JP2002537857A - 遺伝子スクリーニング - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
遺伝子材料試料(１０)中の核酸配列コピー数についてスクリーニングする方法であって、該方法は、複数の異なる遺伝子プローブ(１４)を導入して遺伝子試料(１０)とハイブリダイズさせることを含む。これらのプローブ(１４)は、同じ又は実質的に同じプライマー結合部位と隣接し、それにより、試料結合したプローブの単一プライマー対を用いる増幅を可能にし、従って、異なる配列コピー数を同時にスクリーニングすることを可能にする。
Description
【０００１】 本発明は、配列コピー数に関するスクリーニング、特に複数の核酸配列のコピ
ー数の変化についての実質的に同時のスクリーニングに関係する。
ー数の変化についての実質的に同時のスクリーニングに関係する。
【０００２】 遺伝子配列の正常なコピー数の喪失若しくは減少(欠失)又はコピー数の増加(
増幅)は、広く一般に重要である。かかる遺伝子変化は、特発性精神薄弱と新生
物程にも異なる病気を含む体細胞及び生殖細胞系列の両者に特徴的な表現型の基
礎となることが知られている。かかる遺伝子変化の部位及び性質の実証は、原因
遺伝子の同定及び適当且つ有効な治療法の開発に決定的に重要である。
増幅)は、広く一般に重要である。かかる遺伝子変化は、特発性精神薄弱と新生
物程にも異なる病気を含む体細胞及び生殖細胞系列の両者に特徴的な表現型の基
礎となることが知られている。かかる遺伝子変化の部位及び性質の実証は、原因
遺伝子の同定及び適当且つ有効な治療法の開発に決定的に重要である。
【０００３】 原則として、遺伝子欠失についてサザーンブロットハイブリダイゼーションを
用いてスクリーニングすることは可能である。しかしながら、この方法は、ヘテ
ロ接合性を必要とし、多形遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を用いて、一つ
の対立遺伝子の存在しないことを体細胞又は生殖細胞系列において示すことがで
きるが、その有効性は、ヘテロ接合性の必要性及びゲノムの小さい画分をスクリ
ーニングする場合でさえ反復する試験を要することにより制限される。
用いてスクリーニングすることは可能である。しかしながら、この方法は、ヘテ
ロ接合性を必要とし、多形遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を用いて、一つ
の対立遺伝子の存在しないことを体細胞又は生殖細胞系列において示すことがで
きるが、その有効性は、ヘテロ接合性の必要性及びゲノムの小さい画分をスクリ
ーニングする場合でさえ反復する試験を要することにより制限される。
【０００４】 もし十分な注意を払って定量的収量を確実にするならば、ポリメラーゼ連鎖反
応(ＰＣＲ)を用いて、コピー数についてスクリーニングすることができ、増幅が
進むにつれての産物の蓄積を追跡することにより、定量的ＰＣＲを確実にする特
殊化した系が開発された。しかしながら、かかる系は、複数の変化の実質的に同
時の満足な分析を与えない。
応(ＰＣＲ)を用いて、コピー数についてスクリーニングすることができ、増幅が
進むにつれての産物の蓄積を追跡することにより、定量的ＰＣＲを確実にする特
殊化した系が開発された。しかしながら、かかる系は、複数の変化の実質的に同
時の満足な分析を与えない。
【０００５】 本発明によって、遺伝子材料の試料中の標的核酸配列のコピー数についてのス
クリーニング方法を提供するが、該方法は、試料に、各標的配列とハイブリダイ
ズするのに適し且つ同じ又は実質的に同じプライマー結合部位と両端で隣接する
複数の異なる遺伝子プローブを導入し、その試料を、これらのプローブのそれら
の各配列へのハイブリダイゼーションに好適な条件にかけ、そして試料結合した
プローブのプライマー対を用いる増幅にかけることを含む(増幅されたプローブ
のそれぞれの量の分析は、各核酸配列の試料中のコピー数の定量的測定を与える
)。
クリーニング方法を提供するが、該方法は、試料に、各標的配列とハイブリダイ
ズするのに適し且つ同じ又は実質的に同じプライマー結合部位と両端で隣接する
複数の異なる遺伝子プローブを導入し、その試料を、これらのプローブのそれら
の各配列へのハイブリダイゼーションに好適な条件にかけ、そして試料結合した
プローブのプライマー対を用いる増幅にかけることを含む(増幅されたプローブ
のそれぞれの量の分析は、各核酸配列の試料中のコピー数の定量的測定を与える
)。
【０００６】 好ましくは、各プローブは、例えば、分離用ゲルによる特徴的な顕著な移動性
を有することにより、他のものから識別可能である。好ましくは、複数の異なる
プローブは、各々それぞれの標的核酸配列に特異的に選択した異なるプローブの
予め決めたセットを含む。このセットは、複数の異なる核酸配列の同時の又は実
質的に同時のスクリーニングに適したプローブを含むことができ、それで、生成
される各プローブ生成物の量の、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用
いる測定は、試料中の各配列のコピー数の定量的測定を可能にする。この方法を
用いて、異なる遺伝子の配列又は遺伝子内の異なる配列例えば真核生物遺伝子内
の異なるエキソンをスクリーニングすることができる。好ましくは、この方法を
用いて、遺伝子の変化例えば遺伝子の欠失(配列コピー数の減少)及び遺伝子増幅
(配列コピー数の増加)を検出する。
を有することにより、他のものから識別可能である。好ましくは、複数の異なる
プローブは、各々それぞれの標的核酸配列に特異的に選択した異なるプローブの
予め決めたセットを含む。このセットは、複数の異なる核酸配列の同時の又は実
質的に同時のスクリーニングに適したプローブを含むことができ、それで、生成
される各プローブ生成物の量の、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用
いる測定は、試料中の各配列のコピー数の定量的測定を可能にする。この方法を
用いて、異なる遺伝子の配列又は遺伝子内の異なる配列例えば真核生物遺伝子内
の異なるエキソンをスクリーニングすることができる。好ましくは、この方法を
用いて、遺伝子の変化例えば遺伝子の欠失(配列コピー数の減少)及び遺伝子増幅
(配列コピー数の増加)を検出する。
【０００７】 好ましくは、遺伝子材料を、ハイブリダイズした隣接プライマーが同様に固定
化されるように、ハイブリダイゼーション前に固定化する。好ましくは、プロー
ブの過剰を用いる。
化されるように、ハイブリダイゼーション前に固定化する。好ましくは、プロー
ブの過剰を用いる。
【０００８】 迅速な同定のための標識(例えば、蛍光標識)したプローブが、好適に用いられ
る。１セットより多くのプローブを、同時に又は順次的に用いることができる。
隣接プライマー対は、各プローブ対につき、同じであっても異なってもよい。
る。１セットより多くのプローブを、同時に又は順次的に用いることができる。
隣接プライマー対は、各プローブ対につき、同じであっても異なってもよい。
【０００９】 好ましくは、この方法は、プライマー結合配列間のハイブリダイゼーションを
回避し又は軽減する手段を含む。競争するオリゴヌクレオチドを、好ましくは、
ハイブリダイゼーション段階で、試料に導入して、各プローブに隣接するプライ
マー結合部位に解離可能に結合させることにより、プライマー結合部位の相互作
用を軽減させることができる。
回避し又は軽減する手段を含む。競争するオリゴヌクレオチドを、好ましくは、
ハイブリダイゼーション段階で、試料に導入して、各プローブに隣接するプライ
マー結合部位に解離可能に結合させることにより、プライマー結合部位の相互作
用を軽減させることができる。
【００１０】 好ましくは、未結合のプローブ及びプライマーを、ハイブリダイゼーション段
階の後、分析の前に、結合したプローブから、徹底的に洗い去る。
階の後、分析の前に、結合したプローブから、徹底的に洗い去る。
【００１１】 この方法を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡを、適当なプローブセ
ットを用いてスクリーニングすることができる。この方法を用いて、体細胞及び
／又は生殖細胞系列の配列をスクリーニングすることができる。この方法を用い
て、多形変化についてスクリーニングすることができる。
ットを用いてスクリーニングすることができる。この方法を用いて、体細胞及び
／又は生殖細胞系列の配列をスクリーニングすることができる。この方法を用い
て、多形変化についてスクリーニングすることができる。
【００１２】 この発明は、更に、前記の７つの段落の何れかに実質的に記載したプローブの
セットを提供する。
セットを提供する。
【００１３】 この発明は、尚更に、かかる前記の８つの段落の何れかに記載した方法のため
のキットを含むことができ、かかるキットは、一般的に上記したプローブのセッ
ト、増幅用プライマー及び増幅及び増幅生成物の分析を可能にする手段を含む。
のキットを含むことができ、かかるキットは、一般的に上記したプローブのセッ
ト、増幅用プライマー及び増幅及び増幅生成物の分析を可能にする手段を含む。
【００１４】 本発明を、今から、添付の図面のみを参照して、実施例によって説明する。
【００１５】 図１を参照して、遺伝子材料の試料中の標的核酸配列のコピー数についてスク
リーニングする方法を提供するが、この方法は、各標的配列とのハイブリダイズ
に適し且つ同じ又は実質的に同じプライマー結合部位と両端で隣接する複数の異
なる遺伝子プローブを試料に導入し、この試料を、これらのプローブの各配列へ
のハイブリダイゼーションに有利な条件にかけること及び隣接プライマー対を利
用する試料結合したプローブの増幅を含み、増幅されたプローブのそれぞれの量
の分析は、試料中のそれぞれの核酸配列のコピー数の定量的測定を与える。
リーニングする方法を提供するが、この方法は、各標的配列とのハイブリダイズ
に適し且つ同じ又は実質的に同じプライマー結合部位と両端で隣接する複数の異
なる遺伝子プローブを試料に導入し、この試料を、これらのプローブの各配列へ
のハイブリダイゼーションに有利な条件にかけること及び隣接プライマー対を利
用する試料結合したプローブの増幅を含み、増幅されたプローブのそれぞれの量
の分析は、試料中のそれぞれの核酸配列のコピー数の定量的測定を与える。
【００１６】 この方法を用いて、遺伝子変化について、特に、体細胞及び生殖細胞系列の両
方における遺伝子配列のコピー数の欠失及び増幅についてスクリーニングするこ
とができる。
方における遺伝子配列のコピー数の欠失及び増幅についてスクリーニングするこ
とができる。
【００１７】 図１(１０)に図式表示したスクリーニングすべき遺伝子材料の試料(ＤＮＡ、
ｃＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むことができる)を、ナイロンフィルター等の媒
体(１２)上に可逆的に固定化する。
ｃＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むことができる)を、ナイロンフィルター等の媒
体(１２)上に可逆的に固定化する。
【００１８】 複数のプローブ(１４)を、特異的核酸配列を、もし試料中に存在するならば、
捜し出してハイブリダイズするためにデザインして調製する。これらのプローブ
(１４)を、異なるそれぞれの核酸配列を捜し出すように操作可能な各種の異なる
プローブのセットを含むように選択する(該核酸配列は、例えばそれを採取した
生物の特定の病気に関与する疑いのある配列であってよい)。特定の遺伝子配列
のコピー数の変化は、癌及び精神薄弱等の病気に関与することが知られており、
例えば、ある症状がこれらの病気の関与を示唆する場合に、これらの配列に特異
的なプローブを調製して、本発明の方法論に従って用いるプローブセットに含ま
せることができる。
捜し出してハイブリダイズするためにデザインして調製する。これらのプローブ
(１４)を、異なるそれぞれの核酸配列を捜し出すように操作可能な各種の異なる
プローブのセットを含むように選択する(該核酸配列は、例えばそれを採取した
生物の特定の病気に関与する疑いのある配列であってよい)。特定の遺伝子配列
のコピー数の変化は、癌及び精神薄弱等の病気に関与することが知られており、
例えば、ある症状がこれらの病気の関与を示唆する場合に、これらの配列に特異
的なプローブを調製して、本発明の方法論に従って用いるプローブセットに含ま
せることができる。
【００１９】 適当なプローブセットを造るか又は同定した場合には、それを、それらのプロ
ーブのそれぞれの核酸配列(存在する場合)へのハイブリダイゼーションに好適な
条件下で、固定化遺伝子材料に化学量論的に過剰に導入する。
ーブのそれぞれの核酸配列(存在する場合)へのハイブリダイゼーションに好適な
条件下で、固定化遺伝子材料に化学量論的に過剰に導入する。
【００２０】 一度ハイブリダイゼーションを与えるのに十分な時間が経過したならば、未結
合のプローブを徹底的に洗い去り、ＰＣＲを用いて結合プローブを増幅する。
合のプローブを徹底的に洗い去り、ＰＣＲを用いて結合プローブを増幅する。
【００２１】 異なるプローブの両端に隣接する同じプライマー対結合部位の利用は、この方
法の上首尾の操作に重要であり、異なる結合プローブを単一プライマー対を一緒
に用いて増幅させ、それ故、複数の異なる遺伝子座を同時にスクリーニングする
ことを可能にする。
法の上首尾の操作に重要であり、異なる結合プローブを単一プライマー対を一緒
に用いて増幅させ、それ故、複数の異なる遺伝子座を同時にスクリーニングする
ことを可能にする。
【００２２】 異なるプローブに隣接するプライマー結合部位間の多少の相互作用が経験され
たが、この問題は、それぞれのプライマー結合部位に解離可能に結合しそれによ
りかかる望ましくない相互作用を阻止するがその後の増幅プロセスに悪影響を及
ぼさない過剰の競争的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション溶液の添加
によって扱われた。これらのオリゴヌクレオチドは、一度これらのプローブの試
料へのハイブリダイゼーションが完了したならば、はずされて、これらの結合部
位への増幅プライマーのハイブリダイゼーションを与える。
たが、この問題は、それぞれのプライマー結合部位に解離可能に結合しそれによ
りかかる望ましくない相互作用を阻止するがその後の増幅プロセスに悪影響を及
ぼさない過剰の競争的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション溶液の添加
によって扱われた。これらのオリゴヌクレオチドは、一度これらのプローブの試
料へのハイブリダイゼーションが完了したならば、はずされて、これらの結合部
位への増幅プライマーのハイブリダイゼーションを与える。
【００２３】 プローブのそれぞれのセットは、オリゴヌクレオチドアダプターへの連結によ
り又は一層簡単には、それらのプローブをクローニングベクターの同じ部位に挿
入するように調製して、クローニング部位に隣接する増幅用のプライマーを利用
することにより作成することができる。図６は、ベクターｐＺｅｒｏ２のクロー
ニング部位を示しており(配列は、InVitrogenにより提供されている：http://ww
w.invitrogen.com/vecseq-gcg/pzero2.seq)、鈍端化断片をクローン化するのに
用いるＥｃｏＲＶ部位(小文字)に隣接するプライマーＰＺＡ及びＰＺＢを示して
いる。それ故、これらのプライマーを用いて増幅した生成物は、クローン化イン
サートよりも５９ｂｐ長い。このように、各々異なる遺伝子座を検出するが両端
で同じプライマー結合部位に隣接するプローブのセットを調製することが可能で
ある。
り又は一層簡単には、それらのプローブをクローニングベクターの同じ部位に挿
入するように調製して、クローニング部位に隣接する増幅用のプライマーを利用
することにより作成することができる。図６は、ベクターｐＺｅｒｏ２のクロー
ニング部位を示しており(配列は、InVitrogenにより提供されている：http://ww
w.invitrogen.com/vecseq-gcg/pzero2.seq)、鈍端化断片をクローン化するのに
用いるＥｃｏＲＶ部位(小文字)に隣接するプライマーＰＺＡ及びＰＺＢを示して
いる。それ故、これらのプライマーを用いて増幅した生成物は、クローン化イン
サートよりも５９ｂｐ長い。このように、各々異なる遺伝子座を検出するが両端
で同じプライマー結合部位に隣接するプローブのセットを調製することが可能で
ある。
【００２４】 プローブセットを、各々の寄与するプローブを例えば分離用ゲルにおける移動
度によって区別し得るように造ることは重要である。増幅後に、対応する移動度
の生成物の出現は、特定のヌクレオチド配列の存在を従って標的試料中のその配
列の存在を報告するように作用する。過剰のプローブを用いる場合、及び増幅を
定量的フェーズに限る場合、各生成物の絶対量は、試験した試料中のそのコピー
数を反映する。異なるプローブは、異なる効率で増幅することができるが、各プ
ローブからの比例する寄与は、その試料中の供与量を反映するであろうし、同じ
プローブセットを用いて試験した異なる試料間の比較から推論することができる
。増幅されるのは保持されたプローブであって試料ではないので、生成物のゲル
移動度は、(例えば)その遺伝子座の制限断片長多形(ＲＦＬＰ)の存在により影響
されない。
度によって区別し得るように造ることは重要である。増幅後に、対応する移動度
の生成物の出現は、特定のヌクレオチド配列の存在を従って標的試料中のその配
列の存在を報告するように作用する。過剰のプローブを用いる場合、及び増幅を
定量的フェーズに限る場合、各生成物の絶対量は、試験した試料中のそのコピー
数を反映する。異なるプローブは、異なる効率で増幅することができるが、各プ
ローブからの比例する寄与は、その試料中の供与量を反映するであろうし、同じ
プローブセットを用いて試験した異なる試料間の比較から推論することができる
。増幅されるのは保持されたプローブであって試料ではないので、生成物のゲル
移動度は、(例えば)その遺伝子座の制限断片長多形(ＲＦＬＰ)の存在により影響
されない。
【００２５】 下記の特徴的実験は、本発明の方法を用いて、複数の異なる遺伝子配列を同時
にスクリーニングすることを行った。４３の増幅可能なプローブのセットを、鈍
端化断片をｐＺｅｒｏのＥｃｏＲＶ部位(図６)にクローン化してから、この部位
に隣接するベクタープライマーを用いて増幅し、異なる長さのプローブの混合物
を選択することにより生成した。この混合物は、７つの常染色体(１、５、１１
、１６、１７、１８及び２２)並びにＸ及びＹ染色体に由来するプローブを含ん
だ。
にスクリーニングすることを行った。４３の増幅可能なプローブのセットを、鈍
端化断片をｐＺｅｒｏのＥｃｏＲＶ部位(図６)にクローン化してから、この部位
に隣接するベクタープライマーを用いて増幅し、異なる長さのプローブの混合物
を選択することにより生成した。この混合物は、７つの常染色体(１、５、１１
、１６、１７、１８及び２２)並びにＸ及びＹ染色体に由来するプローブを含ん
だ。
【００２６】 ４３のプローブの初期混合物を、配列決定及びハイブリダイゼーションにより
分散した反復エレメントを含まないことが公知のプラスミド及びプラスミド断片
からサブクローン化し；Ｙリンクしたプローブ(ＳＲＹ)の一つの場合には、１３
６０ｂｐの断片を、プライマーＳＲＹＡ(5'GCAGTAGAGCAGTCAGGGAG3')及びＳＲＹ
Ｂ(5'GGGGAGAGAAAGAAACAAGTTTG3')を用いて増幅した。クローン化ゲノムＤＮＡ
の他の起源は、１番染色体、ｐＪＢＴ２(ＪＡＬＡ、未公開)；５番染色体、ｐＭ
Ｓ６２１(Armour等、1996)；１１番染色体、ｐＥＪ６．６(Goldfarb等、1982)；
１６番染色体、ｐＲＮ６Ｎ６Ａ(ＪＡＬＡ及びR.M.Badge,未公開)；１７番染色体
、ｐＹＮＺ２２(Nakamura等、1988)；１８番染色体、ｐＭＳ４４０(Armour等、1
990)；２２番染色体、ｐＭＳ６３２ｃ(Armour等、1995)；Ｘ染色体、ｐＭＳ６１
３(Armour等、1990)であった。ゲノムインサートの単離及び鈍端を生成する頻繁
に切断する制限酵素での消化(一般に、ＡｌｕＩとＨａｅＩＩＩを用いる二重消
化)の後に、生成した一層小さい断片を、ｐＺｅｒｏ２(InVitrogen)のＥｃｏＲ
Ｖ部位にクローン化し、大腸菌ＴＯＰ１０(InVitrogen)にて増殖させた。ミニサ
テライトを含むクローンに由来するＤＮＡ中の反復領域を回避するように注意し
た。
分散した反復エレメントを含まないことが公知のプラスミド及びプラスミド断片
からサブクローン化し；Ｙリンクしたプローブ(ＳＲＹ)の一つの場合には、１３
６０ｂｐの断片を、プライマーＳＲＹＡ(5'GCAGTAGAGCAGTCAGGGAG3')及びＳＲＹ
Ｂ(5'GGGGAGAGAAAGAAACAAGTTTG3')を用いて増幅した。クローン化ゲノムＤＮＡ
の他の起源は、１番染色体、ｐＪＢＴ２(ＪＡＬＡ、未公開)；５番染色体、ｐＭ
Ｓ６２１(Armour等、1996)；１１番染色体、ｐＥＪ６．６(Goldfarb等、1982)；
１６番染色体、ｐＲＮ６Ｎ６Ａ(ＪＡＬＡ及びR.M.Badge,未公開)；１７番染色体
、ｐＹＮＺ２２(Nakamura等、1988)；１８番染色体、ｐＭＳ４４０(Armour等、1
990)；２２番染色体、ｐＭＳ６３２ｃ(Armour等、1995)；Ｘ染色体、ｐＭＳ６１
３(Armour等、1990)であった。ゲノムインサートの単離及び鈍端を生成する頻繁
に切断する制限酵素での消化(一般に、ＡｌｕＩとＨａｅＩＩＩを用いる二重消
化)の後に、生成した一層小さい断片を、ｐＺｅｒｏ２(InVitrogen)のＥｃｏＲ
Ｖ部位にクローン化し、大腸菌ＴＯＰ１０(InVitrogen)にて増殖させた。ミニサ
テライトを含むクローンに由来するＤＮＡ中の反復領域を回避するように注意し
た。
【００２７】 図６に関して、一次クローンに由来する鈍端化制限断片をｐＺｅｒｏ２(InVit
rogen)のＥｃｏＲＶ部位にクローン化することにより調製したプローブを、直接
、細菌細胞(Sandhu等、1989)から、隣接ベクタープライマーＰＺＡ(5'AGTAACGGC
CGCCAGTGTGCTG3')及びＰＺＢ(5'CGAGCGGCCGCCAGTGTGATG3')を用いて増幅した。
これらのプライマーのｐＺｅｒｏ−２における位置は、図６に示してある。ＰＣ
Ｒを、アドバンストバイオテクノロジーズバッファーＩＶ(７５ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．８、２０ｍＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、０．０１％ツイーン)中で、各０
．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２μＭの各プライマー及び０．
０５Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Advanced Biotechnologies)を用いて
行った。反応物(通常、１０μｌ)を(９５℃で１分間／７０℃で１分間)の２５サ
イクルにかけた。33Ｐで末端標識したＰＺＡを用いて増幅した生成物を、変性６
％ポリアクリルアミド／５０％尿素ゲル上で分離し、プローブ混合物は、すべて
の成分プローブの移動度が異なるようにアセンブルした。
rogen)のＥｃｏＲＶ部位にクローン化することにより調製したプローブを、直接
、細菌細胞(Sandhu等、1989)から、隣接ベクタープライマーＰＺＡ(5'AGTAACGGC
CGCCAGTGTGCTG3')及びＰＺＢ(5'CGAGCGGCCGCCAGTGTGATG3')を用いて増幅した。
これらのプライマーのｐＺｅｒｏ−２における位置は、図６に示してある。ＰＣ
Ｒを、アドバンストバイオテクノロジーズバッファーＩＶ(７５ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．８、２０ｍＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、０．０１％ツイーン)中で、各０
．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２μＭの各プライマー及び０．
０５Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Advanced Biotechnologies)を用いて
行った。反応物(通常、１０μｌ)を(９５℃で１分間／７０℃で１分間)の２５サ
イクルにかけた。33Ｐで末端標識したＰＺＡを用いて増幅した生成物を、変性６
％ポリアクリルアミド／５０％尿素ゲル上で分離し、プローブ混合物は、すべて
の成分プローブの移動度が異なるようにアセンブルした。
【００２８】 固定化のための試料ＤＮＡを、５μｌより少ない初期容積で調製し、１μｌの
１Ｍ ＮａＯＨの添加により変性させ、ナイロンフィルター(ＭＳＩ ＭＡＧＮ
Ａ、凡その寸法２ｍｍ×４ｍｍ)上にスポットして(一度に１μｌ)、適用の間に
溶液を乾燥させた。すべてのＤＮＡを加えた時点で、そのＤＮＡを、Ｕ．Ｖ．照
射を用いて、フィルター上に不可逆的に結合させた。多くのフィルターを同ハイ
ブリダイゼーションにおいて用いるべきなので、個々のマーカーを縁に切り込み
、角によって各フィルターの身元を明らかにした。
１Ｍ ＮａＯＨの添加により変性させ、ナイロンフィルター(ＭＳＩ ＭＡＧＮ
Ａ、凡その寸法２ｍｍ×４ｍｍ)上にスポットして(一度に１μｌ)、適用の間に
溶液を乾燥させた。すべてのＤＮＡを加えた時点で、そのＤＮＡを、Ｕ．Ｖ．照
射を用いて、フィルター上に不可逆的に結合させた。多くのフィルターを同ハイ
ブリダイゼーションにおいて用いるべきなので、個々のマーカーを縁に切り込み
、角によって各フィルターの身元を明らかにした。
【００２９】 フィルターを１ｍｌの予備ハイブリダイゼーション溶液(０．５Ｍ リン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ アルカリ変性したニシ
ン精子ＤＮＡ)中で、一晩、６５℃で、予備ハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ゼーション前に、これを２００μｌの予備ハイブリダイゼーション溶液に変性し
たヒトのＣｏｔ−１ＤＮＡ(Gibco BRL)を加えたものと交換して、終濃度を１０
μｇ／ｍｌとした。１μｌ中に約１００ｐｇの各配列を含むプローブ混合物を７
μｇの大腸菌ＤＮＡ(ＤＨ５αＤＮＡ、ＨａｅＩＩＩで消化したもの)及び１μｇ
のヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ(Gibco BRL)と混合し、２μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加え
て変性させた。３７℃で１分間経過した後に、このプローブ混合物を、氷上に置
き、３μｌの１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4を加えることにより中和して、ハイブリダイゼ
ーション溶液に加えた。
トリウム、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ アルカリ変性したニシ
ン精子ＤＮＡ)中で、一晩、６５℃で、予備ハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ゼーション前に、これを２００μｌの予備ハイブリダイゼーション溶液に変性し
たヒトのＣｏｔ−１ＤＮＡ(Gibco BRL)を加えたものと交換して、終濃度を１０
μｇ／ｍｌとした。１μｌ中に約１００ｐｇの各配列を含むプローブ混合物を７
μｇの大腸菌ＤＮＡ(ＤＨ５αＤＮＡ、ＨａｅＩＩＩで消化したもの)及び１μｇ
のヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ(Gibco BRL)と混合し、２μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加え
て変性させた。３７℃で１分間経過した後に、このプローブ混合物を、氷上に置
き、３μｌの１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4を加えることにより中和して、ハイブリダイゼ
ーション溶液に加えた。
【００３０】 ハイブリダイゼーションを６５℃で一晩行わせ、それらのフィルターを６５℃
で、(ａ)１ｍｌの予備ハイブリダイゼーション溶液の２交換液、(ｂ)２００ｍｌ
の１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ及び(ｃ)５００ｍｌの０．１×ＳＳＣ ０．１％ＳＤ
Ｓ中で徹底的に洗った。洗ったフィルターを、次いで、個々の５０μｌの増幅用
反応物(プローブ増幅に関する成分)にトランスファーし、結合ＤＮＡを９５℃で
１分間／７０℃で１分間の５サイクルで増幅した。
で、(ａ)１ｍｌの予備ハイブリダイゼーション溶液の２交換液、(ｂ)２００ｍｌ
の１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ及び(ｃ)５００ｍｌの０．１×ＳＳＣ ０．１％ＳＤ
Ｓ中で徹底的に洗った。洗ったフィルターを、次いで、個々の５０μｌの増幅用
反応物(プローブ増幅に関する成分)にトランスファーし、結合ＤＮＡを９５℃で
１分間／７０℃で１分間の５サイクルで増幅した。
【００３１】 次いで、この低レベル予備増幅した溶液を、33Ｐ５’末端標識したプライマー
ＰＺＡを用いる、更なる１０μｌの増幅用反応物に播種するのに用いた。標識し
たＰＣＲ生成物が、７２℃２０分間の最終インキュベーション(完了させるため
に、アンテンプレーテッドＡを３’末端に添加)で与えられ、等容のホルムアミ
ド染料混合物(９８％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍｇ
／ｍｌキシレンシアノールＦＦ、１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー)を加え
、そしてこのＤＮＡを１００℃で２分間変性させてから氷上に置いた。この変性
した試料から、４μｌを６％ポリアクリルアミド／５０％尿素ゲル(０．５×Ｔ
ＢＥ中)のウェルに載せ、そのゲルを９０Ｗで(約４５℃のゲル温度を維持)、キ
シレンシアノール染料がゲルの端近くに来るまで泳動した。ゲルを１０％メタノ
ール／１０％酢酸中で固定し、放射能を標準的オートラジオグラフィーにより又
は(定量的分析には)ストレージホスホルイメージャースクリーン(Molecular Dyn
amics)により捕獲したデータに対してＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア分析を
用いて検出した。
ＰＺＡを用いる、更なる１０μｌの増幅用反応物に播種するのに用いた。標識し
たＰＣＲ生成物が、７２℃２０分間の最終インキュベーション(完了させるため
に、アンテンプレーテッドＡを３’末端に添加)で与えられ、等容のホルムアミ
ド染料混合物(９８％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍｇ
／ｍｌキシレンシアノールＦＦ、１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー)を加え
、そしてこのＤＮＡを１００℃で２分間変性させてから氷上に置いた。この変性
した試料から、４μｌを６％ポリアクリルアミド／５０％尿素ゲル(０．５×Ｔ
ＢＥ中)のウェルに載せ、そのゲルを９０Ｗで(約４５℃のゲル温度を維持)、キ
シレンシアノール染料がゲルの端近くに来るまで泳動した。ゲルを１０％メタノ
ール／１０％酢酸中で固定し、放射能を標準的オートラジオグラフィーにより又
は(定量的分析には)ストレージホスホルイメージャースクリーン(Molecular Dyn
amics)により捕獲したデータに対してＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア分析を
用いて検出した。
【００３２】 このプローブセットと、一人の男性及び３人の女性からのＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションのスクリーニング結果を、図２に示す。常染色体遺伝子座は、す
べての個人間で同等のシグナルを与えているが；プローブ毎に絶対強度に変化が
あり、全体に対する各バンドの相対的寄与は、高度に再現性がある。対照してみ
ると、Ｙ由来のプローブのみが、男性のＤＮＡとのハイブリダイズにおいて強い
シグナルを与えている。Ｘリンクしたプローブからの相対的シグナルは、男性に
おいて約５０％減少している(図３及び４)。
ダイゼーションのスクリーニング結果を、図２に示す。常染色体遺伝子座は、す
べての個人間で同等のシグナルを与えているが；プローブ毎に絶対強度に変化が
あり、全体に対する各バンドの相対的寄与は、高度に再現性がある。対照してみ
ると、Ｙ由来のプローブのみが、男性のＤＮＡとのハイブリダイズにおいて強い
シグナルを与えている。Ｘリンクしたプローブからの相対的シグナルは、男性に
おいて約５０％減少している(図３及び４)。
【００３３】 図５は、各プローブからの標準化した相対的シグナルを、プローブの長さに対
してプロットして示しており；シグナル強度は、そのプローブについての常染色
体遺伝子座について試験したすべての個人間の(Ｘリンクしたプローブについて
は、すべての女性の間の)平均値に対して及びＹリンクしたプローブについては
男性に対して標準化してある。四角く囲んだ点は、男性のＸリンクした遺伝子座
についての点(約５０％のシグナル強度)及び女性のＹリンクしたプローブについ
ての点(ゼロに近い)である。この実験は、ホモ接合性欠失(女性におけるＹリン
クした遺伝子座)又はヘミ接合性欠失(男性におけるＸリンクした遺伝子座)の予
想された検出を表している。１４０〜６００ｂｐの大きさの範囲において、この
シグナルは、コピー数変化を一貫して反映しているようである。
してプロットして示しており；シグナル強度は、そのプローブについての常染色
体遺伝子座について試験したすべての個人間の(Ｘリンクしたプローブについて
は、すべての女性の間の)平均値に対して及びＹリンクしたプローブについては
男性に対して標準化してある。四角く囲んだ点は、男性のＸリンクした遺伝子座
についての点(約５０％のシグナル強度)及び女性のＹリンクしたプローブについ
ての点(ゼロに近い)である。この実験は、ホモ接合性欠失(女性におけるＹリン
クした遺伝子座)又はヘミ接合性欠失(男性におけるＸリンクした遺伝子座)の予
想された検出を表している。１４０〜６００ｂｐの大きさの範囲において、この
シグナルは、コピー数変化を一貫して反映しているようである。
【００３４】 ハイブリダイゼーション後に見られる殆どすべての増幅されたバンドは、大き
さにおいて、予想されたプローブと一致した。しかしながら、公知の起源のプロ
ーブと一致しなかった３つのバンドがあり(図２でアスタリスクで印してある)；
これらの内で一番大きいものは、明らかに、Ｙリンクしている。これらのバンド
の出現についての最も簡単な説明は、それらは、同時に作られた他のプローブに
よるプローブ混合物の汚染の結果であるというものである。標的ＤＮＡから回収
されるバンドの強度は(ハイブリダイゼーションが完了に近づいたならば)、その
標的ＤＮＡ中のコピー数に依存し、プローブ混合物中の濃度に依存しないので、
たとえ比較的少量の付加的プローブの汚染でも、増幅生成物中に、予想されたバ
ンドと同じ強度で、予想外のバンドの出現を生じることができた。これらの付加
的バンドの２つに対応するプローブ断片は、初期プローブ混合物の成分として検
出可能である。付加的プローブのたとえ少量の汚染でも回避することの重要性は
、それらのプローブのクローンとしての(ＰＣＲ生成物ではなく)単離及び貯蔵の
利点を表す(汚染されてないプローブ調製物を、コロニー精製されたクローンか
ら再構成することができるので)。
さにおいて、予想されたプローブと一致した。しかしながら、公知の起源のプロ
ーブと一致しなかった３つのバンドがあり(図２でアスタリスクで印してある)；
これらの内で一番大きいものは、明らかに、Ｙリンクしている。これらのバンド
の出現についての最も簡単な説明は、それらは、同時に作られた他のプローブに
よるプローブ混合物の汚染の結果であるというものである。標的ＤＮＡから回収
されるバンドの強度は(ハイブリダイゼーションが完了に近づいたならば)、その
標的ＤＮＡ中のコピー数に依存し、プローブ混合物中の濃度に依存しないので、
たとえ比較的少量の付加的プローブの汚染でも、増幅生成物中に、予想されたバ
ンドと同じ強度で、予想外のバンドの出現を生じることができた。これらの付加
的バンドの２つに対応するプローブ断片は、初期プローブ混合物の成分として検
出可能である。付加的プローブのたとえ少量の汚染でも回避することの重要性は
、それらのプローブのクローンとしての(ＰＣＲ生成物ではなく)単離及び貯蔵の
利点を表す(汚染されてないプローブ調製物を、コロニー精製されたクローンか
ら再構成することができるので)。
【００３５】 この方法の効率は、多くの遺伝子座(この実験では、４３プローブ)を同時に調
べるその能力に由来する。ここで用いる形式においては、放射性標識したプロー
ブを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離するが、同時に分析する
ことのできるプローブ数は、ゲルの分解能によってのみ制限される。１４０〜６
００ｂｐに及ぶ大きさのプローブがこの実験では上首尾に用いられてきたので、
プローブの大きさでの注意深い選択は、百より多くのプローブを含むプローブセ
ットへと導くことができたが、これは(例えば)、染色体特異的なサブセットとし
て、メガベースの分離でのコピー数の分析に用いることができよう。
べるその能力に由来する。ここで用いる形式においては、放射性標識したプロー
ブを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離するが、同時に分析する
ことのできるプローブ数は、ゲルの分解能によってのみ制限される。１４０〜６
００ｂｐに及ぶ大きさのプローブがこの実験では上首尾に用いられてきたので、
プローブの大きさでの注意深い選択は、百より多くのプローブを含むプローブセ
ットへと導くことができたが、これは(例えば)、染色体特異的なサブセットとし
て、メガベースの分離でのコピー数の分析に用いることができよう。
【００３６】 その上、一層の高分離が、蛍光標識したプローブと自動化配列分析用にデザイ
ンされた装置及びソフトウェアを用いて達成され得る。これは、広範囲における
単一塩基の分離(それ故、レーン当たりの更なる探査の可能性)の利点を有するだ
けでなく、単一トラックで複数の蛍光体を用いることもできよう。従って、(例
えば)もし各セットのプローブが異なるプライマー結合部位と隣接する(一のセッ
ト内では同一)各１００プローブの４セットをアセンブルしたならば、それらは
、同一の標的とハイブリダイズすることができ、結合プローブの最初の回収及び
すべてのプライマー対を用いる低レベルの予備増幅の後に、各セットを、それ自
身のプライマー対(一つは、蛍光性)を用いて選択的に増幅することができ、生成
した蛍光性生成物の４つのセットを混合して、同一のレーンで泳動することがで
きよう。同様に、同じプライマーが、異なる蛍光標識を利用できたならば、２つ
の試料(例えば、同一人物からの腫瘍と正常な試料)の間の直接的比較を、各々か
らの生成物を異なる蛍光体を用いて標識して、ゲルの同じレーンで泳動すること
により行うことができよう。
ンされた装置及びソフトウェアを用いて達成され得る。これは、広範囲における
単一塩基の分離(それ故、レーン当たりの更なる探査の可能性)の利点を有するだ
けでなく、単一トラックで複数の蛍光体を用いることもできよう。従って、(例
えば)もし各セットのプローブが異なるプライマー結合部位と隣接する(一のセッ
ト内では同一)各１００プローブの４セットをアセンブルしたならば、それらは
、同一の標的とハイブリダイズすることができ、結合プローブの最初の回収及び
すべてのプライマー対を用いる低レベルの予備増幅の後に、各セットを、それ自
身のプライマー対(一つは、蛍光性)を用いて選択的に増幅することができ、生成
した蛍光性生成物の４つのセットを混合して、同一のレーンで泳動することがで
きよう。同様に、同じプライマーが、異なる蛍光標識を利用できたならば、２つ
の試料(例えば、同一人物からの腫瘍と正常な試料)の間の直接的比較を、各々か
らの生成物を異なる蛍光体を用いて標識して、ゲルの同じレーンで泳動すること
により行うことができよう。
【００３７】 本形式においては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の高分離が、生成物の多
くの異なる遺伝子座からの同時の区別を可能にするが、たとえすべての利用可能
な「スロット」をプローブセットの賢明なアセンブリにて用いても、この形式は
、おそらく、１レーンで分離し得る所定のプライマー対と隣接したプローブの数
を約５００までに制限し、それ故、もし異なる隣接プライマーを有する４つのプ
ローブのセットを同時に用いることができれば、２０００プローブ未満を同時に
この試験で調べることができる。この分析の分離能を、電気泳動に依存しない増
幅されたプローブの定量的検出のための形式を用いることによって増大させるこ
とは可能であろう。一つの別法は、プローブ自体を生成したクローンのアレイを
標識するために回収されたプローブを利用すること；アレイ−ＣＧＨ(Pinkel等
、1998)に類似するが追加された効率を有する手順であろうが、本発明による方
法、ＭＡＰＨは、既に、比例する量の関連する単一コピーのプローブをゲノム標
的から生成しており、その混合物の複雑度を低減し(増大されたハイブリダイゼ
ーション速度のために)、そして、多コピー配列を回避することにより、おそら
く、一層大きいシグナル：ノイズ比での定量を可能にする。
くの異なる遺伝子座からの同時の区別を可能にするが、たとえすべての利用可能
な「スロット」をプローブセットの賢明なアセンブリにて用いても、この形式は
、おそらく、１レーンで分離し得る所定のプライマー対と隣接したプローブの数
を約５００までに制限し、それ故、もし異なる隣接プライマーを有する４つのプ
ローブのセットを同時に用いることができれば、２０００プローブ未満を同時に
この試験で調べることができる。この分析の分離能を、電気泳動に依存しない増
幅されたプローブの定量的検出のための形式を用いることによって増大させるこ
とは可能であろう。一つの別法は、プローブ自体を生成したクローンのアレイを
標識するために回収されたプローブを利用すること；アレイ−ＣＧＨ(Pinkel等
、1998)に類似するが追加された効率を有する手順であろうが、本発明による方
法、ＭＡＰＨは、既に、比例する量の関連する単一コピーのプローブをゲノム標
的から生成しており、その混合物の複雑度を低減し(増大されたハイブリダイゼ
ーション速度のために)、そして、多コピー配列を回避することにより、おそら
く、一層大きいシグナル：ノイズ比での定量を可能にする。
【００３８】 ここに説明した実験は、ゲノムＤＮＡを標的核酸として利用してきたが、この
方法の拡張は、遺伝子発現の高度に並行的な分析のために、ＲＮＡ(又はｃＤＮ
Ａ)を調べるためにプローブを利用することであろう。現在の遺伝子発現の定量
のためのＲＴ−ＰＣＲベースの方法は、多くの遺伝子座の同時の単一の分析を可
能にしない。
方法の拡張は、遺伝子発現の高度に並行的な分析のために、ＲＮＡ(又はｃＤＮ
Ａ)を調べるためにプローブを利用することであろう。現在の遺伝子発現の定量
のためのＲＴ−ＰＣＲベースの方法は、多くの遺伝子座の同時の単一の分析を可
能にしない。
【００３９】 この方法を用いて、標的遺伝子内の異なる遺伝子及び／又は配列に関係する複
数の配列を、変更につき、スクリーニングする(例えば、真核生物遺伝子中のエ
キソンコピー数の変化についてスクリーニングする)ことができよう。
数の配列を、変更につき、スクリーニングする(例えば、真核生物遺伝子中のエ
キソンコピー数の変化についてスクリーニングする)ことができよう。
【００４０】 (例えば)特発性精神薄弱(ＩＭＲ)における欠失及び増幅を検出するための本発
明の方法の利用は、遺伝子座の不在が、多形から生じるよりも異常であるという
ことを仮定している。これは、(ＩＭＲの場合には)両親の分析により最も簡単に
調べることができるが、この技術の一層広い応用が、多形が存在する／存在しな
い遺伝子座を発見することはあり得ることである。もしこの種の十分な(十分に
情報を与える)遺伝子座が利用可能であれば、かかるプローブの相互に適合性の
「多形セット」へのアセンブリは、同時に、(凡そ)５０〜１００遺伝子座を、シ
ーケンシングゲルの単一レーンにおけるゲノタイピングを；混合ＤＮＡ試料の分
析と合わせて可能にするであろう(かかるシステムは、非常に高スループットの
ゲノタイピングを、高価な又は複雑な装置への出資の必要なく、与えることがで
きよう)。
明の方法の利用は、遺伝子座の不在が、多形から生じるよりも異常であるという
ことを仮定している。これは、(ＩＭＲの場合には)両親の分析により最も簡単に
調べることができるが、この技術の一層広い応用が、多形が存在する／存在しな
い遺伝子座を発見することはあり得ることである。もしこの種の十分な(十分に
情報を与える)遺伝子座が利用可能であれば、かかるプローブの相互に適合性の
「多形セット」へのアセンブリは、同時に、(凡そ)５０〜１００遺伝子座を、シ
ーケンシングゲルの単一レーンにおけるゲノタイピングを；混合ＤＮＡ試料の分
析と合わせて可能にするであろう(かかるシステムは、非常に高スループットの
ゲノタイピングを、高価な又は複雑な装置への出資の必要なく、与えることがで
きよう)。
【００４１】 前述の明細書中では、特に重要と思われるこの発明の特徴に注意を引くように
努力しているが、出願人は、上記の及び／又は図面に示した任意の特許可能な特
徴又は特徴の組合せに関して、特定の強調があってもなくても、保護を要求して
いるということは理解されるべきである。
努力しているが、出願人は、上記の及び／又は図面に示した任意の特許可能な特
徴又は特徴の組合せに関して、特定の強調があってもなくても、保護を要求して
いるということは理解されるべきである。
【図１】 本発明の方法の概略図である。
【図２】 本発明の方法により、４つの無関係のヒト由来の試料から生成されたゲル泳動
を示す図である。
を示す図である。
【図３】 図２のゲルの中央領域ＩＩＩの拡大図である。
【図４】 １人の男性の試料(上段のトレース)及び１人の女性(下段のトレース)に由来す
るゲルの領域ＩＩＩの定量的分析の結果を示す図である。
るゲルの領域ＩＩＩの定量的分析の結果を示す図である。
【図５】 プローブの大きさに対してプロットして示した種々のプローブからの相対的シ
グナルを示す図である。
グナルを示す図である。
【図６】 ｐＺｅｒｏ２のＥｃｏＲＶクローニング部位及びＥｃｏＲＶ部位にクローン化
された断片からプローブを生成するために用いられる対応するプライマーの組合
せ(ＰＺＡ及びＰＺＢ)を示す図である。
された断片からプローブを生成するために用いられる対応するプライマーの組合
せ(ＰＺＡ及びＰＺＢ)を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Claims (26)
- 【請求項１】 遺伝子材料の試料中の標的核酸配列(１０)のコピー数につい
てスクリーニングする方法であって、該方法は、その試料(１０)に、それぞれの
標的配列にハイブリダイズするのに適し且つ同じ又は実質的に同じプライマー結
合部位と両端で隣接している複数の異なる遺伝子プローブ(１４)を導入し、その
試料(１０)をこれらのプローブ(１４)のそれぞれの配列へのハイブリダイゼーシ
ョンに好適な条件にかけること及び試料結合したプローブ(１４)のプライマーの
対を利用する増幅を含み、増幅されたプローブ(１４)のそれぞれの量の分析が、
試料(１０)中のそれぞれの核酸配列のコピー数の定量的測定を与える、上記の方
法。 - 【請求項２】 各プローブ(１４)が、他のものから、例えば、分離用ゲル中
での顕著な移動度の特徴を有することにより区別され得る、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 複数の異なるプローブ(１４)が、各々がそれぞれの標的核酸
配列に特異的であるように選択した異なるプローブの予め決めたセットを含む、
請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 セットが、複数の異なる核酸配列のスクリーニングに適した
プローブ(１４)を同時に又は実質的に同時に含み、それで、生成された各プロー
ブ生成物の量の測定が、試料中のそれぞれの配列のコピー数の定量的測定を可能
にする、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、生成された各プローブ生成
物の量を測定する、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 異なる遺伝子の配列又は遺伝子中の異なる配列の例えば真核
生物遺伝子中の異なるエキソンのスクリーニングに用いられる、前記の請求項の
何れかに記載の方法。 - 【請求項７】 遺伝子の変化例えば遺伝子の欠失(配列コピー数の減少)及び
遺伝子の増幅(配列コピー数の増加)を指示するために用いられる、前記の請求項
の何れかに記載の方法。 - 【請求項８】 遺伝子材料(１０)を、ハイブリダイゼーション前に固定化し
、それで、ハイブリダイズした隣接プライマーが同様に固定化される、前記の請
求項の何れかに記載の方法。 - 【請求項９】 過剰のプローブ(１４)を用いる、前記の請求項の何れかに記
載の方法。 - 【請求項１０】 迅速なハイブリダイゼーションのために標識したプローブ
(１４)を用いる、前記の請求項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１１】 蛍光標識で標識したプローブを用いる、請求項１０に記載
の方法。 - 【請求項１２】 １セットより多くのプローブ(１４)を同時に又は順次的に
用いる、請求項３〜１１の何れかに記載の方法。 - 【請求項１３】 隣接プライマー対が、プローブ(１４)の各セットについて
同じである、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 隣接プライマー対が、プローブ(１４)の各セットについて
異なっている、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１５】 プライマー結合配列間のハイブリダイゼーションを回避し
又は軽減する手段を含む、前記の請求項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１６】 競争的オリゴヌクレオチドを試料に、好ましくはハイブリ
ダイゼーション段階で導入して、各プローブに隣接するプライマー結合部位に解
離可能に結合させ、それにより、プライマー結合部位の相互作用を軽減する、請
求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 未結合のプローブ(１４)とプライマーを、ハイブリダイゼ
ーション後、分析の前に、徹底的に洗って、結合したプローブ(１４)から除去す
る、前記の請求項の何れかに記載の方法。 - 【請求項１８】 適当なプローブセットを用いてＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又は
ｃＤＮＡをスクリーニングするために用いられる、請求項３〜１７の何れかに記
載の方法。 - 【請求項１９】 体細胞及び／又は生殖細胞系列の配列をスクリーニングす
るために用いられる、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 多形性の変化についてスクリーニングするために用いられ
る、請求項１８又は１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記の請求項の何れかに実質的に記載されたプローブ(１
４)のセット。 - 【請求項２２】 前記の請求項の何れかに記載した方法のためのキットであ
って、一般に上で規定したプローブセット(１４)、増幅用プライマー並びに増幅
及び増幅生成物の分析を可能にする手段を含む、当該キット。 - 【請求項２３】 実施例及び図面に関して実質的に上に記載した遺伝子材料
の試料中の標的核酸配列のコピー数についてスクリーニングする方法。 - 【請求項２４】 実施例及び図面に関して実質的に上に記載したプローブの
セット。 - 【請求項２５】 実施例及び図面に関して実質的に上に記載した遺伝子材料
の試料中の標的核酸配列のコピー数についてスクリーニングする方法のためのキ
ット。 - 【請求項２６】 ここに開示した任意の新規な主題事項又は新規な主題事項
の組合せであって、前記の請求項の何れかと同じ発明の範囲内にあるか若しくは
ないか又は前記の請求項の何れかと同じ発明と関連するか若しくは関連しない、
上記の新規な主題事項又は新規な主題事項の組合せ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9904991.8A GB9904991D0 (en) | 1999-03-05 | 1999-03-05 | Genetic screening |
| GB9904991.8 | 1999-03-05 | ||
| PCT/GB2000/000761 WO2000053804A2 (en) | 1999-03-05 | 2000-03-03 | Genetic screening |
Publications (1)
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