CN103460049B - 扩增和检测朊病毒的方法 - Google Patents

Abstract

公开了用于检测朊病毒和/或朊病毒蛋白的朊病毒疾病相关形式的方法。这些方法提供了生物样品和环境样品中朊病毒的灵敏且特异性的鉴定。这些方法包括使用免疫沉淀和在没有超声处理的情况下使用摇动的扩增测定，例如QuIC（SQ）或RT‑QuIC（RTQ）。在具体非限制性实例中，所述方法包括使用单克隆抗体15B3和/或RT‑QuIC（RTQ），和/或底物替换步骤。

Description

扩增和检测朊病毒的方法

优先权要求

本申请要求享有2011年1月18日提交的美国专利申请No.61/433,881的权益，所述美国专利申请以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开涉及用于检测样品中传染性蛋白或朊病毒（包括诊断朊病毒相关疾病）的方法及组合物。

联合研究协议缔约方

普利奥尼克斯股份公司（Prionics AG）和由美国国立过敏和传染病研究所（美国国立卫生研究院的一个研究所）代表的美国政府、美国卫生与人类服务部是与本文公开的技术有关的联合研究协议的缔约方。

背景技术

传染性海绵状脑病（TSE）或朊病毒疾病是致死性神经退行性疾病，包括人克罗伊茨费尔特-雅各布病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）、牛海绵状脑病（BSE）、绵羊瘙痒病、鹿慢性消耗性疾病（cervid chronic wasting disease，CWD）和传染性水貂脑病（TME）。TSE的传染原或朊病毒似乎主要由异常的、错折叠的、低聚的并且通常是部分蛋白酶抗性的形式的朊病毒蛋白（例如，PrP-res、PrP^vCJD、PrP^Sc）组成。PrP-res由正常的细胞朊病毒蛋白（PrP^C）在翻译后形成（Borchelt et al.,J Cell Biol,110,743-752,1990；Caughey andRaymond,J Biol Chem,266,18217-18223,1991）。PrP-res，其纯化的形式可类似于淀粉状蛋白纤维，可在多种体外反应中诱导PrP^C聚合和构象改变为传染性PrP-res/PrP^Sc（Castilla et al.,Cell,121,195-206,2005;Deleault et al.,Proc Natl Acad Sci U SA,104,9741-9746,2007）或为PrP^Sc样部分蛋白酶抗性的形式（Caughey et al.,Annu RevBiochem,78,177-204,2009；Deleault et al.,2007,supra；Kocisko et al.,Nature,370,471-474,1994;Saborio et al.,Nature,411,810-813,2001）。这些研究证明了，PrP-res可自我增殖，并且，虽然机制没有被完全了解，但其似乎是有种子的或有模板的聚合（Gadjusek,Infectious amyloids:Subacute Spongiform Encephalopathies asTransmissible Cerebral Amyloidoses.In Fields,B.N.,Knipe,D.M.,and Howley,P.M.(Eds.),Field's Virology,Lippincott-Raven,Philadelphia,pp.2851-2900,1996；Horiuchi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,97,5836-5841,2000；Jarrett andLansbury,Jr.,Cell,73,1055-1058,1993）。

快速且灵敏地检测朊病毒的能力将是处理TSE中的重点。个体中的早期朊病毒检测对于防止扩散以及开始可能的治疗是关键的。朊病毒可在受感染的哺乳动物宿主的多种组织和可获得的体液中找到，包括血液（Brown et al.,Transfusion,38,810-816,1998；Manuelidis et al.,Science,200,1069-1071,1978；Mathiason et al.,Science,314,133-136,2006；Saa et al.,2006a;Terry et al.,J Virol,83,12552-12558,2009；Thorneand Terry,J Gen Virol,89,3177-3184,2008）、母乳（Konold et al.,BMC Vet Res,4,14,2008；Lacroux et al.,PLoS Pathog,4,e1000238,2008）、唾液（Mathiason et al.,Science,314,133-136,2006；Vascellari et al.,J Virol,81,4872-4876,2007）、尿（Gregori et al.,Emerg Infect Dis,14,1406-1412,2008；Murayama et al.,PLoS ONE,5,2007）、粪便（Safar et al.,J Infect Dis,198,81-89,2008）和鼻液（Bessen et al.,PLoS Pathogens,6,e1000837,2010）。在大多数情况中，快速测量这些流体中朊病毒传染性的能力受限于低量的传染原。知道这些流体或组织及其产品中的朊病毒滴度对于朊病毒诊断以及评估公众卫生暴露于这些物质的风险是重要的。此外，能够用于检测环境样品、食品或动物饲料中的朊病毒。因此，仍需要对朊病毒的快速、灵敏且特异性的测定。

发明内容

公开了检测朊病毒蛋白的方法。这些方法提供了对生物和环境样品中朊病毒的灵敏且特异性的鉴定。这些方法包括使用免疫沉淀法以及在没有超声处理的情况下使用摇动的扩增测定，例QuIC或RT-QuIC。

在一些实施方案中，提供了检测朊病毒蛋白的方法，其包括使样品与有效量的特异性结合PrP-res的抗体接触充足的时间以形成免疫复合物，将所述免疫复合物与纯化的重组朊病毒蛋白（rPrP^C）混合以获得反应混合物。所述免疫复合物可从所述样品中分离。进行扩增反应，其包括孵育所述反应混合物以使得PrP-res与rPrP^C在所述反应混合物中共聚集并保持可促进rPrP^C与PrP-res共聚集的孵育条件以产生rPrP^C到rPrP-res^(Sc)的转化，同时抑制（例如防止）自发形成rPrP-res^(spon)的发生。搅动所述反应混合物，其中搅动包括摇动所述反应混合物，而不进行超声处理。检测所述反应混合物中的rPrP-res^(Sc)，其中在所述反应混合物中检测到rPrP-res^(Sc)表明所述样品中存在PrP-res。

在一些实施方案中，可以定量所述反应混合物中rPrP-res^(Sc)的量。在另外的实施方案中，检测所述反应混合物中的rPrP-res^(Sc)包括使用硫磺素T（ThT）。

在另外的实施方案中，可通过添加另外的rPrP^C底物来补充rPrP^C，然后在所述反应混合物中检测。

在另外的实施方案中，所述免疫复合物可例如与包含洗涤剂例如十二烷基硫酸钠的缓冲液预孵育，然后进行扩增反应。特异性结合PrP-res的抗体可结合到固体基质，包括但不限于，磁珠。在另外的实施方案中，所述抗体为15B3。

在另外的实施方案中，所述rPrP^C可以为嵌合的rPrP^C，例如嵌合的仓鼠-绵羊rPrP^C。在具体的非限制性实例中，所述测定可检测vCJD和其他形式的STE。

在一个具体的非限制性实例中，提供了检测生物样品中朊病毒蛋白的方法，其中所述方法包括使所述生物样品，例如血浆、血液、血清、脑脊液或组织样品与有效量的偶联到固体基质的抗体15B3接触充足的时间以在所述固体基质上形成免疫复合物。将所述基质上的免疫复合物与所述生物样品的其他组分分离。将所述固体基质上的免疫复合物与包含约0.01%至约0.05%十二烷基硫酸钠的缓冲液孵育。将所述固体基质上的免疫复合物与纯化的重组朊病毒蛋白（rPrP^C），例如仓鼠绵羊嵌合重组朊病毒蛋白（rPrP^C），以及硫磺素T混合，以制成反应混合物，并进行扩增反应。所述扩增反应包括：(a)孵育所述反应混合物以使得PrP-res与所述反应混合物中存在的rPrP^C共聚集；(b)保持可促进rPrP^C与PrP-res共聚集的孵育条件以产生rPrP^C到rPrP-res^(Sc)的转化，同时抑制rPrP-res^(spon)的形成；(c)搅动步骤（i）中形成的聚集物，其中摇动所述反应混合物，然后不摇动，持续基本相同的时间，例如摇动持续约60秒然后不摇动持续约60秒，或者摇动持续约30秒然后不摇动持续约30秒；(d)向所述反应混合物加入另外的重组朊病毒蛋白（rPrP^C），例如仓鼠绵羊嵌合朊病毒蛋白，然后形成可检测的rPrP-res^(Sc)。可任选地重复所述步骤，例如步骤(c)和(d)。在一些实施方案中，使用ThT荧光检测所述反应混合物中的rPrP-res^(Sc)，其中所述反应混合物的荧光表明所述样品中存在PrP-res。在另外的实例中，所述rPrP^C可通过添加另外的rPrP^C底物来补充，然后检测所述反应混合物中的rPrP-res^(Sc)。在另外的实例中，

从下面参照附图进行的对若干实施方案的具体描述，本发明的上述以及其他特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1a-1b.掺入人血浆中的≥10fg人vCJD PrP-res的IP-S-QuIC检测。将人非朊病毒（肿瘤，T）对照或vCJD脑匀浆物的稀释物掺入到500μl人血浆中以得到4×10^-7（T）；4×10^-7、4×10^-9和4×10^-10（vCJD；分别含约10pg、100fg和10fg PrP-res）的最终稀释物。将PrP^vCJD进行免疫沉淀并如材料和方法中所述进行S-QuIC。第一轮S-QuIC在50℃下进行8小时（h）（图1a）并将所述第1轮反应物体积的1/10用作第2轮的种子（45℃下进行10h）（图1b）。不含血浆的阳性和阴性对照反应直接用2μl的仓鼠未感染的（N）或绵羊瘙痒病的（Sc）脑的5×10^-7稀释物作为种子，绵羊瘙痒病的脑含有约100fg PrP^res种子。在所有的反应中仓鼠rPrP^C23-231被用作底物并与25kDa标记物共迁移。PK-消化的产物按先前报道通过使用多克隆R20抗体的免疫印迹进行分析（24）。空心圆标出17-kDa片段，方括号表示较低分子量条带（10-13kDa）。

图2a-2b.通过IP-S-QuIC对感染绵羊瘙痒病的仓鼠血浆中内源性PrP^Sc进行IP-S-QuIC检测。（图2a）如实施例部分所述用来自绵羊瘙痒病263K和未感染（N）仓鼠的血浆样品（500μl）进行IP-S-QuIC，第1轮S-QuIC在50℃下进行10小时（h），第2轮（图2b）在50℃下进行8小时，星号标记的泳道除外，星号标记的泳道示出以样品#6作为种子的第1轮产物用于比较。不含血浆的阳性和阴性对照反应，rPrP^C23-231底物和对PK消化的产物的分析如对图1所进行的描述。空心圆标记17-kDa片段，方括号表示较低分子量条带（10-13kDa）。

图3a-3b.感染绵羊瘙痒病仓鼠的血浆和血清中内源性PrP^Sc的IP-RT-QuIC检测。（图3a）来自绵羊瘙痒病263K和正常仓鼠的血浆样品和来自绵羊瘙痒病263K仓鼠的血清样品的IP-RT-QuIC分析。（图3b）来自9只绵羊瘙痒病263K和1只未感染仓鼠的血浆样品的分析。在所有的情况中，将500μl样品在37℃下用15B3包被的微珠免疫沉淀约20h。将所述微珠的五分之一在室温下与PBS中的0.05%SDS预孵育约20分钟并用于作为含300mM NaCl的RT-QuIC的种子。RT-QuIC反应在42℃下孵育，在所有反应中仓鼠rPrP^C90-231被用作底物。纵轴表示来自4个重复反应孔的平均荧光。在（图3a）中误差棒显示选择的重复组的标准差。在（图3b）中，记录阳性荧光的所有单独反应达到几乎相同的最大荧光值（约260k单位），而在许多绵羊瘙痒病作为种子的情况中，仅有重复反应的一个亚组在63h内上升超过背景荧光。因为重复中这种全有反应或全无反应，所以标准差不能从所有的重复中计算；而是，在右侧，在反应结束处标明了每个总重复中阳性孔的比例。代表对于在>40-h时间点下的阳性重复（仅）计算的标准差的误差棒，如果有的话，仅仅超出符号的大小，因此未示出。

图4a-4b.掺入人血浆中的人PrP^vCJD的eQuIC检测。将人非朊病毒（肿瘤和阿尔茨海默病）对照或vCJD脑组织的稀释物掺入到500μl的人血浆中以得到4×10^-7（肿瘤和阿尔茨海默病）；和4×10^-12、4×10^-13和4×10^-14（vCJD；分别含有约100ag、10ag和1ag PrP-res）的最终稀释物。将PrP^vCJD使用15B3包被的微珠（图4a）或模拟抗IgM的抗体包被的微珠（图4b）进行免疫沉淀并将所述微珠的一部分用于作为重复eQuIC反应的种子。24h之后，替换底物。在所有反应中嵌合Ha-S rPrP^C被用作底物。纵轴表示来自4个重复孔的平均荧光，右侧的比例表示与相邻迹线相关的阳性/总重复反应。

图5a-5b.感染绵羊瘙痒病仓鼠的血浆中内源性PrP^Sc的eQuIC检测。（图5a）来自8只未感染仓鼠和6只感染绵羊瘙痒病仓鼠（一个在30dpi（临床前）收集，5个在80dpi（临终）收集）的血浆样品（不进行预清除）的eQuIC分析。纵轴表示来自4个重复孔的平均荧光，右侧的比例表示与相邻迹线相关的阳性/总重复反应。虽然用所述绵羊瘙痒病样品作为种子的所有重复反应均为阳性，但是在60小时时对于所述样品中的3个观察到次最大平均荧光。在后者的情况中，孔中的微珠分布部分地干扰荧光读数；当用移液管手动搅拌之后在64小时时重新读这些孔（n=3），荧光达到了最大水平（灰色迹线）。相比之下，搅拌未感染对照孔（n=4）没有增加其荧光。仓鼠rPrP^C90-231被用作底物。（图5b）来自3只未感染仓鼠和7只感染绵羊瘙痒病仓鼠（3只在80dpi收集；2只在30dpi收集；1只在10dpi收集）的预清除血浆样品的eQuIC分析。

图6.底物替换效应的可能机制的示意图。

图7a-7b.在掺入的人血浆中使用15B3的PrP^Sc检测的较好IP-S-QuIC灵敏度和一致性（与模拟微珠对比）。（图7a）使用来自100μl血浆的2-h IP和2轮S-QuIC比较15B3和模拟微珠。将未感染的“正常”(N）或感染绵羊瘙痒病263K（Sc）的仓鼠脑匀浆物掺入100μl人血浆中以得到10^-8（N）；和10^-8、10^-9和10^-10（Sc；分别为约100、10和1fg PrP-res）的最终脑稀释物。将PrP^Sc在37℃下使用40μl(1.6×10⁷个总微珠）的15B3包被的微珠（15B3）或模拟抗IgM的抗体包被的微珠（C）免疫沉淀2h。将微珠重悬在10μl PBS中。将所述微珠的五分之一用于作为第1轮S-QuIC的种子（50℃下10h），将所述第1轮反应物体积的1/10用于作为第2轮的种子（50℃下10h）。（图7b）来自500μl血浆的20-h IP和单轮S-QuIC的15B3微珠。将N或Sc脑匀浆物的稀释物掺入500μl人血浆中以得到2×10^-8（N）；和2×10^-8–2×10^-11（Sc；分别含有约1pg-1fg PrP-res）的最终脑组织稀释物。将PrP^Sc在37℃下使用15B3微珠免疫沉淀约20h。剩余步骤同图7a中一样，不同之处是仅进行单轮S-QuIC（50℃下10h）。不含血浆的阳性和阴性对照反应用2μl仓鼠N或Sc脑的5×10^-7稀释物直接作为种子，Sc脑的稀释物含有约100fgPrP-res种子。在所有S-QuIC反应中，仓鼠rPrP^C23-231被用作底物。按以前的报道（Orru etal.,2009.Protein Eng Des Sel 22:515-521,2009）使用多克隆R20抗体通过免疫印迹对PK消化的产物进行分析。空心圆标记17-kDa片段，方括号表示较低的分子量条带（10-13kDa）。

图8a-8b.15B3结合的PrP^Sc的SDS预处理加快了RT-QuIC检测。将仓鼠N或Sc263K脑匀浆物的稀释物掺入500μl人血浆中以得到2×10^-7（在Sc的情况中含有约10pg PrP-res）的最终脑稀释物。与微珠的IP孵育在37℃下持续约20h。将所述微珠的五分之一用于作为RT-QuIC的种子（图8a），将相同数目的微珠在室温下用PBS中的0.05%SDS预处理约20分钟，用于作为含300mM NaCl的RT-QuIC反应的种子（图8b）。将反应物在42℃下孵育，在所有反应中仓鼠rPrP^C90-231被用作底物。纵轴表示来自4个重复孔的平均荧光，右侧的比例表示与相邻迹线相关的阳性/总重复反应。

图9a-9c.使用不同NaCl，以仓鼠-绵羊嵌合rPrP^C（Ha-S rPrP^C）与以人rPrP^C23-231对比，对结合15B3的人PrP^vCJD的RT-QuIC检测的改善。将人非朊病毒（肿瘤）对照或vCJD脑组织的稀释物掺入至500μl的人血浆中以得到4×10^-7（图9a-9b，在vCJD的情况中含有约10pgPrP-res）或4×10^-7和4×10^-9和4×10^-10（图9c，在vCJD的情况中，分别含有约10pg、100fg和10fg PrPr^res）的最终稀释物。除了标出的NaCl浓度和rPrP^C底物变化外，依材料和方法部分所述将样品进行IP-RT-QuIC。纵轴表示来自4个重复孔的平均荧光，右侧的比例表示与相邻迹线相关的阳性/总重复反应。

图10a-10b.eQuIC中15B3微珠与Magnabeads的比较。将人非TSE阿尔茨海默病（AD）对照或vCJD脑组织的稀释物掺入0.5ml人血浆中以得到4×10^-7（AD）；和4×10^-7、4×10^-10、4×10^-13和4×10^-14（vCJD；分别含有约10pg、10fg、10ag和1ag PrP-res）的最终稀释物。使用免疫沉淀缓冲液（Prionics），将PrP^vCJD在37℃下使用总计1.6×10⁷个的15B3包被的微珠（图10a）或相同数目的MAGNABIND^TM微珠（图10b）免疫沉淀约20h。将微珠用洗涤缓冲液（Prionics）洗涤2次并在10μl PBS中重悬。剩余步骤如材料和方法中所述，以PBS中的0.05%SDS的预孵育开始。纵轴表示来自4个重复孔的平均荧光，右侧的比例表示与相邻迹线相关的阳性/总重复反应。使用MAGNABIND^TM PrP^Sc捕获条件获得相似的结果（Miller andSupattapone,2011,J.Virol.85:2813-2817）。

图11.在微珠上使用更高的15B3含量改善IP-RTQ的速度和灵敏度。将正常（NBH）或有绵羊瘙痒病263K的仓鼠脑匀浆物的稀释物掺入500μl的人血浆中以得到出2×10^-9（NBH）；和2×10^-9和2×10^-10（263K；分别含有约100或10fg PrP-res）的最终脑组织稀释物。将PrP-res在37℃下使用40μl的15B3微珠在37℃下免疫沉淀约20小时。将微珠用0.2%肌氨酰/TBS洗涤2次并重悬在10μl PBS中。0.05%SDS预处理之后，将所述微珠的五分之一用于作为RTQ反应的种子。在所有反应中仓鼠rPrP^C90-231被用作底物。纵轴表示来自2个重复孔的平均荧光。

图12用于掺入血浆中的绵羊绵羊瘙痒病脑匀浆物的eQuIC检测的15B3抗体滴定。结果证明了15B3的量增加导致绵羊eQuIC的灵敏度提高，这使得可更快检测0.5ml血浆中含约100fg的PrP-res的绵羊瘙痒病脑组织稀释物。

图13.掺入绵羊血浆中的ARQ绵羊脑匀浆物的eQuIC检测。所述测定提供了对500ul绵羊血浆中≥约100ag PrP-res（脑组织的5×10^-13稀释物）的检测。

图14.绵羊瘙痒病阳性绵羊的血浆中内源性PrP-res的eQuIC检测。所述测定在来自3只临床（slinically）感染的感染绵羊瘙痒病绵羊的血浆中检测到内源性PrP-res。在来自4只未感染绵羊的血浆样品中未检测到朊病毒。

图15.通过e-QuIC检测掺入血浆中的sCJD脑匀浆物的灵敏度。所述测定检测了在0.5mL人血浆中含有低至约10ag的PrP^res的sCJD脑匀浆物掺入物。

图16.通过e-QuIC检测掺入脑脊液（CSF）的sCJD脑匀浆物的灵敏度。所述测定检测了在0.5ml人脑脊液中含有低至约10ag的PrPres的sCJD脑组织稀释物。

图17.通过e-QuIC检测掺入血浆中的小鼠适应的RML绵羊瘙痒病脑匀浆物的灵敏度。所述测定了检测0.5ml血浆中低至10^-13RML绵羊瘙痒病脑组织稀释物（含约100ag_PrP-res）。

图18.绵羊瘙痒病阳性野生型（WT）和GPI-小鼠的血浆中内源性PrPres的eQuIC检测。所述测定检测了来自野生型小鼠和缺乏糖磷脂酰肌醇锚(GPI^-)的仅表达PrP-sen的转基因小鼠的血浆中的内源性PrP-res。在来自未感染野生型正常小鼠的血浆样品中没有检测到朊病毒。

序列表

序列表

使用标准核苷酸碱基字母缩写和氨基酸的三字母代码(如在37 C.F.R.1.822中所定义的)显示所列出的核酸序列和氨基酸序列。对于核酸序列，只显示每个核酸序列的一条链，但应理解互补链通过任何提及所示出的链而被包括在内。

SEQ ID NO：1为重组叙利亚金仓鼠蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGTWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHFGNDWEDRYYRENMNRYPNQVYYRPVDQYNNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCTTQYQKESQAYYDGRRS

SEQ ID NO：2为重组小鼠(Prnp-a)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGTWGQPHGGGWGQPHGGSWGQPHGGSWGQPHGGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLG

SAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCVTQYQKESQAYYDGRRS

SEQ ID NO：3为重组人(129M)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYML

GSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSS

SEQ ID NO：4为重组人(129V)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVL

GSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSS

SEQ ID NO：5为重组牛(6-八肽重复(octarepeat))蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

KKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGGTHGQWNKPSKPKTNMKHVAGAAAAG

AVVGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITVKEHTVTTTTKGENFTETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGAS

SEQ ID NO：6为重组羊(136A154R171Q)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

154R171Q)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白。

KKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGGSHSQWNKPSKPKTNMKHVAGAAAAGAVVGGLGG

YMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGAS

SEQ ID NO：7为重组鹿(96G132M138S)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

KKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGGTHSQWNKPSKPKTNMKHVAGAAAAGAVVGGLGG

YMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYNNQNTFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFIETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGAS

SEQ ID NO：8为全长叙利亚金仓鼠蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

MANLSYWLLALFVAMWTDVGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGTWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMMHFGNDWEDRYYRENM

NRYPNQVYYRPVDQYNNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDIKIMERVVEQMCTTQYQKESQAYYDGRRSSAVLFSSPPVILLISFLIFLMVG

SEQ ID NO：9为全长小鼠(Prnp-a)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGTWGQPHGGGWGQPHGGSWGQPHGGSWGQPHGGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYRYPNQV

YYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDVKMMERVVEQMCVTQYQKESQAYYDGRRSSSTVLFSSPPVILLISFLIFLIVG

SEQ ID NO：10为全长人(129M)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMK

HMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG

SEQ ID NO：11为全长人(129V)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列。

MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMK

HMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFIETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG

SEQ ID NO：12为全长嵌合仓鼠-绵羊(H-s)蛋白酶K-敏感的朊病毒蛋白的氨基酸序列，其中残基23-137为叙利亚仓鼠序列，剩余残基138-231与绵羊残基141-234(R154，Q171多形体)同源。

HMKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGTWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCTTQYQRESQAYYQRGAS.

具体实施方式

本文公开的方法允许在许多生物样品中检测朊病毒污染、进行诊断和／或监测，所述生物样品包括血液、血液级分、血液制品、尿、鼻液、唾液、脑脊液、粪便、肌肉活组织、淋巴组织、皮肤样品、用于移植的组织样品等。这些方法具有医疗和兽医的应用，并且还可用于检测生物技术制品和环境样品（例如水、土壤、植物、垃圾、污水）以及农业样品（例如基于动物的食物、基于动物的饲料&营养补充物、动物废物、副产物、动物尸体、屠宰场废物、规定的危险物质）以确保没有朊病毒污染。本文公开的方法还可用于例如牛、绵羊和鹿中无朊蛋白的牲畜群认证。本文公开的方法还可用于检测自发性克罗伊茨费尔特-雅各布病。

目前，用于检测TSE传染性的最直接和可靠的测定是动物生物测定。传染性的量化可通过终点（Stamp et al.,1959）或有限稀释生物测定（Gregori et al.,2004）来实现。对于朊病毒因子和宿主种类的一些组合，在实验室啮齿类动物中已经建立了传染性滴度和疾病潜伏期之间的强关联，这使得可使用潜伏期来测量传染性水平（Hunter et al.,1963；Prusiner et al.,1982）。这些生物测定的缺点是它们是动物密集型的、费时且昂贵的。对于某些鼠类适应的绵羊瘙痒病毒株，基于标准的绵羊瘙痒病细胞测定（SSCA）的细胞培养物还可用于通过终点和有限稀释法测量传染性水平（Klohn et al.,2003）。SSCA较动物生物测定提供了若干优点，但是其仍然需要数周来完成并且已被限于少许小鼠适应的绵羊瘙痒病毒株。已经报道了类似的针对鹿朊病毒的基于细胞的测定法（称为CPCA）（Bian et al.,JVirol,84,8322-8326,2010）。动物生物测定SSCA和CPCA的局限意味着需要更多实用的用于朊病毒定量的测定法。

已经报道了多种在体外高度灵敏的检测朊病毒的方法（Atarashi et al.,NatMethods,4,645-650,2007；Atarashi et al.,Nat Methods,5,211-212,2008；Bieschke etal.,Proc Natl Acad Sci U S A,97,5468-5473,2000；Chang et al.,J Virol Methods,159,15-222009；Colby et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,104,9741-9746,2007；Fujihara et al.,FEBS J,276,2841-2848,2009；Orru et al.,Protein Eng Des Sel,22,515-521,2009；Rubenstein et al.,J Gen Virol,91,1883-1892,2010;Saa et al.,Science,313,92-94,2006a;Saa et al.,J Biol Chem,281,35245-35252,2006b；Terry etal.,J Virol,83,12552-12558,2009；Trieschmann et al.,BMC Biotechnol,5,26,2005；Wilham et al.,PLoS Pathog,6,e1001217,2010）。荧光相关光谱可用于检测用荧光标记抗体处理的脑脊液（CSF）样品中PrP-res聚集体的飞摩尔（femtomolar）浓度（Bieschke etal.,supra,2000）。荧光标记的重组PrP^C（rPrP^c）与合成的朊病毒蛋白聚集体结合使得可通过FACS分析对其进行超灵敏检测，并且相似的方法使得可鉴别若干感染BSE和未感染的牛的血清（Trieschmann et al.,2005）。在用脑源PrP^C作为底物的多轮超声处理反应中，使用蛋白质错折叠循环扩增（PMCA）反应，可检测到少至1ag的PrP-res（Saa et al.,supra,2006b）。有限的系列PMCA与高灵敏度荧光检测技术（称为环绕光纤免疫测定（SOPHIA））的偶联使得可更快速检测低至10ag的PrP-res和区分朊病毒感染的血液样品和未感染血液样品（Chang et al.,supra,2009;Rubenstein et al.,.J Gen Virol,91,1883-1892,2010）。

PMCA测定的速度和实用性已经通过使用rPrP^c（Atarashi et al.,supra,2007）以及如对震动诱导的转化（QuIC）反应（Atarashi et al.,supra,2008;Orru et al.,supra,2009）所描述的通过用摇动替换超声处理步骤来改善。标准的QuIC（也称为“SQ”)测定可在一天内检测仓鼠脑匀浆物（BH)中亚飞克（sub-femtogram）量的PrP-res（低于一个致死大脑内剂量）。SQ用于朊病毒检测的有效性被其使用2μl的CSF样品（Atarashi et al.,上文,2008；Orru et al.,上文,2009）或鼻灌洗物（Bessen et al.,PLoS Pathogens,6,e1000837,2010）区分出正常仓鼠和感染朊病毒的仓鼠的能力所证明。SQ反应的适应性改变已经导致了对人组织中变体CJD（vCJD）和绵羊组织中绵羊瘙痒症的灵敏检测（Orru etal.,上文,2009）。

SQ和PMCA测定的读出是通过免疫印迹检测抗具体蛋白酶的朊蛋白作为种子的rPrP产物，这难以适应性改变成自动化的高通量形式。一种替代的潜在更高通量的方法被用于淀粉状蛋白播种测定（ASA），其中荧光染料硫磺素T（ThT）被用于检测朊病毒作为种子的rPrP^C聚合（Colby et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,104,20914-20919,2007，以引用的方式纳入本文）。所述ASA还可以检测导致的蛋白酶敏感疾病的朊病毒，并且与朊病毒疾病的神经病理性症状有98%的相关性（Colby et al.,PLoS Pathog,6,e1000736,2010）。然而，ASA的一个潜在混淆的方面是在约两倍的朊病毒作为种子的反应的延滞期内常见的rPrP原纤维的自发形成（没有朊病毒作为种子）（Colby et al.,Proc Natl Acad Sci U SA,104,20914-20919,2007）。自发的原纤维形成的问题在另一朊病毒作为种子的rPrP^c聚合测定——实时（RT）-QuIC（也称为RTQ，参见例如Wilham et al.,PLoS Pathog,6,e1001217,2010，其描述了所述测定，以引用的方式纳入本文）中极大地减少，其结合了SQ测定的若干方面（间歇摇动、rPrP^C制备、样品制备和没有离液盐），其荧光ThT读出与ASA的类似。

直到最近，PMCA、SQ、RTQ和ASA方法的主要限制是缺乏朊病毒定量。Chen和同事报道了一种称为定量PMCA（qPMCA）的方法，其中PrP^Sc含量通过阳性反应所需的PMCA的轮数来估计（Chen et al.,Nat Methods,7,519-520,2010）。最近，与所述RTQ结合描述了一种使用终点稀释滴定的不同方法，作为用体外朊病毒播种测定来确定相对朊病毒定量的方法（Wilham et al.,supra,2010）。此外，测量了感染朊病毒仓鼠的鼻液和CSF中的朊病毒作为种子的活性。因此，与终点稀释分析结合，所述RTQ可快速确定相对朊病毒浓度，灵敏度可比得上动物生物测定的灵敏度，而时间和成本极大地减少。

本文描述的方法大大地提高朊病毒播种/扩增测定例如SQ和RTQ的灵敏度和实用性，部分是通过将它们与新的朊病毒/PrP-res/PrP^Sc免疫沉淀和处理方案整合。所述方法能够捕获和检测多种液体或组织提取物（包括复杂的生物样品例如血浆，其可包含朊病毒的强抑制剂）中极低水平的朊病毒。

术语

除非另有说明，技术术语依其常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Gene V,由Oxford University Press出版,1994（ISBN0-19-854287-9）；Kendrew et al（eds.）,The Encyclopedia of Molecular Biology,由BlackwellScience Ltd.出版,1994（ISBN0-632-02182-9）和Robert A.Meyers（ed.）,MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995（ISBN1-56081-569-8）。

为了有助于阅读本公开的各个实施方案，提供了对具体术语的如下解释：

聚集体：缔合的多于一个的分子，例如朊病毒蛋白质的二聚体、多聚体和聚合体，例如PrP-res或rPrP-res^(Sc)的聚集体、二聚体、多聚体和聚合体。

搅动：向混合物或反应混合物引入任何类型的湍流或运动，例如通过超声处理、搅拌或摇动。在一些实施方案中，搅动包括使用足以使rPrP-res^(Sc)聚集体成碎片的力，其分散rPrP-res^(Sc)聚集体和/或聚合体以便于进一步扩增。在一些实例中，碎片化包括完全碎片化，而在其他实例中，碎片化仅是部分的，例如，聚集体总体可以通过搅动使约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%成碎片。示例性的搅动方法被描述于下文的实施例部分。

抗体：至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其可特异性识别和结合抗原或其片段的表位。抗体可特异性结合PrP-res/PrP^Sc。抗体可以由重链和轻链组成，所述重链和轻链各自具有可变区，即重链可变（V_H）区和轻链可变（V_L）区。所述V_H区和V_L区一同负责结合被所述抗体识别的抗原。

所述术语抗体包括完整的免疫球蛋白和本领域熟知的它们的变体和部分，例如Fab'片段、F(ab)'₂片段、单链Fv蛋白（“scFv”）和二硫键稳定的Fv蛋白（“dsFv”）。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区与免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链已经被突变以引入二硫键来稳定所述链之间的缔合。所述术语还包括基因工程的形式例如嵌合抗体（例如，人源化抗体）、杂缀合抗体（例如双特异性抗体）。还参见，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3^rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重（H）链和轻（L）链。存在两种类型的轻链，lambda（λ）和kappa（κ）。存在确定抗体分子的功能活性的5类主要重链（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

重链和轻链各自含有恒定区和可变区，（所述区也被称为“结构域”）。所述重链和轻链可变区相结合可特异性结合抗原。重链和轻链可变区含有被三个高变区（也称为“互补决定区”或“CDR”）隔开的“框架”区。已经确定了框架区和CDR的范围（参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health andHuman Services,1991，其以引用的方式纳入本文）。目前，Kabat数据库是在线维持的。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组分轻链和重链的结合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDR。

所述CDR主要负责结合抗原的表位。每条链的CDR通常是指从N末端开始依次编号的CDR1、CDR2和CDR3，并且还通常由具体的CDR所在的链来标识。因此，V_HCDR3位于其中发现它的抗体的重链可变结构域，而V_LCDR1为其中发现它的抗体的轻链可变结构域的CDR1。结合目的抗原的抗体具有特异的V_H区序列和V_L区序列，因此具有特异的CDR序列。具有不同特异性（由于不同抗原的不同结合位点）的抗体具有具有不同的CDR。虽然抗体的CDR各有不同，但是CDR内仅有有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。这些CDR内的位置被称为特异性决定残基（SDR）。

提及“V_H”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的那些。提及“V_L”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的那些。

“单克隆抗体”是由B-淋巴细胞的单个克隆产生或者由转染单个抗体的轻链和重链基因的细胞或其子代产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的融合来制备杂交抗体形成细胞来产生。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。

抗体结合亲和力：抗体对抗原，例如PrP-res的亲和力。在一个实施方案中，亲和力通过Frankel et al.,Mol.Immunol.,16:101-106,1979描述的改进的Scatchard法来计算。在另一实施方案中，结合亲和力通过抗原/抗体的离解速率来测量。在另一实施方案中，高结合亲和力通过竞争性放射免疫测定来测量。在若干实例中，高结合亲和力为至少约1×10^-8M。在其他实施方案中，高结合亲和力为至少约1.5×10^-8M、至少约2.0×10^-8M、至少约2.5×10^-8M、至少约3.0×10^-8M、至少约3.5×10^-8M、至少约4.0×10^-8M、至少约4.5×10^-8M或至少约5.0×10^-8M。

抗原：可在动物中刺激抗体产生或T-细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收至动物的组合物。抗原与特异性的体液免疫或细胞免疫的产物（包括由异源免疫原诱导的那些）发生反应。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上的B-和/或T-细胞对其产生应答的位点。在一个实施方案中，当表位与MHC分子缀合而被呈现时，T-细胞对所述表位产生应答。表位可由连续的氨基酸形成，也可由通过蛋白质的三级折叠靠近的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性剂时得以保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性剂处理时会失去。在独特的空间构象中，表位通常包括至少3个，更通常地至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如，X射线衍射晶体分析和2-维核磁共振。抗原可以是组织特异性抗原，或疾病特异性抗原，例如PrP-res。这些术语不是排他的，如组织特异性抗原也可以是疾病特异性抗原。

保守变体：在朊病毒蛋白的情形中，其是指与另一氨基酸序列仅在一个或若干个氨基酸置换为具有相似生化性质的氨基酸的置换（也称为保守置换）中有偏差的肽或氨基酸序列。保守氨基酸置换可能对所得的蛋白的活性有最小的影响。关于保守置换的其他信息可在例如Ben Bassat et al（J.Bacteriol.,169:751-757,1987)、O’Regan et al.（Gene,77:237-251,1989）、Sahin-Toth et al.（Protein Sci.,3:240-247,1994）、Hochuliet al.（Bio/Technology,6:1321-1325,1988）和广泛使用的遗传学和分子生物学的教科书中找到。在一些实例中，朊病毒蛋白变体可具有不多于1、2、3、4、5、10、15、30、45或更多的保守氨基酸改变。

在一个实例中，保守变体朊病毒蛋白是在功能上与相似的基础组分基本上一样的朊病毒蛋白，例如与参考朊病毒蛋白相比具有序列变化的朊病毒蛋白。例如，朊病毒蛋白或该朊病毒蛋白的保守变体，会与PrP-res（或PrP^Sc）聚集，例如会将rPrP^C转化为rPrP-res^(Sc)（或会被转化为rPrP-res^(Sc)）。在该实例中，朊病毒蛋白和保守变体朊病毒蛋白不具有相同的氨基酸序列。保守变体的序列可具有，例如，1个变化、2个变化、3个变化、4个变化，或5或更多个变化，只要所述保守变体仍与相应的朊病毒蛋白互补。

在一些实施方案中，与其衍生自的朊病毒蛋白相比，保守变体朊病毒蛋白包括一个或多个保守氨基酸置换，且仍保留了朊病毒蛋白的生物活性。例如，保守变体朊病毒蛋白可保留其衍生自的亲本朊病毒蛋白分子的生物活性的至少10%，或者至少20%、至少30%或至少40%。在一些优选的实施方案中，保守变体朊病毒蛋白保留了其衍生自的亲本朊病毒蛋白分子的生物活性的至少50%。保守变体朊病毒蛋白中的保守氨基酸置换可发生在朊病毒蛋白的任何结构域中。

接触：“接触”包括在溶液和固相中，例如使样品与特异性结合剂例如特异性结合PrP-res的抗体接触。

足以进行检测的条件：容许所需活性的任何环境，例如容许抗体结合抗原例如PrP-res和待检测的相互作用的任何环境。例如，这种条件包括合适的温度、缓冲溶液和检测装置例如数字成像设备。

检测：是为确定是否存在物质（例如信号或蛋白质，例如PrP-res）。在一些实例中，该检测还可包括定量，例如定量样品（例如血清样品或样品的级分）中PrP-res的量。

诊断：鉴定病理状态的存在或性质，例如，但不限于，鉴定PrP-res的存在情况，例如在克罗伊茨费尔特-雅各布病中。诊断方法在灵敏度和特异性上不同。诊断测定的“灵敏度”为测试为阳性的患病个体的百分数（真阳性百分数）。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中所述假阳性率被定义为没有患有所述疾病而被测试为阳性的那些个体的比例。虽然具体的诊断方法可能不提供状态的确定诊断，但是如果所述方法提供有助于诊断的阳性指示，那么其是满足需要的。“预后”是病理状态发展（例如严重程度）的概率。

解聚：部分或完全破坏聚集体，例如PrP-res或rPrP-res^(Sc)的聚集体。

编码：其中聚合的大分子或序列中的信息被用于指导产生与第一分子或序列不同的第二分子或序列的任何过程。如本文所用，所述术语被广义地解释，并且可具有多种应用。在一些方面中，术语“编码”描述其中双链DNA分子的一条链被用作模板以通过DNA依赖性DNA聚合酶编码新合成的互补姊妹链的半保留DNA复制过程。

在另一方面中，术语“编码”是指其中一个分子中的信息被用于指导产生具有与第一分子不同的化学性质的第二分子的任何过程。例如，DNA分子可编码RNA分子（例如，通过结合DNA依赖性RNA聚合酶的转录过程）。同样，RNA分子可以在翻译过程中编码肽。当用于描述翻译过程时，术语“编码”还延伸至编码氨基酸的三联密码子。在一些方面中，RNA分子可编码DNA分子，例如，通过结合RNA依赖性DNA聚合酶的反转录过程。在另一方面中，DNA分子可编码肽，其中应当理解，在这种情况中使用的“编码”包括转录和翻译两个过程。

荧光团：一种化合物，当其由暴露于的特定刺激，例如确定波长的光激发时，可发光（发荧光），例如，以不同的波长发光（例如波长更长的光）。荧光团是更大的发光类化合物的一部分。发光化合物包括化学发光分子，其发光不需要特定的波长的光，而是使用化学能量来源。因此，使用化学发光分子（例如水母发光蛋白）可以消除对外源电磁辐射例如激光的需要。

可与特异性结合PrP^Sc的抗体相连的具体荧光团的实例提供于Nazarenko et al.的美国专利5,866,366，例如4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'二磺酸、吖啶和衍生物例如吖啶和吖啶异硫氰酸酯、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸（EDANS）、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸酯（Lucifer Yellow VS）、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、氨基苯甲酰胺、亮黄（Brilliant Yellow）、香豆素和衍生物例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素（AMC，Coumarin120）、7-氨基-4-三氟甲基香豆素（Coumaran151）；焰红染料；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；5',5"-二溴连苯三酚-磺酞（溴邻苯三酚红）；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸苯)-4-甲基香豆素；二乙撑三胺戊乙酸；4,4'-二异硫氰酸二氢-均二苯乙烯-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯（DNS，丹酰氯）；4-二甲氨基偶氮苯-4'-异硫氰酸酯（DABITC）；伊红和衍生物例如伊红和伊红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物例如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；乙啡啶；荧光素和衍生物例如5-羧基荧光素（FAM）、5-(4,6-二氯三嗪基-2-基)氨基荧光素（DTAF）、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、荧光素、荧光素异硫氰酸酯（FITC）和QFITC（XRITC）；荧胺；IR144；IR1446；孔雀绿异硫氰酸酯；4-甲基繖形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚磺酞；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘和衍生物例如芘、芘丁酸和琥珀酰亚胺1-芘丁酸；活性红（ReactiveRed）4（Cibacron^TMBrilliant Red3B-A）；罗丹明和衍生物例如6-羧基-X-罗丹明（ROX）、6-羧基罗丹明（R6G）、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明（Rhod）、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物（德克萨斯红）；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；LightCycler Red640；Cy5.5；和Cy56-羧基荧光素；5-羧基荧光素（5-FAM）；硼二吡咯亚甲基二氟（BODIPY）；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）；吖啶、均二苯乙烯、-6-羧基-荧光素（HEX）、TET（四甲基荧光素）、6-羧基-X-罗丹明（ROX）、德克萨斯红、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、Cy3、Cy5、（Applied Biosystems）、LC Red640、LC Red705、Yakima yellow等。

其他合适的荧光团包括本领域技术人员已知的那些，例如可从Molecular Probes（Eugene,OR）获得的那些。在具体的实例中，荧光团被用作供体荧光团或者被用作受体荧光团。在一些实例中，荧光团为可检测标签，例如与抗体相连的可检测标签。

免疫测定：利用抗体与其相应抗原的反应，例如抗体与蛋白例如PrP-res的特异性结合，测量样品例如生物样品例如获自受试者的血清样品中物质的存在情况或浓度的生化测试。抗原的存在情况或存在的抗原的量均可被测量。在一些实例中，测量了PrP-res的量。

免疫沉淀（IP）:使用特异性结合具体蛋白的抗体或肽使该蛋白质抗原从溶液中沉淀出来的技术。这些溶液经常为动物组织的粗裂解液的形式。其他样品类型可以为体液或生物来源的其他样品。通常，在IP中抗体或肽在所述步骤中的某一时刻被偶联至固体基质上。

分离的：“分离的”生物组分例如肽或多肽的集合（例如PrP^Sc）、细胞、核酸或血清样品已基本上从所述组分天然存在的生物的细胞中的其他生物组分（例如，其他的染色体DNA和RNA、染色体外DNA和RNA以及蛋白质）分离、分开而产生或纯化出来。已被“分离的”核酸、肽和蛋白质因此包括通过常规的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。所述术语还包括通过在细胞内重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的肽和核酸。术语“分离的”或“纯化的”不要求绝对纯净，而是意在作为一个相对的术语。因此，举例来说，分离的肽制剂是其中肽或蛋白质比其细胞内天然环境中的所述肽或蛋白质更富集的肽制剂。优选地，对制剂进行纯化，使得所述蛋白质或肽提供所述制剂的总肽或蛋白质含量的至少50％，例如所述肽或蛋白质浓度的至少50%、至少60%、至少70％、至少80%、至少90％、至少95％或甚至至少99%。

核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA的正义链和反义链以及上述这些的合成形式和混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。本文使用的“核酸分子”是与“核酸”和“多核苷酸”同义的。除非另有说明，核酸分子的长度通常为至少10个碱基。所述术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可包括天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸之一或两者，其通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起。

朊病毒：一种主要由蛋白质组成的传染原。朊病毒在多种动物中引起多种疾病，包括牛海绵状脑病（BSE，又称为疯牛病）和人的克罗伊茨费尔特-雅各布病。所有已知的朊病毒疾病会影响脑或其他神经组织的结构，并且其所有都是不能治疗且致命的。“传染性海绵状脑病（TSE）”或朊病毒疾病是致命的神经退行性病症，包括人克罗伊茨费尔特-雅各布病（CJD）、牛海绵状脑病（BSE）、绵羊瘙痒病、鹿慢性消耗性疾病（CWD）和传染性水貂脑病（TME）。

朊病毒被认为可通过异常地重折叠成为能够将正常蛋白质分子转化为结构异常形式（例如，绵羊瘙痒病中的PrP^Sc或变体CJD的PrP^vCJD）的结构而传染和增殖，所述结构异常形式通常部分地抗蛋白酶K消化，因此在本文中广义上被指定为PrP-抵抗的PrP-res。大多数（如果不是全部）已知的朊病毒可聚合成富含紧密排列的β片层的淀粉状蛋白原纤维。这种改变的结构使得它们对化学和物理因素引起的变性有非常规的抗性，使得难以处理和遏制这些颗粒。

在朊病毒疾病中，朊病毒蛋白的通常抗蛋白酶的病理形式——PrP-res，似乎可在感染的宿主中通过诱导其正常的宿主编码的蛋白酶敏感的前体PrP-sen或PrP^C（对蛋白酶K消化敏感）转化为PrP-res而自我增殖。PrP-sen（PrP^C）为连接单体糖磷脂酰肌醇的糖蛋白，其β-片层含量低，且对蛋白酶高度敏感。相反，PrP-res（例如PrP^Sc）聚集体的β-片层含量高且部分地抗蛋白酶。所述转化的机制细节尚不清楚地理解，但其涉及PrP-res和PrP^C之间的直接相互作用，导致在后者被招募至正在生长的PrP-res多聚体时PrP^C构象变化（由Caughey&Baron,Nature443,803-810,2006综述）。因此，所述转化机制已被初步描述为自催化种子（或有核）聚合。在本文公开的测定中，加入包含PrP-res或朊病毒的生物样品可导致反应混合物中重组PrP^C（rPrP^C）转化为rPrP-res^(Sc)，其然后可被检测。所述重组蛋白rPrP-res^(Sc)为朊病毒诱导的rPrP转化产物的总称，而不管所述朊病毒来源的物种和毒株。所述重组蛋白rPrP-res^(Sc)，不是传染性的。

PMCA或蛋白质错折叠循环扩增：一种通过以下步骤扩增样品中PrP-res的方法：将PrP^C与所述样品混合，孵育所述反应混合物以使得PrP-res起始PrP^C到PrP-res聚合体的转化，使孵育步骤中形成的任何聚集体成碎片（通常通过超声处理），重复所述孵育和破碎步骤一个或多个循环。

多肽：其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，不论L-光学异构体还是D-光学异构体都可以使用，优选L-异构体。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”意在包括任何氨基酸序列并包括修饰的序列例如糖蛋白。术语“多肽”特别地意在包括天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的蛋白质。

术语“多肽片段”是指多肽的部分，其展现出至少一个有用表位。术语“多肽的功能性片段”是指多肽的保留所述多肽的活性的所有片段。例如，生物学功能性片段的大小可从与能够结合抗体分子的表位一样小的多肽片段到能够参与细胞内特征诱导或表型改变的编程的大多肽改变。

QuIC或震动诱导转化：一种具体类型的PrP扩增测定，其中用摇动反应容器代替超声处理以破坏聚集的rPrP^C和rPrP-res^(Sc)。

实时（RT）-QuIC：一种测定，其包括间歇摇动以破坏聚集的PrP^C和PrP-res，并包括使用荧光读出，例如荧光染料硫磺素T（ThT）。示例性的方法公开于例如，Wilham et al.,PLOS Pathog.6(12):e1001217,第1-15页。通常，该测定使用PrP^C作为底物，间歇地摇动反应物，基本无洗涤剂（例如≤0.002%的SDS）或无洗涤剂，且使用无离液剂的反应条件，以及使用基于ThT的荧光检测朊病毒作为种子的rPrP^C淀粉状蛋白原纤维。

样品：获自受试者例如人或兽医学受试者的生物样品，其含有例如核酸和/或蛋白质。本文使用的生物样品包括可用于检测受试者中PrP-res/朊病毒的所有临床样品，包括但不限于细胞、组织和体液，例如：血液；血液的衍生物和级分例如血清；提取的胆汁；活检或手术除去的组织，包括例如未固定的、冷冻的、在甲醛溶液中固定和/或在石蜡中包埋的组织；泪；乳；皮肤刮削物；表面洗出液、尿、痰、脑脊液、前列腺液；脓；或者骨髓穿刺物。在具体的实施方案中，所述生物样品以例如血液样品的形式，例如血清样品，获自受试者。样品还包括环境样品，例如土壤或水样品。

序列同一性：两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性表示为所述序列之间共有的序列同一性水平。序列同一性通常表示为同一性百分比；所述百分比越大，则两条序列越相似。用于对齐待比较的序列的方法在下文具体实施方式IV E部分中详细描述。

单轮：进行一种方法，其中未进行系列扩增。例如，rPrP-res^(Sc)可在样品中通过如下进行扩增：将所述样品与纯化的rPrP^C混合以制备反应混合物；进行扩增反应，其包括(i)孵育所述反应混合物以使得rPrP^C与所述反应混合物中可能存在的PrP-res共聚集，维持可促进rPrP^C与PrP-res共聚集的孵育条件，导致rPrP^C转化为rPrP-res^(Sc)，同时抑制rPrP-res^(spon)（在没有朊病毒或PrP-res的情况下自发产生的抗蛋白酶的rPrP产物）的形成；(ii)搅动步骤(i)中形成的聚集体；(iii)任选地重复步骤(i)和(ii)一次或多次。在所述反应混合物中检测rPrP-res^(Sc)，其中在所述反应混合物中检测到rPrP-res^(Sc)表明所述样品中存在PrP-res。可在所述反应中例如延滞期（在加入所述样品和形成可检测的rPrP-res^(Sc)之间）中加入另外的底物（rPrP^C）。然而，所述反应混合物的一部分没有被除去并且与另外的rPrP^C在单独的反应混合物中孵育。

超声处理：使用声波能量破坏或分散生物材料的过程。

特异性结合剂：基本上仅与确定的靶结合的物质。在一些实施方案中，特异性结合剂为特异性结合PrP-res而不结合PrP^C的抗体。

术语“特异性结合”是指抗体或其他配体整个或部分地与抗原的优先缔合。特异性结合可被区分，这通过特异性识别抗原来介导。虽然选择性反应的抗体可结合抗原，但是它们以低亲和力结合抗原。在另一方面，特异性结合可导致所述抗体（或其他配体）和抗原（或携带所述抗原的细胞）之间的缔合比被结合的抗体（或其他配体）和另一蛋白（或没有所述抗原的细胞）之间的缔合更强。特异性结合通常导致结合到表达靶表位的细胞或组织的抗体或其他配体（每单位时间）的量是没有该表位的细胞或组织的大于2倍，例如大于5倍、大于10倍或大于100倍。多种免疫测定方式适合用于选择与具体蛋白特异性免疫反应的抗体或其他配体。例如，固相ELISA免疫测定常规地被用于选择与蛋白特异性免疫反应的单克隆抗体。关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York(1988)。

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。除非上下文另有明确说明，单数术语“一种”、“一个”和“所述”包括复数的指代物。类似地，除非上下文另有明确说明，词“或（或者）”意欲包括“和（并且）”。还应理解，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且为描述的目而给出。虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本公开内容的实施或测试，但是下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”意指“包括”。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用的方式全文纳入本文。在有冲突的情况下，以包括术语解释的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实例仅是示例性的，不是意欲进行限制。

下文描述了用于实施或测试本公开的合适的方法和材料。但是，所提供的材料、方法和实例仅是示例性的，不意欲进行限制。因此，除非另有说明，本公开的方法和技术可依照类似或等同于描述的那些的方法和材料和/或依照本领域熟知常规方法来进行，如本说明书全文中引用和论述的多种综合性或更专业的参考文献所述（参见，例如Sambrook etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to2000)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley&Sons,1999）。

本文公开的方法利用亲和纯化，例如朊病毒蛋白的免疫沉淀，然后通过另外的检测方法例如但不限于震动诱导的转化测定（QuIC）或实时震动诱导的转化测定（RT-QuIC）以检测样品例如生物样品中的朊病毒。本文公开的方法允许在多种生物样品中检测朊病毒污染、进行诊断和/或监测，所述生物样品包括血液、血液级分和血液制品、尿、鼻液、唾液、脑脊液、粪便、肌肉活组织、淋巴组织、皮肤样品、用于移植的组织样品等。这些方法具有医疗和兽医的应用，并且还可用于测试生物技术制品和环境样品（例如水、土壤、植物、垃圾、污水）以及农业样品（例如基于动物的食物、基于动物的饲料&营养补充物、动物废物、副产物、动物尸体、屠宰场废物、规定的危险物质）以确保没有朊病毒污染。本文公开的方法还可用于例如牛、羊和鹿中无朊病毒的牲畜群的认证。亲和纯化（例如免疫沉淀）和QuIC或RT-QuIC的结合可提供检测PrP-res的出乎意料的出色灵敏度和特异性。

I.朊病毒和朊病毒疾病的综述

传染性海绵状脑病（TSE，或朊病毒疾病）是哺乳动物的传染性神经退行性疾病，其包括（但不限于），绵羊的绵羊瘙痒症；牛的牛海绵状脑病（BSE，又称疯牛病）；水貂的传染性水貂脑病（TME）；麋鹿、麋和鹿的慢性消耗性疾病（CWD）；猫的猫海绵状脑病；尼牙薮羚、羚羊和大弯角羚羊的外来有蹄类脑病（EUE）；以及人的克罗伊茨费尔特-雅各布病（CJD）及其变种（医源性克罗伊茨费尔特-雅各布病（iCJD）、变异型克罗伊茨费尔特-雅各布病（vCJD）、家族性克罗伊茨费尔特-雅各布病（fCJD）和散发性克罗伊茨费尔特-雅各布病（sCJD））、综合征（GSS）、致死性家族性失眠症（fFI）、散发性致死性失眠症（SFI）和库鲁病。TSE具有数月至数年的潜伏期，但是临床症状出现后经常是快速发展、不能治愈且总是致死的。降低TSE风险的企图已经导致了农产品、药物、化妆品和生物技术产品的生产和贸易的深刻变化。

在TSE中，朊病毒蛋白的病理、抗蛋白酶形式，称为PrP^Sc或PrP-res，似乎可在感染的宿主中通过诱导其正常的宿主编码的前体PrP-sen（也称为PrP^C）转化为PrP-res而自我增殖。PrP^C为单体的连接糖磷脂酰肌醇的糖蛋白，其β-片层含量低，且对蛋白酶高度敏感。相反，PrP-res聚集体的β-片层含量高且部分地抗蛋白酶。所述转化的机制细节尚不完全清楚，但其涉及PrP-res和PrP^C之间的直接相互作用，其导致在后者被招募至正在生长的PrP-res多聚体时PrP^C构象变化（由Caughey&Baron(2006)Nature443,803-810综述）。因此，所述转化机制已被初步描述为自动催化的种子（或有核）聚合。

为了更好的理解朊病毒增殖的机制，已经进行了许多在无细胞系统中重现PrP-res形成的尝试。初期的实验表明，PrP-res可诱导PrP^C转化为具有毒株-和物种-特异性的PrP-res样产物，尽管产率是亚化学计量的。最近，表明了PrP-res形成和TSE传染性可在粗脑匀浆物——含有多种用于转化的潜在辅因子的介质——中无限扩增（Castilla et al.,(2005)Cell121,195-206）。对该“蛋白质错折叠循环扩增”（PMCA）反应的分析表明，只要加入聚阴离子例如RNA，PrP-res和朊病毒传染性还可以用从脑组织纯化的PrP^C来扩增（Deleault et al.,(2007)Proc Natl Acad Sci USA.104(23):9741-6）。来自大肠杆菌的重组PrP^C（rPRP^C，也称为rPrP-sen）缺乏糖基化，并且GPI锚可被诱导以自发地或在由先形成的rPrP原纤维作为种子时聚合成淀粉状蛋白原纤维。虽然大多数rPrP淀粉状蛋白制剂是没有传染性的，但是一些仅由rPrP^C组成或与脂质和核酸结合的制剂具有至少适度的传染性[Legname et al.(2004)Science305,673-676；Kim et al.,(2010)J Biol Chem285(19):14083-7；Wang et al.,(2010)Science327(5969):1132-5；Makarava et al.,(2010)ActaNeuropath119(2):177-87；Colby et al.,(2010)PLoS Path6(1):e1000736]。

在应对TSE中，一个关键的挑战是通过快速的方法对低水平的TSE传染性（朊病毒）进行检测。TSE感染最常使用的标记物是PrP-res，PMCA反应使得可极灵敏地检测受感染组织中水平低于单个感染单位的PrP-res。然而，如前所述，目前PMCA的限制包括实现最佳灵敏度所需的时间（约3周）和使用脑PrP^C作为扩增底物。

动物中最常见的TSE是绵羊瘙痒症，但是最有名和危险的TSE是BSE，BSE感染牛并且以其非专业术语“疯牛病”而为人所知。在人中，最常见的TSE是CJD，CJD在全球范围内发生，发病率为每年每一百万人0.5-1.5个新病例。三种不同形式的CJD已在传统上被识别：散发性（sCJD；85%的病例）、家族性（fCJD；10%）和医源性（iCJD；5%）。然而，在1996年，CJD的一种新变异形式（vCJD）出现在UK，其与消费被BSE感染的肉有关。与典型的sCJD相比，vCJD感染平均年龄为27岁的年轻患者，并引起相对长的患病时间（14个月，相比之下sCJD为4.5个月）。因为可得到的有关潜伏期及暴露于受污染牛源食品的水平的信息不足，难以预测未来vCJD的发病率。在动物中，几乎没有所述疾病的遗传形式的证据，大多数病例似乎通过水平或垂直传播获得。

sCJD的临床诊断基于快速进行性多病灶痴呆与锥体和锥体束外征兆、肌阵挛、视觉或小脑征兆的结合，并结合特征性周期性脑电图（EEG）。将sCJD与阿尔茨海默病和其他痴呆区分开的一个关键诊断特征为临床症状的快速发展和该疾病的短的持续时间，经常少于2年。fCJD的临床表现非常相似，不同之处是所述疾病发病略早于sCJD。虽然没有家族史不能排除遗传来源，但是遗传的CJD的家族史或对朊病毒蛋白基因中突变的遗传筛查仍被用于建立fCJD诊断。

变异型CJD最初作为进行性神经精神病症出现，该病症的特征为焦虑、抑郁、情感冷漠、退缩和妄想症状，且伴有持续的痛苦感觉症状，然后为共济失调、肌阵挛和痴呆。变异型CJD可通过疾病的持续时间（通常长于6个月）和EEG分析（vCJD不会显示出在sCJD中观察到的非典型图形）而区分于sCJD。MRI中记录的高双侧丘脑枕信号经常被用于帮助诊断vCJD。此外，基于已被证明在淋巴组织（例如扁桃体和阑尾）中PrP^vCJD染色测试为阳性的数个vCJD病例，扁桃体活检可用于帮助诊断vCJD。然而，由于所述测试的侵入性质，其仅在满足vCJD临床标准（其中脑的MRI不会显示出特征性丘脑枕征兆）的患者中实施。

GSS为显性遗传疾病，其特征为痴呆、帕金森病症状和相对长的持续时间（通常为5-8年）。在临床上，除了经常伴有共济失调和癫痫发作以外，GSS类似于阿尔茨海默病。诊断通过临床检查和对朊病毒蛋白突变进行遗传筛查而建立。FFI也是显性遗传的，并且与朊病毒蛋白突变相关。然而，与FFI有关的主要临床发现为失眠症，在后期是肌阵挛、幻觉、共济失调和痴呆。

仍需要能够检测TSE，包括CJD，以及能够检测生物和环境样品中的朊病毒，包括但不限于检测血液制品中的朊病毒污染。因此，需要用于检测朊病毒的快速和灵敏的测定。本公开提供了一种测定系统，其使用免疫沉淀，然后是第二种检测方法例如QuIC和RT-QuIC以提供用于检测朊病毒的灵敏且特异性的方法。在一些实施方案中，在QuIC或RT-QuIC测定中使用了预先补充的rPrPC底物。不囿于理论，该结合测定提供了灵敏度的意料之外的提高和测定时间的令人惊讶的减少。这些测定使得可在短时间例如两天内，从极低滴度（例如，0.001感染单位/ml）和/或载有抑制因子的流体例如血浆中捕获和检测朊病毒。

II.免疫沉淀

本文公开的方法包括使样品例如生物样品与仅特异性结合朊病毒蛋白的疾病相关的构象（例如，PrP^Sc、PrP^vCJD或PrP-res）的抗体接触。在本文公开的方法中，使所述样品例如生物样品与可固化在固体基质上的捕获单克隆抗体（或其表位结合片段）接触。可选择特异性结合在PrP-res（而不是PrP^C）上表达的表位的单克隆抗体。

所述特异性结合PrP-res或PrP^Sc的单克隆抗体可以来自任何物种，例如鼠抗体。所述单克隆抗体可通过已知的单克隆抗体产生技术产生。通常，单克隆抗体如下制备：再生用目的蛋白免疫的动物的脾细胞，用常规方式例如通过与骨髓瘤细胞融合或通过Epstein-Barr病毒转化来永生化所述细胞，筛选表达所需要的抗体的克隆。参见，例如，Kohler andMilstein Eur.J.Immunol.6:511(1976)。单克隆抗体或单克隆抗体的表位结合区，还可以通过重组方法产生。因此，在一些实施方案中，利用了嵌合或人源化形式的单克隆抗体，其中所使用的抗体包括特异性结合PrP-res或PrP^Sc的抗体的互补决定区（CDR）。

例如，当目的蛋白为能够改变构象以形成PrP-res聚集体的朊病毒蛋白时，所述单克隆抗体可以是通过用重组的正常小鼠细胞蛋白（PrP^C）免疫“敲除”鼠产生的鼠单克隆抗体。然后，可将来自所述免疫的小鼠的脾细胞（寿命有限的产生抗体的淋巴细胞）与非生产的骨髓瘤细胞（“永生”的肿瘤淋巴细胞）融合以形成杂交瘤细胞。然后，根据对PrP-res或PrP^Sc有特异性的抗体的产生和在组织培养中增殖的能力对所述杂交瘤细胞进行筛选。然后，可培养这些杂交瘤细胞以提供特异性单克隆抗体的长久和稳定的来源。通过该方法产生的具体单克隆抗体公开于美国专利6,528,269中。这些单克隆抗体包括由细胞系PrP2F8、PrP5B2、PrP6H3、PrP8C6、PrP8H4和PrP9H7产生的2F8、5B2、6H3、8C6、8H4和9H7，其可特异性结合人PrP-res，还结合来自小鼠、牛、绵羊和其他物种的PrP-res，还参见美国公开专利申请No.2005/0118720，其以引用的方式纳入本文。

本文公开的方法还可利用单克隆抗体15B3，该抗体描述于2008年9月1日公开的美国公开专利申请No.2008/0220447，其以引用的方式纳入本文。所述抗体15B3可从PrionicsAG,Zurich,Switzerland获得，产生该抗体的方法公开于PCT公开文本No.WO 98/37210，其以引用的方式纳入本文。该PCT公开文本还描述了结合PrP-res而不结合PrP^C的抗体。PCT公开文本No.WO 98/37210公开了产生抗体15B3的杂交瘤细胞根据布达佩斯条约以登录号DSMACC2298保藏在DSMZ—德国微生物和细胞培养物保藏中心（Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（德国）（德国布伦瑞克Zellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7 B38124）。

IgM单克隆抗体15B3可特异性识别朊病毒蛋白的疾病相关的形式(即，PrP-res或PrP^Sc）并且能够检测脑匀浆物中的异常PrP，而无需PK消化（Korth et al.,Nature 1997;390:74-77,1997，其以引用的方式纳入本文）。此外，已经表明在GerstmannScheinker综合征的转基因小鼠模型中抗体15B3可结合PrP^Sc的蛋白酶敏感形式，这是相当重要的，因为这表明了血液中的传染性对蛋白酶消化敏感（Nazor et al., EMBO J.24(13):2472-80,2005;Yakovleva et al.,Transfusion 44:1700-5,2004）。

所述捕获单克隆抗体（例如15B3、Ig261、IgW226或262）可在所述测定步骤之前通过不溶解所述捕获单克隆抗体而固定在固相上，例如通过吸附至不溶于水的基质或表面（美国专利No.3,720,760，其以引用的方式全文纳入本文）或通过非共价或共价偶联，例如在用例如硝酸和还原剂事先激活支持物或不激活的情况下，使用戊二醛或碳二亚胺交联（如美国专利No.3,645,852或Rotmans et al.,J.Immunol.Methods 57:87-98,1983中所述），或者在所述测定步骤之后，例如通过免疫沉淀而固定在固相上。

用于固定化的固相可以是基本上不溶于水且用于免疫测定的任何惰性支持物或载体，包括形式为例如表面、颗粒、多孔基质、琼脂糖等的支持物。常用的支持物的实例包括小片、葡聚糖凝胶、聚氯乙烯、塑料微珠、磁珠，以及用聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯制造的测定平板或试管等，包括96孔微量滴定板和384孔微量滴定孔板，以及微粒材料，例如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其他多糖。或者，有活性的不溶于水的基质例如溴化氰激活的碳水化合物和描述于美国专利No.3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440的反应性底物适用于捕获单克隆抗体固定化。在一个实例中，固定化的捕获单克隆抗体包覆在微量滴定板上，尤其地，所述固相可以为多孔微量滴定板。例如，所述多孔微量滴定板可以是微测试96-孔ELISA板。所述固相可以为磁珠，例如（Invitrogen）或其他磁珠，例如可从NEW ENGLAND获得的那些或磁珠。

通常，将所述捕获单克隆抗体（例如，但不限于，15B3）连接在固体基质上。根据需要，这种连接可以通过非共价或共价相互作用或物理连接。用于连接的技术包括描述于美国专利No.4,376,110和本文引用的参考文献中的那些。如果使用共价结合，那么可在本领域熟知的条件下用交联剂和捕获剂一起孵育所述平板、微珠或其他固相。

所述固体基质还可具有抗体，例如与所述固体基质共价连接的兔抗小鼠抗体或兔抗人抗体。然后，可将连接到所述固体基质的抗体与第二目的抗体（例如小鼠或人抗体）孵育以实现所述第二抗体与所述固体基质的连接。在一个具体的非限制性实例中，将兔抗小鼠抗体与固体基质偶联，然后将其与特异性结合朊病毒蛋白的第二抗体例如但不限于15B3、IgG W226或IgG261孵育。

用于将捕获单克隆抗体连接到固体基质的常用交联剂包括，例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、与4-叠氮水杨酸形成的酯、同型双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯例如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，以及双官能团马来酰亚胺例如二-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷。衍生剂，例如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺（propioimidate）可产生能够在光的存在下形成交联的光活化中间体。

如果使用微量滴定孔板（例如，96-孔板或384-孔板），那么可将它们在例如室温下用亲和纯化的捕获单克隆抗体（通常在缓冲液中稀释）包被约2-约3小时。也可直接用特异性结合PrP-res或PrP^Sc的抗体包被所述板。在测定本身之前可堆积和包被所述板很久，然后以手动、半自动或自动的方式，例如通过使用机器人同时在若干样品上进行所述测定。

类似地，如果使用例如M-450（大鼠抗小鼠IgM），那么可以使用本领域已知的任何方法用所述抗体来包被所述微珠。在一个非限制性实例中，使用涡旋将悬浮在小瓶中，然后将适量的移至聚丙烯或聚苯乙烯管中。将所述管置于磁体上持续较短的时间，然后从所述磁体上移开。加入包被缓冲液，例如通过使用涡旋混合所述微珠。在一个非限制性实例中，使用了包含磷酸盐缓冲盐水中约0.01%-1%例如约0.1%的牛血清白蛋白的包被缓冲液。用于所述包被缓冲液的另外阻断剂的实例包括但不限于卵白蛋白、酪蛋白和脱脂乳。加入目的抗体（例如，但不限于，15B3、IgG W226或IgG261），并且用所述目的抗体孵育轻柔混合足够的时间以使所述抗体附着到所述微珠。然后，可使用磁体从上清液分离包被的微珠，并加入包被缓冲液。可将偶联到所述抗体的重复洗涤，并保存备用。

在一个实例中，可将抗体（例如但不限于15B3）以约5μg抗体/100μl偶联到所述基质。在另一实例中，可将抗体（例如但不限于15B3）以每1×10^-6 /μg15B3抗体偶联到所述基质。在另一实例中，可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20或30倍的抗体，例如每100μL（例如4×10⁸个微珠/ml）中30-50μg，例如36μg的抗体，例如15B3。在其他实施方案中，对于1×10⁸个微珠可使用1ng-10μg的抗体。在另一实例中，可以使用1×10^-8 （例如，4×10⁸个微珠/ml)100-300μg的抗体，例如15B3。在一些非限制性实例中，磁珠上抗体的浓度为约10-500μg15B3/1×10⁸个微珠。

包被的板或微珠任选地可用非特异性地结合于结合位点并使所述结合位点饱和的阻断剂处理以防止游离配体与所述板孔上的过量位点的不需要的结合。用于该目的的合适阻断剂的实例包括明胶、牛血清蛋白、卵白蛋白、酪蛋白和脱脂奶。

在进行包被和阻断后，将待分析的样品加入到固定化的抗体。所述样品可以是生物样品或环境样品。可将所述样品匀质化（例如对于组织样品，例如脑样品），并用例如裂解缓冲液（例如，含有1%Nonidet P-40、0.5%去氧胆酸钠、5mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH8.0）适当稀释。可使用其他洗涤剂，例如阴离子型、阳离子型或非离子型洗涤剂，包括但不限于十二烷基硫酸钠（SDS），以匀质化样品。或者，可以使用机械方式，例如使用吹打或装置例如搅拌器和匀浆器。生物样品可以是血液、血清、血浆或另外的生物流体样品，例如但不限于脑脊液或鼻液。所述样品可以为组织样品，例如脑样品或淋巴组织样品（例如扁桃体）。可将所述样品被稀释，例如在缓冲液例如含有牛血清白蛋白的缓冲液中。在一个实施方案中，将所述样品在缓冲液例如任选地包含洗涤剂的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释。所述洗涤剂可以是阳离子型、阴离子型或非离子型洗涤剂。在一个实施方案中，所述洗涤剂为肌氨酰（Sarkosyl）。例如，可将所述微珠在TBS中在约0.1%至约1%，例如约0.4%肌氨酰的存在下与所述样品接触。在另一个实施方案中，可将所述微珠在TBS中在约0.1％至约1％肌氨酰的存在下，例如在缓冲液例如TBS或PBS中在0.4%至约1%肌氨酰的存在下与所述样品接触。在一些实例中，使用了在缓冲液，例如TBS或PBS中约0.1%、约0.4%、约1%、约2%、约3%或约4%的肌氨酰。

为了足够的灵敏度，向所述固定化的捕获单克隆抗体加入的样品的量可以是这样的，即使得所述固定化的捕获单克隆抗体相对于生物样品适当稀释之后所述样品中预计的构象改变的蛋白质的最大摩尔浓度是摩尔过量的。

选择孵育所述生物样品和固定化的单克隆抗体的条件以使所述测定的灵敏度最大以及使解离最少。优选地，所述孵育在十分恒定的温度，约0℃-约40℃，例如在约4℃、室温（例如，约25℃）、约35℃至约39℃下，或者在约37℃，或者约35℃至40℃下完成。在一些实施方案中，所述温度约19至约40℃，例如在室温下。孵育时间可以为例如，2小时至12小时，例如过夜。在一些实例中，在约0℃至约40℃下，例如在约4℃、室温（例如约25℃）或37℃下，所述孵育时间为2、4、6、8、10、12、20或24小时，例如过夜。在具体的非限制性实例中，所述孵育为室温下约2小时，或4℃下过夜，例如4℃下约12小时，或室温下约10至20小时，例如室温或37℃下20小时。

在所述生物样品与固定化的捕获单克隆抗体（例如15B3）接触之后，洗涤所述生物样品。洗涤介质通常为具有使用孵育步骤常用的因素和缓冲液确定的pH的缓冲液（“洗涤缓冲液”）。可进行所述洗涤例如1次、两次、3次或更多次。所述洗涤可在任意的温度下进行，例如约0℃至约40℃，例如在室温下（例如，25℃）或在37℃下。在另外的实施方案中，所述方法包括使用缓冲液中的SDS，例如0.01%至0.1%SDS，例如约0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%或0.07%SDS，例如0.04%至0.06%SDS，例如约0.05%SDS。洗涤缓冲液的实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水（PBS）和三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS），任选地包括肌氨酰，例如约0.05-0.5%肌氨酰，例如0.1%、0.2%、0.3%或0.4%肌氨酰。一个示例性的洗涤缓冲液为TBS中0.2%肌氨酰。

然后，可对已经与所述样品接触的固体基质，例如磁珠，进行处理以检测结合的朊病毒蛋白，例如使用下文所述的标准QuIC（SQ）反应或实时QuIC（RTQ）反应。在一个实施方案中，在检测结合的朊病毒蛋白之前，不释放（洗脱）结合到抗体的朊病毒蛋白（例如PrP^Sc），而是将包含含所述抗体的固体基质和朊病毒蛋白两者的反应混合物直接用于测定（例如但不限于SQ或RTQ）中以检测PrP-res或PrP^Sc。因此，没有将包含特异性结合PrP-res的抗体的免疫复合物从所述反应混合物中分离，而是将其直接用于SQ或RTQ测定。

III.QuIC（SQ）和RT-QuIC（RTQ）

称为蛋白质错折叠循环扩增（PMCA）的朊病毒检测方法基于朊病毒在含PrP^C的组织匀浆物中体外复制的能力（参见，例如PCT公开文本No.WO0204954）。PMCA涉及：通过与源自脑组织的合适朊病毒蛋白底物孵育来扩增PrP-res，系列地扩增PrP^C（例如通过交替的孵育和超声处理步骤）以及检测所得的PrP-res。在一些实例中，在约3周的时间内交替孵育和超声处理，并间歇地将所述反应混合物的一部分移出并与另外的PrP^C孵育以系列地扩增所述样品中的PrP-res。在所述重复的孵育/超声处理/稀释步骤之后，检测所述反应混合物中得到的PrP-res。虽然基于脑提取物的PMCA是用于检测PrP-res的非常灵敏的测定，但是其有数个限制，特别是实现最佳灵敏度所需的时间（2-3周）和使用脑源的PrP^C作为扩增底物。该方法还使用超声处理。

相反，在QuIC方法（SQ和RTQ）中，搅动通过摇动而不是超声处理进行。这些测定使用可以以高纯度大量快速获得的重组表达的rPrP^C作为底物（Atarashi et al.,(2008)NatMethods,5,211-212，其以引用的方式纳入本文），而来自脑组织的天然存在的PrP^C的纯化是困难的，并且有更低的产率（Deleault et al.(2005)J.Biol.Chem.280,26873-26879；Pan et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,10962-10966；Hornemann et al.,(2004)EMBO Rep.5,1159-1164）。此外，与脑匀浆物中或从脑纯化的PrP^C不同，rPrP^C可容易被突变或在策略上用探针标记以简化和加快相关产物的检测。

存在两种类型的利用rPrP^C的PrP-res扩增方法，一种是使用超声处理（rPrP-PMCA）（Atarashi et al.,(2007)Nat Methods,4,645-650），一种是利用摇动（QuIC）（Atarashi et al.,(2008)Nat Methods,5,211-212）。这些方法有利于关于PrP-res结构和转化机制的基础研究。定点突变使得可用多种可报告构象变化以及rPrP-res^(Sc)聚集体内分子间和分子内距离的探针精确标记rPrP^C。此外，RTQ使得可使用硫磺素T（ThT）检测扩增产物。在增强的RTQ中，在许多可检测的（ThT-阳性）的聚合发生之前（例如，在24小时孵育之前），事先补充rPrP^C，同时保留存在的rPrP-res^(Sc)。

QuIC和RT-QuIC方法通常包括将样品（例如，怀疑含有朊病毒或PrP-res的组织样品、CSF样品或血浆样品）与纯化的rPrP^C混合以制备反应混合物，进行初步反应以在所述混合物中形成和扩增特定形式的rPrP-res^(Sc)。所述初步反应包括孵育所述反应混合物以使PrP-res起始rPrP^C到rPrP-res^(Sc)的特定聚集体或聚合物的转化；使所述孵育步骤中形成的任何聚集体或聚合物成碎片；重复所述孵育和碎片化步骤1次或多次，例如约1至2次、1至4次、1至10次或10至约50次。在所述方法的一些实施方案中，通过移出所述反应混合物的一部分并将其与另外的rPrP^C孵育来进行系列扩增。在其他实施方案中，向所述反应加入另外的rPrP^C，例如在所述延滞期中（在形成可检测的rPrP-res^(Sc)之前，例如所述24小时反应之前），并重复所述孵育和碎片化步骤。

在其他的实施方案中，所述方法在没有系列扩增的情况下进行，以使得结合朊病毒的底物保留在反应容器中，并补充所述底物而不除去潜在的PrP-res种子。例如，PrP-res可通过如下步骤在样品中扩增：将所述样品与纯化的rPrP^C混合以制备反应混合物；进行扩增反应，其包括(i)孵育所述反应混合物以使rPrP^C与所述反应混合物中可能存在的PrP-res/PrP^Sc共聚集，并且保持可促进rPrP^C与PrP-res共聚集的孵育条件，导致rPrP^C至rPrP-res^(Sc)的转化，同时抑制rPrP-res^(spon)的形成；(ii)搅动步骤(i)中形成的聚集体；(iii)任选地重复步骤(i)和(ii)1次或多次。检测所述反应混合物中的rPrP-res^(Sc)，其中在所述反应混合物中检测到rPrP-res^(Sc)表明所述样品中存在PrP-res。可在所述反应中例如在加入所述样品和检测rPrP-res^(Sc)形成之间的延滞期中加入另外的底物（rPrP^C）。然而，当使用单轮扩增时，没有将所述反应混合物的一部分移出且将其与另外的rPrP^C孵育。在一些实施方案中，所述rPrP^C可通过向所述反应混合物加入另外的rPrP^C底物来补充。

通常，对于QuIC或RT-QuIC（SQ或RTQ），所述反应包括在没有超声处理的情况下使用摇动（QuIC反应），以及在持续时间内使用约1:1的摇动/静止周期。在一个非限制性实例中，所述反应交替进行60秒的摇动和60秒的不摇动（静止）。在另一非限制性实例中，所述反应交替进行30秒的摇动和30秒的不摇动（静止）。然而，可改变所述时间，例如45秒的摇动和45秒的不摇动或者70秒的摇动和70秒的不摇动。因此，静止的时间和摇动的时间是相等的。在其他实施方案中，总周期的静止时间和摇动时间的长度为120秒。因此，在一些实例中，所述反应包括90秒的摇动和30秒的不摇动，100秒的摇动和20秒的不摇动，或者80秒的摇动和40秒的静止。在另外的实施方案中，所述总循环时间的长度约60、70、80、90、100、110或120秒，包括至少30秒、至少40、或至少50秒的摇动。

还发现反应在37-60℃下，例如45-55℃，例如约50℃，或者在约42℃-46℃下，尤其有效。这些条件对于促进rPrP-res^(Sc)（特别是17kDaPK抗性类型）的形成并同时降低在无种子的反应的开始24小时中rPrP-res^(spon)的形成尤其有效。因此，所述反应可进行3-12小时，例如6-12小时，例如8-10小时。然而，取决于反应温度，14小时、16小时、20小时、24小时，例如至少45小时、48小时或者甚至65或96小时的较长扩增反应也可提供极佳的结果。在一些实施方案中，所述反应进行3-96小时。例如，所述反应可进行不多于12小时、不多于24小时、不多于36小时、不多于48小时、不多于72小时、不多于96小时或不多于120小时。在一些实例中，所述反应进行约5小时-约120小时。

在一些实施方案中，所述反应使用浓度为100mM-500mM的氯化钠（NaCl），例如约100mM、200mM、300mM、400mM NaCl进行。在其他实施方案中，所述反应使用200-400mM NaCl进行。

在其中使用免疫沉淀和实时QuIC的方法（IP-RTQ反应或eQuIC）中，将ThT用于检测rPrP-res^(Sc)。如果固体基质是微珠，例如磁珠，那么所述微珠和任何缔合的朊病毒或朊病毒诱导的RTQ转化产物倾向于紧贴所述反应容器例如孔的底部。因此，可容易地改变反应流体，以其RTQ前状态补充底物，而不从所述孔移出许多微珠或结合的反应产物。所述rPrP^C底物可在延滞期中事先补充，例如在表明由转化为朊病毒接子的淀粉状蛋白产物造成大量消耗的ThT阳性之前。因为补充，IP-RTQ是高度灵敏的，使得RTQ的总灵敏度增加达至少1000倍，并且总反应时间极大的减少。底物的浓度通常为0.1mg/ml。

因此，QuIC反应可以为RT-QuIC反应，并因此可包括使得可检测所述rPrP-res^(Sc)的硫磺素T（ThT）。RT-QuIC测定包括rPrP^C作为底物，例如在96孔板中间歇地摇动反应物，无洗涤剂且无离液剂的反应条件，以及对朊病毒作为种子的rPrP^C淀粉状蛋白原纤维进行基于ThT的荧光检测。使用ThT的一个优点是其可包括在所述反应混合物中。硫磺素T为结合淀粉状蛋白原纤维时显示出增强的荧光的苯并噻唑染料（参见Khurana et al.,J.Structural Biol.151:229-238,2005），并且常被用于检测淀粉状蛋白原纤维。

扩增之后，检测所述反应混合物中朊病毒起始的rPrP-res^(Sc)。如果所述反应（RT-QuIC）包括ThT，那么可使用在450+/-10nM激发并在480+/-10nm发射的荧光检测rPrP-res^(Sc)（参见例如，Wilham et al.,PLOS Pathogens6(12):1-15,2010，其以引用的方式纳入本文）。ThT可直接包括在所述扩增混合物中。在一些实施方案中，如果ThT被包括在内，那么所述反应混合物不包括离液剂或洗涤剂。在一些实施方案中，如果ThT被包括在内，那么所述反应混合物不包括可改变ThT的rPrP-res^(Sc)灵敏度的离液剂或洗涤剂。在一个非限制性实例中，当15B3免疫沉淀与RTQ反应一起使用时，在每个反应中ThT的终浓度为1mM。在其他实例中，以所述反应中约0.1-1mM的终浓度使用ThT。

在所述反应中可改变氯化钠（NaCl）浓度。在一些实施方案中，约200-400mM NaCl的浓度使得可灵敏检测仓鼠、绵羊、鹿和人PrP-res，并同时减少所述底物自发性转化的发生。在一些实施方案中，在RTQ反应中不被包括浓度高于0.002%的洗涤剂。

如果利用QuIC，那么可通过除ThT荧光之外的方式例如使用抗体（见下文）来检测PrP-res。在一些实例中，将反应混合物用蛋白酶K（其消化所述反应混合物中剩余的rPrP^C）消化，然后检测rPrP-res^(Sc)。在QuIC反应中可产生两种类型的错折叠朊病毒蛋白，一种自然发生（rPrP-res^(spon)），另一种是由测试样品中的朊病毒起始的（rPrP-res^(Sc)）。因此，区分前者和后者可基于暴露于蛋白酶K时产生的蛋白质片段大小的不同来完成。用QuIC测定实现了形成的rPrP-res^(spon)的量出乎意料地极大减少。因此，RT-QuIC（RTQ）（其包括硫磺素T）反应不需要进行蛋白酶K处理。因此，该步骤是任选的。

本文公开的所有方法，例如SQ和RTQ，会在多种条件下起作用。在若干实施方案中，支持特定的朊病毒/PrP-res作为种子的SQ的最佳条件包括使用洗涤剂，例如离子型和/或非离子型洗涤剂。所述条件可包括使用约0.05-0.1%的离子型洗涤剂，例如SDS。所述条件还可包括在所述反应混合物中使用约0.05-0.1%的非离子型洗涤剂例如TX-100。

就PrP^C底物而言，还已经发现，SQ和RTQ测定可进行靶PrP-res的跨物种扩增。事实上，rHaPrP和嵌合rPrP^C可被用于SQ和RTQ反应以扩增人朊病毒。rHaPrP似乎具有促进形成这些聚集体且最少形成rPrP-res^(spon)副产物的结构。因此，rHaPrP^C，和包括HaPrP组分的嵌合体，可用于在取自仓鼠以外物种的样品例如取自人、绵羊、牛或鹿的样品中扩增靶PrP-res。

所述反应使用的PrP^C可以为重组朊病毒蛋白，例如来自被设计以过表达所述蛋白的细胞的朊病毒蛋白。任何朊病毒蛋白序列可用于产生rPrP^C，例如非洲爪蟾（Xenopuslaevis）（登录号：NP001082180）、牛（Bos Taurus）（登录号：CAA39368）、斑马鱼（Danio verio）（登录号：NP991149）、捻角羚（Tragelaphus strepsiceros）（登录号：CAA52781）、绵羊（Ovis aries）（登录号：CAA04236）、黄肚红耳龟（Trachemys scripta）（登录号：CAB81568）、原鸡（Gallus gallus）（登录号：AAC28970）、褐家鼠（Rattus norvegicus）NP036763）、小鼠（Mus musculus）（登录号：NP035300）、灰短尾负鼠（Monodelphis domestica）（登录号：NP001035117）、智人（Homo sapiens）（登录号：BAA00011）、长颈鹿（Giraffacamelopardalis）（登录号：AAD13290）、穴兔（Oryctolagus cuniculus）（登录号：NP001075490）、猕猴（Macaca mulatta）（登录号：NP001040617）、水牛（Bubalus bubalus）（登录号：AAV30514）、小旋角羚（Tragelaphus imberbis）（登录号：AAV30511）、蓝牛羚（Boselaphustragocamelus）（登录号：AAV30507）、野牛（Bos garus）（登录号：AAV30505）、美洲野牛（Bison bison）（登录号：AAV30503）、爪哇野牛（Bos javanicus）（登录号：AAV30498）、非洲水牛（Syncerus caffercaffer）（登录号：AAV30492）、赤水牛（Syncerus caffer nanus）（登录号：AAV30491）和瘤牛（Bos indicus）（登录号：AAV30489）。这些序列均以引用的形式纳入本文。

在一些实施方案中，仅部分的朊病毒蛋白序列被表达为rPrP^C。例如，在某些实例中，rPrP^C包括仓鼠（SEQ ID NO:8）或小鼠（SEQ ID NO:9）朊病毒蛋白序列的氨基酸23-231（SEQ ID NO:1、2），或其他朊病毒蛋白序列的相应氨基酸，例如人（129M）朊病毒蛋白（SEQID NO:10）的氨基酸23-231（SEQ ID NO:3）、人（129V）朊病毒蛋白（SEQ ID NO:11）的氨基酸23-231（SEQ ID NO:4）、牛（6-八肽重复）朊病毒蛋白的氨基酸25-241（SEQ ID NO:5）、羊（136A154R171Q）朊病毒蛋白的氨基酸25-233（SEQ ID NO:6）或者鹿（96G132M138S）朊病毒蛋白的氨基酸25-234（SEQ ID NO:7）。所述被表达为rPrP^C的部分朊病毒蛋白序列可对应天然成熟全长PrP^C分子的多肽序列，意指rPrP^C多肽既缺乏氨基末端信号序列又缺乏羧基末端糖磷脂酰肌醇-锚连接序列。在另一实例中，本文描述的测定中利用了人、人129V、牛、羊或鹿的任一种的氨基酸30-231、40-231、50-231、60-231、70-231、80-231或90-231。本领域的技术人员可容易地使用SEQ ID NO：1-11中提供的序列信息，或使用可获自的信息（在2007年7月20日可获得的），来生产这些多肽。

所述rPrP^C可以为嵌合的rPrP^C，其中所述蛋白的一部分来自一个物种，所述蛋白的一部分来自另一物种，其也可被使用。在一个实例中，所述rPrP^C的约10-约90%，例如约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%约80%或约90%来自一个物种，相应地约90%、约80%、约70%、约60%、约50%、约40%、约30%、约20%或约10%来自另一物种。嵌合蛋白可包括例如仓鼠rPrP^C和来自另一物种的rPrP^C，例如人PrP^C。在另一实施方案中，所述嵌合蛋白包括仓鼠PrP^C和绵羊PrP^C。可将嵌合的仓鼠-绵羊rPrP^C构建体用于，例如，但不限于，检测人vCJD朊病毒。在一个实施方案中，使用了嵌合的rPrP^C（命名为Ha-S PrP^C），其中所述嵌合分子包括叙利亚仓鼠序列的残基23-137和与绵羊残基141-234（R154，Q171多形体）同源的剩余残基138-231。

在一些实施方案中，为了产生rPrP^C，将宿主细胞用表达rPrP^C例如人、牛、绵羊或仓鼠rPrP^C或其嵌合形式的核酸载体转化。这些细胞可以为哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或整个生物体，例如转基因小鼠。其他细胞也可用作PrP^C的来源。在具体的实例中，所述细胞为细菌细胞，例如大肠杆菌（E.coli）细胞。从表达rPrP^C的细胞或者在某些情况下从粗细胞裂解物中纯化的rPrP^C，可用作非致病性蛋白的来源。

在一些实施方案中，将所述重组蛋白与另外的氨基酸序列融合。例如，可标记过表达的蛋白用于纯化或者以便于检测样品中的蛋白。可产生的一些可能的融合蛋白包括组氨酸标签标记的rPrP、谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的rPrP、麦芽糖结合蛋白（MBP）标记的rPrP、绿色荧光蛋白（GFP）标记的rPrP以及Flag和myc标记的rPrP。这些另外的序列可用于帮助纯化和/或检测所述重组蛋白，并且在一些情况中，其随后通过蛋白酶切割除去。例如，可将特定蛋白酶切割位点的编码序列插入PrP^C编码序列和纯化标签编码序列之间。这种序列的一个实例为凝血酶的切割位点。因此，可将融合蛋白用蛋白酶切割以使PrP^C从所述纯化标签释放出来。

本领域技术人员已知的多种载体中的任一种可用于过表达rPrP^C。例如，可使用质粒或病毒载体。这些载体可通过多种方法引入至细胞中，所述方法包括，但不限于，转染（例如，通过脂质体、磷酸钙、电穿孔、粒子轰击等）、转化和病毒转导。

重组PrP^C还可包括具有这样的氨基酸序列的蛋白质：即，与野生型序列相比含有置换、插入、缺失和终止密码子。在某些实施方案中，加入蛋白酶切割序列以使得蛋白在被转化为朊病毒形式之后失活。例如，可将被凝血酶、烟草蚀纹病毒（Life Technologies,Gaithersburg,Md.）或因子Xa（Factor Xa）（New England Biolabs,Beverley,Mass.）蛋白酶识别的切割序列插入至所述序列内。在一些实施方案中，在蛋白被转化为PrP-res种子形式之后使其失活是不必要的，因为从所述反应获得的rPrP-res^(Sc)没有或几乎没有传染性。

还可改变pPrP^C蛋白编码序列，例如小鼠、人、牛、绵羊、山羊、鹿和/或麋鹿朊病毒蛋白的编码序列（分别为登录号NM_011170、NM_183079、AY335912、AY723289、AY723292、AF156185和AY748455，所述序列均以引用的形式纳入本文，2007年7月20日）。例如，可进行突变以使多种突变与多种哺乳动物朊病毒蛋白基因中已知的多态性匹配（参见，例如，表1）。此外，包含来自两条或多条不同天然PrP序列（例如来自不同宿主物种或株）的序列的嵌合PrP分子可由含有重组PrP基因序列的载体表达，并且这种嵌合体可用于多种物种朊病毒的RT-QuIC和QuIC检测。表达这些改变的朊病毒蛋白基因的细胞可用作所述rPrP^C的来源，这些细胞可包括内源表达突变rPrP基因的细胞，或者已通过引入表达载体实现表达突变rPrP蛋白的细胞。使用经突变的rPrP^C可以是有利的，因为这些蛋白中的一些可更容易或特异性地转化为蛋白酶抗性形式，或者不易发生自发性（不依赖朊病毒的）转化，因此可进一步提高所述方法的灵敏度。

在某些实施方案中，将半胱氨酸残基置于仓鼠朊病毒蛋白序列的第94和95位以能够在这些位点使用巯基反应性的标签，例如与基于马来酰亚胺的官能团连接的芘和荧光素来选择性标记rPrP。在某些实施方案中，这些标签不妨碍转化，却使得对所述反应产物进行更快速的基于荧光的检测。在一个实例中，rPrP-res^(Sc)的邻近分子中的芘被保持足够接近以使得准分子（eximer）形成，其以明显和可检测的方式改变荧光发射光谱。从未转化的rPrP^C分子中释放或在其上的游离的芘不太可能形成准分子。因此，所述反应可在多孔板中进行，用蛋白酶K消化，然后可测量准分子荧光以快速测试rPrP-res^(Sc)的存在。为标签选择位点94和95是因为PrP-res的该区域中的PK抗性使rPrP-res^(Sc)与rPrP-res^(spon)区分开，导致产生了17kDa rPrP-res^(Sc)条带。可将17-kDa rHa PrP-res^(Sc)片段与所有rHaPrP-res^(spon)片段区分开的PK抗性区的其他位置也可用于该目的。

表1

重组朊病毒蛋白（rPrP^C）可通过本领域技术人员已知的任何方法产生。在一个实例中，可将体外核酸扩增（例如聚合酶链式反应（PCR））用作产生编码朊病毒蛋白的核酸序列的方法。PCR是标准技术，描述于例如PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications（Innis et al.,San Diego,CA:Academic Press,1990）或PCR Protocols,Second Edition（Methods in Molecular Biology,Vol.22,ed.by Bartlett andStirling,Humana Press,2003）。

用于通过PCR产生编码重组朊病毒蛋白的核酸序列的代表性技术涉及制备含有靶核酸分子的样品，所述靶核酸分子包括朊病毒蛋白编码序列。例如，DNA或RNA（例如mRNA或总RNA）可以作为用于PCR反应的合适靶核酸分子。任选地，所述靶核酸分子可通过本领域普通技术人员熟知的多种方法中的任一种从细胞中提取（例如，Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePubl.Assoc.and Wiley-Intersciences,1992）。朊病毒蛋白在多种哺乳动物细胞中表达。在其中RNA为起始靶的实例中，将所述RNA反向转录（使用本领域通常已知的无数种反转录酶中的一种）以产生双链模板分子用于随后的扩增。这种特定的方法被称为反转录酶(RT)-PCR。用于RT-PCR的代表性的方法和条件描述于，例如，Kawasaki et al.（In PCRProtocols,A Guide to Methods and Applications,Innis et al.(eds.),21-27,Academic Press,Inc.,San Diego,California,1990）。

扩增引物的选择根据待扩增的靶核酸分子的一部分或多部分而制备。在多个实施方案中，可选择引物（通常为朊病毒编码核酸序列的至少10个连续核苷酸）以扩增朊病毒编码序列的全部或部分。可能需要改变扩增条件以适应不同长度和组成的引物和扩增子；这种考虑是本领域熟知的并详述于例如Innis et al.（PCR Protocols,A Guide to Methodsand Applications,San Diego,CA:Academic Press,1990）。从编码所提供的朊病毒蛋白的核酸序列，本领域技术人员可容易地设计可成功扩增朊病毒蛋白编码序列的全部或部分的许多不同引物。

如本文所述，许多编码朊病毒蛋白的核酸序列是已知的。虽然公开了具体的核酸序列，但是本领域的技术人员会理解，还提供了许多与本文描述的功能相关的序列，例如编码朊病毒蛋白的保守变体的核酸分子。两条核酸分子密切相关（例如互相为变体）的一种指征是序列同一性，其是一种在两个核酸序列或两个氨基酸序列之间以所述序列之间共有的序列同一性水平的方式表示相似度的量度。序列同一性通常以同一性百分比来表示；百分比越高，两个序列越相似。

比对待比较的序列的方法是本领域熟知的。多种程序和比对算法描述于：Smithand Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988;Higgins and Sharp,Gene73:237-244,1988；Higgins and Sharp,CABIOS5:151-153,1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research16:10881-10890,1988；Huang,et al.,Computer Applicationsin the Biosciences8:155-165,1992；Pearson et al.,Methods in MolecularBiology24:307-331,1994；Tatiana et al.,(1999),FEMS Microbiol.Lett.,174:247-250,1999。Altschul et al.提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑因素（J.Mol.Biol.215:403-410,1990）。

美国国立生物技术信息中心（NCBI）基本局部比对搜索工具（National Centerfor Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool，BLAST^TM,Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990）可从若干来源获得，包括美国国立生物技术信息中心（NCBI,Bethesda,MD）和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn 和tblastx联合使用。可从互联网上BLAST^TM的帮助部分获得如何使用该程序确定序列同一性的描述。

为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列，使用了BLAST^TM(Blastp）程序的“Blast2sequences”功能，并使用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵（开放空位分值[默认值=5]；延伸空位分值[默认值=2]；错配罚分[默认值=-3]；匹配奖分[默认值=1]；期望值（E）[默认值=10.0]；字长[默认值=3]；单行描述数目（V）[默认值=100]；显示的比对数目（B）[默认值=100]）。当比对短肽（少于约30个氨基酸）时，应使用Blast2sequences功能使用设置为默认参数（开放空位9，延伸空位1罚分）的PAM30矩阵进行比对。与参比序列有甚至更大相似性的蛋白在通过这种方法评估时会呈现更高的百分比同一性，例如与目的序列有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。

为了比较核酸序列，可使用BLAST^TM（Blastn）程序的“Blast2sequences”功能，使用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵（开放空位分值[默认值=11]；延伸空位分值[默认值=1]；期望值（E）[默认值=10.0]；字长[默认值=11]；单行描述的数目（V）[默认值=100]；显示的比对数目（B）[默认值=100]）。具有与参比序列甚至更大相似性的核酸序列在通过这种方法评估时会呈现增加的同一性百分比，例如与目的朊病毒序列至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。

序列同一性的另一种指征是核酸杂交。在某些实施方案中，使编码朊病毒蛋白的核酸变体与公开的（或已知的）编码朊病毒蛋白的核酸序列例如，在低严格度、高严格度或极高严格度条件下杂交。产生特定程度的严格度的杂交条件根据选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而有所不同。通常，虽然洗涤次数也会影响严格度，但是杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度（特别是Na⁺浓度）将决定杂交的严格度。Sambrook et al.(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989第9章和第11章详述了有关获得特定程度的严格度所需的杂交条件的计算。

以下为代表性的杂交条件，并不意味进行限制。

极高严格度（检测共有至少90%序列同一性的序列）

杂交：5×SSC在65℃下持续16小时

洗涤2次:2×SSC在室温（RT）每次持续15分钟

洗涤2次：0.5×SSC在65℃下每次持续20分钟

高严格度（检测共有至少80%序列统一性的序列）

杂交：5×-6×SSC在65℃-70℃下持续16-20小时。

洗涤2次：2×SSC在室温下每次持续5-20分钟

洗涤2次：1×SSC在55℃-70℃下每次持续30分钟

低严格度（检测共有至少50%序列同一性的序列）

杂交：6×SSC在室温-55℃下持续16-20小时

洗涤至少2次：2×-3×SSC在室温-55℃下每次持续20-30分钟

包括一个或若干个氨基酸置换为具有相似生化性质的氨基酸的置换（也称为保守置换）的朊病毒蛋白变体，也可用于本发明描述的方法。保守氨基酸置换可能对所得蛋白的活性（例如其转化为PrP-res的能力）影响最小。关于保守置换的其他信息可在，例如，BenBassat et al.(J.Bacteriol.,169:751-757,1987)、O’Regan et al.(Gene,77:237-251,1989)、Sahin-Toth et al.(Protein Sci.,3:240-247,1994)、Hochuli et al.(Bio/Technology,6:1321-1325,1988)和广泛使用的遗传学和分子生物学教科书中找到。在一些实例中，朊病毒蛋白变体可具有不多于3、5、10、15、20、25、30、40或50个保守氨基酸改变。下表示出了可对朊病毒蛋白（例如，SEQ ID NO:1-7示出的重组朊病毒蛋白）进行的示例性的保守氨基酸置换，以使得它们仍可用于本申请要求的测定。

表2：

原始残基	保守置换
		Ala	Ser
Arg	Lys
		Asn	Gln;His
Asp	Glu
		Cys	Ser
Gln	Asn
		Glu	Asp
Gly	Pro
		His	Asn;Gln
Ile	Leu;Val
		Leu	Ile;Val
Lys	Arg;Gln;Glu
		Met	Leu;Ile
Phe	Met;Leu;Tyr
		Ser	Thr
Thr	Ser
		Trp	Tyr
Tyr	Trp;Phe
		Val	Ile;Leu

为了从重组的（或天然的）来源纯化PrP^C，将组合物进行分级以从所述组合物除去多种其他组分。适合用于蛋白质纯化的多种技术都是熟知的。这些技术包括，例如，用硫酸铵、PTA、PEG、抗体等沉淀，或者通过热变性之后离心；层析步骤例如金属螯合物、离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石、凝集素亲和以及其他亲和层析步骤；等电点聚焦；凝胶电泳；以及这些技术和其他技术的组合。

IV.用于rPrP-res^(Sc)扩增测定的样品的来源

使用本文描述的方法分析的样品可包括能够被朊病毒污染的任何组合物。这样的组合物可包括组织样品、活检样品或体液，包括但不限于血浆、血液、淋巴结、脑、脊髓、扁桃体、脾、皮肤、肌肉、阑尾、嗅上皮、脑脊液、尿、粪便、乳、肠、泪和/或唾液。所述样品可以为人样品或兽样品，例如，但不限于来自牛、绵羊或鹿的样品。本发明公开的方法还可用于例如牛、绵羊和鹿的无朊病毒的牲畜群认证。

可从中取得样品用于分析的其他组合物包括例如食物、药剂（例如衍生自动物的生物制剂）、饮用水、法医证据、外科手术工具和/或机械装置。因此，可测试的样品包括生物技术制品和环境样品（例如水、土壤、植物、垃圾、污水）和农业样品（例如基于动物的食物、基于动物的饲料和营养补充物、动物废物、副产物、动物尸体、屠宰场废物、规定的危险物质）以确保没有朊病毒污染。

V.在没有ThT的情况下检测扩增混合物中rPrP-res^(Sc)的方法

一旦已经使用rPrP^C扩增例如使用rPrP-PMCA（例如QUIC测定）产生了rPrP-res^(Sc)，就可检测反应混合物中的rPrP-res^(Sc)。直接和间接方法可用于检测反应混合物中的rPrP-res^(Sc)。使用ThT的检测如上文所述。对于其中直接检测rPrP-res^(Sc)的方法，通常需要从其余的rPrP^C分离新形成的rPrP-res^(Sc)。这通常基于rPrP-res^(Sc)与rPrP^C相比的不同性质来实现。例如，rPrP-res^(Sc)通常为高度不溶的并且对蛋白酶处理有抗性。因此，在rPrP-res^(Sc)和rPrP^C的情况中，分离可通过例如蛋白酶处理来进行。也可使用侧流测定（Lateral flowassay）或SOPHIA。

A.蛋白酶处理

当通过蛋白酶处理分离rPrP-res^(Sc)和rPrP^C时，将反应混合物与例如蛋白酶K（PK）孵育。示例性的蛋白酶处理包括在37℃下用1-20μg/ml的PK消化反应混合物中的蛋白例如rPrP^C约1小时。可通过加入PMSF或电泳上样缓冲液来停止PK的反应，然后评估朊病毒水平。取决于所述样品的性质，在37℃下与1-50μg/ml的PK孵育通常足以除去rPrP^c。

还可通过使用特异性结合所述蛋白的错折叠形式并使其沉淀的配体来将rPrP-res^(Sc)与rPrP^C分离，所述配体包括构象抗体、某些核酸、血纤维蛋白溶酶原、PTA和/或多种肽片段。

B.蛋白质印迹

在一些实例中，将反应混合物用蛋白酶分级或处理以除去rPrP^C，随后进行蛋白质印迹以检测rPrP-res^(Sc)并将rPrP-res^(Sc)与rPrP-res^(spon)区分开。典型的蛋白质印迹步骤始自在还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分级蛋白。然后，将所述蛋白电转印到膜例如硝酸纤维素膜或PVDF上，并在使免疫复合物（抗原/抗体）有效形成的条件下用朊病毒蛋白抗体探测。用于检测朊病毒蛋白的示例性抗体包括3F4单克隆抗体、单克隆抗体D13（针对残基96-106（Peretz et al.(2001)Nature412,739-743））、多克隆抗体R18（针对残基142-154）和R20（直接针对C-端残基218-232）（Caughey et al.(1991)J.Virol.65,6597-6603）。

复合体形成之后，洗涤所述膜以除去非复合的物质。示例性的洗涤步骤包括用溶液例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液洗涤。免疫反应条带通过本领域技术人员已知的多种测定而可视化。例如，可使用增强的化学发光测定（Amersham,Piscataway,N.J.）。

根据需要，朊病毒蛋白浓度可通过蛋白质印迹以及之后的光密度分析，并与朊病毒蛋白浓度已知的样品的蛋白质印迹比较来估计。例如，这可通过将数据扫描至电脑中然后用定量软件进行分析来实现。为了获得可靠和稳固的定量，通常将若干不同稀释度的样品在同一凝胶上分析。

C.ELISA、免疫层析试纸条测定和构象依赖的免疫测定

如上文所述，最简单和直接意义上的免疫测定为结合测定。使用的具体非限制性免疫测定包括多种类型的酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫层析试纸条测定、放射免疫测定（RIA），特别是构象依赖的免疫测定。

在一种示例性ELISA中，将PrP抗体固定到展示蛋白亲和力的选择表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。然后，将怀疑含有朊病毒蛋白抗原的反应混合物加入所述孔。在结合并洗涤以除去非特异性结合的免疫复合物之后，可检测结合的朊病毒蛋白。检测通常通过加入连接到可检测标签的另一种PrP抗体来实现。这种类型的ELISA为简单的“夹心ELISA”。检测还可通过加入第二PrP抗体，然后加入对所述第二抗体具有结合亲和力的第三抗体（该第三抗体连接到可检测的标签）来实现。

在另一种示例性ELISA中，将怀疑含有朊病毒蛋白抗原的反应混合物固定在孔表面上，然后与PrP抗体接触。在结合并洗涤以除去非特异性结合的免疫复合物之后，检测结合的朊病毒抗体。当初始PrP抗体连接到可检测的标签时，可直接检测所述免疫复合物。同样，所述免疫复合物可使用对所述第一PrP抗体具有结合亲和力的第二抗体（该第二抗体连接到可检测的标签）来检测。

其中所述反应混合物中的蛋白质被固定的另一ELISA包括在检测中使用抗体竞争。在该ELISA中，将针对朊病毒蛋白的标记抗体加入孔，使其结合，并利用其标签来检测。然后，通过在与包被的孔孵育之前或孵育期间将给定的反应混合物与标记的针对朊病毒的抗体混合来确定给定反应混合物中朊病毒蛋白抗原的量。所述样品中朊病毒蛋白的存在发挥如下作用：降低能够结合到孔的针对朊病毒的抗体的量并因此降低最后的信号。因此，可定量所述样品中朊病毒的量。

无论所使用的方式如何，ELISA具有某些共同的特征，例如包被、孵育或结合；洗涤以除去非特异性结合的物质；以及检测结合的免疫复合物。下文描述了这些特征。

在用抗原或抗体包被板的过程中，通常用抗原或抗体的溶液孵育所述板的孔，过夜或持续指定的数小时时间。然后，洗涤所述板的孔以除去不完全吸附的物质。然后，将所述孔的任何剩余的可用表面用非特异性蛋白“包被”，所述非特异性蛋白对所述测试抗体是抗原中性的。这些非特异性蛋白包括牛血清白蛋白、酪蛋白和奶粉溶液。所述包被使得阻断所述固定化表面上的非特异性吸附位点，并因此降低由抗体非特异性结合至所述表面上造成的背景。

虽然不一定总是如此，但是通常使用二级或三级检测方式而不是ELISA的直接方法。因此，在蛋白或抗体结合到所述孔，用非反应性物质包被以降低背景以及洗涤以除去未结合物质之后，使所述固定化表面在有效使得免疫复合物（抗原/抗体）形成的条件下与待检测的生物样品接触。然后，所述免疫复合物的检测需要标记的第二结合配体或抗体，或者与标记的三级抗体或第三结合配体缀合的第二结合配体或抗体。

“在有效使得免疫复合物（抗原/抗体）形成的条件下”意指优选包括用溶液例如BSA、牛血清丙种球蛋白、乳蛋白和磷酸盐缓冲盐水（PBS）/吐温稀释抗原和抗体的条件。这些加入的试剂还倾向于帮助降低非特异性背景。“合适的”条件还意指以足以使得有效结合的温度和持续时间进行孵育。孵育步骤通常持续约1-2至4小时，优选在约25℃-27℃的温度下，或可以在约4℃左右下过夜。

在ELISA的所有孵育步骤之后，洗涤所述接触的表面以除去非复合的物质。示例性的洗涤步骤包括用溶液例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液洗涤。在所测试样品和最初结合物质之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤之后，可确定甚至微量的免疫复合物的出现。

为了提供检测检测方式，所述第二或第三抗体通常会具有缔合的标签以使得可检测。在一些实例中，该标签为与合适的显色底物孵育时会产生显色的酶。因此，例如，使所述第一或第二免疫复合物接触并与缀合脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶的抗体孵育一段时间，并且在有利于发生进一步的免疫复合物形成的条件下（例如，室温下在含PBS的溶液例如PBS-吐温中孵育2小时）。

在用标记的抗体孵育并随后洗涤以除去未结合的物质之后，可对标记的量进行定量，例如，通过与显色底物例如脲和溴甲酚紫或2,2′-联氮-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)和H₂O₂（在过氧化氢酶用作酶标签的情况中）孵育。然后，通过测量颜色产生的程度，例如使用可见光谱分光光度计来实现定量。

D.rPrP^C标记

在某些实施方案中，可标记所述重组rPrP^C底物蛋白以能够对转化为rPrP-res^(Sc)的蛋白进行高灵敏度的检测。例如，rPrP^C可以是放射性标记的、加上表位标签的或荧光标记的。所述标记可直接或间接检测。放射性标记包括，但不限于¹²⁵I、³²P、³³P和³⁵S。

可对含标记的蛋白的混合物进行扩增测定，例如QuIC，并且在除去未转化的蛋白（例如通过蛋白酶解）之后，在所述标记的蛋白的转化后高灵敏度地检测产物。或者，可如此标记所述蛋白以使得可根据转化过程中诱导的构象变化来检测信号。这种标记的实例是使用FRET技术，其中所述蛋白被两个合适的荧光基团标记，所述荧光基团在重折叠时变得足够接近以交换荧光能量（参见，例如美国专利No.6,855,503）。

在某些实施方案中，将半胱氨酸残基置于仓鼠朊病毒蛋白序列的第94和95位以能够在这些位点使用巯基反应性标签，例如连接到基于马来酰亚胺的官能团的芘和荧光素来选择性标记rPrP^C。在某些实施方案中，这些标签不妨碍转化却使得对所述反应产物进行更快速的基于荧光的检测。在一个实例中，rPrP-res^(Sc)的邻近分子中的芘被保持足够接近以允许准分子形成，其以明显和可检测的方式改变荧光发射光谱。从未转化的rPrP^C中分子释放或在其上的游离的芘不太可能形成准分子对。因此，rPrP-res^(Sc)扩增反应可在多孔板中进行，用蛋白酶K消化，然后可测量准分子荧光以快速检测rPrP-res^(Sc)的存在。为标签选择位点94和95是因为组成的PrP分子的该区域中的PK抗性使rPrP-res^(Sc)与rPrP-res^(spon)区分开，导致产生了17kDa rPrP-res^(Sc)条带。可将17-kDa PrP-res^(Sc)片段与所有rPrP-res^(spon)片段区分开的PK抗性区的其他位置也可用于该目的。

在某些其他实施方案中，对所述反应将荧光标记的rPrP^C底物的使用与具有固定的rPrP-res^(Sc)特异性抗体的免疫层析试纸条测试（例如，购自Prionics AG,Schlieren-Zurich,Switzerland）的使用结合。然后，用荧光检测器检测rPrP-res^(Sc)与抗体的结合。

通过以下非限制性实施例说明本公开。

实施例

TSE基本上是无法医治的并且难以在不可逆的临床衰退或死亡之前明确诊断。TSE在物种内和物种间的传染性突出了对针对即使是最少量的传染性的实际测试的需要。目前，大多数体外方法具有会妨碍其用于常规的诊断或筛选应用的主要限制。

在医学、农业和野生生物学中控制传染性海绵状脑病（TSE）或朊病毒疾病的关键挑战是开发针对传染水平或低于传染水平的朊病毒的实用测试。特别令人感兴趣的是能够检测血液组分例如血浆中的朊病毒的测试，但是血液通常具有极低的朊病毒浓度且含有最灵敏的朊病毒测试的抑制剂。如本文所公开的，免疫沉淀和改进的实时QuIC反应的结合显著地增强了对稀释到人血浆中的变异型克罗伊茨费尔特-雅各布病（vCJD）脑组织的检测。容易地检测了10¹⁴倍稀释、含有约2ag/ml蛋白酶K抗性的朊病毒蛋白的稀释物，表明对vCJD脑的灵敏度是先前报道的约10000倍。甚至在临床前早期阶段，区分了来自感染绵羊瘙痒症和未感染的仓鼠的血浆和血清样品。这种结合测定，称为增强的QuIC（eQuIC），提供了可用于组织、流体或环境样品中低水平朊病毒的常规检测的显著灵敏的测定。

实施例1

示例性方法

下文提供了用于检测朊病毒蛋白的示例性方法，其包括免疫沉淀和扩增。所提供的方法不应被解释为进行限制。

A)15B3包被

1.涡旋大鼠抗小鼠IgM（Invitrogen,cat.No.110.39D）30秒。

2.将微珠小份（例如250μl）转移至新管中用于15B3抗体包被步骤。

3.将管置于磁体上2分钟，除去微珠储存缓冲液。

4.加入新的包被缓冲液（1×PBS中0.1%BSA，过滤并保存在-4℃）：5倍于初始微珠体积（例如，1250μl）。

5.涡旋。

6.将管置于磁体上2分钟，除去包被缓冲液（参见上文）。

7.重复步骤4和5。

8.加入5倍于初始微珠体积（例如，1250μl）的包被缓冲液。

9.以终浓度360μg/ml向重悬的微珠加入15B3抗体。

10.在室温下使用“翻滚”旋转孵育2小时。

11.用5倍于初始微珠体积的包被缓冲液洗涤3次。

12.用初始体积的包被缓冲液（例如250μl）重悬微珠并保存在-4℃。

B)15B3免疫沉淀500μl人血浆中的263K/vCJD PrP-res

1.涡旋15B3包被的微珠30秒。

2.将涡旋的15B3包被的微珠分为40μl每管/样品。

3.将含有15B3包被的微珠的管放在磁体上2分钟，除去包被缓冲液。

4.向微珠加入500μl的免疫沉淀缓冲液（1×TBS中0.4%肌氨酰）。

1.向免疫沉淀缓冲液中的微珠加入500μl血浆（管中总体积为1ml）。

2.在37℃下使用“翻滚”旋转孵育24小时。

3.将管放在磁体上2分钟并除去缓冲液。

4.每管用500μl1×TBS（三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水）缓冲液中的0.2%肌氨酰洗涤两次。

5.将洗涤的微珠在10μl1×PBS（磷酸盐缓冲盐水，过滤并保存在室温下）中重悬，使用2μl以作为标准QuIC或实时QuIC的种子。

C)标准QuIC（SQ）反应

材料：

a.反应管：0.5ml带有螺旋帽的锥形微量离心管（Fisher02-681-334）

b.1×PBS中15B3包被的微珠，用于免疫沉淀血浆中朊病毒作为种子的活性，保存在4℃。

c.10mM磷酸钠缓冲液（pH5.8）中的仓鼠23-231 rPrP^C

d.4×QUIC缓冲液（最终组成：0.4%SDS，0.4%TritonX-100和4×PBS）：

方法：

1)解冻仓鼠（23-231）rPrP^C并使用100kD微型管过滤器（PALL）通过以4000×g旋转500μl蛋白质5分钟进行过滤。

2)将rPrP^C以1:10稀释在0.1%SDS/PBS中，测量280nm下的UV吸光度。

[蛋白mg/mL]=[280nm吸光度/2.6（即，PrP消光系数）×稀释因数=Xmg/mL，其中X=rPrP^C储存液浓度；理想的蛋白浓度为0.4-0.3mg/ml。

注：

想要100μL反应物中0.1mg/mL rPrP^C=10μg/X=YμLrPrP^C/反应（其中Y=达到0.1mg/ml/反应的终浓度要加入的rPrP^C的体积）

X和Y为变量：X为rPrP^C的浓度，其根据具体制剂而不同，Y为要具有0.1mg/ml的终浓度而向所述反应加入的蛋白质的体积

反应中水的量=100–Y–2–25=ZμL水/反应（其中Z=为达到100μL的最终反应体积而加入的水的体积）。最终反应体积为100μL，所以一旦确立了需要与全部其他组分（例如，NaCl、PBS）一同加入的rPrPC的体积，要达到100μl的其余体积为水。

3)如上文所述在管中制备反应混合物（以指定的顺序加入）。第一轮反应混合物：

其中Z=73-Y

涡旋前三种组分5秒，然后加入所述rPrP^C。轻柔地加入rPrP^C以避免产生气泡。将反应管盖上盖，但不进行涡旋。

4)将管用24×0.5ml管架（tube block）置于Eppendorf中。

5)在R中在50℃下孵育管8-10小时，交替进行60秒的摇动（1500rpm）和60秒不摇动。

6)短暂地旋转所述管以将盖中的任何溶液甩下。

7)移出小份用于第2轮QuIC并/或准备用于PK消化和免疫印迹分析（参见下文）。

第2轮标准QuIC：

1)在新的反应管中制备反应混合物，与上文所述的第1轮类似。注：刚好在转移体积以作为所述第2轮反应管的种子之前轻柔地涡旋样品管以均匀悬浮任何的片状沉淀物。

2)如上文步骤1和2所述，过滤并测量rPrP^C的A280。

3)如先前的段落所述制备反应混合物（以指定顺序加入）：

第2轮反应混合物:

其中Z=73-Y

注：涡旋前三种组分5秒，然后加入所述rPrP^C。轻柔地加入rPrP^C以避免产生气泡。将反应管盖上盖，但不进行涡旋。依照第1轮QuIC的步骤4-7进行。

4.在37℃下在1%肌氨酰/PBS中用3μg/ml的蛋白酶K消化10μl样品1小时

5.向每个样品加入15μl含4M脲的2×上样缓冲液

6.涡旋样品1分钟

7.放在沸水浴中10分钟

8.为了除去微珠，将样品置于磁体上2分钟并将上清液转移至新管

9.装载样品至SDS-PAGE凝胶（15μl/孔）并通过蛋白质印迹进行分析（参见Orru etal.,2009）

D)实时（RT）-QuIC反应

材料：

a.反应板：96孔的底透明板

b.10mM磷酸钠缓冲液（pH5.8）中的仓鼠（90-231）rPrP^C或Ha-S全长rPrP^C

c.实时QuIC缓冲液（RTQB），[10mM磷酸盐缓冲液（pH7.4）、300-400mM NaCl、0.1mg/mL rPrP^C、10μM硫磺素T（ThT）和10mM乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA）]

d.0.05%SDS/PBS，用于15B3微珠预处理

e.新鲜配制：0.032g ThT/10mlMilliQ水（10mM）

第1轮反应的方案：

1.如B部分所述免疫沉淀之后，将保存在1×PBS中的15B3微珠与0.05% SDS/PBS以1:1的比例混合并涡旋

2.在室温下孵育15B3微珠至少15分钟，每约5分钟进行涡旋

3.制备RTQB混合物（考虑96μl混合物/孔×待加入种子的孔的数目+2个另外的孔）

4.RT-QuIC混合物/孔：

每孔中的各反应具有100μl的终体积。“Y”为向每个反应加入的rPrPC的体积以具有0.1mg/ml的终浓度。该体积根据所加入的蛋白的浓度而有所不同。因此，每个反应加入的MilliQ水的体积（“X”）根据向该具体反应加入的rPrP^C的体积而有所不同。

涡旋前五种组分5秒，然后加入rPrP^C，加入rPrP^C之后轻柔地翻转。

5.每孔分成96μl的RTQ混合物

6.直接在孔中用4μl的15B3微珠+0.05%SDS/PBS作为RT-QuIC反应的种子

7.用封口膜（Nalge Nunc International265301）密封所述板

8.在BMG Polarstar酶标仪中在42-46℃下孵育所述板并用摇动动力学循环每约15分钟测量ThT荧光。

9.摇动程序：除了用于荧光测量的最后1分钟以外，以700rpm Double Orbital摇动1分钟，然后静止1分钟。

10.荧光测量设置：

-激发：450nm，发射：480nm

-底部读取，闪光次数：20

-手动增益：1000，积分时间：20μs

底物补充步骤：

11.制备MilliQ水中的10mM ThT储存液（称0.032g ThT/10ml MilliQ水，过滤，并保存在冰上）

12.如下制备RT-QuIC混合物：

13.RT-QuIC混合物/孔：

14.以3000×g旋转平板10分钟。

15.取下并丢弃封口膜

16.从每孔吸走90μl，注意吸管端不要碰到孔的底部

17.向所述相同孔中轻柔地加入100μl/孔的新底物

18.再次密封板（新封口膜）并依照步骤8-10的详细描述进行RT-QuIC。

实施例2

另外的材料和方法

重组朊病毒蛋白纯化：扩增了叙利亚金仓鼠（残基23-231；登录号K02234）、人（残基23-231；登录号M13899.1）rPrP^C和仓鼠-绵羊嵌合rPrP^C[叙利亚仓鼠残基23-137，其后为R₁₅₄,Q₁₇₁多形体的绵羊残基141-234（登录号AY907689）]，将其连接至pET41载体（EMDBiosciences）中并验证了序列。蛋白表达和纯化依照先前所述进行（参见，例如，Wilham etal.,PLoS.Pathog.6:e1001217,2010；Atarashi et al.,Nat.Methods4:645-650,2007）。通过SDS-PAGE、免疫印迹和质谱法估计了的rPrP^C蛋白的纯度≥99%（数据未示出）。

血浆样品收集和组织匀浆物制备：将叙利亚金仓鼠用50μl1%来自临床上用263K绵羊瘙痒病毒株感染的仓鼠脑匀浆物（BH）（图5）或10⁸倍稀释的BH（图2和3）进行脑内接种并持续指定时间，然后收集脑组织和血液。用较低剂量的绵羊瘙痒病病毒接种的仓鼠需要更长的时间发病，因此与图5中在80dpi相比图2和3中是在103-116dpi从“临终”仓鼠收集组织收集组织。对于血浆收集，将仓鼠通过深度异氟烷麻醉处以安乐死并通过心脏插入抽血。将血液立即转移至BD真空采血针（柠檬酸钠，Becton-Dickinson）管并轻柔地混合。将样品在Beckman J6-HC离心机中以3000rpm离心15分钟（min）。将血浆转移至新管并保存在-80℃。仓鼠血清样品以相似的方式收集但是不使用柠檬酸钠。当被指定时（即，图2B），将血浆样品解冻后以16k相对离心力（rcf）离心30秒（s），紧接着是免疫沉淀步骤（使用血浆上清液）。合并的人血浆（Innovative Research）保存在-20℃。对于脑BH稀释物掺入实验，将人血浆小份在4℃下过夜解冻，并进行10分钟的2000×g旋转以除去沉淀的级分。

将仓鼠和人10%（w/v）BH依先前所述（Saa et al.,J.Biol.Chem.281:35245-35252,2006）制备，分成小份并保存在-80℃。对于掺入实验，将BH在含1%或0.1%SDS的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中系列稀释，分别用于S-QuIC或RT-QuIC测定，所述磷酸盐缓冲盐水含有130mM NaCl和N2培养基添加剂（Gibco）（20、21、24）。2微升指定的BH稀释物被用于掺入0.5ml的人血浆。

15B3包被磁珠：将大鼠抗小鼠IgM Dynabeads（Invitrogen）涡旋30秒，将250μl微珠（1×10⁸个总微珠）转移至新管用于包被步骤。在磁体上孵育2分钟之后，丢弃微珠储存缓冲液，使用包被缓冲液（PBS中0.1%BSA；新鲜配制，过滤并保存在4℃）以5初始悬浮微珠体积进行2次洗涤。使用了1×10⁶个微珠/μg15B3抗体（Prionics）的比例。在室温下使用“翻滚”旋转孵育管2h。接着，用包被缓冲液进行另外3次洗涤，将微珠在包被缓冲液（初始微珠体积）中重悬并保存在4℃。依照对15B3微珠的描述但不加入15B3抗体制备模拟对照微珠。

制备MAGNABIND^TM微珠：将MAGNABIND^TM微珠（Pierce,Rockford,IL）涡旋30秒，将1.6×10⁷个总微珠转移至新管。将所述微珠用500μl PBS中的0.5%Triton X-100冲洗2次并用测定缓冲液(（TBS，1%Triton X-100，1%吐温20）以其初始体积重悬。

免疫沉淀血浆中的263K和vCJD PrP-res：将15B3包被的微珠、模拟微珠或MAGNABIND^TM微珠短暂涡旋，将1.6×10⁷个总微珠转移至新管。在磁体上孵育2分钟（min）之后，丢弃储存（包被）缓冲液，加入500μl免疫沉淀缓冲液（Prionics）。接着，向所述微珠加入500μl掺入BH的人血浆或500μl来自未感染绵羊瘙痒病或绵羊瘙痒病阳性动物的仓鼠血浆。在室温或37℃下使用“翻滚”旋转孵育样品过夜（ON）。随后，将样品在磁体上孵育2分钟，丢弃血浆-缓冲液混合物，将微珠用500μl洗涤缓冲液（Prionics）洗涤2次。将所有的微珠重悬至10μl PBS中并现配现用。

S-QuIC和RT-QuIC：S-QuIC测定如先前所述进行（Atarashi et al.,Nat.Methods5:211-212,2008;Orrúet al.,Protein Eng Des Sel22:515-521,2009）。将15B3包被的微珠或模拟微珠S-QuIC反应各自用2μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的微珠作为种子。除了一些改进以外，RT-QuIC如先前所述进行（Wilham et al.,PLoS.Pathog.6:e1001217,2010）。简言之，将来自免疫沉淀步骤的15B3包被的微珠、模拟微珠或MagnaBind微珠（重悬在10μl PBS中）与0.05%SDS/PBS结合（1:1比例），在室温下孵育20分钟，将反应用4μl0.05%SDS/PBS-微珠混合物作为种子。除了附图说明另有指示以外，将RT-QuIC反应在46℃下孵育。底物替换通过在24h之后中断RT-QuIC反应并在4℃下将平板以3000×g旋转10分钟来进行。接着，从每个孔移出90μl上清液，注意不要扰动微珠，并向每个孔轻柔地加入100μl含新rPrP^C的新反应缓冲液。继续RT-QuIC另外36-60h。

实施例3

免疫亲和捕获来自血浆的朊病毒用于SQ测定

做了一些尝试，以通过直接向SQ和RTQ测定加入血浆小份来检测掺入到人和绵羊血浆样品中的朊病毒。但是，血浆组分强烈地抑制两种测定，这与先前报道的另一相关测定的抑制一致（Trieschmann et al.,2005）。这些抑制剂可能是已知可结合朊病毒的血清脂蛋白（Safar et al.,2006）。因此，设计了方法来捕获和浓缩血浆中可检测形式的朊病毒。

通过将单克隆抗体15B3与磁珠偶联来制备朊病毒免疫亲和微珠。该抗体具有与结合PrP^C相比结合PrP-res和其他PrP寡聚物的强烈偏好（Korth et al.Nature390:74-77,1997；Biasini et al.,J.Neurochem.105:2190-2204,2008；Biasini et al.,PLoS.ONE.4:e7816,2009）。最初使用SQ测定测试了偶联15B3的微珠从0.5ml人血浆中捕获263K仓鼠脑PrP^Sc的能力。如前所述（Atarashi et al.,Nat.Methods5:211-212,2007;Atarashi etal.,Nat.Methods4:645-650,2008），阳性反应由免疫印迹中17kD、13kD、12kD和11kD蛋白酶抗性rPrP-res^(Sc)条带的特征模式指示。最初的实验表明了0.1%SDS预处理与Ha-S底物一起使用对绵羊PrP-res的更灵敏的检测。

2轮反应通过将第1轮反应产物的小份在新rPrP^C底物中作为种子来进行。仅用抗IgM的抗体（无15B3）包被的对照（模拟）微珠对朊病毒有一些亲和力，如下所示：例如，用与掺有绵羊瘙痒病脑匀浆物的4×10^-9稀释物的血浆（含有约100fg PrP-res）孵育的微珠作为种子的两个重复单轮反应之一中产生的阳性rPrP-res^(Sc)产物（图7，用星号标记的泳道）。然而，15B3包被的微珠在从血浆中捕获低水平的朊病毒方面效率是100倍，能够检测含有≥1fg PrP-res的稀释物（图7a和7b）。该IP-S-QuIC方案可从vCJD脑匀浆物的低至4×10^-10稀释物（含有约10fg人PrP-res）（图1）和绵羊瘙痒病仓鼠脑的2×10^-11稀释物（含有约1fgPrP-res）（图7）中给出阳性反应。相比之下，在用非TSE人或仓鼠脑匀浆物作为种子的反应中没有产生阳性rPrP-res^(Sc)反应产物。此外，15B3IP-S-QuIC在来自9只临终的感染绵羊瘙痒病仓鼠的0.5ml血浆中检测到天然存在的朊病毒活性，同时在2轮反应中没有阳性S-QuIC反应用来自阴性对照仓鼠的血浆作为种（图2）。

实施例4

通过RT-QuIC（eQuIC）将血浆中朊病毒15B3IP用于检测

将15B3IP适应性改变用于通过RT-QuIC进行检测（命名为IP-RT-QuIC）。RT-QuIC测定使用96孔板中的间歇摇动反应，rPrP^c作为底物，基本上无洗涤剂（≤0.002%SDS）且无离液剂的条件，以及对朊病毒作为种子的淀粉状蛋白原纤维进行基于ThT的检测（Wilham etal.,supra,2010；Atarashi et al.,Nat.Med.17:175-178,2011）。阳性反应由rPrP淀粉状蛋白原纤维存在下ThT荧光的增强来指示，其可被绘制成重复孔的平均荧光。在对使得可使用RT-QuIC测定检测15B3微珠上从血浆中捕获的朊病毒的条件进行筛选的过程中发现，除了对微珠的肌氨酰洗涤之外，室温下用0.05%SDS预孵育所述结合朊病毒的微珠约20分钟，加快了无洗涤剂RT-QuIC中的朊病毒扩增（图8）。

IP-RT-QuIC方案检测到人血浆中绵羊瘙痒病脑的约10^-10稀释物，但是对vCJD脑却没有那么灵敏（图9C）。为了检测绵羊瘙痒病，仓鼠rPrP^C90-231被用作底物。对于vCJD发现，由叙利亚仓鼠残基23-137和其后的绵羊残基141-234（R₁₅₄,Q₁₇₁多形体）组成的嵌合rPrP^C分子提供了比用同源的人PrP^C23-231构建体所观察到的更高的灵敏度和更少的向ThT-阳性产物的自发性（非朊病毒依赖性的）转化（图9）。

使用仓鼠rPrP^C90-231底物，来自感染绵羊瘙痒病仓鼠的0.5ml血浆或血清的内源性PrP^Sc的15B3IP给出了一些，而通常不是全部的，阳性重复反应，表明这些样品中的PrP^Sc水平处于或接近检出限（图3）。总起来说，这些初步结果表明15B3微珠以与S-QuIC或RT-QuIC检测相容的方式从血浆或血清中捕获高度稀释的朊病毒，但是对于检测绵羊瘙痒病仓鼠血浆中的内源性朊病毒，IP-RT-QuIC的灵敏度是临界的。

实施例5

使用底物替换对15B3捕获的朊病毒进行增强的QuIC（eQuIC）检测

为了提高IP-RT-QuIC的灵敏度，在约24小时的RT-QuIC反应之后，引入了底物替换步骤。在IP-RT-QuIC反应中，微珠和连接的朊病毒或朊病毒诱导的RT-QuIC转化产物倾向于附着在反应孔的底部。因此，可除去反应液体并加入新的rPrP^C，而保留所述孔中大部分的微珠或微珠结合的反应产物。IP和RT-QuIC与底物替换的这种结合——称为增强型QuIC（eQuIC）——使得可在约28小时内在使用4批不同人血浆进行的3个独立反应（参见，例如，图4A）的全部重复反应（n=4）中检测vCJD脑组织的4×10^-14稀释物（约1ag vCJD PrP-res）。再进行4×10^-15稀释，在单个实验中4个重复反应中的3个是阳性的（数据未示出）。通过比较，在这些eQuIC实验的每个实验中，阿尔茨海默病和肿瘤脑阴性对照稀释物一致给出了阴性反应。没有15B3的模拟微珠给出了降低很多的灵敏度和一致性（图4b和图10）。此外，偶联15B3的微珠提供了灵敏度是最近被报道具有朊病毒结合能力的超顺磁性纳米颗粒（Milleret al.,J.Virol.85:2813-2817,2011）的>10⁶倍的eQuIC检测（图10）。这些结果证明了基于15B3的eQuIC检测掺入人血浆的极低浓度朊病毒的能力。

实施例6

仓鼠血浆样品中内源性朊病毒的eQuIC检测

还测试了eQuIC是否改善了对来自感染绵羊瘙痒病的仓鼠血浆的内源性朊病毒的检测。与使用未增强的RT-QuIC（图3）的早期结果相比，来自总共13只绵羊瘙痒病仓鼠的所有重复eQuIC反应都是阳性的，而来自11只未感染仓鼠的那些没有一个在65小时内是阳性的（图5）。在所述感染绵羊瘙痒病的仓鼠中，9只在临床上是感染的（感染后80天，dpi），4只是亚临床的（3只在30dpi；1只在10dpi）。因此，eQuIC在绵羊瘙痒病的临床症状之前很久检测到血浆中的朊病毒，在该模型中，所述临床症状在约60dpi开始。对于一些绵羊瘙痒病样品，虽然重复孔各自全部是阳性的，但是给出了次于最大的平均荧光值（图5a）。这种差异性以及延滞期差异性似乎是由于聚集的血浆组分造成的，因为在通过短暂离心预清除紧接着进行免疫沉淀的样品中没有看到这些差异（图5b）。

总起来说，所述结果表明可以以与通过体外朊病毒扩增测定进行的超灵敏检测相容的方式从复杂的装载抑制剂的生物流体中捕获朊病毒。所述eQuIC测定尤其提供了测试PrP-res的量（1ag）的实用、高通量和快速方式，该量比向动物脑内接种引起朊病毒疾病所通常需要的量低若干个数量级。eQuIC检测血浆样品中朊病毒的能力提高表明该测定可用于改善人和动物中的朊病毒疾病诊断，并且可用于筛查血供的朊病毒污染。证明了基于对感染绵羊瘙痒病和未感染的仓鼠的血浆样品进行eQuIC分析可对感染绵羊瘙痒病和未感染的仓鼠进行区分。因为已经在血液的白细胞级分中发现了5-10倍的CJD传染性（Brown etal.,Haemophilia.13Suppl5:33-40,2007），所以白细胞的eQuIC分析会非常灵敏。

本文公开的用于QuIC的两阶段底物加入不同于用于蛋白质错折叠循环扩增（PMCA）（Saa et al.,Science313:92-94,2006；Saa et al.,J.Biol.Chem.281:35245-35252,2006）、rPrP-PMCA（Atarashi et al.,Nat.Methods4:645-650,2008）和QuIC（Atarashi et al.,Nat.Methods5:211-212,2008;Atarashi et al,Nat.Methods4:645-650,2007）反应的系列（多轮）扩增步骤，因为大多数微珠结合的朊病毒和朊病毒作为种子的产物保留在反应容器中，使得可替换所述底物而不除去大部分的种子颗粒。相反，在系列的PMCA和S-QuIC反应中，将所述总反应物的仅一小部分（通常≤10%）转移至含有新底物的新容器，因此失去来自第一轮的许多有种子的活性。

不囿于理论，所述结果表明，在eQuIC反应的初始停滞期中，特别是在加入种子和底物替换之间发生了至少两个过程（图6）。首先，可将rPrP^C转移至池中，不太快地达到朊病毒作为种子的原纤维组装，例如绕道（off-pathway）的寡聚物（OO）；另外，在20小时之后且在初始底物被转化为可检测的ThT阳性原纤维产物之前加入新的rPrP^C不会加快所述反应。因此，建议用“不太快达到的”池而不是不能达到的池，因为即使在没有底物补充的情况下只要给予足够的时间绝大多数底物仍能被转化。其次，必须以某种方式改变并引发初始种子以在加入新的底物时为更快速的原纤维组装提供种子；要不然，当存在相同浓度的新底物时，其能够在所述反应的开始为快速的ThT-阳性rPrP-res^(Sc)组装提供种子。同样，不囿于理论，该引发效应可通过二次成核机制来解释（Ferrone et al.,J.Mol.Biol.183:611-631,1985；Padrick and Miranker,Biochemistry41:4694-4703,2002），例如图6中用红星标记的那些。例如在停滞期中，朊病毒种子可通过以相对慢和基本上不可检测的速率结合rPrP^C来延长，所述基本上不可检测的速率部分地由种子颗粒的浓度确定。随着连续的延长，被提供种子的rPrP原纤维会变得足够长以通过搅动剪切，这增加种子颗粒浓度并加快总的原纤维组装。此外，其他类型的原纤维依赖型二次成核可能有助于原纤维组装的加快。例如，原纤维组装可在需要或不需要相似对齐的种子的情况下沿着已有原纤维的两侧通过rPrP^C底物或产淀粉样蛋白的中间体（AI）的预先对齐或成支架而加速。在任何情况下，需要进一步研究以确定支撑2-阶段底物加入的效应的机制。

用于RT-QuIC的更有效的rPrP^C底物并不总是与被测定的朊病毒/PrP-res的类型最同源的底物。出人意料地，对于人vCJD的检测工作最好的底物是嵌合的仓鼠-绵羊构建体（Ha-S rPrP^C），而不是人rPrP^C分子。

与其他超灵敏的朊病毒/PrP^Sc测定相比时，所述IP-RT-QuIC测定提供了相当大的优势。相对于第一代RT-QuIC测定，所述eQuIC不仅使得可进行装载抑制剂样品（例如血浆）中的朊病毒检测，而且对于在人血浆中的vCJD脑匀浆物稀释物的灵敏度提高达至少10000倍。与已经描述过的PMCA反应相比，对于给定的灵敏度水平所述IP-RT-QuIC更加迅速，通过使用细菌而不是脑作为PrP^C底物的来源而更加实用，通过使用摇动而不是超声处理而更容易地重复，并且由于基于多孔板的反应和荧光检测而更适于高通量分析。

Edgeworth（Lancet377:487-493,2011）已经产生了一种vCJDPrP-res检测测定，其包括在不锈钢微珠上的朊病毒捕获和ELISA检测方法。然而，该捕获-ELISA测定检测到全血中vCJD脑匀浆物的10¹⁰倍稀释物，本文公开的eQuIC测定检测到血浆的10¹⁴倍稀释物。所述Edgeworth测定在来自15个有症状的患者的血液中检测到PrP^vCJD，灵敏度约70%，特异性100%，这基本上与RT-QuIC在使用CSF样品诊断散发性CJD方面一样有效（Atarashi et al.,Nat.Med.17:175-178,2011）。本文公开的eQuIC测定在检测脑源vCJD作为种子的活性方面的约10000倍的灵敏度提供了使用血液、血浆、CSF或其他样品进行vCJD和sCJD诊断的灵敏度提高。本文公开的测定还可用于多种物质，例如食物、饲料、移植组织、医疗设备、农业废物和副产品、土壤、水源和其他环境样品。

实施例7

通过RT-QuIC进行朊病毒的15B3捕获用于检测

寻找了使得可使用RTQ测定对15B3微珠上从血浆中捕获的朊病毒进行检测的条件。存在提高RTQ检测的速度和灵敏度的其他因素。具体地，1)12倍浓度的15B3抗体与微珠的偶联（图11）：微珠上较高的抗体密度可帮助抵消血浆中潜在的PrP-res结合抑制剂并/或通过提供较高浓度的结合位点而加快结合；除了在RTQ之前进行肌氨酰洗涤之外，在室温下，用0.05%SDS处理结合朊病毒的微珠15-20分钟。在一些实例中，所述反应每4×10⁵个Dynabeads使用了0.360μg的15B3。

最初发现，朊病毒作为种子的活性可在SDS处理和加入RTQ反应之前用1M NaCl从微珠上洗脱。如上所述，所述洗脱的物质需要在室温下用0.05%SDS预孵育15-20分钟，以在RTQ中获得提高的朊病毒特异性作为种子的活性。

在进一步测试中发现，可将获自所述IP和SDS处理步骤的结合朊病毒的微珠的一部分（即，重悬在10μl的1×PBS中的总微珠的1/5）更简单地直接与rPrP^C底物在RTQ反应板孔中混合以起始如实施例1的方案详细描述的反应。

将微珠上装载的15B3抗体的量加倍（“20×”）以确定微珠上抗体浓度增加是否会提高所述测定对掺入到0.5ml绵羊血浆中的绵羊ARQ脑匀浆物（含有100fg或10pg PrP-res）的灵敏度。在这些研究中，“20×”表示将1×10⁸个总微珠与200μg15B3孵育，“10×”表示将1×10⁸个总微珠与100μg15B3孵育。Ha-S rPrP^C被用作底物。使用较高装载量的15B3实现了灵敏度提高（参见含有100fg PrP-res的稀释物）。

“20×”eQuIC条件被用于检测掺入到0.5ml血浆中的绵羊ARQ绵羊瘙痒病脑匀浆物（含有低至100ag PrP-res）（参见图13，4个重复反应）。相对于掺入到血浆中的脑匀浆物，相同的eQuIC条件被用于测试所述测定是否可检测来自感染绵羊瘙痒病的绵羊（ARQ|VRQ,VRQ\VRQ）的0.5ml血浆样品中内源性的朊病毒作为种子的活性。结果（见图14）表明了3绵羊瘙痒病阳性和4正常绵羊之间的明显区别。每个含朊病毒样品的所有重复反应（n=4）均为阳性，不含朊病毒样品的所有重复反应均为阴性。

实施例8

另外的eQuIC测定

eQuIC还用于检测掺入到0.5ml正常人血浆的散发性CJD脑匀浆物。在300和400mMNaCl的所有重复反应（n=4）中均检测到低至含有1fgPrP-res的sCJD脑匀浆物的稀释物。对于sCJD，用Ha-S rPrP^C替换人rPrP^C得到相似的的灵敏度，尤其是低至含有1fg PrP-res的稀释物。这些反应使用全长人rPrP-sen作为底物。在所有重复反应中（n=4）检测到含有低至10ag PrP-res的稀释物，而用对照的10^-4稀释物掺入的那些（National Institute forBiological Standards and Control(NIBSC,UK)NHBZ0/0001正常脑组织）无反应（参见图15）。

完成了类似的实验，其中sCJD脑匀浆物稀释物被掺入至0.5ml正常人脑脊液中。在所有重复反应中（n=4）检测到含有低至10ag PrP-res的稀释物，而用对照的10^-4稀释物掺入的那些（National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC,UK)NHBZ0/0001正常脑组织）无反应（参见图16）。

还进行了0.5ml小鼠血浆中的小鼠RML绵羊瘙痒病脑匀浆物稀释物的eQuIC检测。除了小鼠rPrP^C90-231被用作底物以外，这些反应条件类似于上文描述的那些（46℃，300μg15B3有1×10⁸个总微珠）。对于低至10^-13的稀释物（含有100ag PrP-res）所有重复反应（n=4）均为阳性，而用正常小鼠脑的10^-6稀释物作为种子的那些在100小时内无阳性反应（图17）。

eQuIC检测还被用于鉴定22L感染绵羊瘙痒病的小鼠的200μl血浆的内源性朊病毒作为种子的活性。测试了单个样品，一个来自野生型小鼠，另一个来自仅表达缺乏糖磷脂酰肌醇锚的PrP-sen的转基因小鼠。在两种情况中，所有的重复反应（n=4）给出了阳性反应，而来自未感染的野生型小鼠的血浆样品中没有观察到阳性反应（图18）。

考虑到本发明的原理可适用的很多可能的实施方案，应理解举例的实施方案仅是示例，不应认为是限制本发明的范围。而是，本发明的范围应由以下的权利要求书限定。因此，发明人要求落在这些权利要求书的范围和精神之内的所有发明。

Claims (30)

1.一种检测朊病毒蛋白的方法，其用于非诊断目的并且包括：

使样品与有效量的特异性结合朊病毒、PrP^Sc或PrP-res的抗体接触足够的时间以形成免疫复合物，其中所述特异性结合朊病毒、PrP-res或PrP^Sc的抗体与固体基质偶联并且其中所述固体基质为磁珠；

从所述样品中分离所述免疫复合物；

将所述免疫复合物与纯化的重组朊病毒蛋白(rPrP^C)混合以制备反应混合物；和

进行扩增反应，所述扩增反应包括：

(i)孵育所述反应混合物以使所述PrP-res与所述反应混合物中存在的rPrP^C共聚集；

(ii)保持促进所述rPrP^C与PrP-res共聚集的孵育条件以导致所述rPrP^C到rPrP-res^(Sc)的转化，同时抑制rPrP-res^(spon)的形成；

(iii)搅动步骤(i)中形成的聚集体，其中所述反应条件包括摇动所述反应混合物而不是进行超声处理；

(iv)补充底物，包括在反应混合物中添加另外的rPrP^C底物；

(v)重复步骤(i)-(iii)；和

检测所述反应混合物中的rPrP-res^(Sc)，其中在所述反应混合物中检测到rPrP-res^(Sc)表明所述样品中存在PrP-res。

2.权利要求1的方法，其中分离所述免疫复合物包括使用磁体。

3.权利要求1或2的方法，其中所述抗体为15B3、其人源化形式或其抗原结合片段。

4.权利要求3的方法，其中所述抗体与磁珠偶联，并且其中所述磁珠上所述抗体的浓度360μg/ml，或者其中所述磁珠上所述抗体的浓度10-500μg15B3/1×10⁸个微珠。

5.权利要求1-2和4中任一项的方法，其中使所述样品在19-40℃的温度下与所述抗体接触。

6.权利要求1-2和4中任一项的方法，其中所述样品为生物样品。

7.权利要求6的方法，其中所述生物样品为血液、血浆、血清或脑脊液样品。

8.权利要求6的方法，包括用含十二烷基硫酸钠或肌氨酰的缓冲液孵育所述磁珠，然后使所述生物样品与所述磁珠接触。

9.权利要求8的方法，包括用0.01％-0.1％十二烷基硫酸钠洗涤所述磁珠。

10.权利要求8的方法，包括用0.05％十二烷基硫酸钠洗涤所述磁珠。

11.权利要求1-2、4、7、9和10中任一项的方法，其中检测rPrP-res^(Sc)的存在情况包括使用硫磺素T(ThT)。

12.权利要求11的方法，其中在所述反应混合物中不包括高于0.002％的洗涤剂。

13.权利要求1-2、4、7、9、10和12中任一项的方法，还包括在检测rPrP-res^(Sc)的存在情况之前向所述反应混合物加入另外的rPrP^C，而不除去rPrP-res^(Sc)。

14.权利要求13的方法，其中所述另外的rPrP^C被加入到所述反应混合物，而不进行系列的多轮扩增。

15.权利要求1-2、4、7、9、10、12和14中任一项的方法，其中所述rPrP^C为嵌合的仓鼠-绵羊rPrP^C，并且其中所述PrP-res为PrP^CJD。

16.权利要求15的方法，其中所述仓鼠-绵羊rPrP^C包含叙利亚仓鼠PrP序列的氨基酸23-137和绵羊PrP的残基141-234。

17.权利要求16的方法，其中所述绵羊PrP包括R154和Q171。

18.权利要求1-2、4、7、9、10、12、14、16和17中任一项的方法，其中进行所述扩增反应包括在0.05％-0.8％的洗涤剂中孵育所述反应混合物。

19.权利要求18的方法，其中所述洗涤剂包括十二烷基硫酸钠。

20.权利要求19的方法，其中所述洗涤剂包含0.05-0.4％十二烷基硫酸钠(SDS)和0.05-0.4％Triton X-100。

21.权利要求18的方法，其中所述洗涤剂包含0.4％十二烷基硫酸钠(SDS)和0.4％Triton X-100。

22.权利要求1-2、4、7、9、10、12、14、16、17和19-21中任一项的方法，其中检测PrP-res的存在情况包括使所述反应混合物与特异性结合朊病毒、PrP-res或PrP^Sc的第二抗体接触。

23.权利要求22的方法，其中所述特异性结合PrP-res的第二抗体不是15B3。

24.权利要求1-2、4、7、9、10、12、14、16、17、19-21和23中任一项的方法，其中检测PrP-res的存在情况包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、侧流测定、SOPHIA(环绕光纤免疫测定)或蛋白质印迹。

25.权利要求1-2、4、7、9、10、12、14、16、17、19-21和23中任一项的方法，还包括定量所述PrP-res/PrP^Sc。

26.权利要求1-2、4、7、9、10、12、14、16、17、19-21和23中任一项的方法，其中搅动所述聚集体包括摇动所述反应混合物一段时间而不进行超声处理，所述一段时间基本上等于所述摇动之前的静止时间。

27.权利要求26的方法，其中将所述反应混合物摇动60秒然后不摇动60秒。

28.权利要求1的方法，其中重复步骤(iii)1-200次。

29.一种检测朊病毒蛋白的方法，其用于非诊断目的并且包括：

使生物样品与有效量的偶联到固体基质的抗体15B3接触足够的时间以在所述固体基质上形成免疫复合物；

将所述固体基质上的免疫复合物与所述生物样品分离；

用含0.5％十二烷基硫酸钠的缓冲液洗涤所述固体基质上的免疫复合物；

将所述固体基质上的免疫复合物与纯化的仓鼠绵羊嵌合重组朊病毒蛋白(rPrP^C)和硫磺素T混合以制备反应混合物；并且

进行扩增反应，所述扩增反应包括：

(i)孵育所述反应混合物以使得所述PrP-res与所述反应混合物中存在的rPrP^C共聚集；

(ii)保持促进所述rPrP^C与所述PrP-res共聚集的孵育条件以导致所述rPrP^C至rPrP-res^(Sc)的转化，同时抑制rPrP-res^(spon)的形成；

(iii)搅动步骤(i)中形成的聚集体，其中摇动所述反应混合物60秒，然后不摇动60秒；

(iv)在形成可检测的rPrP-res^(Sc)之前，向所述反应混合物加入另外的仓鼠绵羊嵌合重组朊病毒蛋白(rPrP^C)，和

(v)任选重复步骤(iii)和/或(iv)

使用荧光检测所述反应混合物中的rPrP-res^(Sc)，其中所述反应混合物的荧光表明所述样品中存在PrP-res。

30.权利要求29的方法，其中所述生物样品为来自人的血液、血清、血浆、脑脊液或组织样品。