ES2197193T3 - Sondas marcadas con colorantes acoplados por transferencia de energia. - Google Patents
Sondas marcadas con colorantes acoplados por transferencia de energia.Info
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Abstract
SE PROPORCIONAN COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN CONJUNTOS DE ETIQUETAS FLUORESCENTES QUE PORTAN PARES DE MOLECULAS COLORANTES DONANTES Y ACEPTORAS, DISEÑADAS PARA LA EXCITACION EFICAZ DE LOS DONANTES EN UNA LONGITUD DE ONDA Y EMISION UNICAS DEL ACEPTOR EN CADA UNO DE LOS PARES EN DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA. LAS DIFERENTES MOLECULAS TIENEN DIFERENTES PARES DONANTE-ACEPTOR QUE PUEDEN SER MODIFICADOS PARA TENER SUSTANCIALMENTE LA MISMA MOVILIDAD BAJO CONDICIONES DE SEPARACION, VARIANDO LA DISTANCIA ENTRE EL DONANTE Y EL ACEPTOR EN UN PAR DADO. PARTICULARMENTE, LAS COMPOSICIONES FLUORESCENTES ENCUENTRAN SU USO COMO ETIQUETAS EN LA CLASIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS.
Description
Sondas marcadas con colorantes acoplados por
transferencia de energía.
El campo de esta invención es el de las marcas
fluorescentes y su uso.
Hay una creciente demanda en ser capaces de
identificar y cuantificar componentes de mezclas. Cuanto mayor es la
complejidad de la mezcla, mayor es el interés en ser capaces de
detectar simultáneamente la pluralidad de los componentes presentes.
Ilustrativo de esta situación es la secuenciación de ADN, en la que
es deseable excitar eficazmente de uno a cuatro componentes,
marcados de un modo fluorescente, con una fuente láser a una
longitud de onda única, mientras se proporciona para la emisión de
la señal fluorescente una pluralidad de longitudes de onda
distintivas. En esta situación, las diferentes marcas no deben
afectar adversamente a la movilidad electroforética de las
secuencias a las que están unidas.
Actualmente, hay cuatro métodos usados en la
secuenciación automática de ADN: (1) los fragmentos de ADN se marcan
con un fluoróforo y, seguidamente, los fragmentos se separan en un
gel en carriles de secuenciación adyacentes (Ansorge y col.,
Nucelic Acids Res. 15, 4593-4602 (1987)); (2)
los fragmentos de ADN se marcan con cuatro fluoróforos diferentes y
todos los fragmentos se separan electroforéticamente y se detectan
en un carril único (Smith y col., Nature 321,
674-679 (1986)); (3) cada uno de los
didesoxinucleósidos de la reacción de terminación se marca con un
fluoróforo diferente y los cuatro conjuntos de fragmentos se separan
en el mismo carril (Prober y col., Science 238,
336-341 (1987)); o (4) los conjuntos de fragmentos
de ADN se marcan con dos fluoróforos diferentes y las secuencias de
ADN se codifican por la relación de colorantes (Huang y col.,
Anal. Chem. 64, 2149-2154 (1992)).
Todas estas técnicas tienen deficiencias
significativas. El método 1 tiene el problema potencial de las
variaciones en la movilidad de carril a carril, así como una baja
resolución. Los métodos 2 y 3 requieren que los cuatro colorantes se
exciten bien mediante una fuente láser y que tengan espectros de
emisión claramente diferentes. En la práctica, es muy difícil
encontrar dos o más colorantes que puedan excitarse eficazmente con
un láser único y que emitan señales fluorescentes bien
separadas.
Cuando se seleccionan colorantes con espectros de
emisión distintivos desplazados al rojo, sus espectros de absorción
también se mueven al rojo y así todos los colorantes ya no pueden
excitarse eficazmente mediante la misma fuente láser. Además, cuanto
más diferentes sean los colorantes seleccionados, más difícil se
hace seleccionar todos los colorantes, de forma que provoquen el
mismo cambio en la movilidad de las moléculas marcadas.
Por lo tanto, es de un interés sustancial el que
se proporcionen métodos mejorados que permitan el manejo de muestras
múltiples para poder determinar una pluralidad de componentes en el
mismo sistema y en una única separación. También es deseable que
cada marca tenga una capacidad de absorción fuerte a una longitud de
onda común, para tener un rendimiento cuántico alto en la
fluorescencia y tener un desplazamiento de Stokes grande en la
emisión; que las diversas emisiones sean distintivas y que las
marcas introduzcan el mismo cambio en la movilidad. Es difícil
realizar estos objetivos en conflicto mediante la marcación simple
de moléculas con un colorante único.
La patente de Estados Unidos Nº 4996143 describe
sondas de polinucleótidos que contienen fluoróforos donadores y
aceptores para la transferencia energética no radiante, de tal forma
que ni el resto donador ni el aceptor está unido al extremo 5' ó 3'
de la sonda. Los fluoróforos están unidos a las sondas de
polinucleótidos mediante engarces. En una realización, los
fluoróforos donador y aceptor se unen a la sonda de forma que se
proporciona una separación relativa entre ellos de entre dos y siete
unidades de base intermedias.
El documento WO 93/09128 describe un
polinucleótido tiene al menos dos (múltiples) cromóforos donadores y
un fluoróforo aceptor fluorescente, colocados a una distancia para
la transferencia del donador al aceptor tal que los múltiples
donadores pueden recoger la luz de excitación y transferirla al
aceptor. En un ejemplo, se demuestra la transferencia energética
eficaz en una sonda de oligonucleótido en la que un grupo aceptor
fluorescente terminal (rojo de Texas) está separado una unidad de
nucleótido de un grupo donador (fluoresceína).
El documento EP 439036 A describe un sistema de
transferencia energética que incluye el cromóforo lumazina y un
complejo de rutenio unidos a una cadena de nucleótidos.
La solicitud japonesa Nº H5-60698
describe fragmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo, cebadores,
marcados con cuerpos fluorescentes para uso en la separación y
detección de ácidos nucleicos. En particular, se marcan oligómeros
de ADN de cadena única con dos tipos de cuerpos fluorescentes en una
relación de transferencia energética.
Ninguna de las combinaciones o familias de marcas
fluorescentes descritas anteriormente, que comprenden pares de
fluoróforos y su uso en sistemas de separación, implican una
pluralidad de componentes.
El sujeto de la invención proporciona
composiciones y métodos para analizar una mezcla usando una
pluralidad de marcas fluorescentes. Para generar estas marcas, se
unen pares o familias de fluoróforos a una estructura,
particularmente a una estructura de un ácido nucleico, en la que uno
de los miembros de las familias se excita a, aproximadamente, la
misma longitud de onda. Explotando el fenómeno de la transferencia
energética, el otro miembro de cada una de las familias emite a una
longitud de onda diferente y detectable. El intervalo de las
distancias entre los cromóforos donadores y aceptores se elige para
asegurar la transferencia energética eficaz. Además, las marcas
usadas conjuntamente se seleccionan para tener, aproximadamente, la
misma movilidad en un sistema de separación. Esto se consigue
cambiando la movilidad de la entidad marcada variando la distancia
entre los dos o más miembros de la familia de fluoróforos y
eligiendo marcas con la misma movilidad. El sujeto de la invención
tiene una aplicación particular en la secuenciación, en la que los
fluoróforos pueden estar unidos a cebadores universales u otros y en
la que se usan diferentes combinaciones de fluoróforos para los
diferentes didesoxinucleósidos. También se proporcionan kits de
combinaciones de marcas.
La figura 1 es una gráfica de los espectros de
absorción y emisión de FAM-3-TAM en
TBE 1X;
La figura 2 es un diagrama de una electroforesis
capilar de FAM-3-TAM. La muestra se
analizó mediante una típica electroforesis capilar en condiciones de
secuenciación de ADN con excitación a 488 nm. El rastro verde es la
señal fluorescente detectada en el canal verde (525 nm) y el rastro
rojo es la señal fluorescente detectada en el canal rojo (590 nm).
Ambos canales se detectan simultáneamente;
La figura 3 es una gráfica de los espectros de
absorción y emisión de FAM-4-ROX en
TBE 1X;
La figura 4 es un diagrama de una electroforesis
capilar de FAM-4-ROX. La muestra se
analizó mediante una típica electroforesis capilar en condiciones de
secuenciación de ADN con excitación a 488 nm. El rastro verde es la
señal fluorescente detectada en el canal verde (525 nm) y el rastro
rojo es la señal fluorescente detectada en el canal rojo (590 nm).
Ambos canales se detectan simultáneamente;
La figura 5 es un diagrama de una electroforesis
capilar de FAM-4-ROX y el cebador
ROX. Se mezclaron los dos cebadores a la misma concentración juntos
en formamida 80% y se inyectaron en el capilar. Las señales
fluorescentes se detectaron en los canales verde y rojo
simultáneamente con excitación a 476 nm;
La figura 6 es un diagrama de una electroforesis
capilar de una mezcla de FAM-3-ROX,
FAM-4-ROX y
FAM-10-ROX, mostrándose la
dependencia de la movilidad de la distancia entre el donador y el
aceptor. La muestra se analizó mediante una típica electroforesis
capilar en condiciones de secuenciación de ADN con excitación a 488
nm; y
La figura 7 es una comparación del cambio de
movilidad de diferentes cebadores teñidos sobre muestras del
fragmento de ADN M13 mp 18 A.
Se proporcionan marcas fluorescentes nuevas,
combinaciones de marcas fluorescentes y su uso en sistemas de
separación que implican la separación de una pluralidad de
componentes.
De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona una combinación de marcas fluorescentes, comprendiendo
cada marca un par donador-aceptor fluorescente en el
que dicho donador y dicho aceptor se unen, cada uno de ellos,
covalentemente a diferentes átomos de una estructura en cadena de
átomos, con transferencia energética eficaz de dicho donador a dicho
aceptor; en la que cada una de dichas marcas es una especie
molecular única y en la que cada una de dichas marcas absorbe, en la
combinación, a sustancialmente la misma longitud de onda y emite a
una longitud de onda diferente.
De un modo particular, las marcas fluorescentes
comprenden pares de fluoróforos, que, con una excepción en la que
los fluoróforos son el mismo, implican fluoróforos diferentes que
tienen espectros solapantes, en los que la emisión del donador
solapa con la absorción del aceptor para que haya transferencia
energética del fluoróforo excitado al otro miembro del par. No es
esencial que el fluoróforo excitado emita realmente fluorescencia,
siendo suficiente que el fluoróforo excitado sea capaz de absorber
eficazmente la energía de excitación y la transfiera eficazmente al
fluoróforo emisor.
Los fluoróforos donadores de las diferentes
familias de fluoróforos pueden ser el mismo o diferentes, pero serán
capaces de excitarse eficazmente mediante una fuente luminosa única
de un ancho de banda estrecho, particularmente una fuente láser. Los
fluoróforos donadores tendrán una absorción significativa,
normalmente, al menos, aproximadamente, 10%, preferentemente, al
menos, aproximadamente, 20% del máximo de absorción, dentro de 20 nm
del uno al otro, normalmente, dentro de 10 nm, más normalmente,
dentro de 5 nm del uno al otro. Los fluoróforos emisores o aceptores
se seleccionarán para que sean capaces de recibir la energía a
partir de los fluoróforos donadores y emitir luz, que será
distintiva y diferente en la detección. Por tanto, se será capaz de
distinguir entre los componentes de la mezcla a los que se han unido
las diferentes marcas. Normalmente, las marcas emitirán el máximo de
emisión separado por, al menos, 10 nm, preferentemente, al menos, 15
nm y más preferentemente, al menos, 20 nm.
Normalmente, los fluoróforos donadores absorberán
en el intervalo de, aproximadamente, 350 a 800 nm, más normalmente,
en el intervalo de, aproximadamente, 350 a 600 nm ó 500 a 750 nm,
mientras que los fluoróforos aceptores emitirán luz en el intervalo
de, aproximadamente, 450 a 1000 nm, normalmente, en el intervalo de,
aproximadamente, 450 a 800 nm. Como se discutirá a continuación, se
pueden tener más de un par de moléculas absorbentes, para poder
tener 3 o más moléculas, en las que la energía se transfiere de una
molécula a la siguiente a longitudes de onda mayores, para aumentar
en gran medida la diferencia en la longitud de onda entre la
absorción y la emisión observada.
Los dos fluoróforos se unirán a una estructura o
cadena, normalmente una cadena polimérica, en la que la distancia
entre los dos fluoróforos puede variar. La física detrás del diseño
de las marcas está en que la transferencia de la excitación óptica
desde el donador al aceptor depende de 1 / R^{6}, en la que R es
la distancia entre los dos fluoróforos. De este modo, la distancia
debe elegirse para proporcionar una transferencia energética eficaz
desde el donador al aceptor a través del muy bien conocido
mecanismo Foerster. De este modo, la distancia entre los dos
fluoróforos determinada por el número de átomos en la cadena que
separan los dos fluoróforos puede variar de acuerdo con la
naturaleza de la cadena. Se pueden emplear diversas cadenas o
estructuras, tales como ácidos nucleicos, tanto ADN como ARN, ácidos
nucleicos modificados, por ejemplo, aquellos en los que los átomos
oxígeno puede sustituirse por átomos de azufre, carbono o nitrógeno,
aquellos en los que los fosfatos pueden sustituirse por sulfato o
carboxilato, etc.; polipéptidos; polisacáridos; diversos grupos que
pueden añadirse etapa a etapa, tales como grupos bifuncionales, por
ejemplo, haloaminas, o similares. Los fluoróforos pueden sustituirse
como se requiera mediante la adición de los grupos funcionales
apropiados de los diversos bloques constructores, pudiendo estar el
fluoróforo presente en el bloque constructor durante la formación de
la marca o pudiéndose añadir subsecuentemente, tal como se requiera.
Se pueden emplear diversas técnicas químicas convencionales para
asegurar que se obtiene el espaciamiento apropiado entre los dos
fluoróforos.
Generalmente, el peso molecular de las marcas
(fluoróforos más la estructura a la que están unidos) será, al
menos, aproximadamente, 250 Da y no más de, aproximadamente, 5000
Da, normalmente no más de, aproximadamente, 2000 Da. Generalmente,
el peso molecular del fluoróforo estará en el intervalo de,
aproximadamente, 250 a 1000 Da, no difiriendo el peso molecular de
los pares aceptor-donador de las diferentes marcas a
usar juntas, normalmente, en más de, aproximadamente, 20%. Los
fluoróforos pueden unirse a una posición interna de la cadena, en
los extremos, o uno en un extremo y el otro en un sitio interno.
Los fluoróforos pueden seleccionarse para que sean de una familia
química similar, tales como colorantes de cianina, xantenos o
similares. De este modo, se pueden tener los donadores de la misma
familia química, cada par donador-aceptor de la
misma familia química o cada aceptor de la misma familia
química.
Las marcas sujeto de la invención tienen una
aplicación particular en diversas técnicas de separación, tales como
electroforesis, cromatografía o similares, en las que se desea tener
unas propiedades espectroscópicas optimizadas, una alta sensibilidad
y una influencia comparable de las marcas sobre la aptitud
migratoria de los componentes a ser analizados. De particular
interés es la electroforesis, tal como la electroforesis en gel,
capilar, etc. Entre lastécnicas cromatográficas están la HPLC,
cromatografía de afinidad, cromatografía en capa fina,
cromatografía en papel y similares.
Se ha encontrado que el espaciamiento entre los
dos fluoróforos afectará a la movilidad de la marca. Por lo tanto,
se pueden usar diferentes pares de colorantes y variando la
distancia entre los diferentes pares de colorantes, dentro de un
intervalo que aún permita una buena transferencia energética,
proporcionar una movilidad sustancialmente constante de las marcas.
La movilidad no está relacionada con el espaciamiento específico,
por lo que se puede determinar empíricamente el efecto del
espaciamiento en la movilidad de una marca particular. Sin embargo,
debido a la flexibilidad en el espaciamiento de los fluoróforos en
las marcas, mediante síntesis de unas pocas marcas diferentes con
espaciamientos diferentes y pares de colorantes diferentes, ahora se
puede proporcionar una familia de marcas fluorescentes, que
compartan una excitación común, que tengan una emisión distintiva y
fuerte y una movilidad sustancialmente común. Normalmente, la
movilidad no diferirá en más de, aproximadamente, 20% de la una a la
otra, preferentemente no más de, aproximadamente, 10% de la una a la
otra y más preferentemente dentro de, aproximadamente, 5% de la una
a la otra, cuando se usen en una separación en particular.
Normalmente, la movilidad puede determinarse llevando a cabo la
separación de las marcas en sí mismas o la de las marcas unidas a
una molécula común que es relevante en la separación en particular,
por ejemplo, una molécula de ácido nucleico del tamaño apropiado,
estando interesados en la secuenciación.
Pueden tener aplicación una amplia variedad de
colorantes fluorescentes. Estos colorantes pueden caer dentro de
diversas clases, pudiéndose usar combinaciones de colorantes dentro
de la misma clase o de diferentes clases. De las clases se incluyen
los colorantes, tales como los colorantes xanténicos, por ejemplo
fluoresceínas y rodaminas; cumarinas, por ejemplo, umbeliferona;
colorantes de benzimida, por ejemplo, Hoechst 33258; colorantes de
fenantridina, por ejemplo, rojo de Texas y colorantes de etidio;
colorantes de acridina; colorantes de cianina, tales como naranja de
tiazol, azul de tiazol, Cy 5 y Cyfr; colorantes de carbazol;
colorantes de fenoxazina; colorantes de porfirina; colorantes de
quinolina o similares. De este modo, los colorantes pueden absorber
en los intervalos ultravioleta, visible o infrarrojo. En la mayor
parte, las moléculas fluorescentes tendrán un peso molecular menor
de, aproximadamente, 2 kDa, generalmente menor de, aproximadamente,
1,5 kDa.
El donador de energía debe tener un coeficiente
de extinción molar fuerte a la longitud de onda de excitación
deseada, de un modo deseable, mayor de, aproximadamente, 10^{4},
preferentemente, mayor de, aproximadamente, 10^{5}
cm^{-1}M^{-1}. El máximo de excitación del donador y el máximo
de emisión del aceptor (fluorescente) estarán separados por, al
menos, 15 nm o más. La integral de solapamiento de los espectros
entre el espectro de emisión del cromóforo donador y el espectro de
absorción del cromóforo aceptor y la distancia entre los cromóforos
será tal que la eficacia de la transferencia energética del donador
al aceptor variará del 20% al 100%.
La separación del donador y el aceptor, basándose
en el número de átomos en la cadena, variará dependiendo de la
naturaleza de la estructura, si es rígida o flexible, si implica
estructuras cíclicas o estructuras no cíclicas o similares.
Generalmente, el número de átomos en la cadena (los átomos de las
estructuras cíclicas serán contados para ser incluidos en la cadena
como el menor número de átomos alrededor de un lado del anillo)
estará por debajo de, aproximadamente, 200, normalmente, por debajo
de, aproximadamente, 150 átomos, preferentemente, por debajo de,
aproximadamente, 100, influyendo la naturaleza de la estructura en
la eficacia de la transferencia energética entre el donador y el
aceptor.
Mientras que, para la mayor parte de los casos,
se usarán pares de fluoróforos, puede haber situaciones en las que
se pueden usar hasta cuatro fluoróforos diferentes, normalmente, no
más de tres diferentes, unidos a la misma estructura. Usando más
fluoróforos, se puede extender en gran medida el desplazamiento de
Stokes, de modo que se puede excitar en un intervalo de longitud de
onda visible y emitir en el intervalo de longitud de onda
infrarrojo, normalmente, por debajo de, aproximadamente, 1000 nm,
más normalmente, por debajo de, aproximadamente, 900 nm. La
detección de luz en el intervalo de longitud de onda infrarrojo
tiene muchas ventajas, ya que no estará sujeta a interferencia con
la luz Raman y Rayleigh que resulta de la luz de excitación. Para
mantener la movilidad constante, se puede usar el mismo número de
fluoróforos en las marcas, teniendo una multiplicidad del mismo
fluoróforo para igualar el número de fluoróforos en las marcas que
tienen fluoróforos diferentes para un desplazamiento de Stokes
grande.
Las marcas de la presente invención pueden usarse
en aplicaciones que incluyen la detección y distinción entre los
diversos componentes en una mezcla. El método comprende unir
diferentes marcas a los diferentes componentes de interés de la
mezcla de componentes múltiples y detectar cada uno de dichos
componentes marcados mediante irradiación a la longitud de onda de
absorción de dichos donadores y detectar la fluorescencia de cada
una de dichas marcas.
El sujeto de la invención tiene una aplicación
particular en las cadenas de ácidos nucleicos, encontrando las
cadenas de ácidos nucleicos uso como cebadores en la secuenciación,
la reacción en cadena de la polimerasa, particularmente para
determinar el tamaño, u otros sistemas donde los cebadores se
emplean para la extensión de ácidos nucleicos y se desea distinguir
entre diversos componentes de la mezcla en relación con las marcas
en particular. Por ejemplo, en la secuenciación, se pueden emplear
cebadores universales, usándose un par de fluoróforos diferentes
para cada uno de los didesoxinucleósidos diferentes usados en la
extensión durante la secuenciación.
Están disponibles un gran número de nucleósidos,
con grupos funcionales, y pueden usarse en la síntesis de
polinucleótidos. Mediante la síntesis de las marcas de los ácidos
nucleicos sujeto de la invención, se pueden definir los sitios
específicos en los que los fluoróforos están presentes. Se pueden
emplear sintetizadores disponibles comercialmente de acuerdo con los
medios convencionales, de forma que se puede conseguir cualquier
secuencia, con el par de fluoróforos con el espaciamiento apropiado.
Cuando se usan diferentes cebadores en una PCR, cada uno de los
cebadores puede marcarse de acuerdo con el sujeto de la invención,
de forma que se puede detectar fácilmente la presencia de la
secuencia diana complementaria a cada uno de los diferentes
cebadores. Otras aplicaciones en las que pueden usarse incluyen la
identificación de isoenzimas, usando anticuerpos específicos; la
identificación de lectinas, usando diferentes polisacáridos y
similares.
Las marcas fluorescentes de la invención también
pueden usarse en métodos que incluyen la separación de los
componentes de ácido nucleico en una mezcla de componentes
múltiples, en la que cada uno de los componentes de interés
diferentes están marcados con marcas diferentes, comprendiendo cada
marca, un par donador-aceptor fluorescente unido
covalentemente a diferentes átomos de una cadena de oligonucleótido
con una transferencia energética del donador al aceptor eficaz; cada
una de las marcas es una especie molecular única y cada una absorbe
a sustancialmente la misma longitud de onda y emite a una longitud
de onda diferente y cada una de las marcas diferentes tiene
sustancialmente la misma movilidad en dicha separación como
resultado de variar el espaciamiento del par
donador-aceptor a lo largo de la cadena de dicho
oligonucleótido. El método comprende unir marcas diferentes a
componentes diferentes de dicha mezcla de componentes múltiples,
separar dichos componentes en fracciones individuales y detectar
cada uno de dichos componentes marcados mediante irradiación a la
longitud de onda de absorción de dichos donadores y detectar la
fluorescencia de cada una de dichas marcas.
Como se indicó anteriormente, las marcas sujeto
de la invención tienen un uso particular en la secuenciación. Por
ejemplo, se pueden preparar cebadores universales, pudiendo ser el
cebador uno cualquiera de los cebadores universales, habiendo sido
modificado mediante unión de los dos fluoróforos al cebador. De este
modo, están disponibles diversos cebadores comerciales, tales como
cebadores de pUC/m13, \lambdagt10, \lambdagt11 y similares.
Véase Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, CSHL, 1989, sección 13. Las secuencias de
ADN se clonan en un vector apropiado que tiene una secuencia
cebadora unida a la secuencia a ser secuenciada. Se emplean
diferentes 2',3'-ddNTP, de forma que la terminación
sucede en sitios diferentes, dependiendo del ddNTP en particular que
está presente en la extensión de la cadena. Mediante el empleo de
los cebadores en cuestión, cada ddNTP estará asociado con una marca
en particular. Después de la extensión con el fragmento Klenow,
seguidamente, los fragmentos resultantes pueden separarse en un
carril único de electroforesis o en un capilar único de
electroforesis, detectándose el nucleótido de terminación en virtud
de la fluorescencia de la marca.
También se pueden usar las marcas sujeto de la
invención con complejos inmunitarios, pudiéndose marcar los ligandos
o receptores, por ejemplo, anticuerpos, para detectar los diferentes
complejos o miembros de los complejos. Como los ligandos pueden
tener la misma aptitud migratoria en el método de separación, para
determinar la presencia de uno o más de tales ligandos, los
diferentes anticuerpos pueden marcarse con diferentes marcas
fluorescentes a diferentes longitudes de onda, de forma que son
detectables, incluso cuando hay solapamiento de las composiciones en
la separación.
Se proporcionan kits que tienen combinaciones de
marcas, normalmente, al menos, 2. Cada una de las marcas tendrá el
par aceptor-donador, normalmente de estructuras
comparables, estando las marcas separadas a lo largo de la
estructura para proporcionar una movilidad comparable en el método
de separación a usar. Cada una de las marcas de un grupo a usar
juntas, absorberán a, aproximadamente, la misma longitud de onda y
emitirán a longitudes de onda diferentes. Cada una de las marcas de
un grupo tendrá, aproximadamente, el mismo efecto sobre la movilidad
en el método de separación, como resultado de la variación en la
localización de los diferentes fluoróforos a lo largo de la
estructura.
Los kits tendrán, generalmente, hasta,
aproximadamente, 6 marcas diferentes, normalmente, hasta,
aproximadamente, 4 marcas diferentes que son coincidentes, pero
pueden tener 2 o más conjuntos de marcas coincidentes, teniendo de 2
a 6 marcas diferentes.
De un interés particular son las marcas que
comprenden una estructura de ácido nucleico, teniendo las marcas,
generalmente, al menos, aproximadamente, 10 nucleótidos y no más de,
aproximadamente, 50 nucleótidos, normalmente, no más de,
aproximadamente, 30 nucleótidos. Las marcas pueden estar presentes
en los nucleótidos que hibridan con la secuencia complementaria o
pueden estar separadas de esos nucleótidos. Normalmente, los
fluoróforos estarán unidos al nucleótido a través de un engarce
conveniente de, aproximadamente, 2 a 20, normalmente, 4 a 16 átomos
en la cadena. La cadena puede tener una pluralidad de funciones,
particularmente nonoxocarbonilo, más particularmente éster y amida,
amino, oxi- y similares. La cadena puede ser alifática, alicíclica,
aromática, heterocíclica o combinaciones de las mismas,
comprendiendo en la cadena, normalmente, carbono, nitrógeno,
oxígeno, azufre o similares.
La secuencia de ácido nucleico completa puede ser
complementaria a la secuencia del cebador 5' o puede ser
complementaria solamente a la porción 3' de la secuencia.
Normalmente, habrá, al menos, aproximadamente, 4 nucleótidos, más
normalmente, al menos, aproximadamente, 5 nucleótidos que son
complementarios a la secuencia que será copiada. Los cebadores se
combinan con la secuencia que será copiada en el plásmido apropiado,
que tiene la secuencia del cebador en el extremo 3' de la cadena que
será copiada y se añaden los dNTP con una pequeña cantidad del ddNTP
apropiado. Después de la extensión, el ADN puede ser aislado y
transferido a un gel o a un capilar para la separación.
Los kits que se emplean tendrán al menos dos de
las marcas sujeto de la invención, que serán coincidentes, teniendo
la molécula donadora, sustancialmente, la misma absorción, distintos
espectros de emisión y, sustancialmente, la misma movilidad.
Generalmente, para los ácidos nucleicos de cadena única, la
separación entre los fluoróforos será de, aproximadamente, 1 a 15,
más normalmente 1 a 12, preferentemente, aproximadamente, 2 a 10
nucleósidos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como
ilustración y no como limitación.
Se sintetizaron desoxioligonucleótidos (de 12
bases de longitud) con la secuencia
5'-GTTTTCCCAGTC-3', seleccionada del
cebador universal M13, con pares de fluoróforos
donadores-aceptores separados a distancias
diferentes. Específicamente, el dodecámero contiene una base
modificada introducida mediante el uso de
5'-dimetoxitritil-5-[N-(trifluoroacetilaminohexi)-3-
acrilimido]2'-desoxiuridina,
3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidito
(modificador de amino C6 dT) (estructura 1), que tiene un engarce
amino primario en la posición C-5.
Estructura
1
El colorante donador se une al lado 5' del
oligómero y el colorante aceptor se une al grupo amino primario de
la T modificada. Las distancias entre el donador y el aceptor se
cambian variando la oposición de la T modificada en el oligómero.
Los cebadores se designan D-N-A,
siendo D el donador, A el aceptor y N el número de bases entre D y
A. En todos los cebadores preparados, D es el colorante FAM de
Applied Biosystems Inc. (``ABI''), un derivado de fluoresceína y A
es el colorante TAM ó ROX de ABI, los cuales son ambos derivados de
rodamina. Como ejemplo representativo, se muestra a continuación el
FAM-3-TAM (estructura 2).
Estructura
2
Las ventajas del abordaje de transferencia
energética descrito en la presente memoria son: (1) se pueden
generar un mayor desplazamiento de Stokes y señales fluorescentes
mucho más fuertes, cuando se excita a 488 nm y (2) la movilidad de
los cebadores puede ajustarse variando las distancias entre el
donador y el aceptor para conseguir la misma movilidad. El espectro
visible de FAM-3-TAM tiene tanto la
absorción de FAM (495 nm) como la de TAM (560 nm); sin embargo,
cuando se excita a 488 nm, casi toda la emisión que viene de T tiene
un máximo a 579 nm (figura 1). Esto demuestra la transferencia
energética de fluorescencia eficaz de FAM a TAM. Esto también puede
verse, separando el cebador en una columna de electroforesis capilar
(CE) y detectándolo en los canales rojo y verde. Con un cebador
marcado con FAM y TAM, casi toda la emisión se ve en el canal rojo
(590 nm) (figura 2), indicando que la energía del donador FAM se
transfirió casi completamente al aceptor TAM, produciéndose una
desviación de Stokes de 91 nm. La observación de un único pico
indica que el cebador es puro. El mismo resultado se ve para
FAM-4-ROX, que proporciona incluso
un mayor desplazamiento de Stokes de 114 nm (figuras 3 y 4). La
intensificación de las señales fluorescentes de los cebadores de
transferencia energética en comparación con los cebadores marcados
con un único colorante se ve cuando un cebador ROX de ABI, a la
misma concentración que el FAM-4-ROX
(medida mediante luz UV), se inyecta en el mismo capilar. La señal
fluorescente resultante de
FAM-4-ROX parece ser más de diez
veces mayor que la del cebador ROX (figura 5).
Para la aplicación, con éxito, de los cebadores
marcados con fluoróforos donadores y aceptores a la secuenciación de
ADN, es esencial que los cebadores produzcan el mismo cambio en la
movilidad de los fragmentos de ADN y muestren señales fluorescentes
distintas. Se encontró que la movilidad de los cebadores depende de
la distancia entre el donador y el aceptor (figura 6). Se separaron
en un capilar FAM-4-ROX,
FAM-3-ROX y
FAM-10-ROX y se detectaron en los
canales rojo y verde. Para el
FAM-10-ROX la distancia aumentada
entre los colorantes redujo la cantidad de transferencia energética,
dando como resultado señales casi iguales en los dos canales. Cuando
la distancia de separación se reduce, la cantidad de transferencia
energética aumenta como se evidencia en la señal verde relativamente
reducida. Tanto FAM-3-ROX como
FAM-4-ROX exhiben una excelente
transferencia energética, pero su movilidad es marcadamente
diferente, lo que ofrece la posibilidad de ajustar el cambio de
movilidad variando la distancia. Para conseguir una coincidencia
exacta de la movilidad de los dos cebadores que tienen espectros de
emisión marcadamente diferentes, se prepararon también
FAM-3-FAM,
FAM-4-FAM y
FAM-10-FAM. De una genoteca de
cebadores preparada (FAM-N-FAM,
FAM-N-TAM,
FAM-N-ROX), se encontró que los
fragmentos de secuenciación que terminan en A, generados con
FAM-10-FAM y
FAM-3-ROX, usando Sequenase 2,
tienen un cambio de la movilidad muy similar (figura 7),
demostrándose el potencial en el análisis de secuencias de ADN. La
emisión de FAM-10-FAM y
FAM-3-ROX es 525 nm y 605 nm,
respectivamente. Las señales Raman son insignificantes a estas dos
longitudes de onda. De este modo, la relación señal / ruido aumenta
radicalmente.
I. Preparación de dodecámeros de
oligonucleótidos que contienen una T modificada y una marca FAM en
la posición
5'
Se prepararon los siguientes tres cebadores en un
sintetizador de ADN de ABI, modelo 394, a una escala de 0,2
\mumoles:
La base T* modificada, que contiene un engarce
amino, se introdujo en la posición definida mediante el uso del
modificador de amino C6 dT fosforamidito (Glen Research) y FAM se
introdujo mediante el uso de 6-FAM amidito (ABI) en
la última etapa de la síntesis. Cuando las secuencias de bases se
completaron, los oligonucleótidos se separaron del soporte sólido
(CPG) con 1 ml de NH_{4}OH concentrado. Los grupos protectores de
amino en las bases (A, G, C y T*) se eliminaron calentando la
solución de NH_{4}OH durante 4 horas a 55ºC. El análisis por
electroforesis capilar indicó que los oligómeros eran \sim80%
puros, usándose directamente en la siguiente etapa de acoplamiento
del colorante.
II. Unión del colorante fluorescente
secundario al engarce amino de los oligómeros 1, 2 y
3.
Como ejemplo representativo, se muestra más
adelante el esquema de la reacción para acoplar el colorante
secundario (TAM) al oligómero 1:
Se incubaron toda una noche a temperatura
ambiente, los oligonucleótidos marcados con FAM (1, 2 y 3) en 40
\mul de tampón Na_{2}CO_{3}/NaHCO_{3} 0,5 M con un exceso
de, aproximadamente, 150 veces del éster TAM-NHS, o
bien del éster ROX-NHS o bien del éster
FAM-NHS, en 12 \mul de DMSO. El colorante sin
reaccionar se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño
en una columna Sephadex G-25. Seguidamente, se
purificaron los oligonucleótidos marcados con los colorantes
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida 20% y urea 6 M en
TBE (40 cm x 0,8 cm). Los cebadores puros se recuperaron del gel y
se desalinizaron con un cartucho de purificación de
oligonucleótidos. Mediante electroforesis capilar en gel se mostró
que la pureza de los cebadores era >99%.
III. Preparación de los fragmentos de
secuenciación de ADN con FAM-3-ROX y
FAM-10-FAM
Se produjeron fragmentos de secuenciación de ADN
M13mp18 terminados en A usando Sequenase 2.0 (USB). Se prepararon
dos soluciones de hibridación en viales de 600 \mul: (1) 10 \mul
de tampón de reacción, 40 \mul de ADN de cadena única M13mp18 y 6
\mul de FAM-3-ROX; (2) 6 \mul de
tampón de reacción, 20 \mul de ADN de cadena única M13mp18 y 3
\mul de FAM-10-FAM. Cada vial se
calentó a 65ºC durante 5 minutos y seguidamente, se permitió que se
enfriara a temperatura ambiente durante 30 minutos, colocándose en
hielo durante 20 minutos para asegurarse de que los cebadores más
cortos se hubieran hibridado completamente con el molde. Se
añadieron a cada vial en hielo, 3 \mul de DTT, 20 \mul de mezcla
de terminación ddA y 12 \mul de Sequenase 2.0 diluida.
Inicialmente, las mezclas de reacción se incubaron a 20ºC durante 20
minutos y seguidamente, a 37ºC durante otros 20 minutos. Las
reacciones se pararon mediante la adición de 10 \mul de EDTA 50
mM, 40 \mul de NH_{4}OH 4 M y 300 \mul de EtOH 95%. Las
soluciones se mezclaron bien y seguidamente, se colocaron en hielo
durante 20 minutos. Los fragmentos se desalinizaron dos veces con
EtOH 75% frío, se secaron al vacío y se disolvieron en 4 \mul de
formamida 95% (vol. / vol.) y EDTA 50 nM. La muestra se calentó
durante 3 minutos para desnaturalizar el ADN y seguidamente, se
colocó en hielo hasta la inyección de la muestra en el instrumento
de electroforesis capilar. Se realizó una inyección electrocinética
a 10 kV durante 30 segundos.
De los resultados anteriores, es evidente que se
pueden ajustar las composiciones relacionadas, por ejemplo, los
polinucleótidos con los grupos funcionales de 2 fluoróforos, para
proporcionar unas longitudes de onda de emisión diferentes y
rendimientos cuánticos de emisión altos, teniendo sustancialmente
las mismas absorbancia de luz de excitación y movilidad. De este
modo, las mezclas de las composiciones pueden analizarse
independientemente, pudiéndose marcar de un modo diferente las
diferentes composiciones con marcas que tienen bandas de emisión
fluorescente que difieren. Además, las composiciones pueden
prepararse fácilmente, pueden usarse en una amplia variedad de
contextos, tienen una buena estabilidad y unas buenas propiedades
fluorescentes aumentadas.
Claims (27)
1. Una combinación de marcas fluorescentes,
comprendiendo cada marca, un par donador-aceptor
fluorescente en el que dicho donador y dicho aceptor están, cada uno
de ellos, unidos covalentemente a átomos diferentes de una
estructura en cadena de átomos, con transferencia energética eficaz
de dicho donador a dicho aceptor, y en la que cada una de dichas
marcas es una especie molecular única, absorbiendo, cada una de
dichas marcas de la combinación, a sustancialmente la misma longitud
de onda y emitiendo a una longitud de onda diferente.
2. Una combinación de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dichos fluoróforos donadores son los
mismos.
3. Una combinación de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en la que cada uno de dichos fluoróforos
donadores absorben luz en el intervalo de longitud de onda de 350 a
800 nm, y cada uno de dichos aceptores emiten luz en el intervalo de
longitud de onda de 450 a 1000 nm.
4. Una combinación de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el peso molecular de dichas marcas
(fluoróforos más la estructura en cadena de átomos a la que están
unidos) no es más de 5000 daltons.
5. Una combinación de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 4, en la que dichos pares
donador-aceptor son colorantes xanténicos.
6. Una combinación de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que dichos colorantes xanténicos comprenden
derivados de fluoresceína y derivados de rodamina.
7. Una combinación de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha estructura en cadena de
átomos es una estructura polimérica.
8. Una combinación de acuerdo con la
reivindicación 7, en la que dicha estructura polimérica es un
oligonucleótido.
9. Una combinación de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 8, en la que una o más de dichas marcas
fluorescentes comprenden además un tercer fluoróforo de modo que la
energía se transfiere de una molécula a la siguiente a una longitud
de onda mayor y la excitación del primer fluoróforo produce la
fluorescencia del tercer fluoróforo.
10. Un método para identificar y detectar los
componentes de una mezcla de componentes múltiples empleando marcas
fluorescentes para detectar al menos dos componentes de interés, en
el que:
- (i)
- cada una de dichas marcas comprende un par donador-aceptor fluorescente unido covalentemente a diferentes átomos de una estructura en cadena de átomos, con transferencia energética eficaz de dicho donador a dicho aceptor; y
- (ii)
- cada una de dichas marcas es una especie molecular única y cada una absorbe a sustancialmente la misma longitud de onda y emite a una longitud de onda diferente;
comprendiendo dicho
método:
- unir diferentes marcas a diferentes componentes de interés de dicha mezcla de componentes múltiples y detectar cada uno de dichos componentes marcados irradiando a la longitud de onda de adsorción de dichos donadores, y detectando la fluorescencia de cada una de dichas marcas.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dichos fluoróforos donadores son los mismos.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que cada uno de dichos donadores absorbe luz en el
intervalo de longitud de onda de 350 a 800 nm y cada uno de dichos
aceptores emite luz en el intervalo de longitud de onda de 450 a
1000 nm.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que dicho par donador-aceptor son
colorantes xanténicos.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dichos colorantes xanténicos comprenden derivados de
fluoresceína y derivados de rodamina.
15. Un método para separar los componentes de una
mezcla de componentes múltiples, en el que cada uno de los
componentes de interés se marca con marcas diferentes, estando
dichas marcas caracterizadas por que:
- (i)
- cada marca comprende un par donador-aceptor fluorescente unido covalentemente a diferentes átomos de una cadena de oligonucleótido, con transferencia energética eficaz de dicho donador a dicho aceptor;
- (ii)
- cada una de las marcas es una especie molecular única y cada una absorbe a sustancialmente la misma longitud de onda y emite a una longitud de onda diferente; y
- (iii)
- cada una de las diferentes marcas tiene sustancialmente la misma movilidad en dicha separación como resultado de variar el espaciamiento de dicho par donador-aceptor a lo largo de dicha cadena de oligonucleótido;
comprendiendo dicho
método:
- unir diferentes marcas a diferentes componentes de dicha mezcla de componentes múltiples; separar dichos componentes en fracciones individuales; y detectar cada uno de dichos componentes marcados irradiando a la longitud de onda de absorción de dichos donadores y detectando la fluorescencia de cada una de dichas marcas.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dicha separación es mediante electroforesis.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dichos fluoróforos donadores son los mismos.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dicho donador absorbe luz en el intervalo de longitud
de onda de 350 a 800 nm y dicho aceptor emite luz en el intervalo de
longitud de onda de 450 a 1000 nm.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dicho par donador-aceptor son
colorantes xanténicos.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
19, en el que dichos colorantes xanténicos comprenden derivados de
fluoresceína y derivados de rodamina.
21. Un método para secuenciar un ácido nucleico
que emplea cebadores para copiar un ácido nucleico de cadena única y
didesoxinucleótidos para terminar la cadena resultante de dicha
copia, en un nucleótido en particular, comprendiendo dicho
método:
- (i)
- clonar un fragmento de ácido nucleico a ser secuenciado en un vector que comprende una secuencia de unión al cebador, complementaria a un cebador, a 5' de dicho fragmento;
- (ii)
- copiar dicho fragmento con una polimerasa de ADN en presencia de dicho cebador, los dNTP y cada uno de los didesoxinucleótidos de una pluralidad en tubos de reacción separados, para generar fragmentos de secuenciación de ADN de cadena única;
- (iii)
- separar la mezcla de fragmentos de secuenciación de ADN de cadena única resultante y determinar la secuencia por medio de las bandas presentes en el gel;
dichos fragmentos de secuenciación de ADN
comprenden cebadores que tienen un par
donador-aceptor fluorescente unido covalentemente a
diferentes átomos de una estructura en cadena de átomos, con
transferencia energética eficaz de dicho donador a dicho aceptor, en
los que cada uno de dichos cebadores es una especie molecular única
y cada uno absorbe a sustancialmente la misma longitud de onda y
emite a una longitud de onda diferente, teniendo cada uno de dichos
cebadores, sustancialmente, la misma movilidad en dicha separación,
que resulta de variar el espaciamiento y los fluoróforos de dicho
par donador-aceptor a lo largo de dicha cadena de
ácidos
nucleicos.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, en el que uno de los miembros de dicho par
donador-aceptor fluorescente está unido al extremo
5' de dicho cebador.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, en el que hay cuatro cebadores que tienen diferentes pares
donador-aceptor.
24. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, en el que dicho par donador-aceptor fluorescente
se separa no más de 30 nucleótidos.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, en el que al menos dos pares donador-aceptor
fluorescente son colorantes xanténicos.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación
25, en el que dichos colorantes xanténicos comprenden derivados de
fluoresceína y derivados de rodamina.
27. Un kit para uso en uno cualquiera de los
métodos de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 26, que comprende
una combinación de diferentes marcas fluorescentes de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
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