BR112019021889A2 - Substratos tendo reatividade de superfície modificada e propriedades anti-incrustantes em reações biológicas - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a métodos de preparar superfícies de cavidades de amostra. em alguns aspectos, os métodos de preparar uma superfície de cavidade de amostra envolvem colocar em contato a cavidade de amostra com um copolímero de bloco para formar uma camada de envoltório anti-incrustante sobre a superfície de óxido de metal da cavidade de amostra. em alguns aspectos, métodos de passivar e/ou seletivamente funcionalizar uma superfície de cavidade de amostra são proporcionados.
Description
Relatório descritivo de patente de invenção para SUBSTRATOS TENDO REATIVIDADE DE SUPERFÍCIE MODIFICADA E PROPRIEDADES ANTI-INCRUSTANTES EM REAÇÕES BIOLÓGICAS.
PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119 (e) do Pedido de Patente Provisória dos EUA No. 62/502.525, depositado em 5 de maio de 2017, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
CAMPO DA TÉCNICA
[002] O presente pedido refere-se em geral a porções de superfície de substrato seletivamente modificados e métodos de preparar as mesmas. Aspectos da tecnologia proporcionada aqui se referem a alterar a reatividade de uma ou mais porções desejadas de uma superfície de cavidade de amostra. Em alguns aspectos, a descrição proporciona métodos de seletivamente modificar uma ou mais porções de superfície de uma cavidade de amostra.
ANTECEDENTES
[003] Microestruturas são amplamente usadas como ferramentas em análises de molécula única, que inclui análise de ácido nucleico, sequenciamento de ácido nucleico, análise de expressão de gene, genotipagem, análise de mutação, análise de peptídeo, sequenciamento de peptídeo, e triagem de fármaco. Em geral formadas na superfície de um vidro, metal, plástico, ou outro substrato, microestruturas podem incluir porções de superfície seletivamente modificadas que são tornadas mais reativas ou menos reativas em relação a espécies químicas desejadas. Por exemplo, análises de moléculas únicas podem necessitar de confinamento de uma molécula de interesse a uma região desejada do substrato para detecção ou observação. Onde a população de moléculas não especificamente ligadas está dentro da referida re
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2/56 gião, pode ser um desafio filtrar sinais interferentes durante a análise e pode diminuir a precisão dos resultados por contribuir para a análise estatística geral.
SUMÁRIO
[004] Aspectos da tecnologia descrita aqui se referem a métodos de gerar uma porção seletivamente funcionalizada de uma superfície de cavidade de amostra, e dispositivos que compreendem a mesma. Em algumas modalidades, métodos de preparar uma porção de superfície passivada de uma cavidade de amostra são proporcionados aqui. Em algumas modalidades, a descrição proporciona métodos de preparar uma porção de superfície passivada da cavidade de amostra tendo propriedades anti-incrustantes. Em algumas modalidades, a descrição se refere à passivação de uma porção de superfície de óxido de metal de uma cavidade de amostra para promover a funcionalização seletiva de uma porção de superfície de silica de uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, a tecnologia proporcionada na presente descrição pode ser usada para confinar a molécula de interesse a uma região desejada de uma cavidade de amostra.
[005] Em alguns aspectos, a descrição proporciona métodos de seletivamente funcionalizar a superfície de uma cavidade de amostra que envolve colocar em contato uma cavidade de amostra tendo uma primeira superfície e uma segunda superfície com um copolímero de bloco que preferivelmente liga a camada de revestimento na primeira superfície. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com o copolímero de bloco em uma quantidade suficiente para formar uma camada de envoltório anti-incrustante sobre a primeira superfície. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente envolvem colocar em contato a cavidade de amostra com um agente de funcionalização que preferivelmente liga a segunda superfície para gerar uma segunda superfície funcionalizada, em que o agen
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3/56 te de funcionalização compreende uma fração de acoplamento. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com o copolímero de bloco antes de ser colocada em contato com o agente de funcionalização. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com o agente de funcionalização antes de ser colocada em contato com o copolímero de bloco.
[006] Em algumas modalidades, a primeira superfície é uma superfície de metal ou de óxido de metal. Em algumas modalidades, a primeira superfície é uma superfície de plástico (por exemplo, polietileno, polipropileno, poliestireno, policarbonato, cloreto de polivinila, politetrafluoroetileno, ou combinações dos mesmos). Em algumas modalidades, a segunda superfície é uma superfície de silica. Em algumas modalidades, a primeira superfície é uma superfície de óxido de metal e a segunda superfície é uma superfície de silica. Em algumas modalidades, a camada de revestimento compreende um reagente anfipático.
[007] Em alguns aspectos, a descrição proporciona métodos de funcionalizar uma superfície de silica de uma cavidade de amostra que envolve colocar em contato uma cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica com um copolímero de bloco que preferivelmente liga a camada de revestimento na superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com o copolímero de bloco em uma quantidade suficiente para formar uma camada de envoltório antiincrustante sobre a superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente envolvem colocar em contato a cavidade de amostra com um agente de funcionalização que preferivelmente liga a superfície de silica para gerar uma superfície de silica funcionalizada. Em algumas modalidades, o agente de funcionalização compreende uma fração de acoplamento. Em algumas modalidades, a
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4/56 cavidade de amostra é colocada em contato com o copolímero de bloco antes de ser colocada em contato com o agente de funcionalização. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com o agente de funcionalização antes de ser colocada em contato com o copolímero de bloco.
[008] Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem colocar em contato a cavidade de amostra com um reagente anfipático que preferivelmente liga a superfície de óxido de metal para formar a camada de revestimento na superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende um grupo dianteiro hidrófilo configurado para preferivelmente ligar a superfície de óxido de metal e um grupo traseiro hidrófobo configurado para preferivelmente ligar o copolímero de bloco.
[009] Em algumas modalidades, o grupo dianteiro hidrófilo compreende um grupo funcional sulfato, sulfite, fosfato, fosfonato, hidroxila, catecolato, isocianato, hidroxamato, ou carboxila. Em algumas modalidades, o grupo dianteiro hidrófilo compreende um grupo funcional carbonila, amino, sulfidrila, éter, éster, fosfodiéster, glicosídico, ou carboxamida. Em algumas modalidades, o grupo traseiro hidrófobo compreende uma cadeia alquila C1-C30. Em algumas modalidades, 0 grupo traseiro hidrófobo é selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno substituído ou não substituído; alquenileno substituído ou não substituído; alquinileno substituído ou não substituído; heteroalquileno substituído ou não substituído; heteroalquenileno substituído ou não substituído; heteroalquinileno substituído ou não substituído; heterociclileno substituído ou não substituído; carbociclileno substituído ou não substituído; arileno substituído ou não substituído; heteroarileno substituído ou não substituído; e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, 0 grupo traseiro hidrófobo compreende uma cadeia de carbono polifluorada.
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5/5Q
[0010] Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende um composto de ácido fosfônico de alquila de fórmula CH3(CH2)nPO3H2, onde n é um número inteiro com um valor de 1-30. Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende ácido hexilfosfônico, ácido octilfosfônico, ácido decilfosfônico, ácido dodecilfosfônico, ácido polivinilfosfônico, ácido 12-fosfono-1-dodecanossulfônico, ácido 10-undecinilfosfônico, ou ácido hepta-decadecilfosfônico. Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende um fluoro tensoativo. Em algumas modalidades, o fluoro tensoativo é um composto de fórmula CF3(CF2)nZ, onde n é um número inteiro com um valor de 1-30 e Z é um grupo dianteiro hidrófilo.
[0011] Em algumas modalidades, o grupo traseiro hidrófobo do reagente anfipático compreende uma fração de acoplamento covalente. Nas referidas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem colocar em contato a cavidade de amostra com um composto polimérico que é configurado para ligar a fração de acoplamento covalente, desse modo covalentemente fixando o composto polimérico ao reagente anfipático na superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende um composto de ácido fosfônico de alquila de fórmula Y(CH2)nPO3H2, onde n é um número inteiro com um valor de 1-30, e Y é uma fração de acoplamento covalente. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento covalente compreende um grupo amina, um grupo azido, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alquina, ou um grupo sulfidrila.
[0012] Em algumas modalidades, o copolímero de bloco é um copolímero de bloco do tipo A-B-A que compreende um bloco A e um bloco B. Em algumas modalidades, a camada de revestimento preferivelmente liga o bloco B do copolímero de bloco do tipo A-B-A (por exemplo, para formar a camada de envoltório anti-incrustante). Em al
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6/56 gumas modalidades, o bloco Β é mais hidrófobo do que o bloco A. Em algumas modalidades, o bloco A compreende um primeiro bloco de poliéter e o bloco B compreende um segundo bloco de poliéter que é mais hidrófobo do que o primeiro bloco de poliéter.
[0013] Em algumas modalidades, o copolímero de bloco do tipo AB-A é um composto de fórmula I:
(Aa)(Bí,)(Aa) (Fórmula I), onde A é uma unidade monomérica de um composto de poliéter que compreende o bloco A; a é um número inteiro com um valor de 2-150; B é uma unidade monomérica de um composto de poliéter que compreende o bloco B; e b é um número inteiro com um valor de 10-100.
[0014] Em algumas modalidades, o bloco A compreende óxido de polietileno e o bloco B compreende óxido de polipropileno. Em algumas modalidades, o copolímero de bloco do tipo A-B-A é um composto de fórmula II:
(Fórmula II), onde a é um número inteiro com um valor de 2-150; e b é um número inteiro com um valor de 10-100.
[0015] Em algumas modalidades, a superfície de óxido de metal é óxido de alumínio, óxido de titânio, óxido de zircônio, óxido de ferro, óxido de estanho, ou óxido de tântalo.
[0016] Em algumas modalidades, o agente de funcionalização compreende um composto de silano. Em algumas modalidades, o composto de silano compreende mono-etoxissilano, metoxissilano, dietoxissilano, triclorossilano, ou di-etóxi, metoxissilano. Em algumas modalidades, o composto de silano compreende um composto silanoPEG. Em algumas modalidades, o composto de silano compreende um composto tiol-silano ou amino-silano.
[0017] Em algumas modalidades, a fração de acoplamento do
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7/56 agente de funcionalização compreende uma molécula de biotina, uma proteína avidina, uma proteína estreptavidina, uma proteína lecitina, ou a SNAP-tag. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento do agente de funcionalização compreende um grupo amina, um grupo azido, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alquina, ou um grupo sulfidrila.
[0018] Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem colocar em contato a cavidade de amostra tendo a superfície de silica funcionalizada com uma molécula de interesse que é configurada para ligar a fração de acoplamento, sob condições adequada para permitir a ligação da molécula de interesse à fração de acoplamento, desse modo acoplando a molécula de interesse à superfície de silica funcionalizada.
[0019] Em algumas modalidades, o colocar em contato a cavidade de amostra com a molécula de interesse ocorre subsequente ao colocar em contato a cavidade de amostra com o agente de funcionalização sem uma etapa de lavagem intermediária. Em algumas modalidades, o colocar em contato a cavidade de amostra com a molécula de interesse ocorre subsequente ao colocar em contato a cavidade de amostra com o copolímero de bloco sem uma etapa de lavagem intermediária. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com o copolímero de bloco e o agente de funcionalização em etapas separadas de colocar em contato e sem uma etapa de lavagem intermediária.
[0020] Em algumas modalidades, a molécula de interesse compreende uma enzima de polimerização. Em algumas modalidades, a enzima de polimerização é uma DNA polimerase. Em algumas modalidades, a DNA polimerase é a DNA polimerase T4. Em algumas modalidades, a DNA polimerase é a DNA polimerase T7. Em algumas modalidades, a DNA polimerase é a DNA polimerase phi29. Em algumas
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8/56 modalidades, a DNA polimerase é a DNA polimerase M2Y. Em algumas modalidades, a DNA polimerase é a DNA polimerase de Lucilia cuprina.
[0021] Em algumas modalidades, a molécula de interesse é um complexo de modelos de sequenciamento que compreende uma molécula de ácido nucleico matriz tendo um complexo de primer hibridizado/enzima de polimerização. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico matriz é entre cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, entre cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, entre cerca de 10 kb a cerca de 15 kb, entre cerca de 15 kb a cerca de 20 kb, ou entre cerca de 20 kb a cerca de 25 kb. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é entre cerca de 25 kb a cerca de 50 kb, entre cerca de 50 kb a cerca de 100 kb, entre cerca de 100 kb a cerca de 250 kb, entre cerca de 250 kb a cerca de 500 kb, ou entre cerca de 500 kb a cerca de 1000 kb.
[0022] Em algumas modalidades, a molécula de interesse se liga preferivelmente à superfície de silica funcionalizada sobre a superfície de óxido de metal (por exemplo, a superfície de óxido de metal que compreende o copolímero de bloco e/ou a camada de revestimento) com seletividade de cerca de 100 vezes a cerca de 1000 vezes, seletividade de cerca de 200 vezes a cerca de 800 vezes, seletividade de cerca de 400 vezes a cerca de 600 vezes, ou seletividade de cerca de 1000 vezes a cerca de 2000 vezes.
[0023] Em algumas modalidades, a seletividade da molécula de interesse para a superfície de silica funcionalizada sobre a superfície de óxido de metal (por exemplo, a superfície de óxido de metal que compreende o copolímero de bloco e/ou a camada de revestimento) é maior em comparação à cavidade de amostra não colocada em contato com o copolímero de bloco por cerca de 10 vezes a cerca de 100 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 1000 vezes, ou cerca de 200 vezes a cerca de 400 vezes.
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[0024] Em algumas modalidades, os métodos proporcionados aqui adicionalmente compreendem submeter a molécula de interesse a uma reação de sequenciamento. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados aqui adicionalmente compreendem submeter a molécula de interesse (por exemplo, um complexo de modelos de sequenciamento) para uma próxima geração de técnica de sequenciamento.
[0025] Em alguns aspectos, a descrição proporciona um dispositivo integrado que compreende um substrato (por exemplo, um suporte sólido) que compreende uma cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado adicionalmente compreende uma camada de revestimento na superfície de óxido de metal formada por um reagente anfipático que compreende um grupo dianteiro hidrófilo e um grupo traseiro hidrófobo. Em algumas modalidades, o reagente anfipático é ligado à superfície de óxido de metal através do grupo dianteiro hidrófilo. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado adicionalmente compreende uma camada de envoltório anti-incrustante na camada de revestimento formada por um copolímero de bloco do tipo AB-A que compreende um bloco A e um bloco B. Em algumas modalidades, o copolímero de bloco do tipo A-B-A é ligado à camada de revestimento através do bloco B. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado adicionalmente compreende um agente de funcionalização ligado à superfície de silica. Em algumas modalidades, o agente de funcionalização compreende uma fração de acoplamento.
[0026] Em algumas modalidades, o substrato compreende uma estrutura de cavidades de amostra, cada cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica.
[0027] Em algumas modalidades, a cavidade de amostra compreende uma abertura de topo formada em uma superfície do substrato e
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10/56 uma superfície de fundo distai à superfície do substrato. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é compreendida pela superfície de silica.
[0028] Em algumas modalidades, a fração de acoplamento do agente de funcionalização ligado à superfície de silica compreende uma molécula de biotina, uma proteína avidina, uma proteína estreptavidina, uma proteína lecitina, ou uma SNAP-tag. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento do agente de funcionalização ligado à superfície de silica compreende um grupo amina, um grupo azido, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alquina, ou um grupo sulfidrila.
[0029] Em algumas modalidades, o dispositivo integrado é configurado para interagir com um instrumento de sequenciamento de próxima geração.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] Aquele versado na técnica entenderá que as Figuras, aqui descritas, são apenas para fins ilustrativos. Deve ser entendido que, em alguns casos, vários aspectos da invenção podem ser mostrados exagerados ou ampliados para facilitar uma compreensão da invenção. Nos desenhos, caracteres de referência semelhantes geralmente se referem a características semelhantes, elementos funcionalmente semelhantes e/ou estruturalmente semelhantes através das várias Figuras. Os desenhos não estão necessariamente em escala, enfatizando a ilustração dos princípios dos ensinamentos. Os desenhos não pretendem limitar o escopo dos presentes ensinamentos de nenhuma maneira.
[0031] As características e vantagens da presente invenção se tomarão mais evidentes a partir da descrição detalhada estabelecida abaixo quando tomadas em conjunto com os desenhos.
[0032] Ao descrever modalidades em referência aos desenhos,
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11/56 referências de direção (acima, abaixo, superior, inferior, esquerda, direita, horizontal, vertical etc.) podem ser usadas. As referidas referências se destinam apenas como uma ajuda para o leitor visualizar os desenhos em uma orientação normal. Essas referências direcionais não se destinam a descrever uma orientação preferida ou única de um dispositivo incorporado. Um dispositivo pode ser incorporado em outras orientações.
[0033] Como é evidente a partir da descrição detalhada, os exemplos representados nas Figuras (por exemplo, Figuras 1 a 9) e ainda descritos para fins de ilustração através do pedido descrevem modalidades não limitativas e, em alguns casos, podem simplificar determinados processos ou omitir recursos ou etapas para fins de ilustração mais clara.
[0034] A Figura 1 ilustra uma vista em seção transversal de uma cavidade de amostra.
[0035] As Figuras 2A e 2B ilustram fluxos de trabalho para processos de seletivamente funcionalizar a porção de superfície de silica de uma cavidade de amostra.
[0036] A Figura 3 ilustra um processo pelo qual a porção de superfície de silica de um substrato é seletivamente funcionalizada por formar uma camada de envoltório anti-incrustante em uma porção de superfície de óxido de metal do substrato.
[0037] A Figura 4 ilustra um processo de passivar a superfície de óxido de metal por gerar uma camada de passivação de polímero enxertado em uma porção de óxido de metal de um substrato.
[0038] A Figura 5 ilustra configurações não limitantes de copolímeros de bloco.
[0039] A Figura 6 proporciona resultados de imagem a partir de experimentos de molhabilidade.
[0040] A Figura 7 proporciona resultados de imagem a partir de
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12/56 testes de seletividade de ligação.
[0041] A Figura 8 ilustra leituras e representações gráficas de resultados obtidos a partir de testes de fluorescência.
[0042] A Figura 9 ilustra resultados a partir da reação de sequenciamento realizada usando um dispositivo integrado tendo uma superfície seletivamente funcionalizada de acordo com algumas modalidades descritas aqui.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0043] Aspectos da descrição se referem a cavidades de amostra tendo porções de superfície seletivamente modificadas, e a métodos de preparar as mesmas. Em alguns aspectos, a descrição proporciona métodos de modificar porções de superfície de uma cavidade de amostra tendo uma primeira porção de superfície e uma segunda porção de superfície. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com um reagente anfipático que preferivelmente liga a primeira porção de superfície para formar a camada de revestimento na primeira porção de superfície. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com um copolímero de bloco que preferivelmente liga a camada de revestimento na primeira porção de superfície (por exemplo, para formar uma camada de envoltório anti-incrustante sobre a primeira porção de superfície). Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é colocada em contato com um agente de funcionalização que preferivelmente liga a segunda porção de superfície para gerar a segunda superfície funcionalizada porção. Em algumas modalidades, a primeira porção de superfície é uma superfície de plástico e a segunda porção de superfície é uma superfície de silica. Em algumas modalidades, a primeira porção de superfície é uma superfície de óxido de metal e a segunda porção de superfície é uma superfície de silica.
[0044] Entre outros aspectos, a descrição proporciona métodos de
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13/56 preparar cavidades de amostra tendo porções de superfície seletivamente modificadas. Em algumas modalidades, técnicas proporcionadas aqui podem ser usadas para passivar a superfície de óxido de metal de uma cavidade de amostra tendo uma porção de superfície composta de óxido de metal e uma porção de superfície composta de silica. Em algumas modalidades, a descrição proporciona métodos de gerar superfícies passivadas de óxido de metal tendo propriedades anti-incrustantes. Em algumas modalidades, superfícies passivadas de óxido de metal descritas aqui podem ser usadas para facilitar a funcionalização seletiva da porção de superfície de silica de uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, as porções de superfície seletivamente modificadas de uma cavidade de amostra podem ser usadas para promover o confinamento de uma molécula de interesse a uma região desejada de uma cavidade de amostra.
[0045] Em determinadas técnicas, análise de molécula única envolve confinar a molécula de interesse a uma região desejada de uma cavidade de amostra na qual a observação de uma única molécula e/ou detecção de sinal é ótima. Confinamento da molécula de interesse dentro da região desejada pode ser alcançado por seletivamente modificar porções de superfície de uma cavidade de amostra. Por exemplo, uma porção de superfície na região desejada é funcionalizada para reter a molécula de interesse, enquanto a porção de superfície fora da região desejada não é funcionalizada. A referida funcionalização seletiva pode ser alcançado por passivar a porção de superfície fora da região desejada, tornando a mesma inerte em direção a funcionalização.
[0046] Passivação de superfície em geral se refere a um processo pelo qual uma superfície é produzida para ser menos reativa em relação a um ambiente. Por exemplo, em algumas modalidades, onde pode ser desejável se seletivamente funcionalizar uma segunda superfí
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14/56 cie de um substrato sobre uma primeira superfície, a primeira superfície pode ser passivada para tornar a mesma incapaz de, ou altamente resistente a funcionalização. Técnicas de passivação de superfície convencionais podem envolver o uso de composições que formam monocamadas automontadas, que comumente produzem superfícies cobertas de modo imperfeito em virtude de vários defeitos na monocamada. Os referidos defeitos, na prática, proporcionam campos de superfície expostos nos quais a funcionalização pode ocorrer. Os inventores reconheceram e observaram que as referidas e outras limitações podem ser superadas usando reagentes que efetivamente ocultam os defeitos da monocamada. Os inventores adicionalmente reconheceram e adicionalmente observaram que determinados dos referidos reagentes conferem propriedades anti-incrustantes nas superfícies passivadas que podem ser vantajosamente aplicadas no contexto de reações biológicas.
[0047] Aspectos da descrição se referem à modificação seletiva de porções de superfície de cavidades de amostra. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra compreende pelo menos duas porções de superfície tendo diferentes composições químicas. Por exemplo, a Figura 1 ilustra uma vista em seção transversal de uma cavidade de amostra 180 compreendida por um dispositivo integrado 100, de acordo com algumas modalidades não limitantes do presente pedido. A cavidade de amostra 180 pode compreender um pequeno volume ou região definido por uma abertura formada em uma camada de metal 104 e se estendendo para dentro de uma camada de silica 106 do dispositivo integrado 100. A cavidade de amostra 180 pode ter uma ou mais paredes laterais cobertas, pelo menos parcialmente, com um revestimento de óxido de metal 102. Em algumas modalidades, o revestimento de óxido de metal pode ser passivado, de acordo com as técnicas descritas aqui, para gerar um revestimento de passivação 108.
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Um revestimento de passivação 108, em algumas modalidades, pode tomar o revestimento de óxido de metal 102 inerte em direção a um agente de funcionalização 130. Desse modo, o agente de funcionalização 130 preferivelmente se liga à camada de silica 106. Em algumas modalidades, o agente de funcionalização 130 compreende uma fração de acoplamento configurada para se ligar a molécula de interesse 190. Assim, a superfície seletivamente funcionalizada da camada de silica 106 permite o confinamento da molécula de interesse 190 a uma região próxima à superfície de fundo de uma cavidade de amostra 180. Em algumas modalidades, um revestimento de passivação 108 inclui uma camada de revestimento e/ou uma camada de envoltório anti-incrustante para reduzir a quantidade de molécula de interesse 190 que interage com ou adere às paredes laterais. Em algumas modalidades, a camada de revestimento e/ou a camada de envoltório anti-incrustante reduz ou elimina a aderência dos componentes em uma reação biológica nas paredes laterais.
[0048] Em algumas modalidades, a cavidade de amostra tendo porções de superfície seletivamente modificadas pode ser preparada de acordo com o fluxo de trabalho ilustrado na Figura 2A. Como mostrado, a cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal 202 e uma superfície de silica 206 é submetida a uma etapa de passivação (i) para gerar uma camada de revestimento 210 na superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, a camada de revestimento 210 é formada por colocar em contato a cavidade de amostra com um reagente anfipático que preferivelmente liga a superfície de óxido de metal. A cavidade de amostra pode então ser exposta a um copolímero de bloco na etapa (ii) para gerar uma camada de envoltório antiincrustante 220 sobre a superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, a camada de envoltório anti-incrustante 220 é formada por colocar em contato a cavidade de amostra com um copolímero de blo
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16/56 co que preferivelmente liga a camada de revestimento na superfície de óxido de metal. A cavidade de amostra pode adicionalmente ser submetida a uma etapa de funcionalização (iii) para gerar uma superfície de silica funcionalizada 230. Em algumas modalidades, a superfície de silica funcionalizada 230 é formada por colocar em contato a cavidade de amostra com um agente de funcionalização que preferivelmente liga a superfície de silica.
[0049] Deve ser observado que, em algumas modalidades, a ordem das etapas no processo da Figura 2A pode diferir a partir daquela mostrada. Por exemplo, em algumas modalidades, a cavidade de amostra tendo porções de superfície seletivamente modificadas pode ser preparada de acordo com o fluxo de trabalho ilustrado na Figura 2B. Como mostrado, a cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica é submetida à etapa de passivação (i) para gerar a camada de revestimento na superfície de óxido de metal. A cavidade de amostra tendo uma camada de revestimento pode adicionalmente ser submetida a uma etapa de funcionalização (ii) para gerar uma superfície de silica funcionalizada. A cavidade de amostra pode então ser exposta a um copolímero de bloco na etapa (iii) para gerar uma camada de envoltório anti-incrustante sobre a superfície de óxido de metal. Os processos mostrados nas Figuras 2A e 2B ilustram exemplos de uma cavidade de amostra tendo composições de superfície específicas, por exemplo, uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica. Deve ser observado que, em algumas modalidades, técnicas ilustradas nas referidas figuras e descritas em algum ponto aqui podem ser utilizadas com cavidades de amostra tendo diferentes composições de superfície. Por exemplo, em algumas modalidades, a superfície 202 pode ser uma superfície de plástico. Exemplos de superfícies de plástico incluem, por meio de exemplo e não limitação, polietileno, polipropileno, poliestireno, poli
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17/56 carbonato, cloreto de polivinila, poli-tetrafluoroetileno, e combinações dos mesmos.
[0050] Em algumas modalidades, um agente de funcionalização é capaz de ligar múltiplas composições de superfície na cavidade de amostra, por exemplo, o agente de funcionalização é capaz de ligar cada uma da composição de superfície de óxido de metal ou de silica. Nas referidas modalidades, as técnicas descritas aqui podem ser vantajosamente usadas para restringir a ligação do agente de funcionalização a uma região desejada ou uma composição de superfície especificada de uma cavidade de amostra. Por exemplo, em algumas modalidades, a superfície de óxido de metal de uma cavidade de amostra pode ser passivada para evitar ou limitar a extensão de funcionalização na superfície de óxido de metal - consequentemente restringir a funcionalização a uma diferente superfície (por exemplo, uma superfície de silica) de uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, defeitos em um revestimento de passivação pode resultar em campos de superfície expostos de óxido de metal, que pode resultar em funcionalização indesejada da superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, as técnicas descritas aqui são capazes de ocultar campos de superfície expostos de óxido de metal em um revestimento de passivação para promover funcionalização de uma superfície de silica com alta seletividade.
[0051] Em alguns aspectos, os métodos descritos aqui envolvem colocar em contato a cavidade de amostra tendo uma porção de superfície de óxido de metal e uma porção de superfície de silica com um copolímero de bloco que preferivelmente liga a camada de revestimento na superfície de óxido de metal para formar uma camada de envoltório anti-incrustante. Em algumas modalidades, a camada de envoltório anti-incrustante compensa os defeitos na camada de revestimento. Em algumas modalidades, a camada de revestimento com
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18/56 preende uma monocamada. Como usado aqui, uma monocamada se refere a uma camada tendo uma espessura de molécula única. Em algumas modalidades, o termo monocamada é usado intercambiavelmente com monocamada automontada (SAM), a última das quais se refere a um processo de automontagem com o que as moléculas espontaneamente formam conjuntos nas superfícies por adsorção (por exemplo, quimiossorção, fisiossorção). Durante o referido processo de montagem molecular, defeitos podem aparecer na monocamada em virtude de vários fatores intrínsecos (por exemplo, termodinâmicas de formação, propriedades químicas do adsorbato) ou fatores externos (por exemplo, imperfeições na superfície, impurezas). Em algumas modalidades, defeitos na monocamada resultam em campos de superfície expostos. A presente descrição proporciona, em algumas modalidades, métodos de ocultar os referidos defeitos em campos usando uma camada de envoltório anti-incrustante.
[0052] Por exemplo, a Figura 3 ilustra um processo no qual uma camada de envoltório anti-incrustante é formada como parte da porção de superfície de óxido de metal passivada para permitir que um agente de funcionalização seletivamente se ligue a uma porção de superfície de silica. Em algumas modalidades, um substrato (por exemplo, a cavidade de amostra) tendo uma superfície de óxido de metal 302 e uma superfície de silica 304 inclui uma camada de revestimento 310 na superfície de óxido de metal 302. Em algumas modalidades, a superfície de óxido de metal 302 é composta de óxido de alumínio, óxido de titânio, óxido de zircônio, óxido de ferro, óxido de estanho, ou óxido de tântalo. Em algumas modalidades, a camada de revestimento 310 é formada usando um reagente anfipático tendo um grupo traseiro hidrófobo 314 e um grupo dianteiro hidrófilo 316 que preferivelmente liga a superfície de óxido de metal 302. Em algumas modalidades, o reagente anfipático forma conjuntos moleculares na superfície de óxido de
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19/56 metal 302. Como mostrado, em algumas modalidades, um ou mais defeitos 318 podem se formar na monocamada durante a automontagem da camada de revestimento 310 formada pelo reagente anfipático. Em algumas modalidades, o substrato (por exemplo, cavidade de amostra) é submetida a uma etapa de passivação (i) que envolve colocar em contato o substrato com um copolímero de bloco 322 que preferivelmente liga a camada de revestimento 310 na superfície de óxido de metal 302 para formar uma camada de envoltório antiincrustante 320 sobre a superfície de óxido de metal 302. Em algumas modalidades, a natureza e/ou extensão das interações formadas entre o copolímero de bloco e a camada de revestimento efetivamente cobre os campos de defeito, como ilustrado na Figura 3.
[0053] Em algumas modalidades, o copolímero de bloco 322 é um copolímero de bloco do tipo A-B-A tendo um bloco A 324 e um bloco B 326. Em algumas modalidades, a camada de revestimento 310 preferivelmente liga o bloco B 326 do copolímero de bloco do tipo A-B-A. Em algumas modalidades, o bloco B 326 é hidrófobo com relação ao bloco A 324. Nas referidas modalidades, o bloco B 326 pode formar interações com os grupos traseiros hidrófobos 314 da camada de revestimento 310 com base no efeito hidrófobo. O efeito hidrófobo em geral se refere à tendência de moléculas não polares para agregar em solução aquosa e excluir moléculas de água. Assim sendo, à medida que os grupos traseiros hidrófobos 314 da camada de revestimento 310 são de outro modo expostos a um solvente aquoso, a camada de revestimento 310 preferivelmente associa com o copolímero de bloco 322 no bloco mais hidrófobo B 326. Em algumas modalidades, o bloco B é mais hidrófobo do que o bloco A, e A e B têm graus respectivos adequados de polimerização, de modo que uma concentração fundamental de micela de entre ou igual a 0,01 % em peso e 10 % em peso (por exemplo, entre ou igual a 0,01 % em peso e 1 % em peso) em
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20/56 solução aquosa existe a 25 graus Celsius. O termo concentração fundamental de micela tem seu significado comum na técnica e pode se referir à concentração em e acima da qual micelas estáveis (por exemplo, micelas persistentes) se formam por determinadas relações de (grau de polimerização do bloco A) para (grau de polimerização do bloco B). Concentração fundamental de micela pode ser medida por métodos conhecidos daqueles versados na técnica e incluem, mas são não limitados a medições de tensão de superfície ou medições dinâmicas de dispersão de luz. Em algumas modalidades, a cobertura adicional de superfície de óxido de metal exposta 302 proporcionada pela camada de anti-incrustantes 320 promove a funcionalização seletiva da superfície de silica 304.
[0054] Como mostrado na Figura 3, em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem incluir uma etapa de colocar em contato o substrato (por exemplo, a cavidade de amostra) tendo a camada de envoltório anti-incrustante 320 com um agente de funcionalização 332 que preferivelmente liga a superfície de silica 304. Em algumas modalidades, o agente de funcionalização 332 é capaz de ligar ou a superfície de óxido de metal 302 ou a superfície de silica 304. No entanto, em algumas modalidades, a superfície de óxido de metal 302 é preparada com uma camada de passivação 330 que evita que o agente de funcionalização 332 se ligue à superfície de óxido de metal 302, invariavelmente promovendo a sua ligação seletiva à superfície de silica 304 para gerar uma superfície de silica funcionalizada. Em algumas modalidades, o agente de funcionalização 332 compreende um composto de silano capaz de se ligar à superfície de silica 304. Em algumas modalidades, o composto de silano compreende monoetoxissilano, metoxissilano, dietoxissilano, triclorossilano, ou di-etóxi, metoxissilano.
[0055] Em algumas modalidades, o agente de funcionalização 332
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21/56 compreende uma fração de acoplamento 334. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento 334 pode ser usada para fixar a molécula de interesse à superfície de silica 304. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento 334 pode ser um primeiro parceiro de um par de ligação não covalente. Desse modo, em algumas modalidades, a molécula de interesse que compreende um segundo parceiro do par de ligação não covalente pode ser fixada à superfície de silica 304 através de uma fixação não covalente. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento 334 do agente de funcionalização 332 pode ser uma molécula de biotina, uma proteína avidina, uma proteína estreptavidina, uma proteína lecitina, ou uma SNAP-tag. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento 334 pode ser um primeiro parceiro de um par de ligação covalente (por exemplo, um grupo químico reativo). Desse modo, em algumas modalidades, a molécula de interesse que compreende um segundo parceiro do par de ligação covalente pode ser fixada à superfície de silica 304 através de uma fixação covalente. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento 334 do agente de funcionalização 332 pode ser um grupo amina, um grupo azido, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alquina, ou um grupo sulfidrila. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento 334 é compatível com técnicas de conjugação de química de clique. Grupos químicos reativos capazes de conjugação em química de clique são conhecidos na técnica, por exemplo, New, K., et al. (2009) Cancer Biother. Radiopharm. 24(3):289-302, Thirumurugan, P., et al. (2013) Chem. Rev. 113(7):4905-4979, os conteúdos dos quais estão incorporados aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o processo ilustrado na Figura 3 adicionalmente compreende uma etapa de colocar em contato a cavidade de amostra com o reagente anfipático para formar a camada de revestimento 310 na superfície de óxido de metal 302.
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Reagente antipáticos & Camadas de revestimento
[0056] Como usado aqui, um reagente anfipático se refere a um reagente que pode ser usado para gerar uma camada de revestimento em uma superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, o reagente anfipático é uma molécula que é considerada anfipática pelo fato de que a molécula contém uma primeira porção que é hidrófila com relação à segunda porção, a última das quais é consequentemente hidrófoba com relação à primeira porção. Em algumas modalidades, a porção hidrófila é solúvel em água com relação à porção hidrófoba. Em algumas modalidades, a porção hidrófoba é insolúvel em água com relação à porção hidrófila. Em algumas modalidades, o reagente anfipático contém um grupo dianteiro hidrófilo e um grupo traseiro hidrófobo.
[0057] Um reagente anfipático apropriado pode ser selecionado com base em propriedades desejadas (por exemplo, polaridade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, tamanho, rigidez estrutural, etc.) para promover automontagem da monocamada. Por exemplo, em algumas modalidades, o reagente anfipático pode ser projetado para um sistema de solvente específico por variar a hidrofobicidade do grupo traseiro hidrófobo. Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende um composto de ácido fosfônico de alquila de fórmula CH3(CH2)nPO3H2, onde n é um número inteiro com um valor de 1-30. Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende ácido hexilfosfônico, ácido octilfosfônico, ácido decilfosfônico, ácido dodecilfosfônico, ácido polivinilfosfônico, ácido 12-fosfono-1-dodecanossulfônico, ácido 10-undecinilfosfônico, ou ácido heptadecadecilfosfônico.
[0058] Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende um fluoro tensoativo. Em algumas modalidades, o fluoro tensoativo é um composto de fórmula CF3(CF2)nZ, onde n é um número inteiro com um valor de 1-30 e Z é um grupo dianteiro hidrófilo. Um fluoro
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23/56 tensoativo, também algumas vezes referido como um tensoativo fluorado ou uma substância alquilada perfluorada, é um composto organoflúor sintético tendo múltiplos átomos de flúor. Em algumas modalidades, o fluoro tensoativo pode ser qualquer composto tendo pelo menos um de um grupo de -CF2-, -CF2CF3, ou -CF3. Fluoro tensoativos adequados podem ser selecionados em vista de composições de superfície e outras condições experimentais usadas nos métodos descritos aqui. Por exemplo, fluoro tensoativos e propriedades dos mesmos são descritas na publicação U.S. Copendente No.: US 20060234901, 0 conteúdo da qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Exemplos adicionais de fluoro tensoativos e métodos de sintetizar os mesmos são descritos no Pedido U.S. No.: US 09/570,853, 0 conteúdo do qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[0059] Em algumas modalidades, um grupo dianteiro hidrófilo de um reagente anfipático é um grupo químico (por exemplo, um grupo funcional) capaz de associar com a superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, 0 grupo dianteiro hidrófilo é capaz de quelação com a superfície de metal ou de óxido de metal composição. Um grupo dianteiro hidrófilo apropriado pode ser selecionado em vista das composições de superfície presentes em um substrato (por exemplo, cavidade de amostra). Por exemplo, um grupo dianteiro hidrófilo de um reagente anfipático pode ser projetado de modo que 0 grupo dianteiro preferivelmente se liga à superfície desejada a ser passivada. Assim sendo, em algumas modalidades, 0 grupo dianteiro hidrófilo é projetado para preferivelmente ligar a superfície de óxido de metal sobre uma superfície de silica. Em algumas modalidades, 0 grupo dianteiro hidrófilo é capaz de formar interações de doador de ligações de hidrogênio ou interações de aceitante de ligações de hidrogênio com uma molécula de água. Exemplos de grupos dianteiros hidrófilos incluem, sem limitação, sulfato, sulfite, sulfonato, grupos enxofre, fosfato, fosfonato,
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24/56 hidroxila, catecolato, isocianato, hidroxamato, carboxila, grupos amino, grupos amida, grupo carboxilas, e grupo hidroxilas. Deve ser observado que os grupos químicos descritos aqui não são pretendidos para serem limitados a um estado de protonação ou estado de oxidação particular. Assim, por exemplo, um grupo carboxila como usado aqui se refere a, entre outras coisas, um grupo de ácido carboxílico (R-COOH) e um grupo carboxilato (R-COO).
[0060] Em algumas modalidades, o grupo traseiro hidrófobo pode ser projetado de acordo com condições dependentes de experimento, tais como temperatura do solvente, pH, e resistência iônica. É em geral preferível que o grupo traseiro hidrófobo de um reagente anfipático tenha afinidade inferior para a superfície de metal ou de óxido de metal de um substrato do que grupo dianteiro hidrófilo do reagente anfipático. Em algumas modalidades, o grupo traseiro hidrófobo é configurado para preferivelmente interagir com um bloco desejado de um copolímero de bloco. Em algumas modalidades, pode ser desejável se projetar um grupo traseiro hidrófobo de modo que o mesmo não seja completamente solúvel sob um determinado conjunto de condições experimentais. Por exemplo, em algumas modalidades, limitar a solubilidade aquosa de um grupo traseiro hidrófobo promove automontagem de reagente anfipáticos em formar um revestimento de monocamada. Em algumas modalidades, o grupo traseiro hidrófobo é uma cadeia alifática saturada ou não saturada, substituída ou não substituída, cíclica, ramificada ou não ramificada. Em algumas modalidades, a cadeia alifática compreende 4 a 28 átomos de carbono. Em algumas modalidades, o grupo traseiro hidrófobo compreende uma cadeia alquila C1-C30. [0061] Em algumas modalidades, 0 grupo traseiro hidrófobo do reagente anfipático compreende uma fração de acoplamento covalente. Nas referidas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem colocar em contato a cavidade de amostra com um composto po
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25/56 limérico que é configurado para ligar a fração de acoplamento covalente, desse modo covalentemente fixando o composto polimérico ao reagente anfipático na superfície de óxido de metal. Por exemplo, a Figura 4 ilustra um processo não limitante para passivar a superfície de óxido de metal. Como mostrado, um substrato (por exemplo, a cavidade de amostra) tendo uma superfície de óxido de metal 402 e uma superfície de silica 404 é submetida a uma primeira etapa de passivação (i) que envolve colocar em contato o substrato com um reagente anfipático 442 que compreende uma fração de acoplamento covalente 444. Em algumas modalidades, o reagente anfipático compreende um composto de ácido fosfônico de alquila de fórmula Y(CH2)nPO3H2, onde n é um número inteiro com um valor de 1-30, e Y é uma fração de acoplamento covalente. Em algumas modalidades, a fração de acoplamento covalente compreende um grupo amina, um grupo azido, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alquina, ou um grupo sulfidrila. O reagente anfipático 442 se automonta na superfície de óxido de metal 402 através de um grupo dianteiro hidrófilo, que preferivelmente liga a superfície de óxido de metal 402 sobre a superfície de silica 404. Em algumas modalidades, a superfície de óxido de metal 402 preferivelmente liga o grupo dianteiro hidrófilo sobre a fração de acoplamento covalente do reagente anfipático.
[0062] Em algumas modalidades, como mostrado na Figura 4, o substrato (por exemplo, a cavidade de amostra) é adicionalmente submetido a uma etapa de passivação adicional (ii) que envolve colocar em contato o substrato com um composto polimérico 452 que é configurado para ligar a fração de acoplamento covalente 444 do reagente anfipático 442. Desse modo, o composto polimérico 452 é enxertado ao reagente anfipático 442 na superfície de óxido de metal 402 para proporcionar uma cobertura de superfície mais densa na formação da monocamada que minimiza os campos de superfície expostos
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26/56 de óxido de metal. Em algumas modalidades, o composto polimérico 452 compreende um composto de poliéter. Compostos poliméricos e de poliéter são descritos aqui. Em algumas modalidades, o composto polimérico 452 é selecionado para conferir a superfície de óxido de metal passivada 402 com propriedades anti-incrustantes. Em algumas modalidades, o composto polimérico 452 é selecionado para preferivelmente associar com um copolímero de bloco, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o composto polimérico 452 inclui uma fração 454 que configura o composto polimérico 452 para se ligar à fração de acoplamento covalente 444. Em algumas modalidades, a fração 454 compreende um grupo amina, um grupo azido, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alquina, ou um grupo sulfidrila.
[0063] Em alguns aspectos, os métodos descritos aqui podem ser usados para passivar a superfície de óxido de metal por formar uma camada de revestimento na superfície de óxido de metal. Como usado aqui, a camada de revestimento se refere a uma monocamada que se forma diretamente em uma superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, a camada de revestimento é formada na superfície de óxido de metal por automontagem da monocamada. Em algumas modalidades, a camada de revestimento é uma monocamada ordenada ou desordenada. Em algumas modalidades, a camada de revestimento pode ser uma monocamada ordenada e densamente acondicionada. Em algumas modalidades, a camada de revestimento pode ser uma monocamada homogênea ou heterogênea. Em algumas modalidades, os componentes usados para formar a camada de revestimento são permitidos se automontar na superfície de óxido de metal. Embora não desejando ser limitado pela teoria, acredita-se que a automontagem da monocamada na superfície de óxido de metal ocorra por meio de minimização de energia livre. Por exemplo, os grupos diantei
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27/56 ros hidrófilos do reagente anfipático podem ser preferivelmente atraídos à superfície de óxido de metal, que promove agregação dos grupos dianteiros na superfície de óxido de metal para alcançar a montagem ordenada de uma monocamada. A superfície de óxido de metal pode também ser vista como a matriz em torno da qual os grupos dianteiros do reagente anfipático se congregam, deixando os grupos traseiros hidrófobos do reagente anfipático se estendendo a partir da superfície de óxido de metal. Assim sendo, em algumas modalidades, os grupos traseiros no contexto de uma camada de revestimento são livres para se associar com um copolímero de bloco para gerar uma camada de envoltório anti-incrustante.
Camada de envoltório anti-incrustantes & Couolímeros de bloco
[0064] Como usado aqui, uma camada de envoltório anti-incrustante se refere a uma composição que proporciona ou aumenta a resistência a moléculas biológicas de uma superfície de um artigo ao qual a composição é fixada. Por exemplo, em algumas modalidades, uma camada de envoltório anti-incrustante sobre a superfície de cavidade de amostra (por exemplo, óxido de metal) pode resistir à adesão de biomoléculas, que incluem proteínas, ácidos nucleicos, nucleotídeos, nucleotídeos marcados, células, tecido, e/ou outra matéria biológica com relação à quantidade de adesão ao substrato de referência, ou seja, o mesmo substrato ou um substrato de outro modo funcionalmente equivalente desprovido da camada de envoltório antiincrustante. Em algumas modalidades, uma camada de envoltório antiincrustante sobre a superfície de cavidade de amostra (por exemplo, óxido de metal) pode resistir à adesão de moléculas hidrófobas, tais como componentes hidrófobos usados em reações biológicas (por exemplo, moléculas corantes, nucleotídeos marcados com corantes, nucleotídeos, ácidos nucleicos, etc.). Em algumas modalidades, a quantidade de adesão será reduzida em 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,
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70%, 80%, ou mais, por exemplo, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5%, 99,9%, ou mais, com relação ao substrato de referência. Em algumas modalidades, a camada de envoltório anti-incrustante é substancialmente resistente a enzimas de polimerização e/ou ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a camada de envoltório anti-incrustante é substancialmente resistente a moléculas biológicas presentes em uma amostra de sangue.
[0065] Em algumas modalidades, a camada de envoltório antiincrustante se forma sobre a superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, a camada de envoltório anti-incrustante pode formar sobre a superfície de óxido de metal por interações diretas com a superfície de óxido de metal (por exemplo, quelação com uma composição de óxido de metal). Em algumas modalidades, a camada de envoltório anti-incrustante pode se formar sobre a superfície de óxido de metal através de interações com uma ou mais camadas intermediárias. Por exemplo, em algumas modalidades, a camada de envoltório antiincrustante é formada sobre a superfície de óxido de metal através de interações com a camada de revestimento (por exemplo, a monocamada) na superfície de óxido de metal. Em algumas modalidades, a camada de envoltório anti-incrustante interage com a camada de revestimento em virtude de um efeito hidrófobo. O efeito hidrófobo se refere à tendência das moléculas hidrófobas se agregarem em solução aquosa e excluem as moléculas de água. Em algumas modalidades, propriedades anti-incrustantes são conferidas nas superfícies de óxido de metal por colocar em contato a superfície de óxido de metal tendo a camada de revestimento com um copolímero de bloco que preferivelmente liga a camada de revestimento.
[0066] Como usado aqui, um copolímero de bloco se refere a polímeros tendo mais do que um bloco polimérico, cada um tendo uma estrutura distinta a partir daquela de um bloco adjacente. Toda a estru
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29/56 tura, que engloba todos os blocos, forma o copolímero de bloco. Copolímeros de bloco com dois ou três blocos distintos são chamados de copolímeros de dibloco ou de tribloco, respectivamente. Em algumas modalidades, cada bloco de um copolímero é representado por uma letra (por exemplo, bloco A, bloco B bloco, bloco C, etc.), onde cada letra denota o bloco A do copolímero tendo uma composição estrutural distinta que o que dá origem a propriedades distintas para aquele bloco do copolímero. Em algumas modalidades, cada bloco é compreendido de um ou mais tipos de unidades monoméricas ou constitucionais que podem ser selecionadas com base em uma propriedade desejada, tais como hidrofobicidade ou hidrofilicidade, a ser conferida naquele bloco com relação a outro bloco dentro do copolímero de bloco. Por exemplo, em algumas modalidades, um copolímero de bloco como descrito aqui é um Copolímero de tribloco do tipo A-B-A tendo um bloco A e um bloco B, onde o bloco B é hidrófobo com relação ao bloco A. Em algumas modalidades, um copolímero de bloco como descrito aqui é um copolímero de dibloco do tipo A-B tendo um bloco A e um bloco B, onde o bloco B é hidrófobo com relação ao bloco A.
[0067] Em algumas modalidades, um copolímero de tribloco tem três blocos distintos, que podem ser de blocos alternados hidrófilo (A) e hidrófobo (B). A Figura 5 geralmente ilustra configurações não limitantes de copolímeros de bloco e porções dos mesmos. Como mostrado, um copolímero de tribloco do tipo A-B-A 502 pode incluir um bloco B compreendido de um primeiro conjunto de unidades monoméricas (círculos hachurados) ladeados em cada lado por blocos A compreendidos de um segundo conjunto de unidades monoméricas (círculos abertos). Em algumas modalidades, o copolímero de bloco do tipo A-B-A pode ser representado por fórmula I: (Aa)(Bb)(Aa), onde A é uma unidade monomérica de uma estrutura polimérica que compreende o
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30/56 bloco A, a é o grau de polimerização do bloco A e um número inteiro com um valor de 2-150, B é uma unidade monomérica de uma estrutura polimérica que compreende o bloco B, e b é o grau de polimerização do bloco A e um número inteiro com um valor de 10-100.
[0068] Em algumas modalidades, qualquer um dos blocos A ou B pode, por si, ser um copolímero. Por exemplo, em algumas modalidades, um bloco A e/ou um bloco B de um copolímero de bloco pode incluir dois ou mais tipos de unidades monoméricas. Em algumas modalidades, as unidades monoméricas podem estar presentes dentro do bloco A e/ou do bloco B como monômeros alternados 504. Em algumas modalidades, as unidades monoméricas podem estar presentes dentro do bloco A e/ou do bloco B em uma configuração aleatória 506. Em algumas modalidades, a interface química na junção do copolímero pode ser afunilada. Por exemplo, em algumas modalidades, um bloco A e um bloco B podem ser separados por uma interface afunilada 508 de modo que as unidades monoméricas do bloco A fazem uma transição gradual para as unidades monoméricas do bloco B. Assim, deve ser observado que, como usado aqui, os termos bloco A e bloco B podem em geral se referir a blocos de um copolímero de bloco tendo diferentes propriedades hidrófobas/hidrófilas relativas, e não deve ser construída como limitante de qualquer um dos blocos a uma unidade monomérica específica.
[0069] Em algumas modalidades, uma generalização esquemática de um copolímero de tribloco pode ser representada pela fórmula [AaBbCc. . .]a[XxYyZz. . . ]í>[AaBí)Cc. . .]a, onde cada letra significa uma unidade monomérica, cada subscrito a uma unidade monomérica representa a fração molar daquela unidade no bloco particular, os três pontos indicam que podem haver mais ou menos unidades monoméricas em cada bloco, e a e b indicam os graus de polimerização dos blocos A e B, respectivamente. Como sugerido pelo desenho esque
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31/56 mático, em algumas modalidades, o número e a natureza de cada unidade constitucional pode ser separadamente controlada para cada bloco. O desenho esquemático não é significa e não deve ser construído de modo a inferir qualquer relação entre o número de unidades constitucionais ou o número de diferentes tipos de unidades constitucionais em cada um dos blocos, nem o desenho esquemático pretende descrever qualquer número ou arranjo particular das unidades constitucionais dentro de um bloco particular. Em cada bloco A, unidades constitucionais podem ser dispostas em uma configuração puramente aleatória, uma aleatória alternativa, uma alternada regular, um bloco regular, ou um bloco aleatório a não ser que expressamente determinado de outro modo.
[0070] Em algumas modalidades, um copolímero de bloco pode incluir uma configuração ramificada. Por exemplo, a Figura 5 ilustra um exemplo de um bloco ramificado 510 de um copolímero de bloco, onde uma ou mais unidades monoméricas dentro de um determinado bloco pode ser conectado a mais do que duas unidades monoméricas adjacentes. Em algumas modalidades, um copolímero de bloco como descrito aqui pode ser configurado como um copolímero de escova 512. Desse modo, um primeiro polímero de bloco (círculos sombreados) pode ser projetado para preferivelmente interagir com a camada de revestimento enquanto que o segundo polímero de bloco (círculos abertos) se estende para fora e pode ser projetado para proporcionar propriedades anti-incrustantes.
[0071] Em algumas modalidades, pelo menos um bloco (por exemplo, um bloco A e/ou um bloco B) de um copolímero de bloco compreende uma composição tendo propriedades anti-incrustantes. Em algumas modalidades, pelo menos um bloco (por exemplo, um bloco A e/ou um bloco B) de um copolímero de bloco tem uma composição eletricamente neutra, uma composição hidrófila, e/ou uma com
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32/56 posição que compreende doadores de ligação de hidrogênio, mas não aceitantes de ligação de hidrogênio. Em algumas modalidades, pelo menos um bloco (por exemplo, um bloco A e/ou um bloco B) de um copolímero de bloco compreende um poliacrilato (por exemplo, a poliacrilato que compreende cadeias laterais ligadas a uretano), um oligossacarídeo, um poliuretano (por exemplo, um poliuretano segmentado termoplástico), ou um poliéter (por exemplo, um poli(etileno glicol), a poli(óxido de etileno), a poli(propileno glicol), a poli(butileno glicol)), ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, cada bloco (por exemplo, um bloco A e/ou um bloco B) de um copolímero de bloco compreende um respectivo poliacrilato (por exemplo um poliacrilato que compreende cadeias laterais ligadas a uretano), um oligossacarídeo, um poliuretano (por exemplo, um poliuretano segmentado termoplástico), ou um poliéter (por exemplo, um poli(etileno glicol), um poli(óxido de etileno), um poli(propileno glicol), um poli(butileno glicol)), ou uma combinação dos mesmos.
[0072] Em algumas modalidades, pelo menos um bloco de um copolímero de bloco é uma estrutura polimérica que compreende um poliéter. Em algumas modalidades, cada bloco de um copolímero de bloco é uma estrutura polimérica que compreende um poliéter. Em algumas modalidades, pelo menos um bloco é uma estrutura oligomérica ou estrutura polimérica de unidades monoméricas compreendidas de uma unidade de repetição de óxido de etileno (-CH2CH2O-). Em algumas modalidades, 0 bloco A compreende um primeiro bloco de poliéter e 0 bloco B compreende um segundo bloco de poliéter que é mais hidrófobo do que 0 primeiro bloco de poliéter. Em algumas modalidades, 0 bloco A compreende óxido de polietileno e 0 bloco B compreende óxido de polipropileno. Em algumas modalidades, 0 bloco A e/ou 0 bloco B compreende uma mistura de óxido de polietileno e óxido de polipropileno, onde a mistura não altera a hidrofobicidade relativa do
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33/56 bloco B em comparação ao bloco A. Em algumas modalidades, o copolímero de bloco do tipo A-B-A é um composto de fórmula II:
a
JóL a
(Fórmula II), onde a é um número inteiro com um valor de 2-150 e b é um número inteiro com um valor de 10-100. Em algumas modalidades, a é um valor de 10-30 inclusive, e b é um valor de 40-100 inclusive. Em algumas modalidades, a é um valor de cerca de 20, e b é um valor de cerca de 70. Em algumas modalidades, a é um valor de 80-120 inclusive, e b é um valor de 35-95 inclusive. Em algumas modalidades, a é um valor de cerca de 100, e b é um valor de cerca de 65.
[0073] Em algumas modalidades, um copolímero de bloco, tal como um copolímero de tribloco, pode ter limitações estruturais para proporcionar uma necessidade funcional específica. Por exemplo, o peso molecular total (por exemplo, uma base ponderai molecular média, ou um número médio de peso molecular) do copolímero de bloco pode ser suficientemente baixo de modo que o polímero é um líquido a 25 °C ou tem uma viscosidade máxima especificada a 25 °C. Em algumas modalidades, o peso molecular total (por exemplo, base ponderai molecular média) do copolímero de bloco pode ser determinado usando um goniômetro para determinar a funcionalização da superfície seguido por análise usando espectrometria de massa de íon secundário de tempo de voo. Em algumas modalidades, o peso molecular total (por exemplo, base ponderai molecular média) do copolímero de bloco pode ser, por exemplo, cerca de 7,000 g/mol ou menos, ou cerca de
6,500 g/mol ou menos, ou cerca de 6,000 g/mol ou menos, ou cerca de 5,500 g/mol ou menos, ou cerca de 5,000 g/mol ou menos, ou cerca de , ou cerca de 4,500 g/mol ou menos, ou cerca de 4,000 g/mol ou menos, ou cerca de 3,500 g/mol ou menos, ou cerca de 3,000 g/mol, ou cerca de 2,500 g/mol ou menos, ou cerca de 2,000 g/mol ou me
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34/56 nos, ou cerca de 1,500 g/mol ou menos, ou cerca de 1,000 g/mol ou menos. Em algumas modalidades, o peso molecular total do copolímero de bloco é entre 600 g/mol e 1,500 g/mol.
[0074] Em algumas modalidades, o peso molecular de um bloco específico dentro do polímero pode ser especificado para proporcionar uma característica específica ao copolímero de bloco. Por exemplo, o peso molecular do bloco B em um copolímero de bloco do tipo A-B-A pode ser variado com relação ao peso molecular total do copolímero de bloco para alterar a extensão na qual o bloco B interage com a camada de revestimento. A: 44.05 (881), B: 58.08 (4065). Em algumas modalidades, o peso molecular do bloco B pode constituir entre cerca de 30% a cerca de 40%, entre cerca de 40% a cerca de 50%, entre cerca de 50% a cerca de 60%, entre cerca de 60% a cerca de 70%, entre cerca de 70% a cerca de 80%, ou mais de o peso molecular total do copolímero de bloco do tipo A-B-A.
Funcionalização
[0075] Em determinadas modalidades, as técnicas descritas aqui podem ser usadas para confinar a molécula de interesse a uma região desejada de uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, a região desejada pode ser referida como um volume alvo ou um volume de reação. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra ocupa um volume ou espaço definido por uma abertura formada em uma superfície de um dispositivo integrado que se estende através de uma primeira camada e para dentro de uma segunda camada do dispositivo integrado a uma superfície de fundo distai à abertura. Em algumas modalidades, as superfícies expostas da primeira camada e da segunda camada disposta entre a abertura e a superfície de fundo de uma cavidade de amostra pode ser referida como paredes laterais que adicionalmente definem o volume ou espaço ocupado pela cavidade de amostra.
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[0076] Em algumas modalidades, a primeira camada é uma camada de revestimento de metal. Em algumas modalidades, a camada de revestimento de metal compreende um ou mais tipos de metais (por exemplo, alumínio, titânio, zircônio, ferro, estanho, tântalo, etc.). Em algumas modalidades, as porções de superfície expostas da primeira camada compreendem um óxido de metal. Em algumas modalidades, a segunda camada é um material transparente ou vidro. Em algumas modalidades, as porções de superfície expostas da segunda camada compreendem silica fundida ou dióxido de silício. Em algumas modalidades, as paredes laterais de uma cavidade de amostra são compostas de pelo menos uma porção de cada uma das porções de superfície expostas das primeira e segunda camadas. Em algumas modalidades, a superfície de fundo de uma cavidade de amostra compreende silica. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção das paredes laterais adjacentes à superfície de fundo compreende silica.
[0077] Em modalidades quando uma ou mais moléculas ou complexo (por exemplo, uma matriz de sequenciamento) é imobilizada em uma superfície de fundo, pode ser desejável se funcionalizar a superfície de fundo para permitir a fixação de uma ou mais moléculas ou complexos. Em determinadas modalidades, a superfície de fundo compreende um vidro transparente. Em determinadas modalidades, a superfície de fundo compreende silica fundida ou dióxido de silício. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um silano. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um polímero ionicamente carregado. Em algumas modalidades, o polímero ionicamente carregado compreende poli(lisina). Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com poli(lisina)-enxerto-poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com albumina de soro bovino biotinilado (BSA).
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[0078] Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia alquila. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia de poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um silano que compreende um grupo de acoplamento. Por exemplo o grupo de acoplamento pode compreender frações químicas, tais como grupos aminas, grupos carboxilas, grupos hidroxilas, grupos sulfidrilas, metais, quelantes, e semelhante. Alternativamente, as mesmas podem incluir elementos de ligação específicos, tais como biotina, avidina, estreptavidina, neutravidina, lectinas, SNAP-tags™ ou substratos dos mesmos peptídeos ou proteínas de ligação ou associativas, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico, ou semelhante. Adicionalmente, ou alternativamente, o grupo de acoplamento pode ser usado para acoplar um grupo adicional que é usado para acoplar ou ligar com a molécula de interesse, que pode, em alguns casos incluir não só grupos químicos funcionais e elementos de ligação específicos. Por meio de exemplo, um grupo de acoplamento, por exemplo, biotina, pode ser depositado sobre uma superfície de substrato e seletivamente ativado em uma determinada área. Um agente de ligação intermediário, por exemplo, estreptavidina, pode então ser acoplado ao primeiro grupo de acoplamento. A molécula de interesse, que nesse exemplo particular pode ser biotinilada, é então acoplada à estreptavidina.
[0079] Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um silano que compreende biotina, ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia de poli(etileno) gli
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37/56 col, em que a cadeia de poli(etileno glicol) compreende biotina. Em determinadas modalidades, a superfície de fundo é funcionalizada com uma mistura de silanos, em que pelo menos um tipo de silano compreende biotina e pelo menos um tipo de silano não compreende biotina. Em algumas modalidades, a mistura compreende cerca de 10 vezes menos, cerca de 25 vezes menos, cerca de 50 vezes menos, cerca de 100 vezes menos, cerca de 250 vezes menos, cerca de 500 vezes menos, ou cerca de 1000 vezes menos do silano biotinilado do que o silano que não compreende biotina.
Moléculas de Interesse
[0080] Em alguns aspectos, a descrição proporciona técnicas úteis para confinar a molécula de interesse a uma região desejada de uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui envolvem etapas de colocar em contato a cavidade de amostra tendo uma superfície funcionalizada com a molécula de interesse que é configurada para ligar a superfície funcionalizada.
[0081] Em algumas modalidades, a molécula de interesse é a enzima de polimerização. Os termos polimerase e enzima de polimerização, como usado aqui, em geral se refere a qualquer enzima capaz de catalisar a reação de polimerização. Exemplos de polimerases incluem, sem limitação, um ácido nucleico polimerase, uma transcriptase ou uma ligase. A polimerase pode ser uma enzima de polimerização. Modalidades direcionadas em direção a uma extensão de ácido nucleico de molécula única (por exemplo, para o sequenciamento de ácido nucleico) pode usar qualquer polimerase que é capaz de sintetizar um ácido nucleico complementar a uma molécula-alvo de ácido nucleico. Em algumas modalidades, uma polimerase pode ser uma DNA polimerase, uma RNA polimerase, uma transcriptase reversa, e/ou um mutante ou forma alterada de um ou mais do mesmo. Em algumas modalidades, a polimerase pode ser qualquer polimerase selecionada
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38/56 a partir do pedido provisório U.S. copendente No.: 62/436,410, depositado em 19 de dezembro de 2016, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[0082] Em algumas modalidades, a molécula de interesse é uma matriz de sequenciamento. Como usado aqui, a matriz de sequenciamento é a molécula que é o objeto de uma análise (por exemplo, uma análise de sequenciamento). Em algumas modalidades, a matriz de sequenciamento compreende uma molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é referida como um ácido nucleico alvo ou matriz. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende pelo menos um complexo de primer hibridizado/enzima de polimerização. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é colocada em contato com um primer de sequenciamento que é complementar à porção de uma molécula de ácido nucleico de modo que o primer de sequenciamento enrijece a molécula de ácido nucleico. A referida localização de preparação gera um campo no qual a enzima de polimerização (por exemplo, um DNA ou RNA polimerase) pode acoplar a uma molécula de ácido nucleico para formar um complexo de primer hibridizado/enzima de polimerização. Assim sendo, em algumas modalidades, a molécula de interesse é um complexo de modelos de sequenciamento que compreende a molécula de ácido nucleico matriz tendo um complexo de primer hibridizado/enzima de polimerização.
[0083] Em algumas modalidades, o colocar em contato a cavidade de amostra com a molécula de interesse ocorre subsequente ao colocar em contato a cavidade de amostra com o agente de funcionalização sem uma etapa de lavagem intermediária.
[0084] Em algumas modalidades, a molécula de interesse preferivelmente liga a superfície de silica funcionalizada sobre a superfície de óxido de metal passivada com seletividade de cerca de 100 vezes a
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39/56 cerca de 1000 vezes, seletividade de cerca de 200 vezes a cerca de 800 vezes, seletividade de cerca de 400 vezes a cerca de 600 vezes, ou seletividade de cerca de 1000 vezes a cerca de 2000 vezes. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de interesse preferivelmente liga a superfície de silica funcionalizada com cerca de 80 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, ou cerca de 2000 vezes ou mais de seletividade.
[0085] Em algumas modalidades, a seletividade da molécula de interesse para a superfície de silica funcionalizada sobre a superfície de óxido de metal passivada é maior em comparação à cavidade de amostra não colocada em contato com o copolímero de bloco por cerca de 10 vezes a cerca de 100 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 1000 vezes, ou cerca de 200 vezes a cerca de 400 vezes. Por exemplo, em algumas modalidades, a seletividade da molécula de interesse para a superfície de silica funcionalizada sobre a superfície de óxido de metal passivada é maior em comparação à cavidade de amostra não colocada em contato com o copolímero de bloco por cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, ou cerca de 1000 vezes ou mais.
Carregamento da Amostra
[0086] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a técnicas útil para preparar uma ou mais superfícies de uma cavidade de amostra. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente descrição
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40/56 proporciona métodos e composições para funcionalizar a superfície de uma cavidade de amostra. A amostra que compreende uma ou mais composições descritas aqui pode ser adicionada a um substrato que compreende a cavidade de amostra por qualquer número de métodos adequados. Em algumas modalidades, a amostra é carregada por um técnico, por exemplo, por meio de uma pipeta, um dispensador, ou qualquer adequada dispositivo/sistema de transferência de fluido. Em algumas modalidades, a amostra é carregada por meios automatizados (por exemplo, um dispositivo/sistema robótico). Em algumas modalidades, a amostra é carregada por meio de um ou mais canais microfluid icos.
[0087] Em algumas modalidades, a amostra pode ser enviada a um substrato (por exemplo, um dispositivo integrado que compreende cavidades de amostra, uma estrutura) por métodos que são em geral usados para enviar moléculas a um dispositivo analítico. Por exemplo, métodos de envio podem incluir suspender uma ou mais das composições descritas aqui em um fluido e fluindo a suspensão resultante em um substrato. Isso pode incluir simplesmente pipetar a suspensão relevante em uma ou mais regiões do substrato, ou pode incluir mais métodos de fluxo ativo, tais como eletrodireção ou fluxo de fluido com base em pressão. Em algumas modalidades, a amostra é fluida para dentro de regiões selecionadas do substrato, por exemplo, onde a superfície desejada tem que ser funcionalizada em uma região particular de um substrato. Regiões de um substrato podem também ser alvos seletivos de envio simplesmente por pipetar a suspensão relevante na região correta do substrato. Em algumas modalidades, os reagentes, copolímeros, moléculas, produtos químicos, composições, e/ou substâncias descritas aqui são carregadas em uma cavidade de amostra de acordo com técnicas descritas no pedido provisório U.S. copendente No.: 62/436,407, depositado em 19 de dezembro de 2016, o conte
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41/56 údo do qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[0088] Como descrito aqui, aspectos da descrição proporcionam métodos de preparar a cavidade de amostra usando um ou mais de um reagente anfipático, um copolímero de bloco, um agente de funcionalização, e uma molécula de interesse. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra pode ser exposta a dois ou mais dos referidos componentes em aproximadamente no mesmo tempo. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a cada um dos referidos componentes em um modo em etapas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um reagente anfipático e um copolímero de bloco aproximadamente ao mesmo tempo para gerar uma superfície passivada. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um reagente anfipático antes de outros componentes para gerarem a camada de revestimento. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um reagente anfipático por um período de tempo que excede o período de tempo no qual a cavidade de amostra é exposta a um copolímero de bloco. Por exemplo, em algumas modalidades, o reagente anfipático gera uma camada de revestimento através de um processo de automontagem molecular que pode requerer um período de incubação mais longo com a cavidade de amostra tendo a superfície de óxido de metal.
[0089] Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um reagente anfipático por um período de aproximadamente 24 horas para formar uma camada de revestimento antes da cavidade de amostra ser exposta a um copolímero de bloco. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta ao reagente anfipático por um período de aproximadamente 4 a 8 horas, aproximadamente 8 a 12 horas, aproximadamente 12 a 16 horas, aproximadamente 16 a 20 horas, aproximadamente 20 a 24 horas, aproximadamente 24 a 28 horas, aproximadamente 28 a 32 horas, aproximadamente 32 a 36 horas,
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42/56 aproximadamente 36 a 40 horas, aproximadamente 40 a 44 horas, aproximadamente 44 a 48 horas ou mais, para formar a camada de revestimento antes de uma cavidade de amostra ser exposta ao copolímero de bloco. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra tendo uma camada de revestimento ser exposta a um copolímero de bloco por um período de aproximadamente 2 horas antes da cavidade de amostra ser exposta a um agente de funcionalização. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra tendo uma camada de revestimento é exposta ao copolímero de bloco por um período de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas ou mais, para formar uma camada de anti-incrustantes sobre a superfície de óxido de metal.
[0090] Em algumas modalidades, a cavidade de amostra tendo uma camada de anti-incrustantes é exposta a um agente de funcionalização por aproximadamente 1 a 2 horas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um agente de funcionalização por aproximadamente 30 minutos. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um agente de funcionalização por aproximadamente 1 hora. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um agente de funcionalização por aproximadamente 2 horas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um agente de funcionalização por aproximadamente 30 a 90 minutos. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um agente de funcionalização por aproximadamente 3 horas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a um agente de funcionalização por mais do que 3 horas.
[0091] Em algumas modalidades, a cavidade de amostra tendo uma superfície de silica funcionalizada é exposta a uma molécula de
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43/56 interesse por aproximadamente 1 a 2 horas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a uma molécula de interesse por aproximadamente 30 minutos. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a uma molécula de interesse por aproximadamente 1 hora. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a uma molécula de interesse por aproximadamente 2 horas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a uma molécula de interesse por aproximadamente 30 a 90 minutos. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a uma molécula de interesse por aproximadamente 3 horas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é exposta a uma molécula de interesse for mais do que 3 horas.
Preparação da Amostra
[0092] Em algumas modalidades, a amostra que compreende um ácido nucleico alvo pode ser extraída a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou outro indivíduo). Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um paciente. Em algumas modalidades, um ácido nucleico alvo pode ser detectado e/ou sequenciado por diagnóstico, prognóstico, e/ou objetivos terapêuticos. Em algumas modalidades, informação para um teste de sequenciamento pode ser útil para assistência no diagnóstico, prognóstico, e/ou tratamento de uma doença ou condição. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser suspeito de ter uma condição de saúde, tal como uma doença (por exemplo, câncer). Em algumas modalidades, o indivíduo pode estar sofrendo tratamento para uma doença.
[0093] Em algumas modalidades, a amostra biológica pode ser extraída a partir de um fluido corporal ou tecido de um indivíduo, tais como respiração, saliva, urina, sangue (por exemplo, sangue total ou plasma), fezes, ou outro fluido corporal ou amostra de biopsia. Em al
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44/56 guns exemplos, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são extraídas a partir do fluido corporal ou tecido do indivíduo. O um ou mais ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir de uma ou mais células obtidas a partir do indivíduo, tais como parte de um tecido do indivíduo, ou obtido a partir de um fluido corporal livre de célula do indivíduo, tais como sangue total.
[0094] A amostra biológica pode ser processada em preparação para detecção (por exemplo, sequenciamento). O referido processamento pode incluir isolamento e/ou purificação da biomolécula (por exemplo, molécula de ácido nucleico) a partir da amostra biológica, e a geração de mais cópias da biomolécula. Em alguns exemplos, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são isoladas e purificadas a partir de um fluido corporal ou tecido do indivíduo, e amplificado através de amplificação de ácido nucleico, tal como reação de cadeia de polimerase (PCR). Então, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico ou subunidades das mesmas podem ser identificadas, tais como através de sequenciamento. No entanto, em algumas modalidades as amostras de ácido nucleico podem ser avaliadas (por exemplo, sequenciadas) sem necessitar de amplificação.
[0095] Como descrito no presente pedido, sequenciamento pode incluir a determinação de subunidades individuais de uma biomolécula matriz (por exemplo, molécula de ácido nucleico) por sintetizar outra biomolécula que é complementar ou análoga à matriz, tal como por sintetizar a molécula de ácido nucleico que é complementar à molécula de ácido nucleico matriz e identificar a incorporação de nucleotídeos com o tempo (por exemplo, sequenciamento por síntese). Como uma alternativa, o sequenciamento pode incluir a identificação direta de subunidades individuais da biomolécula.
Sequenciamento
[0096] Em alguns aspectos, métodos e dispositivos descritos aqui
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45/56 podem ser usados em tecnologias analíticas que permitem a detecção de uma molécula individual ou partícula em uma amostra. A molécula individual pode ser, por meio de exemplo e não limitação, um amino ácido, um polipeptídeo, um nucleotídeo, um ácido nucleico, ou uma variante do mesmo que compreende uma fração detectável. Por exemplo, em algumas modalidades, métodos e composições proporcionadas na presente descrição podem ser usados em conjunto com tecnologias de sequenciamento de ácido nucleico de molécula única. Sequenciamento de ácido nucleico de molécula única permite a determinação de uma sequência de uma única molécula de ácido nucleico por monitorar, em tempo real, a extensão de uma molécula de ácido nucleico que é complementar à matriz ácido nucleico.
[0097] Em algumas modalidades, os aspectos do presente pedido podem ser usados em métodos relacionados a testes de amostras biológicas. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados aqui são úteis em técnicas usadas para determinar a sequência de um ou mais ácidos nucleicos ou polipeptídeos em uma amostra e/ou para determinar a presença ou ausência de uma ou mais variantes de ácido nucleico ou polipeptídeo (por exemplo, uma ou mais mutações em um gene de interesse) na amostra. Em algumas modalidades, testes podem ser realizados em amostras do paciente (por exemplo, amostras de paciente humano) para proporcionar informação de sequência de ácido nucleico ou para determinar a presença ou a ausência de um ou mais ácidos nucleicos de interesse para diagnóstico, prognóstico, e/ou objetivos terapêuticos. Em alguns exemplos, testes de diagnóstico podem incluir o sequenciamento da molécula de ácido nucleico em uma amostra biológica de um indivíduo, por exemplo por sequenciamento moléculas de DNA livres de células e/ou os produtos de expressão (por exemplo, RNA) em uma amostra biológica do indivíduo. Por exemplo, a presente descrição proporciona métodos e composições
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46/56 que podem ser vantajosamente utilizadas nas tecnologias descritas nos Pedidos de Patente
U.S. copendentes Nos.:
14/543,865,
14/543,867,
15/161,067,
15/255,624,
15/847,001,
14/543,888,
15/161,088,
15/261,697,
62/289,019,
14/821,656,
15/161,125,
15/261,724,
62/296,546,
14/821,686,
15/255,245,
15/600,979,
62/310,398,
14/821,688
15/255,303
15/846,967
62/339,790
62/343,997, 62/344,123, 62/426,144, 62/436,407, e 62/436,410, os conteúdos de cada um dos quais estão incorporados aqui por referência.
[0098] Alguns aspectos do pedido são úteis em técnicas capazes de sequenciamento polímeros biológicos, tais como ácidos nucleicos e proteínas. Em algumas modalidades, os métodos e composições descritos no pedido podem ser usados em técnicas que identificam uma série de nucleotídeos ou monômeros de amino ácido que são incorporados em um ácido nucleico ou proteína (por exemplo, por detectar um curso de tempo de incorporação de uma série de monômeros de nucleotídeo ou amino ácidos marcados). Em algumas modalidades, os métodos e composições descritas no pedido podem ser incorporados nas técnicas que identificam uma série de nucleotídeos que são incorporados dentro de um produto de reação de sequenciamento de ácido nucleico dependente de matriz sintetizado por uma enzima de polimerização em uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, a enzima de polimerização pode ser fixada a uma região desejada de uma cavidade de amostra usando técnicas de funcionalização altamente seletiva de superfície descritas aqui.
[0099] Em algumas modalidades, um complexo que compreende uma polimerase, um ácido nucleico alvo e um primer é formado em solução e o complexo é imobilizado a um suporte sólido (por exemplo, via imobilização da polimerase, primer, e/ou ácido nucleico alvo). Cavidades de amostra
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[00100] Em alguns aspectos, a descrição proporciona um dispositivo integrado que compreende um substrato que compreende uma cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado adicionalmente compreende uma camada de revestimento na superfície de óxido de metal formada por um reagente anfipático que compreende um grupo dianteiro hidrófilo e um grupo traseiro hidrófobo. Em algumas modalidades, o reagente anfipático é ligado à superfície de óxido de metal através do grupo dianteiro hidrófilo. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado adicionalmente compreende uma camada de envoltório anti-incrustante na camada de revestimento formada por um copolímero de bloco do tipo A-B-A que compreende um bloco A e um bloco B. Em algumas modalidades, o copolímero de bloco do tipo A-B-A é ligado à camada de revestimento através do bloco
B. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado adicionalmente compreende um agente de funcionalização ligado à superfície de silica, em que o agente de funcionalização compreende uma fração de acoplamento.
[00101] Em algumas modalidades, o substrato compreende uma estrutura de cavidades de amostra, cada cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra compreende uma abertura de topo formada em uma superfície do substrato e uma superfície de fundo distai à superfície do substrato. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é compreendida por uma superfície de silica. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado é configurado para interagir com um instrumento de sequenciamento de próxima geração.
[00102] Como usado aqui, um dispositivo integrado é um dispositivo capaz de interfacear com um instrumento de base. Em algumas modalidades, um dispositivo integrado pode compreender uma ou
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48/56 mais cavidades de amostra e/ou sensores. Em algumas modalidades, um dispositivo integrado pode ser capaz de interfacear com um instrumento de base que emite ou detecta luz. Nas referidas modalidades, o dispositivo integrado pode compreender uma ou mais cavidades de amostra, cada uma das quais inclui um guia de onda.
[00103] Um dispositivo integrado do tipo descrito aqui pode compreender uma ou mais cavidades de amostra configuradas para receber moléculas de interesse nas mesmas. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra recebe uma molécula de interesse que pode ser disposta em uma superfície de uma cavidade de amostra, tal como uma superfície de fundo. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra é formada dentro de um dispositivo integrado, em que a superfície de fundo de uma cavidade de amostra é distai à superfície do dispositivo integrado dentro do qual a mesma é formada. Em algumas modalidades, a superfície de fundo na qual a molécula de interesse tem que ser disposta pode ter uma distância a partir de um guia de onda que é configurado para excitar a molécula de interesse com um nível desejado de energia de excitação. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra pode ser posicionada, com relação a um guia de onda, de modo que um campo evanescente de um modo ótico se propaga ao longo da guia de onda se sobrepõe com a molécula de interesse.
[00104] A cavidade de amostra pode ter uma abertura de topo em uma superfície de um dispositivo integrado através do qual uma molécula de interesse pode ser disposta em uma cavidade de amostra. O tamanho da abertura de topo pode depender de diferentes fatores, tais como o tamanho das moléculas de interesse (por exemplo, matrizes de sequenciamento, enzimas de polimerização) em uma amostra sendo carregada. Em algumas modalidades, o tamanho da abertura de topo pode depender do instrumento ou aparelho no qual o dispositivo
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49/56 integrado que compreende a cavidade de amostra é sendo utilizada. Por exemplo, em dispositivos que detectam a luz a partir de dentro de uma cavidade de amostra, os sinais de fundo podem resultar a partir de luz dispersa. Quando a molécula de interesse é disposta em uma cavidade de amostra e excitada com energia de excitação, os sinais de fundo podem causar flutuações indesejadas na energia de emissão, assim tornando a medição ruidosa. Para limitar as referidas flutuações, o tamanho da abertura de topo pode ser configurado para bloquear pelo menos uma porção dos sinais de fundo.
[00105] O volume de uma cavidade de amostra pode ser entre cerca de 10’21 litros e cerca de 10’15 litros, em algumas implementações. Pelo fato da cavidade de amostra ter um pequeno volume, a detecção de eventos de amostra única (por exemplo, eventos de molécula única) podem ser possíveis embora as moléculas de interesse possam ser concentradas em um espécime examinado em concentrações que são similares às encontradas em ambientes naturais. Por exemplo, concentrações micromolares da molécula de interesse podem estar presentes em um espécime que é disposto em contato com o dispositivo integrado, mas a nível de pixel apenas cerca de uma molécula de interesse (ou evento de molécula única) pode estar dentro de uma cavidade de amostra a qualquer determinado tempo.
[00106] Estatisticamente, algumas cavidades de amostra podem conter nenhuma molécula de interesse e algumas podem conter mais do que uma molécula de interesse. No entanto, um número apreciável de cavidades de amostra pode conter uma única molécula de interesse (por exemplo, pelo menos 30% em algumas modalidades), de modo que a análise de uma molécula única pode ser realizada em paralelo para um grande número de cavidades de amostra. Pelo fato de que eventos de molécula única ou de amostra única podem ser analisados em cada cavidade de amostra, o dispositivo integrado torna possível
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50/56 se detectar eventos individuais que poderíam de outro modo passar despercebidos nas médias de conjunto.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Molhabilidade aprimorada na superfície de óxido de metal usando copolímero de bloco
[00107] Um processo para passivação de uma superfície de óxido de metal foi avaliado por experimentos de molhabilidade. Um cupom tendo regiões de superfície compostas de TiO2 e SiO2 foi submetido a um processo de duas etapas que envolveu a formação de uma camada de revestimento e formação subsequente de uma camada de envoltório anti-incrustante. Para os objetivos dos referidos experimentos, ácido hexilfosfônico (HPA) foi usado para gerar uma camada de revestimento, e copolímero de tribloco Pluronic P123 (HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH) foi usado para gerar a camada de anti-incrustantes.
[00108] O cupom TiO2/SiO2 foi exposto a HPA por um período de 24 horas para permitir a automontagem da monocamada de HPA na superfície de TiO2. Em seguida da passivação de HPA, a molhabilidade da superfície foi avaliada por medições de ângulo de contato, com gotículas no lado TiO2 do cupom medindo aproximadamente 85° e gotículas no lado SiO2 medindo aproximadamente 15°. Um gráfico de ângulo de contato como uma função do tempo indicou que 0 ângulo de contato de gotícula permaneceu estável na superfície de TiO2 passivada a HPA após duas horas.
[00109] Em seguida da passivação com HPA, 0 cupom de TiO2/SiO2 foi exposto ao copolímero de tribloco por duas horas. Mais uma vez, as medições de ângulo de contato foram obtidas para cada lado do cupom. A molhabilidade no lado do SiO2 aparentemente não foi afetada pela etapa do copolímero de tribloco, com 0 ângulo de contato mantendo em aproximadamente 15°. Isso pode sugerir que a hidrofilicidade de SiO2 é inalterada pela adição de copolímero de bloco.
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Em contraste, o lado de TiO2 do cupom apresentou um aumento mensurável em molhabilidade, com ângulo de contato reduzindo a aproximadamente 45°. O imageamento das gotículas em TiO2 foi obtido em seguida da passivação inicial de HPA (Figura 6, topo) e em seguida da exposição da superfície passivada a HPA ao copolímero de bloco (Figura 6, fundo). A mudança em molhabilidade aqui pode sugerir que a hidrofilicidade de TiO2 passivado a HPA é notadamente aumentada em seguida da adição de copolímero de bloco. Adicionalmente, as referidas observações serão consistentes com a formação de uma camada de envoltório anti-incrustante formada pelo copolímero de bloco.
Exemplo 2. Testes de seletividade de ligação para avaliar funcionalização da superfície
[00110] A seletividade de silanização de superfície foi avaliada por testes de quantum dot (QD)-estreptavidina usando silano conjugado a biotina em um cupom de TiO2/SiO2. Nos referidos experimentos, a seletividade de superfície do composto de silano foi examinada por ou cupons preparados com um revestimento passivado a HPA apenas, ou com cupons preparados por passivação de HPA seguido por camada de envoltório anti-incrustante com copolímero de tribloco. Os resultados de fluorescência de imagem de diferentes condições testadas são mostrados na Figura 7.
[00111] As medições de fluorescência de fundo foram obtidas usando cupom de TiO2/SiO2 que não foram submetidas às etapas de modificação de química de superfície (Figura 7, topo). Para os experimentos de controle, 0 cupom de TiO2/SiO2 foi preparado por passivação com HPA seguido por funcionalização da superfície com silanoPEG-biotina. As medições de fluorescência foram obtidas usando 0 teste de ligação a QD-estreptavidina, que indicou que a silanização no cupom ocorreu com uma seletividade aproximada de 2 vezes para 0 lado de SiO2 (Figura 7, meio). A seletividade foi determinada por sub
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52/56 trair medições de intensidade de fluorescência de fundo a partir das medições de intensidade de controle. Por exemplo, a seletividade de controle para SiO2:TiO2 foi aproximada usando as medições reportadas na Figura 7 (topo, médio), onde a seletividade foi obtida por: (Sicontroí SÍblank)/(TÍcontrol ~ Tíblank) = (53000 - 3400)/(25000 - 2000) = (49600)/(23000) = ~2,2, ou aproximadamente 2 vezes de seletividade.
[00112] Em seguida, um cupom de TÍO2/SÍO2 foi preparado como no Exemplo 1, com passivação de HPA e camada de envoltório de copolímero de tribloco. Em seguida da silanização do cupom modificado por copolímero, as medições de fluorescência indicaram que 0 composto de silano ligado ao lado S1O2 sobre 0 lado T1O2 com seletividade > 500:1 (Figura 7, fundo). Como mostrado, 0 sinal de fluorescência detectado para 0 lado de T1O2 do cupom de copolímero aproximou 0 lado T1O2 em experimentos de matriz. Assim sendo, a seletividade foi calculada como antes, e aproximada para demonstrar uma preferência maior do que 500 vezes para 0 lado S1O2.
Exemplo 3. Efeitos Anti-incrustantes em Reações Biológicas
[00113] Os efeitos da camada de envoltório anti-incrustante nos chips de sequenciamento foram avaliadas por observar emissões de fluorescência a partir de nucleotídeos marcados com corantes em chips processados com HPA ou copolímero de tribloco/HPA. Como mostrado na Figura 8 (esquerda), mínimos sinais de fluorescências foram observados no chip processado de HPA/copolímero de tribloco. Os chips processados apenas com HPA, de modo diferente, mostraram emissões muito maiores detectadas a partir dos nucleotídeos marcados em solução (Figura 8, direita). Os referidos resultados indicam que 0 chip processado com HPA foi mais suscetível a nucleotídeos marcados com corante sendo retidos dentro do volume evanescente de uma cavidade de amostra do que 0 chip processado com HPA/copolímero de tribloco. Adicionalmente, isso sugere que 0 copo
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53/56 límero de tribloco confere propriedades anti-incrustantes para minimizar ou eliminar a suscetibilidade de corantes que se aderem à superfície dentro do volume evanescente. Reações de sequenciamento foram adicionalmente conduzidas usando o chip processado com HPA/copolímero de tribloco para confirmar a compatibilidade com o método de passivação da superfície do copolímero de tribloco (Figura 9).
Equivalentes e Âmbito
[00114] Embora várias modalidades inventivas tenham sido descritas e ilustradas neste documento, aqueles versados na técnica observam prontamente uma variedade de outros meios e/ou estruturas para desempenhar a função e/ou obter os resultados e/ou uma ou mais das vantagens aqui descritas e cada uma dessas variações e/ou modificações é considerada como estando dentro do escopo das modalidades inventivas aqui descritas. De um modo mais geral, aqueles versados na técnica observarão prontamente que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações aqui descritos devem ser exemplares e que os parâmetros, dimensões, materiais e/ou configurações reais dependerão da aplicação ou aplicações específicas para as quais os ensinamentos inventivos é /são usados. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitas equivalentes às modalidades inventivas específicas aqui descritas. Deve, portanto, ser entendido que as modalidades anteriores são apresentadas apenas a título de exemplo e que, dentro do escopo das reivindicações em anexo e equivalentes, as modalidades inventivas podem ser praticadas de outra forma que não como especificamente descrito e reivindicado. As modalidades inventivas da presente descrição são direcionadas a cada recurso, sistema, artigo, material, kit e/ou método individual aqui descrito. Além disso, qualquer combinação de dois ou mais desses recursos, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos, se tais recursos, sistemas,
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54/56 artigos, materiais, kits e/ou métodos não forem mutuamente inconsistentes, está incluída no escopo inventivo da presente descrição.
[00115] Todas as definições, conforme aqui definidas e usadas, devem ser entendidas como controle sobre definições de dicionário, definições em documentos incorporados por referência e / ou significados comuns dos termos definidos.
[00116] Todas as referências, patentes e pedidos de patente aqui descritos são incorporados por referência no que diz respeito ao assunto para o qual cada um é citado, o que em alguns casos pode abranger a totalidade do documento.
[00117] Os artigos indefinidos um e uma, conforme aqui utilizados na especificação e nas reivindicações, a menos que claramente indicado o contrário, devem ser entendidos como pelo menos um. [00118] A frase e/ou, tal como aqui utilizada na especificação e nas reivindicações, deve ser entendida como significando um ou ambos dos elementos combinados, isto é, elementos que estão conjuntamente presentes em alguns casos e de modo disjuntivo presentes em outros casos. Vários elementos listados com e/ou devem ser interpretados da mesma maneira, isto é, um ou mais dos elementos combinados. Outros elementos podem opcionalmente estar presentes, exceto os elementos especificamente identificados pela cláusula e/ou, relacionados ou não a esses elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitative, uma referência a A e/ou B, quando usada em conjunto com linguagem aberta como compreendendo, pode se referir, em uma modalidade, apenas a A (opcionalmente incluindo elementos que não sejam B); em outra modalidade, apenas para B (opcionalmente incluindo elementos que não sejam A); em ainda outra modalidade, para A e B (incluindo opcionalmente outros elementos); etc.
[00119] Conforme usado aqui na especificação e nas reivindica
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55I5Q ções, ou deve ser entendido como tendo o mesmo significado que e/ou como definido acima. Por exemplo, ao separar itens em uma lista, ou ou e/ou devem ser interpretados como inclusivos, ou seja, a inclusão de pelo menos um, mas também incluindo mais de um, de um número ou lista de elementos, e, opcionalmente, itens não listados adicionais. Somente termos claramente indicados ao contrário, como apenas um de ou exatamente um de ou, quando usados nas reivindicações, consistindo de, se referirão à inclusão de exatamente um elemento de um número ou lista de elementos. Em geral, o termo ou, conforme usado aqui, deve ser interpretado apenas como indicando alternativas exclusivas (ou seja, uma ou outra, mas não ambas) quando precedido por termos de exclusividade, como qualquer um, um de, somente um de ou exatamente um de. Consistindo essencialmente em, quando usado nas reivindicações, terá seu significado comum, conforme usado no campo do direito de patentes.
[00120] Como usado aqui no relatório e nas reivindicações, a frase pelo menos um, em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser entendida como significando pelo menos um elemento selecionado a partir de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não necessariamente incluindo pelo menos um de cada elemento listado especificamente na lista de elementos e não excluindo nenhuma combinação de elementos na lista de elementos. Essa definição também permite que elementos possam opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados na lista de elementos aos quais a frase pelo menos um se refere, relacionada ou não a esses elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitative, pelo menos um de A e B (ou, equivalentemente, pelo menos um de A ou B ou, equivalentemente, pelo menos um de A e/ou B) pode se referir, em uma modalidade, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, A, sem B pre
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56/56 sente (e opcionalmente incluindo elementos além de B); em outra modalidade, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, B, sem A presente (e opcionalmente incluindo elementos além de A); em ainda outra modalidade, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, A e pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[00121] Também deve ser entendido que, a menos que seja claramente indicado o contrário, em qualquer método aqui reivindicado que inclua mais de uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou atos do método não é necessariamente limitada à ordem na qual os passos ou atos do método são recitados.
[00122] Nas reivindicações, bem como na especificação acima, todas as frases de transição como compreendendo, incluindo, transportando, tendo, contendo, envolvendo, retendo, compostas de e similares devem ser entendidos como abertos, ou seja, como incluindo, mas não se limitando a. Somente as frases transitórias consistindo em e consistindo essencialmente em devem ser frases transitórias fechadas ou semifechadas, respectivamente, conforme estabelecido no Manual de Procedimentos de Exame de Patentes do Escritório de Patentes dos Estados Unidos, Seção 2111.03. Deve-se considerar que as modalidades descritas neste documento usando uma frase de transição em aberto (por exemplo, compreendendo) também são contempladas, em modalidades alternativas, como consistindo em e consistindo essencialmente em o recurso descrito pela frase transitória finalizada. Por exemplo, se a descrição descreve uma composição compreendendo A e B, a descrição também contempla as modalidades alternativas uma composição consistindo em A e B e uma composição consistindo essencialmente em A e B.
Claims (30)
1. Método de funcionalizar uma superfície de silica de uma cavidade de amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:
colocar em contato uma cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica com um copolímero de bloco que preferivelmente liga uma camada de revestimento na superfície de óxido de metal; e colocar em contato a cavidade de amostra com um agente de funcionalização que preferivelmente liga a superfície de silica para gerar uma superfície de silica funcionalizada, em que o agente de funcionalização compreende uma porção de acoplamento.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende colocar em contato a cavidade de amostra com um reagente anfipático que preferivelmente liga a superfície de óxido de metal para formar a camada de revestimento na superfície de óxido de metal.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o reagente anfipático compreende um grupo dianteiro hidrófilo configurado para preferivelmente ligar a superfície de óxido de metal e um grupo traseiro hidrófobo configurado para preferivelmente ligar o copolímero de bloco.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o grupo dianteiro hidrófilo compreende um grupo funcional sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, hidroxila, catecolato, isocianato, hidroxamato, ou carboxila.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o grupo traseiro hidrófobo compreende uma cadeia alquila C1-C30.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que 0 reagente anfipático compreen
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2/6 de um composto de ácido fosfônico de alquila de fórmula CH3(CH2)nPO3H2, onde n é um número inteiro com um valor de 1-30.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o reagente anfipático compreende ácido hexilfosfônico, ácido octilfosfônico, ácido decilfosfônico, ácido dodecilfosfônico, ácido polivinilfosfônico, ácido 12-fosfono-1-dodecanossulfônico, ácido 10-undecinilfosfônico, ou ácido heptadecafluorodecilfosfônico.
8. Método, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o copolímero de bloco é um copolímero de bloco do tipo A-B-A que compreende um bloco A e um bloco B.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a camada de revestimento preferivelmente liga o bloco B do copolímero de bloco do tipo A-B-A.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o bloco B é mais hidrófobo do que o bloco A.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o bloco A compreende um primeiro bloco de poliéter e o bloco B compreende um segundo bloco de poliéter que é mais hidrófobo do que o primeiro bloco de poliéter.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o copolímero de bloco do tipo A-B-A é um composto de fórmula I:
(Aa)(Bí,)(Aa) (Fórmula I), onde:
A é uma unidade monomérica de um composto de poliéter que compreende o bloco A;
a é um número inteiro com um valor de 2-150;
B é uma unidade monomérica de um composto de poliéter que compreende o bloco B; e
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3/6 b é um número inteiro com um valor de 10-100.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o bloco A compreende óxi do de polietileno e o bloco B compreende óxido de polipropileno.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o copolímero de bloco do tipo A-B-A é um composto de fórmula II:
HO
(Fórmula II), onde:
a é um número inteiro com um valor de 2-150; e b é um número inteiro com um valor de 10-100.
15. Método, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a superfície de óxido de metal compreende óxido de alumínio, óxido de titânio, óxido de zircônio, óxido de ferro, óxido de estanho, ou óxido de tântalo.
16. Método, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o agente de funcionalização compreende um composto de silano.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto de silano compreende monoetoxissilano, metoxissilano, dietoxissilano, triclorossilano, ou dietóxi, metoxissilano.
18. Método, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a porção de acoplamento do agente de funcionalização compreende uma molécula de biotina, uma proteína avidina, uma proteína estreptavidina, uma proteína lecitina, ou uma SNAP-tag.
19. Método, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a porção de acoplamento do agente de
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4/Q funcionalização compreende um grupo amina, um grupo azido, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alcino, ou um grupo sulfidrila.
20. Método, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que ainda compreende colocar em contato a cavidade de amostra tendo a superfície de silica funcionalizada com uma molécula de interesse que é configurada para ligar a porção de acoplamento, sob condições adequadas para permitir a ligação da molécula de interesse à porção de acoplamento, desse modo acoplando a molécula de interesse à superfície de silica funcionalizada.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que colocar em contato a cavidade de amostra com a molécula de interesse ocorre subsequente a colocar em contato a cavidade de amostra com o agente de funcionalização sem uma etapa de lavagem intermediária.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a molécula de interesse é uma enzima de polimerização.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a molécula de interesse é um complexo de modelos de sequenciamento que compreende uma molécula de ácido nucleico matriz tendo um complexo de primer hibridizado/enzima de polimerização.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que a molécula de interesse preferivelmente se liga à superfície de silica funcionalizada sobre a superfície de óxido de metal com seletividade de cerca de 100 vezes a cerca de 1000 vezes, seletividade de cerca de 200 vezes a cerca de 800 vezes, seletividade de cerca de 400 vezes a cerca de 600 vezes, ou seletividade de cerca de 1000 vezes a cerca de 2000 vezes.
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5/6
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que a seletividade da molécula de interesse para a superfície de silica funcionalizada sobre a superfície de óxido de metal é maior em comparação à cavidade de amostra não colocada em contato com o copolímero de bloco por cerca de 10 vezes a cerca de 100 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 1000 vezes, ou cerca de 200 vezes a cerca de 400 vezes.
26. Dispositivo integrado, caracterizado pelo fato de que compreende:
um substrato que compreende uma cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica;
uma camada de revestimento na superfície de óxido de metal formada por um reagente anfipático que compreende um grupo dianteiro hidrófilo e um grupo traseiro hidrófobo, em que o reagente anfipático é ligado à superfície de óxido de metal através do grupo dianteiro hidrófilo;
uma camada de envoltório anti-incrustante na camada de revestimento formada por um copolímero de bloco do tipo A-B-A que compreende um bloco A e um bloco B, em que o copolímero de bloco do tipo A-B-A é ligado à camada de revestimento através do bloco B; e um agente de funcionalização ligado à superfície de silica, em que o agente de funcionalização compreende uma porção de acoplamento.
27. Dispositivo integrado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende uma estrutura de cavidades de amostra, cada cavidade de amostra tendo uma superfície de óxido de metal e uma superfície de silica.
28. Dispositivo integrado, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a cavidade de amostra compre
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6/6 ende uma abertura de topo formada em uma superfície do substrato e uma superfície de fundo distai à superfície do substrato.
29. Dispositivo integrado, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a superfície de fundo é compreendida por uma superfície de silica.
30. Dispositivo integrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de que o dispositivo integrado é configurado para interagir com um instrumento de sequenciamento de próxima geração.
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