である。

【００２３】かかるＰＣＲ法による核酸試料増幅の詳細
は、例えば、特開昭62-217161号公報において既に報告
されている。増幅の対象とされる試料ＤＮＡとしては、
任意に選択することが可能である。すなわち、その配列
の既知・未知にかかわらず、あらゆる種類の真核生物、
原核生物、ウイルスのＤＮＡに対して選択することがで
きる。また、真核生物や原核生物のｍＲＮＡやＲＮＡウ
イルスのＲＮＡから逆転写して得られたｃＤＮＡを選択
することも可能である。

【００２４】さらに、長さの異なるＤＮＡ同士の組合せ
に限定されるものではなく、分析の対象が同一のＤＮＡ
上の複数領域にかかる場合でも、本発明分析方法を適用
することが可能である。この反応は、用いるＰＣＲプラ
イマー毎に別々の反応容器中で行なうこともできるが、
全体的な測定の効率を考慮した場合、同一反応容器中で
一度に複数の標識オリゴヌクレオチドを用いることが好
ましい。

【００２５】又、この反応は、試験管内で行なうことも
できるが、ＰＣＲ自動反応装置を用いて行なうことも可
能である。さらに、本発明は、増幅されたＤＮＡ鎖を分
子量分離し、蛍光色素を光で励起して蛍光検出すること
を特徴とする。この分子量分離は常法によって行なうこ
とができる。すなわち、電気泳動法、膜分離法等を採用
することができるが、続く蛍光検出のステップの操作の
簡便を図るという意味で、アクリルアミドゲルを用いた
電気泳動法を採用するのが好ましい。

【００２６】次に、特定の色素を光で励起して、かかる
色素が標識されている特定のＤＮＡ断片を蛍光検出する
ことが必要である。励起光は効率良く標識された蛍光色
素を励起可能な光であれば特に限定されない。例えば蛍
光色素としてスルフォローダミン 101の塩化スルホン酸
誘導体及びＴＲＩＴＣを選択した場合には、波長が543n
m 付近のヘリウムネオンレーザー光が好適である。

【００２７】この蛍光検出においては、ゲルにトランス
イルミネーター等の装置を用いた目視法を採用すること
も可能であるが、検出の正確・簡便を期するという意味
で、多色蛍光分析装置等の蛍光分析機器を用いるのが好
ましい。本発明に用いることのできる蛍光分析機器う
ち、好ましい態様の一つとして以下の多色蛍光分析装置
を挙げることができる。

【００２８】かかる蛍光分析装置としては、例えば特開
平2-269935号, 同2-269936号公報及び同2-269937号公報
に記載された蛍光分析装置を好適に用いることができ
る。なお、各蛍光分析装置において、標識色素として、
例えばテキサスレッドとＴＲＩＴＣのごとく比較的励起
波長が近い蛍光色素を選択する場合には、同一波長のレ
ーザー光源を使用することで足りる。しかしながら、多
数の試料を検出する場合等、多種類の蛍光色素の選択を
する場合において励起波長が大きく異なる複数の色素を
選択する場合においては複数のレーザー光源を用いるこ
とができる。すなわち励起光の波長を変化させて目的と
する色素のみを励起する手段を用いることも可能であ
る。

【００２９】

【発明の効果】本発明により、従来検出が困難であっ
た、複数の領域を対象とするＰＣＲ増幅産物の個々の断
片を容易に検出することが可能になった。特に本発明で
は、複数種の短いオリゴヌクレオチドをそれぞれ異なる
色素で標識して用いることができるので、各々の産物が
どのオリゴヌクレオチドからの伸長産物であるかを同定
することが可能である。さらに、本発明は通常区別が困
難である、長さが同一あるいは近接している複数の産物
を区別することも可能である。このように、複数の産物
の由来がプライマーの標識物によって分類できるため
に、複数の塩基配列情報に基づく、より情報量の多い詳
細な分析が可能である。

【００３０】

【実施例】本発明の一例を実施例を用いて説明する。

【００３１】

【実施例１】 (１) 標識オリゴヌクレオチドの調製以下の試料ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを実施例１に
用いた。試料ＤＮＡ：311塩基のインサートを持つプラスミドpUC
119：１ng ヒト白血球抽出ＤＮＡ：１μg オリゴヌクレオチド：配列番号３の塩基配列を有するプライマーＫＭ１配列番号４の塩基配列を有するプライマーＫＭ２配列番号５の塩基配列を有するプライマーＡ配列番号６の塩基配列を有するプライマーＢ (ａ) 試料ＤＮＡの調製イ) 311塩基のインサートを持つプラスミドpUC119の調
製プラスミドpUC119に組み込んだ 311塩基のインサート
は、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの 269塩基からなるＣ８-
２領域 (Nucleic Acid Res. vol.18,(1990) pp1685〜pp
1689) を含む領域に由来するＤＮＡである。

【００３２】この 311塩基から成るＤＮＡは、Ｃ型肝炎
の保因者の血液から常法により調製した。すなわち、Ｃ
型肝炎の保因者の血液をＡＧＰＣ法 (Analytical Bioch
emistry,vol.162, (1987) pp156〜pp159)によりＣ型肝
炎ウイルスＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出後、この全ＲＮ
Ａから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製した。このｃ
ＤＮＡより配列番号１及び配列番号２に示されたオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法 (特開昭62-2
17161号公報) により、求める 311塩基のＤＮＡを得
た。

【００３３】この 311塩基ＤＮＡの5'末端を常法により
リン酸化して、pUC119 (宝酒造社製) の SmaＩサイトに
組み込むことにより、試料ＤＮＡとして用いる 311塩基
のインサートを持つpUC119を調製して、E.coli JM109
コンピテントセル(宝酒造社製) に形質転換した。この
311塩基のインサートを有するpUC119を試料ＤＮＡとし
て用いる場合には、このプラスミドで形質転換したE.co
li JM109から、アルカリ−ＳＤＳ法 (Birnboim, H.C. a
nd Doly, J., Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979))に
よって、311塩基のインサートを有するpUC119を調製し
た。

【００３４】ロ) ヒト白血球抽出ＤＮＡの調製ヒト白血球抽出ＤＮＡは、健常人の血液から常法により
調製した。すなわち、健常人の血液を相当量ヘパリン採
血し、これに蒸留水を加え血球を破壊した後、これを30
00rpm程度で５分間遠心した。この操作をさらに２回繰
り返した後、白血球を含む下層を分離し、ＳＤＳ(Sodiu
m Dodecyl Sulfate)存在下でプロテアーゼＫを作用さ
せ、さらにフェノール−クロロホルム抽出とエタノール
沈殿操作で精製を行ない、ヒト白血球抽出ＤＮＡを調製
した。

【００３５】(ｂ) 標識オリゴヌクレオチドの調製蛍光色素スルフォローダミン101の塩化スルホン酸誘導
体（商品名テキサスレッド，モレキュラープローブ社
製）で標識してpUC119に特異的なプライマーＫＭ１及び
ＫＭ２を；ＴＲＩＴＣ (モレキュラープローブ社製) で
標識してヒトミトコンドリアのＶ領域に特異的なプライ
マーＡ及びＢをＰＣＲプライマーとして用いた。

【００３６】これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡシ
ンセサイザー (ＡＢＩ社製) により合成し、この合成の
際に、各オリゴヌクレオチドの5'末端にアミノ基導入試
薬を用いて各蛍光色素を標識した。かかる標識オリゴヌ
クレオチドは、ＨＰＬＣで精製して以下の検出に供し
た。 (２) 試料ＤＮＡの増幅上記の核酸試料混合物とＰＣＲプライマーを各々20pmo
l、各ｄＮＴＰを各々250μM、 MgCl₂を２.5mM、Tris-HC
l (pH8.５) を10mM、KCl を50mM、ゼラチンを0.00１％
(w/v) (各々最終濃度) となるように混合し、全体を 1
00μl とした。このＰＣＲプライマー混合液に耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ (パーキンエルマーシータス社製) ５
ユニットを加え、蒸発防止用のミネラルオイルを重層
し、94℃・30秒、50℃・90秒、72℃・90秒の熱サイクル
を30回繰返しＰＣＲ増幅を行なった。ＰＣＲ産物は、エ
タノール沈澱操作を行なうことによって余分な塩類等を
除去し、一部を図１に示す２色検出型装置を用いて電気
泳動後蛍光の計測を行なった。

【００３７】図１において、11はガラスのゲル板を、12
はアクリルアミドゲルを、13は励起用光源であるヘリウ
ムネオンレーザー、14はミラー、15はプリズム、16・17
はバンドパスフィルタを18はレンズを、19は２次元検出
器を、20はデータ処理用のコンピュータを示している。
２色検出型装置において、まず、100μlスケール反応で
得られたＰＣＲ産物の１／10⁴量を電気泳動を行ない分
子量分離をし、泳動中のゲルにヘリウムネオンレーザー
光 (波長543nm)を照射して、標識されたテキサスレッド
とＴＲＩＴＣを励起して、それぞれの極大波長の蛍光量
(テキサスレッド:615nm、ＴＲＩＴＣ：575nm) を測定
した。

【００３８】結果を図２に示す。図２において、上段21
はテキサスレッドについて、下段22はＴＲＩＴＣについ
ての検出を行なった結果である。縦軸は蛍光強度の相対
値を、横軸は分子量を示し、右にいくほど分子量が大き
くなる。テキサスレッドの検出ピーク23とＴＲＩＴＣの
検出ピーク24は未反応のテキサスレッド標識プライマー
ＫＭ１と未反応のＴＲＩＴＣ標識プライマーＢによるも
のと考えられた。そして検出ピーク25と検出ピーク26
は、それぞれプライマーに標識されている蛍光色素の違
いにより、ピーク25がインサートを持つプラスミドpUC1
19に対応する 434塩基、ピーク26がヒトミトコンドリア
のＶ領域に対応する121塩基のＰＣＲ産物に対応するも
のであることがわかった。

【００３９】尚、実施例１においては、期待されるＰＣ
Ｒ産物の長さが既知のものを用いて、本発明方法の効果
について検討したが、仮にＰＣＲ産物の長さが未知の場
合でも標識色素の違いによりその由来を知ることができ
る。さらに、反応によって生ずる副生産物の由来も構成
色素の違いにより知ることができる。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の配列合成ＤＮＡプライマー配列の起源：Ｃ型肝炎ウイルス配列：ＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＣＧＡＡ
Ｇ配列番号：２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の配列合成ＤＮＡプライマー配列の起源：Ｃ型肝炎ウイルス配列：ＴＧＴＧＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＡＴＧ
Ｔ配列番号：３配列の長さ：18 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の配列合成ＤＮＡプライマー配列：ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ配列番号：４配列の長さ：18 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の配列合成ＤＮＡプライマー配列：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ配列番号：５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の配列合成ＤＮＡプライマー配列：ＡＴＧＣＴＡＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＡＣＡ
Ｇ配列番号：６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の配列合成ＤＮＡプライマー配列：ＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴ
Ｃ

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に用いた２色検出型装置である。

【図２】実施例１により得られた結果である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】鋳型となる同一又は異なる試料ＤＮＡの
複数領域に、それぞれ、オリゴヌクレオチドを結合さ
せ、延長鎖を酵素反応により伸長させ、得られた各領域
に対応する延長鎖を再度鋳型として前記の反応を繰り返
すことにより、前記試料ＤＮＡの複数領域のＤＮＡをそ
れぞれ増幅させる核酸試料調製方法において、オリゴヌ
クレオチドが相互に同一でない配列を持つ少なくとも２
種のオリゴヌクレオチドであり、かつ当該少なくとも２
種のオリゴヌクレオチドを、それぞれ異なる蛍光色素で
標識し、延長鎖を酵素反応によって、異なる蛍光色素で
標識された前記複数領域に対応する核酸断片を調製し
て、分子量分離し、蛍光色素を光で励起し蛍光検出する
ことを特徴とする核酸試料検出方法。
【請求項２】オリゴヌクレオチドが少なくとも相互に
同一でない配列を持つ３種のオリゴヌクレオチドであ
り、かつ当該少なくとも３種のオリゴヌクレオチドのう
ち少なくとも２種を、それぞれ異なる蛍光色素で標識し
たものであることを特徴とする請求項１記載の核酸試料
検出方法。
【請求項３】オリゴヌクレオチドのうち、少なくとも
１つの長さが、8merから10merであることを特徴とする
請求項１記載の核酸試料検出方法。