KR102037059B1 - 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 토양, 구체적으로 변형 프리온의 감염이 의심되는 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 토양 시료에 존재하는 변형 프리온을 물리적인 힘으로 수득하고, 비드를 사용하여 PMCA를 수행함으로써 미량의 변형 프리온을 경제적이고 정확하게 검출할 수 있으므로, 동물 사육 농장으로부터 수득된 환경 시료를 이용하여 변형 프리온을 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법{DETECTING METHOD OF ABNORMAL PRION FROM SOIL}
본 발명은 토양, 구체적으로 변형 프리온의 감염이 의심되는 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법에 관한 것이다.
전염성해면상뇌증은 치명적인 신경의 퇴행성 질환을 일으키는 일종의 퇴행성 신경질환으로서, 사슴의 만성소모성질병(chronic wasting disease, CWD), 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopathy, BSE), 면양 또는 산양의 스크래피(scrapie), 밍크의 전염성밍크뇌증(transmissible mink encephalopathy), 및 고양이의 해면상뇌증(feline spongiform encephalopathy)뿐만 아니라, 사람에서의 크로이츠펠트-야콥병(creutzfeldt-jacob disease, CJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤인커 증후군(gerstmann-straussler-scheinker syndrome) 및 쿠루(kuru) 등을 포함한다.
이와 같은 전염성해면상뇌증의 원인인 변형 프리온은 감염성 단백질로 보고되었다. 변형 프리온은 체내에서 정상 프리온과 동일하게 면역원성을 갖지 않아 숙주의 면역체계로 제거되거나 항체반응을 유발하지 않는다. 또한, 긴 잠복기를 가지면서 감염된 동물의 뇌에서 신경세포를 파괴시키고 비정상 단백질 섬유를 침적시켜 뇌에 스펀지(해면상) 형태의 특이한 패턴을 나타내는 공포(空胞)를 형성시킨다.
특히, 사슴의 만성소모성질병은 사슴에서 발생하는 만성 신경변성 질병으로서, 변형 프리온의 감염에 의해 신경세포의 공포변성과 중추신경조직의 해면상 변화를 나타낸다. 사슴의 만성소모성질병은 3 내지 5년의 다양하고 긴 잠복기와, 유연, 불안, 침울, 이물성 폐렴, 보행장애, 기립불능 등의 다양한 임상 증상을 나타낸다. 일반적으로 만성소모성질병에 걸린 사슴은 100% 폐사된다.
만성소모성질병에 감염된 사슴은 축군내에서 다른 사슴들과 떨어져 있고, 몸의 균형을 유지하는 조정능력을 상실하는 등의 이상행동을 보인다. 또한, 침을 많이 흘리고 침울해지며 체중감소, 마비(예를 들면, 연하곤란), 갈증, 소변의 증가 등과 같은 임상 증상을 나타낸다. 만성소모성질병은 타액, 뇨와 같은 사슴의 분비물에 포함된 변형 프리온이 사슴간의 접촉이나 농장의 토양을 매개체로 전파된다. 이는 외기환경에 의해 잘 파괴되지 않아 오염된 환경에 노출된 사슴에서 지속적으로 감염되는 것이 보고되었다. 스크래피의 원인이 되는 변형 프리온은 3 내지 16년까지 환경에 남아있는 것으로 알려져 있다. 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1483438호는 종래의 PMCA(protein misfolding cyclic amplification) 기능을 향상시켜 병원성 프리온 단백질의 증폭을 향상시키고, 공동현상(cavitation)을 증가시키는 초음파 장비에 관한 것으로, 상기 초음파 장비는 극미량의 병원성 프리온 단백질을 검출하는데 유용하게 사용될 수 있음을 개시하고 있다.
사슴의 만성소모성질병은 그 원인이 변형 프리온이라고 최근에 밝혀지면서, 전염성해면상뇌증(TSE)로 분류되고, 국내에서는 제2종 가축전염병으로 지정 및 관리되고 있다. 만성소모성질병은 캐나다에서 수입된 엘크(elk)에 의해 국내로 유입되었으며 다섯 차례에 걸쳐 국내 사슴 농가에서 발생되었다. 만성소모성질병에 감염된 사슴이 사육된 농장의 경우 농장 환경에 잔존하고 있는 병원체를 모두 소독한 뒤, 다시 사슴을 사육해야한다. 그러나, 변형 프리온은 일반적인 미생물 소독제로 잘 소독되지 않아, 소독이 끝난 후 이를 확인하는 것이 매우 중요하다.
일반적으로 변형 프리온은 토양에 존재하는 미네랄과 결합함으로써 감염력이 지속되는 것으로 나타나며, 다양한 토양의 토성에 따라 변형 프리온의 용출 민감도가 다른것으로 알려져 있다. 따라서, 토양에서 미네랄과 결합된 형태로 토양에 존재하는 변형 프리온을 검출하기 위해 계면활성제를 이용하는 방법이 보고되어 있으나, 이와 같은 방법은 검출한계가 낮아 실제로 적용된 사례는 없었다.
이에, 본 발명자들은 환경 시료로부터 경제적이고 정확하게 변형 프리온을 검출하는 방법을 개발하고자 노력하던 중, 토양 시료에 PBS를 첨가하여 강하게 볼텍싱하고 원심분리하여 수득된 토양 세척액을 주형으로 이용하고, 여기에 비드를 첨가하여 PMCA를 수행하면 높은 민감도로 변형 프리온을 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1483438호
본 발명의 목적은 토양에 존재하는 변형 프리온을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 변형 프리온의 감염이 의심되는 토양 시료에 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가한 혼합액을 볼텍싱하는 단계; 상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 상층액을 이용하여 변형 프리온 연쇄증폭(protein misfolding cyclic amplification with bead, PMCAb)을 수행하고, 증폭된 변형 프리온을 탐지하는 단계를 포함하는 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 토양 시료에 존재하는 변형 프리온을 물리적인 힘으로 수득하고, 비드를 사용하여 PMCA를 수행함으로써 미량의 변형 프리온을 경제적이고 정확하게 검출할 수 있으므로, 동물 사육 농장으로부터 수득된 환경 시료를 이용하여 변형 프리온을 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 엘크 프리온을 포함하는 0.1 또는 1%(w/v) 농도의 뇌유제액으로 4개월 동안 오염시킨 토양에서 면역블롯팅으로 변형 프리온을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 변형 프리온에 비드를 첨가하지 않거나(A), 테프론 비드(B), 세라믹 비드(C) 또는 스테인레스 비드(D)를 첨가하여 PMCAb를 수행한 뒤, 면역블롯팅으로 변형 프리온을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 엘크 프리온을 포함하는 0.001, 0.01, 0.1 또는 1%(w/v) 농도의 뇌유제액으로 1개월 동안 오염시킨 토양에 완충액을 첨가하여 세척한 세척 상층액을 주형으로 PMCAb를 수행한 뒤, 면역블롯팅으로 변형 프리온을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 엘크 프리온을 포함하는 0.001, 0.01, 0.1 또는 1%(w/v) 농도의 뇌유제액으로 4개월 동안 오염시킨 토양에 완충액을 첨가하여 세척한 세척 상층액을 주형으로 PMCAb를 수행한 뒤, 면역블롯팅으로 변형 프리온을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 엘크 프리온을 포함하는 0.001, 0.01, 0.1 또는 1%(w/v) 농도의 뇌유제액으로 1개월 또는 4개월 동안 오염시킨 토양을 완충액으로 세척하고 남은 토양 시료를 주형으로 PMCAb를 수행한 뒤, 면역블롯팅으로 변형 프리온을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 사슴의 만성소모성질병이 발생하였던 농장의 토양을 채취하고, 이를 완충액으로 세척한 세척 상층액을 주형으로 PMCAb를 수행한 뒤, 면역블롯팅으로 변형 프리온을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 사슴의 만성소모성질병이 발생하였던 농장의 토양을 완충액으로 세척하고 남은 토양 시료를 주형으로 PMCAb를 수행한 뒤, 면역블롯팅으로 변형 프리온을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 방법을 도식화하여 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 변형 프리온의 감염이 의심되는 토양 시료에 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가한 혼합액을 볼텍싱하는 단계; 상기 혼합액을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 상층액을 이용하여 변형 프리온 연쇄증폭(protein misfolding cyclic amplification with bead, PMCAb)을 수행하고, 증폭된 변형 프리온을 탐지하는 단계를 포함하는 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법을 제공하기 위해, 변형 프리온의 감염이 의심되는 토양 시료에 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가한 혼합액을 볼텍싱하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프리온(prion)"은 단백질성 감염성 입자를 의미하는 것으로 단백질로만 구성되어 있다. 상기 프리온은 포유류에서 소해면상뇌증, 만성소모성질병, 스크래피, 전염성밍크뇌증, 고양이 해면상뇌증, 크로이펠트-아콥병, 쿠루 등을 포함하는 질병을 유발하는 원인으로 알려져 있다. 프리온은 자신의 단백질 구조를 리폴딩(refolding)함으로써 비정상적인 변형 프리온으로 변환되는데, 이렇게 변환된 변형 프리온은 안정적이고, 감염 조직에 축적되며 조직손상 및 세포의 사멸을 유발한다.
상기 변형 프리온의 감염이 의심되는 토양은 변형 프리온이 감염된 동물이 사육되던 장소의 토양일 수 있다. 상기 동물은 포유동물일 수 있고, 구체적으로, 소, 사슴, 양(예를 들면, 면양, 산양 등), 밍크 및 고양이 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 계면활성제를 포함하지 않는 완충액은 토양에 포함되어 있는 미네랄 성분, 토양의 흡착능력 및 흡착된 단백질의 형태 등에 영향을 주지 않고 계면활성제를 포함하지 않는 것이라면 모두 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 계면활성제를 포함하지 않는 완충액은 인산완충액(phosphate-buffered saline, PBS), 트리스완충액(tris-buffered saline) 및 염화나트륨 완충액(sodium chloride buffer)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 계면활성제를 포함하지 않는 완충액은 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 첨가될 수 있고, 상기와 같이 토양에 포함되어 있는 미네랄 성분, 토양의 흡착능력 및 흡착된 단백질의 형태 등에 영향을 주지 않는 범위내에서 적절히 변형될 수 있다.
또한, 토양 시료에 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가한 혼합액은 2,000 내지 4,000 rpm, 2,000 내지 3,800 rpm, 2,000 내지 3,500 rpm, 2,000 내지 3,200 rpm, 2,300 내지 4,000 rpm, 2,300 내지 3,800 rpm, 2,300 내지 3,500 rpm, 2,300 내지 3,200 rpm, 2,500 내지 4,000 rpm, 2,500 내지 3,800 rpm, 2,500 내지 3,500 rpm, 2,500 내지 3,200 rpm, 2,800 rpm 내지 4,000 rpm, 2,800 내지 3,800 rpm, 2,800 내지 3,500 rpm, 2,800 내지 3,200 rpm, 3,000 rpm 내지 4,000 rpm, 3,000 내지 3,800 rpm, 3,000 내지 3,500 rpm 또는 3,000 내지 3,200 rpm의 범위로 볼텍싱될 수 있다.
또한, 본 발명은 혼합액을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 상층액은 변형 프리온의 감염이 의심되는 토양 시료에 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가한 뒤, 볼텍싱함으로써, 토양 시료에 포함되는 변형 프리온을 포함할 수 있다. 상기 상층액이 제거된 토양 시료는 다시 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가하고 볼텍싱한 뒤, 원심분리를 수행함으로써 상층액을 수득하는 단계에 사용될 수 있다. 상기 단계는 1 내지 20회, 1 내지 17회, 1 내지 15회, 1 내지 13회, 1 내지 10회, 3 내지 20회, 3 내지 17회, 3 내지 15회, 3 내지 13회, 3 내지 10회, 5 내지 20회, 5 내지 17회, 5 내지 15회 또는 5 내지 13회 반복수행될 수 있다.
나아가, 본 발명은 수득된 상층액을 이용하여 변형 프리온 연쇄증폭을 수행하고, 증폭된 변형 프리온을 탐지하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "변형 프리온 연쇄증폭(protein misfolding cyclic amplification with bead, PMCAb)"은 변형 프리온을 증폭시키는 기술로서, 변형 프리온 증폭기술이 개발된 이후, 시료에 포함되는 미량의 변형 프리온을 검출할 수 있게 되었다. 상기 변형 프리온 연쇄증폭은 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 변형 프리온 연쇄증폭은 토양 시료에 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가하고 볼텍싱한 혼합액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 주형으로 사용하여 수행될 수 있다.
상기 변형 프리온 연쇄증폭에 사용되는 비드는 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있고, 구체적으로 세라믹, 스테인레스 스틸 및 테프론으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 소재로 제조된 비드가 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 비드는 테프론으로 제조된 비드일 수 있다. 또한, 상기 변형 프리온 연쇄증폭은 30 내지 300회, 40 내지 300회, 45 내지 300회, 50 내지 300회, 30 내지 280회, 40 내지 280회, 45 내지 280회, 50 내지 280회, 30 내지 250회, 40 내지 250회, 45 내지 250회, 50 내지 250회, 30 내지 200회, 40 내지 200회, 45 내지 200회, 50 내지 200회, 30 내지 180회, 40 내지 180회, 45 내지 180회 또는 50 내지 180회 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 증폭된 프리온의 탐지는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 탐지는 면역블롯팅 또는 실시간 유도변환 분석기법(RT-QUIC)을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 사슴의 만성소모성질병을 유발하는 엘크 프리온이 감염된 마우스 모델의 뇌를 이용하여 변형 프리온이 포함된 뇌유제액을 제조하고, 상기 뇌유제액을 토양에 처리하여 오염시켰다. 상기 오염된 토양 시료에 PBS를 첨가하고 볼텍싱한 뒤, 혼합액을 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이와 같이 토양 시료에 PBS를 첨가 및 혼합하여 상층액을 취하는 과정을 10회 반복한 뒤, 수득한 상층액을 주형으로 변형 프리온 연쇄증폭을 수행하였다.
변형 프리온 연쇄증폭이 완료된 시료를 이용하여 변형 프리온에 대한 면역블롯팅을 수행한 결과, 뇌유제액을 0.001, 0.01, 0.1 또는 1%(w/v)로 처리하여 1개월 또는 4개월 동안 오염시킨 모든 토양 시료에서 변형 프리온이 검출되었다(도 3 및 4 참조). 또한, 엘크 프리온이 감염된 사슴을 사육하던 농장의 토양 시료를 사용하여 동일한 방법으로 변형 프리온을 검출할 수 있음을 확인하였다(도 6 및 7 참조).
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 방법은 토양 시료에 존재하는 변형 프리온을 경제적으로 민감하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 토양 시료의 준비 및 전처리
토양에 존재하는 변형 프리온을 검출하기 위해, 토양 시료에 변형 프리온 단백질을 첨가하여 다음과 같이 전처리하였다.
먼저, 전남 축산기술연구소의 사슴사육장 토양을 채취하여 방사선을 조사하고, 상기 토양을 혈액 배지(코메드, 대한민국)에 도말하여 미생물에 오염되지 않았음을 확인하여 준비하였다. 한편, 변형 프리온은 사슴의 만성 소모성 질병의 원인인 엘크 프리온(elk prion)이 과발현된 마우스 모델의 뇌로부터 수득하였다. 구체적으로, 상기 마우스 모델을 희생시켜 뇌를 적출하고, 적출된 뇌를 전환 완충액[conversion buffer: 1x PBS, 150 mM NaCl, 1%(v/v) 트리톤 X-100, 4 mM EDTA, 0.05%(w/v) 디지토닌(digitonin) 및 단백질 분해효소 억제제 칵테일]에 5%(w/v)가 되도록 첨가하여 에멀젼화시켰다. 상기 에멀젼을 2,000 g의 조건하에서 1분 동안 원심분리한 뒤, 뇌유제액으로서 상층액을 수득하고 이를 사용전까지 -80℃에서 보관하였다. 상기 준비된 토양에 0.1 또는 1%(w/v)의 뇌유제액을 주 1회 첨가하여 1개월 또는 4개월 동안 엘크 프리온으로 토양을 오염시켰다.
0.5 g의 오염된 토양 및 2 ㎖의 PBS를 15 ㎖의 원심튜브에 넣고, 이를 3,200 rpm으로 10초 동안 볼텍싱하였다. 볼텍싱 후, 이를 1,000 g의 조건하에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 취하였다. 상기 펠렛에 2 ㎖의 PBS를 첨가하고, 3,200 rpm으로 10초 동안 볼텍싱한 뒤, 상층액을 제거하였다. 이때, 500 ㎕의 상층액을 보관하여 추후 변형 프리온의 검출에 사용하였다(W1 내지 W3). 상기 과정을 2회 반복하고, 4번째부터는 500 ㎕의 PBS를 첨가하여 동일한 과정을 7회 수행하였다. 이때, 상층액을 보관하여 추후 변형 프리온의 검출에 사용하였다(W4 내지 W10). 한편, 10회까지 세척하고 상층액을 제거한 토양에 1 ㎖의 PMCA 전환 완충액을 첨가하였다. 이를 인텔리-믹서 SLRM3(intelli-mixer SLRM3)를 이용하여 65도 왕복 및 99 rpm의 조건하에서 1시간 동안 교반하였다. 교반 후, 20 ㎕의 0.1 M 페파블록(pefabloc)을 첨가하고 1,000 g의 조건하에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 수득하였다. 이를 4회 반복하여 수득된 상층액을 세척 후 토양 시료로서 사용하였다(E1 내지 E4).
실시예 2. 변형 프리온의 검출
뇌유제액으로 오염된 토양을 세척하는 과정에서 수득된 상층액을 이용하여 면역블롯팅의 방법으로 변형 프리온을 검출하였다. 이때, 변형 프리온이 프로테아제에 저항성을 나타내는 특징을 이용하였다.
먼저, 실시예 1에서 뇌유제액으로 오염된 토양을 10회 세척하는 동안 보관한 상층액을 이용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 구체적으로, W1 내지 W10의 상층액을 각각 5 ㎕씩 취하고, 여기에 15 ㎕의 전환 완충액 및 800 ㎍/㎖의 프로테아제 K를 첨가하였다. 이를 37℃에서 60분 동안 반응시킨 뒤, 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛에 20 ㎕의 1x SDS 샘플 버퍼를 첨가하고 100℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 추출된 단백질을 12%의 비스-트리스 폴리아크릴아마이드 겔(bis-tris polyacrylamide gel)에 로딩하였다. 200 V의 조건하에서 35분 동안 전기영동하여 단백질을 전개시하고, 이를 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 30분 동안 블로킹시킨 뒤, 프리온 단백질에 특이적인 토끼 다클론항체(농림축산검역본부, 한국)를 1:3,000의 비율로 첨가하였다. PVDF 막을 1시간 동안 실온에서 반응시킨 뒤, TBST 용액으로 5분 동안 3회 세척하였다. 그 후, 2차 항체로서 알카라인 포스파타제가 접합된 염소 항토끼 IgG 항체를 1:3,000의 비율로 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 PVDF 막을 TBST로 5분 동안 3회 세척한 뒤, CDP 스타(CDP star)를 사용하여 발색시키고 LAS 4000(Kodak, 일본) 카메라를 이용하여 촬영한 사진을 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 엘크 프리온을 4개월 동안 오염시킨 모든 샘플에서 엘크 프리온이 검출되었고, 특히 0.1%(w/v)의 뇌유제액으로 오염된 토양을 세척하여 수득한 상층액에서 가장 많은 양의 변형 프리온이 검출되었다.
상기로부터, 토양 시료를 PBS로 세척하여 수득한 상층액에서 변형 프리온이 낮은 민감도로 검출되는 것을 알 수 있었다. 그러나 이와 같은 변형 프리온의 검출은 토양에 오염된 변형 프리온의 양이 적을수록 이를 세척한 상층액에서 더욱 효과적으로 검출되었다. 따라서, 토양 시료로부터 변형 프리온을 검출하기 위한 변형 프리온의 증폭은 토양 시료 자체보다는 토양 시료를 세척하여 수득된 상층액을 이용하여 수행하는 것이 적합함을 알 수 있었다.
실시예 3. 변형 프리온의 증폭 조건 확인
엘크 프리온(elk prion)이 과발현된 마우스 모델의 정상 뇌 조직을 기질로 이용하여 변형 프리온의 증폭 조건을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 뇌유제액을 10-3, 10-5, 10-7, 10-9, 10-11, 10-13 및 10-15로 희석하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료 100 ㎕를 0.2 ㎖ 튜브에 넣고, 여기에 하기 표 1에 기재된 바와 같이 비드를 첨가한 뒤, 37℃의 항온수조에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합물을 초음파 분쇄기 S-4000을 사용하여 증폭시켰다. 구체적으로, 증폭은 160 내지 170 W로 진폭(amplitude) 70 V, 펄스 지속시간 30초 및 펄스 정지시간 9분 30초를 1회로 하여, 이를 총 56회 반복하였다. 한 라운드의 마지막 반응이 끝난 PMCAb 반응액을 70 ㎕ 취하여 분석때까지 보관하고, 반응액에 정상 마우스로부터 상술한 방법과 동일하게 수득한 70 ㎕의 뇌유제액을 더 첨가하고, 이를 다시 37℃의 항온수조에서 16시간 동안 반응시켜 2번째 라운드를 수행하고, 이를 다시 반복하여 3번째 라운드까지 완료하였다. 그 후, 증폭이 끝난 샘플을 사용하여 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 엘크 프리온을 검출하고, 그 결과를 표 1 및 도 2에 나타내었다.
비드 종류 세라믹 스테인레스 스틸 테프론 비드 무첨가
직경(㎜) 2.8 2.38 2.38
개수 2 2 2
검출한계 1R 10-3 10-3 10-3 10-3
2R 10-5 10-3 10-7 10-5
3R 10-7 10-7 10-9 10-7
표 1 및 도 2에서 나타난 바와 같이, 세라믹 또는 스테인레스 스틸 비드를 사용한 경우와 비교하여 테프론 비드를 사용하여 PMCAb를 수행한 경우가 변형 프리온을 더욱 민감하게 검출하였다. 구체적으로, PMCAb를 3라운드까지 완료한 뒤, 세라믹 또는 스테인레스 스틸 비드는 10- 7으로 희석된 시료에서 변형 프리온을 검출하였으나, 테프론 비드는 10- 9으로 희석된 시료에서 변형 프리온을 검출함으로써 100배 민감함을 확인하였다(표 1 및 도 2).
실시예 4. 엘크 프리온으로 오염된 토양을 이용한 변형 프리온 증폭
뇌유제액이 오염된 토양에 존재하는 변형 프리온을 연쇄증폭법(protein misfolding cyclic amplification with beads, PMCAb)을 사용하여 증폭시켰다.
먼저, 실시예 1에서 제조된 뇌유제액을 0.001, 0.01, 0.1 또는 1%(w/v)로 첨가하여 1개월 또는 4개월 동안 오염된 토양시료를 실시예 2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 10회 세척하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액을 이용하여 실시예 3과 동일한 조건 및 방법으로 변형 프리온을 증폭시켰다. 이때, 비드로는 상기 표 1에 기재된 바와 같은 테프론 비드를 사용하였다. PMCAb가 완료된 후, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 면역블롯팅을 수행하여 증폭된 변형 프리온을 확인한 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다.
도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 1개월 또는 4개월 동안 0.001, 0.01, 0.1 또는 1%(w/v)의 뇌유제액을 처리함으로써, 엘크 프리온으로 오염시킨 토양을 세척한 세척액에서 변형 프리온이 검출되었다. 그러나, 도 5에 나타난 바와 같이, 토양 자체에서는 1개월 동안 1%의 뇌유제액으로 오염시키거나, 4개월 동안 0.01, 0.1 또는 1%(w/v)의 뇌유제액으로 오염시킨 시료에서만 변형 프리온이 검출되었다. 따라서, 상기로부터 토양을 세척한 토양 세척액에서 변형 프리온이 더 많이 존재하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 토양 세척액에 포함된 변형 프리온의 감염력 확인
본 발명에 따른 방법으로 수득된 토양 세척액에 포함된 변형 프리온이 감염력을 갖는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 8주령의 엘크 프리온을 발현하는 형질전환 마우스에 실시예 4에서 변형 프리온이 증폭된 세척액을 마리당 20 ㎕씩 뇌내 투여하였다. 그 결과, 총 5마리의 마우스 중에서 2마리가 변형 프리온에 감염된 증상을 보였으며, 266±7일의 잠복기를 보였다.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 방법으로 수득된 토양 시료의 세척액에 감염력이 있는 변형 프리온이 존재하는 것을 확인하였다.
실험예 1. 변형 프리온이 감염된 사슴 사육농장의 토양으로부터 변형 프리온의 검출
변형 프리온이 감염된 사슴을 사육한 농장에서 채취한 토양을 사용하여 변형 프리온을 검출하였다(경남 진주, 대한민국). 먼저, 변형 프리온이 감염된 사슴 사육농장의 4군데에서 토양을 채취하고, 이를 실시예 1에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 전처리하였다. 그 후, 전처리된 시료를 이용하여 실시예 2 및 3에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 증폭시켜 면역블롯팅을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 토양을 세척한 경우, 농장의 4군데에서 채취한 토양 중, 3곳의 토양을 세척한 세척액에서 변형 프리온이 검출되었다(도 6). 그러나, 도 7에 나타난 바와 같이, 세척된 토양에서는 변형 프리온이 검출되지 않았다(도 7).
따라서, 상기로부터 본 발명의 방법으로 전처리된 토양은 종래의 방법보다 더욱 경제적으로 변형 프리온을 검출할 수 있다.

Claims (8)

1) 변형 프리온의 감염이 의심되는 동물 사육농장에서 수득된 토양 시료에 계면활성제를 포함하지 않는 완충액을 첨가한 혼합액을 볼텍싱하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 혼합액을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 상층액을 이용하여 변형 프리온 연쇄증폭(protein misfolding cyclic amplification with bead, PMCAb)을 수행하고, 증폭된 변형 프리온을 탐지하는 단계를 포함하는 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법에 있어서,
상기 계면활성제를 포함하지 않는 완충액은 인산완충액(phosphate-buffered saline, PBS), 트리스완충액(tris-buffered saline) 및 염화나트륨 완충액(sodium chloride buffer)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고;
상기 변형 프리온 연쇄증폭이 테프론으로 제조된 비드를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 볼텍싱은 3,000 내지 3,200 rpm으로 수행되는, 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1) 내지 2)가 1 내지 20회 반복수행되는, 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 변형 프리온 연쇄 증폭이 30 내지 300회 수행되는, 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 탐지가 면역블롯팅 또는 실시간 유도변환 분석기법(RT-QUIC)으로 수행되는, 토양으로부터 변형 프리온을 검출하는 방법.
삭제
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