JP3895369B2 - エネルギー転移連結の色素によりラベルされたプローブ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明の分野は螢光標識及びそれらの使用に関する。
【0002】
背景
混合物の構成成分を同定し、そして定量するための需要が益々増大している。混合物の複雑性が高まるほど、存在する多くの成分を同時に検出できる興味が高まる。この情況の例として、DNA配列決定が存在し、この場合、多くの個別の波長で螢光シグナル発光を提供しながら、単一の波長でレーザー源により1〜4種の蛍光標識された成分を効果的に励起することが望ましい。この情況においては、異なったラベルは、それらが結合される配列の電気泳動移動性に悪影響を及ぼすべきではない。
【0003】
現在、自動化されたDNA配列決定のために使用される次の4種の方法が存在する:(1)DNAフラグメントが1つの蛍光団によりラベルされ、そして次に、そのフラグメントが隣接する配列決定レーンで実験され(Ansorge et al., Nucleic Acids Ros. 15, 4593-4602(1987);(2)DNAフラグメントが4種の異なった螢光団によりラベルされ、そしてすべてのフラグメントが電気泳動的に分離され、そして単一のレーンで検出され(Smith et al., Nature 321, 674-679(1986);(3)終結反応における個々のジデオキシヌクレオシドが異なった蛍光団によりラベルされ、そして4組のフラグメントが同じレーンにおいて実験され(Prober et al., Science 238, 336-341(1987);あるいは(4)DNAフラグメントの組が2種の異なった蛍光団によりラベルされ、そしてDNA配列が色素比を伴ってコードされる(Huang et al., Anal. Chem. 64, 2149-2154(1992))。
【0004】
そられの技法のすべてはかなりの欠点を有する。方法1は、移動性におけるレーンからレーンの変動及び低い処理量の潜在的な問題を有する。方法2及び3は、4種の色素が1つのレーザー源により十分に励起され、そしてそれらが明確に異なった発光スペクトルを有することを必要とする。実際、単一のレーザーにより効果的に励起され得、そして十分に分離された螢光シグナルを発光する複数の色素を見出すことはひじょうに困難である。
特有の赤色シフトされた発光スペクトルを有する色素を選択できるので、それらの吸光最大値もまた、赤色に移動し、そしてすべての色素は同じレーザー源によりもはや効果的に励起され得ない。
【0005】
また、より異なった色素が選択されるので、色素がラベルされた分子の同じ移動性シフトを引き起こすようなすべての色素を選択することはより困難になる。
従って、多くの構成成分が同じシステム及び一回の実施で決定され得るように、サンプルの多重化を可能にする改良された方法を提供することが実質的な興味の対象である。また、個々のラベルが、共通する波長で強い吸光性を有し、螢光のために高い収量を有し、発光の大きなストークスシフトを有し、種々の発光が個別であり、そしてラベルが同じ移動性シフトを導びくことが望まれる。単一色素により分子を単純にラベルすることによってそれらの矛盾する目的を達成することは困難である。
【0006】
発明の要約
本発明は、多くの蛍光ラベルを用いて混合物を分析するための組成物及び方法を提供する。蛍光ラベルを生ぜしめるためには、蛍光団の対が主鎖、特に核酸主鎖に結合され、ここで前記対のメンバーの1つがほぼ同じ波長で励起される。エネルギー転移の現象によって、前記個々の対の他のメンバーが検出的に異なった波長で発光することが見出された。ドナー蛍光団及び受容体蛍光団との間の距離の範囲が、効果的なエネルギー転移を確保するために選択される。さらに、結合して使用される蛍光ラベルが別のシステムにおいてほぼ同じ移動性を有するように選択される。これは、蛍光団の対の複数のメンバー間の距離を変えることによりラベルされた存在物の移動性を変え、そして同じ移動性を有するラベルを選択することによって達成される。本発明は特に配列決定に適用され、ここで蛍光団がユニバーサルプライマー又は他のプライマー及び異なったジデオキシヌクレオシドのために使用される異なった蛍光団の組合せに結合され得る。蛍光ラベル(蛍光化合物)の組合せのキットもまた提供される。
【0007】
特定の態様の記載
新規蛍光ラベル、その蛍光ラベルの組合せ、及び多くの構成成分の分離を包含する分離システムへのそれらの使用が提供される。特に、蛍光ラベルは、複数対の蛍光団を含んで成り、その1種を除いて、蛍光団は同じであり、オーバーラップするスペクトルを有する異なる蛍光団を含み、ここでドナー蛍光団の発光が受容体蛍光団の吸光とオーバーラップし、その結果、励起された蛍光団から他の蛍光団へのエネルギー転移が存在する。励起された蛍光団が実際に蛍光を発することは必須ではなく、励起された蛍光団がその励起エネルギーを効果的に吸収でき、そしてそれを発光のための螢光団に効果的に転移することで十分である。
【0008】
蛍光団の異なる対におけるドナー蛍光団は、同じであっても又は異なっていても良いが、しかし狭いバンド幅の単一光源、特にレーザー源により効果的に励起され得るべきである。ドナー蛍光団は、有意な吸光性、すなわち、お互い20nm以内、普通10nm以内、より普通には5nm以内で、吸収最大値(absorption moxima)の少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約20%の吸光性を有するであろう。発光のための性又は受容体蛍光団は、ドナー蛍光団からのエネルギーを受け、そして光を発することができるように選択され、それらは明確且つ検出できるほど異るであろう。従って、異なる蛍光ラベルが結合されている混合物中の構成成分間を区別することができるであろう。通常、蛍光ラベルは、少なくとも10nm、好ましくは少なくとも15nm及びより好ましくは少なくとも20nmだけ分離された発光最大値(emissionmoxima)で発光するであろう。
【0009】
通常、ドナー蛍光団は、約350〜800nmの範囲で、より通常には約350〜600nm又は500〜750nmの範囲で吸光し、そして受容体蛍光団は、約450〜1000nmの範囲で、通常約450〜800nmの範囲で光を発するであろう。続いて論ずるように、一対よりも多くの吸光性蛍光団を有することができ、その結果、3種又はそれ以上の蛍光団を有することができ、ここで、吸光と観察される発光との間での波長の差異を高度に増加させるために、エネルギーはより高い波長で1つの蛍光団から次の蛍光団に転移される。
【0010】
2種の蛍光団が、主鎖、通常重合体鎖、により連結され、ここで前記2種の蛍光団間の距離は変えられ得る。蛍光ラベルの設計の背後にある物理学は、ドナー蛍光団から受容体蛍光団への光学的励起の転移は1/R6(ここでRは2種の蛍光団間の距離である)に依存するということである。従って、前記距離は、良く知られたFoerster機構を通してドナーから受容体への効果的なエネルギー転移を提供するように選択されるべきである。従って、2種の蛍光団を分離する主鎖における原子の数により決定されるような、2種の蛍光団間の距離は、主鎖の性質に従って変えられ得る。
【0011】
種々の主鎖、たとえば核酸、DNA及びRNAの両者、修飾された核酸、たとえば酸素が硫黄、炭素又は窒素により置換されているもの、ホスフェートがスルフェート又はカルボキシレート等により置換されていのもの、ポリペプチド、多糖類、段階的に付加され得る種々の基、たとえば二官能基、たとえばハロアミン、又は同様のものが使用され得る。螢光団は、適当であれば種々の構築ブロックの適切な官能価により置換され得、ここで螢光団はラベルの形成の間、その構築ブロック上に存在し、又は適切であれば、続いて付加され得る。種々の従来の化学が、2種の蛍光団間に適切な空間が得られることを確保するために使用され得る。
【0012】
蛍光ラベル(蛍光団+それらが結合される主鎖)の分子量は一般的に、少なくとも約250Dal(ドルトン)でありそして約5,000Dalよりも高くなく、通常、約2,000Dalよりも高くないであろう。螢光団の分子量は一般的に約250〜1,000Dalの範囲であり、ここで一緒に使用されるべき異なったラベル上の受容体−ドナー対の分子量は通常、約20%以上、異ならないであろう。蛍光団は、中央部で主鎖に、両末端で主鎖に、又は一端で主鎖に及び内部部位で他の主鎖に結合され得る。蛍光団は、類似する化学物質の種類、たとえばシアニン色素、キサンテン又は同様のものからであるように選択される。従って、同じ化学物質の種類からのドナー、同じ化学物質の種類からの個々のドナー蛍光団−受容体蛍光団対又は同じ化学物質の種類からの個々の受容体蛍光団を有することができる。
【0013】
本発明のラベルは、種々の分離技法、たとえば電気泳動、クロマトグラフィー又は同様のものに特に適用され得、ここで最適化された分光特性、高い感受性及び分析される成分の移動性向に対してのラベルの比較できる影響を有することが望まれる。特に、電気泳動、たとえばゲル、細管、等の電気泳動が興味の対象である。クロマトグラフィー技法の中には、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、紙クロマトグラフィー及び同様のものがある。
【0014】
2種の蛍光団間の距離はラベルの移動性に影響を及ぼすであろうことが見出された。従って、異なる蛍光団素対を使用することができ、そして良好なエネルギー転移を可能にする範囲内で、異なる蛍光団間の距離を変えることによって、蛍光ラベルのために実質的に一定した移動性を提供することができる。その移動性は特定の空間に関係されず、その結果、特定のラベルの移動性に対するその空間の効果を経験的に決定できるであろう。
【0015】
しかしながら、ラベルにおける蛍光団の空間の柔軟性のために、異なった空間及び異なった蛍光団対を有する数種類の異なった蛍光ラベルを合成することによって、強く且つ明確な発光及び実質的に共通する移動性を有する、通常の励起を共有する螢光ラベルの種類を提供することができる。通常、移動性は、特別な分離に使用される場合、お互い約20%以下、好ましくはお互い約10%以下、及びより好ましくは、お互い約5%以内で異なるであろう。移動性は通常、単独でラベルの分離を、又は特定の分離に関連する共通の分子、たとえば配列決定に興味ある場合、適切な大きさの核酸分子に結合されるラベルの分離を実施することによって決定され得る。
【0016】
蛍光団として、広範囲の種類の蛍光色素が使用れ得る。それらの色素は、種々のクラスに分けられ、ここで色素の組合せが同じクラス内に又は異なったクラス間に使用され得る。それらのクラス内には、色素、たとえばキサンテン色素、たとえばフルオレセイン及びローダミン、クマリン、たとえばウンベリフェロン、ベンズイミド色素、たとえばHuechest 33258、フェナントリジン色素、たとえばTexas Red、及びエチジウム色素、アクリジン色素、シアニン色素、たとえばチアゾールオレンジ、チアゾールブルー、Cy5及びCyfr、カルバゾニル色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、キノリン色素、又は同様のものが包含される。従って、色素は紫外線、可視又は赤外線範囲で吸収することができる。多くの場合、蛍光分子は、約2KDal以下、一般的には約1.5KDal以下の分子量を有するであろう。
【0017】
エネルギードナー蛍光団は、所望する励起波長で強い吸光度係数、望ましくは約104以上、好ましくは約105cm1M-1以上の吸光度係数を有すべきである。ドナー蛍光団の励起最大値及び受容体蛍光団の発光最大値は、少なくとも15nm又はそれ以上分離されるであろう。ドナー蛍光団の発光スペクトルと受容体蛍光団の吸光性スペクトルとの間のスペクトルオーバーラップ全体及び発色団間の距離は、ドナーから受容体へのエネルギー転移の効率が20%〜100%の範囲になるように存在するであろう。
【0018】
主鎖中の原子の数に基づいてのドナー蛍光団及び受容体蛍光団の距離は、主鎖の性質、硬質か又は柔軟か、たとえば環構造か又は非環状構造か、又は同様の性質に依存して変化するであろう。一般的に、主鎖中の原子の数(環構造中の原子は主鎖に包含される環の片側のまわりの原子の最低数として計数されるであろう)は、約200以下、通常約150以下、好ましくは約100以下であり、ここで主鎖の性質がドナーと受容体との間のエネルギー転移の効率に影響を及ぼすであろう。
【0019】
ほとんどの場合、蛍光団の対が使用されるが、4種までの異なる、通常、3種よりも多くない異なる、同じ主鎖に結合される蛍光団が使用され得る情況が存在する。多くの蛍光団を用いることによって、ストークスシフトを非常に拡張することができ、その結果、可視波長範囲で励起することができ、そして通常、約1000nm以下、より通常には約900nm以下の赤外線波長範囲で発光することができる。赤外線波長範囲での光の検出は多くの利点を有する。なぜならば、励起光に起因するラマン及びレイリー光からの障害を受けやすくないであろうからである。移動性の恒常性を維持するためには、大きなストークスシフトのために異なった螢光団を有するラベル上の螢光団の数を調和するために多数の同じ螢光団を有するラベル上に同じ数の螢光団を用いることができる。
【0020】
本発明は、核酸鎖に特に適用でき、ここで前記核酸鎖は配列決定、特にサイジングのためのポリメラーゼ鎖反応、又はプライマーが核酸伸長のために使用され、そして特定のラベルに関する混合物の種々の成分間を区別したい場合の他のシステムにおいて、プライマーとして使用される。たとえば、異なる対の蛍光団が配列決定の間、伸長のために使用される異なった個々のジデオキシヌクレオシドのために使用される配列決定においては、ユニバーサルプライマーが使用され得る。
【0021】
官能化された多数のヌクレオシドが利用でき、そしてポリヌクレオチドの合成に使用され得る。対象の核酸ラベルを合成することによって、蛍光団が存在する特定部位を定義できる。市販の合成機が従来の手法に従って使用され得、その結果、適切な空間を有する螢光団の対を有するいづれかの配列が達成され得る。
異なる複数のプライマーがPCRに使用される場合、個々のプライマーが本発明に従ってラベルされ、その結果、異なるプライマーの個々に対して相補的な標的配列の存在を容易に検出することができる。使用される他の用途は、特定の抗体を用いてのアイソザイムの同定、異なった多糖類を用いてのレクチンの同定、及び同様の同定を包含する。
【0022】
すでに指摘されたように、本発明の蛍光ラベルは特に配列決定に使用される。たとえば、プライマーへの2種の蛍光団の結合により修飾されている、ユニバーサルプライマーのいづれかの1種であり得るユニバーサルプライマーが調製され得る。従って、種々の商業的プライマー、たとえばpUC/M13,λgt10,λgt11,及び同様のものからのプライマーが利用できる。Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., CSHL, 1989, Section13を参照のこと。DNA配列が、配列決定されるべき配列に連結されるプライマー配列を有する適切なベクターでクローン化される。異なった2′,3′ddNTPが使用され、その結果、終結が、鎖拡張に存在する特定のddNTPに依存して、異なった部位で生じる。本発明のプライマーを用いることによって、個々のddNTPは特定のラベルに関連するであろう。クレノウフラグメントによる拡張の後、その得られるフラグメントは、電気泳動による単一のレーンにおいて、又は電気泳動による単一の細管において分離され、ここでラベルの螢光により終結ヌクレオチドを検出することができる。
【0023】
本発明の蛍光ラベルを免疫複合体と共に使用することもでき、ここでリガンド又は受容体、たとえば抗体が異なった複合体又は複合体のメンバーを検出するためにラベルされ得る。リガンドが分離方法において同じ移動性向を有する場合、1又は複数のそのようなリガンドの存在を検出するために、分離における組成のオーバーラップが存在する場合でさえ、検出できるように、異なった抗体が異なった波長で螢光を発する異なったラベルによりラベルされ得る。
【0024】
ラベルの組合せ、通常少なくとも2種のラベルを有するキットが提供される。個々のラベルは、通常比較しうる主鎖と共にドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有し、ここで蛍光ラベルは使用される分離方法において比較しうる移動性を与えるために主鎖にそって分離される。一緒に使用されるグループにおける個々のラベルは、ほぼ同じ波長で吸光し、そして異なった波長で発光する。グループにおける個々のラベルは、主鎖にそっての異なる蛍光団の配置の変動の結果として、分離方法における移動性に対してほぼ同じ効果を有するであろう。
キットは、マッチする約6種までの、通常約4種までの異なったラベルを有するが、しかし2〜6種の異なったラベルを有する、複数組のマッチするラベルを有することができる。
【0025】
核酸主鎖を含んで成る蛍光ラベルが特に興味の対象であり、ここで前記蛍光ラベルは一般的に、少なくとも約10個のヌクレオチドそして約50個よりも多くないヌクレオチド、通常約30個よりも多くないヌクレオチドを有するであろう。ラベルは、相補的配列にハイブリダイズするヌクレオチド上に存在し、又はそれらのヌクレオチドから分離され得る。螢光団は通常、鎖に約2〜20個、通常4〜16個の原子を有する便利な結合アームによりヌクレオチドに連結されるであろう。前記鎖は多くの官能基、特に非−オキソカルボニル、より特定にはエステル及びアミド、アミノ、オキソ及び同様のものを有する。鎖は、通常、炭素、窒素、酸素、硫黄又は同様のものを鎖に含んで成る、脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式炭化水素、又はそれらの組合せであり得る。
【0026】
完全な核酸配列は、5′プライマー配列に対して相補的であり、又はその配列の3′部分に対してのみ相捕的であり得る。通常、コピーされるべき配列に対して相補的である、少なくとも約4個のヌクレオチド、より通常には少なくとも約5個のヌクレオチドが存在するであろう。プライマーは、コピーされるべき鎖の3′端でプライマー配列を有する適切なプラスミドにおいてコピーされるべき配列、及び少量の適切なddNTPと共に添加されるdNTPと共に組合される。伸長の後、DNAは単離され、そして分離のためにゲル又は細管に移される。
【0027】
使用されるキットは少なくとも2種の蛍光ラベルを有し、これはドナー蛍光団のために実質的に同じ吸光度、別個の発光スペクトル及び実質的に同じ移動性を有することによってマッチするであろう。一般的に、一本鎖核酸のためには、分離は螢光団間で約1〜15個、より通常には1〜12個、好ましくは約2〜10個のヌクレオシドからであろう。
【0028】
実施例
次の例は例示的であって、本願発明を限定するものではない。
実験
遺伝子分析のための、エネルギー転移蛍光団により標識されたオリゴヌクレオチドラベルの設計及び合成
M13ユニバーサルプライマーから選択された、配列5′−GTTTTCCCAGTC−3′を有するデオキシオリゴヌクレオチド(12塩基の長さ)を、異なった距離により分離されたドナー−受容体螢光団対により合成した。特に、前記12ーマーは、C−5位置で第一アミンリンカーアームを有する、下記の5′ジメトキシトリチル−5−〔N−(トリフルオロアセチルアミノヘキシ)−3−アクリルイミド〕−2′−デオキシウリジン、3′−〔(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)〕−ホスホラミジット(Amino-Modifier C6dT)(構造体1)の使用により導入される修飾された塩基を含む:
【0029】
【化1】
【0030】
ドナー蛍光団はオリゴマーの5′側に結合され、そして受容体蛍光団は修飾されたT上の第1アミン基に結合される。ドナー蛍光団と受容体蛍光団との間の距離は、オリゴマー上の修飾されたTの位置を変えることによって変えられた。プライマーはD−N−A(ここでDはドナー蛍光団であり、Aは受容体蛍光団であり、そしてNはDとAとの間の塩基の数である)とに示される。調製されるすべてのプライマーにおいては、DはApplied Biosystems Inc.(“ABI”)製の色素FAM、すなわちフルオレセイン誘導体であり、AはABI色素TAM又はROX(両者ともロダミン誘導体である)である。代表的な例として、FAM-3-TAMの構造体が下記に示される(構造体2):
【0031】
【化2】
【0032】
本明細書に記載されるエネルギー転移アプローチの利点は、(1)488nmで励起する場合、大きなストークスシフト及びより強い螢光シグナルが生成され得、そして(2)プライマーの移動性が同じ移動性を達成するためにドナーと受容体との間の距離を変えることにより調整され得ることである。FAM-3-TAMの可視スペクトルはFAM(495nm)及びTAM(560nm)の両者の吸光性を有するが、しかしながら、488nmでの励起に関しては、ほぼすべての発光は579nmで最大であるTから発生する(図1)。これはFAMからTAMへの効果的な螢光エネルギー転移を示す。これはまた、細管電気泳動(CE)カラム下にプライマーを負荷し、そして赤及び緑色のチャネルに検出することによっても見られ得る。
【0033】
FAM-及びTAM-ラベルされたプライマーにより、ほぼすべての発光が赤色のチャネル(590nm)に見られる(図2)、これはドナーFAMからのエネルギーが受容体TAMにほとんど完全に転移され、91nmのストークスシフトを生成することを示唆する。単一のピークの観察は、プライマーが純粋であることを示す。同じ結果が、114nmの大きなストークスシフトを付与するFAM-4-ROXに関して見られる(図3及び4)。単一の色素によりラベルされたプライマーに比較してエネルギー転移プライマーの螢光シグナルの増強が見られ、ここではFAM-4-ROXの濃度と同じ濃度(UVにより測定される)でのABI ROXプライマーが同じ細管に注入されている。FAM-4-ROXのその得られる螢光シグナルは、ROXプライマーのシグナルよりも10倍以上高いことが見出された(図5)。
【0034】
DNA配列決定へのドナー受容体螢光団によりラベルされたプライマーの好結果をもたらす適用のためには、プライマーはDNAフラグメントの同じ移動性シフトを生成し、そして明確な螢光シグナルを示すことが不可欠である。プライマーの移動性はドナーと受容体との間の距離に依存することが見出された(図6)。FAM-4-ROX,FAM-3-ROX及びFAM-10-ROXが細管から分離され、そして赤及び緑色のチャネルに検出された。FAM-10-ROXに関しては、色素間の距離の増加がエネルギー転移の量を減じ、2つのチャネルにほとんど等しいシグナルをもたらす。低下した相対的な緑色のシグナルにより示されるように、分離距離が減じられるにつれて、エネルギー転移の量は増加する。FAM-3-ROX及びFAM-4-ROXの両者は卓越したエネルギー転移を示すが、しかしそれらの移動性は明白に異なっており、すなわち距離を変えることにより移動性シフトを調整する可能性を提供する。
【0035】
明確に異なった発光スペクトルを有する2種のプライマーの移動性の正確な整合を得るために、FAM-3-FAM,FAM-4-FAM及びFAM-10-FAMもまた調製された。調製されたプライマー(FAM-N-FAM,FAM-N-TAM,FAM-N-ROX)のライブラリー間で、Sequenase2を用いてFAM-10-FAM及びFAM-3-ROXにより生成される、Aで終結する配列決定フラグメントがひじょうに類似する移動性シフトを有する(図7)ことが見出されており、これはDNA配列の分析のための可能性を示す。FAM-10-FAM及びFAM-3-ROXの発光は、それぞれ525nm及び605nmに存在する。水のラマンシグナルは、それらの2種の波長において、とるにたらない。従って、シグナル:ノイズの比は劇的に高められる。
【0036】
I.修飾されたT及び5′位でのFAMラベルを含む12ーマーのオリゴヌクレオチドの調製
次の3種のプライマーを、0.2μモル規模でABI Model394 DNA合成機上で調製した:
【化3】
【0037】
アミノリンカーアームを含む修飾された塩基T*が、Amino-Modifier C6 dTホスホラミジット(Glen Research)を用いることにより、定義された位置に導入され、そしてFAMが合成の最後の段階で6-FAMアミジット(ABI)を用いて導入された。塩基配列が完結された後、オリゴヌクレオチドを、1mlの濃NH4OHにより固体支持体(CPG)から切断した。塩基上のアミノ保護基(A,G,C及びT*)を、55℃で4時間、NH4OH溶液を加熱することによって除去した。細管電気泳動分析は、オリゴマーが約80%の純度であり、そしてそれらが次の色素カップリング段階に直接使用されることを示唆した。
【0038】
II.オリゴマー1,2及び3のアミノリンカーアームの第2蛍光団の結合
代表的な例として、オリゴマー1に第2色素(TAM)を結合せしめる反応スキームが下記に示される:
【0039】
【化4】
【0040】
0.5MのNa4CO3/NaHCO3緩衝液40μl中、FAM-ラベルのオリゴヌクレオチド(1,2及び3)を、12μlのDMSO中、約150倍過剰量のTAM-NHSエステル又はROX-NHSエステル又はFAM-NHSエステルと共に室温で一晩インキュベートした。反応しなかった色素を、Sephadex G-25カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。次に、2種の色素ラベルのオリゴヌクレオチドを、6M尿素−TBE,20%アクリルアミドゲル電気泳動(40cm×0.8cm)により精製した。純粋なプライマーをゲルから除去し、そしてOligonucleotide Purification Cartridgeにより脱塩した。プライマーの純度は、細管ゲルクロマトグラフィーにより99%以上であることが示された。
【0041】
III.FAM-3-ROX及びFAM-10-FAMによるDNA配列決定フラグメントの調製
Aで終結されるM13mp18のDNA配列決定フラグメントを、Sequenase2.0(USB)を用いて製造した。次の2種のアニーリング溶液を600μlのバイアルに調製した:(1)10μlの反応緩衝液、40μlのM13mp18一本鎖DNA及び6μlのFAM-3-ROX;(2)6μlの反応緩衝液、20μlのM13mp18一本鎖DNA及び3μlのFAM-10-FAM。個々のバイアルを65℃で5分間加熱し、そして室温に30分間冷却し、そして次に、20分間、氷上に置き、短いプライマーが鋳型に完全にハイブリダイズしたことを確認した。3μLのDTT,20μlのddA終結混合物及び12μLの希釈されたSequenase2.0を、氷上の個々のバイアルに添加した。
【0042】
その反応混合物を20℃で20分間、及び次に、37℃でさらに20分間インキュベートした。反応を、50mMのEDTA 10μL,4MのNH4OH 40μL及び95%EtOH 300μLの添加により停止した。前記溶液を十分に混合し、そして次に、氷上に20分間、置いた。フラグメントを75%冷EtOHにより2度脱塩し、真空下で乾燥せしめ、そして95%(v/v)ホルムアミド4μl及び50mMのEDTAに溶解した。サンプルを3分間、加熱し、DNAを変性し、そして次に、細管電気泳動装置上へのサンプルの注入まで、氷上に置いた。電気運動学的注入は、10KVで30秒間実施された。
【0043】
実質的に同じ励起−吸光性及び移動性を有すると共に、異なった発光波長及び高い発光電子量を付与するために、関連する組成物、たとえば2種の螢光団により官能化されたポリヌクレオチドを調製できることは、上記結果から明らかである。この手段においては、組成物の混合物は独立して分析され、ここで異なった成分が異なった螢光発光バンドを有するラベルにより特異的にラベルされ得る。さらに、前記組成物は容易に調製され得、広範囲の種類の内容物に使用され得、そして増強された螢光性質及び良好な安定性を有する。
【0044】
引用されるすべての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が引用により組込まれていることを特異的且つ個々に示されているかのように、引用により本明細書に組込まれている。
前述の発明は一層の理解のために例示的且つ例的にいくらか詳細に記載されて来たけれども、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、1×TBEにおけるFAM-3-TAMの吸光及び発光スペクトルのグラフである。
【図2】図2は、FAM-3-TAMのCEエレクトロフェログラムである。サンプルは488nmの励起を有する典型的な細管電気泳動DNA配列決定条件により分析された。緑の痕跡は緑のチャネルに検出される螢光シグナルであり(525nm)、そして赤の痕跡は赤のチャネルに検出される螢光シグナルである(590nm)。両チャネルは同時に検出される。
【図3】図3は、1×TBEにおけるFAM-4-ROXの吸光及び発光スペクトルのグラフである。
【図4】図4は、FAM-4-ROXのCEエレクトロフェログラムである。サンプルは、488nmの励起を有する典型的な細管電気泳動DNA配列決定条件により分析される。緑の痕跡は緑のチャネルに検出される螢光シグナルであり(525nm)、そして赤の痕跡は赤のチャネルに検出される螢光シグナルである(590nm)。両チャネルは同時に検出される。
【図5】図5は、FAM-4-ROX及びROXプライマーのCEエレクトロフェログラムである。同じ濃度での2種のプライマーが80%ホルムアミドにおいて一緒に混合され、そして細管中に注入された。螢光シグナルが476nmでの励起を伴って緑及び赤のチャネルにおいて同時に検出された。
【図6】図6は、ドナーと受容体との間の距離に対しての移動性の依存性を示す、FAM-3-ROX,FAM-4-ROX及びFAM-10-ROX混合物のCEエレクトロフェログラムである。サンプルは、488nmの励起を有する典型的な細管電気泳動DNA配列決定条件により分析される。
【図7】図7は、M13mp18AフラグメントDNAサンプルに対しての異なった色素プライマーの移動シフトの比較である。
Claims (19)
- 注目の少なくとも2種の構成成分を検出するために複数の異なる蛍光ラベルを用いて複数成分の混合物中の構成成分を同定し、そして検出するための方法であって、前記個々の蛍光ラベルが、
(1)主鎖に結合されたドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有し、そして前記ドナー蛍光団から前記受容体蛍光団への効果的なエネルギー転移を生じさせるものであり;そして
(2)前記個々の蛍光ラベルが実質的に同じ波長で吸光し、そして異なる波長で発光する、
ことを特徴とし;
(a)主鎖と構成成分との特異的結合により、前記複数成分の混合物中の異なる構成成分に異なる発光波長を有する異なる蛍光ラベルを結合せしめ;
(b)未結合の蛍光ラベルを除去し;そして
(c)前記ドナー蛍光団の吸光波長において共通の光源により照射し、そして前記個々の蛍光ラベルの蛍光を検出することにより、前記蛍光ラベルに結合した個々の構成成分を検出する;
ことを含んで成る方法。 - 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の個々のドナー蛍光団が350〜800nmの波長範囲で光を吸収し、そして前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の受容体蛍光団が450〜1000nmの波長範囲で光を発する、請求の範囲第1項記載の方法。
- 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対が異なる9−フェニルキサンテンから成る請求の範囲第2項記載の方法。
- 注目の少なくとも2種の構成成分を検出するために複数の異なる螢光ラベルを用いて複数成分の混合物中の構成成分を同定し、そして検出するための方法であって、前記個々の蛍光ラベルが、
(1)オリゴヌクレオチド鎖に結合されたドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有し、そして前記ドナー蛍光団から前記受容体蛍光団への効果的なエネルギー転移を生じさせるものであり;そして
(2)前記個々の蛍光ラベルが実質的に同じ波長で吸光し、そして異なった波長で発光する、
ことを特徴とし;
(a)オリゴヌクレオチド鎖と構成成分との特異的結合により、前記複数成分の混合物中の異なる構成成分に異なる発光波長を有する異なる蛍光ラベルを結合せしめ;
(b)未結合の蛍光ラベルを除去し;そして
(c)前記蛍光ドナーの吸光波長において共通の光源により照射し、そして前記個々の蛍光ラベルの蛍光を検出することにより、前記蛍光ラベルに結合した個々の構成成分を検出する;
ことを含んで成る方法。 - 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の個々のドナー蛍光団が350〜800nmの波長範囲で光を吸収し、そして前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の受容体蛍光団が450〜1000nmの波長範囲で光を発する、請求の範囲第4項記載の方法。
- 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対が異なる9−フェニルキサンテンから成る請求の範囲第5項記載の方法。
- 複数成分の混合物の構成成分を分離するための方法であって、注目の個々の異なる構成成分が異なる蛍光ラベルによりラベルされ、前記蛍光ラベルが、
(1)オリゴヌクレオチド鎖に結合されたドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有し、そして前記ドナー蛍光団から前記受容体蛍光団への効果的なエネルギー転移を生じさせるものであり;
(2)前記個々の蛍光ラベルが実質的に同じ波長で吸光し、そして異なった波長で発光し;そして
(3)前記個々の異なる蛍光ラベルが、前記オリゴヌクレオチド鎖上の前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対のドナー蛍光団と受容体蛍光団との間の距離を変えることにより移動性向の差による前記分離において実質的に同じ移動性を有する、
ことを特徴とし、
(a)オリゴヌクレオチド鎖と構成成分との特異的結合により、前記複数成分の混合物中の異なる構成成分に異なる発光波長を有する異なる蛍光ラベルを結合せしめ;
(b)前記構成成分を個々の画分に分離し;そして
(c)前記受容体の吸光波長において共通の光源により照射し、そして前記個々の蛍光ラベルの蛍光を検出することにより、前記個々の構成成分を検出する;
ことを含んで成る方法。 - 前記分離が電気泳動によるものである請求の範囲第7項記載の方法。
- 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の個々のドナー蛍光団が350〜800nmの波長範囲で光を吸収し、そして前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の受容体蛍光団が450〜1000nmの波長範囲で光を発する、請求の範囲第7項記載の方法。
- 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対が異なる9−フェニルキサンテンから成る請求の範囲第9項記載の方法。
- 一本鎖核酸をコピーするためのプライマー及び特定のヌクレオチドで前記コピーに起因する鎖を終結するためのジデオキシヌクレオシドを用いて核酸配列を配列決定するための方法であって、前記プライマーのそれぞれが前記ジデオキシヌクレオシドの特定の1つに対応しており、
配列決定されるべき核酸フラグメントを、プライマーに結合する前記核酸フラグメントの5′側配列(プライマー結合配列)を含んで成るベクターでクローニングし;
異なる反応容器において、前記プライマー、dNTP及び少量の異なった1種のジデオキシヌクレオチドの存在下でDNAポリメラーゼにより前記フラグメントをコピーし;そして
一本鎖DNAフラグメントの得られる混合物を分離し、そしてゲル上に存在するバンドにより配列を決定することを含んで成り、
ここで、前記プライマーが、
(1)前記プライマー結合配列に対して相補的な核酸鎖に結合されたドナー蛍光団−受容体螢光蛍光団対を有し、そして前記ドナー蛍光団から前記受容体蛍光団への効果的なエネルギーの転移を生じさせるものであり、
(2)前記個々のプライマーが実質的に同じ波長で吸光し、そして異なった波長で発光し;そして
(3)前記個々のプライマーが、前記核酸鎖上の前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対のドナー蛍光団及びドナー蛍光団と受容体蛍光団との間の距離を変えることにより前記分離において実質的に同じ移動性を有する、
ことを特徴とする方法。 - 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対のメンバーの1つが前記プライマーの5′末端に結合されている請求の範囲第11項記載の方法。
- 異なるドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有する4種のプライマーが使用され、個々プライマーは異なる発光波長を有することにより異なる、請求の範囲第11項記載の方法。
- 少なくとも2つのドナー蛍光団−受容体蛍光団対がキサンテン化合物である請求の範囲第11項記載の方法。
- 前記キサンテン化合物がフルオレセイン及びローダミンを含んで成る、請求の範囲第14項記載の方法。
- 複数構成成分混合物中の少なくとも2種類の構成成分を同定し、検出するための、少なくとも2種の蛍光物質を含んでなるキットであって、前記個々の蛍光化合物が、
(1)核酸主鎖に結合されたドナー蛍光団−受容体蛍光団対を有し、前記ドナー蛍光団から前記受容体蛍光団への効果的なエネルギーの転移を生じさせるものであり、前記構成成分と核酸主鎖は特異的に結合しうるものであり;
(2)個々の蛍光化合物が実質的に同じ波長で吸光し、そして異なった波長で発光し;そして
(3)個々の蛍光化合物が、前記主鎖上の前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対のドナー蛍光団及びドナー蛍光団と受容体蛍光団との間の距離を変えることにより、電気泳動による核酸の分離において実質的に同じ移動性を有する;
ことを特徴とするキット。 - 前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の前記ドナー蛍光団が350〜800nmの波長範囲で光を吸光し、そして前記ドナー蛍光団−受容体蛍光団対の受容体蛍光団が450〜1000nmの波長範囲で光を発する、請求の範囲第16項記載のキット。
- 少なくとも2つのドナー蛍光団−受容体蛍光団対がキサンテン化合物から成る請求の範囲第17項記載のキット。
- 前記キサンテン化合物がフルオレセイン又はローダミンである請求の範囲第18項記載のキット。
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