CN101218510A - 通过自动化的蛋白质错折叠循环扩增超灵敏检测朊病毒 - Google Patents

Abstract

提供了用于检测样品中朊病毒的高灵敏方法。这些方法可以用于诊断朊病毒介导的可传染的海绵状脑病，如牛海绵状脑病、克雅病、瘙痒病或者慢性萎缩病。具体地，公开了用于朊病毒的连续自动化循环扩增的方法。该方法是快速和高度灵敏的，使得它对于高通量测试是理想的。

Description

通过自动化的蛋白质错折叠循环扩增超灵敏检测朊病毒

                     发明背景

本申请要求2005年4月20日提交的美国临时专利申请序号60/673,302的优先权，将该临时申请完整引入本文作为参考。

按照国家健康研究所(National Institutes of Health)的津贴号AG024642-01，美国政府可以享有本发明的某些权利。

I.发明领域

本发明一般涉及病理学、生物化学和细胞生物学。具体地，本发明提供了用于检测样品中蛋白质或者朊病毒，包括诊断与朊病毒相关的疾病的方法、组合物和装置。

II.相关技术的描述

朊病毒疾病也被称作传染性海绵状脑病(TSE)，包含一组致命的感染性神经变性疾病，其包括克雅病(CJD)、库鲁病、格斯特曼综合征(GSS)、致命性家族性失眠症(FFI)和人类中的偶发致命性失眠(sFI)和瘙痒病、牛海绵样脑病(BSE)和动物中的慢性消耗性疾病(CWD)(Collinge，2001；Prusiner，2001)。这些疾病的特征是脑空泡形成、星形胶质增生、神经元凋亡和中枢神经系统中错折叠的朊病毒蛋白质(PrP^Sc)的积累(Prusiner，1998)。

朊病毒疾病的标志性事件是形成被称作PrP^Sc的异常折叠的蛋白质，其是被称作PrP^C的正常蛋白质的翻译后修饰的形式(Cohen和Prusiner，1998)。还没有检测到区分两种PrP同种型的化学差异(Stahl等人，1993)并且该转变似乎涉及构象改变，其中正常蛋白质的α-螺旋含量减小并且β折叠的量增加(Pan等人，1993)。结构改变随后是生物化学性质的改变：PrP^C在非变性去污剂中是可溶的；PrP^Sc是不溶的；PrP^C容易被蛋白酶消化，而PrP^Sc部分耐受，导致形成N-末端截短的片段(Baldwin等人，1995；Cohen和Prusiner，1998)。用于表示PrP的不同种类的术语见表1。

                           表1

PrP，指总的朊病毒蛋白质，对于不同同种型没有产生差异
	PrPC，健康人中存在的正常的、非病原性、非传染性细胞蛋白质。该形式富含α-螺旋构象，是可溶的和蛋白酶敏感的。
PrPSc，受TSE侵袭的个体中存在的与疾病相关的错折叠的朊病毒蛋白质。该形式是感染性的，富含β-折叠构象，可溶的并且多数是蛋白酶抗性的。
	PrPres，指富含β折叠、蛋白酶抗性的朊病毒蛋白质，其可以与PrPSc相同或不同。具体地，该名称用于指体内产生的蛋白酶抗性蛋白质，其还没有被实验表明为感染性的。
PrP27-30，对应于蛋白质核心，其在蛋白酶处理PrPSc或PrPres后保持耐受性的。它由该蛋白质的后三分之二组成。

当前，对于TSE没有准确的死前诊断(Brown等人，2001；Collins等人，2000；Ingrosso等人，2002；Soto，2004)。对于人类疾病，诊断主要是基于临床检查并且根据临床诊断拟合标准教导的程度而认为该疾病是可能的或者很可能的。只能通过海绵状改变、星形胶质增生和淀粉状蛋白斑(尽管这些斑不总是在所述TSE中看到)的脑组织学分析在死后进行确定的诊断(Ingrosso等人，2002；Kordek，2000)。尽管脑活组织检查已经被用于建立确定的诊断，但是因为脑活组织检查是侵入性的且昂贵的，它是强烈不被鼓励的。此外，脑活组织检查有时产生假阴性结果，因为组织样品可以采自脑的未受侵袭的区域。

BSE流行的严重后果刺激欧洲共同体(European Community)实施一个系统来评估和验证旨在快速检测受感染的动物的生物化学试验(Bird，2003；Butler，1998)。通过脑的组织学分析对有病的牛的死后鉴定是准确的(Heim和Wilesmith，2000)。然而，该方法是耗时的、劳动密集的并且不能在大规模上进行。开发了新的试验使得可以在仅仅几个小时内处理多个样品，从而可以阻止动物的商业化直到可以得到结果。已经进行了两个战役来评估9种不同的试验，其使用来自BSE感染的和正常牛的盲法样品(Editorial，2001；Bird，2003；Moynagh和Schimmel，1999)。使用灵敏性和特异性作为标准，5种试验被欧洲共同体批准用于BSE检测。所有5种试验都基于病理学PrP^Sc同种型的免疫检测，4种使用蛋白酶解区分来自错折叠的PrP的PrP^C。然而，当前这些试验的灵敏度使得可以仅仅检测在(或者接近)疾病的症状期时的脑中的朊病毒。

令人惊奇地，最近的研究报导了第一种可能的通过输血感染的vCJD病例(Llewelyn等人，2004)。一名69岁的人在接受一名个体捐献的红细胞输血后6.5年发生了vCJD症状，所述个体在供血后3.5年发生了vCJD症状。如果通过输血传播vCJD的可能性受到发现类似病例的支持，那么它可以导致潜在的vCJD流行的显著后果，因为它将表明在临床病症产生之前几年，血液就含有感染力。因为该可能性，开发CJD的灵敏的和症状前血液试验是最重要的。数学作为TSE传播的可能来源的额外证据来自Houston和Hunter的精巧的实验，其中BSE的传播通过绵羊中的输血发生(Houston等人，2000；Hunter等人，2002)。有趣的是，在这些实验中，用于输血的血液从处于潜伏期中间阶段的绵羊得到。也已经在vCJD的啮齿动物模型中的潜伏期和症状期期间在血液中显示了感染性(Brown等人，1999)。这些发现对于TSE诊断以及对于一些其他应用，如血库安全性和血浆产品工业具有重要的暗示。

PrP^Sc的形成不仅是该疾病的最可能的原因，而且是最被清楚地知道的标记。组织和细胞中PrP^Sc的检测与该疾病和TSE感染性的存在在很大程度上相关。失活或者消除TSE感染性的处理也消灭了PrP^Sc(Prusiner，1991)。认为在人或者动物组织上鉴定PrP^Sc对于TSE诊断是关键的(WHOReport，1998)。该应用的一个重要的限制是灵敏度，因为仅在该疾病的晚期在CNS中PrP^Sc的量是高的(对于常规方法检测足够了)。然而，已经阐明在该疾病的更早阶段，存在PrP^Sc的全身分布(以低含量)，特别在淋巴网状系统中(Aguzzi，1997)。实际上，已经报导在从vCJD患者得到的腭扁桃体组织和阑尾中存在PrP^Sc(Hill等人，1997)。尽管不知道在疾病过程多早的时候扁桃体或者阑尾活组织检查可以用于vCJD诊断，但是已经表明在遗传上对瘙痒病敏感的绵羊中，可以在症状前和孵化期早期在扁桃体组织中检测到PrP^Sc。然而，迄今在偶发性CJD或GSS的任何病例中还没有在这些组织中检测到PrP^Sc(Kawashima等人，1997)。正常的蛋白质被表达在白细胞和血小板中，因此在受侵袭的个体中，可能一些血细胞可能含有PrP^Sc(Aguzzi，1997)。这增加了血液试验用于CJD的可能性，但是这将需要比当前可利用的测定方法具有更大程度的灵敏度的测定方法。

可以一致性地和可再现性地检测血液中的朊病毒的一种方法是感染性生物测定方法(Brown等人，1998；Brown等人，2001；Ingrosso等人，2002)。然而，由于得到结果所需的时间很长(几个月到几年)和物种障碍作用，生物测定方法的广泛使用受到限制，但是这些实验使得可以估计血沉棕黄层中PrP^Sc的浓度为1×10^-14M到1×10^-16M(即，每ml血沉棕黄层60,000-6,000,000个PrP^Sc分子)(Brown等人，2001；Soto，2004)。

最近，基于朊病毒能够在含有PrP^C的细胞裂解物中体外复制的能力，开发了更快速的朊病毒检测方法。该技术被称作蛋白质错折叠循环扩增(PMCA)，其涉及将样品与“非病原性构象异构体”混合，温育该混合物，解聚蛋白质，然后进行重复温育和解聚步骤，见WO 0204954；Saborio等人，2001；Castilla等人，2004和Saa等人，2004，将它们都引入本文作为参考。然后可以以高水平的灵敏度检测体外扩增的朊病毒，这通常通过蛋白质印迹或者ELISA测定方法实现。该技术提供了快速结果的重要益处，然而，仍然被认为没有感染性生物测定方法灵敏。此外，尽管可以使用该测定方法从血液扩增朊病毒，但是希望提高测定方法的灵敏度水平和/或增加可再现性，特别对于诊断目的。其他研究人员对该测定方法的随后的改进已经表明朊病毒可以被连续复制；然而，诊断试验仍然需要复制水平的提高(Bieschke等人，2004)。从而，当前仍然需要快速检测朊病毒的方法，其足够灵敏以检测低水平的朊病毒污染。

                      发明概述

本发明提供了用于检测样品中朊病毒的高度灵敏的方法，被称作“连续自动化蛋白质错折叠循环扩增”(saPMCA)。本文使用的术语“朊病毒”被定义为感染性蛋白质，与其在现有技术中的用法一致。特别地，朊病毒具有改变同源蛋白质的构象使得处于改变构象中的该同源蛋白质具有与最初的朊病毒基本上相同的活性的能力。

本发明的一些方法涉及通过saPMCA扩增朊病毒蛋白质，saPMCA使得可以高灵敏地检测样品中的朊病毒。在一些实施方案中，检测朊病毒的方法涉及扩增朊病毒，连续扩增朊病毒，检测朊病毒和失活残留的感染性朊病毒蛋白质。所述方法可以包括下面的步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的一步或多步：

(a)将样品与非病理性蛋白质混合以得到反应混合物；

(b)初步扩增步骤，其包括：

(i)温育反应混合物，

(ii)破坏该反应混合物，

(iii)重复步骤(b)(i)和(b)(ii)一次或多次，

(c)进行连续扩增步骤，包括：

(i)除去一部分反应混合物并将其与额外的非病理性蛋白质一起温育，

(ii)重复扩增步骤(b)，

(iii)重复步骤(c)(i)和(c)(ii)一次或多次；

(d)检测连续扩增的反应混合物中的朊病毒；

(e)失活残留的朊病毒。

进一步在下文描述每一步：

(a)将样品与非病原性蛋白质混合以得到反应混合物。术语“样品”是指能够被朊病毒污染的物质的任一组合物。例如，样品可以包含来自怀疑患有TSE的动物的组织样品。本文使用的术语“非病原性蛋白质”是指在氨基酸序列中与朊病毒同源并且能够被转化成朊病毒的蛋白质。从而，“反应混合物”是指至少包含样品和非病原性蛋白质的组合物。在一些实施方案中，反应混合物还包含“转化缓冲液”，其有利于朊病毒复制。示例性的转化缓冲液可以包含1X磷酸缓冲的盐水(PBS)与150mM额外的NaCl，0.5％TritonX-100和蛋白酶抑制剂混合物。

(b)初步扩增步骤包括在有利于朊病毒复制的条件下温育反应混合物(b)(i)，接着破坏反应混合物以便破坏蛋白质团聚体(b)(ii)。如本文使用的术语“破坏”是指可以借以解聚蛋白质的任何方法。示例性的解聚方法包括用溶剂处理、改变pH、温度、离子强度，或者通过物理方法，如超声处理或者匀浆。将这两个步骤重复一次或多次，从而扩增朊病毒(b)(iii)。

(c)将来自初步扩增的反应混合物进行连续扩增，其极大地增强了朊病毒复制。在该步骤中，将一部分反应混合物与额外的非病原性蛋白质一起温育(c)(i)以得到连续扩增的反应混合物。如本文使用的“额外的非病原性蛋白质”可以来自与用于初步扩增(a)的非病原性蛋白质相同的来源，或者它可以来自不同的来源。在一些实施方案中，连续扩增将包括重复初步扩增步骤(c)(ii)一次或多次。在进一步的实施方案中，重复连续扩增步骤(c)(i)和(c)(ii)一次或多次以进一步从样品扩增朊病毒(c)(iii)。通过将样品进行顺序的连续扩增，极大地提高了灵敏性程度，允许检测少于约10⁵、10⁴、10³个，或者其中可以得到的任何范围或者甚至更少的朊病毒。在一些实施方案中，该高灵敏性允许以比感染生物测定方法更高的灵敏性检测朊病毒，感染生物测定方法已经是朊病毒存在的金标准测试。

(d)通过本领域技术人员已知的直接和间接的测定方法可以检测连续扩增的反应混合物中的朊病毒。用于检测连续扩增的反应混合物中的朊病毒的示例性方法被概述在下面。

(e)可以通过本领域技术人员已知的多种方法将残留的朊病毒失活，如用浓碱处理或者高温处理，如用2N NaOH处理1小时和/或在134℃高压灭菌18分钟。这将消除朊病毒作为生物有害废物的危险和帮助减小测试多种样品时将发生的污染。备选地，可以以这样的方式修饰非病原性PrP底物，例如，通过加入蛋白酶剪切位点，使得saPMCA的转化可以容易地失活。

本发明还提供了通过检测来自动物的样品中朊病毒的存在，来诊断动物中的疾病的方法，如包括上述步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的一步或多步的方法。本文使用的“动物”是指对朊病毒疾病敏感的任何动物。例如，动物包括但不限于多种哺乳动物，如人、奶牛、绵羊、鹿和麋鹿。反应混合物中朊病毒的检测表明朊病毒疾病的阳性诊断。如本文定义的“朊病毒疾病”是可以通过朊病毒载体传播的任何疾病，如包括CJD(sCJD、fCJD、iCJD和vCJD)、GSS、库鲁病、FFI、sFI、瘙痒病、BSE和CWD的疾病。

预期所检测的朊病毒可以包含异常折叠的PrP蛋白质，其通常被称作PrP^Sc。例如，朊病毒蛋白质可以是哺乳动物PrP^Sc。PrP^Sc可以包含绵羊PrP^Sc、牛PrP^Sc、小鼠PrP^Sc、人PrP^Sc、鹿PrP^Sc或者来自其他哺乳动物的PrP^Sc。在其他实施方案中，朊病毒可以包含酵母PrP^Sc，例如，Ure2或Sup35的异常构象。

设想本发明的方法可以用于检测多种样品中的朊病毒。在一些实施方案中，样品是来自动物的组织样品。

组织样品可以包含来自脑或者来自外周器官的样品。例如，来自脾脏、扁桃体、或者其他淋巴器官的样品可以是优选的，因为已经表明在朊病毒感染的动物中，它们含有相对大量的朊病毒。可以使用其他生物液体，如脑脊液、血液、尿、奶、泪液、唾液。在具体实施方案中，样品可以来自血液。血样中朊病毒的检测是很重要的，因为它代表可以从活生物容易得到的容易收集的组织。从而，本发明可以确保能够以足够检测临床前疾病的灵敏度检测来自血样的朊病毒疾病，这是本领域中的重要进步。

在本发明的一些实施方案中，通过超声处理破坏反应物中的蛋白质。为了防止污染，优选超声装置不与样品直接接触。从而，可以进行用可商购的微超声仪进行超声处理。超声处理装置可以是自动化的并且能够进行编程操作，从而可以进行高通量样品扩增。例如，超声处理可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多秒脉冲，或者其中可以得到的任何范围，以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效能的，或者其中可以得到的任何范围的超声处理。还优选可以将反应混合物保持在封闭环境中以防止蒸发。例如，可以进行扩增而将样品保持在密封的有机玻璃围绕物中。

在本发明的一些实施方案中，可以随着扩增的过程而改变超声处理步骤的参数。例如，在每个循环后可以增加或者减小超声处理时间和/或超声处理效能。在一些实施方案中，可以针对循环扩增的每个步骤将超声处理参数(即，时间和效能)预先编程。

在本发明的一些实施方案中，设想反应混合物的温育可以在或者接近生理温度的温度下。例如，在约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、到约50℃，或者其中可以得到的任一范围的温度下温育。在本发明的一些应用中，在约37℃温育。还设想可以改变温度。例如，在每次温育反应混合物时，可以升高或者降低温度。还设想可以在破坏反应混合物之前改变反应混合物的温度。在一些实施方案中，通过可编程的恒温器监视和/或控制反应混合物的温度。例如，可以将样品置于自动化的循环变温器中，从而允许随着扩增的过程对反应混合物的温度编程。

还设想可以在一系列时间期限内进行反应混合物的温育。例如，可以温育反应混合物约1分钟到约10小时。在一些实施方案中，温育时间为约或者至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200分钟或者其中可以得到的任一范围。在更进一步的实施方案中，温育反应混合物约30分钟。还设想可以在整个扩增过程中改变温育时间。例如，在每个扩增步骤后，温育时间可以增加或者减少一个时间增量。在其他实施方案中，将破坏装置自动化使得可以对温育时间编程。

在本发明的一些实施方案中，多次重复温育和破坏(步骤(b)(i)和(b)(ii))，设想可以将它们重复至少或者至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500次，或者其中可以得到的任一范围。设想在本发明的一些实施方案中，初步扩增(步骤(b))将在约3天或者更短的时间内发生。这可以是优选的，因为在一些情况下，非病原性蛋白质或者其他辅因子可能具有有限的稳定性并且延长温育可以导致转变速率的最终降低。具体地，已经表明在约75小时的温育后，PrP^C转变速率降低。

在一些实施方案中，可以将步骤(c)(i)和(c)(ii)、连续扩增重复多次。例如，可以将步骤(c)(i)和(c)(ii)重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100次，或者其中可以得到的任一范围。在一些实施方案中，将额外的非病原性蛋白质与反应混合物或者系列反应混合物混合之前作为冻干的粉剂或者片剂保存，和/或保持冷冻，以防止蛋白质降解。在进一步的实施方案中，可以对连续扩增步骤数目进行预编程用于自动化的扩增。

在本发明的一些实施方案中，反应混合物可以还包含样品、非病原性蛋白质和转变缓冲液。在一些实施方案中，转变缓冲液包含盐溶液和去污剂。转变缓冲液还可以包含金属螯合剂。这是尤其有利的，因为对于PrP^C向PrP^Sc的转变，Cu²⁺和一定程度上的Zn²⁺干扰朊病毒扩增。在优选实施方案中，金属螯合剂是EDTA。反应混合物可以还包含额外的成分，例如一种或多种缓冲剂、盐、去污剂、脂类、蛋白质。混合物、核酸和/或膜制剂。

在本发明的一些实施方案中，非病原性蛋白质可以来自细胞裂解物。细胞裂解物可以包含粗细胞裂解物或者已经被以一种用来富集裂解物中的所述非病原性蛋白质的方式处理的细胞裂解物。细胞裂解物可以是液体、半液体、或者冻干的蛋白质粉剂或者片剂。在一些实施方案中，细胞裂解物包含脑匀浆。在一些实施方案中，脑匀浆是哺乳动物脑匀浆。在一些实施方案中，细胞裂解物优选来自与受试样品相同物种的生物。细胞裂解物可以来自过表达非病原性蛋白质的细胞。在一些实施方案中，细胞裂解物来自已经用表达非病原性蛋白质的核酸表达载体转化的细胞。例如，非病原性蛋白质可以来自过表达PrP组织培养细胞、如过表达PrP^C的成神经瘤细胞的细胞裂解物。非病原性蛋白质也可以在细菌中被重组表达。

在本发明的一些实施方案中，非病原性蛋白质可以包含具有与PrP^C同源的氨基酸序列的蛋白质。例如，非病原性蛋白质可以与来自小鼠、人、牛、绵羊、山羊和/或麋鹿给出的通过GenBank检索号NP_035300、NP_898902、AAP84097、AAU02120、AAU02123和AAU93884(都引入本文作为参考)分别给出的PrP蛋白质相同或者高度同源。在一些实施方案中，非病原性蛋白质可以包含具有改变的氨基酸序列的PrP^C。例如，非病原性蛋白质可以包含具有氨基酸替代、缺失或者插入的PrP^C。一些优选的突变包括已知的哺乳动物PrP多态性(表2)。在其他情况中，优选的突变可以是已经在人类中显示出增加朊病毒疾病风险的那些突变(表2)。设想此类突变蛋白质可以用于进一步增强本发明方法的灵敏性。在其他实施方案中，本发明的方法可以用于研究某些突变的PrP对于被PrP^Sc转变的敏感性。

在本发明的一些实施方案中，非病原性蛋白质可以来自表达作为融合蛋白的非病原性蛋白质的细胞。例如，非病原性蛋白质的编码序列可以与其他氨基酸编码序列融合。例如，融合的氨基酸序列可以包含报道蛋白、检测标记、蛋白质纯化标记或者定位信号的编码序列。此外，为了检测，可以标记非病原性蛋白质，例如，通过掺入放射性氨基酸或者用荧光团共价修饰。

还设想非病原性蛋白质可以以这样的方式被修饰以便增加它发生向朊病毒的转变的能力。在优选实施方案中，可以预处理非病原性蛋白质以改变糖基化。该步骤可以进一步增强非病原性蛋白质向朊病毒的转变速率，因为以前已经表明较少糖基化形式的PrP^C优先被转变成PrP^Sc(Kocisko等人，1994)。例如，可以用磷脂酶C处理PrP^C以便在与样品混合前除去磷脂酰肌醇。备选地，可以修饰重组蛋白以改变连接糖基化位点的氨基酸，从而在细胞中合成稳定的单糖基化或者未糖基化形式。

在本发明的进一步的实施方案中，可以以这样的方式处理样品或者将其分级分离以在saPMCA之前浓缩样品的蛋白质。例如，可以通过磷钨酸(PTA)沉淀，或者结合到显示出与PrPSc特异性地相互作用的配体，如构象抗体、某些核酸、纤溶酶原或者多种短肽浓缩蛋白质(Soto等人，2004)。还设想可以分级分离样品。例如，可以收获在温和去污剂中不溶的级分，该步骤将增加样品中朊病毒的浓度(WO 0204954)。

设想在反应混合物或者连续扩增的反应混合物中扩增的朊病毒的检测可以通过本领域中技术人员公知的多种方法进行。在一个实施方案中，用蛋白酶，如蛋白酶K处理反应混合物或者连续反应混合物，然后使用抗朊病毒抗体，通过蛋白质印迹或者ELISA检测朊病毒。在优选实施方案中，可以使用抗PrP抗体，如3F4单克隆抗体。在一些实施方案中，ELISA测定方法可以是两位点免疫测定夹心ELISA。在其他实施方案中，可以通过依赖构象的免疫测定方法(CDI)检测朊病毒。还设想通过动物生物测定方法检测扩增的朊病毒，其中用反应混合物或者连续反应混合物接种受试动物并评估临床症状。还可以通过功能测定方法检测扩增的朊病毒，如通过它们感染某些培养的哺乳动物细胞的能力来检测(Klohn等人，2003)。最后，可以通过间接方法检测扩增的朊病毒，所述方法如一些开发中的分光技术，包括多谱紫外荧光术、共焦双色荧光相关光谱法、傅里叶变换红外光谱法或者毛细管电泳和荧光共振能量转移(FRET)(Soto等人，2004)。

本发明还提供了用于扩增和检测朊病毒蛋白的装置。该装置包含可编程的微量培养板超声波仪。可以就多个循环、温育时间、超声处理效能和超声处理时间给微量培养板超声波仪编程。该装置还可以包含能够针对宽范围的不同的温育温度被编程的培养箱。在一些实施方案中，该装置还可以包含用于样品和反应混合物操作的可编程的机器人探头。还设想可以将反应混合物中非病原性蛋白质和朊病毒的分离和朊病毒的检测自动化。例如，可以如本文描述的用如美国专利6,562,209中描述的自动化的ELISA方法或者通过如美国专利5,914,273和5,567,595中描述的自动化的蛋白质印迹检测朊病毒。其中非病原性蛋白质被荧光标记。在样品进行saPMCA时可以通过FRET检测构象改变并且“实时”监视。

在一些实施方案中，本发明涉及用于检测样品中的朊病毒的试剂盒，其包含：非病原性蛋白质。在一些实施方案中，试剂盒还包含：用于样品扩增的围绕物，如微量滴定板，或者样品管；扩增缓冲液，其在扩增前被加入到样品和非病原性蛋白质中；saPMCA的阳性和阴性对照样品，其中阳性对照样品含有朊病毒，阴性对照样品不含朊病毒；用于失活朊病毒的去污染缓冲液，例如，包含2N氢氧化钠的喷雾剂、溶液或者抹布；用于分离朊病毒和非病原性蛋白质的物质，如蛋白酶K消化缓冲剂，或者朊病毒分级分离缓冲剂；用于检测朊病毒蛋白质的物质，例如，用于蛋白质印迹或者ELISA测试的PrP特异抗体。

如本文使用的“灵敏性”是指一种测定方法检测病原性朊病毒的构象异构体的存在的能力(即，给出最高百分比的真实阳性反应和低百分比的假阴性反应)。如本文使用的，特异性是指一种测定方法可靠地区分病原性的构象异构体和PrP^c的能力(即，给出低百分比的假阳性反应和高百分比的真实阴性反应)。本发明的方面包括能够检测10μl样品中少于2、5、10、50、100、200、500阿克(ag)、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5飞克(fg)或者更少的朊病毒的方法。在进一步的方面，所述方法能够检测样品(例如，每20μl样品)中3×10⁷、1×10⁷、5×10⁶、1×10⁶、5×10⁵、1×10⁵、5×10⁴、1×10⁴、5×10³、1×10³、100、50、26个分子或者更少的朊病毒，包括它们之间的所有值。在更进一步的方面，本发明的方法能够检测263K瘙痒病脑的1×10^-7、5×10^-7、1×10^-8、5×10^-8、1×10^-9、5×10^-9、1×10^-10、5×10^-10、1×10^-11、5×10^-11、1×10^-12、5×10^-12或者更高稀释度的样品稀释液中的朊病毒，包括它们之间的所有值。本发明的方法与蛋白质印迹分析相比将通常能够使灵敏性增加4×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、3×10⁹或者更大的倍数，包括它们之间的所有值。本发明的实施方案包括能够区分病原性和非病原性朊病毒的测定方法的大于90％、92％、95％、98％、99％直到100％的检测特异性。

在更进一步的实施方案中，本发明的方法可以用于检测可能被或者已经被朊病毒污染的生物样品。怀疑被污染的样品包括，但不限于，血液(血浆、血细胞、血小板，等等)、尿、脑脊液和从此类样品得到或者分离的任何产品。在一些方面中，可疑样品可以是将用于器官移植、移植的动物或者人的器官、组织或者细胞或者此类样品的纯化产物。

在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方案可以用于本申请中描述的任何其他方法或组合物。从而，涉及一种方法或组合物的实施方案也可以被用于本发明的其他方法和组合物。

如本文说明书中使用的，“一个”或“一种”是指一个或多个。如权利要求书中所用的，当与术语“包含”结合使用时，单词“一个”可以指一个或多于一个。

说明书中术语“或者”的使用用于指“和/或”，除非明确指出，是指仅仅备选方案或者备选方案是相互排他的，尽管本公开支持仅仅指备选方案和“和/或”的定义。本文使用的“另一个”可以指至少另一个或多个。

在本申请中，术语“约”用于指出一个值包括装置误差、用于确定值的方法的内在差异或者在研究受试者中存在的差异。

根据下面的详述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，详述和特定实施例尽管指出本发明的优选实施方案，但是仅仅为了阐明给出，因为在本发明的精神和范围内的多种改变和修饰将从该详述而变得对于本领域技术人员是显而易见的。

                        附图简述

下面的附图是本说明书的部分并且被包括用于进一步阐明本发明的一些方面。通过参考附图以及本文给出的特定实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。

图1.描绘示例性saPMCA步骤的流程图。粗箭头指出可以重复以产生多次多种或者连续扩增循环的步骤。

图2.通过PMCA在瘙痒病感染的仓鼠的血液中的PrP^Sc检测。来自瘙痒病接种的动物和对照动物组的血样在温育期间的不同时间被采集。如所述的用1ml血液制备血沉棕黄层(Castilla等人，2005)。将样品进行144个PMCA循环。将来自第一轮扩增的10μl样品稀释到90μl正常的脑匀浆中并进行新一轮的144个PMCA循环。将该方法共重复7次。每个小图代表使用每组动物中的样品在第7轮PMCA中得到的结果。Ix：来自263K瘙痒病感染的仓鼠的样品；Cx：来自注射PBS的对照动物的样品。在电泳前，所有样品都用PK处理，但是正常的脑匀浆(NBH)不用PK处理。

图3.在温育期间在不同的时间点PrP^Sc血液阳性动物的比例。对比接种后(其中采集样品)的时间给出了对血液中PrP^Sc得分为阳性的样品的百分比。观察到PrP^Sc可检测性的两个阶段：在温育期间的早期，其可能对应于淋巴样组织中正在发生外周朊病毒复制的时间和症状阶段的第二阶段，其中脑含有大量的PrP^Sc。

图4.通过saPMCA检测到的PrP^Sc的最小量。将瘙痒病仓鼠脑匀浆的等分试样连续稀释到转变缓冲液中以达到10^-12和10^-14稀释度。在4个单独的试管中将20μl每种稀释液的4个等分试样与80μl正常的脑匀浆混合并进行144个PMCA循环。之后，PK消化后，将20μl的体积用于蛋白质印迹，将10μl稀释到90μ正常脑匀浆中并将样品进行第二轮的144个PMCA循环。重复该步骤7次以达到7个连续轮的PMCA。S1、S2、S3和S4对应于每种稀释液中四个重复管。作为阴性对照，使用稀释10^-12到转变缓冲液中的正常脑匀浆并进行相同的saPMCA方案。该实验还在4个一式两份管中进行并且C1、C2、C3和C4代表每个结果。

                       发明详述

本文公开了检测样品中朊病毒的方法；该方法可以用于诊断动物中的多种疾病。本发明的用于检测朊病毒的方法提高了灵敏性并且缩短了高灵敏性检测样品中朊病毒的必要时间。本发明将使得能够高通量、准确和灵敏地筛选样品以及诊断临床疾病。例如对于奶牛，该方法可以用于诊断牛海绵样脑病(BSE)。对于绵羊，该方法也可以用于诊断瘙痒病。对于鹿和麋鹿，该方法可以用于诊断CWD。本发明的优点包括测试活动物感染以保护兽群免于被不必要地淘汰或者朊病毒不经意引入食物链中。

还设想所述的诊断方法可以应用于人类和人类疾病。可以在人类中诊断的朊病毒疾病包括克雅病(CJD)、库鲁病、致命性家族性失眠症、格斯特曼综合征或者偶发性致命性失眠症。本发明的方法再次提供了与当前可用于诊断这些神经病症的方法相比明显的优点。例如，当前用于CJD诊断的认知测试和临床病征仅仅可以指示可能的诊断。本发明提供了客观的方法，通过该方法可以得到阳性诊断，得到假阳性或者假阴性结果的机会很小。此外，该测试的灵敏性使得可以检测来自外周组织，如血液的疾病，其将比当前的脑活组织检查方法的侵入性更小并且更便宜。本发明还提供了足够高的灵敏性，使得在临床症状发生前就可以检测和诊断疾病。

通过本发明的方法也可以检测介导其他疾病状态的错折叠的蛋白质。例如，可以检测错折叠的Aβ，其被称作β-淀粉状蛋白，已知其与阿尔茨海默氏病有关。该方法可以进一步被用作阿尔茨海默氏病的诊断测试。如对于CJD一样，阿尔茨海默氏病的诊断当前主要基于认识测试，并且生物化学测试步骤将是一个重大的优点。

本发明的另一应用是作为化合物的高通量筛选方法，所述化合物增强或者抑制非病原性蛋白质向朊病毒的转变。在该方面，设想反应混合物还可以包含受试化合物。对照反应混合物和包括受试化合物的反应混合物可以在扩增后评估朊病毒水平。其中检测受试与对照反应混合物中朊病毒水平之间的差异，可以鉴定增强或者抑制非病原性蛋白质向朊病毒转变的化合物。在该方法的其他实施方案中，来自对照和受试反应混合物的样品可以在2、3或者更多扩增步骤后被采集以测定朊病毒复制速率。通过比较对照朊病毒复制速率与在受试化合物存在下的增殖速率，可以定量地评估候选调节物对朊病毒复制的影响。

I.传染性海绵状脑病(TSE)

在动物中，最常见的TSE是瘙痒病，但是最有名和危险的疾病是最近发现的BSE，其侵袭牛并且在世界上通过其俗名“疯牛病”闻名。在人类中，最常见的TSE是CJD，其在世界上的发病率是每年每一百万人0.5到1.5个新的病例(Johnson和Gibbs，Jr，1998)。已经常规地认识到三种不同形式的CJD(Collinge，2001)：偶发性(sCJD；85％病例)、家族性(fCJD；10％)和医源性(iCJD；～5％)。然而，在1996年，在英国出现了CJD的一种变体形式(vCJD)，其已经与受BSE感染的肉的消费关联起来(Bruce，2000；Collinge，1999；Scott等人，1999)。与sCJD的典型病例相反，vCJD侵袭平均年龄为27岁的年轻患者，并且是相对长的疾病(14个月，相比sCJD为4.5个月)。因为可以获得的关于潜伏期和暴露于受污染的牛食品的水平的信息不足，所以重要的是对vCJD的潜在的将来发病率做出有根据的预测(Baiter，2001)。在动物中，没有遗传形式疾病的证据，并且多数病例似乎通过水平或者垂直传播获得。

sCJD的临床诊断是基于快速发展的多病灶痴呆与具有锥体和锥体外束征、肌阵挛和视觉或者小脑病征以及特征性的周期性脑电图(EEG)(Collins等人，2000；Ingrosso等人，2002；Kordek，2000；Weber等人，1997)。诊断sCJD并且将其与阿尔茨海默氏病和其他痴呆相区别的一个关键特征是该疾病的临床特征的快速发展和短的持续时间，其通常少于2年。fCJD的临床表现非常相似，只是在sCJD中的疾病发作稍早。遗传性CJD的家族史或者PrP基因中突变的遗传筛选被用于确定fCJD诊断，尽管缺少家族史不能排除遗传起源(Kordek，2000)。

变异的CJD最初似乎为进行性神经精神病征，其特征是焦虑、抑郁、冷漠和妄想的症状(Henry和Knight，2002)。这伴随着持续的疼痛感觉症状并且接着是共济失调、肌阵挛和痴呆。变异的CJD与sCJD的区别是疾病的持续时间(通常大于6个月)和EEG分析(vCJD不显示出在sCJD中所观察到的非典型的图像)。在MRI中注意到的高的两侧丘脑枕信号通常用于帮助诊断vCJD(Coulthard等人，1999)。此外，扁桃体活组织检查可以用于帮助诊断vCJD，该诊断是基于许多vCJD病例已经表明对于淋巴样组织(如扁桃体和阑尾)中的PrP^Sc染色是测试阳性的。然而，因为该测试的侵入性性质，应该仅在完成vCJD的临床标准的患者中进行，其中脑的MRI不显示出特征性丘脑枕病征(Hill等人，1999)。

GSS是显性遗传的疾病，其特征是痴呆、帕金森病症状和相对长的持续时间(通常5-8年)(Boellaard等人，1999；Ghetti等人，1995)。在临床上，GSS类似于阿尔茨海默氏病，只是其通常伴随着共济失调和发作。通过临床检查和Prp突变的遗传筛选确定诊断(Ghetti等人，1995)。FFI也是显性遗传的并且与PrP突变有关。然而，与FFI有关的主要的临床发现是失眠症，在晚期是肌阵挛、幻觉、共济失调和痴呆(Cortelli等人，1999)。

II.蛋白质来源

A.非病原性蛋白质的来源

如上面详述的，多种来源可以被用于得到用于本发明方法的非病原性蛋白质。例如，蛋白质可以在细胞中被内源表达并且这些细胞用于制备提供非病原性蛋白质的裂解物。裂解物可以来自组织培养细胞或者从完整生物、器官或者组织提取。例如，对于非病原性蛋白质是PrP的情况，可以使用脑匀浆。这些脑匀浆可以是哺乳动物脑匀浆，并且它们优选来自与被测试的具体样品相同的物种或者来自转基因小鼠，该小鼠经工程化以表达来自将被测试的物种的PrP。

设想除了使用粗细胞裂解物外，还可以使用部分纯化的蛋白质。例如，对于PrP的情况，已经表明多数蛋白质定位于膜的被称作“脂膜筏”的结构中。从而，通过从裂解物富集脂膜筏，可以实现PrP^C的部分纯化。该富集方法通常依赖于脂膜筏结构对温和去污剂如冰预冷的Triton X-100的抗性，并且是本领域技术人员公知的。

如上面所指出的，在一些情况中，优选将非病原性蛋白质去糖基化。例如，可以用肽N-糖苷酶F(New England Biolabs，Beverly，MA)根据生产商的使用说明处理非病原性蛋白质。在该情况中，在37℃温育约2小时导致显著的去糖基化。

通常，“纯化的”将指非病原性蛋白质组合物，其已经被分级分离或者分离以除去多种其他的蛋白质或者肽组分，并且该组合物基本上保留非病原性蛋白质，如可以通过蛋白质印迹检测非病原性蛋白质可以对其进行评估。

为了从天然的或者重组的组合物纯化非病原性蛋白质，将该组合物进行分级分离以从组合物除去多种其他组分。多种适用于蛋白质纯化的技术将是本领域技术人员公知的。这些技术包括例如，用硫酸铵、PTA、PEG、抗体等沉淀，或者通过热变性接着离心；层析步骤，如离心交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石、卵磷脂亲和以及其他亲和层析步骤；等电聚焦；电泳；以及此类和其他技术的组合。

在本发明的一些实施方案中，非病原性蛋白质源可以来自使得过表达或者经工程化而过表达所述蛋白质的细胞。例如，可以用表达非病原性蛋白质，如PrP^C的核酸载体转化细胞。这些细胞可以包含哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、完整生物，如转基因小鼠，或者可以用于非病原性蛋白质的有用来源的其他细胞。来自表达细胞的粗制细胞裂解物或者纯化的非病原性蛋白质可以被用作非病原性蛋白质源。

在一些情况中，优选将重组蛋白与额外的氨基酸序列融合。例如，可以标记过表达的蛋白质被用于纯化或者方便检测样品中的蛋白质。可以产生的一些可能的融合蛋白包括组氨酸标记、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、绿色荧光蛋白(GFP)、Flag和myc标记的PrP。这些额外的序列可以用于帮助纯化和/或检测重组蛋白，并且在一些情况中，可以通过蛋白酶切割而被除去。例如，可以将特定蛋白酶切割位点的编码序列插入到非病原性蛋白质编码序列和纯化标记编码序列之间。此类序列的一个实例是凝血酶的切割位点。可以用蛋白酶切割该融合蛋白以从纯化标记释放非病原性蛋白质。

在非病原性蛋白质是高度纯化的情况下，反应混合物可以进一步包含额外的细胞裂解物以提供对于转变重要的第二种因子。例如，对于PrP的情况，来自PrP裸鼠的脑匀浆可以是理想的。设想本发明的方法可以用于鉴定在非病原性蛋白质的病例转变中重要的辅因子。

本领域技术人员已知的多种载体中的任一种可以用于过表达非病原性蛋白质。例如，可以使用质粒或者病毒载体。本领域技术人员公知可以通过多种方法向细胞中导入这些载体，所述方法包括，但不限于，转染(例如，通过脂质体、磷酸钙、电穿孔、微粒轰击，等等)、转化和病毒转导。

非病原性蛋白质还可以包含这样的蛋白质，其具有与野生型序列相比含有替代、插入、缺失和终止密码子的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，可以加入蛋白酶切割位点以允许蛋白质在被转化成朊病毒形式后将其失活。例如，可以向序列中插入凝血酶、烟草蚀纹病毒(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)或者因子Xa(New England Biolabs，Beverley，MA)蛋白酶识别的切割序列。

在一些实施方案中，可以在PrP编码序列中，例如在小鼠、人、牛、绵羊、山羊，和/或麋鹿PrP的编码序列(如通过GenBank检索号NM_011170、NM_183079、AY335912、AY723289、AY723292和AY748455给出，将它们都引入本文作为参考)中产生改变。例如，可以产生突变以匹配多种哺乳动物PrP基因已知的突变和多态性(表2)。设想表达这些改变的PrP基因的细胞可以被用作非病原性蛋白质的来源。这些细胞可以包含内源表达突变的PrP基因的细胞或者已经通过导入表达载体而表达突变PrP蛋白的细胞。突变的非病原性蛋白质的使用可以是尤其有利的，因为这些蛋白质可能更容易地转变成朊病毒，从而可以进一步增强本发明方法的灵敏性。

设想本发明的方法可以用于测试突变对非病原性蛋白质的转变速率的影响。例如，对于PrP的情况，可以将突变的PrP和野生型PrP与等量的朊病毒混合并进行saPMCA。通过比较在具有突变的PrP和野生型PrP的样品中朊病毒复制的速率，可以鉴定调节朊病毒复制的能力的突变。来自此类研究的其他结果可以用于确定具有某些PrP多态性的动物是否对TSE较敏感或者较不敏感。

                                      表2

病原性人突变	人多态性	绵羊多态性	牛多态性
				2个八重复插入片段4-9个八重复插入片段密码子102Pro-Leu密码子105Pro-Leu密码子117Ala-Val密码子145终止密码子178Asp-Asn密码子180Val-Ile密码子198Phe-Ser密码子200Glu-Lys密码子210Val-Ile密码子217Asn-Arg密码子232Met-Ala	密码子129Met/Val密码子219Glu/Lys	密码子171Arg/Glu密码子136Ala/Val	5或6个八重复

B.用于saPMCA测定方法的样品来源

如上文所述的，设想用于本发明方法的样品可以基本上包含能够被朊病毒污染的任一组分。此类组分可以包含来自组织的组织样品，包括但不限于，血液、淋巴结、脑、脊髓、扁桃体、脾脏、皮肤、肌肉、阑尾、嗅上皮、脑脊液、尿、奶、肠、泪液和/或唾液。可以得到用于分析的样品的其他组分包括食品、饮用水、法医证据、手术器具和/或机器。

C.用于检测saPMCA反应混合物中的朊病毒的方法

直接和间接方法可以用于诊断反应混合物或者连续反应混合物中的朊病毒蛋白质。对于直接检测朊病毒的方法，通常需要从剩余的非朊病毒蛋白质分离新形成的朊病毒。这通常基于朊病毒相对于非病原性蛋白质的不同性质来完成，例如，朊病毒通常高度可溶并且抗蛋白酶处理。因此，对于PrP^Sc和Pr^PC，可以通过蛋白酶处理，或者在去污剂中的差速离心或者这两种技术的组合进行分离。

对于通过蛋白酶处理来分离朊病毒和非病原性蛋白质的情况，将反应混合物与例如蛋白酶K(PK)一起温育。示例性的蛋白酶处理包括在反应混合物中用50μg/ml蛋白酶K(PK)在45℃消化蛋白质，如PrP^C 1小时。可以在评估朊病毒水平之前，通过加入PMSF或者电泳样品缓冲液来停止与PK的反应。在45℃用50μg/ml PK温育足够除去非病原性蛋白质。

在一些情况下，可以通过分级分离来分离非病原性蛋白质与朊病毒。对于PrP^C和PrP^Sc的情况，可以使用差别的溶解度。示例性步骤包括：在10％肌氨酰存在下在4℃温育反应混合物30分钟。之后，在BiosafeOptima MAX超速离心机(Beckman Coulter，Fullerton，CA)中以100,000xg离心样品1小时，并重悬浮含有PrP^Sc的沉淀物，然后分析朊病毒。在一些情况中，在加入肌氨酰之前，将反应混合物与不同浓度的盐酸胍在室温下摇动温育2小时。之后，加入肌氨酰并使用离心分离可溶的和不可溶的蛋白质。

通过使用特异结合并沉淀错折叠形式的蛋白质的配体，包括构象抗体、某些核酸、纤溶酶原、PTA和/或多种肽片段，也可以分离朊病毒与非病原性蛋白质(Soto等人，2004)。

1.蛋白质印迹

可以对经分级分离或用蛋白酶处理以除去PrP^C的反应混合物进行蛋白质印迹以检测PrP^Sc。典型的蛋白质印迹步骤以通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件下分级分离开始。然后将蛋白质电印迹到膜，如硝酸纤维素或者PVDF膜上，并在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下，用抗朊病毒抗体探测。用于检测PrP的示例性抗体是3F4单克隆抗体(Kascsak等人，1987)。在复合体形成后，洗涤膜以除去非复合的物质。优选的洗涤步骤包括用溶液如PBS/Tween或者硼酸盐缓冲液洗涤。通过本领域技术人员已知的多种测定方法，例如，增强型化学发光测定方法(ECL)(Amersham，Piscataway，NJ)显示免疫反应带。

可以通过蛋白质印迹，接着通过光密度计分析并与朊病毒浓度已知的样品的蛋白质印迹比较来估计朊病毒浓度。例如，这可以通过将数据扫描到计算机中，接着用定量软件分析来完成。为了得到可靠和稳健的定量，在相同的凝胶中分析样品的几种不同的稀释液。

2.ELISA和构象依赖性免疫测定方法(CDI)

如上面详述的，最简单和直接意义上的免疫测定方法是结合测定方法。一些优选的免疫测定方法是本领域中已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和特别是构象依赖性免疫测定(CDI)。

在一种示例性ELISA中，将抗朊病毒抗体固定到所选的显示出蛋白质亲和性的表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，向孔中加入怀疑含有朊病毒蛋白质抗原的反应混合物。在结合并洗涤除去非特异结合的免疫复合体后，可以检测结合的朊病毒蛋白质。通常通过加入连接到可检测标记的另一种抗朊病毒抗体来实现检测。该类型的EILSA是简单的“夹心ELISA”。还可以通过加入第二种抗朊病毒抗体，接着加入对第二种抗体具有结合亲和力的第三种抗体来实现检测，所述第三种抗体被连接到可检测标记。

在另一种示例性ELISA中，将怀疑含有朊病毒蛋白质抗原的反应混合物固定在孔表面，然后与抗朊病毒抗体接触。在结合并洗涤除去非特异结合的免疫复合体后，检测结合的抗朊病毒抗体。其中最初的抗朊病毒抗体被连接到可检测的标记，可以直接检测免疫复合体。再一次，可以用对第一种抗朊病毒抗体具有结合亲和性的第二种抗体来检测免疫复合体，该第二种抗体被连接到可检测的标记。

另一种ELISA(其中反应混合物的蛋白质被固定)涉及在检测中使用抗体竞争。在该ELISA中，向孔中加入抗朊病毒蛋白质的经标记的抗体，允许结合，并通过它们的标记检测。然后，通过将其与在与经包被的孔温育之前或者期间与抗朊病毒的经标记的抗体混合来测定给定反应混合物中朊病毒蛋白质抗原的量。样品中朊病毒蛋白质的存在减小了用于结合到孔的抗朊病毒抗体的量，从而减小了最终的信号。从而，可以定量样品中朊病毒的量。

不管所使用的形式，ELISA具有某些共同的特征，如包被、温育或结合、洗涤以除去非特异性结合的种类和检测结合的免疫复合体。这些在下文描述。

在用抗原或者抗体包被平板中，将通常将孔与抗原或者抗体的溶液在特定的小时内温育过夜。然后洗涤平板的孔以除去不完全吸附的物质。然后用对于受试抗血清抗原中性的非特异性蛋白质“包被”孔的任何剩余的可利用的表面。这些蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。包被允许阻断固定表面上的非特异性吸附位点，从而减小由血清在表面上的非特异性结合引起的背景。

在ELISA中，可能更习惯使用二级或者三级检测方式而不是直接步骤。从而，在蛋白质或者抗体结合到孔后，用非反应性物质包被以降低背景，并洗涤除去未结合的物质，用待测试的生物样品在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下接触固定化表面。免疫复合体的检测需要经标记的二级结合配体或者抗体，或者二级结合配体或者抗体与经标记的三级抗体或者三级结合配体的结合。

“在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下”是指所述条件优选包括用溶液如BSA、牛血清丙种球蛋白(BGG)和磷酸缓冲的盐水(PBS)/Tween稀释抗原和抗体。这些加入的物质倾向于帮助降低非特异性背景。

“合适的”条件也指在足以允许有效结合的温度和一段时间下温育。温育步骤通常为约1到2到4小时，优选在25℃到27℃的温度下，或者可以在约4℃过夜等等。

在ELISA中的所有温育步骤之后，洗涤接触的表面以便除去非复合的物质。优选的洗涤步骤包括用溶液如PBS/Tween或者硼酸盐缓冲液洗涤。在受试样品和最初结合的物质之间形成特异性免疫复合体，以及在随后的洗涤之后，可以确定甚至微量的免疫复合体的存在。

为了提供检测手段，第二种或第三种抗体将具有结合的标记以允许检测。优选地，这将是在用合适的显色底物温育时显色的酶。从而，例如，将希望用脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或者过氧化氢酶-缀合的抗体在有利于发生进一步的免疫复合体形成的条件下接触和温育第一种或第二种免疫复合体一段时间(例如，在室温下含有PBS的溶液如PBS-Tween中温育2小时)。

用经标记的抗体温育，以及随后洗涤以除去未结合的物质后，定量标记物的量，例如，通过用显色底物如脲和溴甲酚紫或者2，2′-连氮-双-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS]和H₂O₂(在过氧化物酶作为酶标记的情况下)温育。然后通过测量生色的程度，例如，使用可见光谱分光光度计来实现定量。

3.动物生物测定方法

通过本领域技术人员公知的动物生物测定方法还可以间接检测反应混合物中朊病毒的存在。对于PrP^Sc的情况，示例性步骤可以包括：

将4-6周龄的动物(叙利亚金色仓鼠)麻醉并用约1μl反应混合物在右侧海马中立体定位注射。这可以用计算机化的灌注机器完成，该机器以给定的速率，如0.1μl/分钟向脑中注射样品。用下面的等级通过一周两次对动物打分来测量临床疾病的发作：

1.正常动物；

2.轻微的行为异常，包括活动过度和对噪声的超敏感；

3.中度的行为问题，包括头震颤、共济失调、摇摆步态、头部摆动、易激惹和进攻性；

4.严重的行为异常，包括所有上面的问题加上头部和身体抽搐和自发的反绕；

5.疾病末期，其中动物躺在笼子中并且不再能够站立。

认为在两个连续的周内得分为水平4的动物是有病的并且将其处死。可以通过暴露于二氧化碳而处死以避免过度疼痛。通过本领域中公知的方法提取脑和其他组织和进行组织学分析。例如，将一个半球固定在10％甲醛溶液中，切成切片，并包埋在石蜡中。将来自每个石蜡块的连续切片(～6μm后)用苏木精染色，使用标准方案或者与识别PrP的抗体一起温育，在一些情况中，用抗胶质细胞原纤维酸性蛋白的抗体温育一起可以用作对照。例如，使用过氧化物酶-抗过氧化物酶方法对免疫反应显影。在该情况中，通过吸收验证抗体特异性。在一些情况中，也可以使用蛋白质印迹分析对PrP^Sc进行生物化学检查。在一些情况中，通过对组织学和生物化学分析各自使用一个脑半球，可以进行这两种分析。

4.细胞测定方法

另一种检测低浓度朊病毒的策略是使用细胞感染性测定方法(Klohn等人，2003)。小鼠成神经细胞瘤N2a亚系对于某些朊病毒高度易感，如通过PrP^res的积累和感染性所证实的。在该测定方法中，将易感的N2a细胞暴露于含有朊病毒的样品3天，生长到汇合，并分传3次。用自动化计数装置测定含有PrP^res细胞的比例。在一些应用中，还可以通过流式细胞术测定含有朊病毒的细胞数目。对感染的剂量应答在朊病毒浓度的两个对数内是线性的。主张细胞测定方法与小鼠生物测定方法一样灵敏，快10倍，花费低两个数量级，并且适于使用机器人自动化。

D.PrP^C标记：

在本申请的一些应用中，可以标记非病原性蛋白质以能够高灵敏性地检测转变成朊病毒的蛋白质。例如，非病原性蛋白质可以被放射性标记、表位标记或者荧光标记。可以直接或者间接地检测标记。放射性标记包括，但不限于，¹²⁵1、³²P、³³P和³⁵S。

将含有经标记的蛋白质的混合物进行saPMCA并通过转化经标记的蛋白质并例如通过蛋白酶解除去未转化的蛋白质后，以高灵敏性检测产物。备选地，可以以这样的方式标记蛋白质使得当在转化期间诱导了构象改变时，可以检测到信号。一个实例是使用FRET技术，其中用两种合适的荧光团标记蛋白质，当蛋白质再折叠时，这两种荧光团变得足够接近以交换荧光能量(见例如，美国专利6,855,503)。

1.荧光共振能量转移(FRET)

一类染料是ET(能量转移)染料，已经基于荧光共振能量转移(FRET)机制开发了这类染料以产生大的和不同的斯托克斯位移并且用于同时检测混合物中不同标记的样品。这些ET染料包括复杂的分子结构，其由供体荧光团和受体荧光团以及标记功能组成以允许它们缀合到目的生物分子。当供体荧光团激发时，通过FRET机制供体吸收的能量被转移到受体荧光团并且引起其发荧光。不同的受体可以与一种供体一起使用，形成一组ET染料，从而当该组在单个供体频率下被激发时，取决于受体的选择，可以观察到多种发射。当定量这些不同的发射时，可以快速测定经标记的蛋白质的折叠的改变。可以使用的一些示例性染料包括BODIPY FL、萤光素、四甲基罗丹明、IAEDANS、EDANS或者DABCYL。其他染料已经被用于FRET，例如，在美国专利5,688,648、6,150,107、6,008,373和5,863,727和PCT公布WO 00/13026和WO01/19841中公开的染料，将它们都引入本文作为参考。

III.抗体产生

在一些实施方案中，本发明涉及抗体。例如，抗体被用于许多检测朊病毒的方法中(例如，蛋白质印迹和ELISA)。除了针对全长蛋白质产生的抗体外，还可以应答较小的构建体，其包括表位核心区，包括野生型和突变表位产生抗体。

如本文所用的，术语“抗体”意在宽泛地指任何免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，IgG和/或IgM是优选的，因为它们是生理条件下最常见的抗体，还因为它们在实验室条件下最容易制备。

认识到单克隆抗体(mAbs)具有一些优点，例如，可再现性和大规模生产，并且它们的使用通常是优选的。本发明从而提供了人、鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔和甚至鸡来源的单克隆抗体。

术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且包括抗体片段，如Fab’、Fab、F(ab′)₂、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)，等等。用于制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域中公知的。制备和表征抗体的手段也是本领域公知的(见例如，Harlow和Lane，″Antibodies：A Laboratory Manual，″Cold Spring HarborLaboratory，1988；引入本文作为参考)。

产生单克隆抗体(mAbs)的方法通常以与用于制备多克隆抗体相同的株系开始。简言之，用根据本发明的免疫原性多肽组合物免疫动物并从该免疫的动物收集抗血清，可以制备多克隆抗体。备选地，在本发明的一些实施方案中，从可以暴露于特定抗原的人收集血清。可以在工作环境中发生暴露于特定抗原，从而这些人已经在职业上暴露于特定抗原并且已经产生了抗肽、多肽或者蛋白质的多克隆抗体。在本发明的一些实施方案中，来自职业上暴露的人的多克隆血清被用于通过使用免疫检测方法鉴定朊病毒中的抗原区。

多种动物种类可以被用于产生抗血清。通常，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或者山羊。因为兔的相对大的血液体积，兔是产生多克隆抗体的优选的选择。

如本领域中公知，给定的组合物的免疫原性可以改变。因此，通常必须加强宿主免疫系统，如可以通过将肽或者多肽免疫原偶联到载体来实现。示例性和优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白，如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或者兔血清白蛋白也可以被用作载体。

将多肽缀合到载体蛋白的手段是本领域公知的并且包括戊二醛、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺和二-叠氮化的联苯胺。

如本领域公知，使用免疫应答的非特异性刺激剂(称作佐剂)，可以增强特定免疫原组合物的免疫原性。合适的分子佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，如细胞因子、毒素或者合成的组合物。

可以使用的佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物，如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰基脂质A(MPL)。还设想RIBI，其在2％鲨烯/Tween 80乳液中含有从细菌提取的三种组分：MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。甚至可以使用MHC抗原。示例性的、通常优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(免疫应答的非特异性刺激剂，含有杀死的结核分枝杆菌)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。

除了佐剂外，可以希望共同施用生物应答调节剂(BRM)，其已经表明上调T细胞免疫性或者下调抑制细胞活性。此类BRM包括但不限于，西米替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m²)(Johnson/Mead，NJ)，细胞因子，如γ-干扰素、IL-2或者IL-12或者编码涉及免疫辅助细胞功能的蛋白质如B-7的基因。

用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量随着免疫原的性质以及用于免疫的动物而变。多种途径可以用于施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可以通过在免疫后在多个点采集处采集免疫动物的血样来监测多克隆抗体的产生。

还可以给予第二次加强注射。重复加强和滴定过程直到实现合适的滴定。当得到所希望水平的免疫原性时，可以对经免疫的动物取血并分离和保存血清，和/或可以用动物产生mAb。

通过使用公知的技术，如美国专利4,196,265(引入本文作为参考)中实例的技术，可以容易地制备mAb。通常，该技术涉及用所选的免疫原组合物，如纯化或者部分纯化的多肽、肽或者结构域(为野生型或者突变的组合物)免疫合适的动物。以有效刺激抗体产生细胞的方式施用免疫组合物。

如果需要，可以使用过滤、离心和多种层析方法，如HPLC或者亲和层析来进一步纯化mAb。可以从这样产生的单克隆抗体得到本发明的单克隆抗体的片段，这可通过包括用酶，如胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶和/或通过化学还原切割二硫键的方法进行。备选地，使用自动化的肽合成仪可以合成本发明所包括的单克隆抗体片段。

还设想可以用分子克隆方法产生mAb。为此，从分离自经免疫的动物的脾脏的RNA制备组合免疫球蛋白噬菌粒文库，并使用表达抗原的细胞和对照细胞，通过淘选法筛选表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规的杂交瘤技术的优点是在一轮中可以产生和筛选大约10⁴倍多的抗体，并且通过H和L链组合产生新的特异性，所述组合进一步增加了发现合适抗体的机会。

IV.筛选朊病毒功能的调节剂

如上文所述，本发明可以被用于鉴定调节朊病毒复制能力的化合物，此类化合物可以是治疗朊病毒介导的疾病的候选物。设想筛选化合物的方法包括对对照反应混合物进行saPMCA并且可以在扩增后评估包括受试化合物的反应混合物的朊病毒水平。其中检测受试和对照反应混合物中朊病毒水平的差异，可以鉴定增强或抑制非病原性蛋白质向朊病毒的转变的化合物。这些测定方法可以包括随机筛选候选物质的大文库；任选地，测定方法可以用于集中在特定类别的化合物，这些化合物是通过肉眼对认为使得它们更可能调节朊病毒功能的结构特征而选择得到的。

按照功能，是指可以通过测定标准量的非病原性蛋白质被已知量的朊病毒转变为朊病毒来测定转变效率。这可以通过例如在一定次数的saPMCA循环后定量反应混合物中朊病毒的量来测定。这在下面的实施例2中被更具体地显示，其中鉴定了朊病毒复制的增强剂和朊病毒复制的抑制剂。具体地，表明向反应混合物加入Cu²⁺抑制了朊病毒复制，而向反应混合物加入EDTA增强了朊病毒转变。由于本文公开的saPMCA测定方法的快速、高通量性质，所以设想可以筛选潜在的朊病毒复制调节物的小组。

当然，将理解本发明的所有筛选方法都可以用于自身，尽管可能没有发现或者鉴定到有效的候选物。本发明提供了筛选此类候选物的方法，而不仅仅是发现它们的方法。

A.调节剂

如本文使用的，术语“候选物质”是指潜在地抑制或者增强朊病毒功能活性的任何分子。候选物质可以是蛋白质或者其片段，小分子，或者甚至核酸分子。可以证明最有用的药理学化合物将是结构上与PrP相关的化合物，或者其他结合铜的化合物。使用先导化合物帮助开发改进的化合物被称作“推理性药物设计”并且不仅包括与已知的抑制剂和活化剂的比较，而且包括涉及预测目标分子的结构。

推理性药物设计的目标是产生生物活性多肽或者目标化合物的结构类似物。通过产生此类类似物，可能形成药物，其比天然的分子活性更高或者更稳定，所述天然分子对改变具有不同的敏感性或者可以影响多种其他分子的功能。在一种方法中，将产生目标分子或者其片段的三维结构。这可以通过x射线晶体学、计算机建模或者通过两种方法的组合完成。

还可能使用抗体来确定目标化合物激活剂或者抑制剂的结构。原则上，该方法产生药物核心(pharmacore)，随后的药物设计可以基于该药物核心。通过产生抗功能性的药学活性抗体的抗独特型抗体，可能完全绕过蛋白质晶体学。作为镜像的镜像，将预期抗独特型的结合位点是最初抗原的类似物。然后，抗独特型可以被用于从化学或者生物学产生的肽库鉴定和分离肽。所选的肽将作为药物核心。使用本文中描述的用于产生抗体的方法，使用抗体作为抗原，可以产生抗独特型。

另一方面，可以简单地从多种商业来源获得小分子库，认为其满足有用的药物的基本标准以“暴力”鉴定有用的化合物。此类文库，包括组合产生的文库(例如，肽库)的筛选是筛选大量相关(和不相关)化合物的活性的快速和有效的方法。组合方法还通过在有活性但是其他方面不理想的化合物基础上产生模型化的第二代、第三代和第四代化合物，导致潜在药物的快速进化。

候选化合物可以包括自然存在的化合物的片段或者部分，或者可以发现为已知化合物的活性组合，其否则是无活性的。建议可以将从天然来源，如动物、细菌、真菌、植物来源，包括叶子和树皮和海产样品分离的化合物作为潜在有用的药剂的候选物来测定。将理解筛选的药剂还可以衍生自或者合成自化学组合物或者人造的化合物。从而，可以理解通过本发明鉴定的候选化合物可以是肽、多肽、多核苷酸、小分子抑制剂或者可以通过推理性药物设计从已知的抑制剂或者刺激剂开始设计的任何其他化合物。

其他合适的调节剂包括抗体(包括单链抗体)，每种将对于目标分子是特异的。在本文件别处将对此类化合物作更详细地描述。

除了最初鉴定的调节化合物之外，发明人还预期可以配制其他立体上相似的化合物以模拟调节物结构的关键部分。此类化合物(可以包括肽调节剂的肽模拟物)可以与最初调节剂以相同的方式使用。朊病毒复制的优选的调节物将具有穿过血脑屏障的能力，因为许多朊病毒本身在中枢神经系统中出现。

根据本发明的抑制剂可以是直接对朊病毒发挥活性、对非病原性蛋白质或者对非病原性蛋白质向朊病毒的转变所需的因子发挥活性的抑制剂。不管通过本发明筛选方法鉴定的抑制剂或者活化剂的类型，此类化合物的抑制或者活化作用与不存在所加入的候选物质时所观察到的相比，导致改变的朊病毒扩增或者复制。

V.试剂盒

本文描述的任一种组分可以被包含在试剂盒中。在非限制性实例中，在试剂盒中提供了非病原性蛋白质、朊病毒转变因子、净化溶液和/或转变缓冲液与金属螯合剂。试剂盒可以还包含用于表达或者纯化非病原性蛋白质的试剂。试剂盒还可以包含可以用于标记非病原性蛋白质的试剂，例如，放射性同位素或者荧光团。

特别设想用于实现本文描述的方法的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于扩增和检测样品中朊病毒的试剂盒。在这些实施方案中，试剂盒可以在合适的容器工具中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多种下面的：1)转变缓冲液；2)非病原性蛋白质；3)净化溶液；4)阳性对照，含有朊病毒的样品；5)阴性对照样品，不含有朊病毒；或者6)用于检测朊病毒的试剂。

用于检测朊病毒的试剂可以包含下面中的一种或多种：用于朊病毒的ELISA和/或CDI检测的预包被的微量滴定板；朊病毒可以在其中复制的组织培养细胞；或者用于ELISA、CDI或者蛋白质印迹检测方法的抗体。

此外，本发明的试剂盒可以含有下面的一种或多种：无蛋白酶的水；用于抑制朊病毒复制的铜盐；用于增强朊病毒复制的EDTA溶液；用于分离朊病毒与非病原性蛋白质的蛋白酶K；用于分离朊病毒与非病原性、经修饰的或者经标记的蛋白质的分级分离缓冲液(增强检测的灵敏性)；或者转变因子(增强复制效率)。

在一些实施方案中，转变缓冲液可以以“准备扩增的形式”被提供，其中它被分配在微量滴定板中，从而可以将样品和非病原性蛋白质加入第一个孔中，并进行初步扩增。一部分反应混合物转移到相邻的孔后，加入额外的非病原性蛋白质用于连续扩增。可以穿过微量滴定板重复这些步骤用于多次连续扩增。

试剂盒的组分可以被包装在在水性介质中或者以冻干的形式包装。试剂盒的容器工具将通常包括至少一个小瓶、试管、平板、烧瓶、瓶子、注射器或者其他容器工具，可以将组分置于其中并优选合适地等分试样。当试剂盒中存在一种以上的组分(标记试剂和标记物可以被包装在一起)时，试剂盒将通常还含有第二个、第三个或者其他额外的容器，可以将额外的组分单独置于所述容器中。然而，小瓶中可以包含组分的多种组合。本发明的试剂盒将通常包括用于包含蛋白质的工具和紧密限制以用于商业销售的任何其他试剂容器。此类容器可以包括注射或者充气成型的塑料容器，其中可以保持所希望的小瓶。

当在一种和/或多种液体容器中提供试剂盒的组分时，液体溶液通常为水溶液，其是无菌的和无蛋白酶的。在一些情况中，可以将蛋白质性组合物冻干以防止降解和/或可以将试剂盒或者其组分保存在低温下(即，小于约4℃)。当以干粉和和/或片剂提供试剂和/或组分时，可以通过加入合适的溶剂来重构粉剂。设想可以在另一个容器工具中提供溶剂。

                         实施例

包括下面的实施例用于进一步阐明本发明的多个方面。本领域技术人员将理解下面实施例中公开的技术代表发明人发现的在实施本发明中良好地发挥作用并从而可以被认为组成其最佳实施方式的技术和/或组合物。然而，本领域技术人员根据本公开将明白，可以对所公开的具体实施方案做出多种改变并且仍然得到相似的结果而不背离本发明的精神和范围。

                      实施例1

                   从脑纯化PrP^Sc

将1g脑组织在含有蛋白酶抑制剂的5ml冷PBS中匀浆。对于PMCA产生的PrP^res，在最后纯化后，将含有用作底物的正常脑匀浆的总样品以与脑匀浆相同的方式加工。将样品与1体积20％肌氨酰混合并将混合物匀浆和超声处理直到得到透明的制备物。将样品在4℃以5000rpm离心15分钟。丢弃沉淀物并将上清液与1/3体积的含有0.1％SB-314的PBS混合并在Biosafe Optima MAX超速离心机(Beckman Coulter，Fullerton，CA)中以100,000xg在4℃下离心3小时。丢弃上清液并将沉淀重悬浮在600μl含有0.1％SB-314，10％NaCl的PBS中并超声处理。将重悬浮的沉淀在600ul含有20％蔗糖、10％NaCl和0.1％SB 3-14的PBS上分层并在4℃离心3小时。丢弃上清液并将沉淀重悬浮在300μl含有0.1％SB 3-14的PBS中并再次超声处理。超声处理后，将样品与PK(100μg/ml)在37℃温育2小时并摇动。将经消化的样品在100μl含有20％肌氨酰、0.1％SB 3-14和10％NaCl的PBS上分层并以100,000xg离心1小时30分钟。将最终的沉淀重悬浮在100μl PBS中并超声处理。将样品在-80℃保存。通过银染和氨基酸组成分析来分析纯度。

                        实施例2

            自动化：增加通量和减少扩增时间

单探头常规超声波仪的使用对于同时处理许多样品(如诊断试验将需要的)造成了实际的问题。本发明已经将循环扩增系统改造成96孔形式的微板超声波仪(Misonix^TM 3000型(Farmingdale，N.Y.))，其同时对所有孔提供超声处理并且可以被编程用于自动操作。该改进不仅缩短了处理时间、增加通量，还允许常规地进行比单探头超声波仪更多的循环。消除了交叉污染，因为探头不直接侵入样品。这对于处理感染性样品和减小假阳性结果是重要的。1小时温育的10个循环接着30秒的超声波脉冲得到了PrP^Sc信号的显著放大，类似于使用常规的超声波仪所观察到的。对于常规诊断中的实际应用，希望缩短进行试验所需的时间。为了评估是否可以缩短时间，发明人使用超声处理之间的不同的温育时间评估了是否可以缩短时间。当温育样品30分钟时，在自动化PMCA中的扩增效率是最高的。因此，在所有随后的研究中，每个循环由30分钟温育接着超声脉冲组成。该改进与常规的PMCA步骤相比导致时间缩短50％。

                         实施例3

                 通过金属螯合提高扩增效率

作为我们优化PMCA步骤的努力的一部分，发明人发现以前观察到的相对低水平的扩增部分是由于样品中存在金属阳离子。当在EDTA——一种宽范围的金属螯合剂存在下进行PMCA反应时，扩增的效率戏剧性地更高。

已经充分确定PrP以高亲和性结合铜(和以较低亲和程度结合锌)并且实际上正常的朊病毒蛋白质的可能的生物学功能将是参与Cu²⁺的跨细胞膜转运(Brown和Sassoon，2002)。结果表明当向反应物中加入Cu²⁺时，EDTA在加强PMCA效率中的积极作用丧失。该作用非常清楚并且是依赖浓度的。用其他二价阳离子如Ca²⁺和Mg²⁺没有观察到显著效果，但是Zn²⁺也降低朊病毒转变效率，尽管没有Cu²⁺显著。这些发现提示Cu²⁺(或者Zn²⁺)对PrPC的结合可以抑制朊病毒复制过程，提示朊病毒疾病的可能的新的治疗方法。该数据帮助通过向反应物中加入金属螯合剂(如EDTA)而显著提高PMCA效率。

                    实施例4

             通过saPMCA超灵敏检测朊病毒

通过比较扩增之前和之后，在蛋白质印迹中的信号强度，来分析在自动化的PMCA后检测的灵敏度。确定140个PMCA循环使得可以检测263K瘙痒病脑的少至6.6百万倍稀释液中的PrP^Sc。不用PMCA，在相同材料的1000倍稀释液中检测到相等量的PrP^Sc，表明在这些条件下灵敏度增加约6,600倍。

在这些研究期间，注意到在约150轮(温育75小时)后扩增效率开始降低。发明人发现该问题的原因是在37℃下连续温育使材料失活。可能温育对PrP^C底物或者催化转变必需的其他脑辅因子的稳定性有不利影响。该结论是基于一个实验，其中当在开始PMCA扩增前72小时内将10％正常脑匀浆预温育(用或者不用超声处理)时，扩增效率显著降低。该结果促使开发被称作连续自动化PMCA(saPMCA)的新技术以便进一步增加检测的灵敏度。该技术由进行一系列至多144个PMCA循环组成。在第一轮144个PMCA循环结束后，将样品稀释10倍到新鲜的10％正常脑匀浆中并且进行再一次144(或者更少)个PMCA循环。saPMCA解决了底物耗尽的问题并且使得可以保持PrP的指数转变。两个连续轮的PMCA循环导致灵敏度显著提高，所述两轮被扩增样品的10倍稀释液被分开到新鲜的10％正常脑匀浆。该实验由进行第一轮的96个PMCA循环组成，其中在瘙痒病脑的至多3.1×10⁶倍稀释液中检测到PrP^Sc信号。之后，将这个稀释液和所有连续稀释液(其中没有检测到PrP^Sc信号)都稀释10倍到正常脑匀浆中并进行新一轮的118个PMCA循环。该第二轮PMCA使得可以检测瘙痒病感染的仓鼠脑的至多5×10¹⁰倍稀释液中的PrP^Sc。通过比较使用或者不使用PMCA的PrP^Sc信号强度，灵敏度增加约1千万倍。通过进行更多轮的saPMCA，进一步增加了该灵敏度。

                       实施例5

       通过saPMCA在体外进行无限的朊病毒复制

saPMCA之后的原理预计通过连续的稀释和连续轮的扩增可以在体外无限复制朊病毒。为了评估该假设，将用263K瘙痒病感染的仓鼠脑匀浆并稀释10⁴倍到10％正常仓鼠脑匀浆中。将样品立即冷冻或者进行20个PMCA循环。在该第一轮的PMCA后，采集扩增和冷冻样品的小的等分试样并稀释10倍到更多的正常脑匀浆中。将这些样品再次立即冷冻或者通过20个PMCA循环扩增。重复该步骤几次并在蛋白酶K(PK)消化以除去剩余的PrP^C之后，通过蛋白质印迹测定PrP^Sc扩增。在进一步的研究中，进行17轮的PMCA。在PMCA的最后系列中，瘙痒病脑匀浆的量等于10^-20倍稀释液。所存在的PrP^Sc接种物的量的估计表明，在该稀释后，存在少于1分子的脑来源的蛋白质，而新产生的PrP^Sc的量对应于约1×10¹²个分子，其等同于瘙痒病脑的100倍稀释液中存在的PrP^Sc的浓度。将10^-20稀释液的扩增样品进一步稀释并进行几轮的PMCA，其被稀释100倍以达到等于10^-40的瘙痒病脑匀浆的最后稀释度。通过进行一系列1000倍稀释，接着通过48个循环的PMCA，PrP^Sc的连续复制还额外持续到高达10^-55倍的稀释度。发明人从这些结果断定，PMCA使得可以在体外无限复制PrP^Sc。有趣的是，即使在1000倍稀释样品后仍然可以完全回收信号，提示扩增率为至少1000。此外，当稀释时，PrP复制率没有改变，其提示新转变的蛋白质能够以类似于脑来源的PrP^Sc的效率诱导PrP^Sc形成。对照实验在任何条件下不显示任何蛋白酶抗性PrP，在所述对照实验中，将健康的脑匀浆连续稀释成自身并进行如上述相同数目的PMCA循环，但是不存在PrP^Sc接种物。

                      实施例6

          通过saPMCA进行的朊病毒检测的再现性

通过监测在不同的实验条件下在PMCA循环之前和之后得到的PrP^Sc信号，来测量扩增的再现性。将含有瘙痒病脑的稀释到10％健康仓鼠脑匀浆中的10,000-倍稀释液的等价样品置于微板超声波仪的不同位置中并进行48个PMCA循环。在相同样品的三个不同的蛋白质印迹中得到的PrP^Sc信号的光密度计分析表明，尽管观察到一定的小的差异，但是差异不是统计学显著的并且不能归因于位置影响(相反，它们仅仅归因于实验差异性)。为了进一步分析该方法的再现性，将含有瘙痒病脑稀释到10％健康仓鼠脑匀浆中的10,000-倍稀释液的等价样品进行在不同的天进行的实验中的48个PMCA循环。在7个不同的天中，扩增效率基本上相同。光密度计分析再次表明信号在不同的实验中不是统计学上不同的。通过将从5个不同仓鼠得到的10,000倍稀释的瘙痒病脑匀浆制备物扩增到相同底物，研究不同的但是相当的接种物对转变效率的影响。在48个PMCA循环后，观察到PrP^C向PrP^Sc的大的和相似的转变。当来自5只不同仓鼠的正常脑匀浆物用作独特PrP^Sc接种物的扩增底物时，得到类似的结果。然而，实验的光密度计分析表明：在两种情况下，一个样品得到与其他四种样品相比显著不同的扩增水平。这些结果提示在PrP或者转变因子的表达中的个体差异可能导致改变体外朊病毒转变的程度。在上述每种研究中，在含有相同的物质但是保持冷冻而没有扩增的样品中没有检测到PrP^Sc。

                       实施例7

          通过saPMCA进行的朊病毒检测的特异性

检测的特异性对于诊断测定方法是非常重要的。在盲法研究中评估循环扩增的特异性，其中将瘙痒病侵袭的仓鼠的10个脑样品和健康动物的11个样品进行48个PMCA循环并在蛋白酶K(PK)消化后通过蛋白质印迹检测PrP^Sc。结果表明，尽管在PMCA后，来自患病动物的样品100％都是阳性的，但是来自正常动物的样品都没有显示出任何PrP^Sc信号。在10个阳性对照样品中，7个对应于脑的10,000倍稀释液，2个对应于50,000倍稀释液，1个对应于100,000倍稀释液。在没有PMCA扩增时，这10个样品都没有在蛋白质印迹中显示出任何PrP^Sc信号(数据未显示)。该数据的解释是，在所用的条件下，PMCA导致PrP^Sc检测中的100％特异性。

如前面阐明的，使用PMCA的扩增率取决于进行的温育/超声处理循环次数(Saborio等人，2001)。从而，发明人决定评估在许多PMCA循环后，PrP^Sc样信号是否可能在阴性样品中出现。为此，在不存在(阴性对照)和存在(阳性对照)50,000倍稀释的瘙痒病脑的等分试样存在下，将10％健康仓鼠脑匀浆进行24、48、96或144个PMCA循环并通过蛋白质印迹分析检测PrP^Sc信号。结果清楚地表明在PMCA后仅在阳性对照样品中检测到PrP^Sc反应性，强度取决于进行的循环次数。相比，在阴性对照样品中，没有检测到PrP^Sc，与进行的PMCA循环次数无关。为了评估PrP^Sc形成的程度和PMCA循环次数之间的关系，发明人尝试将数据拟合到数学公式。考虑到所有可得到的点(再次通过一式三份进行)，采用S形曲线得到了最佳的拟合(方程：信号强度＝1882/(1+e^{-(循环次数-53.6)/21.8})，表明在转变程度和循环次数之间的指数关系后，新PrP^Sc的形成达到平台。该平台可以是由于所有PrP底物由于转变成PrP而耗尽或者由于底物或者推定的转变因子在长时间温育/超声处理后失活而丧失转变功效。通过saPMCA解决了该问题。当排除最后的时间点拟合数据时，用指数曲线得到了最佳拟合(方程：信号强度＝67.4/e^{0.98(循环次数)})。这些发现支持如下观点：当转变条件不是限制因素时，对PMCA循环次数的指数依赖性(小于100个循环)。

在甚至更有挑战性的条件下研究特异性，其中在将物质稀释以更新底物后，进行几轮PMCA。将来自健康仓鼠和263K瘙痒病感染的动物的脑稀释10⁴-倍到10％正常仓鼠脑匀浆中。将样品进行48个PMCA循环。在第一轮PMCA后，取扩增样品的小的等分试样并稀释10倍到更多正常的脑匀浆中。通过48个PMCA循环再次扩增这些样品。重复该步骤几次并在PK消化后通过蛋白质印迹分析测定PrP^Sc产生。在该研究中，当最初接种物来自瘙痒病感染的动物时，10轮PMCA以达到最初脑的终浓度等于10^-13导致连续形成PrP^Sc。当不存在PrP^Sc接种物时，没有检测到PrP^Sc，表明即使在480个PMCA循环后，系统也保持高度特异性并且没有观察到假阳性样品。

                        实施例8

             saPMCA允许检测单个分子的PrP^Sc

为了估计本发明的saPMCA可以在给定样品中检测的PrP^Sc分子的最小数目，将瘙痒病脑匀浆稀释10^-12倍到转变缓冲液中并将该物质进行saPMCA。根据发明人的估计，用于这些研究的瘙痒病感染的脑中PrP^Sc浓度为约67ng/μl。该结果表明10^-12倍稀释液应该含有～6.7×10^-20g//μl或者1.3分子的PrP^Sc单体/μl。因为在该研究中使用了20μl的体积，所以在测试的样品含有约26分子的单体PrP^Sc。令人惊奇地，在5轮saPMCA后，在使用的4个复制品之一中检测到信号，并且在7轮扩增后，发明人在4个复制品的3个中检测到信号(图4)。引人注意的是，当使用脑(将不含有PrP^Sc分子的样品)的10^-14倍稀释液时，或者在不存在PrP^Sc的任一对照样品中，没有检测到扩增产物(图4)。在10^-13倍稀释液中没有检测到信号(数据未显示)。

最近的数据已经表明能够维持感染和诱导PrP^C向PrP^Sc的无细胞转变的最小尺寸的颗粒含有14到28个分子的PrP单体。表明saPMCA可以扩增寡聚体感染性的PrP^Sc的单个颗粒。该前所未有的扩增效率只与DNA的PCR扩增效率相当。此外，尽管在这些扩增水平下PCR通常导致人为扩增产物，但是本发明使用PMCA很少看到假阳性。

                       实施例9

              在saPMCA和用于快速检测BSE的

             标准测试之间朊病毒检测的灵敏性比较

如前面提到的，BSE流行病的严重后果和关于vCJD的医源性传染的不断提高的关注刺激研发一些新的检测PrP^Sc的生物化学方法。5种测试已经得到欧共体的批准并且被广泛地用于几个国家的BSE监视中(Moynagh和Schimmel，1999；Soto，2004)。所有这些测试都对应于通过蛋白质印迹、ELISA或者CDI对PrP^Sc的免疫性检测(综述见(Soto，2004))。为了比较使用这些原理的测试(适于检测仓鼠PrP^Sc)与PMCA检测的灵敏性，发明人使用相同的样品以不同方法平行地进行研究，所有样品都被制备成10％正常脑匀浆以方便比较(表3)。蛋白质印迹是最标准的但是是这些测试中灵敏度最低的，可以检测20μl样品中最少4.0ngPrP^Sc，其等同于8×10¹⁰个分子的错折叠蛋白质。根据我们的结果，简单的ELISA比蛋白质印迹灵敏8倍。然而，已经报导了更灵敏的ELISA，如两位点免疫测定夹心ELISA(Deslys等人，2001)。根据文献估计，CDI检测PrP^Sc至多等同于2×10⁵的最大稀释度的瘙痒病脑匀浆，表明它比蛋白质印迹灵敏27倍(表3)。已经用于增强PrP^Sc检测的一种策略是使用磷钨酸(PTA)特异性沉淀和浓缩蛋白质(Safar等人，1998；Wadsworth等人，2001)。根据我们的结果，PTA沉淀来自瘙痒病脑的PrP^Sc导致与标准蛋白质印迹相比检测增加50倍(表3)。通过比较，一轮100个PMCA循环导致与蛋白质印迹相比对PrP^Sc的检测灵敏2500倍。该灵敏度阈值表明一轮PMCA可以检测少至3.2×10⁷分子的PrP^Sc。令人惊奇地，两轮PMCA能够系统地检测PrP^Sc至多等同于2×10¹⁰的瘙痒病脑的最大稀释度，表明比标准蛋白质印迹的灵敏度高6.5百万倍(表3)。换句话说，两轮100个PMCA循环可以检测少至12,300个分子的PrP^Sc。

几个连续轮的PMCA循环在扩展后产生了信号，即使此时起始材料是病脑匀浆的1×10^-12倍稀释液。该扩增导致相对于标准蛋白质印迹灵敏度增加30亿倍(表3)。直到现在，感染性的动物生物测定是迄今为止可用于检测朊病毒的最灵敏的测定方法。在动物生物测定方法中，263K瘙痒病感染的仓鼠是最快速和灵敏的，因为动物可以被最低量的感染物感染并且在接种后在最短的时间观察到疾病症状。实际上，病脑的1×10^-9稀释度是仍然可以在50％的动物中产生疾病的最小量(平均致死剂量或者LD50)。在我们的实验中，在所有动物中产生疾病的最小稀释度是4×10^-9，表明生物测定方法可以减少少至107,000个分子的错折叠蛋白质，其代表比蛋白质印迹高725,000倍的灵敏度(表3)。值得注意地，我们使用与感染性研究相同的样品，采用saPMCA的发现表明2和7轮的saPMCA比最有效的生物测定方法分别更灵敏＞8和＞4000倍(表3)。

                                     表3：

测定方法	检测到的最大稀释度a	检测到的最小PrP量b	PrP分子的最小数目c	灵敏度的增加d
					蛋白质印迹	3.0×10-3	4.0ng	8.0×1010	1
ELISA	3.7×10-4	0.5ng	1.0×1010	8
					磷钨酸	6.0×10-5	80pg	1.6×109	50
依赖于构象的免疫测定方法e	5.0×10-5	67pg	1.3×109	60
					动物生物测定方法	2.0×10-9	5.3fg	1.1×105	725,000
一轮PMCAf	1.2×10-6	1.6pg	3.2×107	2,500
					两轮PMCA(saPMCA)f	5.0×10-10	0.7fg	1.3×104	6,000,000
七轮PMCAf	1.0×10-12	1.3ag	26	3,000,000,000

^a检测到的最大稀释度对应于263K瘙痒病脑中的最大稀释度，其中PrP^Sc是可以检测到的。

^b在20μl脑样品体积中可以检测到的PrP^Sc的最小量。

^c通过与重组PrP比较估计20ml样品体积中检测到的PrP分子的数目。

^d相对于使用3F4抗体的标准蛋白质印迹测定方法来表达灵敏度的增加。

^e构象依赖性免疫测定方法的数据来自文献，而所有其他都是通过实验计算的。

^f来自PMCA的数据对应于每轮使用100个PMCA循环在三个不同的实验中得到的平均值。

                      实施例10

           通过saPMCA检测外周组织中的朊病毒

朊病毒诊断测定方法的实际应用取决于在外周组织和生物液体中检测PrP^Sc的可能性。在已经表明是感染性的并且在朊病毒神经侵入中起作用的外周组织包括淋巴器官，尤其是脾脏(Aguzzi，2003)。因此，为了评估使用PMCA检测外周中PrP^Sc的可能性，将瘙痒病患者和正常的动物组处死，将它们的脾脏匀浆，与正常仓鼠脑匀浆混合，并进行PMCA。在这些动物脑内接种263K仓鼠瘙痒病并在疾病的临床病征清楚后处死。在扩增前，在任一动物中都没有观察到对应于PrP^Sc的可检测信号。然而，在96个PMCA循环后，来自患病动物脾脏的所有10个样品都给出对应于PrP^Sc的清晰信号，而在13个对照样品中都没有检测到信号。PrP^Sc信号的程度在不同样品中不同，可能反映了不同个体脾脏中存在不同量的PrP^Sc。

                         实施例11

                      血样中朊病毒检测

方法

血样

用于这些研究的样品是从叙利亚金色仓鼠得到的，在所述仓鼠腹膜内接种100μl来自受263K瘙痒病毒株侵袭的动物的10％脑匀浆(或者载体)(Castilla等人，2005a)。在所指出的时间(表4)处死每组7只动物，并使用含有EDTA的注射器从心脏直接收集血液。将血液放置在含有柠檬酸钠的管中并以1ml等分试样分离。处理样品以分离血沉棕黄层级分(Castilla等人，，2005b)。

PMCA步骤

将血沉棕黄层冻融3次并以100,000xg在4℃离心1小时。将沉淀重悬浮在100μl的10％正常脑匀浆中。制备含有具有所需的转变系数的PrP底物的正常脑匀浆是为了得到良好的扩增效率。用磷酸缓冲盐水(PBS)加上5mM EDTA灌注健康动物，然后收获组织。用转变缓冲液(含有NaCl 150mM的PBS，1.0％Triton X-100和完全蛋白酶抑制剂的混合物(含有EDTA)，来自Roche，瑞士)制备10％脑匀浆(w/v)并通过短暂的低速离心(1500rpm 30秒)澄清样品。将含有将要扩增样品的管放置在微超声波仪(Misonix Model 3000，Farmingdale，NY)的板夹上的适配器上并编程进行37℃温育30分钟，然后是设置为60-80％功效的20秒超声处理脉冲的循环(Castilla等人，2005a)。在整个过程中将微量培养板角孔保持在培养箱中从而在没有摇动下进行温育。已经描述了自动化PMCA的更详细的技术方案，包括故障排除部分(Castilla等人，2004；Saa等人，2004)。

PrP^Sc检测

在45℃搅拌下用蛋白酶K(50μg/ml)消化60分钟后，通过蛋白质印迹检测PrP的蛋白酶抗性形式。通过加入电泳样品缓冲液终止消化。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质分级分离，电印迹到硝酸纤维素膜中，用在PBS，0.05％Tween-20中稀释1∶5000的3F4抗体(Signet，Dedham，MA)检测。通过增强的化学发光测定方法(Amersham，Piscataway，NJ)显示免疫反应性带。使用UVPBioimaging system EC3装置(Upland，CA)通过光密度测定方法分析蛋白质印迹信号。

结果

感染性疾病的常规诊断的最佳来源是生物液体，如尿和血液。令人注目的证据表明在血液中存在传染物，尽管以非常小的迄今在生物化学上检测不到的量存在。为了评估saPMCA在检测血液中朊病毒中的应用，从具有瘙痒病的临床病征的18只仓鼠和12只正常健康对照中采集样品。如方法中所述的提取血沉棕黄层并加入10％正常的仓鼠脑匀浆中。在144个PMCA循环后，18个瘙痒病样品中的一个样品显示出对应于扩增的PrP^Sc的信号。在第二轮144个循环的PMCA后，在9个样品中观察到PrP^Sc，但是在对照样品中都没有观察到PrP^Sc。在总共6轮的PMCA后，18个样品的16个得到清晰的阳性信号，而12个对照样品都没有显示可检测的信号。这些结果表明PMCA能够以89％的灵敏性和100％特异性(没有假阳性)检测血液中的朊病毒。迄今为止，能够检测血液中朊病毒的唯一测定方法是动物生物测定方法，其需要几乎2年才能得到结论性结果。用于血液中朊病毒检测的生物测定方法的灵敏性为约31％，其对应于不同研究人员报导的不同实验的平均值(Brown等人，2001)。因此，saPMCA比甚至最灵敏的生物测定方法具有戏剧性地更高的灵敏性。此外，因为没有其他方法可以检测血液中的朊病毒，所以还不清楚是否所有患病动物都预期在它们的血液中含有朊病毒。

                      实施例12

            症状前动物血液中的朊病毒检测

为了评估PMCA应用于检测症状前阶段血液中朊病毒的存在。将几组仓鼠用载体(磷酸缓冲盐水或者PBS)或者用263K瘙痒病毒株的10％脑匀浆进行腹膜内(i.p.)注射。在温育期间的不同时间，将这几组动物处死，收集血液并如以前所述的分离血沉棕黄层级分(Castilla et at，2005b)。将样品重悬浮在健康仓鼠脑匀浆中并进行144个PMCA循环。为了更新底物，在一轮PMCA循环之后，将样品稀释10倍到正常脑匀浆中并进行另一轮144个PMCA循环。将该步骤重复7次，因为根据我们的结果，7轮144个PMCA循环使得可以检测10-30个分子的单体仓鼠PrP(未公布的观察)，其根据最近的数据(Silverira等人，2005)对应于一个单位的感染性寡聚体PrP^Sc。

在腹膜接种后2周处死第一组仓鼠。5只感染的或对照动物没有一只显示出在它们的血液中PrP^Sc的可检测到的量(图2，表4)。该结果表明在接种后前几天内，在接种物中存在的PrP^Sc消失到检测不到的水平。有趣的是，在接种后20天，在50％的受感染的动物中一周后可以容易地检测到PrP^Sc，但是在对照中都没有检测到PrP^Sc(图2，表4)。在腹膜内接种后40天观察到症状前阶段中阳性动物的最高百分比，其中PrP^Sc检测的灵敏度为60％。令人惊奇地，在接种后60天，血液中PrP^Sc的检测变得更困难。实际上，在70天时5只动物仅仅1只的动物得分为阳性，而在接种后80天，5只动物都没有可检测到的PrP^Sc(表4)。在症状阶段(在该实验中为114.2±5.6天时)，80％的动物在它们的血液中有PrP^Sc，证实了在脑内感染263K朊病毒的仓鼠中的以前的报导(Castilla等人，2005b)。重要的是，在所分析的38只对照动物任一只中都没有检测到假阳性结果(表4)。

在温育期间的不同时间PrP^Sc检测的分布显示了有趣的趋势(图3)。在症状前阶段期间的早期，在接种后20-60天之间观察到PrP^Sc检测的第一个峰。已经报导外周施用朊病毒导致在任何感染性物质到达脑之前，在淋巴样组织和脾脏中的复制早期(Kimberlin和Walker，1979；Glatzel和Aguzzi，2000)。实际上，在温育期的前半期中，在外周接种的动物脑中几乎检测不到或者没有感染性。因此，可能在症状前阶段早期中血液中PrP^Sc的来源是脾脏和其他淋巴器官。令人惊奇地，在该最初阶段后，血液中PrP^Sc的量下降并且在接种后80天实际上消失了(图3)。PrP^Sc的不可检测性的时间窗口与感染性从外周转移到脑的时刻吻合。在症状期，发明人能够检测多数动物血液中的PrP^Sc(图3)。根据公布的研究和发明人使用该模型的经验，在临床病征出现之前的仅仅几周，在脑中出现大量PrP^Sc(Kimberlin和Walker，1986；Soto等人，2005)。从而，在临床阶段，血样中PrP^Sc可能来自脑渗漏。

通过在动物中的感染测定方法确定在该疾病的症状阶段和症状前阶段中，血液都携带朊病毒(Brown等人，2001；Brown，2005；Hunter，2002)。在绵羊的实验BSE感染时，通过输血从无症状感染的动物传播感染性(Hunter，2003)，表明感染物在潜伏期存在于血液中。在人类中，直到最近都没有通过输血传播人TSE的证据。然而，最近，三例vCJD已经与来自随后死于vCJD7的无症状供者的输血有关(Peden等人，2004)。通过输血传播的令人担忧的高比例的病例提示朊病毒以相对升高的量存在于静静地孵育vCJD的个体的血液中。基于使用动物模型的研究，认为所有群体可以对vCJD感染敏感，尽管迄今仅在人朊病毒蛋白质基因的密码子129处甲硫氨酸纯合子中发生了临床病例。因为潜伏期可以是几十年，当前不知道有多少人可能处于vCJD感染的无症状期。此外，可能一些感染的患者从来没有发生临床症状，但是将仍然保持无症状携带者，其可以潜在地传播疾病到其他个体。不存在筛选测试和治疗该疾病的有效疗法，前面存在可怕的全世界公共健康挑战以防止进一步感染、评估感染率和治疗受感染的患者。本发明人的发现代表第一次通过生物化学方法在受感染但是无症状的实验动物的血液中检测到PrP^Sc(感染性朊病毒的主要组分)。PMCA技术已经适于从扩增人来源的朊病毒(Soto等人，2005；未公布的结果)。准确检测vCJD的症状前阶段中的PrP^Sc将是具有巨大应用的主要突破，以减小更多人被该致命和可怕的疾病再次污染的危险。

表4.在血液中PrP^Sc的症状前检测中使用的动物数目和所得的结果

时间，天	对照阳性/总数	感染的阳性/总数	灵敏度/特异性
				14	0/5	0/5	0％/100％
20	0/4	3/6	50％/100％
				40	0/5	6/10	60％/100％
60	0/4	2/5	40％/100％
				70	0/5	11/5	20％/100％
80	0/5	0/5	0％/100％
				症状的	0/10	8/10	80％/100％

                      实施例13

                使用细胞底物扩增朊病毒

使用来自于与PrP^Sc和转变因子来源相同物种的脑匀浆进行常规的PMCA扩增。然而，利用脑带来了实际的和伦理问题，特别对于人样品的情况。为了克服该困难，发明人已经实施了将过表达正常朊病毒的成神经瘤细胞作为转变的底物。发现saPMCA的扩增效率类似于使用脑匀浆或者成神经瘤细胞细胞裂解物。

                     实施例14

             通过saPMCA体外产生的PrP^Sc

          在生物化学和结构上与脑来源的PrP^Sc相同

saPMCA使得可以产生不含有任何脑来源的PrP^Sc的PrP^Sc样品。该材料对于分析体外产生的蛋白质的生物化学和结构性质和将它们与体内产生的PrP^Sc的性质比较是理想的。首先使用蛋白质印迹谱的比较表明体外复制导致与疾病相关的错折叠蛋白质有相同的电泳迁移率和糖基化图式的蛋白质。实际上，使用来自不同物种/毒株的具有不同的蛋白质印迹谱的PrP^Sc接种物进行的实验表明，新产生的PrP^Sc总是遵循用作模板的错折叠蛋白质的图式(Soto等人，2004)。此外，体外产生的高度纯化的PrP^Sc的氨基酸组成分析显示了与使用脑来源的PrP^Sc非常相似的结果，表明蛋白酶K(PK)消化后的切割位点在两种蛋白质中是相同的。这是重要的，因为已经表明来自不同毒株的PrP^Sc由于蛋白质的不同折叠或者聚集而具有不同的PK切割位点(Chen等人，2000；Collinge等人，1996)。在实验中进一步证实了新产生的和脑来源的PrP^Sc的相似的糖基化图式，在所述实验中，用内切糖苷酶处理蛋白质。结果表明酶促除去糖基化链在两种蛋白质中以相似的效率发生并且未糖基化的带具有相同的分子量。

错折叠的PrP的已经将其与正常的蛋白质同种型区分的典型特征是病理蛋白质对蛋白酶降解的高度抗性。为了比较蛋白质抗性谱，将相似量的PMCA-产生的PrP^Sc(在瘙痒病脑匀浆的10^-20稀释度后产生)和脑来源的PrP^Sc用50、100、150、200和250、1000、2500、5000和10000μg/ml PK处理60分钟。两种蛋白质对于这些大PK浓度高度抗性，并且令人惊奇地，抗性的图式几乎相同。该结果是非常重要的，因为蛋白酶抗性是疾病相关的PrP的标志特征之一，并且它的量与感染力密切相关(McKinley等人，1983)。已经报导了一些方法产生蛋白酶抗性形式的PrP，但是在多数情况中，蛋白酶抗性仅在低浓度酶下被检测到并且从而不与在真正的PrP^Sc中看到的蛋白酶抗性程度相当(Jackson等人，1999；Lee和Eisenberg，2003；Lehmann和Hams，1996)。

错折叠的PrP的另一种典型的性质是在非离子去污剂中的高度不溶性。在10％肌氨酰存在下温育和离心后，检测到来自脑和来自PMCA的95％的PrP^Sc，表明两种蛋白质高度不溶并且相似地不溶。当用＞2M盐酸胍处理蛋白质时，失去了PrP^Sc的不溶性，表明两种来源的PrP^Sc对于离液剂变性都同样敏感。

PrP^C和PrP^res和之间的主要差别(其造成其他生物化学差异)是两种蛋白质的二级结构；而PrP^C主要是α-螺旋的，PrP^Sc富含β折叠构象(Cohen和Prusiner，1998；Pan等人，1993)。为了研究二级结构，在10^-20倍稀释后，从患瘙痒病的仓鼠的脑或者从扩增的样品中高度纯化PrP^Sc。使用基于去污剂中的差别沉淀和蛋白酶降解的标准纯化步骤并且通过电泳后银染和通过氨基酸组成分析估计纯度＞90％。使用体外产生的PrP^Sc的傅里叶变换红外光谱学进行的结构研究显示由高水平的β折叠含量组成的光谱，其非常类似于用纯化的脑源PrP^Sc得到的光谱。光谱的解卷积和拟合分析显示两种蛋白质二级结构的几乎相同的谱，其与以前对仓鼠PrP^Sc报导的相一致(Caughey等人，1998；Pan等人，1993)。重要的是，光谱显示α螺旋结构的相对少的含量，如对疾病相关的错折叠朊病毒蛋白质所预期的(May等人，2004)。认为α螺旋结构的缺乏是多数体外PrP再折叠测定方法的缺点，其中PrP^res-样形式几乎完全以聚集的β折叠结构组成(May等人，2004)。通过圆二色性研究还证实了PMCA产生的PrP^Sc存在高水平的β折叠结果以及存在无规则卷曲和α-螺旋。在细菌中产生的重组全长仓鼠PrP^C的FTIR谱显示预期高比例的α-螺旋和无规则卷曲和＜10％的β-折叠结构。

PrP^Sc的β折叠结构的高含量导致在体外和体内形成更高级别团聚体的高倾向性(Ghetti等人，1996；Prusiner等人，1983)。为了研究团聚体的超结构特征，在负染后通过电子显微镜分析来自高度纯化的脑来源的和PMCA产生的PrP^Sc的样品。两种蛋白质形成典型的朊病毒棒状结构，其直径为10到20nm，长为50到100nm，如以前所述(Prusiner等人，1983；Wille等人，2000)。

朊病毒的标志性质是它们能够维持体内自催化复制(Prusiner，1998)。向动物中注射含有PrP^Sc的脑提取物可以进一步指导正常PrP^C的转变，并且错折叠的蛋白质可以以这种方式保持在动物和世代间的复制(Prusiner，1998)。该结果提示新形成的PrP^Sc能够甚至在不存在脑源PrP^res时保持在体外复制。然而，为了分析转变效率是否相同，发明人比较了脑源和PMCA产生的PrP^res诱导的PrP^C转变率。对于这些实验，将含有等同于瘙痒病脑匀浆的100倍稀释度的相似量的PrP^Sc的两种样品的等分试样进一步稀释到正常脑匀浆中并进行20个扩增循环。两种样品都能够转变高水平的PrP^C以产生相似量的PrP^res。当将样品稀释160倍以上(总共16,000倍)时，在这些条件下失去了有效转变。该结果表明使用20个扩增循环，对于脑和PMCA PrP^Sc得到了大约300倍的扩增率。如前面讨论的，扩增率取决于进行的循环数(例如，当样品进行140个循环时，得到＞6500倍的扩增)，但是不管PrP^Sc来自体内样品还是来自体外产生的蛋白质，该扩增率是相似的。

最后，发明人研究体外产生的PrP^Sc的转变活性是否如关于脑PrP^res所报导的一样抵抗变性。将脑来源的和体外产生的PrP^Sc的样品通过在100、110、120和140℃温育1小时进行热变性。之后，通过将这些样品稀释到正常脑匀浆中并进行20个PMCA循环，将这些样品用于引发PrP^Sc形成。新PrP^Sc的产生没有被以前在100或者100℃加热样品而改变，但是通过在120℃温育PrP^Sc，该活性显著降低，并且在140℃加热后活性完全消失。有趣的是，脑源的和PMCA产生的PrP^Sc的热抗性谱非常相似，进一步指出两种形式相互相似这一假设。

                      实施例15

           通过saPMCA体外产生的PrP^Sc是感染性的

长期以来追求的一个目的是通过诱导PrP的错折叠在体外产生朊病毒感染性物质。该实验的成功完成被广泛地认为是朊病毒增殖的有争论的蛋白质唯一假说的最后证据(Soto和Castilla，2004)。通过PMCA在体外连续扩增PrP^Sc提供了实现该目的的完美系统，因为在连续稀释PrP^Sc接种物后在进行多轮扩增之后，发明人能够产生错折叠蛋白质的制备物，其在生物化学和结构上与脑源的PrP^Sc相同，但是缺少最初瘙痒病感染的接种物的任何分子。为了确定体外产生的PrP^res的感染能力，将几组野生型叙利亚仓鼠脑内(i.c.)接种样品，该样品通过6或者16轮通过10倍稀释的分开的连续PMCA产生。因为在第一次PMCA时，瘙痒病脑匀浆的稀释液为10^-4，在这些组中瘙痒病物质的最终稀释液分别为10^-9和10^-19。在接种之前，在所有样品中进行用磷酸缓冲盐水的额外的10倍稀释。尽管进行该高度稀释，但是在扩增后PrP^Sc的量保持恒定。通过定量蛋白质印迹分析的详细估计表明这些样品中PrP^Sc的量类似于263K仓鼠脑的10^-4稀释液中存在的PK抗性蛋白质的量，所述10-4稀释液含有大约10¹⁰个分子的错折叠蛋白质。根据该量，将动物用10^-10稀释液感染(表5中的组6)，99.99999％的物质对应于新产生的PrP^Sc(0.99999×10¹⁰个分子)并且仅仅0.000001％对应于脑源的PrP^Sc(1×10⁴个分子)。在10^-20稀释度(组7)下，100％的PrP^Sc都是新产生的蛋白质(1×10¹⁰个分子)。令人惊奇地，这两组(组6和7)中所有动物都显示出瘙痒病的典型病征并且在接种后约170天死于该疾病(表5)。

                                      表5

组号(扩增的)	瘙痒病脑稀释度	PrPres(a)分子(脑/PMCA)	预测的存活时间b(％患病动物)	观察到的存活时间c(患病的/总动物)
					1(无)	10-10	～104(104/0)	＞600天(0％)	＞400天(0/6)
2(扩增的*)	10-20	0(0/0)	＞600天(0％)	＞400天(0/6)
					3(扩增的*)	10-10	～104(104/0)	＞600天(0％)	＞400天(0/6)
4(无)	10-20	0(0/0)	＞600天(0％)	＞400天(0/6)
					5(无)	10-4	～1010(1010/0)	94+/-2.7天(100％)	106+/-2.9(6/6)
6(扩增的)	10-10	～1010(104/0.99×1010)	N/A	177+/-7.3(6/6)
					7(扩增的)	10-20	～1010(0/1010)	N/A	162+/-3.5(6/6)

^a基于定量蛋白质印迹，使用已知浓度的重组仓鼠PrP作为标准来估计PrP^res的分子数

^b基于以前的数据和公布的观察结果预测存活时间

^c将观察到的存活时间表示为平均值+/-标准误

^*表明扩增在无PrP的脑匀浆中进行。

根据使用263K实验模型的经验和文献报导，瘙痒病脑匀浆的10^-9稀释液是观察到感染性的最后稀释度(并且仅在一些动物中)。因此，发明人假设等于10^-10和10^-20的稀释液将不产生任何可检测到的疾病(表5)。该估计通过在我们的对照组中的结果证实(表5；组1、2、3和4)。进行两个不同的阴性对照组；第一组含有瘙痒病脑匀浆在正常仓鼠脑匀浆中的10^-10和10^-20稀释液，其与用于PMCA的样品以10倍稀释平行地进行，但是保持冷冻而不扩增(组1和2)。第二个对照由瘙痒病脑匀浆连续稀释到PrP敲除小鼠脑匀浆中直到10^-10和10^-20稀释液并以与研究样品相同的方式进行PMCA循环(组3和4)组成。这四组阴性对照样品中，6只动物在感染后长达300天都没有显示出任何疾病病征(表3)。该结果清楚地表明在PMCA扩增的样品中看到的感染性与新近体外产生的PrP^res有关。

为了比较PMCA产生的PrP^Sc的感染能力与脑源感染力，给一组动物接种含有与6和16个连续PMCA轮后产生的PrP^Sc相似量的PrP^Sc。如上面提到的，对使用蛋白质印迹分析的仔细估计表明在连续PMCA测定后PrP^Sc的量等同于瘙痒病脑匀浆的10^-3稀释液(考虑到接种前的10倍稀释，为10^-4)。注射该稀释液的瘙痒病脑的阳性对照组动物(组5)患有该疾病，平均存活时间为106天(表5)。该实验的物质和使用的稀释液精确对应于用于开始PMCA扩增的样品，因此它作为任何稀释和扩增前样品中存在的感染性的双对照和与该量的PrP^res有关的感染性的对照。存活时间短于用相等量的PMCA产生的PrP^res所得到的存活时间，表明体外产生的错折叠的蛋白质感染性明显更低。可以进行感染性滴定研究以精确地发现样品中有多低的感染性，但是基于存活时间，在体外产生的PrP^Sc的感染性比相同量的脑源PrP^res低10到100倍。发明人还进行了感染物的第二次传代并且初步结果表明用最初来自PMCA的物质感染的动物与注射脑感染性物质的动物相似地病倒。这些结果表明体外产生的感染物随时间是稳定的。

通过扩增的样品产生的疾病样品中观察到的临床病征与接种感染性脑物质的动物的临床病征相同，并且包括活动过度、运动损伤、头部摆动、肌肉虚弱和体重减轻。为了评估该疾病的生物化学和神经病理学特征是否也是相同的，发明人进行了脑源PrP^Sc(组5)和PMCA产生的PrP^Sc(组6和7)诱导的疾病感染的动物脑的比较研究。来自这四组中所有动物的脑样品含有大量和相似量的PrP^res，其具有相同的糖基化谱。相反地，在阴性对照动物的脑中没有检测到蛋白酶抗性的蛋白质。为了进一步评估PMCA产生的感染性是否代表新的毒株，发明人比较了PrP^Sc和仓鼠中两种其他标准瘙痒病毒株即263K和昏睡株的PK处理后的电泳迁移率和糖形图式。而PMCA产生的PrP^Sc的蛋白质印迹图式与263K相同(该毒株用于通过PMCA产生新的PrP^Sc)，它与昏睡株有实质不同，已知昏睡株是与263K在生物化学上不同的毒株。

组织学分析表明脑的典型的海绵状变性，并且来自体外产生的PrP^Sc感染的动物的样品显示的空泡形成的图式和程度与来自接种感染性脑物质的仓鼠脑的那些不可区分。当对组织样品染色以研究PrP积累和星形胶质增生时，也看到相同的PrP相似性。从而，基于动物的所有生物化学、组织学和临床分析，发明人断定体外产生的PrP^Sc引发了与脑源PrP^res相似的神经障碍。

实施例13和14中数据表明通过saPMCA在体外产生的PrP^Sc与疾病期间在脑中产生的错折叠的蛋白质相同。尽管这不是TSE诊断的saPMCA的实际应用所需的，但是显示了该测定方法在复制疾病过程中的相关性。与该技术的自动化、灵敏度、再现性和高通量偶联的这些发现可以是用于鉴定用于TSE疗法的化合物的非常有用的测定方法。

本文公开和要求保护的所有组合物和方法可以根据本公开不用过度实验进行和实施。尽管已经按照优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员显而易见的是可以对本文描述的组合物和方法和方法的步骤或步骤的顺序进行变更而不背离本发明的概念、精神和范围。一个实施方案的方面可以应用于其他实施方案或者反之亦然。更具体地，将显而易见的是，化学上和生理学上相关的某些物质可以替代本文描述的物质而将实现相同或者相似的结果。认为本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代和修饰都在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

                        参考文献

下面的参考文献特别引入本文作为参考，直到它们提供与本文给出的互补的示例性步骤或其他补充的程度。

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Claims (49)

1.检测样品中朊病毒的方法，其包括：

(a)将样品与非病原性蛋白质混合以制备反应混合物；

(b)进行初步扩增，其包括：

(i)温育反应混合物；

(ii)破坏反应混合物；

(iii)重复步骤(i)和(ii)一次或多次；

(c)进行连续扩增，其包括：

(i)除去一部分反应混合物并将它与额外的非病原性蛋白质一起温育；

(d)使用测定方法检测反应混合物中的朊病毒。

2.权利要求1的方法，其中所述朊病毒包括哺乳动物PrP。

3.权利要求1的方法，其中所述非病原性蛋白质包含可检测的标记。

4.权利要求1的方法，其还包括在约25到50℃下温育样品。

5.权利要求1的方法，其还包括温育样品约1分钟到约10小时。

6.权利要求1的方法，其中通过超声处理来破坏样品。

7.权利要求6的方法，其中超声波仪对于自动化操作来说是可编程的。

8.权利要求6的方法，其中样品不直接接触超声波仪。

9.权利要求1的方法，其中将样品密封以防止蒸发。

10.权利要求1的方法，其中重复步骤(b)(i)和(b)(ii)1到200次。

11.权利要求1的方法，其中反应混合物还包含金属螯合剂。

12.权利要求11的方法，金属螯合剂是EDTA。

13.权利要求1的方法，其中非病原性蛋白质来自细胞裂解物。

14.权利要求13的方法，其中细胞裂解物来自过表达PrP的细胞。

15.权利要求13的方法，其中细胞裂解物来自表达突变体或者经标记的PrP的细胞。

16.权利要求13的方法，其中细胞裂解物是脑匀浆。

17.权利要求13的方法，其中脑匀浆物是哺乳动物脑匀浆物。

18.权利要求13的方法，其中脑匀浆物的来源是与样品来源相同的物种。

19.权利要求1的方法，其中在约3天的时间内进行步骤(b)。

20.权利要求1的方法，其中所述样品是来自动物的组织样品。

21.权利要求20的方法，其中所述组织样品来自脑。

22.权利要求20的方法，其中所述样品来自外周器官。

23.权利要求22的方法，其中所述外周器官是血液、扁桃体、脾脏或者其他淋巴器官。

24.权利要求1的方法，其中检测朊病毒的测定方法是蛋白质印迹、动物生物测定方法、ELISA或者CDI、细胞感染性测定方法或者光谱测定方法。

25.权利要求24的方法，其中ELISA测定方法是两位点免疫测定夹心ELISA。

26.检测样品中朊病毒的方法，其包括：

(a)将样品与非病原性蛋白质混合以制备反应混合物；

(b)进行初步扩增，其包括：

(i)温育反应混合物；

(ii)破坏反应混合物；

(iii)重复步骤(i)和(ii)一次或多次；

(c)进行连续扩增，其包括：

(i)除去一部分反应混合物并将它与额外的非病原性蛋白质温育；

(ii)重复步骤(b)；

(d)使用测定方法检测反应混合物中的朊病毒。

27.权利要求26的方法，其还包括重复步骤(c)一次或多次。

28.权利要求27的方法，其中可以在含有2×10⁵个或者更少朊病毒分子的样品中检测到朊病毒。

29.权利要求27的方法，其还包括失活残留的朊病毒。

30.诊断动物中疾病的方法，其包括通过权利要求1的方法检测来自动物的样品中朊病毒的存在。

31.权利要求30的方法，其中所述动物是死亡的。

32.权利要求30的方法，其中所述动物是活的。

33.权利要求30的方法，其中所述动物是奶牛。

34.权利要求33的方法，其中所述疾病是牛海绵状脑病。

35.权利要求30的方法，其中所述动物是人。

36.权利要求35的方法，其中所述疾病是克雅病(CJD)、库鲁病、致命性家族性失眠症(FFI)、格斯特曼综合症(GSS)或者偶发性致命性失眠症(sFI)。

37.权利要求36的方法，其中所述CJD是iCJD、vCJD、fCJD或sCJD。

38.权利要求36的方法，其中所述CJD由被来自另一物种的朊病毒感染引起。

39.权利要求38的方法，其中所述CJD由牛朊病毒感染引起。

40.权利要求30的方法，其中所述动物是绵羊或者山羊。

41.权利要求40的方法，其中所述疾病是瘙痒病。

42.权利要求30的方法，其中所述动物是鹿或者麋鹿。

43.权利要求42的方法，其中所述疾病是CWD。

44.用于检测样品中朊病毒的试剂盒，其包含：

(a)非病原性蛋白质和下面中的至少一种：

(i)具有金属螯合剂的转变缓冲液，或

(ii)朊病毒转变因子。

45.权利要求44的试剂盒，其中将所述非病原性蛋白质冻干。

46.权利要求44的试剂盒，其还包含下面的一种或多种：

(a)转变缓冲液，

(b)消毒溶液，

(c)阳性对照，

(d)阴性对照，或者

(e)用于检测朊病毒的试剂。

47.权利要求44的试剂盒，其中非病原性蛋白质包含可检测的标记。

48.权利要求44的试剂盒，其还包含用于标记非病原性蛋白质的试剂。

49.权利要求46的试剂盒，其中用于检测朊病毒的试剂还包含抗体。

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