JP7287942B2 - 高強度標識反応物組成物および配列決定のための方法 - Google Patents

高強度標識反応物組成物および配列決定のための方法 Download PDF

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Description

本出願は、一般に、明るく標識された反応物組成物および単一分子の検出のためにそれを使用する方法に関する。
次世代シーケンシング技術の進歩により、単一分子の超並列分析が可能になり、ライフサイエンス研究の状況が根本的に変化した。これらの手法の一部には、発光標識された反応成分を使用して、生物学的反応をリアルタイムで監視することが含まれる。標識は光源で照らされて発光し、発光した光は光検出器で検出される。これらの事象を記録および分析して、対応する発光特性に基づいて個々の反応成分を特定できる。複数のタイプの中から特定のタイプの標識分子を識別するには、各タイプが一意で容易に識別可能な発光特性を有することが重要である。さらに、これらのパラメータは、励起源の出力および機器全体のサイズのような機器の要件を決定する場合がある。
本明細書に開示される技術の態様は、リンカー（例えば、拘束されたリンカー）によって分離された２つ以上の発光標識を含む標識反応成分に関する。いくつかの実施形態において、本出願は、標識－標識間相互作用（ｌａｂｅｌ－ｌａｂｅｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）による検出可能な信号の減衰を回避するための発光標識の分離に関する。いくつかの態様において、本出願は、リンカーを介して２つ以上の発光標識（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｓ）に接続されたヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）を含む標識ヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本出願は、鋳型核酸を配列決定するための組成物、方法、およびキットを提供する。
いくつかの態様において、本出願は、リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続されたヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）を含む標識ヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、重合反応における基質として使用するために構成される。いくつかの実施形態において、本出願の標識ヌクレオチドは、最小距離で互いに分離された２つ以上の発光標識を含む。いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の発光標識から少なくとも５オングストローム離れている。例えば、いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の発光標識から少なくとも５オングストローム、少なくとも１０オングストローム、少なくとも１５オングストローム、少なくとも２０オングストローム、少なくとも２５オングストローム、少なくとも３０オングストローム、少なくとも４０オングストローム、または少なくとも５０オングストローム、離れている。いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の発光標識の重心（ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｍａｓｓ）から少なくとも５オングストローム離れた重心を含む。
いくつかの実施形態において、本出願の標識ヌクレオチドは、スペーサ分子を介してリンカーに付着した１つ以上の発光標識を含む。いくつかの実施形態において、スペーサ分子は、発光標識をリンカー上の付着部位に接続する。いくつかの実施形態において、発光標識は、発光標識とリンカー上の付着部位との間に少なくとも８つの連続した原子を含むスペーサ分子を介してリンカーに付着される。いくつかの実施形態において、スペーサ分子は、発光標識とリンカー上の付着部位との間に５０未満、４０未満、３０未満、または２０未満の連続した原子を含む。いくつかの実施形態において、発光標識はリンカーに組み込まれている（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ）。
いくつかの実施形態において、リンカーはオリゴマーである（例えば、オリゴマーリンカー、またはポリマーリンカー）。いくつかの実施形態において、オリゴマーはモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、２つ以上の異なるタイプのモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、複数の同じタイプのモノマー単位を含む（例えば、オリゴマーは、１つのタイプのモノマー単位のポリマーである）。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、複数の第１のタイプのモノマー単位を有する第１の領域と、複数の第２のタイプのモノマー単位を有する第２の領域とを含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、それぞれが複数の異なるタイプのモノマー単位を含む複数の異なる領域（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは少なくとも５個のモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは少なくとも１０個のモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、１５０個未満、１００個未満、または５０個未満のモノマー単位を含む（例えば、少なくとも５個のモノマー単位で、かつ２００、１５０、１００、７５、５０、または２５個未満のモノマー単位；少なくとも１０個のモノマー単位で、かつ２００、１５０、１００、７５、５０、または２５個未満のモノマー単位）。
リンカーがオリゴマー（例えば、オリゴマーリンカー、ポリマーリンカー）であるいくつかの実施形態において、各発光標識は、オリゴマーの少なくとも５個のモノマー単位によって互いの標識から分離されている。いくつかの実施形態において、第１の発光標識は、第２の発光標識がリンカーに組み込まれるかまたはリンカーに付着する第２の位置から少なくとも５モノマー単位離れた第１の位置でリンカーに組み込まれる。隣接する発光標識がリンカーに組み込まれているいくつかの実施形態において、標識は５個未満のモノマー単位で分離することができる。いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の付着部位から、少なくとも５個のモノマー単位（例えば、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、またはそれ以上のモノマー単位）分離している付着部位でリンカーに付着されている。いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の付着部位から、少なくとも５個のモノマー単位であり、かつ４０個未満のモノマー単位（例えば、３８個未満、３６個未満、３４個未満、３２個未満、３０個未満、２８個未満、２６個未満、２４個未満、２２個未満、または２０個未満のモノマー単位）分離している付着部位に付着されている。いくつかの実施形態において、発光標識は、オリゴマーの２つの連続するモノマー単位の間でリンカーに組み込まれる（例えば、オリゴマーの２つの隣接するモノマー単位を共有結合する）。
いくつかの実施形態において、リンカーは、リンカーに接続された２つまたはそれ以上の標識間の相互作用を防ぐのに十分に剛性である（ｒｉｇｉｄ）。いくつかの実施形態において、リンカーの剛性は、同じリンカーに付着した単一の標識として存在する場合の強度と比較して、各標識の強度の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば９５～１００％（例えば、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％）を保持するのに十分である。
いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドのアミノ酸組成は、構造的剛性を提供する（例えば、ペプチドリンカーに１つ以上のポリプロリンセグメントが存在するため）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーの９０％以上（例えば、すべて）がポリプロリンポリマーからなる。いくつかの実施形態において、ペプチドの剛性は、化学修飾を介してペプチドを拘束することにより提供される。例えば、いくつかの実施形態において、ペプチドは１つ以上の環化セグメントを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは環化ペプチドである（例えば、ステープルペプチド、エンドツーエンドの環化ペプチドなど）。いくつかの実施形態において、１つ以上の剛性アミノ酸ポリマーセグメントと１つ以上の化学修飾アミノ酸ポリマーセグメントとの組み合わせを組み込むことにより、十分なペプチド剛性を提供することができる。
いくつかの実施形態において、リンカーは多糖（例えば、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ポリグルコース、ポリラクトース、アミノグリコシド、Ｎ－アセチルアミノグリコシド、およびそれらの組み合わせ）である。
いくつかの実施形態において、リンカーは核酸である。いくつかの実施形態において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の二本鎖核酸セグメントを使用することにより、十分な剛性が提供される（例えば、２つまたはそれ以上の異なる標識を分離する）。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、一本鎖または二本鎖核酸の、または１つ以上の一本鎖および１つ以上の二本鎖のセグメントを含む核酸）の１つ以上の化学修飾によって十分な剛性が提供される。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の二本鎖セグメントと１つ以上の化学修飾セグメントとの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の一本鎖の、および１つ以上の二本鎖の、セグメントの組み合わせを含む。一本鎖セグメントは、いくつかの実施形態において、ループの形で存在していてもよい（たとえば、本明細書の他の場所で説明されるステムループ二次構造のように）。いくつかの実施形態において、一本鎖セグメントは、二本鎖セグメント内の不対領域の形態で存在する。例えば、内部ループは、１本の鎖の１つ以上の塩基が他の鎖の１つ以上の隣接する塩基と塩基対合相互作用を形成しない二本鎖セグメント内に形成することができる。不対領域のさらなる例には、バルジループが含まれ、これは、一方の鎖が他方の鎖に対して１つ以上の追加の塩基を含む二本鎖セグメント内に形成することができる。いくつかの実施形態において、一本鎖領域および二本鎖領域は構造的剛性を付与する。
いくつかの実施形態において、一本鎖領域（例えば、不対領域）は、少なくとも２塩基長（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基長）である。いくつかの実施形態において、一本鎖領域は、２～１０塩基長（例えば、２～８塩基長、４～１０塩基長、または４～８塩基長）である。いくつかの実施形態において、二本鎖領域は、２～４０塩基長である（例えば、２～２０塩基長、２～１０塩基長、１０～４０塩基長、１０～３０塩基長、１０～２０塩基長、２０～４０塩基長、または２０～３０塩基長）。
いくつかの実施形態において、核酸は、２つ以上の発光標識に付着した第１のオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の発光標識は、第１のオリゴヌクレオチド鎖上の２つ以上の付着部位で付着される。いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の発光標識の中心点から少なくとも５オングストローム離れた中心点を有する立体体積（ｓｔｅｒｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の発光標識の中心点から少なくとも６オングストローム、約５～１０オングストローム、約６～１０オングストローム、約１０～１５オングストローム、約１５～２０オングストローム、約２０～２５オングストローム、または約２５～５０オングストローム、離れた中心点を有する立体体積を含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチド鎖をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖はヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）に付着している。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド鎖はヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）に付着している。
いくつかの実施形態において、２つ以上の付着部位は、第１のオリゴヌクレオチド鎖上の少なくとも５塩基（例えば、少なくとも５ヌクレオチド）だけ互いに分離されている。いくつかの実施形態において、２つ以上の付着部位は、第１のオリゴヌクレオチド鎖上の、少なくとも５塩基かつ４０塩基未満（例えば、約５～３０塩基、約５～２０塩基、約５～１０塩基、約１０～４０塩基、約２０～４０塩基、または約３０～４０塩基）だけ互いに分離されている。いくつかの実施形態において、各付着部位は、第１のオリゴヌクレオチド鎖上のグアニンまたはシトシンから分離された少なくとも２塩基である。いくつかの実施形態において、各付着部位は、第１のオリゴヌクレオチド鎖上の脱塩基部位に生じる。いくつかの実施形態において、各付着部位は、第１のオリゴヌクレオチド鎖上のヌクレオチドの核酸塩基で生じる。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、Ａ、Ｔ、またはＵ核酸塩基から選択される。
いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）のステムループを形成する。いくつかの実施形態において、各ステムループのループ領域は、２つ以上の付着部位の付着部位を含む。いくつかの実施形態において、各ステムループのループ領域は、少なくとも４個の不対塩基（たとえば、４、５、６、７、８個またはそれ以上の不対塩基）を含む。いくつかの実施形態において、ループ領域は、３３％未満のＧ／Ｃ含有量を有する配列（例えば、ヌクレオチド配列）を含む。
いくつかの態様において、本開示の標識ヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド鎖であって、同第１のオリゴヌクレオチド鎖の末端で２つ以上の分岐オリゴヌクレオチド鎖に付着した第１のオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸リンカーを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、共有結合カップリング化合物を介して２つ以上の分岐オリゴヌクレオチド鎖に付着している。いくつかの実施形態において、各分岐オリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも１つの発光標識を含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は第２のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズされる（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ｗｉｔｈ）。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド鎖はヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）に付着している。いくつかの実施形態において、各分岐オリゴヌクレオチド鎖は、相補的な分岐オリゴヌクレオチド鎖とさらにハイブリダイズされる。
いくつかの実施形態において、共有結合カップリング化合物は以下の構造：
Figure 0007287942000001
（式中、Ｎｆは第１のオリゴヌクレオチド鎖であり、Ｎｂは分岐オリゴヌクレオチド鎖であり、ＲｆおよびＲｂはそれぞれ、互いに独立して、置換または非置換アルキレン；置換または非置換アルケニレン；置換または非置換アルキニレン；置換または非置換ヘテロアルキレン；置換または非置換ヘテロアルケニレン；置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換ヘテロシクリレン；置換または非置換カルボシクリレン；置換または非置換アリーレン；置換または非置換ヘテロアリーレン；およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される結合部（ｂｏｎｄ）または連結基であり、そして、Ｏの各例（ｅａｃｈ ｉｎｓｔａｎｃｅ）は、隣接するオリゴヌクレオチド鎖の５’リン酸基または３’ヒドロキシル基のいずれかの酸素原子である）
からなる。
いくつかの態様において、本開示の標識ヌクレオチドは、共有結合カップリング化合物から伸びる３個以上のオリゴヌクレオチド鎖（例えば、３、４、５、６個またはそれ以上のオリゴヌクレオチド鎖）を含む第１のオリゴヌクレオチド成分を含む核酸リンカーを含む。いくつかの実施形態において、３個以上のオリゴヌクレオチド鎖のうちの少なくとも１つがヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）に付着している。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド成分は第２のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド成分は、発光標識に付着した少なくとも１つのオリゴヌクレオチド鎖を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の標識ヌクレオチドは、蛍光色素で発光標識されている。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、ローダミン色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素、またはシアニン色素である。
いくつかの実施形態において、本開示の標識ヌクレオチドは、２つ以上の発光標識のいずれかの発光標識から少なくとも１ｎｍ離れたヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、約１～１０ｎｍの間（例えば、約２～１０ｎｍの間、約４～１０ｎｍの間、約６～１０ｎｍの間、または約８～１０ｎｍ）だけ、２つ以上の発光標識のいずれかの発光標識から離れている。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、約２～２０ｎｍ（例えば、約６～２０ｎｍ、約１０～２０ｎｍ、約１２～２０ｎｍ、または約１６～２０ｎｍ）だけ２つ以上の発光標識のいずれかの発光標識から離れている。
いくつかの態様において、本開示は、鋳型核酸の配列を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、標的体積（ｔａｒｇｅｔ ｖｏｌｕｍｅ）中の複合体であって鋳型核酸、プライマー、および重合酵素を含む複合体を、本出願によって提供される複数のタイプの発光標識ヌクレオチドにさらすことを含むステップを含む。いくつかの実施形態において、複数のタイプの発光標識ヌクレオチドのうちの１つ以上は、リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続されたヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも１０個のモノマー単位を含むオリゴマーである。いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の付着部位から少なくとも５個のモノマー単位離れた付着部位にてリンカーに付着している。例えば、いくつかの実施形態において、付着部位は、約５～３０個のモノマー単位、約５～２０個のモノマー単位、約５～１０個のモノマー単位、約１０～４０個のモノマー単位、約２０～４０モノマー単位、または約３０～４０モノマー単位だけ任意の他の付着部位から離れている。いくつかの実施形態において、各発光標識は、任意の他の発光標識から少なくとも５オングストローム離れている。例えば、いくつかの実施形態において、各発光標識は、約５～１０オングストローム、約６～１０オングストローム、約１０～１５オングストローム、約１５～２０オングストローム、約２０～２５オングストローム、または約２５～５０オングストロームだけ任意の他の発光標識から離れている。したがって、いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の発光標識ヌクレオチドのいずれかを利用する核酸の配列を決定する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、方法は、１つ以上の励起エネルギーの一連のパルスを標的体積の近傍に向けるステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーを含む核酸への連続的な取り込み中に、発光標識ヌクレオチドから複数の放射光子を検出するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、放射された光子のタイミングおよび任意で発光強度および／または輝度を決定することにより、組み込まれたヌクレオチドの配列を識別するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、反応混合物中の４つの異なるタイプのヌクレオチド（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン／ウラシル）は、それぞれ１つ以上の発光分子（例えば、本明細書に記載されているように、２つ以上の発光標識を有するもの）で標識することができる。いくつかの実施形態において、各タイプのヌクレオチドは、複数の同じ発光分子（例えば、ヌクレオチドに接続された同じ蛍光色素の２つ以上）に接続され得る。いくつかの実施形態において、各発光分子は、複数のヌクレオチド（例えば、同じヌクレオチドの２つ以上）に接続され得る。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドを複数の発光分子に（例えば、本明細書に記載のリンカーを介して）接続することができる。
いくつかの実施形態において、４つのヌクレオチドのセット中の発光標識は、芳香族化合物または複素芳香族化合物を含む色素から選択することができ、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、カルバゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、フェナントリジン、フェノキサジン、ポルフィリン、キノリン、エチジウム、ベンズアミド、シアニン、カルボシアニン、サリチレート、アントラニレート、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、または他の類似化合物であってもよい。色素の例には、フルオレセインまたはローダミン色素などのキサンテン色素、ナフタレン色素、クマリン色素、アクリジン色素、シアニン色素、ベンゾオキサゾール色素、スチルベン色素、ピレン色素、フタロシアニン色素、フィコビリプロテイン色素、スクアライン色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素などが含まれる。
いくつかの態様において、本出願は、鋳型核酸を配列決定するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の複数のタイプの発光標識ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標識ヌクレオチドの各タイプは、リンカーを介して１つ以上のヌクレオチド（例えば、１つ以上のヌクレオシドポリリン酸）に付着した２つ以上の発光標識を含む。いくつかの実施形態において、キットは重合酵素をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、配列決定される鋳型核酸に相補的なプライマーを含む。
いくつかの態様において、本出願は、核酸配列決定反応組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、反応混合物中に２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の異なるタイプの発光標識ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、発光標識ヌクレオチドの各タイプは、本出願に従う標識ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は重合酵素をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は鋳型核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、鋳型核酸に相補的なプライマーをさらに含む。
明るく標識された反応物（ｂｒｉｇｈｔｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｒｅａｃｔａｎｔ）の発光標識の分離を一般的に示す図である。 異なる発光標識付着構成を有する一般的なリンカー構造を示す。 ２つの発光標識に付着した核酸リンカーを一般的に示す図である。 異なる鎖構成を有する一般的な核酸（上）と、発光標識の空間的占有を一般的に示す図（下）を示す。 異なる相対標識付着部位（上）と異なる反応物結合性（下）を有する一般的な核酸を示す。 同一の（左）または反対の（右）のオリゴヌクレオチド鎖の接続を介して標識を反応物に接続する一般的な核酸を示す。 明るく標識された反応物の設計に使用できるおおよそのサイズ拘束の例を含む一般的な核酸を示す。 ２本の発光標識を同一の鎖の接続を介してヌクレオシドポリリン酸に接続する核酸の例示的な構造である。 棒状（ｒｏｄ－ｓｈａｐｅｄ）核酸リンカー（たとえば、図３Ｃに示す）を使用して、標識されたヌクレオシドポリリン酸の取り込みを検出できることを確認した配列決定反応の例を示す。 棒状（ｒｏｄ－ｓｈａｐｅｄ）核酸リンカー（たとえば、図３Ｃに示す）を使用して、標識されたヌクレオシドポリリン酸の取り込みを検出できることを確認した配列決定反応の例を示す。 ２本の発光標識を反対の鎖の接続を介してヌクレオシドポリリン酸に接続する核酸の例示的な構造である。 オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれた発光標識を有する核酸リンカーの例示的な構造である。 示されている４つの異なる核酸リンカー構築物を使用して実施された配列決定反応の例を示す。 示されている４つの異なる核酸リンカー構築物を使用して実施された配列決定反応の例を示す。 示されている４つの異なる核酸リンカー構築物を使用して実施された配列決定反応の例を示す。 単一のステムループ二次構造を有する一般的な核酸リンカーを示す。 複数のステムループ二次構造を有する一般的な核酸リンカーを示す。 別個のステムループ二次構造のループに発光標識が付着した核酸リンカーの例示的な構造である。 ステムループ核酸リンカーを有する標識ヌクレオシドポリリン酸（たとえば、図４Ｃに示す）を使用してヌクレオシドポリリン酸の取り込みを検出できることを確認した配列決定反応の例を示す。 ステムループ核酸リンカーを有する標識ヌクレオシドポリリン酸（たとえば、図４Ｃに示す）を使用してヌクレオシドポリリン酸の取り込みを検出できることを確認した配列決定反応の例を示す。 発光標識に付着した分岐オリゴヌクレオチド鎖を有するツリー型の核酸リンカーを一般的に示す。 別個の分岐オリゴヌクレオチド鎖の末端に付着した発光標識を有するツリー型の核酸リンカーの例である。 星型核酸リンカーを一般的に示しており、星型核酸リンカーの設計に使用できるおおよそのサイズ拘束の例を提供する。 星型核酸リンカーを一般的に示しており、星型核酸リンカーの設計に使用できるおおよそのサイズ拘束の例を提供する。 星型核酸リンカーの例示的な構造である。 四面体コアを有する核酸リンカーの例示的な構造である。 四面体コアを有する核酸リンカーの例示的な構造である。 四面体コアを有する核酸リンカーを合成するために使用できる反応スキームの例を示す。 四面体コアを有する核酸リンカーを合成するために使用できる反応スキームの例を示す。 三方接合部にて付着した発光標識を有する四面体ベースの核酸リンカー構造を一般的に示す。 三方接合部にて付着した発光標識を有するシクロデキストリンベースの核酸リンカーを生成するプロセスを一般的に示す。 蛍光寿命測定においてスペーサ長の影響を評価するための一連の実験で使用される核酸リンカー構造の例を示す。 蛍光寿命測定においてリンカー拘束の影響を評価するための一連の実験で使用される核酸リンカー構造の例を示す。 拘束リンカーの蛍光寿命においてスペーサ長の影響を評価するための一連の実験で使用される核酸リンカー構造の例を示す。
当業者は、本明細書に記載される図面が例示目的のみであることを理解するであろう。場合によっては、本発明の様々な態様は、本発明の理解を容易にするために誇張または拡大して示される場合があることを理解されたい。図面において、同様の参照文字は、一般に、様々な図を通して機能的に類似するおよび／または構造的に類似する要素の類似の特徴を指す。図面は必ずしも縮尺通りではなく、その代わりに教示の原理を説明することに重点が置かれている。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図していない。
本発明の特徴および利点は、図面と併せて以下に述べる詳細な説明からより明らかになるであろう。
図面を参照して実施形態を説明する場合、方向の参照（「上」、「下」、「頂部」、「底部」、「左」、「右」、「水平」、「垂直」など）を使用してもよい。そのような参照は、単に読者が通常の向きで図面を見ることへの補助として意図されている。これらの方向の参照は、具体化されたデバイスの好ましい向きまたは唯一の向きを記述することを意図するものではない。デバイスは、他の向きで具現化されてもよい。
詳細な説明から明らかなように、図面（たとえば図１～１０）に示され、さらには、本出願を通して図示の目的でさらに説明されている例は、非限定的な実施形態を説明しており、場合によってはより明確に図示する目的にて、特定のプロセスを単純化するか、または特徴若しくはステップを省略し得る。
他の態様の中でも、本開示は、２つ以上の標識を含む発光標識反応物を提供し、同標識は、高強度および／または一貫した放射特性（たとえば、一貫した放射寿命）を提供するように構成される。いくつかの実施形態において、２つ以上の標識は、放射の強度または放射の他の放射特性を低下させる可能性がある標識－標識間相互作用を回避するように構成される。いくつかの実施形態において、２つ以上の標識は、ａ）リンカーとの相互作用を回避するように、および／またはｂ）それぞれがリンカーとの同様の相互作用を有するように、構成される。
いくつかの態様において、本開示は、高い放射強度を有する発光標識反応物（ｒｅａｃｔａｎｔｓ）に関連する方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、高い放射輝度を有する発光標識反応物に関する方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、一貫した放射寿命を有する明るく標識された反応物に関する。本明細書で使用されるいくつかの実施形態において、「輝度（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）」（およびその変形例、例えば「明るい（ｂｒｉｇｈｔ）」、「明るく（ｂｒｉｇｈｔｌｙ）」など）は、標識反応物分子当たりの平均放射強度を報告するパラメータを指す。したがって、いくつかの実施形態において、「放射強度（ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）」を使用して、明るく標識された反応物を含む組成物の輝度を一般的に指すことができる。いくつかの実施形態において、標識された反応物の輝度は、その量子収率（ｑｕａｎｔｕｍ ｙｉｅｌｄ）と吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）との積に等しい。いくつかの実施形態において、本開示の標識反応物は、量子収率を最大にし、および／または吸光係数値を最小にして輝度の増加を促進するように設計される。
本開示の明るく標識された反応物は、いくつかの実施形態において、増加した放射輝度および一貫した放射寿命を有するように設計される。いくつかの実施形態において、反応物の２つの標識は、互いにおよび／または周囲環境と相互作用して、１つ以上の放射特性が２つの標識間で一貫しないようにすることができる。いくつかの実施形態において、単一分子検出方法が特定のタイプの分子を識別するためにこれらの特性に依存している場合、一貫性のない放射特性が問題となり得る。例えば、いくつかの実施形態において、一貫しない放射寿命は、一貫した放射寿命で観察される情報の単一のグループ化とは対照的に、情報の２つの別個のクラスターを報告する寿命読み取り値をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、一貫した放射寿命は、例えば、１つ少ない標識を有する標識反応物と比較してほぼ不変の放射寿命を有するような、放射寿命の保存を含むことができる。いくつかの実施形態において、多重標識反応物中の標識の放射寿命は、単一標識反応物中の同じ標識と比較して変化していない。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、単一の構築物上の発光標識の数を増やして輝度を上げると、放射寿命が短くなる可能性がある。いくつかの実施形態において、本開示は、特定の構造的な拘束を使用して設計された組成物を提供し、放射寿命に影響を与えることなく輝度を高める特定の最小距離で隣接する標識を分離する。いくつかの実施形態において、多重標識構築物の放射寿命は、少なくとも１つ少ない発光標識（例えば、同じタイプのフルオロフォア色素の少なくとも１つ少ない）を有する構築物の放射寿命と比較される。いくつかの実施形態において、放射寿命は約３０％以下（例えば、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または約０％だけ増加または減少する）だけ変化する。
いくつかの態様において、本開示は、特定の機器構成要素の必要性を排除するために配列決定反応において検出可能な組成物を開発でき、それにより技術をよりコンパクトなシステムに移行できるという認識および評価に関する。たとえば、配列決定機器には一般に、センサーでの望ましくない検出事象の原因となる励起光をフィルター処理するための光学フィルターが必要である。所望の発光を透過し、励起光を十分に遮断するために使用される光学フィルターは、厚く、かさばり、高価で、かつ光の入射角の変動に耐えられないため、小型化が妨げられている。しかしながら、本発明者らは、寿命が保存された明るく標識された反応物を使用することにより、そのようなフィルタリングの必要性を減らすことができ、場合によってはそのようなフィルターの必要性を完全になくすことができることを認識し、かつ評価した。本明細書に記載されている明るい反応物は、より少ない光パワー（例えば、励起エネルギー）を使用することを可能にし、その結果、散乱と結果としてのフィルタリングの必要性を低減する。
本出願の態様は、リンカー１００を介して反応物１８０に接続された２つの発光標識を示す、図１Ａに示される非限定的な図に従って構成される明るく標識された反応物を提供する。図示されるように、各発光標識は、スペーサを介してリンカー１００に付着している。いくつかの実施形態において、スペーサは、標識とリンカーの間に共有結合ブリッジを形成する。したがって、いくつかの実施形態において、スペーサは発光分子の一部でもリンカー組成物のスペーサ部分でもない（例えば、スペーサはポリマーまたはオリゴマーリンカーのモノマー単位を含まない）。スペーサの第１の端部はリンカー付着部位１０２に付着し、スペーサの第２の端部は標識付着部位１２２に付着する。いくつかの実施形態において、リンカー付着部位１０２は、スペーサの原子をリンカー１００の原子に結合する共有結合の位置によって近似され得る。いくつかの実施形態において、リンカー付着部位１０２は、リンカー１００の隣接鎖内にある原子にて生じる。いくつかの実施形態において、標識付着部位１２２は、スペーサの原子を標識の原子に結合する共有結合の位置によって近似され得る。いくつかの実施形態において、標識付着部位１２２は、スペーサの原子に共有結合した標識の原子にて生じる。いくつかの実施形態において、標識付着部位１２２は、標識の原子に共有結合するスペーサの原子にて生じる。
本明細書の他の場所で説明するように、いくつかの実施形態において、本出願のリンカー構築物は２つ以上の発光標識を含み、隣接する発光標識は最小距離ｄＡだけ離れた付着部位を有するものとして記載される。いくつかの実施形態において、各発光標識は、最小距離ｄＬだけ隣接するものから離れている。図１Ａに示すように、いくつかの実施形態において、ｄＬは標識付着部位間の距離である。いくつかの実施形態において、標識－標識間の分離は、各標識分子のサイズによってさらに決定され得る。したがって、いくつかの実施形態において、発光標識は、楕円体または回転楕円体の近似したまたは計算された立体体積１１２によって記述され、立体半径ｒ１の測定値を取得することができる。いくつかの実施形態において、発光標識は、楕円または円の近似したまたは計算された立体円周によって記述され、立体半径（ｓｔｅｒｉｃ ｒａｄｉｕｓ）ｒ１の測定値を取得することができる。いくつかの実施形態において、立体半径（例えば、ｒ１、ｒ２）は、発光標識の最長寸法の半分として計算または近似され得る。例えば、いくつかの実施形態において、発光標識の化学構造は、ソフトウェアまたは当技術分野で知られている適切な方法を使用して（例えば、熱力学的に好ましい分子の立体配座に基づいて）、二次元または三次元構造として評価され、そして立体半径（たとえば、ｒ１、ｒ２）は、二次元または三次元空間での構造の最長寸法の半分を計算することによって決定される。いくつかの実施形態において、総計標識半径（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｌａｂｅｌ ｒａｄｉｉ）（ｒ１＋ｒ２）は、標識が重複しないようなものであるという条件である場合、標識は最小距離ｄＬだけ離れている。
いくつかの実施形態において、図１Ｂに図示されるように、リンカーの構成および／またはスペーサの剛性は、付着部位間の距離ｄＡがｄＬとほぼ同じになるようなものである（例えば、構築物１５０のように）。いくつかの実施形態において、リンカーの構成および／またはスペーサの剛性は、付着部位間の距離ｄＡが最小距離ｄＬよりも短くなるようなものである（例えば、構築物１５２のように）。いくつかの実施形態において、リンカーの構成および／またはスペーサの剛性は、付着部位間の距離ｄＡが最小距離ｄＬよりも大きくなるようなものである（例えば、構築物１５４のように）。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明する概念は、リンカー１００として任意の適切な分子足場を使用して実装できることを理解されたい。いくつかの実施形態において、リンカーは有機化合物である。リンカー１００としての使用に適した有機化合物の例には、ポリフェニル、ポリアルキン、アルファヘリックス模倣物、およびペプチド模倣物が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、リンカー１００は、オリゴマー、例えば、モノマー単位から構成されるオリゴマーリンカーである。オリゴマーは、いくつかの実施形態において、１つ以上のタイプのモノマー単位を含む。モノマー単位のタイプには、一例として、かつ限定されるものではないが、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびそれらの類似体および誘導体）、アミノ酸（例えば、天然および非天然のアミノ酸）、単糖類、および、フェニルおよびアルキニル含有化合物のような有機化合物が含まれる。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、同じタイプのモノマー単位の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つのタイプのモノマー単位から構成されるオリゴマーは、ポリマー（例えば、ポリマーリンカー）と称されてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、２つ以上の異なるタイプのモノマー単位（例えば、モノマー単位の混合物）を含む。
いくつかの実施形態において、オリゴマー（例えば、オリゴマーリンカーまたはポリマーリンカー）は、少なくとも５個のモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは少なくとも１０個のモノマー単位を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、少なくとも１０個かつ２００個未満のモノマー単位（例えば、少なくとも１０個かつ１５０個未満のモノマー単位、少なくとも１０個かつ１００個未満のモノマー単位、少なくとも１０個かつ５０個未満のモノマー単位、少なくとも１０個かつ４０個未満のモノマー単位、少なくとも１０個かつ３０個未満のモノマー単位、または少なくとも１０個かつ２０個未満のモノマー単位）を含む。
いくつかの実施形態において、リンカー（例えば、ポリマーリンカー、オリゴマーリンカー）は多糖である。リンカー１００としての使用に適した多糖類の例は、当技術分野で知られている（例えば、固体支持体オリゴ糖合成およびコンビナトリアル炭水化物ライブラリー（Ｗｉｌｅｙ ２００１）に記載されているもの）。
いくつかの実施形態において、リンカー（例えば、ポリマーリンカー、オリゴマーリンカー）はペプチドである。リンカー１００としての使用に適したペプチドの非限定的な例には、オリゴペプチド、環状ペプチド、および小タンパク質（例えば、ホッジス（Ｈｏｄｇｅｓ），Ａ．Ｍ．およびシェパーツ（Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ），Ａ．のＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９：１１０２４－１１０２５（２００７年）に記載されているような鳥膵臓ペプチドベースのミニチュアタンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。幾何学的な拘束をペプチド構造に設計する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、剛性を付与し、標識分離を促進するために特に有用であると想定される。たとえば、ペプチドのアミノ酸配列のプロリン含有量を変更して、ペプチドの形状を制御できる（たとえば、クリンツァー（Ｋｒｉｔｚｅｒ）、Ｊ．Ａ．他、（２００６年）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、７：２９－３１）。有用なペプチド工学技術のさらなる非限定的な例には、ペプチド環化（例えば、マリツェフ（Ｍａｌｔｓｅｖ），Ｏ．Ｖ．他、（２０１６年）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、５５（４）：１５３５～１５３９頁を参照）、ステープリングおよび／またはＨ結合サロゲートを介したα－ヘリカルペプチド拘束（例えば、ドース（Ｄｏｕｓｅ），Ｃ．Ｈ．他、（２０１４年）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、９：２２０４～２２０９頁を参照）、サイクリックβ－シートおよびβ－ヘアピン模倣物を介したペプチド拘束（例えば、ギッブス（Ｇｉｂｂｓ），Ａ．Ｃ．他、（１９９８年）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．、５：２８４～２８８頁を参照）が含まれる。
いくつかの実施形態において、リンカー（例えば、ポリマーリンカー、オリゴマーリンカー）は核酸である。いくつかの態様において、明るく標識された反応物は、コア核酸構築物に付着した２つの発光標識を一般的に示す図２Ａに示される図に従って設計される。図示されるように、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの発光標識２１０が、スペーサ２２０を介して付着部位２０２で核酸リンカー２００に付着される。いくつかの実施形態において、核酸リンカー２００は、少なくとも２つのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、核酸リンカー２００は、少なくとも２つの発光標識を含み、各発光標識は、最小距離ｄＬだけ隣のものから隔てられている。いくつかの実施形態において、発光標識の少なくとも２つが同じオリゴヌクレオチド鎖に付着され、各付着部位は最小距離ｄＡだけ隣のものから隔てられている。いくつかの実施形態において、発光標識は、スペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖に付着され、各スペーサは、最小距離ｄＡＬだけその付着部位から所定の発光標識を分離する。
いくつかの実施形態において、最小距離ｄＬ、ｄＡ、およびｄＡＬは、例えば、当技術分野で知られている理論的方法を使用して（例えば、計算的または他の方法で）取得することができる。いくつかの実施形態において、理論的な方法は、結合長、結合角度および回転、静電学、核酸ヘリシティ、および溶液中の分子を表す可能性がある他の物理的要因などの分子構造を説明する任意のアプローチを含むことができる。いくつかの実施形態において、距離測定は、例えば、結晶学的または分光学的手段により、実験的に得ることができる。
本開示の態様は、少なくとも部分的に、核酸リンカーを有する明るく標識された反応物（例えば、標識ヌクレオチド）が以下の式１：
式１：２（ｄＡＬ）－ｄＡ＜１２Å，
（ここで、２（ｄＡＬ）－ｄＡは負の値であってもよい）
に従って設計され得るという発見に関する。いくつかの実施形態において、ｄＡは１７オングストローム（Å）より大きい。いくつかの実施形態において、ｄＡは少なくとも１７Åであるが、３５０Å以下である。（例えば、ｄＡは約１７～３５０Åの間、約１７～３００Åの間、約１７～２５０Åの間、約１７～２００Åの間、約１７～１５０Åの間、約１７～１００Åの間、または約１７～５０Åの間）。
さらに他の態様において、本開示の標識ヌクレオチドは、式２：
式２：２（ｄＡＬ）／ｄＡ＜１
に従って設計することができる。
いくつかの実施形態において、２（ｄＡＬ）／ｄＡは１未満、好ましくは０．５未満である。いくつかの実施形態において、２（ｄＡＬ）／ｄＡは０．１未満である。
いくつかの実施形態において、本開示の標識ヌクレオチドは、式３：
式３：［２（ｄＡＬ）＋ＬＬＤ］／ｄＡ＜１
（ここで、ＬＬＤは最長標識寸法（ＬＬＤ）を表す距離である）
に従って設計することができる。いくつかの実施形態において、［２（ｄＡＬ）＋ＬＬＤ］／ｄＡは０．５未満である。いくつかの実施形態において、［２（ｄＡＬ）＋ＬＬＤ］／ｄＡは０．２未満である。いくつかの実施形態において、［２（ｄＡＬ）＋ＬＬＤ］／ｄＡは０．１未満である。
いくつかの実施形態において、最小距離ｄＡＬは、発光標識２１０のほぼ中央の原子から、スペーサ２２０が付着しているオリゴヌクレオチド鎖上の原子まで測定される。いくつかの実施形態において、最小距離ｄＡＬは、（例えば、発光分子の重心、または当技術分野で知られている、または本明細書の他の場所で説明されている他の方法に基づいて近似される）発光標識２１０の中心からスペーサ２２０が付着しているオリゴヌクレオチド鎖上の原子まで測定される。いくつかの実施形態において、最小距離ｄＡＬは、スペーサ２２０の長さとして測定される（例えば、発光標識２１０を核酸２００に付着するスペーサ２２０の原子に付着させているスペーサ２２０の原子から測定される）。いくつかの実施形態において、最小距離ｄＡは、スペーサが共有結合しているオリゴヌクレオチド骨格上の原子間（例えば、脱塩基付着部位の炭素原子間）の距離として測定される。いくつかの実施形態において、最小距離ｄＡは、オリゴヌクレオチド鎖上の標識された塩基間の距離（例えば、塩基性付着部位の核酸塩基上の原子間の距離）として測定される。
いくつかの実施形態において、最小距離ｄＬは、隣接する発光標識のほぼ中央の原子間の距離として測定される。いくつかの実施形態において、隣接する発光標識は、約６オングストロームの距離ｄＬだけ離れている。いくつかの実施形態において、距離ｄＬは少なくとも６オングストローム（例えば、少なくとも６オングストローム、少なくとも７オングストローム、少なくとも８オングストローム、少なくとも９オングストローム、少なくとも１０オングストローム、少なくとも１１オングストローム、または少なくとも１２オングストローム）である。いくつかの実施形態において、最小距離ｄＬは近似値として測定され、これは、スペーサの構成、スペーサの柔軟性、または核酸の柔軟性において考慮されてもされなくてもよい。
他の態様の中でも、本開示は、放射寿命を損なうことなく輝度を最大にするように多重標識反応物を設計できるように、発光標識間の距離ｄＬを開発する一般的な戦略を提供する。いくつかの実施形態において、十分に近接した隣接する発光標識は、消光効果が生じるように相互作用することができ、その結果、放射寿命の値が減少する、および／または一貫性のないものになる。したがって、本明細書で提供される一般的な設計戦略は、いくつかの実施形態において、隣接する発光標識間の相互作用の程度を制限する構造的な拘束をともなっていてもよい。
いくつかの実施形態において、発光標識は、放射および／または非放射減衰を介して核酸リンカーのグアニン核酸塩基と相互作用して、減少したおよび／または一貫性のない放射寿命をもたらし得る。いくつかの実施形態において、発光標識付着部位は、付着部位を囲む領域のＧ／Ｃ含有量を最小化することにより開発される。したがって、いくつかの実施形態において、付着部位はオリゴヌクレオチド鎖のＡ／Ｔリッチ領域に位置する。いくつかの実施形態において、各付着部位は、オリゴヌクレオチド鎖上のＧまたはＣヌクレオチドから少なくとも２ヌクレオチド離れている（例えば、ＧまたはＣヌクレオチドから２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドだけ離れている）。したがって、いくつかの実施形態において、各付着部位には、ＡまたはＴから選択される少なくとも２つの連続したヌクレオチドが隣接している。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の付着部位間の距離は、介在する非標識塩基（例えば、介在するヌクレオチド）の数によって説明することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖上の付着部位は、少なくとも５個の非標識塩基（例えば、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の非標識塩基）だけ離れている。いくつかの実施形態において、付着部位は、６、７、８、または９個の非標識塩基だけ離れている。いくつかの実施形態において、付着部位は、オリゴヌクレオチド鎖上にて、５～１００個の非標識塩基（例えば、５～８０、５～６０、５～４０、５～２０、または５～１０個の非標識塩基）だけ離れている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される設計原理は、輝度および／または発光強度を増加させるために、標識反応成分への連続する発光標識の追加を可能にする。いくつかの実施形態において、本出願の技術は、式Ｌｎ（ｘ）に従う輝度および／または発光強度を有する多重標識反応成分を提供し、ここで、Ｌｎは標識反応物上の発光標識の総数に等しく、ｘは対応する単一標識反応物の測定輝度または蛍光強度に等しい。したがって、いくつかの実施形態において、２色素標識反応成分は、１色素標識類似体と比較して２倍の輝度および／または発光強度を有する。いくつかの実施形態において、３または４色素標識反応成分は、１色素標識類似体と比較して、それぞれ３倍または４倍の輝度および／または発光強度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている明るく標識された反応物は、Ｌｎ（ｘ）によって予測された値の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である輝度および／または発光強度を示す。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される核酸リンカーは、少なくとも２つの発光標識を有するオリゴヌクレオチド鎖を含む。図２Ｂは、２つの発光標識に付着した一本鎖核酸リンカー２５０を一般的に示している。示されているように、一本鎖リンカーは、標識間の相互作用を促進する可能性のある比較的高度の柔軟性を有することができる。いくつかの実施形態において、一本鎖リンカー構築物を使用して、一貫したおよび／または保存された寿命を有する明るく標識された反応物を、例えば、シアニンベースの色素などの消光効果を生じるべく相互作用することのない特定の標識を利用することにより生成することができる。しかしながら、いくつかの種類の色素では、リンカーの柔軟性に起因する標識と標識との近接性が促進されると、放射寿命が短くなったり、一貫性が失われたりする可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、標識オリゴヌクレオチド鎖は、１以上のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズして、全体的な核酸リンカーの柔軟性を低下させる。
いくつかの実施形態において、核酸リンカー上の発光標識間の適切な距離ｄＬを開発するための一般的な設計戦略として鎖ハイブリダイゼーションを使用した。いくつかの実施形態において、鎖ハイブリダイゼーションを使用して、核酸の特定の領域（例えば、標識領域内および／または標識領域を反応物から分離する領域内）の剛性を増加させた。図２Ｂは、標識領域を剛性にし、それによってそうでなければ標識－標識間の相互作用を促進する可能性のある鎖の柔軟性を低下させるために、ハイブリダイゼーション化オリゴヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸リンカー２５２を一般的に示す。
核酸リンカー２５２によって図示されるように、いくつかの実施形態において、付着点の周りの発光標識の移動は、標識－標識間の近接性を促進することができる。また、図示されるように、いくつかの実施形態において、付着部位の周りの標識の移動は、核酸リンカーのオリゴヌクレオチド鎖に一層近接した標識をもたらし得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖は、発光標識と相互作用して、一貫性のないおよび／または減少した放射寿命測定値を生成し得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている核酸リンカーは、特定の長さ、剛性、付着部位、および／または標識－標識間の相互作用および／またはリンカー－標識間の相互作用の程度を制限する構成を有するスペーサを含む。
いくつかの実施形態において、発光標識間の分離距離は、標識が互いに対して存在する空間の体積の文脈で定義することができる。たとえば、図２Ｂは、距離ｄＬを測定する方法の例を示す図２５４を示している。いくつかの実施形態において、各発光標識は立体体積２１２によって定義され得る。いくつかの実施形態において、立体体積２１２は、半径２１２－ｒの球として、またはそうでなければ楕円形として近似される。いくつかの実施形態において、各発光標識は、他の標識の中心点から少なくとも５オングストローム離れた中心点を有する立体体積２１２を含む（例えば、隣接する標識間の中心点は少なくとも５オングストローム離れている）。発光標識の中心点は、例えば、標識の重心または幾何学的中心を含む、標識の任意の適切な中心であり得る。いくつかの実施形態において、図２Ｂに図示されるように、半径２１２－ｒを計算または近似することにより、発光標識の中心点を決定することができる。いくつかの実施形態において、発光標識の中心点は、発光標識の最長寸法の半分として計算または近似することができる（たとえば、図１Ａのｒ１およびｒ２について本明細書の他の箇所で説明するように）。
いくつかの実施形態において、隣接する発光標識間の距離（ｄＬ）は、隣接する発光標識の重心間の距離として測定され得る。いくつかの実施形態において、重心は、発光標識内のすべての原子の平均位置を指し、それらの質量に従って重み付けされる。重心を計算する方法は、当技術分野で知られている（例えば、リーチ（Ｌｅａｃｈ），Ａ．Ｒ．、分子モデリング：原理と応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（第２版）、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ（２００１年）；グエンザ（Ｇｕｅｎｚａ），Ｍ．、（２００２年）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３５（７）：２７１４～２７２２頁、を参照）。
いくつかの実施形態において、隣接する発光標識間の距離（ｄＬ）は、隣接する発光標識の幾何学的中心間の距離として測定することができる。分子の幾何学的中心は、いくつかの実施形態において、分子のすべての原子（例えば、発光標識のすべての原子）の平均位置を指し、原子は重み付けされていない。したがって、いくつかの実施形態において、分子の幾何学的中心は、分子内のすべての原子の座標の平均である空間内の点を指す。
いくつかの実施形態において、立体体積２１２は、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用してより正確に計算される。たとえば、分極率を含む特性のモル屈折率は、式：
モル屈折率＝［（ｎ２－１）／（ｎ２＋２）］×（ＭＷ／ｄ）
（ここで、ｎ＝屈折率；ＭＷ＝分子量；およびｄ＝密度である）
に従って計算され得る。
いくつかの実施形態において、標識の立体体積２１２は、追加の、および／またはより複雑な因子を含むようにコンピュータ的に（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ）計算することができる。たとえば、Ｖｅｒｌｏｏｐ立体係数は、結合角、ファンデルワールス半径、結合長、および可能な立体配座に基づいて分子の空間寸法を提供する（たとえば、ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ），Ｋ．Ｃ．他、（２０１２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４、３６６～３７４頁を参照）。
いくつかの実施形態において、付着部位の周りの発光標識の移動は、分離距離ｄＬに考慮され得る。図２Ｂに示すように、いくつかの実施形態において、標識のスペーサ長および立体体積に基づいて、各付着部位の周りの標識の移動範囲を定義することができる。この理論的な移動の範囲は破線で示されている。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される様々な組成物および設計戦略は、移動の範囲が示される重複領域に近づく程度を有利に制限できることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、標識が重複領域に近づく可能性が高い程度を制限するために、本開示に従って、スペーサ剛性、スペーサ長、および付着部位の分離にそれぞれ対処することができる。また、例えば、放射および／または非放射減衰が発生するために標識が必ずしも物理的に接触する必要がないため、図２５４が例示目的であることを理解されたい。
いくつかの実施形態において、図２５４に描かれた標識の移動の範囲は、一般に空間体積と称され、例えば、標識が時間内の所定の地点にて空間のある地点に存在する可能性のあるさまざまな確率の領域を有する空間の領域であり得る。いくつかの実施形態において、各標識は、任意の他の発光標識の空間体積と実質的に重ならない空間体積を占める。いくつかの実施形態において、各標識は、任意の他の標識を実質的に含まない空間体積を占有する。
いくつかの実施形態において、二本鎖リンカーのらせん構造を考慮して、発光標識の相対付着部位を設計することができる。図２Ｃは、距離ｘだけ分離された２つの標識を有する核酸２６０の例を示している。核酸２６２（ほぼ縮尺で描かれている）は、核酸２６０の約半分の塩基（ｒｏｕｇｈｌｙ ｈａｌｆ ａｓ ｍａｎｙ ｂａｓｅｓ ａｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）で隔てられた付着部位で２つの発光標識に付着されているが、らせんに沿った相対的付着部位の位置により、およそ２ｘの空間の標識分離距離が生じる。図示されるように、いくつかの実施形態において、核酸リンカーは、標識間の立体障壁として作用することにより、標識間の放射および／または非放射減衰の程度をさらに制限することができる。
いくつかの実施形態において、「立体障壁（ｓｔｅｒｉｃ ｂａｒｒｉｅｒ）」という用語は、リンカーに付着した発光標識とリンカーの他の付着物との間に位置するリンカーまたはリンカーの一部（例えば、核酸リンカーまたはその一部）を指す。理論に束縛されることを望まないが、立体障壁は、発光標識によって放射される放射および／または非放射減衰を吸収、偏向、またはそうでなければブロックすることができると考えられている。いくつかの実施形態において、立体障壁は、１つ以上の発光標識が１つ以上の他の発光標識と相互作用する程度を防止または制限する。いくつかの実施形態において、立体障壁は、１つ以上の発光標識が１つ以上の反応物と相互作用する程度を防止または制限する。いくつかの実施形態において、立体障壁は、１つ以上の発光標識が反応物（例えば、反応物に結合したポリメラーゼ）に関連する１つ以上の分子と相互作用する程度を防止または制限する。したがって、いくつかの実施形態において、立体障壁という用語は一般に、核酸リンカーのある部分によって提供される保護または遮蔽効果を指すことがある。
いくつかの実施形態において、１つ以上の構造モチーフは立体障壁として機能することができる。例えば、いくつかの実施形態において、二本鎖核酸リンカーによって形成されたらせんは立体障壁として機能する。いくつかの実施形態において、ステムループまたはその一部（例えば、ステム、ループ）は立体障壁として機能する。いくつかの実施形態において、三方向接合部（ｔｈｒｅｅ－ｗａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）（例えば、２つ以上のステムループを有する核酸のように）は立体障壁として機能する。いくつかの実施形態において、付着物を有さないハイブリダイゼーションされた鎖（例えば、支持鎖）は立体障壁として機能する。いくつかの実施形態において、スペーサは立体障壁として機能する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された明るく標識された反応物は、発光標識と反応物との間の分離を提供する。いくつかの実施形態において、核酸２６４は、合成反応においてポリメラーゼ２９０の基質として機能するヌクレオシドポリリン酸２８０反応物を含む。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ活性部位に近接した標識は、ポリメラーゼ活性に有害であり得るポリメラーゼ光損傷を誘発する可能性がある（例えば、非放射減衰などを介して）。図示されるように、核酸２６６は、リンカーの少なくとも一部が標識と反応物との間の介在領域にあるように反応物に付着される。そのようなものとして、いくつかの実施形態において、核酸リンカーは、標識誘導光損傷からポリメラーゼをさらに保護する立体障壁として機能することができる。ポリメラーゼ保護のこの効果は、いくつかの実施形態において、標識－反応物間の空間的分離および／または標識と反応物との間の立体障壁の存在を通じて起こり得る。ポリメラーゼ保護は、同時係属中の米国特許出願第１５／６００９７９号にさらに詳細に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、核酸リンカー（例えば、核酸リンカーの１つ以上のオリゴヌクレオチド鎖および／または１つ以上のスペーサ）のサイズおよび構成が、発光標識とヌクレオシドポリリン酸との間の距離を決定する。いくつかの実施形態において、距離は約１ｎｍまたは２ｎｍ～約２０ｎｍである。たとえば、２ｎｍを超える、５ｎｍを超える、５～１０ｎｍ、１０ｎｍを超える、１０～１５ｎｍ、１５ｎｍを超える、１５～２０ｎｍ、２０ｎｍを超える。しかしながら、特定の検出技術では、発光標識が励起されるために定義された照射ボリューム内にあることが必要であるため、発光標識とヌクレオシドポリリン酸との間の距離は長すぎてはいけない（たとえば、ヌクレオシドポリリン酸がポリメラーゼの活性部位内に保持されている場合）。したがって、いくつかの実施形態において、全体の距離は、３０ｎｍ未満、２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ、または２０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物の他の特徴を実装して、標識－反応物間の分離を促進し、標識により誘発される光損傷の可能性を最小限に抑えることができ、同特徴は、例えばスペーサ長、スペーサ剛性、付着部位の位置である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸リンカーへの反応物の接続は、標識－反応物間の分離を促進するために発光標識に対して修飾され得る。図３Ａは、同一の鎖または反対の鎖の標識－反応物の接続を有する核酸リンカーを一般的に示している。いくつかの実施形態において、核酸３００は、２つ以上の発光標識と、同じオリゴヌクレオチド鎖に付着した反応物とを含む。いくつかの実施形態において、同一の鎖の接続により、標識と反応物との間に共有結合が生じる。
いくつかの実施形態において、核酸３０２は、２つ以上の発光標識と、異なるオリゴヌクレオチド鎖に付着した反応物とを含む。いくつかの実施形態において、反対の鎖の接続は、標識と反応物との間の非共有結合をもたらす。いくつかの実施形態において、標識および反応物の反対の鎖の接続は、標識付着オリゴヌクレオチド鎖および反応物付着オリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションによって生じる。図示されるように、いくつかの実施形態において、本開示の核酸リンカーは、標識－反応物分離距離ｄＬＲを含む。いくつかの実施形態において、ｄＬＲは、反応物と最も近い発光標識との間の距離である。いくつかの実施形態において、ｄＬＲは、標識付着部位から反応物付着部位まで測定される。いくつかの実施形態において、ｄＬＲは、標識の発光分子から反応物まで測定される。いくつかの実施形態において、ｄＬＲは少なくとも１ｎｍである。いくつかの実施形態において、ｄＬＲは約１ｎｍ～約１０ｎｍの間である（例えば、約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、または１０ｎｍ以上）。いくつかの実施形態において、ｄＬＲは約２ｎｍ～約３０ｎｍの間（例えば、約２～２５ｎｍの間、約２～２０ｎｍの間、約２～１５ｎｍの間、約２～１０ｎｍの間、約２～５ｎｍの間、約５～１０ｎｍの間、約１０～２０ｎｍの間、約５～３０ｎｍの間、約１５～３０ｎｍの間、または約２０～３０ｎｍの間）である。
図３Ｂは、明るく標識された反応物の設計に使用される非限定的な距離仕様の例を示す。いくつかの実施形態において、核酸リンカー３０４は、同一の鎖の接続を介して２つの発光標識およびヌクレオシド六リン酸（例えば、反応物）に付着される。いくつかの実施形態において、図示されるように、ｄＬは約１ｎｍであり、ｄＬＲは約７ｎｍである。いくつかの実施形態において、本開示の明るく標識された反応物は、３つ以上の発光標識を含む。例えば、いくつかの実施形態において、核酸リンカー３０６は、同一の鎖の接続を介して３つの発光標識およびヌクレオシド六リン酸（例えば、反応物）に結合される。図示されるように、いくつかの実施形態において、３つ以上の付着部位に３つ以上の発光標識が付着した構築物は、必然的に２つ以上の分離距離ｄＬを有するであろう。いくつかの実施形態において、単一の構築物上の各分離距離ｄＬは、本明細書の記載に従って独立して設計することができる。いくつかの実施形態において、各標識分離距離ｄＬは、ほぼ同一になるように設計することができる。例えば、いくつかの実施形態において、分離距離ｄＬの各出現は約３．５ｎｍであり、ｄＬＲは約７ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本出願の明るく標識された反応物は、異なるオリゴヌクレオチド鎖を介して付着された２つ以上の発光標識を含む。例えば、いくつかの実施形態において、核酸リンカー３０８は、別個のオリゴヌクレオチド鎖を介して付着された４つの発光標識を含む。いくつかの実施形態において、核酸リンカー３０８の非標識オリゴヌクレオチド鎖は、２つの発光標識およびヌクレオシドポリリン酸に付着した第１のオリゴヌクレオチド鎖に相補的な第１の部分を含む。非標識オリゴヌクレオチド鎖は、２つの発光標識に付着した第２のオリゴヌクレオチド鎖に相補的な第２の部分をさらに含む。図示されるように、いくつかの実施形態において、各標識鎖内の発光標識付着部位は、９ヌクレオチドだけ隔てられている。いくつかの実施形態において、非連続な標識鎖上の最も近い付着部位間の分離は、同一であっても、異なっていても（例えば、１０ヌクレオチドの分離により図示されるように）よい。
同一の鎖の標識－反応物の接続を有する非限定的な一般的な核酸リンカー３０４は、図３Ｃに示される標識ヌクレオシドポリリン酸を生成するための基礎として使用された。図示されるように、図３Ｃの核酸リンカーは、２つのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド鎖を含む。本開示の特定の実施形態によれば、２つの発光標識をリンカーの第１のオリゴヌクレオチド鎖内の脱塩基部位に付着させた。本明細書の他の場所で一般的な付着戦略として記載されているクリックケミストリー技術を使用して、ヌクレオシドポリリン酸を同じオリゴヌクレオチド鎖に付着させた。本明細書に記載されている理論に従って、付着成分の拘束された空間的立体配座を促進するために、第２のオリゴヌクレオチド鎖を第１の鎖にハイブリダイズさせた。図３Ｃの構築物は、他の標識されたヌクレオシドポリリン酸との単一分子配列決定の実施で首尾よく使用できた（図３Ｄ）。同様に設計された構築物が、反対の鎖の接続を有して生成され、図３Ｅに示される。
図３Ｅは、ヌクレオシドポリリン酸（例えば、反応物）を発光標識と非共有結合的に連結する核酸リンカーの例示的な構造を示す。図示されるように、脱塩基付着部位で２つの発光標識に付着した第１のオリゴヌクレオチド鎖を、末端付着部位でヌクレオシド六リン酸に付着した第２のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせた。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物を生成するために本開示で提供される設計戦略は、リンカーに組み込まれた（例えば、オリゴヌクレオチド鎖などのオリゴマーリンカーまたはポリマーリンカーに組み込まれた）標識などの代替的な標識コンジュゲーション戦略を含むと考えられる。例えば、図３Ｆは、オリゴヌクレオチド鎖内に２つの標識が付着した核酸リンカーの例を示す。
図３Ｆに図示されるように、いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物は、オリゴヌクレオチド鎖内に付着した（例えば、鎖に組み込まれた）２つの発光標識を含む。いくつかの実施形態において、そのようなコンジュゲーション戦略は、シアニンベースの色素などの、放射および／または非放射減衰を介して相互作用しない発光分子を使用して実装できる（たとえば、図３Ｆの四角で囲まれた領域）。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖内に付着した発光分子の数は、オリゴヌクレオチド鎖のサイズによってのみ制限され得る。したがって、いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物は、オリゴヌクレオチド鎖内に付着した２個を超える発光標識（例えば、２、３、４、５、６、または６個を超える発光標識）を含む。図３Ｆに示した構築物は、３つの他の明るく標識されたヌクレオシドポリリン酸（図３Ｇ）を使用した配列決定の実施で首尾よく使用できた。
本開示は、いくつかの態様において、一貫したおよび／または保存された放射寿命を有する明るく標識された反応物の足場を提供する構造的に拘束された立体配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）を有する核酸リンカーを設計できるという発見に関する。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖ハイブリダイゼーションは、標識分離の目的のために、拘束された立体配座を促進する１つの一般的な戦略である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖ハイブリダイゼーションは、異なるオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションを伴う。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖ハイブリダイゼーションは、自己鎖（ｓｅｌｆ－ｓｔｒａｎｄ）ハイブリダイゼーション（例えば、一本鎖内での自己ハイブリダイゼーション）を伴う。いくつかの実施形態において、別個の鎖ハイブリダイゼーションに関して本明細書の他の箇所で説明するように、自己鎖ハイブリダイゼーションは核酸リンカーの柔軟性を制限する場合がある。いくつかの実施形態において、自己鎖ハイブリダイゼーションを使用して、核酸リンカーに１つ以上のステムループ構造を形成する。
ステムループ、またはヘアピンループは、オリゴヌクレオチド鎖が折り畳まれ、同一の鎖の別のセクションと塩基対を形成するときに形成される、オリゴヌクレオチド鎖上のヌクレオチドの不対ループである。いくつかの実施形態において、ステムループの不対ループは３～１０個のヌクレオチドを含む。したがって、ステムループは、ハイブリダイズしてステムを形成する逆相補配列を有するオリゴヌクレオチド鎖の２つの領域によって形成することができ、２つの領域は不対ループを形成する３～１０ヌクレオチドによって分離される。いくつかの実施形態において、ステムは、１つ以上のＧ／Ｃヌクレオチドを有するように設計することができ、これは、Ａ／Ｔヌクレオチドと比較して形成される付加的な水素結合相互作用によりさらなる安定性を提供できる。いくつかの実施形態において、ステムは、不対ループ配列にすぐ隣接するＧ／Ｃヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ステムは、不対ループ配列に隣接する第１の２、３、４、または５ヌクレオチド内にＧ／Ｃヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ステムループ核酸リンカーの不対ループは、１つ以上の発光標識を含む。したがって、いくつかの実施形態において、１つ以上の標識付着部位が不対ループに存在する。いくつかの実施形態において、付着部位は、不対ループの脱塩基部位に生じる。いくつかの実施形態において、付着部位は不対ループの基部に生じる。いくつかの実施形態において、ループは、例えば、本明細書の他の場所で説明されるように、グアニンで観察される消光効果のために、Ａ／Ｔ／Ｕに富む配列を含む。いくつかの実施形態において、付着部位は、不対ループ内のＡ、Ｔ、またはＵヌクレオチドで生じる。いくつかの実施形態において、少なくとも４つの連続するＡ、Ｔ、またはＵヌクレオチドは、付着部位のいずれかの側に存在する。いくつかの実施形態において、不対ループは、３３％未満のＧ／Ｃ含有量（例えば、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または０％のＧ／Ｃ含有量）を含む。
いくつかの実施形態において、発光標識は、ステムループの不対ループに付着される（例えば、標識付着部位はループ内に生じる）。例えば、図４Ａは、ステムループ核酸リンカー４００を有する標識反応物の例を一般的に示している。図示されるように、いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖４１０は自己ハイブリダイズしてステムループを形成する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の自己ハイブリダイズされた部分は、ステムループのステム４１２を形成する。いくつかの実施形態において、自己の鎖のハイブリダイゼーションは、ステムループのループ４１４（例えば、不対ループ）の形成をもたらす。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖４１０は、反応物に付着した第２のオリゴヌクレオチド鎖４２０とさらにハイブリダイズされる。したがって、いくつかの実施形態において、ステムループ核酸リンカーは、反対の鎖の接続を介して発光標識を反応物に非共有結合する。いくつかの実施形態において、発光標識に付着した自己ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド鎖（例えば、ステムループを有する鎖）は、同一の鎖の接続を介して１つ以上の反応物に付着できることを理解されたい。
いくつかの実施形態において、２つ以上の発光標識がステムループ核酸リンカーに付着している。例えば、いくつかの実施形態において、ステムループ核酸リンカー４０２は、２つの発光標識に付着している。図示されるように、いくつかの実施形態において、２つの発光標識の付着部位は、ステムループのループ内に生じる。いくつかの実施形態において、自己ハイブリダイズされたステム領域によって提供される安定性により、比較的低いレベルの柔軟性を有するループ領域となる。いくつかの実施形態において、不対ループ内の発光標識付着部位は、好ましい標識－標識間の空間分離および／または好ましい標識－反応物間の空間分離を促進するように設計することができる。非限定的なステムループ核酸リンカー４０２によって提供される例は、ループの直径に近い距離だけ互いに分離されている標識付着部位を示している。いくつかの実施形態において、この設計は、空間を介した標識－標識間の分離を最大化することができる。いくつかの実施形態において、この設計は、本明細書の他の場所で説明されるように、ループによって提供される立体バリア効果を通じて標識－標識間の相互作用の程度をさらに制限する。いくつかの実施形態において、ステムループ核酸リンカーは２つ以上のステムループを含む（図４Ｂ）。
図４Ｂに図示されるように、いくつかの実施形態において、ステムループ核酸リンカー４０４は、２つのステムループを含む。いくつかの実施形態において、２つのステムループの形成は、三方向接合部４１０が形成されるようにＹ字型を有する核酸リンカーをもたらす。いくつかの実施形態において、これらの特徴から生じる相対的な安定性および幾何学的に拘束された立体配座のため、一般的な設計戦略として三方向接合部が企図される。いくつかの実施形態において、ステムループ核酸リンカー４０４は、各ループに付着した１つの発光標識を含む。いくつかの実施形態において、ステムループ核酸４０４は、反対の鎖の接続を介して発光標識と反応物とを非共有結合し、例えば、１つ以上の反応物に付着した第２のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチド鎖に１つ以上の標識が付着されている。いくつかの実施形態において、ステムループ核酸４０６は、同一の鎖の接続を介して発光標識および反応物を接続する（例えば、同じオリゴヌクレオチド鎖に付着した１つ以上の標識および１つ以上の反応物）。ステムループ核酸４０６は、三方向接合部を有する明るく標識された反応物の設計で使用される非限定的な距離仕様の例を示している。たとえば、これらのおおよその距離は、図４Ｃに示す標識ヌクレオシドポリリン酸を生成するための基礎として使用された。図４Ｃの構築物は、他の標識ヌクレオシドポリリン酸との単一分子配列決定で首尾よく使用できた（図４Ｄ）。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発光標識がステムループのステムに付着している。いくつかの実施形態において、核酸リンカーのステムループは発光標識を含まない。いくつかの実施形態において、核酸リンカーのステムループは、ステム内に不対領域（例えば、「バルジループ」）を含む。いくつかの実施形態において、ステムループなどの１つ以上の非標識構造モチーフが核酸リンカーに含まれる（例えば、核酸リンカーにおいて、１つ以上の発光標識と１つ以上のヌクレオシドポリリン酸との間にあるような位置にて）。そのような実施形態において、本明細書の他の箇所に記載されるように、１つ以上の非標識構造モチーフは立体バリア効果を提供することができる。
いくつかの実施形態において、ステムループ核酸リンカーは、発光標識に付着した第１のオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、発光標識は、スペーサを介して第１のオリゴヌクレオチド鎖の付着部位に付着する。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、ステムおよびループ（例えば、不対ループ）を有するステムループ二次構造を形成する。いくつかの実施形態において、ループは付着部位を含む。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは、第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド鎖はヌクレオシドポリリン酸に付着している。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドポリリン酸は、スペーサを介して第２のオリゴヌクレオチド鎖に付着している。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は以下の構造：
Figure 0007287942000002
（式中、ＮＡおよびＮＢはそれぞれ、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから独立して選択される５～４０ヌクレオチドの連続した配列であり、第２のオリゴヌクレオチド鎖はＮＡの５’部分またはＮＢの３’部分のいずれかとハイブリダイズされており、括弧はｙステムループを形成する領域を示し、各ステムループはステムとループとを有し、ｙは１～３であり；Ｎ１およびＮ２はそれぞれ、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから独立して選択される５～２０ヌクレオチドの連続した配列であり、ここで、Ｎ１（Ｓ１）の５’部分とＮ２（Ｓ２）の３’部分は逆相補的または部分的に逆相補的であり、互いにハイブリダイズしてステムモチーフを形成することができ；Ｎ１（Ｌ１）の３’部分、Ｎ２（Ｌ２）の５’部分および介在領域は、Ｓ１とＳ２がハイブリダイズしてステムモチーフを形成するときにループモチーフを形成し；（Ａ／Ｔ）は、Ａ、Ｔ、およびＵから選択されるヌクレオチドであり；Ｘ１は、第２のオリゴヌクレオチド鎖の付着部位であり；Ｙ１は第１のリンカーであり；かつＺ１は発光標識である）
からなる。
本明細書に記載されるように、本開示の態様は、１つ以上の発光標識を１つ以上の反応物（例えば、１つ以上のヌクレオシドポリリン酸）に接続するための幾何学的に拘束されたリンカー構成に関する。いくつかの実施形態において、幾何学的に拘束された構成は、２つ以上の発光標識を有する核酸リンカーを指し、発光標識は対称構成により空間的に分離されている。いくつかの態様において、本開示の明るく標識された反応物は、図５Ａに示されるようなツリー型の構成に似た核酸リンカーを含む。いくつかの実施形態において、ツリー型のリンカー５００は、反応物（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）に接続されたトリス標識核酸リンカーを含む。図示されるように、いくつかの実施形態において、ツリー型のリンカー５００は、３つの主要なオリゴヌクレオチド成分を含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド成分５１０は、分岐リンカーを介して共有結合した４つのオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、成分５１０のオリゴヌクレオチド鎖のうちの３つがそれぞれ発光標識に付着される（例えば、本明細書に記載される末端付着または他のコンジュゲーション戦略を介して）。したがって、いくつかの実施形態において、成分５１０の３つの標識オリゴヌクレオチド鎖は、一般に成分５１０の標識部分と称される。いくつかの実施形態において、成分５１０の第４のオリゴヌクレオチド鎖は標識されていない。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチド鎖は、第２のオリゴヌクレオチド成分５２０とハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、核酸リンカー５００の第２のオリゴヌクレオチド成分５２０は、反応物に付着される（例えば、本明細書に記載される末端付着または他のコンジュゲーション戦略を介して）。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチド成分５３０は、成分５１０の標識部分の３つのオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチド成分５３０は、成分５１０とのハイブリダイゼーションが標識領域の構造的剛性を提供して発光標識の空間的分離を促進するため、支持鎖と称される。
理解されるべきであるように、本明細書に記載されるリンカー設計戦略のいずれかは、本開示により企図されるツリー型の核酸リンカーまたは任意の他の核酸リンカー構成に適用され得る（例えば、鎖接続性、スペーサ特性およびスペーサ構成、標識－標識間の分離、標識－反応物間の分離、３方向接合部など）。ツリー型の核酸５０２は、ツリー型の核酸リンカーを有する明るく標識された反応物の設計で使用される非限定的な距離仕様の例を示している。図示される例として、これらのおおよその距離は、図５Ｂに示される標識ヌクレオシドポリリン酸を生成するための基礎として使用された。図示されるように、いくつかの実施形態において、ツリー型の核酸は、複数の反応物（例えば、２つのヌクレオシドポリリン酸塩、または２つ以上のヌクレオシドポリリン酸塩）を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ツリー型の核酸リンカーは、反応物を有するハイブリダイズされた部分を含む第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖に関して記載されている。例えば、いくつかの実施形態において、ツリー型の核酸リンカーは、カップリング化合物（例えば、分岐カプラー）を介して第１オリゴヌクレオチドの末端で２つ以上の分岐オリゴヌクレオチド鎖に付着した第１オリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、各分岐オリゴヌクレオチド鎖は発光標識に付着している。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、反応物（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）に付着した第２のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチド鎖（例えば、第３のオリゴヌクレオチド成分）は、２つ以上の分岐オリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、カップリング化合物は以下の構造：
Figure 0007287942000003
（式中、Ｎｆは第１のオリゴヌクレオチド鎖であり；Ｎｂは分岐オリゴヌクレオチド鎖であり；ＲｆおよびＲｂはそれぞれ、互いに独立して、置換または非置換アルキレン；置換または非置換アルケニレン；置換または非置換アルキニレン；置換または非置換ヘテロアルキレン；置換または非置換ヘテロアルケニレン；置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換ヘテロシクリレン；置換または非置換カルボシクリレン；置換または非置換アリーレン；置換または非置換ヘテロアリーレン；およびそれらの組み合わせからなる群から選択される結合部または連結基であり；そして、Ｏの各例は、隣接するオリゴヌクレオチド鎖の５’リン酸基または３’ヒドロキシル基のいずれかの酸素原子である）
からなる。
いくつかの態様において、本開示は、星型の核酸リンカーを有する明るく標識された反応物を提供する。図６Ａに示すように、星型の核酸リンカーは、リンカーの外部領域に対称的に配置された反応物と、構成のコア領域により近い１つ以上の発光標識を提供できる。このようにして、いくつかの実施形態において、反応物は、例えばポリメラーゼと反応する可能性がより高くなり得る。いくつかの実施形態において、コア領域付近の発光標識付着部位を囲むヌクレオチド含有量は、本明細書に記載される仕様に従って選択される（例えば、低Ｇ／Ｃ含有量により標識とリンカーと間の消光効果を回避する）。いくつかの実施形態において、星型の核酸リンカー６００は、分岐リンカーを介して付着した３つのオリゴヌクレオチド鎖を有するＹ字型オリゴヌクレオチド成分を含む。いくつかの実施形態において、Ｙ字型オリゴヌクレオチド成分の３つのオリゴヌクレオチド鎖のそれぞれは、反応物に（例えば、末端で）付着している。いくつかの実施形態において、Ｙ字型オリゴヌクレオチド成分の３つのオリゴヌクレオチド鎖のそれぞれは、オリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド鎖の１つは発光標識に付着している。しかしながら、いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド鎖の２つまたは３つがそれぞれ発光標識に付着している。
いくつかの実施形態において、星型の核酸リンカーのＹ字型オリゴヌクレオチド成分は、３個を超える反応物に付着している。例えば、いくつかの実施形態において、星型の核酸リンカー６０２を有する明るく標識された反応物は、Ｙ字形オリゴヌクレオチド成分の２つのオリゴヌクレオチド鎖のそれぞれに２つの反応物を含む。いくつかの実施形態において、２つの反応物は、図示されるように、非標識鎖とハイブリダイズされるＹ字型オリゴヌクレオチド成分の鎖に付着される。
いくつかの実施形態において、星型の核酸リンカーは、標識オリゴヌクレオチド成分および反応物オリゴヌクレオチド成分を含み、各オリゴヌクレオチド成分はＹ字型オリゴヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、星型の核酸リンカー６０４は、３つの発光標識に付着した第１のＹ字型オリゴヌクレオチド成分を含む。いくつかの実施形態において、各発光標識は、第１のＹ字型成分の各オリゴヌクレオチド鎖に付着している。いくつかの実施形態において、図示されるように、各発光標識は、第１のＹ字型オリゴヌクレオチド成分のコア領域の近くに付着している。いくつかの実施形態において、星型核酸リンカー６０４は、３つの反応物に付着した第２のＹ字型オリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、各反応物は、第２のＹ字型成分の各オリゴヌクレオチド鎖に付着している。いくつかの実施形態において、図示されるように、各反応物は、第１のＹ字型オリゴヌクレオチド成分の外部領域で（例えば、末端付着部位を介して）付着される。星型の核酸６０６は、星型の核酸リンカーを有する明るく標識された反応物の設計に使用される非限定的な距離仕様の例を示している。本開示に従って生成された星型核酸リンカーを有する明るく標識された反応物の例示的な構造は、図６Ｂに示されている。
いくつかの実施形態において、星型核酸リンカーは、リンカーのＹ字型オリゴヌクレオチド成分で使用される共有結合カップリング化合物に関して説明することができる。例えば、いくつかの実施形態において、星型の核酸リンカーを有する明るく標識された反応物は、共有結合カップリング化合物から伸びる３つ以上のオリゴヌクレオチド鎖を含む第１のオリゴヌクレオチド成分を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１つは反応物（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）に付着している。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド成分のオリゴヌクレオチド鎖の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）がそれぞれ１つ以上の反応物に付着している。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド成分は第２のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド成分は、発光標識に付着した少なくとも１つのオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド成分は、共有結合カップリング化合物から伸びる３つ以上のオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチド成分の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のオリゴヌクレオチド鎖がそれぞれ発光標識に付着している。
いくつかの態様において、本開示の明るく標識された反応物は、四面体コアを有する核酸リンカーを含む。図６Ｃの例示的な構造によって示すように、四面体コアは、１つ以上の発光標識と１つ以上のヌクレオシドポリリン酸塩の対称的に拘束された空間的配置を促進する４方向共有結合カップリング化合物を指す。図６Ｄは、図６Ｃに示す例示的な構造を合成するために使用できる反応スキームの例を示している。いくつかの実施形態において、四面体コアは、本明細書に記載される１つ以上の明るく標識された反応物設計戦略のいずれかと組み合わせて使用することが企図される。一例として、四面体コアによって提供される対称的に拘束された利点は、図６Ｅに示す明るく標識された反応物を生成するために、本明細書で記載されている３方向接合部を用いて実施された。図示されるように、いくつかの実施形態において、本明細書の他の場所で説明されるように、三方接合部またはその近くでの発光標識の付着は、立体効果を有利に提供することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、対称的な付着を可能にするコア化学カプラーを使用するさらなる対称的に拘束された構成を企図する。いくつかの実施形態において、例えば、明るく標識された反応物はシクロデキストリンベースのコアを含む。三方向接合部を有するシクロデキストリンベースの核酸リンカーを生成するための例示的な合成スキームを図７に示す。シクロデキストリンカップリング化合物の例示的な構造を、本明細書に記載される実施形態に従う３つ以上のオリゴヌクレオチド鎖の共有結合に使用できる他のカップリング化合物の例とともに表１に提供する。
Figure 0007287942000004
スペーサ
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、スペーサを介して核酸リンカーに付着させることができる。いくつかの実施形態において、スペーサは、付着部位で核酸リンカーのオリゴヌクレオチド鎖に付着する。いくつかの実施形態において、付着部位は、オリゴヌクレオチド鎖の末端部位（例えば、５’；または３’；末端）に生じる。例えば、図３Ｃ、３Ｅ、４Ｃ、６Ｂ、６Ｃ、８、９、および１０（ヌクレオチドの末端付着）、および図５Ｂ、９、および１０（発光標識の末端付着）に示されるように、末端付着部位の例が本出願において提供される。いくつかの実施形態において、付着部位は、オリゴヌクレオチド鎖内の脱塩基部位（ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）（例えば、ヌクレオチドを欠いているがヌクレオチドに隣接している部位）で生じる。例えば、図３Ｃ、３Ｅ、６Ｂ、６Ｃ、および８（発光標識の脱塩基付着）に示すように、基本的な脱塩基付着部位の例が本出願において提供される。いくつかの実施形態において、付着部位は、オリゴヌクレオチド鎖の塩基性部位（ｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ）に生じる（例えば、鎖上のヌクレオチドの核酸塩基、糖、またはリン酸などのヌクレオチドに付着する）。例えば、図４Ｃおよび８（発光標識の基本的な取り付け）に示されているように、塩基性取り付け部位の例が本出願で提供されている。
いくつかの実施形態において、スペーサは複数のチミジンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサは分岐スペーサ、例えば分岐チミジンスペーサを含む。いくつかの実施形態において、分岐スペーサは分岐チミジンスペーサを含む。例えば、いくつかの実施形態において、各ヌクレオシドポリリン酸は、式Ｎｕ－Ｔ（Ｔ）ｎＴ－Ｒのチミジンスペーサを含み、ここで、Ｎｕはヌクレオシドポリリン酸を表し、Ｔはチミジンヌクレオチドを表し、ｎは１～３０の整数値であり、そしてＲは１つ以上の追加のヌクレオシドポリリン酸を接続する収束点を表す。いくつかの実施形態において、収束点はさらに、核酸のオリゴヌクレオチド鎖に直接付着している。いくつかの実施形態において、収束点は、例えば、さらなるチミジンリンカーおよび／またはさらなる収束点を介して、オリゴヌクレオチド鎖に間接的にさらに付着される。分岐チミジンスペーサの例を図５Ｂに示し、図５Ｂは、チミジンスペーサとオリゴヌクレオチド鎖にさらに直接付着する収束点とを有する２つのヌクレオシドポリリン酸を示している。
いくつかの実施形態において、スペーサは、２個以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）のヌクレオシドポリリン酸塩が各発光標識に接続されるように、１つ以上の分岐点を含み、２個以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）の発光標識が各ヌクレオシドポリリン酸に接続されており、または２個以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）のヌクレオシドポリリン酸が２個以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）の発光標識に接続されている。
いくつかの実施形態において、スペーサは、核酸リンカーのオリゴヌクレオチド鎖上の末端部位にて付着している。いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、以下に示される一般的なスペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖の５’または３’末端のいずれかに付着される。
Figure 0007287942000005
いくつかの実施形態において、スペーサは、核酸リンカーのオリゴヌクレオチド鎖内の内部脱塩基部位に付着している。いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、以下に示す一般的なスペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖の内部脱塩基部位に付着している。
Figure 0007287942000006
発光標識を取り付けるためのスペーサの例（例えば、末端付着部位、内部脱塩基付着部位、または塩基性付着部位を介して）を表２に提供し、以下に示す。発光標識を有するスペーサ構造が示されてもよいが、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるスペーサ構造のいずれかを使用して反応物（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）を核酸リンカーに付着できるように、反応物を置換できることを理解されたい。
いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、以下に示すグリコールアミンスペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖の内部脱塩基部位に付着している。
Figure 0007287942000007
いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、以下に示されるセリノールアミンスペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖の内部脱塩基部位に付着している。
Figure 0007287942000008
いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、以下に示されるＣ６－アミノ－Ｔスペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖の内部塩基性部位に付着している。
Figure 0007287942000009
いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、以下に示されるＣ２－アミノ－Ｔスペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖の内部塩基性部位に付着している。
Figure 0007287942000010
いくつかの実施形態において、発光標識および／または反応物は、以下に示すＣ８－アルキン－ｄＴスペーサを介してオリゴヌクレオチド鎖の内部塩基性部位に付着している。
Figure 0007287942000011
いくつかの実施形態において、１つ以上の発光標識および／または１つ以上の反応物（例えば、１つ以上のヌクレオシドポリリン酸）は、当該分野で公知の化学カップリング技術を使用して核酸リンカーに付着され得る。例えば、いくつかの実施形態において、クリックケミストリー技術（例えば、銅触媒、ひずみ促進、銅フリークリックケミストリーなど）を使用して、１つ以上の発光標識と１つ以上のヌクレオシドポリリン酸を核酸に付着させることができる。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドポリリン酸は、以下に示される一般構造式に従って、アジドコンジュゲート（ａｚｉｄｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ｄＮ６Ｐ（例えば、ｄＮ６Ｐ－Ｎ３）を介して核酸リンカーに結合される：
Figure 0007287942000012
式中、塩基はアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、およびそれらの誘導体から選択される核酸塩基であり、Ｙ－Ｚ－は－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり；かつＸはＮＨまたはＯである。例えば、いくつかの実施形態において、アジドコンジュゲートｄＮ６Ｐ（例えば、ｄＮ６Ｐ－Ｎ３）および／またはアジドコンジュゲート発光標識（例えば、色素－Ｎ３）は、適切な反応条件下で、ｄＮ６Ｐ－Ｎ３または色素－Ｎ３のアジドをアルキンコンジュゲート核酸リンカーの末端アルキンと接触させて、核酸リンカーとｄＮ６Ｐまたは色素との間にトリアゾール結合を形成することにより、銅触媒反応において核酸リンカーに付着される。いくつかの実施形態において、アジドコンジュゲートｄＮ６Ｐ（例えば、ｄＮ６Ｐ－Ｎ３）および／またはアジドコンジュゲート発光標識（例えば、色素－Ｎ３）は、適切な反応条件下で、ｄＮ６Ｐ－Ｎ３または色素－Ｎ３のアジドをシクロオクチンコンジュゲート核酸リンカーの内部アルキンと接触させて核酸リンカーとｄＮ６Ｐまたは色素との間に多環結合を形成することにより、銅フリー反応にて核酸リンカーに付着する。核酸リンカーのシクロオクチン修飾は、当該分野で公知の銅フリークリックケミストリー部分を生成するのに適したシクロオクチン試薬を使用して達成され得る。例えば、シクロオクチン修飾核酸リンカーは、適切なシクロオクチン試薬（例えば、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチルＮ－スクシンイミジルカーボネート）を核酸リンカーの末端アミンと接触させることにより調製される。
したがって、いくつかの実施形態において、スペーサは、結合基（例えば、ＢＣＮ、テトラジン、テトラゾール、およびクリック反応および同様のカップリング技術に適した反応性部分のカップリングを介して生成される他の生成物）を含む。いくつかの実施形態において、スペーサは次式：
Figure 0007287942000013
（式中、Ｒ１は第１の連結基であり、第１オリゴヌクレオチド鎖の付着部位に付着しており；Ｒ２は第２の連結基であり、Ｒ１とＲ３を共有結合するために行われるカップリング反応で形成されるカップリング部分を含み、Ｒ３は第３の連結基であり、発光標識に付着している。）
からなる。
いくつかの実施形態において、スペーサは、
Figure 0007287942000014
から選択される式：
（式中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、置換または非置換アルキレン；置換または非置換アルケニレン；置換または非置換アルキニレン；置換または非置換ヘテロアルキレン；置換または非置換ヘテロアルケニレン；置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換ヘテロシクリレン；置換または非置換カルボシクリレン；置換または非置換アリーレン；置換または非置換ヘテロアリーレン；およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される結合部または連結基である）
からなる。
いくつかの実施形態において、クリックケミストリーを使用して生成されたスペーサの例を表２に示し、ここで、
Figure 0007287942000015
は発光標識（または代替実施形態においては反応物）である。
Figure 0007287942000016
本明細書で使用される場合、「核酸リンカー」とは、一般に、１つ以上の発光標識を１つ以上のヌクレオシドポリリン酸に接続する核酸を指す。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは一般に、共有結合性付着または塩基対合（例えば、ハイブリダイゼーション）を介して接続された任意の数のオリゴヌクレオチド鎖を有する構築物を指し得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、代替的に、異なる機能的成分（例えば、１つ以上の発光標識、１つ以上のヌクレオシドポリリン酸）が付着できる「コア」または「塩基」構築物と称されることもある。「構築物」なる用語は、いくつかの実施形態において、全般的にリンカーを指すために様々な文脈を通して使用され、本明細書に記載の様々な他の成分（例えば、スペーサ、標識、ヌクレオシドポリリン酸など）を包含しても包含しなくてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸リンカーは、材料の粒子に付着していない（例えば、金属材料、磁性材料、ポリマー材料、または他の材料の粒子に付着していない）。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは線状分子（例えば、「ロッド型」核酸）である。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは環状分子である。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは一本鎖である（例えば、ステムループ構造の有無にかかわらず）。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは二本鎖である（例えば、ステムループ構造の有無にかかわらず）。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸リンカーの２本の鎖は（相補的配列のために）ハイブリダイズされ、共有結合していない。しかしながら、いくつかの実施形態において、（例えば、１つ以上の化学リンカーを使用して）１つ以上の共有結合を導入して、二本鎖リンカーの２つの鎖を共有結合させることができる。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは、本明細書に記載されるように１つ以上の追加の部分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは、ｉ）糖リン酸骨格の内部または末端に１つ以上の追加の部分、ｉｉ）１つ以上の修飾（例えば、１つ以上の修飾塩基または糖）、またはｉ）とｉｉ）の組み合わせ、を含む。しかしながら、いくつかの実施形態において、核酸リンカーは、ｉ）、ｉｉ）、またはｉ）若しくはｉｉ）のいずれも含まない。
核酸リンカーの文脈において、それに付着した「ヌクレオチド」または「ヌクレオシドポリリン酸」は、成長中の核酸鎖に（例えば、配列決定反応中に）組み込まれるように構成される１つ以上のヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）を指すことを理解されたい。いくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシド一リン酸またはヌクレオシドポリリン酸を含む。ヌクレオシドポリリン酸塩の例には、いくつかの実施形態において、ヌクレオシド二リン酸塩または三リン酸塩、またはヌクレオシド六リン酸塩などの３を超える５’リン酸塩を含むヌクレオシドが含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、「標識ヌクレオチド」は、ヌクレオシドポリリン酸が核酸合成反応条件下でポリメラーゼ酵素の基質として作用する、本出願のリンカーを介して１以上の発光標識に結合したヌクレオシドポリリン酸を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドポリリン酸は、ホスホリル転移反応（例えば、ヌクレオシドポリリン酸のα－ホスフェートの、そのβ－ホスフェートから成長中の核酸鎖の３’ヒドロキシル基への転移）において、適切なポリメラーゼ酵素によって作用され得る少なくとも二リン酸基または三リン酸基を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレオシドリン酸塩（例えば、ヌクレオシドポリリン酸塩）は、末端リン酸塩を介して、本出願のリンカーの一部を形成するオリゴヌクレオチド（例えば、標識または非標識オリゴヌクレオチド鎖）に付着することができ、それは、標識誘導の光損傷からポリメラーゼを保護する保護分子として機能できる（たとえば、本出願の他の場所で説明されているように）。本出願に記載の組成物または方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ヌクレオシドリン酸塩（例えば、ヌクレオシドポリリン酸塩）のリン酸塩部分（例えば、ポリリン酸塩部分）は、１つ以上のリン酸塩（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のリン酸基）またはその変異体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ヌクレオシドリン酸塩（例えば、ヌクレオシドポリリン酸塩の）リン酸塩部分（例えば、ポリリン酸塩部分）は、リン酸エステル、チオエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート結合、他の適切な結合、またはそのような修飾の２つ以上、あるいはそれらの２つ以上の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、核酸リンカーの標識鎖および非標識鎖は、互いに実質的に相補的である（例えば、二量体化ドメイン内の鎖が、二量体化ドメインの長さにわたって、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が互いに相補的である）。
ヌクレオシドポリリン酸は、ｎ個のリン酸基を有することができ、ここで、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の数である。ヌクレオシドポリリン酸塩の例には、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸が含まれる。標識ヌクレオチドは、ヌクレオシドポリリン酸の末端リン酸が１つ以上の発光標識を含むリンカー（例えば、核酸リンカー）に付着し、それにより標識ヌクレオシドポリリン酸を形成するように、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸であり得る。そのような標識は、発光（例えば、蛍光または化学発光）標識、蛍光標識、着色標識、発色標識、質量タグ、静電標識、または電気化学標識であり得る。標識（またはマーカー）は、本明細書に記載のスペーサなどのリンカーを介して末端リン酸塩に結合させることができる。リンカー（例えば、スペーサ）は、例えば、少なくとも１つまたは複数のヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基またはハロアルキル基を含むことができ、これは、例えば、天然または修飾ヌクレオチドの末端リン酸で、リン酸エステル、チオエステル、ホスホルアミデートまたはアルキルホスホネート結合を形成するのに適している。リンカー（例えば、スペーサ）は、重合酵素の助けなどを用いて、末端リン酸塩から標識を分離するために切断可能であってもよい。ヌクレオチドおよびリンカー（例えば、スペーサ）の例は、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第７，０４１，８１２号明細書に提供されている。
ヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、またはそれらの変異体のいずれかを含むことができる。ヌクレオチド（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）は、メチル化核酸塩基を含んでいてもよい。例えば、メチル化ヌクレオチドは、核酸塩基に付着した（例えば、核酸塩基の環に直接付着している、核酸塩基の環の置換基に付着している）１つ以上のメチル基を含むヌクレオチドであってもよい。例示的なメチル化核酸塩基には、１－メチルチミン、１－メチルウラシル、３－メチルウラシル、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、７－メチルアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン、１－メチルグアニン、７－メチルグアニン、Ｎ２－メチルグアニン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチルグアニンが含まれる。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、一般に、１つ以上の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、またはそれらの変異体から選択される１つ以上のサブユニットを含んでもよい。いくつかの例では、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらの誘導体である。いくつかの実施形態において、核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トリアゾール結合核酸、２’－Ｆ修飾核酸、およびそれらの誘導体および類似体を含むが、これらに限定されない修飾核酸である。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。いくつかの実施形態において、核酸は一般にヌクレオチドの任意のポリマーを指す。
いくつかの実施形態において、本開示は、それらの分子の１つ以上の発光特性に基づいて単一分子を識別するための新しい組成物を提供する。いくつかの実施形態において、分子（例えば、発光標識されたヌクレオシドポリリン酸）は、その輝度、発光寿命、吸収スペクトル、放射スペクトル、発光量子収率、発光強度、またはそれらの２つ以上の組み合わせに基づいて識別される。識別するとは、分子の正確な分子の同一性を割り当てることを意味する場合もあれば、特定の分子を可能な分子のセットから区別すること（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ）または差別化すること（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ）を意味する場合もある。いくつかの実施形態において、異なる輝度、発光寿命、吸収スペクトル、放射スペクトル、発光量子収率、発光強度、またはそれらの２つ以上の組み合わせに基づいて、複数の単一分子を互いに区別することができる。いくつかの実施形態において、分子を一連の別個の光パルスにさらし、分子から放射される各光子のタイミングまたは他の特性を評価することにより、単一の分子が識別される（例えば、他の分子と区別される）。いくつかの実施形態において、単一の分子から連続して放射される複数の光子に関する情報は、分子を識別するために集約および評価される。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命は、分子から連続して放射される複数の光子から決定され、発光寿命は分子を識別するために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子の発光強度は、分子から連続的に放射される複数の光子から決定され、発光強度は分子を識別するために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命および発光強度は、分子から連続して放射される複数の光子から決定され、発光寿命および発光強度は分子を識別するために使用できる。
したがって、本出願のいくつかの態様において、反応試料は複数の別個の光パルスにさらされ、一連の放射された光子が検出および分析される。いくつかの実施形態において、放射された一連の光子は、存在する単一の分子についての情報を提供し、それは実験の時間にわたって反応サンプル内で変化しない。しかしながら、いくつかの実施形態において、放射された一連の光子は、反応サンプル中に異なる時間に存在する一連の異なる分子に関する情報を提供する（例えば、反応またはプロセスが進行するにつれて）。
発光標識
本明細書で使用される「発光標識（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ）」は、１つ以上の光子を吸収し、その後１つ以上の持続時間後に１つ以上の光子を放射する分子である。いくつかの実施形態において、この用語は、一般に、標識反応物の非反応物部分を指すために使用され得る（例えば、発光標識は、フルオロフォアおよびスペーサの少なくとも一部を含み得る）。いくつかの実施形態において、この用語は、光子を吸収および／または放射する分子（例えば、フルオロフォア）を具体的に指す。いくつかの実施形態において、この用語は、文脈に応じて「発光分子」と交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、発光標識はフルオロフォア（例えば、本明細書で互換的に使用される「色素」または「フルオロフォア色素」）である。いくつかの実施形態において、発光標識はローダミンベースの分子である。いくつかの実施形態において、発光標識はシアニンベースの分子である。いくつかの実施形態において、発光標識はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ベースの分子である。
通常、発光標識は芳香族またはヘテロ芳香族化合物を含み、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、カルバゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、フェナントリジン、フェノキサジン、ポルフィリン、キノリン、エチジウム、ベンズアミド、シアニン、カルボシアニン、サリチレート、アントラニレート、クマリン、フルオレセイン、ローダミンまたは他の同様の化合物、であり得る。色素の例としては、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’－ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）を含む、フルオレセインまたはローダミン染料のようなキサンテン色素が含まれる。色素の例には、アルファまたはベータ位置にアミノ基を有するナフチルアミン色素も含まれる。たとえば、ナフチルアミノ化合物には、１－ジメチルアミノナフチル－５－スルホネート、１－アニリノ－８－ナフタレンスルホネートおよび２－ｐ－トルイジニル－６－ナフタレンスルホネート、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が含まれる。色素の他の例には、３－フェニル－７－イソシアナトクマリンなどのクマリン；９－イソチオシアナトアクリジンやアクリジンオレンジなどのアクリジン；Ｎ－（ｐ－（２－ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；インドジカルボシアニン３（Ｃｙ（登録商標）３）、（２Ｚ）－２－［（Ｅ）－３－［３－（５－カルボキシペンチル）－１，１－ジメチル－６，８－ジスルホベンゾ［ｅ］インドール－３－イウム－２－イル］プロプ－２－エニリデン］－３－エチル－１，１－ジメチル－８－（トリオキシダニルスルファニル）ベンゾ［ｅ］インドール－６－スルホネート（Ｃｙ（登録商標）３．５）、２－｛２－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－２－オキソエチル｝－１６，１６，１８，１８－テトラメチル－６，７，７ａ，８ａ，９，１０，１６，１８－オクタヒドロベンゾ［２’’，３’’］インドリジノ［８’’，７’’：５’，６’］ピラノ［３’，２’：３，４］ピリド［１，２－ａ］インドール－５－イウム－１４－スルホネート（Ｃｙ（登録商標）３Ｂ）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ（登録商標）５）、インドジカルボシアニン５．５（Ｃｙ（登録商標）５．５）、３－（－カルボキシ－ペンチル）－３’－エチル－５，５’－ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）などのシアニン；１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ－キサンテノ［２，３，４－ｉｊ：５，６，７－ｉ’ｊ’］ジキノリジン－１８－イウム、９－［２（または４）－［［［６－［２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル）オキシ］－６－オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］－４（または２）－スルホフェニル］－２，３，６，７，１２，１３，１６，１７－オクタヒドロ－内塩（ＴＲまたはテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）（登録商標））；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素；ベンゾオキサゾール；スチルベン；およびピレンなどが含まれる。
特定の実施形態において、発光標識は表３から選択される色素である。表３に列記されている色素は非限定的であり、本出願の発光標識には表３に列記されていない色素が含まれる場合がある。特定の実施形態において、１つ以上の発光標識ヌクレオチドの発光標識は表３から選択される。特定の実施形態において、４つ以上の発光標識ヌクレオチドの発光標識は、表３から選択される。
Figure 0007287942000017
Figure 0007287942000018
Figure 0007287942000019
Figure 0007287942000020
色素は、最大吸光度または放射された発光の波長に基づいて分類することもできる。表４は、最大吸光度のおおよその波長に従って列にグループ化された例示的なフルオロフォアを提供する。表４に列記されている色素は非限定的であり、本出願の発光標識は表４に列記されていない色素を含んでもよい。正確な最大吸光度または放射波長は、示されたスペクトル範囲に対応しない場合がある。特定の実施形態において、１つ以上の発光標識ヌクレオチドの発光標識は、表４に列記された「赤色」群から選択される。特定の実施形態において、１つ以上の発光標識ヌクレオチドの発光標識は、表４に列記された「緑色」群から選択される。特定の実施形態において、１つ以上の発光標識ヌクレオチドの発光標識は、表４に列記された「黄色／オレンジ色」群から選択される。特定の実施形態において、４つのヌクレオチドの発光標識は、すべてが表４に列記された「赤色」、「黄色／オレンジ色」、または「緑色」グループの１つから選択されるように選択される。特定の実施形態において、４つのヌクレオチドの発光標識は、表４に列記される「赤色」、「黄色／オレンジ色」、および「緑色」群の第１の群から３つが選択され、４番目が表４に列記されている「赤色」、「黄色／オレンジ色」、および「緑色」群の第２の群から選択されるように選択される。特定の実施形態において、４つのヌクレオチドの発光標識は、表４に列記された「赤色」、「黄色／オレンジ色」、および「緑色」群の最初から２つが選択され、３番目および４番目が表４に列記されている「赤色」、「黄色／オレンジ色」、および「緑色」群の第２の群から選択されるように選択される。特定の実施形態において、４つのヌクレオチドの発光標識は、表４に列記された「赤色」、「黄色／オレンジ色」、および「緑色」群の最初から２つが選択され、３番目が表４に列記されている「赤色」、「黄色／オレンジ色」、および「緑色」群の第２の群から選択され、かつ４番目が表４に列記されている「赤色」、「黄色／オレンジ色」、および「緑色」群の第３の群から選択されるように選択される。
Figure 0007287942000021
Figure 0007287942000022
Figure 0007287942000023
特定の実施形態において、発光標識は、第１および第２の発色団を含み得る。いくつかの実施形態において、第１の発色団の励起状態は、第２の発色団へのエネルギー移動を介して緩和することができる。いくつかの実施形態において、エネルギー伝達はＦｏｅｓｔｅｒ共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）である。そのようなＦＲＥＴ対は、複数の発光標識の中から標識を区別しやすくする特性を有する発光標識を提供するのに有用であり得る。特定の実施形態において、ＦＲＥＴ対は、第１のスペクトル範囲で励起エネルギーを吸収し、第２のスペクトル範囲で発光を放射し得る。
いくつかの実施形態において、発光標識は、本明細書に記載されるリンカー分子内に付着される（例えば、オリゴマーまたはポリマーリンカーに組み込まれる）。表５は、オリゴヌクレオチド鎖の文脈におけるそのようなコンジュゲーション戦略に適合するフルオロフォアのいくつかの例を提供する。示されているように、表５のシアニンベースのフルオロフォアは、フルオロフォア自体がオリゴヌクレオチド鎖内の共有結合の一部を形成するように、第１鎖部分の３’末端と第２の鎖部分の５’末端にコンジュゲートする（たとえば、発光標識は、スペーサを使用せずに付着される）。いくつかの実施形態において、これらのおよび類似のタイプのフルオロフォアは、オリゴマーまたはポリマー構造の任意のクラス内に付着できることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、第１のペプチド部分のＣ末端および第２のペプチド部分のＮ末端へのコンジュゲーションを介してペプチド内に付着している。いくつかの実施形態において、単一のリンカー分子は、リンカー内に付着した２つ以上のフルオロフォアを含む（例えば、単一のリンカー内に付着した２、３、４、５、６、または６つ以上の色素）。いくつかの実施形態において、リンカーは、リンカー内に付着した１つ以上のフルオロフォアと、スペーサを介して付着した１つ以上のフルオロフォアとを含む。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている明るく標識された反応物は、リンカー内でスペーサなしで付着した１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、または６つを超える）のフルオロフォアと、スペーサを介してリンカーに付着した１つ以上（たとえば、１、２、３、４、５、６つ、または６つを超える）のフルオロフォアと、を含む。
Figure 0007287942000024
一連の発光標識分子（たとえば、発光標識ヌクレオチド）の場合、発光標識ＦＲＥＴ対の特性により、複数の識別可能な分子（たとえば、ヌクレオチド）を選択できる。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ対の第２の発色団は、複数の他の発光標識分子とは異なる発光寿命を有する。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ対の第２の発色団は、複数の他の発光標識分子とは異なる発光強度を有する。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ対の第２の発色団は、複数の他の発光標識分子とは異なる発光寿命および発光強度を有する。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ対の第２の発色団は、複数の他の発光標識分子とは異なるスペクトル範囲の光子を放射する。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ対の第１の発色団は、複数の発光標識分子とは異なる発光寿命を有する。特定の実施形態において、ＦＲＥＴ対は、複数の他の発光標識分子とは異なるスペクトル範囲の励起エネルギーを吸収し得る。特定の実施形態において、ＦＲＥＴ対は、複数の他の発光標識分子のうちの１つ以上と同じスペクトル範囲の励起エネルギーを吸収し得る。
配列決定反応には、明るく標識された反応物の特定の組み合わせが好ましい場合がある。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも１つは、シアニン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも１つは、ローダミン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも２つはそれぞれシアニン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも２つはそれぞれ、ローダミン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも３つはそれぞれ、シアニン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも３つはそれぞれ、ローダミン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも４つはそれぞれ、シアニン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の少なくとも４つはそれぞれ、ローダミン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の３つはそれぞれシアニン色素またはその類似体を含み、明るく標識された反応物の４番目のものはローダミン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の２つはそれぞれシアニン色素またはその類似体を含み、３番目、および任意に４番目の明るく標識された反応物はローダミン色素またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、明るく標識された反応物の３つはそれぞれローダミン色素またはその類似体を含み、３番目、および任意に４番目の明るく標識された反応物はシアニン色素またはその類似体を含む。
本明細書に記載されるように、発光標識は、１つ以上の光子を吸収し、その後１つ以上の持続時間後に１つ以上の光子を放射する分子である。分子の発光は、発光寿命、吸収スペクトル、放射スペクトル、発光量子収率、発光強度を含むがこれらに限定されないいくつかのパラメータによって記載される。吸収と励起という用語は、本出願全体で互換的に使用される。いくつかの実施形態において、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）と放射（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）という用語は互換的に使用される。典型的な発光分子は、複数の波長にて光を吸収するか、それによる励起を受ける場合がある。特定の波長または特定のスペクトル範囲内の励起は、発光放射事象によって緩和される場合があるが、特定の他の波長またはスペクトル範囲での励起は、発光放射事象によって緩和されない場合がある。いくつかの実施形態において、発光分子は、単一波長または単一スペクトル範囲内の発光のためにのみ適切に励起される。いくつかの実施形態において、発光分子は、２つ以上の波長にて、または２つ以上のスペクトル範囲内で発光するために適切に励起される。いくつかの実施形態において、分子は、励起光子の波長または吸収スペクトルを測定することにより特定される。
発光放射事象から放射された光子は、可能な波長のスペクトル範囲内の波長で放射する。通常、放射された光子は、励起光子の波長と比較して、より長い波長を有する（たとえば、エネルギーが少ない、または赤方偏移する）。特定の実施形態において、放射された光子の波長を測定することにより分子が識別される。特定の実施形態において、分子は、複数の放射された光子の波長を測定することにより識別される。特定の実施形態において、放射スペクトルを測定することにより分子が特定される。
発光寿命とは、励起事象と放射事象との間の持続時間を指す。いくつかの実施形態において、発光寿命は、指数関数的減衰の方程式の定数として表される。励起エネルギーを送達する１つ以上のパルス事象があるいくつかの実施形態において、持続時間は、パルスとその後の放射事象との間の時間である。
分子の発光寿命の決定は、任意の適切な方法を使用して実行できる（たとえば、適切な手法を使用して寿命を測定するか、放射の時間依存特性を決定する）。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命を決定することは、１つ以上の分子（例えば、配列決定反応における異なる発光標識されたヌクレオシドポリリン酸）に対する寿命を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命を決定することは、基準に対する寿命を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命を決定することは、寿命（例えば、蛍光寿命）を測定することを含む。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命を決定することは、寿命を示す１つ以上の時間的特性を決定することを含む。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命は、励起パルスに対して１つ以上の時間ゲート窓にわたって生じる複数の放射事象の分布に基づいて決定することができる（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の放射事象）。例えば、単一分子の発光寿命は、励起パルスに関して測定された光子到達時間の分布に基づいて、異なる発光寿命を有する複数の分子と区別され得る。
単一分子の発光寿命は、単一分子が励起状態に達した後に放射される光子のタイミングを示し、単一分子は光子のタイミングを示す情報によって区別できることを理解されたい。いくつかの実施形態は、分子を、その分子によって放射される光子に関連する時間を測定することにより、その分子の発光寿命に基づいて複数の分子から区別することを含み得る。時間の分布は、その分布から決定され得る発光寿命の指標を提供し得る。いくつかの実施形態において、単一分子は、時間の分布を既知の分子に対応する参照分布と比較することなどにより、時間の分布に基づいて複数の分子から区別することができる。いくつかの実施形態において、発光寿命の値は時間の分布から決定される。
発光量子収率とは、特定の波長にて、または特定のスペクトル範囲内で、放射事象を引き起こす励起事象の割合を指し、通常は１未満である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子の発光量子収率は、０～約０．００１、約０．００１～約０．０１、約０．０１～約０．１、約０．１～約０．５、約０．５～０．９、または約０．９～１である。いくつかの実施形態において、発光量子収率を決定または推定することにより分子が特定される。
単一分子について本明細書で使用される場合、発光強度は、パルス励起エネルギーの送達によって励起されている分子によって放射される単位時間あたりの放射光子の数を指す。いくつかの実施形態において、発光強度は、パルス励起エネルギーの送達によって励起されている分子によって放射され、特定のセンサーまたはセンサーのセットによって検出される、単位時間あたりの放射光子の検出数を指す。
発光寿命、発光量子収率、および発光強度は、異なる条件下で特定の分子ごとに異なる場合がある。いくつかの実施形態において、単一分子は、分子の集合体とは異なる観測された発光寿命、発光量子収率、または発光強度を有するであろう。いくつかの実施形態において、サンプルウェルに閉じ込められた分子は、サンプルウェルに閉じ込められていない分子とは異なる観測された発光寿命、発光量子収率、または発光強度を有するであろう。いくつかの実施形態において、別の分子に付着した発光標識または発光分子は、別の分子に付着していない発光標識または発光分子とは異なる発光寿命、発光量子収率、または発光強度を有するであろう。いくつかの実施形態において、巨大分子複合体と相互作用する分子は、巨大分子複合体と相互作用しない分子とは異なる発光寿命、発光量子収率、または発光強度を有するであろう。
特定の実施形態において、本出願に記載される発光分子は、１つの光子を吸収し、ある期間後に１つの光子を放射する。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命は、持続時間を測定することにより決定または推定され得る。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命は、複数のパルス事象および放射事象の複数の持続時間を測定することにより決定または推定することができる。いくつかの実施形態において、持続時間を測定することにより、分子の発光寿命を複数のタイプの分子の発光寿命間で区別することができる。いくつかの実施形態において、分子の発光寿命は、複数のパルス事象および放射事象の複数の持続時間を測定することにより、複数のタイプの分子の発光寿命間で区別することができる。特定の実施形態において、分子は、分子の発光寿命を決定または推定することにより、複数のタイプの分子間で識別または区別される。特定の実施形態において、複数のタイプの分子の複数の発光寿命の間で分子の発光寿命を区別することにより、複数のタイプの分子の間で分子が識別または区別される。
特定の実施形態において、発光放射事象は蛍光である。特定の実施形態において、発光放射事象はリン光である。本明細書で使用される場合、発光という用語は、蛍光とリン光の両方を含むすべての発光事象を包含する。
配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
本出願のいくつかの態様は、核酸やタンパク質などの生体ポリマーの配列決定に役立つ。いくつかの態様において、本出願に記載されている組成物および技術を使用して、核酸またはタンパク質に組み込まれている一連のヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーを特定できる（たとえば、一連の標識ヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーの取り込みの経時変化を検出することにより）。いくつかの実施形態において、本出願に記載の組成物および技術を使用して、ポリメラーゼ酵素によって合成された鋳型依存性核酸配列決定反応生成物に組み込まれる一連のヌクレオチドを識別することができる。
標的核酸の核酸塩基と相補的ヌクレオシドポリリン酸（例えば、ｄＮＴＰ）の塩基対形成時に、ポリメラーゼは、新たに合成された鎖の３’ヒドロキシル末端と、ｄＮＴＰのアルファリン酸との間にホスホジエステル結合を形成することにより、新たに合成された核酸鎖にｄＮＴＰを組み込む。（例えば、本出願のリンカーを介して）ｄＮＴＰにコンジュゲートした発光標識がフルオロフォアである例では、その存在は励起によって通知され、取り込みのステップ中および／またはステップ後に放射パルスが検出される。本出願のリンカーを介してｄＮＴＰの末端（ガンマ）リン酸にコンジュゲートされている検出標識（たとえば、発光標識）の場合、新しく合成された鎖へのｄＮＴＰの取り込みにより、ベータおよびガンマリン酸が放出され、そして、リンカーはサンプルウェル内で自由に拡散することができる検出標識を含み、フルオロフォアから検出される放射の減少をもたらす。
特定の実施形態において、鋳型依存性核酸配列決定反応生成物は、天然に存在する核酸ポリメラーゼによって実施される配列決定反応で合成される。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼの変異体または修飾変異体である。いくつかの実施形態において、鋳型依存性核酸配列決定産物は、鋳型核酸鎖に相補的な１つ以上のヌクレオチドセグメントを含むであろう。一態様において、本出願は、その相補的核酸鎖の配列を決定することにより、鋳型（または標的）核酸鎖の配列を決定する方法を提供する。
本明細書で使用される「ポリメラーゼ」という用語は、一般に、重合反応を触媒することができる任意の酵素（または重合酵素）を指す。ポリメラーゼの例には、核酸ポリメラーゼ、転写酵素またはリガーゼが含まれるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは重合酵素であり得る。（例えば、核酸配列決定のための）単一分子核酸伸長を対象とする実施形態は、標的核酸分子に相補的な核酸を合成することができる任意のポリメラーゼを使用してもよい。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および／またはそれらの１つ以上の突然変異体または改変形態であり得る。
ポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、修飾ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ－Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、クレノウフラグメント、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、およびそれらのバリアント、修飾産物および誘導体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは単一サブユニットポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの特性の非限定的な例は、とりわけ、ＤＮＡ複製第２版、コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）およびベイカー（Ｂａｋｅｒ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳細に記載されている。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、高い処理能力を備えたポリメラーゼである。しかしながら、いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、処理能力が低下したポリメラーゼである。ポリメラーゼの処理能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）とは、一般に、核酸鋳型を解放することなくｄＮＴＰを核酸鋳型に連続的に組み込むポリメラーゼの能力を指す。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、低い５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’→５’エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、対応する野生型ポリメラーゼと比較して５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’→５’活性が低下するように（例えば、アミノ酸置換により）修飾される。ＤＮＡポリメラーゼのさらなる非限定的な例には、９°Ｎｍ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、およびクレウノエキソ－ポリメラーゼのＰ６８０Ｇ変異体が含まれる（ツスケ（Ｔｕｓｋｅ）他、（２０００）、ＪＢＣ ２７５（３１）：２３７５９－２３７６８）。いくつかの実施形態において、低減した処理能力を有するポリメラーゼは、ヌクレオチド反復の１つ以上のストレッチ（例えば、同じタイプの２つ以上の連続塩基）を含む鋳型の配列決定の精度を高める。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、非標識核酸よりも標識されたヌクレオチドに対してより高い親和性を有するポリメラーゼである。
別の態様において、本出願は、複数の核酸断片を配列決定することにより標的核酸を配列決定する方法を提供し、ここで標的核酸は断片を含む。特定の実施形態において、この方法は、複数の断片配列を組み合わせて、親標的核酸の配列または部分配列を提供することを含む。いくつかの実施形態において、組み合わせるステップは、コンピュータハードウェアおよびソフトウェアによって実行される。本明細書に記載される方法は、染色体全体またはゲノムなどの関連する一組の標的核酸の配列決定を可能にし得る。
配列決定中に、重合酵素が標的核酸分子のプライミング位置にカップリングしてもよい（たとえば、付着してもよい）。プライミング位置は、標的核酸分子の一部に相補的なプライマーであり得る。代替として、プライミング位置は、標的核酸分子の二本鎖セグメント内に提供されるギャップまたはニックである。ギャップまたはニックは、０から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、または４０個のヌクレオチドの長さである。ニック（ｎｉｃｋ）は、二本鎖配列の一方の鎖の切断を提供することができ、これは、例えば、鎖置換ポリメラーゼ酵素などの重合酵素のプライミング位置を提供することができる。
場合によっては、配列決定プライマーは、固体支持体に固定されていても固定されていなくてもよい標的核酸分子にアニーリングすることができる。固体支持体は、例えば、核酸配列決定に使用されるチップ上のサンプルウェル（例えば、ナノ開口部、反応チャンバ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは、固体支持体に固定され得、標的核酸分子のハイブリダイゼーションはまた、標的核酸分子を固体支持体に固定する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼが固体支持体に固定され、可溶性プライマーおよび標的核酸がポリメラーゼと接触する。しかしながら、いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体が溶液中で形成され、複合体が固体支持体に固定される（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、および／または標的核酸の固定化を介して））。いくつかの実施形態において、サンプルウェル内の成分（例えば、ナノ開口部、反応チャンバ）はいずれも固体支持体に固定化されていない。例えば、いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体は溶液中で形成され、複合体は固体支持体に固定化されない。
適切な条件下で、アニーリングされたプライマー／標的核酸に接触するポリメラーゼ酵素は、１つ以上のヌクレオチドをプライマーに追加または組み込むことができ、ヌクレオチドは５’から３’への鋳型依存的にプライマーに追加できる。（例えば、ポリメラーゼの作用を介した）プライマーへのヌクレオチドのそのような取り込みは、一般的にプライマー伸長反応と称され得る。各ヌクレオチドは、核酸伸長反応中に検出および識別できる検出可能な標識に関連付けられ（たとえば、その発光寿命および／またはその他の特性に基づいて）、伸長プライマーおよび従って新たに合成された核酸分子の配列に組み込まれた各ヌクレオチドを決定するために使用される。標的核酸分子の配列も新たに合成された核酸分子の配列相補性により決定できる。場合によっては、配列決定プライマーの標的核酸分子へのアニーリングおよびヌクレオチドの配列決定プライマーへの取り込みは、同様の反応条件（たとえば、同じまたは同様の反応温度）または異なる反応条件（たとえば、異なる反応温度）にて生じ得る。いくつかの実施形態において、合成方法による配列決定は、標的核酸分子の集団（例えば、標的核酸のコピー）の存在および／または標的核酸の集団を達成するための標的核酸の増幅のステップを含み得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、合成による配列決定は、評価される各反応における単一分子の配列を決定するために使用される（そして配列決定のための標的鋳型を調製するために核酸増幅は必要とされない）。いくつかの実施形態において、本出願の態様に従って、複数の単一分子配列決定反応が並行して（例えば、単一チップ上で）実行される。例えば、いくつかの実施形態において、複数の単一分子配列決定反応はそれぞれ、単一チップ上の別個の反応チャンバ（例えば、ナノ開口部、サンプルウェル）で実施される。
実施形態は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、または９９．９９９９％の正確性、および／または、約１０塩基対（ｂｐ）、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、または１００，０００ｂｐ以上の読み取り長のような、高い正確性および長い読み取り長で単一核酸分子の配列決定をすることができる。いくつかの実施形態において、単一分子配列決定に使用される標的核酸分子は、サンプルウェルの底部または側壁などの固体支持体に固定化または付着された配列決定反応の少なくとも１つの追加成分（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ、配列決定プライマー）を含有するサンプルウェル（例えば、ナノ開口部）に追加または固定化される一本鎖標的核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ誘導体、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＲＮＡ誘導体）鋳型である。標的核酸分子またはポリメラーゼは、サンプルウェルの底部または側壁のようなサンプルの壁に直接またはリンカーを介して付着させることができる。サンプルウェル（たとえば、ナノ開口部）には、たとえば適切な緩衝剤、補因子、酵素（たとえば、ポリメラーゼ）および、例えば本出願のリンカーを介してｄＮＴＰに接続できるフルオロフォアのような発光標識を含む、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰを含む、デオキシリボヌクレオシド三リン酸のようなデオキシリボヌクレオシドポリリン酸といった、プライマー伸長反応を介する核酸合成に必要な他の試薬も含めることができる。いくつかの実施形態において、標識から放射される光の検出が、新たに合成された核酸に組み込まれるｄＮＴＰの同一性を示すように、ｄＮＴＰの各クラス（例えば、アデニン含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ）、シトシン含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＣＴＰ）、グアニン含有ｄＮＴＰ（例えば、ｄＧＴＰ）、ウラシル含有ｄＮＴＰ（たとえば、ｄＵＴＰ）およびチミン含有ｄＮＴＰ（たとえば、ｄＴＴＰ））は（たとえば、本出願のリンカーを介して）別個の発光標識にコンジュゲートされている。「別個の発光標識」は、いくつかの実施形態において、別のｄＮＴＰとは異なる発光標識（例えば、異なるフルオロフォア）を含む１つのｄＮＴＰを指すことができる。いくつかの実施形態において、別個の発光標識とは、別のｄＮＴＰと異なる数の同じまたは類似の発光標識を含む１つのｄＮＴＰを指す。いくつかの実施形態において、別個の発光標識は、他のｄＮＴＰと検出可能に異なる１つ以上の発光特性を含む１つのｄＮＴＰを指す。発光標識から放射された光は、任意の適切なデバイスおよび／または方法を介して検出され、適切な発光標識（および関連するｄＮＴＰ）に起因する。発光標識は、発光標識の存在がｄＮＴＰの新たに合成された核酸鎖への取り込みまたはポリメラーゼの活性を阻害しないように、任意の位置でｄＮＴＰに（例えば、本出願のリンカーを介して）コンジュゲートさせることができる。いくつかの実施形態において、発光標識は、ｄＮＴＰの末端リン酸塩（例えば、ガンマリン酸塩）に（例えば、本出願のリンカーを介して）コンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、一本鎖標的核酸鋳型を、配列決定プライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および核酸合成に必要な他の試薬と接触させることができる。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰの取り込みが連続的に起こり得るように、すべての適切なｄＮＴＰを一本鎖標的核酸鋳型と同時に接触させることができる（例えば、すべてのｄＮＴＰが同時に存在する）。他の実施形態において、ｄＮＴＰを一本鎖標的核酸鋳型と順次接触させてもよく、ここで、一本鎖標的核酸鋳型は、ｄＮＴＰが異なる一本鎖標的核酸鋳型と接触させる間に洗浄ステップを伴って、適切な各ｄＮＴＰと別々に接触する。一本鎖標的核酸鋳型を各ｄＮＴＰと別々に接触させ、続いて洗浄するこのようなサイクルは、識別しようとする一本鎖標的核酸鋳型の連続する各塩基位置について繰り返すことができる。
いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは一本鎖標的核酸鋳型にアニーリングし、ポリメラーゼは一本鎖標的核酸鋳型に基づいて、プライマーにｄＮＴＰ（または他のヌクレオシドポリリン酸）を連続的に組み込む。組み込まれた各ｄＮＴＰに関連付けられた固有の発光標識は、プライマーへのｄＮＴＰの組み込み中または組み込み後に適切な励起光で励起でき、その後、任意の適切なデバイスおよび／または方法を使用して、その放射を検出できる。光の特定の放射の検出（たとえば、特定の放射寿命、強度、スペクトル、および／またはそれらの組み合わせを有する）は、組み込まれた特定のｄＮＴＰに起因する。次いで、検出された発光標識のコレクションから得られた配列を使用して、配列相補性を介して一本鎖標的核酸鋳型の配列を決定することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、同時係属中の米国特許出願第１４／５４３，８６５号、同第１４／５４３，８６７号、同第１４／５４３，８８８号、同第１４／８２１，６５６号、同第１４／８２１，６８６号、同第１４／８２１，６８８号、同第１５／１６１，０６７号、同第１５／１６１，０８８号、同第１５／１６１，１２５号、同第１５／２５５，２４５号、同第１５／２５５，３０３号、同第１５／２５５，６２４号、同第１５／２６１，６９７号、同第１５／２６１，７２４号、同第１５／６００，９７９号、同第１５／８４６，９６７号、同第１５／８４７，００１号、同第１５／９７１，４９３号、同第６２／２８９，０１９号、同第６２／２９６，５４６号、同第６２／３１０，３９８号、同第６２／３３９，７９０号、同第６２／３４３，９９７号、同第６２／３４４，１２３号、および同第６２／４２６，１４４号（それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載された技術において有利に利用され得る方法および組成物を提供する。
キット
さらに他の態様において、本出願は、鋳型核酸を配列決定するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の複数のタイプの発光標識ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標識ヌクレオチドの各タイプは、本出願に従うリンカーを介して１つ以上のヌクレオシドポリリン酸に付着した２つ以上の発光標識を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、図３Ａ～３Ｃ、３Ｅ～３Ｇ、４Ａ～４Ｃ、５Ａ～５Ｂ、６Ａ～６Ｃ、および８～１０に示される標識ヌクレオチドから選択される。例えば、いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、図３Ｇに示される構造に従って設計される。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、図３Ｂ（３０６）、図３Ｂ（３０８）および図５Ａ（５０２）に示される構造に従って設計される。いくつかの実施形態において、キットは、重合酵素（例えば、本明細書の他の場所に記載されるＤＮＡポリメラーゼ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、配列決定される鋳型核酸に相補的なプライマーを含む。
いくつかの態様において、本出願は、本明細書に記載の１つ以上の明るく標識された反応物を含む反応混合物を提供する。いくつかの実施形態において、反応混合物は、配列決定反応に加えられた混合物を含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は重合酵素を含む。いくつかの実施形態において、重合酵素は、固体支持体（例えば、本明細書の他の場所に記載されるように、サンプルウェルの底部）に固定されるように構成される。いくつかの実施形態において、反応混合物は、配列決定される鋳型核酸を含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は、鋳型核酸の一部に相補的なプライマーを含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は、配列決定反応を開始するのに必要な１つ以上の成分（例えば、マグネシウムまたは鉄などの二価金属イオン）を含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は、配列決定反応を安定化するのに必要な１つ以上の成分（例えば、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤など）を含む。
実施例１：核酸リンカーを使用した色素付着戦略
さまざまな次世代シーケンシング技術が、標識された反応成分を実装する。たとえば、色素標識ヌクレオチドを使用して、各塩基タイプに対応する固有の発光特性の検出または観察に基づいて、取り込み事象中に特定の塩基呼び出し（ｃａｌｌｓ）を行うことができる。したがって、寿命および強度のようなこれらの特性は、セット内の各塩基について簡単に識別できることが必要である。標識ヌクレオチドの蛍光強度を高めるための初期の努力により、色素標識ヌクレオチドの輝度は、第２の色素分子が構築物に追加されると増加することが明らかになった。しかしながら、蛍光寿命は、単一標識変異体に比べて著しく減少した。改良された標識ヌクレオチドの開発において、蛍光色素をヌクレオチドに結合するためのコア構造として核酸を調査した。
多重標識ヌクレオチドの蛍光寿命の変化の潜在的な原因の１つは、同じ構築物の色素分子間の相互作用の程度であり、これにより消光効果（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）が得られる。この可能性は、図８に示す色素標識ヌクレオチドを生成することでさらに調査した。２つの色素分子（ＤｙＬｉｇｈｔ ５３０Ｒ２）を、核酸リンカーを介してヌクレオシドポリリン酸に接続した。非標識オリゴヌクレオチド鎖を標識オリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせて、核酸リンカーに剛性を付与した。核酸への色素付着のために、Ｃ６－アミノ－Ｔスペーサを使用して第１の構築物８００を作成し、色素付着のためにグリコールアミンスペーサを使用して第２の構築物８０２を作成した。
第１の構築物の分析では、約１．４ｎｓの蛍光寿命が明らかになり、一方、第２の構築物では約３．５ｎｓの寿命を示した。第２の構築物で測定された寿命の増加は、第１の構築物と比較して、色素の付着に比較的短いスペーサを使用したことに起因していた。図８に示すように、第１の構築物のＣ６－アミノ－Ｔスペーサは、第２の構築物のグリコールアミンスペーサよりも長い。第２の構築物の寿命が改善された１つのあり得る説明は、スペーサの長さが短くなると、付着した色素の移動範囲が重複する程度が制限されるため、色素－色素間の相互作用が減少したことである。
実施例２：リンカーの剛性の増加は蛍光寿命を延長する
潜在的に色素の空間的重複が原因で、スペーサ長が蛍光寿命に影響する可能性があるという観察に続いて、多重標識分子内の色素の対称配置が同様の効果をもたらす可能性があると考えた。Ｙ字型の核酸リンカーを生成して、図９に示す。最初の構築物は、示された分岐リンカーを介して共有結合した３つのオリゴヌクレオチド鎖を有していた。２本の鎖はそれぞれ色素分子（Ｃｈｒｏｍｉｓ ５３０Ｎ）の末端に付着したが、３本目の鎖はヌクレオシドポリリン酸に末端に付着した。ヌクレオシドポリリン酸と標識領域との間に剛性を付与するために、第３の鎖を非標識鎖とさらにハイブリダイズさせた。この構築物の第２のバージョンは、第１および第２の鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド成分９０２とのハイブリダイゼーションによって生成した。
最初の構築物の分析により、約２．３ｎｓの蛍光寿命が明らかになったが、追加のオリゴヌクレオチド成分９０２を有する構築物は約４．２ｎｓの寿命を示した。後者の構築物の寿命の測定された増加の１つのあり得る説明は、オリゴヌクレオチド成分９０２が標識領域に剛性を付与したことである。増加した剛性は、各色素をより限られた移動範囲に拘束することにより、色素の分離を促進すると考えられる。
実施例３：拘束されたリンカー構成における色素スペーサ長の影響
幾何学的に拘束されたリンカー構成は、図１０に示すトリス色素標識構築物を生成することでさらに開発された。図示されているように、核酸リンカー部分は３つの主要なオリゴヌクレオチド成分を含んでいた。第１の成分は、示された四方向分岐リンカーを介して共有結合した４つのオリゴヌクレオチド鎖を含んでいた。これらの鎖のうち３本はそれぞれ末端が色素分子（ＡｔｔｏＲｈｏ６Ｇ）に付着され、４本目の鎖は第２のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズさせた。第二のオリゴヌクレオチド成分は、示されている分岐リンカーを介して２つのヌクレオシドポリリン酸に末端付着されていた。示された分岐リンカーを介して共有結合した３つのオリゴヌクレオチド鎖を含む第３のオリゴヌクレオチド成分を、第１の成分の３つの色素標識鎖とハイブリダイズさせて標識領域に剛性を付与した。図１０に示す四角で囲まれた領域に従って、異なるスペーサ長を有する２つの別個のトリス色素構造体が生成された。
より長いスペーサを有する第１のトリス色素標識ヌクレオチド構築物（図１０、四角で囲まれた領域の上部、を参照）は、１色素標識ヌクレオチド構築物に比べて蛍光強度が３倍になることを示した。加えて、同一の色素分子を有する２色素１ヌクレオチド構築物と比較した場合、寿命がわずかに短縮されたことが示された（図示せず）。より短いスペーサを有する第２のトリス色素標識ヌクレオチド構築物で得られた測定（図１０、四角で囲まれた領域の底部を参照）は、第１のトリス色素標識構築物に比べて蛍光寿命のわずかな増加を示した。
以前のトリス色素標識ヌクレオチドは、配列決定反応中に複数の寿命を生成し、これは、２つの色素が相互作用して第１の寿命を生成し、非相互作用色素が第２の寿命を生成した結果と考えられた。重要なことは、配列決定反応中に図１０に示すいずれかのトリス色素標識分子について、単一の寿命のみが観察されたことである。
等価物と範囲
本明細書においていくつかの発明の実施形態について記載および例示してきたが、当業者は、機能を実施するための、ならびに／あるいは本明細書に記載される結果および／または１つもしくは複数の利点を得るためのさまざまなその他の手段および／または構造について容易に想定するであろうが、そのような変更および／または修正のそれぞれは、本明細書に記載されている本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が特定の用途、または発明の教示が使用される用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、ルーチン的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の発明の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、あるいは確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示されるものであり、別途、具体的に説明および特許請求されない限り、添付した特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、発明の実施形態を実施できることを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載されるそれぞれ個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。さらに、そのような機能、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、そのような機能、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により援用される文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味を制御するものであると理解されるべきである。
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、それらは場合によっては文書全体を包含してもよい。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明らかに反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
語句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、そのように結びつけられた複数の要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、またその他の場合には非結合的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」を用いて列記された複数の要素は、同様に、即ち、そのように結びつけられた複数の要素の「１つまたは複数」として解釈されるべきである。「および／または」の句により特に特定される要素以外のその他の要素が、特に特定された要素と関連するまたは関連しないに関わらず、任意選択的に存在する可能性がある。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」なる記載は、非制限的（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）言語、例えば「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等と連携して使用される場合、１つの実施形態ではＡのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択的にその他の要素を含む）等、を参照する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。たとえば、リスト内の項目を区切る場合、「または」あるいは「および／または」は、包括的、つまり要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが２つ以上、任意選択的にさらなるリスト化されていない項目を含むと解釈されるものとする。「～のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、「～のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または特許請求の範囲において使用される場合の「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、明確に反示される用語に限り、複数の要素の数またはリストのうちのまさに１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」なる用語は、排他性の用語、例えば「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「～のうちの１つ（ｏｎｅ ｏｆ）」、「～のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または「～のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」等が先行する場合に限り、排他的な代替的用語（すなわち、「一方または他方、ただし両方ではない（ｏｎｅ ｏｒ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｏｔｈ）」）を示すと解釈するものとする。「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、１つまたは複数の要素のリストを参照する際の語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきであるが、要素のリスト内に特にリスト化されているあらゆる要素それぞれの少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、また要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを排除するものでもない。この定義は、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で特に特定された要素以外の要素が、そのような特に特定された要素に関連するか関連しないかに関わらず、任意選択的に存在し得ることも可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同じく「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同じく「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、１つの実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含み、Ｂは存在しない（任意選択的にＢ以外の要素を含む）こと；別の実施形態では、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含み、Ａは存在しない（任意選択的にＡ以外の要素を含む）こと；さらに別の実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含み、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含む（任意選択的にその他の要素を含む）こと等を指す。
また、反対であることが明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本願で特許請求された任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、該ステップまたは行為が引用された順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
特許請求の範囲および上記した明細書において、すべての移行句、例えば「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「～を伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「～を保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「～から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」等は非制限的である、すなわち、～を含むが、これらに限定されない、を意味するものと理解される。移行句「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に限り、特許審査手順の米国特許オフィスマニュアル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、セクション２１１１．０３に規定するように、それぞれ限定的（ｃｌｏｓｅｄ）または半限定的な（ｓｅｍｉ－ｃｌｏｓｅｄ）移行句であるものとする。非制限的な移行句（例えば、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用する本文書に記載されている実施形態も、代替的実施形態においては、非制限的移行句により記載される、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」特徴および「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」特徴、としてやはり企図されていると認められるべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」について記載する場合、本開示は、「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」といった代替的実施形態も企図している。
以下に、上記実施形態から把握できる技術思想を付記として記載する。
［付記１］
リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続されたヌクレオチドを含む標識ヌクレオチドにおいて、各発光標識は、任意の他の発光標識から少なくとも５オングストローム離れている、標識ヌクレオチド。
［付記２］
各発光標識が、任意の他の発光標識の重心から少なくとも５オングストローム離れた重心を含む、付記１に記載の標識ヌクレオチド。
［付記３］
１つ以上の発光標識が、同発光標識と前記リンカー上の付着部位との間に少なくとも８つの隣接原子を含むスペーサ分子を介して同リンカーに付着している、付記１または付記２に記載の標識ヌクレオチド。
［付記４］
前記スペーサ分子が、前記発光標識と前記リンカー上の付着部位との間に５０個未満、４０個未満、３０個未満、または２０個未満の連続した原子を含む、付記３記載の標識ヌクレオチド。
［付記５］
１つ以上の発光標識が前記リンカーに組み込まれている、付記１～４のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記６］
前記リンカーが、少なくとも１０個のモノマー単位を含むオリゴマーである、付記１～５のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記７］
前記オリゴマーが、１５０未満、１００未満、または５０未満のモノマー単位を含む、付記６記載の標識ヌクレオチド。
［付記８］
１つ以上の発光標識が、任意の他の付着部位から少なくとも５モノマー単位離れた付着部位で前記リンカーに付着している、付記６～７のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記９］
前記リンカーが核酸である、付記１～８のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１０］
前記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはそれらの誘導体を含む、付記９記載の標識ヌクレオチド。
［付記１１］
前記リンカーがペプチドである、付記１～８のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１２］
前記ペプチドが、環化およびポリプロリン修飾の少なくともいずれかを介して立体配座に拘束されている、付記１１に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１３］
前記リンカーが多糖である、付記１～８のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１４］
リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続されたヌクレオチドを含む標識ヌクレオチドであって、前記リンカーは、第１のオリゴヌクレオチド鎖の２つ以上の付着部位で２つ以上の発光標識に付着した同第１のオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であり、かつ各発光標識は、任意の他の発光標識の中心点から少なくとも５オングストローム離れた中心点を有する立体体積を含む、標識ヌクレオチド。
［付記１５］
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチド鎖をさらに含み、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が前記ヌクレオチドに付着している、付記１４に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１６］
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチド鎖をさらに含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記ヌクレオチドに付着している、付記１４に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１７］
前記２つ以上の付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上において少なくとも５塩基だけ互いに分離している、付記１４～１６のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１８］
前記２つ以上の付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上において少なくとも５塩基、かつ５０未満の塩基によって互いに分離している、付記１４～１７のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記１９］
各付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上のグアニンまたはシトシンから分離された少なくとも２塩基である、付記１４～１８のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記２０］
少なくとも１つの付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上の脱塩基部位に生じる、付記１４～１９のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記２１］
少なくとも１つの付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上の核酸塩基に生じる、付記１４～２０のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記２２］
前記核酸塩基が、Ａ、Ｔ、またはＵ核酸塩基から選択される、付記２１記載の標識ヌクレオチド。
［付記２３］
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が１つ以上のステムループを形成する、付記１４～２２のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記２４］
各ステムループのループ領域が、前記２つ以上の付着部位の付着部位を含む、付記２３に記載の標識ヌクレオチド。
［付記２５］
各ステムループの前記ループ領域が少なくとも４つの不対塩基を含む、付記２４記載の標識ヌクレオチド。
［付記２６］
前記ループ領域が、３３％未満のＧ／Ｃ含有量を有する配列を含む、付記２４～２５のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記２７］
リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続されたヌクレオチドを含む標識ヌクレオチドであって、前記リンカーは、
第１のオリゴヌクレオチド鎖であって、共有結合カップリング化合物を介して同第１のオリゴヌクレオチドの末端で２つ以上の分岐オリゴヌクレオチド鎖に付着し、各分岐オリゴヌクレオチド鎖は発光標識を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖と、
ヌクレオチドに付着した第２のオリゴヌクレオチド鎖であって、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチド鎖と、
を含む核酸である、標識ヌクレオチド。
［付記２８］
各分岐オリゴヌクレオチド鎖が相補的分岐オリゴヌクレオチド鎖とさらにハイブリダイズする、付記２７記載の標識ヌクレオチド。
［付記２９］
前記共有結合カップリング化合物が構造：
［化１］
Figure 0007287942000025
からなり、
式中、
Ｎ ｆ は第１のオリゴヌクレオチド鎖であり、
Ｎ ｂ は分岐オリゴヌクレオチド鎖であり、
Ｒ ｆ およびＲ ｂ はそれぞれ、互いに独立して、置換または非置換アルキレン；置換または非置換アルケニレン；置換または非置換アルキニレン；置換または非置換ヘテロアルキレン；置換または非置換ヘテロアルケニレン；置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換ヘテロシクリレン；置換または非置換カルボシクリレン；置換または非置換アリーレン；置換または非置換ヘテロアリーレン；およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される結合部または連結基であり、かつ
Ｏの各例は、隣接するオリゴヌクレオチド鎖の５’リン酸基または３’ヒドロキシル基のいずれかの酸素原子である、
付記２７～２８のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記３０］
リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続されたヌクレオチドを含む標識ヌクレオチドであって、前記リンカーは、
共有結合カップリング化合物から伸びる３つ以上のオリゴヌクレオチド鎖を含む第１のオリゴヌクレオチド成分であって、オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１つが前記ヌクレオチドに付着している、第１のオリゴヌクレオチド成分と、
発光標識に付着した少なくとも１つのオリゴヌクレオチド鎖を含む第２のオリゴヌクレオチド成分であって、同第２のオリゴヌクレオチド成分が前記第１のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズし、それにより前記ヌクレオチドおよび前記発光標識を接続する、第２のオリゴヌクレオチド成分と、
を含む核酸である、標識ヌクレオチド。
［付記３１］
前記発光標識が蛍光色素である、付記１～３０のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記３２］
前記蛍光色素が、ローダミン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、またはシアニン色素である、付記３１に記載の標識ヌクレオチド。
［付記３３］
前記ヌクレオチドが、前記２つ以上の発光標識の任意の発光標識から少なくとも１ｎｍ離れている、付記１～３２のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記３４］
前記ヌクレオチドが、前記２つ以上の発光標識の任意の発光標識から約１～１０ｎｍ離れている、付記１～３３のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記３５］
前記ヌクレオチドが、前記２つ以上の発光標識の任意の発光標識から約２～２０ｎｍ離れている、付記１～３４のいずれか１項に記載の標識ヌクレオチド。
［付記３６］
鋳型核酸の配列を決定する方法であって、前記方法は、
（ｉ）標的体積中の複合体であって、鋳型核酸、プライマー、および重合酵素を含む複合体を、１つ以上の異なるタイプの発光標識ヌクレオチドにさらすことであって、各タイプの発光標識ヌクレオチドは、付記１～３５のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドを含む、前記さらすことと、
（ｉｉ）１つ以上の励起エネルギーの一連のパルスを前記標的体積の近くに向けることと、
（ｉｉｉ）プライマーを含む核酸への連続的な取り込み中に、発光標識ヌクレオチドから複数の放射光子を検出することと、
（ｉｖ）タイミングと、任意選択的に放射された光子の発光強度とを決定することにより組み込まれたヌクレオチドの配列を識別することと、
を含む、方法。
［付記３７］
鋳型核酸を配列決定するためのキットであって、前記キットは、
２つ以上の異なるタイプの発光標識ヌクレオチドを含み、各タイプの発光標識ヌクレオチドは、付記１～３５のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドを含む、キット。
［付記３８］
重合酵素をさらに含む、付記３７に記載のキット。
［付記３９］
前記鋳型核酸に相補的なプライマーをさらに含む、付記３７～３８のいずれか一項に記載のキット。
［付記４０］
反応混合物中に２つ以上の異なるタイプの発光標識ヌクレオチドを含む核酸配列決定反応組成物であって、各タイプの発光標識ヌクレオチドが付記１～３５のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドを含む、核酸配列決定反応組成物。
［付記４１］
重合酵素をさらに含む、付記４０に記載の組成物。
［付記４２］
鋳型核酸をさらに含む、付記４０～４１のいずれか一項に記載の組成物。
［付記４３］
前記鋳型核酸に相補的なプライマーをさらに含む、付記４２記載の組成物。

Claims (20)

  1. 核酸リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続されたヌクレオシドポリリン酸を含む標識ヌクレオチドにおいて、前記核酸リンカーは、前記ヌクレオシドポリリン酸の末端リン酸に接続されており、各発光標識は、任意の他の発光標識から少なくとも５オングストローム離れており、（ｉ）少なくとも１つの発光標識が前記核酸リンカー内に組み込まれており、かつ前記核酸リンカー内に組み込まれている前記少なくとも１つの発光標識がシアニンベースのフルオロフォアである；および／または（ｉｉ）少なくとも１つの発光標識がグリコールアミンスペーサ分子を介して前記核酸リンカーに付着されている、標識ヌクレオチド。
  2. 各発光標識が、任意の他の発光標識の重心から少なくとも５オングストローム離れた重心を含む、請求項１に記載の標識ヌクレオチド。
  3. 前記核酸リンカーが、少なくとも１０個のモノマー単位を含むオリゴマーであり、任意で、前記オリゴマーが、１５０未満、１００未満、または５０未満のモノマー単位を含む、請求項１または請求項２に記載の標識ヌクレオチド。
  4. １つ以上の発光標識が、任意の他の付着部位から少なくとも５モノマー単位離れた付着部位で前記核酸リンカーに付着している、請求項３に記載の標識ヌクレオチド。
  5. 前記核酸リンカーは、第１のオリゴヌクレオチド鎖の２つ以上の付着部位で２つ以上の発光標識に付着した同第１のオリゴヌクレオチド鎖を含み、かつ各発光標識は、任意の他の発光標識の中心点から少なくとも５オングストローム離れた中心点を有する立体体積を含む、請求項１に記載の標識ヌクレオチド。
  6. 前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチド鎖をさらに含み、
    （ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が前記ヌクレオシドポリリン酸に付着しているか、あるいは
    （ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が前記ヌクレオシドポリリン酸に付着している、請求項５に記載の標識ヌクレオチド。
  7. 前記２つ以上の付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上において少なくとも５塩基、かつ５０未満の塩基によって互いに分離している、請求項５または請求項６に記載の標識ヌクレオチド。
  8. 各付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上のグアニンまたはシトシンから分離された少なくとも２塩基である、請求項５～７のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
  9. 少なくとも１つの付着部位が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖上の脱塩基部位に生じる、請求項５～８のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
  10. 前記第１のオリゴヌクレオチド鎖が１つ以上のステムループを形成し、任意で、各ステムループのループ領域が、前記２つ以上の付着部位の付着部位を含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
  11. 前記シアニンベースのフルオロフォアは、化学構造式：
    Figure 0007287942000026
    を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
  12. 前記グリコールアミンスペーサ分子を介して前記核酸リンカーに付着される前記少なくとも１つの発光標識は、ローダミン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、またはシアニン色素を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
  13. 構造式：
    Figure 0007287942000027
    を含み、式中：
    Figure 0007287942000028
    は、前記グリコールアミンスペーサ分子を介して前記核酸リンカーに付着される前記少なくとも１つの発光標識である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
  14. 核酸リンカーを介して２つ以上の発光標識に接続された反応物を含む標識分子であって、各発光標識は、任意の他の発光標識から少なくとも５オングストローム離れており、（ｉ）少なくとも１つの発光標識が前記核酸リンカー内に組み込まれており、かつ前記核酸リンカー内に組み込まれている前記少なくとも１つの発光標識がシアニンベースのフルオロフォアである；および／または（ｉｉ）少なくとも１つの発光標識がグリコールアミンスペーサ分子を介して前記核酸リンカーに付着されている、標識分子。
  15. 前記シアニンベースのフルオロフォアは、化学構造式：
    Figure 0007287942000029
    を有する、請求項１４に記載の標識分子。
  16. 前記グリコールアミンスペーサ分子を介して前記核酸リンカーに付着される前記少なくとも１つの発光標識は、ローダミン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、またはシアニン色素を含む、請求項１４または請求項１５に記載の標識分子。
  17. 構造式：
    Figure 0007287942000030
    を含み、式中：
    Figure 0007287942000031
    は、前記グリコールアミンスペーサ分子を介して前記核酸リンカーに付着される前記少なくとも１つの発光標識である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の標識分子。
  18. 鋳型核酸の配列を決定する方法であって、前記方法は、
    （ｉ）標的体積中の複合体であって、鋳型核酸、プライマー、および重合酵素を含む複合体を、１つ以上の異なるタイプの発光標識ヌクレオチドにさらすことであって、各タイプの発光標識ヌクレオチドは、請求項１～１３のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドを含む、前記さらすことと、
    （ｉｉ）１つ以上の励起エネルギーの一連のパルスを前記標的体積の近くに向けることと、
    （ｉｉｉ）プライマーを含む核酸への連続的な取り込み中に、発光標識ヌクレオチドから複数の放射光子を検出することと、
    （ｉｖ）タイミングと、任意選択的に放射された光子の発光強度とを決定することにより取り込まれたヌクレオチドの配列を識別することと、
    を含む、方法。
  19. 鋳型核酸を配列決定するためのキットであって、前記キットは、
    ２つ以上の異なるタイプの発光標識ヌクレオチドを含み、各タイプの発光標識ヌクレオチドは、請求項１～１３のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドを含む、キット。
  20. 反応混合物中に２つ以上の異なるタイプの発光標識ヌクレオチドを含む核酸配列決定反応組成物であって、各タイプの発光標識ヌクレオチドが請求項１～１３のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドを含む、核酸配列決定反応組成物。
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